Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 7 MON810 mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri M.Querci, M.Mazzara WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR E UROPA ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 2 İçindekiler Bölüm 7 MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri Roundup Ready Soyanın Özellikleri 3 MON810 Mısırın Özellikleri 7 Bt-176 Mısırın Özellikleri 11 Kaynaklar 16
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 3 Roundup Ready Soyanın Özellikleri 1 Kısa Tanımlama İsim GTS 40-3-2 Başvuran Monsanto Canada Şirketi Bitki Türü Glycine max L. (Soya Fasülyesi) Yeni Özellikler Roundup ready herbisitinin aktif içeriği Glufosat toleransı Genetik Modifikasyon Metodu Partikül bombardımanı (biyolistik) Önerilen Kullanım Hayvan besini (çoğunlukla yağdan arındırılmış olarak sıkıştırılmış gevrek ve yemek) ve insan tüketimi (çoğunlukla yağ, protein ve diyet liflerinde) için soya üretimi Temel Bilgi Soya hattı GTS 40-3-2 Monsanto Canada Şti. tarafından soya üretiminde zararlı bitkilerle mücadelede alternatif bir sistem olarak glufosatın kullanımına olanak sağlamak için geliştirilmiştir. GTS 40-3-2 nin geliştirilmesi, Agrobacterium tumefaciens suşu CP4 den izole edilen glufosat dirençli 5-enolpurivil-şikimat-3-fosfat sentaz (EPSPS) enzimini kodlayan genin, ticari soya çeşidi (Asgrow Tohum Şirketi) A5403 e aktarılması yolu ile olmuştur. Yeni Karakterin Tanımı Glufosat toleransı Roundup ın aktif molekülü olan Glufosat, sistemik, seçici olmayan zararlı ot kontrol maddesi olarak dünya çapında kullanılan bir herbisittir. Glufosat 5-enolpurivil-şikimat- 3-fosfat sentaz (EPSPS) enziminin kompetitif inhibitörü olarak görev yapar. EPSPS fenilalanin, tirosin ve triptofan aromatik aminoasitlerinin üretiminde yer alan şikimat biyokimyasal yolunda zorunlu bir enzimdir (Şekil 1). EPSPS in engellenmesi büyümenin durdurulması ve bitki ölümüne yol açar. Aktarılan Glufosat tolerans geni bu enzimin bakteri kökenli (Agrobacterium tumefaciens CP4 suşundan) versiyonudur. Bitki, mantar ve mikroorganizmalarda 1 Kanada Besin Teftiş Ajansı, Karar DD95-05 den alınmıştır.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 4 bulunan bu enzim glufosata yüksek derecede dirençlidir. Bu nedenle inhibisyona uğramaz ve bitkinin aromatik amino asit metabolik ihtiyaçlarını karşılayabilir. Fosfoenolpiruvat + Eritroz-4-fosfat Şikimat-3-fosfat Fosfoenolpiruvat (PEP) Glifosat (Roundup ) N-(fosfonometil) glisin 5-enolpiruvil-şikimat-3-fosfat (EPSP) Fenilalanin Tirosin Triptofan Şekil 1. EPSPS enzimi şikimat-3-fosfat ve fosfoenolpiruvat (PEP) arasındaki reaksiyonu katalize eder. 5-enolpiruvil-şikimat-3-fosfat (EPSP) ile fosfat bu reaksiyonun ürünleridir. EPSP, aromatik aminoasit sentezinde gerekli bir ara moleküldür. Bu biyokimyasal yolun glufosat tarafından engellenmesi, protein sentezini engelleyerek bitki ölümüne yol açar. EPSPS, glufosatın bitkideki tek hedef enzimidir ve PEP kullanan diğer enzimler glufosattan etkilenmezler EPSPS geni kuvvetli bir konstitütif promotör olan karnıbahar mozaik virüsü (P- CaMVE35S) ve A. tumefaciens kaynaklı nopalin sentaz terminatörü (T-nos) ile kontrol edilmektedir (Şekil 2). Bitki kökenli, kloroplast transit peptidi (Petunia hibrida dan CTP4) kodlayan DNA sekansı glufosat tolerans geninin 5 ucuna klonlanmıştır. EPSPS genine birleştirilen sinyal peptidi yeni sentezlenen enzimin şikimat yolunun bulunduğu ve glufosatın etkisini gösterdiği kloroplastlara geçişini
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 5 sağlar. Geçiş gerçekleştikten sonra, transit peptidi özel bir proteaz ile enzimden ayrılır ve hızlı bir şekilde parçalanır. EPSPS sentaz doğada yaygın olarak bulunur ve toksik ve allerjik olması beklenmez. Toksik ve allerjik polipeptidlerin sekans databazlarında karşılaştırma analizleri yapıldığında bilinen herhangi bir toksin yada allerjenin aminoasit sekansı ile önemli bir homoloji göstermemiştir. P-E35S CTP4 CP4 EPSPS T-nos Şekil 2. Roundup Ready soya gen kasetinin şematik gösterimi (Padgette ve ark. 1995 ten uyarlamam). Geliştirme Metodu Ticari soya çeşidi A5403 (Asgrow Tohum Şirketi) altın partikül bombardıman yoluyla, E.coli den elde edilen plasmid vektörü PV-GMGT04 ile transforme edilmiştir (bakınız Şekil 3). PV-GMGT04, glufosat toleransı kodlayan CP4 EPSPS genini, seçici markör olarak β-glukoronidaz üretimi için gus genini, ve antibiyotik direnci için nptii genini (kanamisin direnci) içermektedir. Seçilen ilk transformantta biri gus seçici markörü, diğeri glufosat tolerans geni ile olmak üzere iki integrasyon bölgesi görülmüştür. Bu iki bölge, izleyen eşeyli üreme jenerasyonlarında bağımsız olarak ayrışmış ve analizler sonucu, hat GTS 40-3-2 de sadece glufosat tolerans geninı içeren tekil bir bir integrasyon bölgesi bulunduğu görülmüştür. Bitki Genomuna Sabit İntegrasyon İlk verilere göre (Padgette ve ark. 1995, 1996) GTS 40-3-2, nos poliadenilasyon sinyali, CP4 EPSPS sekansı, kloroplast sinyal peptidi ve CaMV 35S promötörü içeren CP4 EPSPS gen kasetinin tek bir fonksiyonel kopyasını içermektedir. Orjinal plasmid vektörden bitkiye bu füsyon gen dışında başka bir kodlama bölgesinden geçiş bulunmamıştır. İzleyen nesillerde bu birleşik genin ayrışması gözlenmediğinden, GTS 40-3-2 hattının birleşik gen için homozigot olduğu kabul
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 6 edilmiştir.6 nesil boyunca yapılan DNA analizleri, gen entegrasyonunun sabit kaldığını göstermiştir. Güncel karakterizasyon çalışmaları, DNA entegrasyonu sırasında farklı düzenlemeler meydana geldiğini göstermiştir. Roundup Ready soya 40-3-2, işlevsel olan birincil gen entegrasyonu bölgesi haricinde 250 bp ve 72 bp lik iki küçük, fonksiyonel olmayan DNA dizisi daha içermektedir (Mansanto 2000, Windels ve ark. 2001). Şekil 3. Roundup Ready soya vaka 40-3-2 geliştirmek için kullanılan PV-GMGT04 plazmid (Monsanto, 2000) Düzenleme Kararı Roundup Ready (RR) soya şu anda Avrupa Birliğinde pazara sunum için onaylanan tek transgenik soya hattıdır. 1994 de ABD de onay almasından sonra Avrupa Birliğine ithaline 96/281/EC Komisyon kararı ile 3 Nisan 1996 da onay verilmiştir. Bu karar yanlızca tohumun Avrupa Birliğine ithaline, kısmi olarak soya içeren besin, hayvan gıdası gibi canlı olmayan ürünlerin endüstriyel işlenmesi amacı ile üretimi için izin verir.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 7 MON810 Mısırın Özellikleri 2 Kısa Tanımlama İsim Başvuran Bitki Türü Yeni Özellikler Genetik Modifikasyon Metodu Önerilen Kullanım Vaka MON810 mısır (ticari ismi Yieldgard ) Monsanto Canada Şirketi Zea mays L. (mısır) Avrupa Mısır kurduna direnç (Ostrinia nubilalis) Partikül bombardımanı (biyolistik) İnsan tüketimi için Z. mays üretimi (tohum yağı ve yaş veya kuru öğütme) ve çiftlik hayvanları besini olarak Temel Bilgi Mısır MON810 (YieldGard ) Avrupa Mısır kurduna (ECB, Ostrinia nubilalis) dirençli olarak Monsanto Canada Şirketi tarafından geliştirilmiştir. Geleneksel pestisitler kullanılmadan ECB nin larval dönemlerinde sebep olduğu ürün kayıplarını önlemek için bir yöntem sağlamıştır. MON810 bitki hücrelerine mikroprojektil bombardıman ve rekombinant DNA teknolojisi yolu ile, doğada bulunan insektisidal (böcek öldürücü) proteini (Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki den) kodlayan genin aktarılması ile geliştirilmiştir. Bu protein ECB nin de dahil olduğu kelebek ve güveleri içeren bazı Lepidoptera türlerine karşı aktiftir. MON810 da ifade edilen insektisidal protein CRYIA(b) δ-endotoksinin kısaltılmış bir gen versiyonu ile ifade edilir ve mısır bitkilerini ECB larvaları tarafından verilen yaprak ve bitki sapı zararından korur. Yeni Karakterin Tanımı Avrupa Mısır kurduna direnç Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki endospor oluşturan, gram pozitif, toprakta yaşayan bir bakteridir. Sporogenik döneminde endospora ek olarak Avrupa mısır kurdu (ECB), Ladin tomurcuk kurdu, Çingene güvesi, Diamondback güvesi, Tütün tomurcuk kurdu, Lahana kurdu gibi bazı lepidoptera böceklere karşı, aralarında aktif 2 Kanada Besin Teftiş Ajansı, Karar 97-19 dan alınmıştır.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 8 CRYIA(b) δ-endotoksin aktif proteini de olmak üzere bir çok insektisidal protein kristali üretmektedir. Bu proteinin insanlara, diğer omurgalılara ve yararlı böceklere toksik olmadığı defalarca gösterilmiştir (Lee ve ark. 1995). MON810, konstitütif CaMV 35S promotörü ve HSP70 intron lider sekansının kontrolünde olan tek kopya cryia(b) geninin aktarılması yoluyla geliştirilmiştir (Şekil 4). Bacillus thuringiensis ssp.hd-1 den alınan cryia(b) genini kodlayan sekans, CRYIA(b) δ-endotoksin proteinin bitkilerde ifadesini en iyi şekilde arttırmak için modifiye edilmiştir. Protein kırılma sonrası tripsin dirençli bio-aktif bir moleküle dönüşür ve lepidopteran larvalarına toksik hale gelir. İnsektisidal aktivitenin, bu aktif proteinin hassas böceklerin orta bağırsak epitel hücrelerindeki özel alıcılara tutunmasına bağlı olduğu düşünülmektedir. Bunu izleyen gözenek oluşumu ozmotik dengeyi bozarak hücrenin patlamasına yol açar. Bu proteine hassas olan mısırın lepidoptera zararlıları ECB ve mısır kulakkurdu dur. Değiştirilmiş mısırda ifade edilen toksinin aminoasit sekansının doğada bulunan proteinle aynı ve organik besin endüstrisi tarafından biopestisit olarak yaygın biçimde kullanılan protein ile eşdeğer olduğu tespit edilmiştir. P-E35S hsp70 cryia(b) T-nos Şekil 4. MON810 mısırda kullanılan PV-ZMBK07 plasmidinde yer alan cryia(b) gen kasetinin ve hsp70 intron 1 in şematik gösterimi (BATS, 2003). P-E35S: geliştirilmiş CaMV 35S promotör hsp70: mısır hsp70 intron 1 sekansı sentetik cry1a(b)geni T-nos terminasyon sekansı
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 9 Geliştirme Metodu MON810 PV-ZMBK07 ve PV-ZMGT10 plazmidlerinin biyolistik yöntemi ile birlikte mısır genotipi Hi-II ye aktarılması ile elde edilmiştir. PV-ZMBK07 plazmidi cryia(b) genini (Şekil 5) PV-ZMGT10 plazmidi ise CP4 EPSPS ve gox genlerini taşımaktadır. Her iki plazmid de E. coli de replikasyon için gerekli olan puc plasmidi replikasyon orijin sekansını(ori-puc) ve bakteri promotör kontrolu altında nptii genini (bakteri seçimi için) taşımaktadır. Her iki vektör de bitki kültürü hücrelerine mikroprojektil bombardımanı ile aktarılmıştır. Aktarılan hücrelerden Glufosat dirençli olanlar seçilmiş ve bitki rejenerasyonu için gerekli doku kültürü ortamlarına alınmıştır (Amstrong ve ark. 1991) Yazarlar tarafından sağlanan moleküler analizlerde, sadece PV-ZMBK07 plazmidindeki genetik elementlerin MON810 genomuna tek bir kopya olarak yerleştiği görülmüştür. Geliştirilmiş CaMV 35S promotörü, hsp70 ön sekansı ve kısaltılmış cryia(b) gen sekansları tam iken, gen kasedinin 3 ucunun kopması sebebi ile PV- ZMBK07 de bulunan nos 3 terminasyon sinyalinin kaybolduğu, bu nedenle alıcı genomuna yerleşmediği tespit edilmiştir (BATS 2003). Şekil 5. MON810 mısırda kullanılan PV-ZMBK07 plasmidinin şematik gösterimi (Agbios Database, Essential Biosafety)
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 10 Bitki Genomuna Sabit İntegrasyon Yazarlar tarafından sağlanan veriler, segregasyon ve stabilitenin, cryia(b) geninin MON810 genomuna tek bir bölgeden entegre olmuş olması ile uyum gösterdiğini ortaya koymaktadır. Entegrasyon stabilitesi birçok nesil boyunca çaprazlama ile gösterilmiştir. Bu mısır hattı farklı mısır genotipleri ile 4 nesil boyunca çaprazlandığında ECB ye karşı direnç devam etmiştir. MON810 hattı üçüncü nesilden geri çaprazlama yolu ile elde edilmiştir. Üç nesil boyunca bu tekli yerleşmenin sabit integrasyonu Southern Blot analizleri ile gösterilmiştir. Düzenleme Kararı Mısır hattı MON810 un Birleşik Devletlerde ekilmesi Temmuz 1996 da Çevre Koruma Ajansı tarafından onaylanmıştır. Bu mısır hattının Avrupa Birliğinde ticarileşmesi 22 Nisan 1998 tarih 98/294/EC nolu Komisyon kararı ile teyit edilmiştir (Komisyon Kararı 98/294/EC). Kanada Besin Teftiş Ajansı, bu mısır hattının besin ve yem olarak onayını Karar Dokümanı 97-101 ile yayınlamıştır. MON810 hattı Arjantin, Avustralya, Japonya, Güney Afrika ve İsviçre de onaylanmıştır. Bu mısır hattı insan tüketimi için (yaş ve kuru öğütme ve tohum yağı) ve çiftlik hayvanlarının yemi olarak tasarlanmıştır.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 11 Bt-176 Mısırın Özellikleri 3 Kısa Tanımlama İsim Başvuran Bitki Türü Yeni Özellikler Genetik Modifikasyon Metodu Önerilen Kullanım Vaka 176 Bt mısır Ciba-Geigy Ciba Tohumculuk ve Mycogen Şirketi Zea mays L. (mısır) Avrupa mısır kurduna direnç (Ostrinia nubilalis), glufosinat amonyum herbisitine tolerans Olgunlaşmamış embryolarda partikül bombardımanı (biyolistik) Hibrid tane mısır olarak tarım (yetiştirme) Temel Bilgi Ciba Tohumculuk ve Mycogen Anonim Şirketi Avrupa Mısır kurduna (ECB) dirençli bir mısır hattı geliştirmişlerdir. Vaka Bt-176 olarak tanımlanan bu mısır hattı, embriyolara mikroprojektil bombardıman ve rekombinant DNA teknolojisi yolu ile doğada bulunan, insektisidal bir proteini (Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki den) kodlayan genin aktarılması ile geliştirilmiştir. Bu protein Lepidoptera takımına ait, ECB nin de dahil olduğu bazı kelebek ve güve türlerine karşı aktiftir. Bu protein doğadaki CRYIA(b) δ-endotoksinin en sekansı kısaltılmış bir versiyonudur şeklidir ve mısır bitkilerini ECB larvaları tarafından verilen zararlardan korur. Buna ek olarak bu hat mısıra, genetik olarak değişikliğe uğratılmış bitkileri çok erken gelişme dönemlerinde seçip ayrıştırabilmek için herbisit glufosinat amonyum herbisitine direnç sağlayan bir başka gen de aktarılmıştır. Yeni Karakterlerin Tanımlanması Avrupa mısır kurduna (ECB) direnç Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki endospor oluşturan, gram pozitif, toprakta yaşayan bir bakteridir. Sporogenik döneminde endospora ek olarak Avrupa mısır kurdu (ECB), Ladin tomurcuk kurdu, Çingene güvesi, Diamondback güvesi, Tütün tomurcuk kurdu, Lahana kurdu gibi bazı lepidoptera böceklere karşı, aralarında aktif 3 Kanada Besin Teftiş Ajansı, Karar 96-09 dan alınmıştır.
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 12 CRYIA(b) δ-endotoksin aktif proteini de olmak üzere bir çok insektisidal protein kristali üretmektedir. Bu proteinin insanlara, diğer omurgalılara ve yararlı böceklere toksik olmadığı defalarca gösterilmiştir (Lee ve ark. 1995). Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki HD-1 suşundan alınan sentetıik cryia(b) geni, CRYIA(b) δ-endotoksin proteinin daha kısa bir versiyonunu kodlar. Bu gen mısırdaki ifadesini arttırmak için sentetik olarak geliştirilmiştir ve nükleotid dizini düzeyinde doğal genle %65 lik bir homoloji göstermektedir (Koziel ve ark. 1993). Kısaltılmış cryia(b) geni doğal CRYIA(b) proteinin insektisidal aktivite gösteren bölgesini içermektedir. İnsektisidal aktivitenin, bu aktif proteinin hassas böceklerin orta bağırsak epitel hücrelerindeki özel alıcılara tutunmasına bağlı olduğu düşünülmektedir. Bunu izleyen gözenek oluşumu ozmotik dengeyi bozarak hücrenin patlamasına ve böceğin ölümüne yol açar Vaka Bt-176 iki ayrı sentetik cryia(b) gen konstrüksiyonu taşıyan bir vektörün transformasyonu ile elde edilmiştir. Konstrüksiyonların birinde cryia(b) geni mısır fosfoenolpiruvat-karboksilaz (P-PEPC) promotörünün transkripsiyonel kontrolü altındadır ve sadece yeşil dokularda ifade edilir. İkinci konstrüksiyonda aynı gen mısır kalsiyuma bağlı protein kinaz promotörü (P-CDPK) kontrolü altındadır ve özellikle polende ifade edilir. Her iki konstrüksiyonda da gen kaseti Karnıbahar Mozaik Virüs kökenli terminatör ile durdurulur. Gen kasetleri ayrıca mısır fosfoenolpiruvatkarboksilaz geninin intron 9 parçasını içermektedir (bakınız Şekil 6 ve Şekil 7). CRYIA(b) proteinin yeşil dokularda ifadesi ilk nesil yapraklar üzerinde beslenen ECB larvalarına karşı direnç kazandırmak için tasarlanmıştır. Polendeki ifade ise polen üzerinde beslenen ikinci nesil ECB larvalarını hedef alarak tasarlanmıştır. Bt-176 yapraklarından elde edilen CRYIA(b) proteini, memeli mide koşulları taklit edilerek in vitro sindirim denemelerine maruz bırakılmış ve geleneksel besin proteinleri gibi parçalandığı gösterilmiştir. P-CDPK cryia(b) T-35S PEPC Intr # 9 Şekil 6. CDPK promotör kontrolü altında sentetik cryia(b) gen kaseti şematik gösterimi (Matsuoka ve ark., 2000).
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 13 PEPC Intr # 9 T-35S cryia(b) P-PEPC Şekil 7. PEPC promotör kontrolü altında sentetik cryia(b) gen kaseti şematik gösterimi (Matsuoka ve ark., 2000). Glufosinat amonyum herbist toleransı Glufosinat amonyum tolerans geni (bar geni) toprak bakterisi Streptomyces hygroscopicus dan elde edilmiştir. Bu gen CaMV35S konstitütif promotörünün transkripsiyonel kontrolü altında fosfinotrisin asetiltransferaz (PAT) enzimini kodlar ve polen dışında bütün bitki dokularında aktiftir. Fosfinotrisin, glutamin sentetaz inhibitörüdür ve glufosinat amonyum un aktif içeriğidir. Fosfinotrisinin herbisidal aktivitesi glutamin sentetaz enziöiminin inhibe edilmesi ile bitkide öldürücü miktarlarda amonyum akümülasyonu ile sonuçlanır. PAT fosfinotrisin asetilasyonunu katalize eder ve herbisidal aktivitesini ortadan kaldırır. Fosfinotrisin in L-izomeri (L-PPT) yaygın olarak yabani ot kontrolünde kullanılır. L- PPT glufosinat amonyumun herbisitinin aktif maddesidir. Hoechst tarafından geliştirilmiştir ve BASTA ticari ismi ile anılır. Bu izomer glutamin sentetazın substratı olan glutamatın yapısal analoğudur (L-PPT ve glutamatın karşılaştırılması için bakınız Şekil 8). Şekil 8. L-PPT (sol) ve glutamatın (sağ) karşılaştırılması
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 14 L-PPT ilk olarak Streptomyces viridochromogenes den izole edilmiştir. Bu organzima yanlızca fosfinotrisin L-izomerini sentezler. Sentetik glufosinat amonyum PPT nin D- ve L- izomerlerinin eşit mollarda rasemik bir karışımıdır (D-PPT herbisidal aktivite göstermez). PAT enzimi fosfinotrisin üzerinde etki gösterir,piruvat, kolin ve serin içeren diğer yaygın asetiltransferaz substratları üzerinde etkisi gözlenmemiştir. Memeli mide koşullarının taklit edildiği, E.coli tarafından ifade edilen PAT enzimi varlığında gerçekleştirilen in vitro sindirim çalışmalarında bu proteinin geleneksel besin proteini gibi sindirildiği görülmüştür. Glufosinat amonyum tolerans geni, bitki ıslahı sırasında transfer edilen genlerin izlenebilmesi ve transforme olan embryoların seçici ortamda tanımlanabilmesi için markör olarak bitkiye aktarılmıştır. Rapor edilen (FSANZ 2000), moleküler veriler, BT- 176 vakasının karnıbahar mozaik virüsü 35S promotörü ve 35S terminatörü (sırasıyla P-CaMV-35S ve T-35S) kontrolünde tek kopya bar geni taşıdığını işaret etmektedir(bakınız şekil 9). P-35S bar T-35S Şekil 9. bar genine ait şematik gösterim (Matsuoka ve ark., 2000) Geliştirilme Metodu Bt-176 vakası iki plazmidin biyolistik transformasyon yolu ile kendilenmiş mısır hattı CG00526 (Zea mays L.) ya aktarılması sonucu elde edilmiştir. İki sentetik cryia(b) geni tek bir plazmide (pcib4431) birlikte klonlanmıştır. Aktarılan ikinci plazmid vektörü (pcib3064), toprak bakterisi Streptomyces hygroscopicus dan izole edilen herbisit tolerans geni (bar) taşımaktadır. İki vektör, mısır hattı CG00526 ın olgunlaşmamış embriyolarına partikül bombardıman yoluyla aktarılmıştır. Gen aktarılan bitkilerde yapılan moleküler analizler bu mısır vakasının genomuna her plazmid vektörün iki ya da daha fazla kopyasının yerleştiğini göstermiştir. Testler ve Northern Blot analizleri, bakteri geriplanında vektörleri seçmek amavı ile aktarılmış olan bakteri promotörü tarafından kontrol edilen ampisilin direnç geninin (bla geni)
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 15 yaprak dokusu ya da polende ifade edilmediğini göstermektedir. İki bağımsız transgenik mısır bitkisi daha sonraki çaprazlama ve karakterizasyon için seçilmiştir: Vaka 171 ve Vaka 176 (Koziel ve ark. 1993). Buna ek olarak yapılan karakterizasyon çalışmaları Bt-176 mısırda cry1a(b) (Koziel ve ark 1993), bar ve bla genleri (Privalle 1994) bulunduğunu ispatlamıştır. Yeni Zelanda gıda standartları (FSANZ 2000) tarafından rapor edilen verilere göre Bt-176 mısır DNA Southern Blot analizleri ile görüldüğü üzere, bu vakada 6 kopyaya kadar cry1a(b) ve bla geni ve en az iki kopya bar geni (35S promotörü ile birlikte) bulunabilir (Privalle 1994). Karakterlerin Yerleşmesindeki Sabitlik Rapor edildiği üzere (FSANZ 2000), serada büyüyen bitkilerin polen ve yeşil yapraklarında CRY1A(b) ve PAT protein üretimi 4 başarılı geri çaprazlama nesli boyunca sabit kalmıştır. Segregasyon analizleri ECB ye direnç ve herbisit toleransı özelliklerinin Mendel karakterleri gibi ko-segrege olduğunu göstermiştir. 3240 bitki üzerinde yapılan bir çalışmada yalnızca 5 bitki (%0,15) glufosinat amonyuma dirençli fakat ECB larvalarının zararlarına karşın hassas bulunmuştur. Düzenleme Kararları Ağustos 1995 de, ABD Çevre Koruma Birimi 2000 yılına kadar Vaka 176 dan gelen tarla mısırının ticarileştirilmesini koşullu olarak onaylamıştır. Bu mısır hattının Avrupa Birliğinde ticarileşmesi için gerekli komisyon kararı (97/98/EC) 23 Ocak 1997 de yasallaşmıştır. Bu mısır hattı ziraai, endüstriyel işlemlerde tohum olarak ve hayvan besini olarak üretimi ve tohum üretimi amacıyla ekilmek üzere tasarlanmıştır (Komisyon Kararı 97/98/EC).
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 16 Kaynaklar Agbios database on Essential Biosafety. Molecular Characterization of MON810 inserted DNA. http://www.agbios.com/main.php (accessed January 2010) Armstrong, C.L., Green, C.E. and Phillips, R.L. (1991). Development and avaibility of germplasm with high type II culture formation response. Maize Genetics Cooperation Newsletter 65, 92-95. BATS (2003). Genetically Modified (GM) Crops: molecular and regulatory details. http://www.bats.ch/gmo-watch/index.php (accessed January 2010) Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate. Plant Biosafety Office. Decision Document DD96-09: Determination of Environmental Safety of Event 176 Bt Corn (Zea mays L.) Developed by Ciba Seeds and Mycogen Corporation. http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9609e.shtml (accessed January 2010) Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate. Plant Biosafety Office. Decision Document DD95-05: Determination of Environmental Safety of Monsanto Canada Inc.s Glyphosate Tolerant Soybean (Glycine max. L.) Line GTS 40-3-2. http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9505e.shtml (accessed January 2010) Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate. Plant Biosafety. Decision Document 97-19: Determination of the safety of Monsanto Canada Inc. s Yieldgard TM Insect Resistant Corn (Zea mays L.) MON810. http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9719e.shtml (accessed January 2010) Commision Decision 97/98/EC of 23 January 1997 concerning the placing on the market of genetically modified maize (Zea mays L.) with the combined modification for insecticidal properties conferred by the t-endotoxin gene and increased tolerance to the herbicide glufosinate ammonium, pursuant to Council Directive 90/220/EEC.(OJ L 31,1.2.1997, p.69)
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 17 Commision Decision 96/281/EC of 3 April 1996 concerning the placing on the market of genetically modified soyabeans (Glycine max L.) with increased tolerance to the herbicide glyphosate, pursuant to Council Directive 90/220/EEC. (OJ L 107, 30.4.1996), p. 10) Commision Decision 96/294/EC of 22 April 1998 concerning the placing on the market of genetically modified maize (Zea ays L. line MON810) pursuant to Council Directive 90/220/EEC. (OJ L 131, 5.5.1998, p. 33). Foods Standarts Australia New Zealand-FSANZ (formerly Australia New Zeland Food Authority-ANZFA) (2000). Draft risk analysis report. Food produced from insect-protected Bt-176 corn. Application 385, http://www.foodstandards.gov.au/_srcfiles/a385%20fa.pdf (accessed January 2010) Koziel, M. G.et al. (1993). Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thrungiensis BIO/Technology 11, 194-200. Lee, T.C., Zeng, J., Bailey, M., Sims, S.R., Sanders, P.R. and Fuchs, R.L. (1995). Assessment of equivalence of insect protected corn- and E-coli produced B.t.k. HD-1 protein. Plant Physiol. Suppl. 108, 151. Matsuoka, T., Kawashima, Y., Akiyama, H., Miura, H., Goda, Y., Kusakabe, Y., Isshiki, K., Toyota, M. and Hino. A. (2000). A method of detecting Recombinant DNAs from four lines of genetically modified maize. Journal of Food Hygienic Society of Japan 41, 137-143 Monsanto Company (2000). Updated Molecular Characterization and safety Assessment of Roundup Ready Soybean Event 40-3-2. Monsanto Report, Product Safety Centre. Padgette, S.R., Kolacz, K.H., Delannay, X., Re, D.B., LaVallee, B.J., Tinius, C.N., Rhodes, W.K., Otero, Y.I., Barry, G.F., Eicholtz, D.A., Perchke, V.M., Nida,D.L., Taylor, N.B. and Kishore, G.M. (1995). Development, identification and characterization of a glyphosate-tolerant soyabean line. Crop Science 35, 1451-1461
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soyanın Özellikleri 18 Padgette, S.R., Re, D.B., Barry, G.F., Eicholtz, D.A., Delannay, X., Fuchs, R.L., Kishore, G.M and Fraley, R.T. (1996). New weed control opportunities: Development of soybeans with Roundup Ready gene. In Duke, S.O. (ed.). Herbicide-Resistant Crops. Agricultural, Economic, Regulatory and Technical Aspects. CRC Lewis Publishers., pp 53-84. Privalle L. (1994). Quantification of Cry1A(b) and PAT proteins in Bt corn (corn) tissues, whole plants and silage. Performing laboratory: Ciba Seeds Agricultural Biotechnology Research Unit, Ciba-Geigy Corporation, research Triangle Park. NC, USA. Study No CAB-009-94. Windels, P., Taverniers, I., Depicker, A., Van Bockstaele, E. and De Loose, M. (200!). Characterization of the Roundup Ready soybean insert. European Food Research Technology 213, 107-112.