ANALĐZ ĐÇĐN GEREKLĐ EKĐPMANLAR. Mikro pipet (1000 µl) Ependorf tüpü (1.5 ml) Cam tüp (16X100 mm)

Transkript

1 1 GĐRĐŞ Toplam lipid tayininde sülfo-fosfo-vanillin reaksiyonu takip edilmekte olup hızlı güvenilir ve kolay bir yöntem olduğu için tercih edilmiştir. Serum içerisindeki toplam lipid miktarının kantitatif olarak saptanması için üretilmiş olmakla birlikte uygun kalibrasyon grafiği üretilmesi durumunda lipid içerikli diğer örneklerin lipid derişimlerinin saptanması içinde kullanılabilmektedir. Test kitinin üretmiş olduğu sonuçlar lipid ekstraksiyonu ve gravimetrik ölçümü temel alan yöntemlerle karşılaştırılabilecek düzeydedir. Sülfo-fosfo-vanillin yönteminde lipid sülfürik asit ile reaksiyona girmekte ve karbonyum iyonları oluşturmaktadır. Karbonyum iyonları ise vanillin fosfat esterleri ile reaksiyona girerek renkli kompleksler meydana getirir. Renk yoğunluğu takip edilerek ortamdaki toplam lipid miktarı ölçülebilmektedir. Biyozim Toplam Lipid Analiz Kiti nde yüksek saflıkta kimyasallar kullanılarak kısa sürede, yüksek doğrulukta ve tekrarlanabilir sonuçların üretilebilmesi mümkün kılınmıştır. Yöntem mümkün olduğunca basitleştirilmiş ve her aşamasında kullanıcı kolaylığı ön planda tutulmuştur. ANALĐZ ĐÇĐN GEREKLĐ EKĐPMANLAR Mikro pipet ( µl) Ependorf tüpü (1.5 ml) Cam tüp (16X100 mm) Mikro pipet (1000 µl) Makro küvet (3 ml) 1 Vorteks Analitik terazi Spektrofotometre (530 nm) Su banyosu (kaynar su banyosu) ANALĐZ KĐTĐ ĐÇERĐĞĐ Toplam lipid analiz kiti; vanillin, potasyum fosfat, sülfürik asit, toplam lipid standardı ve koruyuculardan oluşmaktadır. 1 nolu şişe (# ): Toplam lipid analiz çözeltisi(50 analiz/şişe) Vanillin Potasyum fosfat Koruyucu 2 nolu şişe (# ): Asit çözeltisi (50 ml) H 2 SO 4 (Derişik) 3 nolu şişe (# ): Toplam lipid standardı Potasyum oleat 0.5 g (6 g/l) Koruyucu 1 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilmektedir. -1-

2 2 ÇÖZELTĐLERĐN HAZIRLANMASI Toplam lipid analiz kitinde tüm kimyasallar kullanıma hazır olarak sunulmuştur. Aşağıdaki prosedür gerçekleştirilerek çok kısa bir sürede ölçüme başlanabilmektedir. Potasyum oleat standart çözeltilerinin hazırlanması: 3 nolu şişe içerisinde bulunan potasyum oleat (6 g/l) standardı kullanılarak 1.0 g/l, 2.0 g/l, 3.0 g/l ve 4.0 g/l derişimlerindeki lipid çözeltilerini etanol içerisinde hazırlayınız. Dört farklı derişimdeki lipid çözeltileri kalibrasyon grafiğinin çizilmesinde kullanılacaktır. STABĐLĐTE Analiz kimyasalları oda sıcaklığında 12 ay saklanabilmekte ve bu süre içerisinde herhangi bir problemle karşılaşılmadan kullanılabilmektedir. Kalibrasyon grafiğinin üretilmesi aşamasında kullanılmak üzere hazırlanan toplam lipid çözeltileri uzun süreli uygun olmayan koşullarda bekletilmesi durumunda oksitlenebilmektedir. Hazırlanan çözeltilerin uzun süre kullanımı için koruyucu ilave edilmeli ve karanlık ortamda muhafaza edilmelidir. ÖRNEK HAZIRLAMA Örneğin berrak ve homojen olması gerekmektedir. Serum harici örneklerde toplam lipid tayini yapılıyorsa EK1 de verilen örnek hazırlama yöntemlerinden yararlanılmalıdır. Örneğin 6 g/l den fazla lipid içermesi durumunda seyreltilmesi gerekmektedir. Seyreltme işlemi, aşağıdaki tabloya uygun olarak gerçekleştirilir. Toplam lipid derişimi (g/l) Örnek + Etanol Miktarı Seyreltme Faktörü < > ANALĐZ BĐLGĐLERĐ Spekrofotometre dalga boyu: 530 nm Küvet: 1 cm standart (Plastik veya cam) Spekrofotometre sıfır ayarı : Kör çözeltisi -2-

3 3 ANALĐZ PROSEDÜRÜ 1. Çözeltileri prosedüre göre hazırlayınız. 2. Test tüplerini numaralandırınız (kör, standart ve örnekler). 3. Test tüplerine ml örnek veya standart çözelti koyunuz. 4. Örnek üzerine dikkatli bir şekilde 1.0 ml asit çözeltisi ilave ediniz, karıştırarak örneğin asit içerisinde tamamen çözünmesini sağlayınız. 5. Tüpleri kaynar su banyosunda 10 dk inkübe ediniz. 6. Tüpleri hızlı bir şekilde soğutunuz (soğuk su içerisinde 2-3 dk bekletiniz). 7. Tüplere 1 ml toplam lipid analiz çözeltisi (1 nolu şişe) ilave ediniz ve karıştırınız (Döndürerek yavaş bir şekilde karıştırınız. Reaktif ilave edilmesi sonucu ısı açığa çıkacaktır. Bu aşamada dikkatli olunması gerekmektedir.). 8. Tüplere 1 ml saf su ilave ediniz ve karıştırınız. 9. Tüpleri 10 dk soğuk su içerisinde inkübe ediniz. 10. Kör çözeltisini kullanarak spektrofotometreyi sıfırlayınız nm de absorbans değerlerinizi ölçünüz, ölçümlerde ışık yolu 10 mm olan cam veya plastik küvet kullanınız. 2 Analizin kolay takip edilebilmesi için aşamalar tabloda özetlenmiştir. KÖR ÖRNEK Örnek veya standart ml Asit çözeltisi (2 nolu şişe) 1.0 ml 1.0 ml Karıştırarak örneğin asit içerisinde tamamen çözünmesini sağlayınız Tüpleri kaynar su banyosunda 10 dk inkübe ediniz. Tüpleri hızlı bir şekilde soğutunuz. Toplam lipid analiz çözeltisi (1 nolu şişe) 1.0 ml 1.0 ml Saf su 1.0 ml 1.0 ml Döndürerek yavaş bir şekilde karıştırınız. Tüpleri 10 dk soğuk su içerisinde inkübe ediniz. Kör çözeltisini kullanarak spekrofotometreyi sıfırlayınız. 530 nm de absorbans artışını ( A) ölçünüz. 2 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilir. -3-

4 4 KALĐBRASYON GRAFĐĞĐNĐN ÇĐZĐLMESĐ VE ÖRNEK TOPLAM LĐPĐD DERĐŞĐMĐNĐN HESAPLANMASI Farklı derişimlerde hazırlanan toplam lipid standart çözeltileri kullanılarak derişim-absorbans grafiğini çiziniz ve eğilim çizgisini orijinden geçiriniz. 3, 4 L Eğilim çizgisinin eğimini (M, abs x g toplam lipid ) saptayınız. Absorbans artışı ( A) Toplam lipid derişimi (g/l) = Toplam lipid kalibrasyon grafiğinin eğimi (M) DOĞRUSALLIK SINIRI Toplam lipid analiz kitinin doğrusallık sınırı 6 g/l potasyum oleat saptanmıştır. olarak HASSASĐYET ve ÖLÇÜM SINIRI Toplam lipid analiz kiti 0.15 abs L/g ölçüm hassasiyetine ve 0.1 g/l ölçüm sınırı değerlerine sahiptir. Düşük oranda toplam lipid içeren örneklerde; örnek miktarı arttırılarak ve/veya analiz sürecinde düşük oranda seyreltme yapılarak analizin hassasiyeti arttırılabilir, ölçüm sınırı düşürülebilir. DOĞRULUK Toplam lipid analiz kitinin ölçüm doğruluğunu saptamak için iki farklı toplam lipid derişiminde beş tekrarlı ölçüm alınmış ve ölçümler arasındaki standart sapma değerleri hesaplanmıştır. Standart sapma (ss) değerleri kullanılarak yüzde değişim katsayısı (%DK= ss/ortalama X 100) hesaplanmıştır. Her iki toplam lipid oranı için de %DK değerinin % 5 deneysel hata sınırlarının altında kaldığı saptanmıştır. Toplam Lipid oranı (g/l) Standart Sapma % DK 6.0 ± ± Biyozim tayin kiti kullanılarak tekrarlanabilir doğru sonuçlar üretilebilmektedir. Aynı örnek için gerçekleştirdiğiniz ölçümlerde % 5 in üzerinde farklılığın olması durumunda analiz sürecinde gerçekleştirdiğiniz aşamaların gözden geçirilmesi gerekmektedir. 3 Kalibrasyon grafiğini günlük ve hazırlanan her analiz çözeltisi için yeniden çiziniz. 4 Eğilim çizgisinin korelasyon katsayısının (r 2 ) in üzerinde olması gerekmektedir. Bu değerden düşük bir korelasyon değeri elde etmeniz durumunda hazırlamış olduğunuz standart çözeltilerin hazırlanması aşamasında veya analiz aşamasında bir hata yapılmıştır. Olabilecek hataları gözden geçiriniz ve ölçümünüzü tekrarlayınız. -4-

5 5 Muhtemel hata kaynakları aşağıda verilmiştir. 1. Yanlış mikro pipet kullanımı, 2. Analiz sıcaklığının kontrolsüz olması, 3. Çözeltilerin iyi karıştırılmaması, homojen olmaması, 4. Örneğin homojen olmaması, bulanık veya renkli olması, 5. Reaksiyon ortamının temiz olmaması. UYARI-I Analiz sürecinde belirtilen inkübasyon sürelerine uyunuz ve reaksiyon ürünlerini bekletmeden bir sonraki aşamaya geçiniz veya absorbans ölçümünü yapınız. Toplam lipid reaktif renginin kahverengiye dönmesi çözeltinin bozulduğunun göstergesidir. Renk değişimi gözlenen çözeltileri kullanmayınız. Kontrol örneklerinde sonuç üretilmesi analiz reaktiflerinin bozulduğunun göstergesidir. Bu tür reaktifleri kullanmayınız. Analiz çözeltilerini çapraz-kontamine etmeyiniz. Analiz kimyasallarının ve çözeltilerinin gözle veya deriyle temasına izin vermeyiniz. Analiz kimyasallarını ve çözeltilerini herhangi bir şekilde koklamayınız ve içmeyiniz. Toplam lipid analiz kiti içerisinde derişik asit çözeltisi bulunmaktadır. Derişik asit çözeltileri kullanılırken dikkatli olunmalıdır. Vücuda temas etmesi durumunda temas eden bölge bol su ile yıkanmalıdır. UYARI-II Bu kitapçıkta; ulusal ve uluslararası yayımlarda yer alan, doğruluğu kesin olarak kabul edilmiş bilgiler yer almakta ve ürünlerimiz bu bilgiler doğrultusunda üretilmektedir. Fakat kullanım koşulları bizim kontrolümüz dışında olduğundan, analiz sonuçlarının doğruluğuyla ilgili üretici firma tarafından herhangi bir garanti verilmemektedir. -5-

6 6 EK-1 SERUM HARĐCĐ ÖRNEKLERDE TOPLAM LĐPĐD TAYĐNĐ Biyozim toplam lipid tayini kiti kullanılarak serum harici örneklerde de lipid tayini yapılabilmektedir. Analiz kitinde takip edilen sülfo-fosfo-vanillin yönteminde örneğin toplam lipid miktarı lipidin yapındaki bulunan karbonkarbon çift bağ miktarı ölçülerek saptanmaktadır. Dolayısıyla örneğin yapısında bulunan lipid bileşimine bağlı olarak kalibrasyon grafiği üretilmelidir. Uygun standart lipid bileşimine göre hazırlanan kalibrayon grafiği kullanılarak örneklerin toplam lipid miktarı, lipid ekstraksiyonu ve gravimetrik ölçümü temel alan yöntemlerle karşılaştırılabilecek düzeyde saptanabilmektedir (Knight et. al., 1972). Farklı yağ ve yağ asidi bileşimleri için üretilmiş kalibrasyon grafikleri Şekil 1 de görülmektedir. Her bir bileşim için doğrusal kalibrasyon grafiği üretilebilmektedir. Üretilen kalibrasyon grafikleri kullanılarak lipid içeriği bilinmeyen örneklerin toplam lipid içeriği saptanabilmektedir. NOTLAR Şekil 1. Farklı lipidler için sülfo-fosfo-vanillin reaksiyonu sonuçu üretilen kalibrasyon grafikleri (Knight et. al., 1972). Örnek hazırlama: Örneklerinizi hekzan içerisinde çözerek toplam lipid içeriği 6 g/l derişimin altında olacak şekilde seyreltiniz. Her bir seyretmede sonrasında karışımın homojen olduğundan emin olunuz. Analizde prosedüründe önerildiği şekilde 20 µl seyreltik standardınızdan veya örneğinizden kullanarak analizinizi gerçekleştiriniz. Örneklerinizde bir miktar bulanık olması analizinizde problem yaratmayacaktır. Bulanıklığın fazla olması durumunda santrifüj yaparak bulanıklık etmenlerinin çözeltiden uzaklaşmasının sağlayınız. Tahin ve benzeri örneklerde bulanıklığın problem yaratmadığı saptanmıştır. -6-

7 7 Analiz kitinde karbon-karbon çift bağı takip edildiği için örneğinizde lipid harici yapılarında çift bağ bulundurun bileşenler toplam lipid analiz sonuçuna girişimde bulunacaktır. Lipid harici çift bağ bulunduran bileşikleri yapısında yüksek oranda bulunduran örneklerde toplam lipid tayini yapılmadan önce bu bileşiklerin uzaklaştırılması gerekmektedir. REFERANSLAR 1. Saldamlı Đ.S. ed.: Gıda Kimyası, Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, Türkiye (1998) 2. Knight, JA et al, Clin. Chem., 19:199 (1972). 3. Jacobs, SL and Henry, RJ, Clin. Chem. Acta, 7:270 (1962). -7-

8 8 Notlar -8-