EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ (YÜKSEK L SANS TEZ ) SOYA FASULYES N N ( GLYC NE MAX (L.) MERR LL VAR. UMUT 2002) BÜYÜMES vegel M ÜZER NE BOR ELEMENT N N ETK LER Nevruz LAT F Biyoloji Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: 401.03.00 Sunu Tarihi: 20.02.2008 Tez Yöneticisi: Yrd. Doç. Dr. Esin AKÇAM OLUK Bornava- ZM R
III Nevruz LAT F tarafından YÜKSEK L SANS tezi olarak sunulan Soya Fasulyesinin (Glycine max (L.) Merrill var. Umut 2002) Geli imi üzerine bor elementinin etkileri ba lıklı bu çalı ma, E.Ü Lisansüstü E itim ve Ö retim Yönetmenli inin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan de erlendirilerek savunmaya de er bulunmu ve 20/2/2008 tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oybirli i/oyçoklu u ile ba arılı/ba arısız bulunmu tur. Jüri Üyeleri: mza Jüri Ba kanı: Yrd. Doç. Dr. Esin AKÇAM OLUK Raportör Üye: Prof. Dr. smail TÜRKAN Üye: Yrd. Doç. Dr. Levent IK...
IV
V ÖZET SOYA FASULYES N N ( Glycine max (L.) Merrill var. UMUT 2002) BÜYÜMES ve GEL M ÜZER NE BOR ELEMENT N N ETK LER LAT F, Nevruz Yüksek Lisans Tezi, Biyoloji Anabilim Dalı Tez Yöneticisi: Yrd. Doç. Dr. Esin AKÇAM OLUK Bu çalı mada perlit kültüründe Glycine max (L.) Merrill var. Umut 2002 bitkisi üzerine borsuzluk ve fazla borun (0.1 mm) etkileri ara tırılmı tır. Elde edilen sonuçlardan anla ıldı ına göre tohumların çimlenme oranı uygulamadan olumsuz etkilenmemi tir. Ayrıca yapılan fizyolojik analizlerde bu çalı madaki fazla bor uygulamasının fotosentetik verimi ve gövde boyunu arttırıcı yönde etki yaptı ı, ancak kök boyunda bir azalmaya yol açtı ı belirlenmi tir. IAA hormon miktarı da hem borsuzluk hem de fazla bor uygulaması sonucu artarken, ABA miktarında belirgin bir de i iklik gözlenmemi tir. Protein içeri i ise uygulamalardan olumsuz etkilenmi tir. Bakla (meyve) ba lama borsuzluktan olumsuz yönde etkilenirken, bor fazlalı ı bakla sayısını arttırıcı yönde etki etmi tir. Tohum tane a ırlı ı ise uygulamalardan olumsuz etkilenmi tir. Sonuçlardan, bu çalı mada uygulanan bor fazlalı ının (0.1 mm) bakla ba layıncaya dek geçen vejetatif dönemde bitkiye olumsuz bir etkisinin olmadı ı bilakis bu deri imdeki borun bitkiye kontrole oranla daha yararlı oldu u gözlenmi tir. Bitkinin jeneratif evrelerinden biri olan bakla ba lama da
VI bu deri imdeki bordan olumlu etkilenirken, tohum a ırlı ındaki dü ü ün, uygulamaların protein metabolizması üzerindeki etkisinden kaynaklandı ı dü ünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Glycine max, Bor, IAA, ABA, Fotosentetik Pigment, Verim Parametreleri.
VII ABSTRACT THE EFFECTS of BORON on SOYBEANS ( Glycine max (L.) Merrill var. UMUT 2002) GROWTH and DEVELOPMENT LAT F, Nevruz Master Degree Thesis, Biology, The Department of Biology Supervisor: Yrd. Doç. Dr. Esin AKÇAM OLUK In this study, Glycine max (L) Merrill var. Umut 2002 seeds were used as material in perlite culture. The effects of boron deficiency or excess boron application (0.1 mm) on this plant has been researched. It has been understood after the obtained results estimated that the germination ratio of seeds was not effected negatively from the applications. Besides on the physiological analysis on this study it has been noted that the photosyntetic yield and the shoot development were increased, but the root development was decreased. The IAA hormone levels have decreased in both applications, but no distinct changes noted on ABA levels. The protein amount was effected negatively from the applications. Although the pods (fruit) were effected negatively from boron deficiency. The weight of seeds was effected negatively by the applications. As a result, the application of excessive boron (0.1 mm) has got no negative effect on this plant during the vegetative period and also was useful for the development of the plant. The generative period of the plant has
VIII effected positively by the concentration of boron (0.1 mm) and it can be said that the weight decrease of the seeds is caused by the boron effects on the protein metabolism. Key words: Glycine max, Boron, IAA, ABA, photosyntetic pigment, yield parameters
IX TE EKKÜR Yüksek Lisans tezimin her a amasında, en ba ta her türlü deste ini benden esirgemeyen sayın hocam Yrd. Doç. Dr. Esin AKÇAM OLUK a te ekkür ederim. Ayrıca de erli bilgilerine ba vurdu um sayın hocalarım Prof. Dr. Avni GÜVEN e, Yrd. Doç. Dr. Meliha GEM C ye, Dr. Lale YILDIZ AKTA a, denemelerimde yardımlarını esirgemeyen sevgili arkada larım Yük. Biyolog Nil AZER ye, Biyolog Yasemin YA MUR a, Yük. Biyolog Nezahat TURFAN a; her zaman maddi manevi her türlü desteklerini gördü üm sevgili babam ve e ime; tüm yüksek lisans süresince burs imkanlarından yararlandı ım KKTC Milli E itim Bakanlı ına, çalı mamızı 2007-fen-36 no lu proje ile destekleyen Ege Üniversitesi Rektörlü üne ve Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Botanik Anabilim Dalı na te ekkürlerimi sunarım.
X
XI Ç NDEK LER Sayfa ÖZET...V ABSTRACT... VII TE EKKÜR...IX Ç ZELGELER D Z N...XIII EK LLER D Z N...XIV 1.G R...1 2. MATERYAL ve METOD...20 2.1. Materyal ve Yeti tirilmesi...20 2.2.Bitkilerde Çimlenme Oranı ile Morfolojik, Fizyolojik ve Verim Parametreleri Ölçümleri...21 2.2.1. Fotosentetik pigment analizi...21 2.2.2. Bitkisel hormon analizi...22 2.2.3. Protein içeri inin belirlenmesi...24 3. BULGULAR...25 3.1. Çimlenme Oranına li kin Bulgular...25 3.2. Kök ve Gövde Uzunluk Bulguları...27 3.3. Ya ve Kuru A ırlık Bulguları...31 3.4. Fotosentetik Pigment çeri ine li kin Bulgular...32
XII 3.5. Hormon Miktarlarına li kin Bulgular...35 3.6. Borun Protein Miktarı Üzerine Etkisine li kin Bulgular...36 3.7. Borun Verim Parametreleri Üzerine Etkileri ile lgili Bulgular...37 4. TARTI MA ve SONUÇLAR...39 5. KAYNAKLAR D Z N...46 6. ÖZGEÇM...58
XIII Ç ZELGELER D Z N Çizelge Sayfa 1.1. Dünya Toplam Bor Rezervleri (x1000 ton B 2 O 3 )...3 1.2. Bitki türlerinin sulama suyundaki bora toleransları...14 2.1. Hoagland ve Arnon çözeltisi...20 3.1.1. Farklı bor konsantrasyonlarının soya fasulyesi tohum çimlenme oranına etkileri...25 3.2.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30. günde soya fasulyesi kök ve gövde büyümesi üzerine etkileri...27 3.3.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi bitkilerinde taze ve kuru a ırlık üzerine etkileri...31 3.4.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi yapraklarının fotosentetik pigment içeri i (mg/g) üzerine etkileri...32 3.5.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi yapraklarının IAA, ABA ve sitokinin içeri i üzerine etkileri...34 3.6.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi yapraklarının protein miktarlarına etkileri...35 3.7.1. Farklı bor konsantrasyonlarının bitki ba ına bakla sayısı (100. gün) ve tohum a ırlı ı (1000 tane) (120. gün) a ırlı ı üzerine etkileri...36
XIV EK LLER D Z N ekil Sayfa 1.1 Türkiye deki bor madeni rezerv bölgeleri...3 1.2 Borla etkilenmi bitkilerde metabolik olayların, cevapların veya etkilerin önerilen hipotetik sıralaması...7 3.1.1. Farklı bor konsantrasyonlarının soya fasulyesi tohum çimlenme oranına etkileri...26 3.1.2. 15. günde farklı bor konsantrasyonlarının soya fasulyesi fide geli mesi üzerine etkileri...26 3.2.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30. günde soya fasulyesi gövde büyümesi üzerine etkileri...27 3.2.2. Farklı bor konsantrasyonlarının 30. günde soya fasulyesi kök büyümesi üzerine etkileri...28 3.2.3. Bor uygulaması yapılmı bitkilerin 30. gündeki genel görünümü...28 3.2.4. Kontrol grubuna ait bitkilerin 30. gündeki genel görünümü...29 3.2.5. +Bor uygulaması yapılmı bitkilerin 30. gündeki genel görünümü...29 3.2.6. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi bitkilerinde kök-gövde büyümesi üzerindeki etkileri...30 3.3.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi bitkilerinin ya ve kuru a ırlıkları üzerine etkileri...31 3.4.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi yapraklarının klorofil içeri i üzerine etkileri...32
XV 3.4.2. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi yapraklarının klorofil a/b oranı üzerine etkileri...33 3.4.3. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi yapraklarının karotenoid içeri i üzerine etkileri...33 3.5.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi yaprakların IAA, ABA ve sitokinin içeri i üzerine etkileri...35 3.6.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi yapraklarının protein miktarlarına etkileri...36 3.7.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 100. günde bitki ba ına bakla sayısı üzerine etkileri...37 3.7.2. Farklı bor konsantrasyonlarının 120. günde bitkinin 1000-tane a ırlı ı üzerine etkileri...37
XVI
1 1- G R nsanlık tarihi boyunca, insanların öncelikli gereksinimi olan beslenme ihtiyaçlarının kar ılanması önemli bir sorun olmu tur. Tuzluluk, su kıtlı ı, çevre kirlili i ve besleyicilerin eksik veya fazla olu u gibi etmenlerle olu an kullanılabilir (tarıma elveri li ) toprakların azalı ı nedeniyle, hızla artan ve 2050 yılında 9.1 milyara ula aca ı tahmin edilen dünya nüfusunun beslenmesi, tehlikeye girmektedir. Dolayısıyla, ekilebilir alanlarda maksimum verimi elde edebilmek için bitkilerin optimum beslenme artlarının belirlenmesi, toprakta varolan minerallerle bitkilerin etkile iminin aydınlatılması da ön plana çıkmaktadır. Bu yönüyle, bitkiler için temel bir mikro besleyici oldu u uzun yıllar önce saptanan (Warington, 1923; Sommer ve Lipman, 1926; Ludbrook, 1942; Bowen ve Gauch, 1965) ancak bitki beslenmesi üzerindeki rolü hakkında çeli kili görü lerin oda ı olan borla ilgili çalı malar da bitki-mineral ili kileri konusundaki ara tırmalar arasında yerini almı bulunmaktadır. Elementel bor 1808 yılında Fransız Kimyacı Gay-Lussac ile Baron Louis Thenard ve ba ımsız olarak ngiliz kimyacı Sir Humpry Davy tarafından bulunmu tur. Borun kelime kökeni olarak Arapça buraq/baurach ve Farsça da buraj kelimeleri gösterilmektedir. Bu benzetme muhtemelen borun en çok bulundu u form olan boraksın beyaz renkte olmasından kaynaklanıyor olabilir (Desser, http://www.mvschools.org/ms/academics/science/elements, 22.01. 2008 ). Bor, periyodik tabloda B simgesiyle gösterilen, 3A grubunun ba ında, atom numarası 5, atom a ırlı ı 10,81, yo unlu u 2,84 gr/cm 3, ergime noktası 2300 o C ve kaynama noktası 2550 o C olan, metalle ametal arası yarı iletken özelliklere sahip bir elementtir. Genellikle do ada tek ba ına de il, ba ka elementlerle bile ikler halinde bulunur. Tabiatta yakla ık 230 çe it bor minerali vardır. Oksijenle ba yapmaya yatkın olması sebebiyle pek çok de i ik bor-
2 oksijen bile imi bulunmaktadır (Nable ve ark., 1997; Bilim ve Teknik, Mayıs,2002). Bor-oksijen bile imlerinin genel adı borattır. Bor dünya kabu unda düzgün da ılmamı tır. Ço u topraklarda birincil kayna ı turmalin ve volkan lavlarıdır. Bor bile ikleri, özellikle de boraks binlerce yıldan beri kullanılmaktadır. Babillerin boru kıymetli e yaların ergitilmesinde, Mısırlıların mumyalamada, Eski Yunanlıların ve Romalıların temizlikte, Mısırlıların, Mezopotamya uygarlılarının ve Arapların bazı hastalıkların tedavisinde bor'dan yararlandı ı bilinmektedir (Ölçen, 2001). Hafifli i, gerilmeye olan direnci ve kimyasal etkilere dayanıklılı ı sebebiyle; plastiklerde, sanayi elyafı üretiminde, lastik ve ka ıt endüstrisinde, tarımda, nükleer enerji santrallerinde, roket yakıtlarında da kullanılmaktadır. Camın ısıyla genle mesini önemli ölçüde indirgedi i, camı asite ve çizilmeye kar ı korudu u, titre im, yüksek ısı ve ısı oklarına kar ı dayanıklılı ı sa ladı ı için ısıya dayanıklı cam gereçleri ve elektronik ve uzay ara tırmalarında kullanılacak üstün nitelikli camların üretiminde de önemli yeri vardır. Bazı bor bile ikleri yüksek sertlik derecesine sahiptir. (Moh skalasına göre sertlik derecesi 9-elmasınki 10). Bu sebeple, a ındırıcı ve ı ıkkıran olarak, metalleri ve süper ala ımları kesme, bileme ve cilalamada kullanılmaktadır. Bor bile ikleri tungsten karbüre göre daha yüksek kesme oranına, sürekli-a ıri görme kabiliyetine sahiptir ve so utuculara ihtiyaç göstermez (Garrett, 1998). Ayrıca uzay ta ıtları için yakıt olarak dü ünülmekte ve mobil ileti im araçlarının akım levhalarının vazgeçilmez hammaddelerinden biri olarak da kullanılmaktadır. Yakla ık 800.000.000 tonluk görünür B 2 O 3 kapasitesi ile ülkemiz (özellikle Orta Anadolu bölgesi), dünya ekonomik bor rezervinin %63 üne sahiptir ( ekil 1.1). Ülkemizi 209.000.000 tonla ABD, 136.000.000 tonla Rusya, 41.000.000 tonla ili izlemektedir (Tablo 1.1).
3 ekil 1.1- Türkiye deki bor madeni rezerv bölgeleri( www.egebor.net, 2.01.2008) Tablo1.1- Dünya toplam bor rezervleri (x1000 ton B 2 O 3 ) ÜLKE Görünür rezerv* % Görünür Rezerv** % Olası Rezerv % Toplam Rezerv % Türkiye 803000 63 375000 75.4 269000 51.3 644000 63.0 Rusya+ 136000 10.7 28000 5.6 112000 21.4 140000 13.7 BDT ABD 209000 16.4 45000 9.2 60000 11.5 105000 10.3 Çin 36000 2.8 27000 5.4 9000 1.7 36000 3.5 ili 41000 3.2 8000 1.6 33000 6.3 41000 4.0 Sırbistan - - 3000 0.6 - - 3000 0.3 Peru 22000 1.7 4000 0.8 18000 3.4 22000 2.0 Bolivya 19000 1.5 4000 0.8 15000 2.9 19000 2.0 ran - - 1000 0.2 1000 0.2 2000 0.2 Arjantin 9000 0.7 2000 0.4 7000 1.3 9000 1.0 Toplam 1275000 100. 497000 100. 0 0 Kaynaklar: K GEM* ; Roskill**, 1999 524000 100.0 1021000 100. 0
4 Borun tarımda kullanımı ile ilgili bilgiler sekizinci yüzyıla kadar dayanmaktadır. Bitkinin ihtiyaç duydu u miktarı esas alındı ında bir mikrobesleyicidir ve mikrobesleyiciler arasındaki tek ametal olan elementtir. Bu elementin yüksek bitkiler için mutlak gerekli oldu u yakla ık 84 yıl önce belirlenerek (Warington, 1923) bitki beslenmesi için gerekli 16 temel elementten biri olarak literatüre geçmi tir. Bu yönüyle bitki fizyolojisi ve geli iminde önemli rolleri vardır. Temel mikro besleyicilerden herhangi birinde oldu u gibi borun da ortamda yeteri kadar bulunmaması, di er elementlerin tam veya fazla olması durumunda bile bitkinin geli imini de i tirir. Bitki bunlardan birinin azalması halinde, di erlerinden de ancak azalan elementten yararlanabildi i kadar yararlanır. Azalan element ortamdan tamamen kayboldu unda, di er elementlerin kullanımı da durur. Buna Minimum Yasası (Von Liebig, 19.yy) adı verilir. Çok bilinen bu kuraldan yararlanarak bitki besleyicilerinin tümünün bitkiler için optimum seviyesi belirlenebilir. Borun bitkiler için temel olu unun dı ında, kendine özgü olarak, optimum ve toksik seviyeleri arasındaki aralı ın dar olu u, bu elementi tarımsal açıdan önemli ve çalı ılması zor bir parametre haline getirmektedir (Blevins ve Lukaszewski, 1994). Bitki türleri arasında oldu u gibi, aynı türün çe itleri arasında da bora duyarlılıkta büyük farklılıkların oldu u ve bu farklılıkların nedeninin de bitkilerin bor toksisitesinden fizyolojik olarak farklı düzeylerde etkileni inden kaynaklandı ı belirtilmektedir (Paull ve ark., 1988). Ba ka bir deyi le, di er besleyici minerallerden farklı olarak borun optimum seviyesi farklı türler arasında de i iklik gösterebilir; örne in, fasulye için 0.3 mg/l B, yulaf için 1-2 mg/l B ve eker pancarı için ise 2-4 mg/l B (sulama suyunda) gibi (Keren ve Bingham, 1985). Hatta aynı tür içerisinde de optimum ve toksik seviyeleri arası oldukça dar olabilir; örne in mısır (Zea mays L.) ın
5 sekiz farklı çe idiyle yapılan bir çalı mada (Güne ve ark., 2000) topra a 10 mg/kg bor uygulamasına oransal ya a ırlıktaki cevap (10/0) Sele çe idinde % 54 olarak saptanırken Furio çe idinde % 80 olarak ortaya çıkmı tır. Yine bir ba ka çalı mada denenen üç bu day çe idinden biri (Bonza) uygulanan bor toksisitesine (100 mg/l bor) tolerant olarak belirlenirken di eri (Fang 60) hassas olarak ortaya çıkmı tır (Punchana ve ark., 2004). Bu konudaki örnekleri ço altmak mümkündür (Taban ve Erdal, 2000). Borun bitkideki etkileri polen çimlenmesi ve polen tübü uzaması, IAA metabolizması, nükleik asit metabolizması, hücre bölünmesi, hücre çeperi biyosentezi, eker biyosentezi ve translokasyonu, protein sentezi, membran permeabilitesi gibi çe itli hücresel süreçlerde görülmektedir (Parr ve Loughman, 1983; Dugger, 1983; Lovatt, 1985). Elementin fenolik bile iklerin içeri i ve metabolizmasındaki de i imlerle de ili kili oldu u (Ruiz ve ark., 1998), yapraklara yapraktan uygulandı ında bu maddelerin azaldı ı (Mondy ve Munshi, 1993) bulunmu tur. Ayrıca, borun yüksek ı ıkta fenoliklerin toksik etkisini yok etti i de bildirilmektedir (Çakmak ve Römheld, 1997). Bor, bitkilerde ekerin hormon faaliyeti üzerindeki etkisini, fotosentez miktarını, köklerin büyümesini ve havadan emilen karbondioksit miktarını artırır. Bir di er fonksiyonu ise hücre büyümesi ve yapısı üzerine olup, son yapılan çalı malara göre, askorbat metabolizmasında da önemli bir i leve sahip oldu u saptanmı tır (Lewis, 1980; Blevins and Lukaszewski, 1998). Ayrıca, borun, Ipomea batatas ın tüberlerinden safla tırılan asid fosfataz (E.C. 3.1.3.2.) da oldu u gibi enzim yapısına katılmasının yanı sıra (Uehara ve ark., 1974), özel bitki enzimlerinin yapısal bir bile eni olmadı ı dü ünülmektedir (Dugger, 1983). Ancak, bitki metabolizmasında bir enzim aktivatörü olarak görev yaptı ı (Blevins ve Lukaszewski,1994) ve a ırlıklı olarak katekol oksidaz, polifenol oksidaz,
6 tirosinaz, peroksidaz ve IAA oksidaz gibi oksidazlarla (Bohnsack and Albert, 1977) 6-fosfoglukonat ve aldolazı (substrata veya enzim-substrat kompleksine ba lanarak) inhibe etti i ortaya konmu tur (Blevins velukaszewski,1994) ( ekil 1.2). Bitkilerin ihtiyaç duydukları bor miktarı oldukça az olmakla beraber gerek duyulan bu miktarın çok az da olsa altı ya da üstü bitkinin geli imi üzerine olumsuz etki yapmakta ve geli im ço u zaman durmaktadır. Yapılan çalı maların sonuçlarının ortaya koydu una göre bitki bor içeri i (kuru maddede) 25-100 ppm arasındaysa optimum, 200 ppm in üzerine çıktı ında toksik olarak kabul edilmektedir. 20 ppm ise bitkilerde eksiklik sınırı olarak belirtilmi tir (Vitosh ve ark., 1994). Toprakta alınabilir bor miktarı 1 ppm den dü ük ise bor eksikli i, 5 ppm den yüksek oldu unda da bor toksisitesi söz konusu olabilir (Reisenauer ve ark., 1973). Ayrıca, sulama suyunda 1 ppm düzeyinde borun varlı ı duyarlı bitkilerde, 10 ppm düzeyindeki bor varlı ı ise tolerant bitkilerde toksisite semptomlarını ortaya çıkarabilmektedir (Reisenauer ve ark., 1973). Borun bitkilerce kullanılabilen formu toprakta çözünebilen, ba ımsız, - iyonize olmamı H 3 BO 3, B(OH) 3 veya iyon halindeki B(OH) 4 dır (Hu ve Brown, 1997). Bor topraktan köklerle pasif absorbsiyonla alınır ve bu alınımda toprak ph ı, nemi ve sıcaklı ı da etkilidir (Golberg, 1997). Ortam ph ı 6.3-6.5 arasında oldu unda bor alınımı en yüksek düzeye ula maktadır. Ancak ph ın yükselmesiyle birlikte bor alınımı durur. Bunun nedeni olarak
ekil 1.2. Borla etkilenmi bitkilerde metabolik olayların, cevapların veya etkilerin önerilen hipotetik sıralaması 7
8 ph ın yükselmesiyle birlikte kullanılabilir borun topra ın organik ve inorganik kolloidleri tarafından adsorbe edili i gösterilmektedir (Dugger, 1983; Shorrocks, 1997). Genel olarak alınımı gerçekle tikten sonra bor, ksilemde transpirasyon ile uçlara do ru ta ınmaktadır. Bitkiler tarafından bor alınımı ve farklı organlara ta ınımının bitkinin su alımı ve ksilemdeki hareketi ile gerçekle ti i (yani elementin bitkide immobil oldu u), ancak farklı bitki türleri arasında de i ik ekillerde ta ınabilece i de belirtilmi tir (Marschner, 1976). Bor ta ınmasının daha çok transpisyona ba lı olması, yaprak uçları ve kenarlarında bor birikiminin nedenini de açıklamaktadır. Borun yapraklarda bu ekilde akümüle olması kimi hallerde toksik etkilere neden olabilmektedir. Bazı türler bor akümülasyonun neden olaca ı bu toksik etkilerden korunmak için, gutasyon damlaları içinde boru dı arı atma mekanizması geli tirmi lerdir (Scaife ve Turner, 1963). Ta ınımı konusunda bazı bitkilerde, bor için, ksilem ve flöem arasındaki geçi lere dayalı bir süreç olabilece i de öngörülmektedir (Shelp ve ark, 1987; Shelp ve Shattuck, 1987; Shelp, 1988). Bu sürece göre hem damarlar arasındaki de i im, hem de mezofil aracılı ıyla ksilem ve flöem arasındaki katı hareketini içeren uzun mesafeli ta ınım retranslokasyon terimi ile açıklanmaktadır. Öte yandan bazı bitkilerin bor açısından floemmobil oldu u, yani borun flöemde ta ındı ı ileri sürülmektedir (Brown ve Shelp, 1997). Bu durum örn. elma, badem ve nektarin gibi özellikle predominant fotosentez ürünü sorbitol olan türlerde gerçekle mektedir. Bu tip bitkilerde borun sorbitolle bile ik olu turarak flöemde ta ındı ı; fıstık, ceviz ve incir gibi ilk fotosentez ürününün poliol olmadı ı türlerde ise ta ınmadı ı kanıtlanmı tır (Makkee ve ark., 1985). Bu konu ile ilgili yapılan bir ba ka denemede sorbitolce zengin türlere yapraktan uygulanan borun hızla (0-15 gün
9 içerisinde) meyvelere ta ındı ı, ancak sorbitolce fakir türlerde yaprakta kaldı ı bulunmu tur ( Brown ve Hu, 1996). Ta ınımı gibi, borun hücre içinde yerle imi de de i iklik göstermektedir. Bu konuda gelinen son nokta ise suda çözünür borun ço unun apoplastik bölgede borik asit olarak lokalize oldu u, suda çözünmeyen borun ço unun ise cis-diol konfigürasyonuna sahip substratlarla özellikle de poliollerle ( eker alkolleriyle) kompleks olu turdu u yönündedir ( ekil 1.3) (Makkee ve ark., 1985; Loomis ve Durst, 1992; Matoh ve ark., 1996). ekil 1.3- Borun bir eker alkolü olan mannitolle olu turdu u kompleks. Liliaceae, Amaryllidaceae, Asteraceae, Chenopodiaceae, Apiaceae ve Brassicaceae gibi familyalarda ise suda çözünmeyen borun ço unun hücre çeperindeki pektinin yapısında bulunan rhamnogalacturanon II (RG-II) ile bile ik olu turdu u belirtilmektedir ( ekil 1.4 ve 1.5) (Ishii ve Matsunaga, 1996; Kobayashi ve ark., 1996; O Neill ve ark., 1996).
10 ekil 1.4. Borun RG-II monomerlerine borat ester ba larıyla ba lanı ı. ekil 1.5. Borun iki RG-II monomerini çapraz ba ladı ını gösteren konfigürasyon Ancak borun gerek sitoplazmada gerekse hücre çeperinde kompleks olu turdu u maddeler polioller ve RG-II ile sınırlı de ildir. ekerler, NAD,
11 fenoller, organik asitler ve bazı polimerler di er örnekler arasında sayılabilir (Makkee ve ark., 1985; Loomis ve Durst, 1992; Hu ve ark., 1997). Dünya topraklarında borun genellikle eksikli i görüldü ü ve bitkideki fonksiyonlarının da ortamdan bu maddenin çekilmesiyle belirlendi i için, literatürde genellikle bitkilerde bor eksikli inin etkilerinin çalı ıldı ı ara tırmalar görülmektedir. Gerçekten de özellikle hububat bitkilerinde bor eksikli inin etkilerinin daha yaygın oldu u belirtilmektedir. Nitekim, tek çeneklilerde kritik bor eksiklik düzeyi 5-10 mg/kg iken çift çeneklilerde bu miktar 20-70 mg/kg a kadar çıkmaktadır. Bunun nedeni olarak bu iki gurubun hücre çeperi bile enlerinin farklılı ı (Loomis ve Durst, 1992), bu farkın da çeperdeki pektinin dikotillerde daha fazla olu undan kaynaklandı ı gösterilmektedir (Hu ve ark., 1996). Bor eksikli ine ba lı beslenme düzensizliklerinin karakteristik oldu u bitkiler arasında yumru köklü bitkiler ( eker pancarı), yonca ve alfaalfa gibi legümenler, meyve a açları (özellikle fındık), asma, zeytin ve pamuk sayılabilir. Bitkinin ortamdan sa layabildi i bor optimumun altına dü tü ünde bitkide özgün bor eksikli i semptomları (bazı anormallikler) geli mektedir. Bu anormalliklerin elementin esas sonucu mu, yoksa esas etkinin ikincil sonucu mu oldu u ise metabolik aktiviteler ve/veya morfolojideki görülebilir de i ikliklerin zamanlamasından bulunabilir (Hirsch ve Torrey, 1980). Dolayısıyla eksikli in ortaya çıkardı ı ilk semptomların belirlenmesi önem ta ımaktadır. Ancak bunun belirlenmesi de kolay olmayabilir, çünkü fizyolojik de i iklikler ço unlukla görülmez, gizlidir ve ayrıca borun eksilme sıklı ının derecesine ba lı olarak semptomların ortaya çıkı ı gecikiyor olabilir. Bor eksikli inin birincil etkileri hücre çeperi ve zarında görülüp, bitki metabolizmasında da ardı ık ikincil etkilere sahiptir (Wang ve ark.,2006).
12 Özellikle, serbest oksin seviyesinde bir dü ü, ba lı oksin seviyesinde bir artı ve IAA-oksidaz aktivitesinde de bir azalmaya da neden oldu u için lateral tomurcukların apikal dominansiden kurtulmasına neden olacak ekilde büyüme ve geli meyi etkiler (Dugger,1983). Ayrıca, Li ve ark. (2001) bezelye bitkisiyle yaptıkları çalı malarında bor eksikli inde özellikle, IAA nın sürgün ucundan ta ınımının belirgin bir ekilde azaldı ını rapor etmi lerdir. Aynı ekilde daha yakın bir tarihte, ve Li ve ark. (2001) nın çalı malarından hareketle Wang ve ark. (2006) da yine bezelye bitkisiyle gerçekle tirdikleri çalı malarında aynı sonuca ula mı lar, ilaveten sürgün ucuna ilave bor uygulamasının (10 µm), IAA nın polar ta ınımını stimüle etti ini göstermi lerdir. Olayın mekanizması konuısunda henüz bir netlik olmamakla birlikte, bazı ara tırmacılar, borun IAA ta ınımı üzerine bu do rudan ve özgün etkisinin hücre zarındaki IAA alınımsalınım ta ıma sistemiyle (Palme ve Galweiler, 1999; Geldner ve ark., 2001) ya da polar IAA akı ının korunmasında asal rolleri olan NADH-oksidaz veya H+- ATP-azlarla etkile me yoluyla (Rubery ve Sheldrake, 1974) oldu u eklinde açıklamaktadır. Bundan ba ka bor eksikli inde gövdelerde pektik matriksin sertle mesinin sonucu olarak mikrofibrillerin düzenlenmesinin bozuldu u ve birikiminin azaldı ı ileri sürülmektedir (Starck, 1963). Kök ucu hücrelerinde ise özellikle boyuna çeperlerde düzensiz kalınla malar meydana gelebilir (Kouchi ve Kumatawa, 1975;1976). Bazen golgi cihazının geli iminde de anormallikler görülür ve bu anormallikler hücre çeperi ve zarı arasındaki salgı vezikülü sayısını arttırabilir (Kouchi ve Kumatawa, 1975;1976). Öyle ki, borun ortamdan alınmasından sadece 6 saat sonra ortaya çıkan bu kalınla manın sebebi olarak çeper ve membran arasındaki bu salgı vezikülü birikimi gösterilmektedir (Hirsh ve Torrey, 1980). Dolayısıyla borun çeper materyal
13 sentezinde de il, apoplastik bölgede çeper bile enlerinin ince-yapısal düzenlenmelerinde i gördü ü üzerinde vurgu yapılmaktadır (Matoh, 1997). Tüm bunlara ba lı olarak bitkinin fenotipine yansıyan eksiklik etkilerini öyle sıralayabiliriz. Bor eksikli inin fenotipteki ilk belirtisi olarak, kök uzaması durur. Bu durum önceleri hücre bölünmesinin de il, hücresel olgunla ma ve farklıla manın durmasından kaynaklandı ı dü ünülmü se de (Skok, 1958), daha sonra hücre bölünmesinin de engellendi i ortaya konmu tur (Dugger,1983). Bunu müteakiben yava lamı ve normal olmayan geli me ve yeni yaprakların mavi-ye il renk alı ı gözlenir. Ayrıca yaprak ve saplar kırılganla ır. Bu etkilere paralel olarak büyüme ucu hasar görür; hasar gördü ü noktadan itibaren siyahla ır ve uç büyümesi durur. Bu da bitkide yava ve bodur geli ime veya bazı durumlarda ölüme sebep olur (Vitosh ve ark., 1994). Bu tip vejetatif semptomların görülmedi i bitkilerde de olmak üzere, bor eksikli inin süreklili inde reprodüktif evre de zarar görür. Çiçeklenme, polen çimlenmesi, bunun paralelinde meyve tutumu ve tohum ba lama engellenebilir (Dehll ve Huang, 1997). Bor eksikli inin belirlendi i topraklarda borla gübreleme yoluna gidilebilir. Ancak bu elementin eksik ve toksik seviyeleri arasındaki aralık dar oldu undan gübrelemede dikkatli olunması gerekir. Nitekim hatalı ve a ırı gübreleme toprakta bor fazlalı ını meydana getirebilir. Ana kayanın kendi içeri inden kaynaklanan bor miktarının yanı sıra bor toksisitesi daha çok kurak ve yarı kurak bölge topraklarında gözlenir (Nable ve ark., 1997). Ayrıca madencilik, endüstriyel atıklar, arıtma çamurları ve çöp kompostları da toprakta bor fazlalı ına neden olan etmenlerdir. Yine toprak özelli i (tekstürü) ve sulama suyundaki bor da topra ın bor içeri inin artmasına neden olur. Özellikle fay hatlarına ve deniz suyuna yakın kuyu sularında, sıcak kaynak ve
14 kaplıca sularında, tuzlu ve alkali toprakların bulundu u bölgelerdeki yer altı ve taban sularında yüksek miktarda bor bulundu u bilinmektedir (Nable ve ark., 1997; Shorrocks, 1997). Daha öncede de indi imiz gibi, sulama suyundaki bora göre bitkiler üç farklı guruba ayrılırlar; 0.3-1 ppm aralı ındaki bor varlı ından olumsuz etkilenmeyenler, 1-2 ppm arasında ya ayabilenler ve 2-4 ppm e dayanıklı olanlar (Keren ve Bingham, 1985) (Tablo 1.2). Tablo 1.2- Bitki türlerinin sulama suyundaki bora toleransları (Keren ve Bingham, 1985 ten düzenlenmi tir). Bor Miktarı Bitki Yanıtı Örnek Bitki Türleri (mg/l) 0.3-1 Hassas Persea americana (avokado) Malus domestica (elma) Phaseolus vulgaris (fasulye) 1-2 Yarı Dirençli Avena sativa (yulaf) Zea mays (mısır) Solanum tuberosum (patates) 2-4 Dirençli Daucus carota (havuç) Medicago sativum(yonca) Beta vulgaris ( eker pancarı) Hassas türlerde borun floem mobil oldu u, dirençli türlerde ise immobil oldu u görülmektedir. Bu nedenle immobil türlerde bor en çok transpirasyonla yaprak kenarlarında birikir ve buradan gutasyonla atılabilece i gibi yaprak yüzeyinde bitkiye fotosentez yapabilece i alan da kalır. Borun floem mobil
15 oldu u hassas türlerde ise önce klorofil konsantrasyonu azalır, bunu müteakiben büyüme durur; daha sonra CO 2 fiksasyonu azalır ve sonuçta yaprakta fotosentetik alan kaybı meydana gelir. Bu olayların fizyolojik temelinde borun sitoplazmik metabolizmayı bozu u yatmaktadır. Yukarıda da de indi imiz gibi, borik asit köklerden yapraklara ksilem elemanları aracılı ıyla ta ınır (Revan, 1980) ve bir kısmı çeperdeki yeni sentezlenmi pektik polisakkarit zincirin RG-II bölgesine ba lanır. Kalan borun ço u ise çeperde herhangi bir liganda ba lanmadan borik asit olarak kalır. Ortamdaki miktarı arttıkça borun köklerden sürgünlere ta ınımı da arttı ı için e er artı devam ederse bor yaprak hücre çeperinde birikecek ve sonuçta sitoplazmaya da sızacaktır. Bu sızıntı fazlala tı ında da sitoplazmik metabolizma zarar görece i için bor toksisitesini meydana getirecektir (Matoh, 1997). Buradaki tek karanlık nokta borun kök hücre çeperlerinden ksilem elemanlarına nasıl yüklendi idir. Bor toksisitesinin fenotipte ilk belirtileri olarak özellikle ya lı yapraklarda yaprak uçlarının sararması, klorozis ve yaprak kenarlarının a ırı derecede yanması gözlenir. Semptomlar daha sonra orta damara kadar yayılır. Bor miktarının 5 ppm den fazla olması durumunda kökte yanma meydana gelip, ani bitki ölümü gözlenebilir. Ayrıca yaprakların kıvrılması, kabuk nekrozları, genç gövdelerde uç yanıklı ı, yaprak aksillerinde a ırı zamklanma ve gövde ile petiyoller arasında kahverengi mantarsı lezyonların görülmesi de semptomlar arasında sayılabilir (Vitosh, 1994; Brown and Shelp, 1997; Nable, 1991). Bunların yanı sıra köklerde biriken a ırı borun kök uzamasını ve lateral kök geli imini inhibe etti i de belirtilmektedir (Lovatt ve Bates, 1984). Bora toleranslı bitkiler ortamdaki bordan kaçınmak amacıyla bazı mekanizmalar geli tirirler. Örne in bazı bitkiler kök sistemlerinde yer alan
16 fiziksel bir bariyer vasıtasıyla veya köklerden boru uzakla tırmaya yarayan pompa mekanizmasıyla fazla bordan kaçınabilirler; ya da kimi bitkiler kök sistemlerindeki bir takım kimyasal reaksiyonlar aracılı ıyla rizosfer ph ını de i tirerek bor alınımını engelleyebilirler. Ayrıca deri imin yüksek oldu u toprak katmanlarında kimi bitkiler yüzeysel kökler olu turarak bor toksisitesine kar ı kendilerini koruyabilirler (Cartwright ve ark., 1987; Rahtjen ve ark., 1987; Paull ve ark., 1992). Bitkilerin kendilerini koruyamayacak seviyedeki bor fazlalı ının giderilmesi için toprak ph ına ba lı olarak kireçleme yapılabilir. lk ve en etkili mücadele budur. Bundan ba ka toprak iyi drene edilerek borsuz sulama suyu ile yıkanabilir ya da ara bitki olarak topraktan çok bor kaldıran türler yeti tirilebilir (Babao lu ve ark., 2004). Bir de toprakta ve sulama suyunda sorun olu turan boru fiske etme özelli ine sahip orzan adlı bile i in kullanılması da önerilmektedir (Nable, 1991; Shorrocks, 1997).Ayrıca, bor toksisitesiyle mücadele ile ilgili yapılan çalı malarda çinkonun borun toksik etkisini azaltıcı etkisinin bulundu u gözlenmi tir. Aynı ekilde kalsiyum varlı ında da bor alımı yava lar. Sodyum ve klorürün de benzer etkilerinin oldu u ileri sürülmü tür (Nable ve ark., 1997). Bizim çalı ma materyalimizi olu turan Soya bitkisi, dahil oldu u Fabaceae familyasının ço u üyesi gibi bora kar ı tolerant olarak bilinmektedir (Schon ve Blevins, 1987). Bitkinin yapraklarıyla yapılan testlere göre, B eksikli i için kritik seviyenin 9-10 ppm, B toksisitesi içinse 50-60 ppm oldu u saptanmı tır (Schon ve Blevins, 1987). Soya fasulyesi, Japonya ve Çin gibi do u Asya ülkelerinin en önemli tarımsal ürünlerinden biri olarak, yüzyıllardan beri, buradaki insanların temel besinlerini olu turmu tur. Anavatanının do u Asya, muhtemelen Çin oldu una
17 inanılan soya, insano lu tarafından kültüre alınan ve yeti tirilen en eski bitkilerden bir tanesidir. Botanik özellikleri açısından dik büyüyen, dallanabilen, küçük çalı görünümlü, sap ve yaprakları gri, kahverengi ve bunların de i ik tonları gibi farklı renklerdeki tüylerle kaplı, yeti me artlarına ba lı olarak 30 cm ile 2 m arasında boylanabilen, beyaz veya mor renklerde çiçe e sahip, her birinde 1-5 arasında tane bulunabilen baklalar olu turan, güçlü bir yan kök sistemiyle desteklenmi kazık köklü, köklerinde havanın serbest azotunu ba layabilen Rhizobium japonicum bakterilerinin bulundu u nodüller olu turan, yazlık karakterde bir baklagildir. Bugün, dünyada yakla ık 90.000.000 hektarlık alanda soya tarımı yapılmakta ve yıllık 200.000.000 ton civarında bir üretim gerçekle mektedir. Dünyada en fazla soya ekimi ve üretimi yapılan ülkeler sırasıyla, ABD, Brezilya, Arjantin, Çin ve Hindistan dır (FAO, 2004 yılı verileri). Soya bitkisi, tanesindeki ortalama % 18-20 ya, % 40 protein, % 30 karbonhidrat, % 5 mineral madde (fosfor, potasyum, kalsiyum, kükürt, magnezyum vb) ve çok sayıdaki vitaminlerle (en çok A ve B), ayrıca proteinin yapısında zengin ve de erli amino asitler bulundurması nedeniyle, "harika bitki" olarak da anılmaktadır. Ayrıca, omega-3 ya asidi olarak da bilinen linolenik asit yönünden oldukça zengindir. Omega-3 ya asidi, vücut tarafından yapılamamakta ve dı arıdan alınmak zorundadır. Kalp rahatsızlıkları, kandaki kolestrol dengesinin düzenlenmesi ve kemik erimesine kar ı mutlak surette alınması zorunlu olan Omega-3 ya asidi miktarı, soyada % 5-11 arasında de i mektedir. nsan beslenmesinin yanında, hayvan yemi olarak da iyi bir besin kayna ıdır (www.vejetaryen.net). Soya küspesi, hayvan yemi olarak, içerdi i yüksek orandaki protein (% 50) nedeniyle, özellikle de
18 kümes hayvanları için çok yararlıdır ve bunların günlük beslenme programlarına konmaktadır. Tarımsal açıdan da yararları vardır. Bir baklagil bitkisi olması nedeniyle, topra ın serbest azotunu köklerindeki nodüllerde ba layarak, masrafsız olarak hem kendine besin maddesi temin etmekte, hem de kendisinden sonra gelecek bitkiye hazır besin elementi sunmaktadır. Ayrıca, bir çapa bitkisi olması nedeniyle de, tarladaki ot mücadelesinde (ot populasyonunun azalmasında) fayda sa lar. Bahsedilen bu özellikleri, soyanın iyi bir münavebe bitkisi oldu unu ortaya koymaktadır. Bu özelliklerinin yanında, sanayide de en çok kullanılan bitkilerden bir tanesidir. çerdi i yüksek orandaki protein nedeniyle, soya eti yapımında, un, süt, yo urt ve peynir yapımında, boya, mu amba, tutkal gibi daha birçok sanayi ürünü imalatında kullanılmaktadır. Soyadan elde edilen sanayi ürünü sayısı 200 e yakla mı tır. Soyanın ülkemizde ilk olarak Ordu ilinde I. Dünya sava ı yıllarında yeti tirilmeye ba landı ı bilinmektedir. Ordu ve Samsun illerinde 1980 yılına kadar yeti tirilen soya, bu yıllarda Akdeniz bölgesine de götürülmü, ana ürün yanında, II. ürün programına da alınmı tır. lk yıllarda gerekli ilgiyi görmü ve yayım çalı maları ile ekili alanları yava yava bir miktar artmı tır. Devlet tarafından 1981 yılında destekleme kapsamına alınmasıyla üretiminde artı lar ya anmı tır. Öyle ki, desteklemenin sona erdi i 1987 yılında ekili alanı 112.000 hektara ula mı ve 250.000 ton ürün elde edilmi tir. Destekleme kapsamına 1991 yılında tekrar alınmı ve bu destek 1993 yılı sonuna kadar sürdürülmü ve 1994 yılından itibaren de destek kapsamından çıkarılmı tır. Destek kapsamından çıkarılması sonucunda gerekli ilgi ve deste i bulamayınca, tarımdaki yerini kaybetme noktasına gelmi tir.
19 Son yıllarda, devlet tarafından tekrar destekleme prim ödemesi kapsamına alınan birkaç bitkiden birisidir. Yukarıda detaylarıyla vurgulamaya çalı tı ımız üzere bor toksisitesi de bitkilerde en az bor eksikli i kadar olumsuz etki yapmaktadır ve ülkemiz gibi bor açısından zengin topraklarda önemli verim kayıplarına neden olabilmektedir. Bor zengini bir ülke olmamız dolayısıyla tarla ürünlerimiz için bu element açısından toksisite sınırlarının belirlenmesi önem arz etmektedir. Ülkemizde bu amaçla yapılan sınırlı sayıda çalı ma oldu u görülmektedir (Çakmak ve ark., 1996; Taban ve Erdal, 2000; Gemici ve ark., 2002; Akçam Oluk ve ark., 2005; Hakkı ve ark., 2007). Biz de çalı mamızda bitki metabolizması üzerine yukarıda da bahsedildi i gibi birçok düzenleyici etkisi bulunan bor elementinin; çok geni bir kullanım alanına sahip, dünya beslenmesinde önemli bitkilerden biri olan soya fasulyesi üzerindeki fizyolojik etkilerini ülkemiz artlarını göz önünde bulundurarak ara tırmayı planladık.
20 2. MATERYAL VE METOT 2.1. Materyal ve Yeti tirilmesi Bu çalı mada materyal olarak Ege Tarımsal Ara tırma Enstitüsü nden temin edilen Glycine max (L.) Merrill var. Umut 2002 tohumları kullanılmı tır. Tohumlar saf su ile doyurulmu perlit içeren 2 lt lik saksılara her birine iki er adet olacak ekilde ekilmi ve seraya yerle tirilerek 3 guruba ayrılmı tır. Birinci gurup borsuz (-B), ikinci gurup 0.05 mm (Kontrol) ve üçüncü gurup 0.1 mm bor içeren (+B) ½ kuvvet Hoagland çözeltisi (Hoagland ve Arnon, 1950) (Tablo 2.1) ile 15 günde bir, saf su ile münavebeli olacak ekilde sulanmı tır. Ancak, ikinci aydan itibaren, havaların a ırı ısınması nedeniyle saksılar seradan bahçeye çıkarılmı ve saf su ile sulamaya önce haftada bir, hemen ardından her gün olacak ekilde ortalama be ay (Mayıs-Ekim) devam edilmi tir. Tablo 2.1. Hoagland ve Arnon çözeltisi Besleyiciler g/l KNO 3 1.02 Ca(NO 3 ) 2 0.492 NH 4 H 2 PO 4 0.23 MgSO 4.7H 2 O 0.49 H 3 BO 3 0.00286 MnCl 2.4H 2 O 0.00181 CuSO 4.5H 2 O 0.00008 ZnSO 4.7H 2 O 0.00022 H 2 MoO 4 0.00009 %0.5 FeSO 4.7H 2 O 0.0245 %0.4 Tartarik asit 0.000028 CoSO 4.7H 2 O 0.00585
21 2.2. Bitkilerde Çimlenme Oranı ile Morfolojik, Fizyolojik ve Verim Parametreleri Ölçümleri Farklı B konsantrasyonlarına maruz kalmı bitkilerin çimlenme oranı 9, 12. ve 15. günlerde çimlenen tohumların sayılarak % de erlerinin hesaplanması ile elde edilmi tir. Bitkilerde morfolojik ölçümler olarak kabul edilen kök-gövde boyu ile taze ve kuru a ırlık belirlenmesi 30 günlük bitkilerden yapılan hasat edilen örneklerle gerçekle tirilmi tir. Taze a ırlı ı saptanan materyal 80 C lik etüvde 96 saat bekletildikten sonra kuru a ırlı ıölçülmü tür. Yine 30 günlük bitkilerden alınan yaprak ve apikal tomurcuk örneklerinde de fizyolojik ölçümler olarak pigment, hormon ve protein analizleri yapılmı tır. Yakla ık dört ayın sonunda ise bitkilerin ba ladı ı bakla sayısı ve tohum a ırlı ı verim parametreleri olarak hesaplanmı tır. Bitki ba ına bakla sayısı, toplam bakla sayısı bitki sayısına bölünmek suretiyle, 1000 tane a ırlı ı ise 1000 tohum tartılıp a ırlı ı alınarak kayda geçirilir. 2.2.1. Fotosentetik Pigment Analizi Yaprak ve apikal tomurcuktaki fotosentetik pigment içeri i Withman ve ark. (1971) na göre belirlenmi tir. Bu amaçla 0.1 g lık materyal, sıvı azot kullanılarak havanda ö ütülmü ve 10 ml (% 80 lik) asetonla ekstre edilmi tir. Ekstrakt çift katlı filtre ka ıdından süzülerek deney tüplerine alınmı ve süzüntü yine % 80 lik asetonla 10 ml ye tamamlanmı tır. Bu ekstraktın Varian marka Carry 50 model spektrofotometrede klorofil a için 663, klorofil b için 645 ve karotenoid için 450 nm de olacak ekilde absorbans de erleri okunmu tur. Bu de erler a a ıda verilen denklemlerde yerine konarak her
22 madde (klorofil a,b ve karotenoid) miktarı mg/g taze a ırlık cinsinden bulunmu tur: mg klorofil a / g doku = [12.7 (D 663 ) - 2.69 (D 645 )]. (V/1000. A ırlık) mg klorofil b / g doku = [22.9 (D 645 ) - 4.68 (D 663 )]. (V/1000. A ırlık) mg toplam klorofil / g doku = [20.2 (D 645 ) + 8.02 (D 663 )]. (V/1000. A ırlık) mg toplam karotenoid / g doku = 4.07 (D 645 ) - [(0.0435 x Kla miktarı)+(0.367xklb miktarı)] Bu e itlikte D, absorbans de erini; V, %80 lik asetonun son hacmini; a ırlık, kullanılan bitkisel dokunun ya a ırlı ını göstermektedir. 2.2.2. Bitkisel Hormon Analizi Örneklerin hormon ( IAA ve ABA) içeri i Yürekli ve ark. (1974) na göre belirlenmi tir. Bu amaçla, 1g örnek önce sıvı azot kullanılarak havanda ö ütülmü tür. Daha sonra bu toz halindeki örnek so uk (+4 o C) metanol kullanılarak homojenize edilmi tir. Elde edilen homojenat havandan yıkanarak behere aktarılır ve içerisine 1-2 adet butile hidroksi toluen (BHT) (2,6-di-tert-butyl-4- methylphenol = MeC 6 H 2 (CMe 3 ) 2 OH)) kristali ve 1-2 ml saf su ilave edilerek bir gece +4 o C de bekletilmi tir. Bu sürenin sonunda ekstrakt Wattman No:1 filtre ka ıdından süzülerek uçurma balonuna aktarılmı tır. Eksttraktaki metanol rotary evaporatörde uçurma i lemi yapılarak uzakla tırılmı tır. Balonun çeperine yapı an kalıntı toplam 50 ml saf su ile 4-6 kez yıkamak suretiyle ayırma hunisine alınır ve elde edilen bu su fazının ph ı 0.1 N HCl ile 3 e ayarlanıp etil asetat ile 4-6 kez partisyona u ratılmı tır. Su fazının uzakla tırılmasıyla elde edilen etil asetat fazı uçurma balonuna alınır ve rotary
23 evaporatörde etil asetatı uçurma i lemi gerçekle tirilmi tir. Etil asetat örnekten uzakla tırıldıktan sonra balonun çeperindeki kalıntı 1ml metanol ile yıkanmak suretiyle alınır ve ince tabaka kromatografisinde ( TK) kullanılmı tır. TK için 20x20 cm cam plaklar üzerine 0,5mm kalınlı ında silika jel dökülüp kuruduktan sonra bir gece 105 C lik etüvde aktive edilmi tir. Daha sonra hazırlanmı bu plaklar üzerine sırasıyla 1ml örnek, IAA ve ABA hormonlarının standartları Hamilton ırıngası ile uygulanmı tır. Yürütmeye hazır hale gelmi olan bu plaklar, izopropil alkol: amonyak: saf su (80: 10: 10 v/v) karı ımı (Kefford, 1955) içeren yürütme tankına yerle tirilerek mobil faz ~10cm yol alana kadar karanlıkta yürütülmü tür. Yeterince yürümü olan plaklar mobil fazın geldi i nokta i aretlenerek so uk hava ile kurutulmu tur. Bu i lem sona erdikten sonra plaklara 254 nm UV ı ık altında bakılır ve IAA ve ABA için standartların ula tı ı bölge (lekeler) i aretlenmi tir. Daha sonra örne in yürüdü ü sütunda standartların de erlerine denk gelen bölge (leke) kazınarak deney tüplerine aktarılmı ve üzerlerine 10 ml metanol eklenerek ve hormonların metanole geçmesi amacıyla karanlıkta 1 saat bekletilmi tir. Bu süre sonunda metanol ekstraktından bir miktar alınarak Varian marka Carry 50 model spektrofotometrede IAA için 224, ABA için 263 nm de absorbans de erleri okumu ve Yürekli ve ark. (1974) tarafından hazırlanmı kalibrasyon e risine göre µg/g (ppm) taze a ırlık olarak tayin edilmi tir. Ayrıca ekstraksiyon sonunda ayrılan su fazı örne in sitokinin içeri inin belirlenmesi amacıyla bu day yapra ı ya lanması biyolojik testinin yapılmasında kullanılmı tır. Biyolojik test sonucunda örneklerin sitokinin içeri i µg/g (ppm) olarak hesaplanmı tır.
24 2.2.3. Protein çeri inin Belirlenmesi Birer gramlık taze yapraklar 3 ml 0.05 M ph ı 7.6 olan sodyum fosfat tamponu ile homojenize edilir ve çift katlı tülbent bezinden süzülerek ependorf tüplerine aktarılmı tır. Hazırlanan bu homojenat +4 C de 13000g de 15 dakika santrifüjlenmi tir. Süpernatant Bradford (1976) yöntemi ile protein miktarının belirlenmesi için kullanılmı tır. Bu yönteme göre Bovin Serum Albumin (BSA) standartları 0.05 µg/ml, 0.1 µg/ml, 0.15 µg/ml ve 0.2 µg/ml olarak hazırlanmı tır. 100 mg Coomassie Brillant Blue, 50 ml %95 lik etil alkolde çözülür, üzerine 100 ml %85 lik ortofosforik asit ilave edilerek saf su ile 600 ml ye tamamlanmı tır. Bu karı ım filtre ka ıdından süzülmü ve süzüntüye %85 lik gliserol ilave edilerek saf su ile 1000 ml ye tamamlanmı tır (indikatör çözelti). 0.3 ml süpernatantın üzerine, 0.5 ml indikatör çözelti ve 0.2 ml saf su ilave edilerek elde edilen karı ım Jenwey 6015 UV/VS spektrofotometrede 595 nm dalga boyunda köre kar ı absorbans de erleri okunmu ve BSA ile hazırlanan kalibrasyon e risine göre örneklerin toplam protein içeri i mg/g taze a ırlık olarak belirlenmi tir.
25 3. BULGULAR Uygulama yapılmı Glycine max var. Umut 2002 çe idinde, ortamdaki farklı bor konsantrasyonlarının çimlenme oranını, 30. günde kök-gövde boyu, toprak üstü uzunlu u, ya -kuru a ırlık, hormon içeri i (IAA, ABA ve sitokinin), fotosentetik pigment içeri i ve protein miktarı, 100. günde ba lanan bakla sayısı ve 120. günde tohum a ırlı ı (1000 tane) üzerine etkilerine yönelik bulgularımız a a ıdaki gibidir. 3.1. Çimlenme Oranına li kin Bulgular Borun çimlenme oranına ili kin etkilerinin irdelenmesine yönelik olarak elde etti imiz sonuçlar, 9. günde B içermeyen ortamda (-B) yeti tirilmi bitkilerin kontrol grubuna nazaran %12.68, 12. günde %16.47, 15. günde ise %17.2 lık bir azalı gözlenirken, 0.1 mm B içeren ortamda (+B) yeti tirilenlerde ise, 9. günde % 2.82, 12. günde %2.35 lik artı gözlenirken 15. günde çimlenme oranının kontrol grubu ile e it oldu u gözlenmi tir ( Tablo 3.1.1 ve ekil 3.1.1 ile ekil 3.1.2). Tablo 3.1.1. Farklı bor konsantrasyonlarının soya fasulyesi tohum çimlenme oranına etkileri. Uygulama 9. gün 12. gün 15. gün (mm B) -B (0) 62± 0.41 71± 0.78 77± 0.19 K (0.05) 71± 0.27 85± 0.62 93± 0.43 +B (0.1) 73± 0.39 87± 0.57 93± 0.29
26 çimlenme oranı (%) 100 80 60 40 20 0 9. gün 12. gün 15.gün 0 0.05 0.1 ekil 3.1.1. Farklı bor konsantrasyonlarının soya fasulyesi tohum çimlenme oranına etkileri. ekil 3.1.2. 15. günde farklı bor konsantrasyonlarının soya fasulyesi fide geli mesi üzerine etkileri ( A: - B; B: K; C: + B).
27 3.2. Gövde ve Kök Uzunluklarına li kin Bulguları Elde edilen sonuçlardan hareketle, gövde boyunda B grubunun kontrol grubuna oranla %5.88 lik bir azalı, +B grubunun ise % 47.06 lık artı gösterdi i gözlenmektedir. (Tablo 3.2.1 ve ekil 3.2.1, ekil 3.2.3, ekil 3.2.4, ekil 3.2.5 ile ekil 3.2.6). Kök boyunda ise -B grubu ile kontrol grubu arasında % 5.13 lük bir artı bulunurken, +B uygulamasının % 12.82 lik bir azalı meydana getirdi i gözlenmektedir (Tablo 3.2.1 ve ekil 3.2.2, ekil 3.2.3, ekil 3.2.4, ekil 3.2.5 ile ekil 3.2.6). Tablo 3.2.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30. günde soya fasulyesi kök ve gövde büyümesi üzerine etkileri. Uygulama Gövde boyu (cm) Kök boyu (cm) (mm B) -B (0) 16± 0.91 41± 0.42 K (0.05) 17± 1.02 39± 0.77 +B (0.1) 25± 0.36 34± 0.27 30 gövde boyu (cm) 25 20 15 10 5 0 0 0,05 0,1 ekil 3.2.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30. günde soya fasulyesi gövde büyümesi üzerine etkileri.
28 50 kök boyu (cm) 40 30 20 10 0 0,05 0,1 0 ekil 3.2.2. Farklı bor konsantrasyonlarının 30. günde soya fasulyesi kök büyümesi üzerine etkileri. ekil 3.2.3. Bor uygulaması yapılmı bitkilerin 30. gündeki genel görünümü.
29 ekil 3.2.4. Kontrol grubuna ait bitkilerin 30. gündeki genel görünümü. ekil 3.2.5. +Bor uygulaması yapılmı bitkilerin 30. gündeki genel görünümü.
30 ekil 3.2.6. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi bitkilerinde kök-gövde büyümesi üzerindeki etkileri ( A: -B, B:Kontrol, C: +B). 3.3. Taze ve Kuru A ırlıklara li kin Bulgular Elde edilen sonuçlara göre, B içermeyen ortamda yeti tirilen bitkilerin kök taze a ırlık de erlerinde kontrol ile mukayese edildi inde % 41.04 lük; kök kuru a ırlık de erlerinde ise % 5.8 lik bir azalı gözlenirken, +B uygulaması yapılmı bitkiler kontrol ile kıyaslandı ında kök taze a ırlı ında % 93.45 lik; kök kuru a ırlı ında ise % 7.1 lik bir artı gözlenmi tir (Tablo 3.3.1 ve ekil 3.3.1). Gövde a ırlıkları bakımından ise B içermeyen ortamda yeti tirilen bitkilerin kontrol grubuna oranla taze a ırlı ının % 30.21; kuru a ırlı ının ise % 26.36 lık bir azalı gösterdi i bulunmu tur. +B uygulaması yapılan gruba ait örnekler irdelendi inde ise kontrole oranla gövde taze a ırlı ının % 3.2 lık artı gösterirken gövde kuru a ırlı ı bakımından önemli bir de i iklik göstermedi i gözlenmi tir. (Tablo 3.3.1 ve ekil 3.3.1).
31 Tablo 3.3.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi bitkilerinde taze ve kuru a ırlık üzerine etkileri. Uygulama Kök T.A. Kök K.A Gövde T.A. Gövde K.A. (mm B) -B (0) 6.48± 0.34 1.46± 0.19 8.04± 0.64 1.9± 0.1 K (0.05) 10.99± 0.74 1.55± 0.27 11.52± 0.56 2.58± 0.21 +B (0.1) 21.26± 0.21 1.66± 0.13 11.89± 0.77 2.6± 0.35 25 kök- gövde a ırlıkları (g) 20 15 10 5 0 0,05 0.1 0 kök taze a. kök kuru a. gövde taze a. gövde kuru a. ekil 3.3.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi bitkilerinin ya ve kuru a ırlıkları üzerine etkileri. 3.4. Fotosentetik Pigment çeri ine li kin Bulgular Yapılan analiz sonuçlarına göre, Kl a miktarı, -B uygulaması yapılmı bitkilerde kontrole göre % 10.71 lik bir azalı gösterirken, +B uygulamasının kontrole göre bir farklılık göstermedi i gözlenmemi tir. Kl b miktarı açısından ise, -B uygulamasında kontrole oranla % 21.43 lük bir artı meydana gelirken, +B uygulamasında ise % 17.86 lık bir azalma gözlenmi tir (Tablo 3.4.1 ve ekil 3.4.1).
32 Bitkilerin Kl a/b oranında, B içermeyen ortamda yeti tirilmi olanlarda % 26 lık bir azalı a kar ın, + B uygulamasına maruz kalanlarda % 22 lık bir artı kaydedilmi tir (Tablo 3.4.1 ve ekil 3.4.2). Gerek B içermeyen (-B) gerekse 0.1mM B içeren (+B) ortamda yeti tirilen bitkilerin toplam karotenoid içeri inde kontrol grubuna göre % 7.69 luk azalı kaydedilmi tir (Tablo 3.4.1 ve ekil 3.4.3). Tablo 3.4.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi yapraklarının fotosentetik pigment içeri i (mg/g) üzerine etkileri. Uygulama Klorofil a Klorofil b Klorofil a/b Toplam (mm B) Karotenoid -B (0) 0.25± 0.015 0.34± 0.055 0.74± 0.023 0.13± 0.01 K (0.05) 0.28± 0.015 0.28± 0.05 1± 0.033 0.14± 0.005 +B (0.1) 0.28± 0.021 0.23± 0.035 1.22± 0.027 0.13± 0.015 0,4 Klorofil Miktarı (mg/g TA) 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 Kla Klb 0 0 0,05 0,1 ekil 3.4.1. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi yapraklarının klorofil içeri i üzerine etkileri.
33 1,4 1,2 Kl a/b oranı 1 0,8 0,6 0,4 0 0,05 0,1 0,2 0 ekil 3.4.2. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi yapraklarının klorofil a/b oranı üzerine etkileri. toplam karotenoid miktarı (mg/g TA) 0,145 0,14 0,135 0,13 0,125 0 0,05 0,1 ekil 3.4.3. Farklı bor konsantrasyonlarının 30 günlük soya fasulyesi yapraklarının karotenoid içeri i üzerine etkileri.