TESCİLLİ HAŞHAŞ (Papaver somniferum L.) ÇEŞİTLERİNDE TUZ STRESİNİN ANTİOKSİDANT ENZİMLER ÜZERİNE ETKİSİ. Hasan DURUKAN

TESCİLLİ HAŞHAŞ (Papaver somniferum L.) ÇEŞİTLERİNDE TUZ STRESİNİN ANTİOKSİDANT ENZİMLER ÜZERİNE ETKİSİ Hasan DURUKAN Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ 2011 Her hakkı saklıdır

T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Yüksek Lisans Tezi TESCİLLİ HAŞHAŞ (Papaver somniferum L.) ÇEŞİTLERİNDE TUZ STRESİNİN ANTİOKSİDANT ENZİMLER ÜZERİNE ETKİSİ Hasan DURUKAN TOKAT 2011 Her hakkı saklıdır

TEZ BEYANI Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim. Hasan DURUKAN

ÖZET Yüksek Lisans Tezi TESCİLLİ HAŞHAŞ (Papaver somniferum L.) ÇEŞİTLERİNDE TUZ STRESİNİN ANTİOKSİDAN ENZİMLER ÜZERİNE ETKİSİ Hasan DURUKAN Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ Papaver somniferum L. ülkemizde ticari olarak yetiştirilen önemli bir tıbbi bitkidir. Tuz stresine maruz kalan bitkilerde serbest radikallerin miktarı artmaktadır. Bitkilerde bulunan antioksidan enzimler ise bu radikalleri temizlemektedir. Bu araştırmada, ülkemizde yetiştirilen tescilli haşhaş (Papaver somniferum L. ) çeşitlerinde sera koşullarında 5 ay süresince yetiştirilen 17 tescilli haşhaş çeşitine 50 mm, 100 mm, 150 mm ve 200 mm konsantrasyonlarında tuz stresi uygulanmış bu uygulamaların katalaz (CAT), peroksidaz (POD), askorbat peroksidaz (APX) enzimleri üzerine etkileri ile kapsüllerin boyu, çapı, kapsül ağırlığı ve tohum ağırlığında meydana gelen değişimlere etkisi incelenmiştir. 50 mm, 100 mm, 150 mm tuz stresinde bitki çeşitlerinde genel olarak CAT ve POD enzim aktivitelerinde azalmalar gözlenirken, 200 mm tuz stresinde ise POD enzim aktivitesinde artış belirlenmiştir. 50 mm ve 150 mm tuz stresinde APX aktivitesinde genel olarak azalmalar gözlenmiş, 100 mm ve 200 mm tuz stresi uygulamalarında ise APX enzim aktivitesinde artmalar belirlenmiştir. Tuz stresi uygulanmış çeşitlerin kapsüllerinin boyu, çapı, ağırlığı ve tohum ağırlığı ise genel olarak azaldığı belirlenmiştir. 2011, 52 sayfa Anahtar kelimeler: Papaver somniferum L., Antioksidan enzim, Tuz stresi i

ABSTRACT M. Sc. Thesis THE EFFECTS OF SALT STRESS ON ANTIOXIDANT ENZYMES IN REGISTERED POPPY (Papaver somniferum L.) CULTİVARS Hasan DURUKAN Gaziosmanpaşa University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Assoc. Prof. Dr. İskender PARMAKSIZ Papaver somniferum L. is an important medicinal plant grown in our country. The amount of free radicals in plants subjected to salt stress increases. Antioxidant enzymes present in plants remove these radicals. In this work, salt stress concentrations of 50 mm, 100 mm, 150 mm and 200 mm were applied to 17 registered poppy (Papaver somniferum L.) cultivars grown under greenhouse conditions for 5 months and the effects of these applications were investigated on enzymes catalase (CAT), peroxidase (POD) and ascorbate peroxidase (APX), as well as on changes in capsule length and circumference, capsule weight and seed weight. In 50 mm, 100 mm, 150 mm salt stresses, CAT and POD enzyme activities in general decreased; while in 200 mm, POD enzyme activity increased. In 50 mm and 150 mm salt stresses, APX activity in general decreased; whereas in 100 and 200 mm, APX enzyme activity increased. In cultivars subjected to salt stress; capsule length, circumference and weight and seed weight decreased in general. 2011, 52 pages Keywords: Papaver somniferum L., Antioxidant enzymes, Salt stress ii

ÖNSÖZ Yüksek lisans eğitimim boyunca bilgi ve birikimleriyle her zaman yanımda olan ve tez çalışmam süresince maddi ve manevi desteğini esirgemeyen danışmanım Doç. Dr. İskender PARMAKSIZ a ve değerli Bölüm başkanımız Sayın Prof. Dr. Zekeriya ALTUNER e çalışmamızda yardımlarını esirgemeyen Sayın Doç. Dr. Lokman ÖZTÜRK e ve Araş. Gör. Dursun KISA ya, laboratuar çalışmamda emeği geçen değerli arkadaşlarım Yahya KILINÇ a, Eda ALTU ya ve Araş. Gör. Mesut KOYUNCU ya, tez çalışmamın istatistik analizinde yardımlarını esirgemeyen Sayın Doç. Dr. Ahmet ŞEKEROĞLU na, son olarak hayatım boyunca her aldığım kararın arkasında duran emek ve çabalarımı her zaman takdir eden aileme teşekkürü bir borç bilirim. Bu tez çalışması; Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projesi 2011/40 nolu Tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinde tuz stresinin antioksidant enzimler üzerine etkisi projesi tarafından desteklenmiştir. Hasan DURUKAN Kasım 2011 iii

İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET............. i ABSTRACT.......ii ÖNSÖZ......iii İÇİNDEKİLER DİZİNİ...iv SİMGE ve KISALTMALAR.vi ŞEKİLLER DİZİNİ......vii ÇİZELGELER DİZİNİ...viii 1. GİRİŞ 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ 4 2.1. Bitkilerde Tuz Stresi...4 2.2. Tuz Stresi Altında Bitkilerin Geliştirdikleri Uyum Mekanizmaları...6 2.3. Tuz Stresinin Belirlenmesinde Kullanılan Parametreler...7 2.3.1. Bitki Gelişme İndeks Değerleri...8 2.3.2. İyon Miktarındaki (Na, K ve Cl) Değişmeler ve K/Na Oranı...9 2.3.3. Yaprak Alanındaki Değişmeler...9 2.3.4. Klorofil ve Karotenoid Miktarlarındaki Değişmeler...10 2.3.5. Şeker Miktarındaki Değişimler...10 2.3.6. Osmoregülant Madde Miktarlarındaki Değişmeler...11 2.3.7. Hücre Zarında Meydana Gelen Değişmeler...12 2.3.8. Antioksidant Enzim Aktivitelerindeki Değişmeler...12 2.3.8.1. Katalaz (CAT)...14 2.3.8.2. Peroksidaz (POD)...15 2.3.8.3. Askorbat Peroksidaz (APX)...15 2.4. Papaveraceae Familyasının Genel Özellikleri...16 2.4.1. Çalışmanın Yapılmasındaki Önemi...16 2.4.2. Çalışmada Kullanılacak Papaver somniferum L. Çeşitleri...17. 3. MATERYAL ve YÖNTEM..19 3.1. MATERYAL.......19 3.2. YÖNTEM..........21 iv

3.2.1. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddeler....21 3.2.2. Çalışmada Kullanılan Cihazlar..21 3.2.3. Çalışmada Kullanılan Çözeltiler 22 3.2.3.1. Homojenat Tamponu..22 3.2.3.2. Katalaz Aktivesinin Ölçülmesi için Kullanılan Çözeltiler.22 3.2.3.3. Peroksidaz Aktivesinin Ölçülmesi için Kullanılan Çözeltiler...22 3.2.3.4. Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin Ölçülmesi için Kullanılan Çözeltiler...22 3.2.3.5. Protein Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler...22 3.2.4. Katalaz, Peroksidaz, Askorbat Peroksidaz Aktivitelerinin ve Protein... Miktarlarının Belirlenmesi için Homojenat Hazırlanması...23 3.2.5. Katalaz Aktivitesinin Belirlenmesi...23 3.2.6. Peroksidaz Aktivitesinin Belirlenmesi...23 3.2.7. Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin Belirlenmesi...24 3.2.8. Protein Miktarının Belirlenmesi...24 3.2.9. Kapsül Ağırlıklarının, Boylarının, Çaplarının ve Tohum Ağırlıklarının... Belirlenmesi..........25 3.2.10. İstatistik Analiz...25 4. BULGULAR... 26 4.1. Tuz Uygulamalarının Protein Miktarı Üzerine Etkisi.. 26 4.2. Tuz Uygulamalarının Katalaz Aktivitesi Üzerine Etkisi...... 28 4.3. Tuz Uygulamalarının Peroksidaz Aktivitesi Üzerine Etkisi.....30 4.4. Tuz Uygulamalarının Askorbat Peroksidaz Aktivitesi Üzerine Etkisi.....32 4.5. Tuz Uygulamalarının Kapsüllerin Boyları Üzerine Etkisi...34 4.6. Tuz Uygulamalarının Kapsüllerin Çapları Üzerine Etkisi...36 4.7. Tuz Uygulamalarının Kapsüllerin Ağırlıkları Üzerine Etkisi...38 4.8. Tuz Uygulamalarının Kapsüllerin Tohum Ağırlıkları Üzerine Etkisi.. 40 5. TARTIŞMA ve SONUÇ....42 KAYNAKLAR... 47 ÖZGEÇMİŞ...52 v

SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama ha Hektar bar Basınç birimi mm Milimolar kda 0 Kilodalton Santigrat derece C % Yüzde g Gram ml Mililitre μl Mikrolitre Nm Nanometre mg Miligram μmol Mikromol cm Santimetre dk Dakika UV Ultraviole Kısaltmalar Açıklama TÜİK SOD CAT POD APX GPX GR DHAR MDA TMO OSH P EU/g ROT Türkiye İstatistik Kurumu Süperoksit dismutaz Katalaz Peroksidaz Askorbat peroksidaz Glutatyon peroksidaz Glutatyon redüktaz Dehidroaskorbat redüktaz Malondialdehit Toprak Mahsülleri Ofisi Ortalamanın Standart Hatası Anlamlılık değeri Gram yaprak başına düşen enzim Radikal oksijen türevleri vi

ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 3.1. Beş aylık büyüme peryodu sonunda kasa içerisindeki haşhaş bitkiler 19 Şekil 4.1. Protein tayininde kullanılan BSA standart grafiği...26 vii

ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılacak haşhaş çeşitlerinin isimleri...20 Çizelge 4.1. Tuz stresinin tescilli (Papaver somniferum L.) çeşitlerinde ve farklı. dozlardaki toplam protein miktarı (mg/ml) üzerine etkisi......27 Çizelge 4.2. Tuz stresinin tescilli (Papaver somniferum L.) çeşitlerinde ve farklı. dozlardaki katalaz aktivitesi (EU/g yaprak) üzerine etkisi. 29 Çizelge 4.3. Tuz stresinin tescilli (Papaver somniferum) L.) çeşitlerinde ve farklı dozlardaki peroksidaz aktivitesi (EU/g yaprak) üzerine etkisi...31 Çizelge 4.4. Tuz stresinin tescilli (Papaver somniferum L.) çeşitlerinde ve farklı. dozlardaki askorbat peroksidaz aktivitesi (EU/g yaprak) üzerine etkisi...33 Çizelge 4.5. Tuz stresinin tescilli (Papaver somniferum L.) çeşitlerinde kapsüllerin. boylarına (cm) olan etkisi...35 Çizelge 4.6. Tuz stresinin tescilli (Papaver somniferum L.) çeşitlerinde kapsüllerin. çaplarına (cm) olan etkisi...37 Çizelge 4.7. Tuz stresinin tescilli (Papaver somniferum L.) çeşitlerinde kapsüllerin.. ağırlığına (g) olan etkisi......39 Çizelge 4.8. Tuz stresinin tescilli (Papaver somniferum L.) çeşitlerinde kapsüllerin. tohum ağırlığına (g) olan etkisi.....41 viii

1. GİRİŞ Bitkilerde stres; bitkinin bulunduğu ortamda çevresel etmenlerin değişmesiyle bitkinin büyümesinde, gelişmesinde ve ürün kaybında meydana gelebilecek olumsuz değişmeler olarak adlandırılır. Bitkilerde meydana gelen stres faktörleri abiyotik faktörler ve biyotik faktörler olmak üzere 2 ye ayrılır; 1. Abiyotik faktörler; a) Fiziksel faktörler; Kuraklık, Sıcaklık, Radyasyon, Su baskını, Mekanik etkiler b) Kimyasal faktörler; Hava kirliliği, Bitki besin elementleri, Pestisitler, Toksinler, Tuzlar, Toprak ph sı 2. Biyotik faktörler; Yabani bitkiler, Böcekler, Mikroorganizmalar, Hayvanlardır. Tuz stresi bitkisel üretimi azaltan, ürünlerin kalitesini düşüren, tarım alanlarına zarar veren ve yetiştiriciler tarafından istenilmeyen bir durumdur. Blum ve Jordan (1985), dünya üzerinde tarımda kullanılabilir alanların sadece % 10 unun herhangi bir çevresel stres etmeni ile karşı karşıya kalmadığını; % 26 oranında en fazla kuralık stresi, % 20 lik bir oranla bunu mineral stresine maruz kalan alanların takip ettiğini bildirmiştir. Ülkemizde tuzlu topraklar toplam 1,5 milyon ha alanı kapsamaktadır (TÜİK, 2004). Çevik (1986), Türkiye topraklarının toplam alanının 78 milyon hektar olup, bunun % 36 sının işlenebilir arazi olduğu, bu alanların % 3,2 sinin tuzluluk problemine sahip olduğunu bildirmiştir. Ülkemizde kurak ve yarı kurak bölgelerinde drenaj kaynaklarının iyi olmadığı topraklarda sulama suları ile gelen tuzlar, yağışlar ve sulama suları ile yeterli bir yıkanma sağlanmadığı durumlarda, zamanla toprakların tuzlulaşmasına neden olmaktadır (Uygan ve ark., 2006). Tuzluluk bitkilerin büyümesi ve ürünlerin miktarını sınırlandıran temel bir çevresel faktördür (Allakhverdiev ve ark., 2000: Ashraf ve ark., 2008). Yağışların düşük olması, sulamanın uygunsuz ve yetersiz yapılması, aşırı ve yanlış gübrelemeler bitkilerde tuz stresine neden olmaktadır. Tuzluluk, bitkinin morfolojisi ve anatomisini de kapsayan tüm metabolizmasını etkileyen bir faktördür (Levitt,1980). Tuzluluk stresi ile karşı

2 karşıya kalan bitkilerde genotipik özellikler çerçevesinde değişik şekillerde tepkiler oluşmaktadır. Dünyada çoğu kurak ve yarı kurak bölgelerde toprak ve su kaynakları çok miktarda tuz içermektedir. Aşırı tuz bitkiler ve ürünlerinde ozmotik etkilere, spesifik iyon toksitesine ve oksidatif strese neden olmaktadır (Munns, 2002). Toprakta yüksek konsantrasyonlarda bulunmaları tüm dünyada çeşitli ürünlerin verimlerinde büyük azalmalara yol açmaktadır (Sekmen ve ark., 2007). Bitkilerde tuz stresi; arpa, mısır ve pirinç gibi ürünlerin çoğunda sıklıkla konu olmaktadır (Sairam ve Tyagi, 2004). Bitkinin yetiştiği ortamda tuz miktarı yönünden sorunlu olması, bitkinin fazla miktarda serbest oksijen radikallerin sentezlemesine neden olur. Sentezlenen serbest oksijen radikalleri, protein membran lipitleri ve nükleik asitler ile klorofil gibi hücre komponentlerini de bozmaktadır (Yaşar ve ark., 2008). ROS birikimi membran lipitlerinin, nükleik asitlerin ve proteinlerin oksidatif hasarına neden olmaktadır (Mittler, 2002). Stres altında bitkilerde oluşan ve hücrelerinin yapısını bozan serbest oksijen radikallerini zararsız bileşiklere dönüştüren antioksidan enzim aktivitelerinin yüksek olması bitkiyi oksidatif zararlanmaya karşı dayanıklı yapmaktadır. Bitkideki kloroplastlar, toksik oksijen türevlerine karşı antioksidatif savunma sistemlerine sahip olup, bu antioksidanların başında vitamin E, vitamin C, glutatyon ve karotenoidler (beta-karoten ve zeaksantin) gelmektedir (Karanlık, 2001). Oksidatif stresin etkilerini en aza indirmek için, bitki hücrelerinde gelişmiş karmaşık bir antioksidan sistem vardır, bu düşük moleküler ağırlıklı antioksidan yapı aktif oksijen türevlerini süperoksit dizmutaz (SOD), katalaz (CAT), askorbat peroksidaz (APX), glutatyon peroksidaz (GPX) ve glutatyon redüktaz (GR) gibi enzimlerle temizlemektedirler (Apel ve Hirt, 2004). Bazı çalışmalarda tuza tolerant türlerin antioksidan enzim ve antioksidan içeriklerini artmasıyla tuza cevap verdiği ama tuza duyarlı türlerin bunu yapamadıkları belirtilmiştir (Shalata ve ark., 2001; Demiral ve Türkan, 2005). Tuzlu toprakların yeniden tarıma kazandırılması oldukça zor ve masraflı olduğu için bu alanlarda çalışan araştırmacılar için tuza karşı tolerant bitkilerin yetiştirilmesi önem kazanmıştır. Bitkilerin tuzlu ortamlarda Na + ve Cl - iyonlarını en az oranda bünyelerine

3 alma istekleri ve K + veya Ca 2+ iyonlarına olan oranı toleransın belirlenmesinde kullanılan bir parametredir. Khan ve Panda (2008), tuz stresine bağlı olarak Na/K oranının tuza hassas genotiplerde, toleranslı genotiplere göre daha fazla olduğunu bildirmişlerdir. Tuz toleransı, bitki çeşitlerine göre değişmektedir. Levitt (1980) in açıkladığı iki farklı mekanizma, Marschner (1995) tarafından daha sonra geliştirilerek anlatılmıştır. Buna göre, eğer bir bitkide tuzdan sakınım (exclusion) ve tuzu kabullenme (inclusion) mekanizmalarından birisi iyi gelişmiş ise, bu bitki genotipinin tuza toleransı yüksek olmaktadır. Tuzdan sakınım mekanizmasına sahip olan bitkiler dış ortamda bulunan tuzun alınmasını engelleyen bir sisteme sahip olmakta ve oluşabilecek toksiteyi engellemektedir. Tuzu kabullenme mekanizmasında ise bitki dış ortamdan iyonları alsa bile doku toleransı sayesinde oluşabilecek toksiteden etkilenmemektedir. Ülkemiz çoğrafik konumu sayesinde bitki çeşitliliği yönünden dünyanın en zengin ülkelerinden biridir. Dünyada haşhaşın üretim alanının büyük çoğunluğu Hindistan ve Türkiye de yapılmaktadır. Haşhaş ülkemizde yetiştirilen önemli kültür bitkilerinden biridir. Dünyada Papaver cinsine ait yaklaşık 110 türün (Kapoor, 1997) ülkemizde ise 50 taksonunun bulunduğunu bildirmişlerdir (Güner ve ark., 2000). Bu tez çalışmasının amacı ülkemizin doğal florasında değişik bölgelerde yetiştirilen 17 tescilli haşhaş (Papaver somniferum L.) çeşitlerinde farklı tuz stresinde antioksidan enzim aktiviteleri ve kapsüllerinin boyu, çapı, ağırlığı ve tohum ağrılıkları üzerine etkisi araştırılmıştır. Çalışmadan elde edilecek sonuçların, ileride gerçekleştirilecek Papaver somniferum L. genetiği ve ıslahı çalışmalarına yardımcı olmasının yanında; ülkemizde ilk çalışma olması nedeniyle özgün değer taşımaktadır.

2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1. Bitkilerde Tuz Stresi Tuz stresi yağışların az olduğu kurak ve yarı kurak bölgelerde meydana gelen ve üretimi engelleyen bir abiyotik stres faktörüdür. Yağışlı bölgelerde topraktaki çözünebilir tuzlar, yağışlarla toprak içerisinde aşağıya doğru hareket ederek yer altı sularına ve daha sonra akarsularla denizlere taşınırlar. Bu nedenle tuzlulaşma olayı yağışlı bölgelerde rastlanmaz bununla birlikte, bu bölgelerde de tuzlanmaya deniz kıyısındaki ırmak deltalarında ve denize yakın alçak arazilerde yer alan topraklarda rastlanır (Gökoğlu, 2005). Toprakta bulunan tuz miktarı bitki için gerekli olan miktarın üzerine çıktığında bitkinin büyümesi ve gelişmesinde bozukluklara, ürünlerinde nitelik ve nicelik kayıplarına neden olur. Tuz konsantrasyonu kullanılabilir su potansiyelini düşürmeye yetecek kadar olduğunda (0,5-1,0 bar) bitki strese girer ki, bu da tuz stresi olarak adlandırılır. (Levitt, 1980). Tuzluluk sorunu denildiğinde en fazla zararlı etkiyi yapan ve en yaygın iyonlar olan Na + ve Cl - iyonlarının toprakta yüksek düzeylerde bulunduğu anlaşılmaktadır (Munns ve Termaat, 1986). Tuzluluk sorununa neden olan bileşikler klorürler (NaCl, CaCl, MgCl ), sülfatlar (Na SO, MgSO ), nitratlar (Na NO, KNO ), karbonatlar ve 2 2 2 4 4 2 3 3 bikarbonatlar (CaCO, Na CO, NaHCO ) ve boratlardır. Ancak genelde toprak 3 2 3 3 tuzluluğu ve tuz stresi denildiğinde NaCl ün varlığından söz edilmektedir (Munns ve Termaat, 1986). Bitkilerde tuz stresi 3 şekilde ortaya çıkmaktadır; 1. Kök bölgelerindeki düşük su potansiyeli, 2. Na + ve Cl - gibi iyonların toksik etkiye sahip olması, 3. Besin alınımında ve taşınımında meydana gelen dengesizlikler (Munns ve Termaat, 1986; Lauchli, 1986; Marschner, 1995).

5 Bitkinin gelişimini sürdürdüğü ortamda su potansiyeli açısından yetersiz olması bitkiyi strese sokmaktadır. Tuz stresinde de kuraklık stresine benzer şekilde olup bitki büyümesi ve gelişmesi için gerekli olan suyu ortamdan alamaz. Bunun asıl nedeni ortamda bitkinin ihtiyacı olan miktardan fazla çözünmüş tuzun hücreye girmesidir. Tuzlu topraklarda ozmotik dengesizlik ve kök bölgesi su potansiyelindeki düşüşe bağlı olarak bitkinin su ve besin elementlerini alması engellenmektedir (Yakıt, 2005). Bitkiler kök bölgesinde artan ozmotik potansiyel nedeniyle gerekli olan suyu yeterli miktarlarda alamazlar. Ozmotik stres sodyum iyonlarının direkt bir etkisi olmaksızın su eksikliğinden kaynaklanmaktadır (Munns, 2002). İyonik dengesizlik aşırı miktarda Na + ve Cl - birikiminden kaynaklanmakta ve K +, Ca 2+, Mn 2+ - ve NO gibi besin 3 elementlerinin alınımını azaltmaktadır (Hasegawa ve ark., 2000; Viegas ve ark., 2001). Tuz stresine maruz kalmış bitkilerde toksiteye sebep olan Na + katyonundaki artış K + katyonunun alınımını, Cl - - miktarındaki artış NO alınımını engeller (İnal ve ark., 3 1995). Tuz stresine maruz kalmış bitkide Na + katyonunun hücreye girmesiyle Ca 2+ ve K +, elementleriyle rekabete girmekte ve hücrelerdeki Na/K ve Na/Ca dengelerini bozmaktadır. Na + katyonun hücreye girmesi aynı zamanda K + ve Ca 2+ katyonlarının hücreye alınmasını da engellemektedir. Tuz stresine maruz kalmış bitkilerde Na/K dengesinin bozulmasıyla beraber bitki bulunduğu ortamdan yeterli miktarda suyu alamamaktadır. Hücreye potasyum katyonunun alınamaması bitkinin su alımını engellediği için bitkiyi kuraklık stresine sokmaktadır. Bitkide su dengesini sağlanmasını sağlayan potasyum bu açıdan çok önemlidir. Bitkiye bu gibi stres durumunda uygulanacak potasyum ilavesi bitkinin stres durumundan etkilenirliğini azaltmaktadır. Potasyum alımına bağlı olarak ozmotik potansiyel artmakta ve hücrelere fazla miktarlarda su alımı gerçekleşmektedir. Stoma hücrelerini açılıp kapanma mekanizmasıda potasyum ile doğru orantılı olarak çalışmaktadır. Potasyum miktarının stoma hücrelerinde birikmesiyle hücrelere su girişi olmakta, potasyum azalmasıyla birlikte hücrelerde nişasta ve şeker birikmesiyle oluşan su potansiyelinin artmasına dayanmaktadır.

6 Sodyum iyonları köklerden pasif olarak hücreye girmektedir. Bitkide toksiteye neden olduğundan dolayı hücrede tonoplast zarlarında bulunan tonoplastlardaki H + pompalarıyla atılmaktadır. Sodyum iyonlarının hücreler arası dokularda birikmesi metabolizması için toksiktir ve topraktaki Na + miktarının aşırı düzeyde olması bitkide büyüme inhibisyonunda rol oynamaktadır (Mengel ve Kirkby, 2001). Bu sebepten dolayı sodyum iyonları vakuollerde depo edilmektedir. Bitkinin birçok organeli üzerinde Na + iyonları olumsuz etkide bulunmakta olup, bitkide hem floem, hem de ksilem iletim demetlerinde hareket edebilme yeteneğinde olduğu için bu etki ilk önce yaşlı yaprak uçlarında görülmeye başlanır, yaprak ayası ve sapına doğru ilerleyerek nekrotik lekelere kadar dönüşen semptomlar vermektedir (Mer ve ark., 2000). Tuzluluk, diğer abiyotik stres faktörlerinden olan yüksek ve düşük sıcaklık, kuraklık ve mineral element eksikliğinden kaynaklanan stres faktörlerinde olduğu gibi bitkilerde karbon metabolizmasını ve elektron taşınım aktivitesini engellemektedir (Sreenivasulu ve ark., 2000). Sayed (2003), tuz stresinin fotosentez etkinliğini azalttığını bildirmiştir. Bitki dokularında toksik iyonların birikmesi membran geçirgenliklerini etkilemektedir (Gupta ve ark., 2002). Tuz stresini artmasıyla beraber fotosentezde gözlemlenen azalmalar fotosentetik pigmentlerin ve protein konsantrasyonundaki azalmalarla ilişkilidir. Tuz stresi altında bitkiler su kaybını önlemek için stomalarını kapatmakta, böylece CO gazının girişi engellenmektedir. Bunun sonucu olarak CO fiksasyonu 2 2 azalmaktadır (Sreenivasulu ve ark., 2000). Tuz stresi altında net CO fiksasyonunun 2 azalması; su noksanlığı, stomaların kapanışı, apoplastta tuzun birikmesi ve mezofil hücrelerinin turgoru kaybetmesi veya tuz iyonlarının doğrudan toksisitesi nedeniyledir (Yaşar, 2003). 2.2. Tuz Stresi Altında Bitkilerin Geliştirdikleri Uyum Mekanizmaları Bitkiler bulundukları çevrede bir çok biyotik ve abiyotik stres etmeniyle karşılaşmaktadır. Stres şartlarında bitki yaşantısını sürdürebilmek için savunma mekanizmaları geliştirerek ortama uyum sağlamaya çalışmaktadır. Stres şartlarına

7 toleransı fazla olan bitkiler bu gibi durumlardan çok az etkilenirken, toleransı az olan bitkiler ise yaşantılarını sürdürememektedir. Bitkiler stres şartlarına uyum mekanizmalarını etkileyen en önemli etmenler; bitkinin bulunduğu gelişme dönemi, tuzun miktarı ve uygulanması süresidir. Nerson ve Paris (1984), kavunların farklı dönemlerde yapmış oldukları çalışmada çimlenme döneminde iyi sonuç veren kavun tohumlarının fide döneminde aynı şekilde iyi sonuçlar vermediğini belirlemişlerdir. Levitt (1980), tuz stresine maruz kalan bitkiler dayanıklılığı, tuzdan sakınım ve tuza tolerans mekanizmalarıyla kontrol edildiğini bildirmiştir. Bitkiler köklerinde bulunan tuz iyonlarını gövdeye ve yapraklara göndermeyerek tuza karşı tolerans göstermektedir. Bitki stres şartlarında tuzun alınmasını hücre zarı geçirgenlikleriyle engel olabileceği Na + pompaları yardımıyla Na + iyonlarının sitoplazmadan dışarıya atılması, bitkideki Na + miktarının tolere edilebilir sınırlar içerisinde kalmasını sağlayabilmektedir (Yang ve ark., 1990). Sodyum iyonlarının vakuollerde biriktirilmesiyle olabilecek zararlı etkenlerden kaçınılması (Tattini ve ark., 1994) veya birim hacimde tuzun hızlı büyümeyle bünyesinden seyreltilmeside görülen diğer mekanizmalardandır. Tuz stresinde maruz kalmış bitkiler bulundukları ortamlarda artan iyon alımları nedeniyle ihtiyacı olan suyu ortamda bulunmasına rağmen alamamaktadır. Artan iyon alımlarıyla ozmotik stresin giderilmesi ve böylece hücre turgorunda azalma olmadan bitkinin gelişmesini sürdürebilmesine ozmotik uyum adı verilmektedir (Rains, 1972). Stres koşullarında bitkiler hücrelerinde bulunan su miktarlarını azalttıklarında bitkiye su girişi gerçekleşmektedir. Ozmotik uyum, Hellebust (1976) a göre, bitkilerin K + ve Na + gibi bazı inorganik iyonlar ya da gliserol, sukroz, prolin, betain gibi bazı organik iyonları biriktirebilme yeteneği olarak tanımlanmaktadır. Böyle durumlarda bitkilerde sukroz, prolin ve betain gibi organik maddelerin artışı olmaktadır. 2.3. Tuz Stresininin Belirlenmesinde Kullanılan Parametreler Bitkilerin tuzlu şartlarda Na + iyonu yerine K + veya Ca 2+ iyonlarını tercih etmelerini sağlayan seçicilik özelliğinin gelişmiş olması ve buna baplı olarak ölçülen yüksek K/Na ve Ca/Na oranları, tuza tolerant genotip seçimlerinde kullanılabilecek güvenilir bir

8 parametre olarak karşımıza çıkmaktadır (Maathuis ve Amtmann, 1999). Tuza tolerantlık bitki türleri arasında değişen hatta aynı türler arasında bile farklı gösteren bir özelliktir. Tuza tolerant transgenik bitkilerin elde edilmesi araştırmacılar tarafından hedefleniyor olmasına rağmen tolerantlığı sağlayan genlerin fazla sayıda olması bu durumu güçleştirmektedir. Tuza tolerans, diğer abiyotik stres konularından olan kuraklık, yüksek veya düşük sıcaklık, don zararına göre üzerinde daha fazla çalışmanın yapıldığı bir konudur (Aktaş, 2002). Yapılan birçok araştırmada tuza karşı toleransın belirlenmesinde genellikle kullanılan parametreler şunlardır; 1. Bitki gelişme indeks değerleri (Bitki boyu, taze ve kuru ağırlıkları) 2. İyon miktarındaki (Na, K ve Cl) değişmeler ve K/Na oranı 3. Yaprak alanındaki değişmeler 4. Klorofil ve karotenoid miktarlarındaki değişmeler 5. Şeker miktarındaki değişmeler 6. Prolin, glisin ve betain gibi osmoregülant madde miktarındaki değişmeler 7. Hücre zarındaki meydana gelen değişmeler (iyon sızıntısı veya lipid peroksidasyon ürünü olan MDA miktarındaki değişmeler) 8. Antioksidant enzim aktivitelerindeki değişmeler 2.3.1. Bitki Gelişme İndeks Değerleri Tuz stresi altındaki bitkilerde köklerin su alma yeteneklerinde önemli azalmalar meydana geldiğinden, kök gelişimi ve gövde uzaması gibi faaliyetlerde gerileme görülmektedir. Stres altındaki bitkilerin gövde çapları azaldığı gibi boyları da kontrole göre küçük kalmaktadır (Yakıt, 2005). Stres altındaki bitkilerin sürgün ve köklerinin kuru ağırlıklarında azalmalar olmaktadır. Tuz stresine maruz kalan bitkilerde yaş ve kuru ağırlıkları devamlı olarak azalmaktadır (Chartzoulakis ve Klapaki, 2000). Çiçek ve Çakırlar (2002), tuz stresine maruz bırakılan mısır bitkisinde yapmış oldukları çalışmada bitki boyu, nispi su içeriği ile toplam yaş ve kuru ağırlıklarında azalmalar belirlemişlerdir. Kuşvuran (2004), yapmış olduğu çalışmada tuz uygulama süresi

9 arttıkça bitki ağırlıklarında tuza dayanım düzeyini belirlemede daha etkin bir parametre olacağını belirtmiştir. 2.3.2. İyon Miktarındaki (Na, K ve Cl) Değişmeler ve K/Na Oranı Bitkilerde stres koşullarında K/Na oranı tuza tolerantlığın değerlendirmesinin yapıldığı bir parametredir. Tuz stresine maruz kalan bitki ortamda aşırı miktarda Na + ve Cl - iyonlarını almaktadır. Azevedo Neto ve ark. (2004) ın mısır bitkisinde yapmış oldukları çalışmada yaprak ve köklerde Na + içeriği arttıkça K + içeriğini azaldığını bildirmişlerdir. Bitkilerde K + içeriğindeki kayıplar hücreleri fiziksel ve biyokimyasal zararlara uğratarak tuz toksitesinin ana nedeni olduğunu bildirmiştir (Shabala ve ark., 2006). Tuz konsantrasyonunun yüksek olduğu yetiştirme ortamlarında bitkiler aşırı miktarda Na + iyonunu hücreye almaktadır. Na + iyonuna iyonik çapları ve elektriksel yükleri nedeniyle büyük benzerlik gösteren K + iyonunun alımı bu nedenle tuzlu koşullarda engellenmektedir (Kuşvuran ve ark., 2008). Kavun genotiplerinin bazılarında Na + iyonu alımındaki artışlarla birlikte K + iyonu alımında azalmalar ortaya çıktığı halde, tuza yüksek düzeyde duyarlılık gösteren genotiplerin bulunduğu bazılarında tuz stresi altındaki bitkilerdeki K + iyonu miktarları, kontrol bitkilerine göre fazla bulunmuştur (Kuşvuran ve ark., 2008). Çiçek ve Çakırlar (2002), mısır bitkisinde yapmış oldukları çalışmada tuz uygulanmasında Na + ve Na/K oranlarında artma olduğu rapor etmişlerdir. İnal ve ark. (2009), havuçta yapmış oldukları çalışmada tuz stresi altında Na + iyonun yüksek seviyede, K + iyonunun ise düşük seviye kaldığını bildirmişlerdir. 2.3.3. Yaprak Alanındaki Değişmeler Tuz stresine maruz kalan bitkiler ortamdan suyu almaması nedeniyle bünyedeki suyu muhafaza etmek amacıyla fotosentez etkinliği azaltmaktadır. Munns ve Termaat (1986), tuz stresinden en fazla etkilenen organların yapraklar olduğunu bildirmişlerdir. Yaşar (2003), tuz stresi altındaki bitkilerde stomalar kapatılmakta, yaprak alanları da küçülerek transpirasyon azaltılmaya çalıştığı bildirmiştir. Böylece bitki su kaybını en aza indirmek ve topraktan su ile birlikte yüksek miktardaki tuzun alınmasını

10 engellemeye gayret etmektedir. Tuz stresi uygulanan bitkilerde genel olarak yaprak alanları kontrol gruplarına göre daha küçük olmaktadır. Tuz stresi altında yaprak alanı ve generatif evreye geçişte çiçeklenme ve meyve verimi de olumsuz etkilenir (Yakıt, 2005). 2.3.4. Klorofil ve Karotenoid Miktarlarındaki Değişmeler Tuz stresine maruz kalan bitkilerde fotosentez etkinliğinde azalmaya neden olmaktadır (Sayed, 2003). Fotosentezdeki bu azalmaların temel nedenleri tuzların toksiteye neden olması ve stomaların kapanması nedeniyle CO miktarındaki azalmalar 2 gösterilmektedir. Tuz stresi altında net CO fiksasyonunun azalması; su noksanlığı, 2 stomaların kapanışı, apoplastta tuzun birikmesi ve mezofil hücrelerinin turgoru kaybetmesi veya tuz iyonlarının doğrudan toksisitesi nedeniyledir (Yaşar, 2003). Bitkilerin tuz stresi altında yaprak dokusundaki total klorofil ve karotenoid içeriği genellikle azalmaktadır (Agastian ve ark., 2000). Klorofil içeriği tuz stresi altındaki bitkilerde olumsuz şekilde etkilenmektedir. Tuz stresi altında genel metabolik faaliyetlerin aksaması, başta Ca ve K olmak üzere N, P ve Mg gibi makro besin elementlerinin alınımlarında kısıtlanma gibi faktörler klorofil aktivasyonunu olumsuz etkiler (Yakıt, 2005). Turan ve ark. (2007), mercimek türlerinde yapmış oldukları çalışmada mercimek fidelerinde toplam klorofil içeriğinin tuz uygulamalarında kontrol grubuna göre önemli düzeyde azaldığını bildirmişlerdir. 2.3.5. Şeker Miktarındaki Değişimler Glukoz, fruktoz, sukroz, trehaloz ve fruktanlar gibi şekerler ve nişasta tuz stresine maruz kalan bitkilerde birikmekte ve ozmotik koruma, ozmotik düzenleme, karbon kaynağı ve radikal temizleyicisi gibi fonksiyon görmektedir (Parida ve ark., 2002). Strese maruz kalan bitkilerde genel olarak şeker miktarları yüksek seviyede nişasta ise fotosenteze bağlı olarak düşük düzeyde olmaktadır. Toplam çözünebilir şeker içeriği sorgum bitkisinde tuzluluğun artışına bağlı olarak artmaktadır (Ibrahim, 2004). Tuz

11 stresine karşı yanıt olarak çözünebilir şekerlerin birikmesindeki belirgin değişimler, bir tür içerisinde veya türler arasında ve hatta tüm hatlar arasında tuza tolerans açısından farklılıkların ifade edilmesi için önemli bir kanıt olabilmektedir (Ashraf ve Harris, 2004). 2.3.6. Osmoregülant Madde Miktarlarındaki Değişmeler Osmoregülatör sistem, bitki stres faktörüyle karşılaştığında hücrelerin ozmotik potansiyellerini arttırarak ortamdaki suyun bünyeye alınmasını sağlamaktadır. Stres faktörlerinin artmasıyla birlikte bitkide osmoregülatör sistem buna cevap veremez bu gibi durumlarda bitki strese girmektedir. Strese girmiş durumlarda bitkilerde prolin, glisin ve betain gibi aminoasitler sentezlenmektedir. Tuz stresi altındaki birçok bitki çeşitinde prolin içeriğinde önemli artış gözlenmiştir (Delauney ve Verma, 1993). Prolin, tuz stresi gibi bir çok stres etmeni altında sentezlenen ve ozmoregülatör sistemin önemli bir organik maddesidir. Prolin ilavesinin ortama ilave edilmesi bitkiyi stres şartlarını tolere etmesi açısından önemlidir. NaCl teşvikli oksidatif stresin bir sonucu olarak glisinbetain birikmekte ve tuza tolerans mekanizmalarının stimulasyonuna katkıda bulunmaktadır (Demiral ve Türkan, 2006). Glisinbetain arpa, mısır, sorgum, pirinç, domates, patates, ıspanak, havuç ve Cezayir menekşesi gibi bir çok bitki türünde tuz stresine cevap olarak artmaktadır (Demiral ve Türkan, 2006). Güneş ve ark. (1997), yapmış oldukları çalışmada buğday bitkisinde tuz uygulamasının prolin miktarını artırdığı tespit etmişlerdir. Alian ve ark. (2000), tuz stresi uygulanmış oldukları domates bitkisinde prolin artışı ile tuzluluk arasında bir ilişki bulamadıklarını ifade etmişlerdir. Taban (1999) mısır bitkisinde yapmış olduğu çalışmada tuza toleransı olan bitkilerde Cl - iyonları az, prolin miktarının ise fazla olduğunu bildirmiştir. Çiçek ve Çakırlar (2002), mısır bitkisinde yapmış oldukları çalışmada tuz stresine maruz bırakılan bitkide prolin, Na ve Na/K oranlarında artış olduğunu tespit etmişlerdir.

12 2.3.7. Hücre Zarında Meydana Gelen Değişmeler Stres şartlarında kalan bitkilerin bünyelerinde serbest oksijen türevlerinin arttığı araştırıcılar tarafından bildirilmiştir (Gossett ve ark., 1994; Sreenivasulu ve ark., 2000). Stres şartlarında ortamda artan radikal oksijen türevleri (ROT) hücrelerin yapısını bozarak doku hasarlarına neden olmaktadır. Aktif oksijen türevleri membran lipidlerinin peroksidasyonuna neden olmakta ve hücre zarında hasara yol açmaktadır (Sreenivasulu ve ark., 1999). Lipid peroksidasyonu sonucunda açığa çıkan malondialdehit in miktarı, oksidatif zararın en kolay göstergesidir (Zhang ve Kirkham, 1996). Hücre zarı hasarı göstergesi olan lipid peroksidasyon ürünü MDA miktarı, tuz stresi altında hassas genotiplerde artış göstermiş; buna karşılık klorofil miktarlarında değişen oranlarda kayıplar meydana gelmiştir. Hücre zarlarındaki tahribat sonucunda lipidlerin oksidasyonu sonucunda ortaya çıkan bir ürün olan MDA miktarının belirlenmesi, çeşidin strese karşı gösterdiği tepki hakkında bilgi verebilir. MDA birikimi, iyon sızması (relative leakage ratio=rlr) ile paralellik göstermektedir (Kuşvuran ve ark., 2008). Yaşar (2003), tuza toleransı yüksek patlıcan bitkisinde yaprak dokularında MDA miktarının duyarlı çeşitlere göre daha düşük olduğunu belirlemiştir. Karanlık (2001), buğdayda bitkisinde yapmış olduğu çalışmada tuza tolerantın yüksek olduğu bitkilerde düşük MDA miktarı ve daha az lipid peroksidasyonu olduğunu belirlemiştir. 2.3.8. Antioksidant Enzim Aktivitelerindeki Değişmeler Stres altındaki canlıların genelinde olduğu gibi bitkilerde de stres karşısında serbest oksijen radikallerini zararsız bileşiklere dönüştüren antioksidan miktarları ve antioksidan enzim aktiviteleri yüksek olduğunda, o bitkiler oksidatif zararlanmaya karşı daha dayanıklı olmaktadırlar (Yaşar ve ark., 2008). Antioksidanlar, hem doğrudan hem de dolaylı olarak ilaçların, kanserojenlerin ve bazı toksik radikal reaksiyonlarının istenmeyen etkilerine karşı hücreleri koruyan maddelerdir. Vitamin C, E, A, beta-karoten, metallotionin, poliaminler, melatonin,

13 NADPH, adenozin, koenzim Q-10, ürat, ubikinol, polifenoller, flavonoidler, fitoöstrojenler, sistein, homosistein, taurin, metiyonin, s-adenozil-l-metiyonin, resveratrol, nitroksidler, GSH, bu gruba giren antioksidanlar arasındadır (Mercan, 2004). Antioksidan enzimlerin seviyesindeki değişimler tuza tolerantlıkta parametre olarak kullanılabileceğini bildirmişlerdir (Demiral ve Türkan, 2005). Süperoksit dismutaz (SOD), askorbat peroksidaz (APX), glutatyon redüktaz (GR), katalaz (CAT) gibi enzimler serbest oksijen radikallerinin yok edilmesinde en etkin antioksidatif enzimler olarak bilinmektedirler (Çakmak ve Marschner, 1992; Gossett ve ark., 1994). Gossett ve ark. (1996), yapmış oldukları çalışmada pamuk (Gossypium hirsutum L.) bitkisinin kontrol ve NaCl toleranslı hücre hatlarında 150 mm NaCl stresi uygulanmasının gruplarda meydana gelen antioksidan tepkileri araştırmışlardır. Araştırma sonucunda NaCl uygulanmış gruplarda tuzun zararlı etkilerinden kurtulmak için APX, CAT, POD ve GR gibi antioksidan enzim aktivitelerinin arttığını bildirmişlerdir. Yaşar (2003), yapmış olduğu çalışmada 38 farklı patlıcan genotiplerinin tuza tolerans yeteneği ve antioksidan enzim aktiviteleri arasındaki ilişkiyi incelemiştir. Patlıcan genotipleri su kültürü kullanılarak yetiştirilmiş ve 150 mm NaCl ile strese sokulmuştur. Araştırma sonucunda patlıcan genotiplerinde in vivo ve in vitro şartlar altında SOD, CAT, GR ve APX enzim aktivitelerinde artış olduğunu tespit etmişlerdir. Yaşar ve ark. (2006), Cucumis melo L. çeşitlerinden 4 yerli çeşit Besni, Yuva, Midyat ve Şemame ile 3 çeşit Ananas, Galia C8 ve Galia F1 kavunlarda tuz stresinin vermiş oldukları antioksidan enzim aktivitelerini ve askorbik asit seviyelerini araştırmışlardır. Araştırma sonucunda APX enzim aktivitesinin artış gösterdiği, tuza tolerant olan genotiplerde bu artışın hassas genotiplere oranla daha yüksek olduğunu ve GR enzim aktivitesinin ise bütün çeşitlerde arttığı tespit etmişlerdir. Shalata ve Tal (1998), kültür çeşidi Lycopersicon esculentum ve yabani toleranslı Lycopersicon pennelii çeşitlerinde yapmış oldukları çalışmada 100 mm tuz stresi altında antioksidan enzim aktivitelerindeki değişimleri incelemişlerdir. Lycopersicon

14 pennelii çeşitinde lipit peroksidasyonu, CAT ve GR aktivitesi düşük bulunmuştur. Lycopersicon esculentum çeşitinde SOD, CAT ve APX aktivitesinin arttığı ve GR aktivitesinin ise azaldığını belirlemişlerdir. Yaşar ve ark. (2008), tuz stresinin karpuzda antioksidatif enzim aktivitesi üzerine etkisini araştırmıştır. Karpuz yapraklarında antioksidatif enzim aktivitelerini belirlemek için yürütülen çalışmada tuza duyarlı Golden Crown F1, Crimson Sweet ile tuza tolerant Diyarbakır ve Midyat yerel genotiplerinin fideleri su kültüründe test edilmiştir. Fideler 4-5 yapraklı dönemlerinde 10 gün süreyle 100 mm NaCl stresine maruz bırakılmıştır. Tuz uygulanan gruplarda, tuza tolerant genotiplerin SOD, CAT, APX ve GR enzim aktivitelerinin duyarlı olanlara göre çok yüksek olduğu saptanmıştır. Azevedo Neto ve ark. (2006), tuza duyarlı (BR5011) ve tuza toleranslı (BR5033) mısır genotiplerinin yapraklarında ve köklerinde 100 mm tuz stresi uygulanmış antioksidan enzimler ile lipid peroksidasyon aktiviteleri araştırılmıştır. Araştırma sonucuna göre tuz stresi altında yapraklarda SOD, APX, GPX ve GR aktiviteleri kontrole göre artış göstermiştir. Tuz stresi altında tuza hoşgörülü çeşitlerde katalaz enzim aktivitesinde anlamlı bir değişiklik olmamıştır. Tuza duyarlı çeşitlerde ise katalaz enzimi önemli derecede azalmıştır. Tuza dayanıklı genotiplerin köklerinde SOD ve CAT aktivitesinin düştüğü; APX, GPX ve GR aktivitelerinin ise kontrolle aynı kalmıştır. Tuza duyarlı genotiplerin köklerinde ise bütün enzim aktiviteleri azalmıştır. Rahnama ve ark. (2003), 4 farklı patates bitkisinde yapmış oldukları çalışmada 0, 50 mm, 100 mm ve 150 mm tuz stresi uygulanıp antioksidan enzim aktiviteleri araştırılmıştır. Patates bitkisinin tuz stresi altında POD ve CAT aktivitelerinde artış gösterip, SOD ve APX aktivitelerinde azalmalar olduğunu bildirmiştir. 2.3.8.1. Katalaz (CAT) (E.C.1.11.1.6) Stres şartlarında reaktif oksijen türevlerine karşı üretilen bir antioksidan enzim çeşitidir. Katalaz enzimi (CAT), konsantrasyonu yüksek olan hidrojen peroksitin (H 2 O 2 ) su ve oksijene kadar parçalanmasını sağlar. Bu enzim yapısında prostetik grup olarak porfirin

15 içerir ve molekül ağırlığı yüksek olan bir enzimdir. Katalaz genellikle bitkilerin yaprak, kotiledon ve kök hücrelerinde peroksizom ve glioksizomlarında bulunur. Bundan farklı olarak ise mısırda bulunan CAT III ise hücrelerin mitokondrilerindedir (Öztürk, 2002). Katalaz enziminin ana fonksiyonu, moleküler oksijen varlığında hücre metabolizmasının bazı basamaklarında sentezlenen, radikal özellikli hidrojen peroksit veya ROOH gibi herhangi bir peroksitin radikal özelliğini gidererek oluşturabilecekleri geri dönüşümsüz hasarların önüne geçmektir. Zira hidrojen peroksit, singlet oksijen ve hidroksil radikalinin (OH - ) potansiyel bir kaynağıdır (Öztürk, 2002). 2.3.8.2. Peroksidaz (POD) (E.C.1.11.7) Peroksidaz enzimleri, hidrojen peroksit substratını kullanarak pek çok organik ve inorganik maddenin oksidasyonunu katalizleyen enzim grubudur. Peroksidazların molekül ağırlıkları genellikle 35-100 kda arasında değişmektedir. Peroksidaz enzimleri, fenoller, hidrokinonlar, hidrokinoidaminler (yalnızca benzidin türevi olanlar) gibi pek çok sayıda aromatik komponentlerin dehidrojenasyonlarınıda katalizlemektedirler. Peroksidazlar, çeşitli aromatik bileşikleri substrat olarak kullanarak metabolizmanın sonucunda meydana gelen hidrojen peroksiti etkisiz hale getirirler (Öztürk, 2002). 2.3.8.3. Askorbat Peroksidaz (APX) (E.C.1.11.1.11) Askorbat peroksidaz hücrelerde meydana gelen fizyolojik olaylar sonucunda ortaya çıkan hidrojen peroksitin hasarlarını ortadan kaldırır. Bu enzim baskın olarak sitoplazmada, mitokondrilerde ve kloroplastlarda bulunur. Askorbat peroksidaz, hidrojen peroksiti nötralize etmek için askorbatı bir elektron vericisi olarak kullanır. Bu enzim askorbat-glutatyon döngüsündeki ilk enzimdir. Askorbat peroksidaz hidrojen peroksitin suya redüksiyonunu katalizler ve bir redüktant olarak askorbata karşı yüksek bir afinitesi ve spesifikliği vardır (Asada, 1999).

16 2.4. Papaveraceae Familyasının Genel Özellikleri. Ülkemizde bitki çeşitliliği yönünden çok zengin bir ülkedir. Bunun temel nedenleri; iklim farklılıkları, topografik çeşitlilikler, jeolojik çeşitlilikler, deniz, göl, akarsu gibi değişik su ortamı çeşitlilikleri, yükseklik farklılıkları ve ekolojik farklılıklardır (Atalay 1994; Çelik, 2003). Ülkemizde haşhaş elde edilen tohum, yağ ve alkoloidler açısından önemli bir kültür bitkisidir. Genellikle tek yıllık, iki yıllık ve çok yıllık bitkilerdir. Bazı varyeteler tohumlarında % 50 ye varan yağ içerir, bu yağlar oleik ve linoleik asit formundadır. Bu yağlar yüksek miktarlarda doymamış yağ asitleri içerdiklerinden insanların tüketimi için oldukça kalitelidir (Özcan ve Atalay, 2006; Parmaksız ve Özcan, 2011). Modern tıpta analjezik ilaç ve öksürük ilacı olarak kullanılmaktadır (Peter, 2001; Unver ve ark., 2010). Papaveraceae familyası üyelerini yaprakları alternan dizilişli ve genellikle tüylü, tohumları çok sayıda ve küçük, embriyoları bol etlidir. Meyveleri ise çok sayıda ve kapsül içerisinde bulunmaktadır. Bitkiler tuz stresine maruz kaldıklarında stresten dolaylı bir etkisi olarak fazla miktarda serbest radikaller sentezlenmekte ve bu radikallerin yapabileceği dokusal hasarı önlemek için bitkide antioksidativ savunma mekanizması uyarılmaktadır. Antioksidan olarak bilinen bileşikler ise organizmada oksijen radikallerinin temizlenmesini sağlamaktadır. Dolayısıyla strese giren bitkilerde bu enzimlerin aktivite ölçümleri ile stres seviyeleri belirlenebilir. Meyve kabuğundan 20 kadar alkoloit elde edilir. Bunlar afyon türevleri olan, morfin, kodein, narkotin, papaverin gibi uyuşturucu olarak ve tıpta da kullanım alanı olan maddelerdir (Facchini ve ark,. 2007). 2.4.1. Çalışmanın Yapılmasındaki Önemi Bu yapılan çalışmada, ülkemizde yetiştirilen tescilli haşhaş (Papaver somniferum L. ) çeşitlerinde tuz stresinin uygulanmasıyla stres şartlarının antioksidan enzim seviyelerine

17 olan etkisinin belirlenmesi amaçlanmaktadır. Bu proje ile ülkemizde yetiştirilen 17 tescilli Papaver somniferum L. çeşidinin tuz ile enzim aktivitelerinin ilişkilendirilmesi ve tuz stresine dayanıklı çeşit veya çeşitlerin tespiti amaçlanmaktadır. 2.4.2. Çalışmada Kullanılacak Papaver somniferum L. Çeşitleri Türkiye de ilk defa, 1984 yılında Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesinde Prof. Dr. Şükrü Emiroğlu tarafından Emiral-84 çeşidi haşhaş tescil ettirilmiştir. Bu çeşit gri-nefti tohum renkli ve kırmızı çiçeklidir. Tohumluk üretimi yoktur. Toprak Mahsulleri Ofisince geliştirilen bazı haşhaş çeşitleri ; Ofis-95, Afyon-95, Ofis-96 çeşitleri çiftçi populasyonundan seleksiyonla elde edilmişlerdir. Sarı tohumludurlar. Çeşitli bölgelere adaptasyon kabiliyetleri yüksektir. Morfin oranları % 0,55-0,75 arasındadır. Eskişehir-Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsünde ıslah edilen çeşitler ; Anayurt-95 ve Kemerkaya-95 çeşitleri sarı tohumludur. Çiftçi populasyonundan seleksiyonla elde edilmişlerdir. Adaptasyon kabiliyetleri iyidir. Morfin oranları % 0,40-0,60 arasındadır. Ankara-Tarla Bitkileri Merkez Araştırma Enstitüsünde Islah Edilen Çeşitler Beyaz Tohumlu Çeşitlerden Ankara-94 seleksiyonla ıslah edilmiştir. Tohum verimi yüksek, erkenci ve geniş adaptasyon kabiliyetine sahiptir. Kışlık ve yazlık olarak ekilebilir. Morfin oranı % 0,40-0,60 arasındadır. Kocatepe-96 ise melezlemeyle ıslah edilmiştir, morfin oranı yüksek bir çeşittir (% 0,60-0,85). Kışlık ve yazlık ekilebilir. Yazlık ekimlerin sulanabilir yerlerde yapılması gereklidir. Sarı Tohumlu Çeşitler Afyon Kalesi-95 ve Karahisar-96 dır. Bunlardan Afyon Kalesi-95 melezleme ile ıslah edilmiştir. Kapsül, tohum ve morfin verimi üstün

18 bir çeşittir (Morfin oranı % 0,55-0,85). Geniş adaptasyon kabiliyeti gösterir. Kışlık ve yazlık ekilebilir. Yazlık ekimlerin sulanabilir alanlarda yapılması uygundur. Karahisar-96 ise; Melezleme ile elde edilmiştir. Adaptasyon kabiliyeti yüksek ve verimli bir çeşittir. Morfin oranı % 0,55-0,80 dir. Mavi Tohumlu Şuhut-94, seleksiyonla elde edilmiştir. Morfin oranı yüksektir (% 0,50-0,90). Kışlık ve yazlık ekilebilir. Kışlık ekimlerin taban tarlalarda yapılması, yazlık ekimlerin ise sulanabilir şartlarda yapılması uygundur. Camcı-95 ise, melezleme ile elde edilmiştir. Morfin oranı yüksektir (% 0,58-0,85). Morfin verimi, tohum ve kapsül verimleri iyi durumda olan bir çeşittir. Kışlık ve yazlık ekilebilir. Yazlık ekimlerin sulanabilen yerlerde olması tavsiye edilir. Adaptasyon kabiliyeti iyidir. Mavi haşhaş tohumları ihracata uygundur (TMO, 2010).

3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. MATERYAL Materyal olarak ülkemizde yetiştirilen 17 tescilli Papaver somniferum L. çeşitleri kullanılmıştır. Çalışmada, Toprak Mahsulleri Ofisinden (TMO) temin edilen ve Tokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Biyoteknoloji ve Moleküler Genetik Laboratuvarı nda korunan tohumlar kullanılmıştır. Çalışmada kullanılacak haşhaş çeşitlerinin isimleri Çizelge 3.1 de verilmiştir. Şekil 3.1. Beş aylık büyüme peryodu sonunda kasa içerisindeki haşhaş bitkileri

20 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılacak haşhaş çeşitlerinin isimleri ÖRNEK ÖRNEK ÖRNEK ADI NO NO ÖRNEK ADI 1 KOCATEPE-96 10 OFİS-8 2 ANKARA-94 11 CAMCI-95 3 OFİS-4 12 OFİS-95 4 ŞUHUT-94 13 KEMERKAYA-95 5 ANAYURT-95 14 OFİS-96 6 TMO-1 15 KARAHİSAR-96 7 TMO-3 16 AFYON KALESİ 8 TMO-2 17 OFİS-3 9 AFYON-95 Haşhaş tohumları öncelikle küçük viollerde yetiştirilip daha sonrasında içersinde % 40 torf, % 40 elenmiş bahçe toprağı, % 20 kum bulunan kasalara aktarılmıştır (Koyuncu, 2010). Her kasada 3 farklı çeşit ve her çeşitten 3 farklı tekerrür olacak şekilde ayarlanmıştır. Kasalardaki bitkiler sera ortamında kontrollü olarak yetiştirilmiştir. 5 aylık büyüme peryodu boyunca bitkiler sera koşullarında yeterli büyüklüğe (yaklaşık 10 yapraklı dönem) ulaşılması beklenmiştir. Bitkiler vejetatif olarak yeterli (yaklaşık 10 yapraklı dönem) büyüklüğe ulaştıklarında kasalara numaralandırılarak farklı dozlarda NaCl uygulamaları yapılmıştır. Uygulama 5 farklı dozda (0 (kontrol), 50, 100, 150, 200 mm), 3 tekerrürlü (her tekerrürde 3 bitki) (17 örnek x 5 doz x 3 tekerrür = 255 örnek çalışılmıştır) gerçekleştirilmiştir. Uygulamadan 21 gün sonunda bitkilerin yaprakları hasat edilerek analizler yapılana kadar -80 o C derin dondurucuda muhafaza edilmiştir. Bazı bitki çeşitlerinde yüksek tuz stresi uygulamasına bağlı olarak meydana gelen kurumalar, yapraklardaki nekrotik lekeler ve böceklenmelerden dolayı sonuca etki etmemek için bu tip yapraklarda denemeler yapılmamış ve bu gruplar değerlendirmeye alınmamıştır.

3.2. YÖNTEM 3.2.1. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddeler 1. Potasyum di-hidrojen fosfat (KH 2 PO 4 ) 2. Hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) 3. Askorbik asit 4. Guaiacol 5. Sülfosalisilik asit 6. Coomassie brilliant blue G-250 7. Sığır serum albumini 8. Etanol 9. Hidroklorik asit 10. Sodyum hidroksit 3.2.2. Çalışmada Kullanılan Cihazlar 1. Etüv: Nüve (Ankara, Türkiye) 2. Hassas/Analitik terazi: Shimadzu (Osaka, Japonya) 3. Manyetik karıştırıcı: Heidolph (Almanya) 4. Spektrofotometre: Jasco V-UV/VIS 5. Otomatik pipetler: Eppendorf (Almanya) 6. Soğutmalı mikrosantrifüj: Hettich R22 (Almanya) 7. Santrifüj: Nüve (Ankara, Türkiye) 8. ph metre: Hana (Romanya) 9. -80 o C derin dondurucu: Hettich (Almanya) 10. Kumpas: (A.B.D)

22 3.2.3. Çalışmada Kullanılan Çözeltiler 3.2.3.1. Homojenat Tamponu 1. 50 mm KH 2 PO 4 (ph=7) 3.2.3.2. Katalaz Aktivitesinin Ölçülmesi için Kullanılan Çözeltiler 1. 50 mm KH 2 PO 4 (ph=7) (aktivite tamponu) 2. 30 mm (H 2 O 2 ) (substrat çözeltisi) 3.2.3.3. Peroksidaz Aktivitesinin Ölçülmesi için Kullanılan Çözeltiler 1. 50 mm KH 2 PO 4 (ph=6,5) (aktivite tamponu) 2. 22,5 mm (H 2 O 2 ) (substrat çözeltisi) 3. 30 mm Guaiacol 3.2.3.4. Askorbat Peroksidaz Aktivitesinin Ölçülmesi için Kullanılan Çözeltiler 1. 50 mm KH 2 PO 4 (ph=6) (aktivite tamponu) 2. 2.5 mm Askorbik Asit (substrat çözeltisi) 3. 10 mm H 2 O 2 : (substrat çözeltisi) 3.2.3.5. Protein Miktarının Belirlenmesinde Kullanılan Çözeltiler 1. Coomassie Brilliant Blue G-250

23 3.2.4. Katalaz, Peroksidaz, Askorbat Peroksidaz Aktivitelerinin ve Protein Miktarının Belirlenmesi için Homojenat Hazırlanması Enzim aktivitelerinin ve protein miktarının belirlenebilmesi için 0,3 g yaprak dokusu 1,5 ml 50 mm KH 2 PO 4 (ph=7) tamponu içerisinde porselen havanda homojenize edilmiştir. Homojenat eppendorf tüplerine aktarılarak +4 0 C de 15000 x g de 20 dakika süresince santrifüj edildi. Santrifügasyon sonucunda elde edilen süpernatantlar buzdolabında saklanmış ve enzim aktivite ölçümlerinde kullanılmıştır. 3.2.5. Katalaz (E.C.1.11.1.6) Aktivitesinin Belirlenmesi Katalaz hidrojen peroksitin (H 2 O 2 ) su (H 2 O) ve oksijen (O 2 ) e parçalanmasını katalizleyen bir enzimdir. Aktivite ölçümü ise bu reaksiyon sırasında H 2 O 2 nin su ve oksijene parçalanması sırasında meydana gelen renk açılmasının 240 nm de izlenmesi esasına dayanır. Aktivite ölçümünde 3 ml lik reaksiyon karışımına, 50 mm potasyum fosfat tamponu (ph 7,0), 30 mm H 2 O 2 ve 30 μl homojenat konulmuş ve 2 dakika boyunca spektrofotometrede absorbansı ölçülmüştür. Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan aralıktan dakika başına düşen absorbans hesaplanmıştır. 240 nm de, bir dakika içerisinde 1 μmol H 2 O 2 nin parçalanmasını sağlayan enzim miktarı 1 ünite olarak belirlenmiştir. 240 nm de H 2 O 2 nin ekstinksiyon katsayısı 0,036 cm 2 μmol - 1 dır (Havir ve Mchale, 1987). Sonuçlar mg protein başına enzim ünitesi olarak verilmiştir. 3.2.6. Peroksidaz (E.C.1.11.1.7) Aktivitesinin Belirlenmesi Peroksidaz aktivitesinin belirlenmesi için aktivite ölçümünde 3 ml lik reaksiyon karışımı 50 mm potasyum fosfat tamponu (ph 7.0), 22,5 mm H 2 O, 30 mm guaiacol ve 20 μl enzim ekstraktından oluşacak şekilde hazırlanmıştır. Reaksiyon aktivite ölçüm ortamına en son olarak enzim çözeltisinin ilave edilmesiyle başlanmıştır ve 470 nm de 2 dakika boyunca optik dansitesi kaydedilmiştir. Bir enzim ünitesi bir dakikada 1 μmol 2