GÜVENLİ VE ETKİN LABORATUVAR UYGULAMALARI 111-546 KONTAMİNASYONSUZ ÇALIŞMA KURALLARI Doç. Dr. Hilâl Özdağ STERİL ÇALIŞMAK Her ne kadar moleküler biyoloji laboratuvarlarındaki genel çalışmalar kesin sterilite gerektirmiyorsa da steril çalışma kurallarını rutin olarak uygulama alışkanlığı deneylerin sağlıklı akışını güvene alır. Steril çalışma alışkanlığı RNA çalışmaları, radyoaktif çalışmalarını çok kolay ve güvenilir hale getirecektir. 1
NE ZAMAN STERİL ÇALIŞMAK GEREKİR? Transformasyon için E.coli kültürü hazırlandığında LB petrileri hazırlandığında, Hücreler ayırılıp/bölündüğünde(split) Besiyeri için serum filtre edilirken Liyofilize bakterileri açıp rehidrate ederken STERİL ÇALIŞMAK NE ZAMAN TAVSİYE EDİLİR? Restriksiyon kesimi hazırlarken: Birçok enzim gliserol içinde hazırlanmasına ve gliserol bakteriyostatik olmasına rağmen (%50 ve üzeri) dilüe enzimler bakteriyel kontaminasyona açıktır. Ayrıca enzimler dışardan gelecek yabancı elementlerce inhibe olabilirler. PCR: PCR makinelerinin bulunduğu yer ve PCR ürünlerinin kontrol edildiği/kullanıldığı yerin PCR reaksiyonlarının kurulduğu mekanın birbirlerinden ayrı olması gerekmektedir. Hücrelerin 32P ile işaretlenmesi: Steril çalışmak ile kendinizi korumuş olursunuz. Radyoaktif reaktiflerin ağzını açık bırakıp aerosol oluşturmaz radyoaktif pipetleri yeniden kullanmamış olursunuz. 2
STERİL TEKNİK STERİL TEKNİK Çalışma alanınız kalabalık ve hareketten mümkün olduğunca uzakta olmalıdır: Pencereler kapalı olmalıdır. Kapı yanında çalışılmaz. Çalışma alanı boş olmalıdır: Çalışma tezgahında kullanmadığınız şişe, reaktif benzeri malzemeler bulunmamalıdır. Çalışmanız bittikten sonra kullandığınız malzemeleri yerlerine yerleştirip tezgahı temizleyip bırakmalısınız. Çalışma tezgahı kullanılmadan önce antiseptik/temizleme malzemesi ile silinmelidir: Genellikle %70 EtOH bu işi görür. Çalışma tezgahında %70 EtOH içeren bir şişe mutlaka bulundurulmalıdır. 3
STERİL TEKNİK Bütün pipetler ve şişeler steril olmalıdır: Eğer birşeyin steril olup olmadığında emin değilseniz kullanmayın. Çalışma alanınızı ve kullanacağınız araç ve reaktifleri en az hareket yapmanız gerekecek şekilde yerleştirin. Kullanacağınız herşeyi tezgah üzerinde hazır bulundurun. Mutlaka eldiven giyin. Eldivenlerinizin kontamine olduğunu düşündüğünüz anda değiştirin. STERİL ÇALIŞMADA TEKNİK İPUÇLARI ASGARİYE DÜŞÜRÜN Mesafeyi Maruz bırakma/kalma süresini Hareketleri Dökerek transfer etmeyi(pipetle transfer tercih edilmeli) 4
STERİL ÇALIŞMADA TEKNİK İPUÇLARI ŞİŞEAĞZINI45 o CAÇIYLAAÇIN EĞER BİR KAPAĞI YERE KOYMANIZ GEREKİYORSA KAPAĞI AĞZI AŞAĞI DÖNÜK OLACAK ŞEKİLDE TEMİZ BİR YÜZEYE BIRAKIN. (Kapak ağzını yukarı dönük olarak da bırakabilirsiniz ancak bu durumda elinizi kapak üzerine değdirmemelisiniz!) CAM PİPET VE AÇIK ŞİŞELERLE ALEV YANINDA ÇALIŞIN. STERİL ÇALIŞMADA TEKNİK İPUÇLARI PLASTİK ŞİŞE VE PİPETLERLE ÇALIŞIRKEN ALEV YANINDA OLMAYIN. PİPETLEMEYİ YAVAŞÇA YAPIN ŞİŞEYİ ÇALKALAMAYIN (Aerosol oluşumunu engeller). ŞİŞELERİN AĞIZLARINI AÇIK BIRAKMAYIN. 5
STERİLİTENİN KAYBOLDUĞU DURUMLAR Pipetin içine çok fazla sıvı çekmek: Pipeti atın pipetörü kontrol edin, filtreyi değiştirmeniz gerekebilir. Pipetin ucunu şişeye, yere veya pipet kutusunun dışına değdirmek: Pipeti atın. Ağzıaçıkbirkapveyatüpüyeredüşürmek:Düşeniatın! Filtreye değmiş olan herhangi birşeyi atın: Vakum filtresi Çalışırken pipetleri tekrar tekrar kullanmak: Bir pipet bir kez ıslandıktan sonra artık havadan kontamine olması çok kolay hale gelir. PİPETLEME Cam Pipetler Cam pipetler metal kutularda steril edilerek kullanılır. Hücre veya bakteri için kullanılanlarının pamuk tıkaçlı olması gerekir. Kutunun kapağını gevşet. Birelilekutuyututarkendiğerelilekapağıçıkar. Kutunun ağzını ve kapağını ateşten geçir. Kapağı yere koy. Kutuyu yatay olarak tutarken hafifçe sallayarak pipetlerin uca doğru gelmesini sağla. 6
PİPETLEME Cam Pipetler Bir pipeti baş ve işaret parmaklarını kullanarak ucundan tutup kutunun dışına değdirmeden çek. Pipetinalt1-3 ünü180 o Cçevirerek1-3snalevdengeçir. Pipetleme yapacağın şişeyi 45oC açı ile eğdikten sonra. Şişeyi tuttuğun elin iki parmağıyla şişenin kapağını aç. Diğer elinde pipet yardımcısına bağlı pipet var iken şişenin ağzını alevden geçir. Pipeti yeniden alevden geçir. PİPETLEME Cam Pipetler Pipeti şişe içindeki sıvıya daldır. Yeterince sıvıyı pipete çektikten sonra pipeti şişeden yavaşça çıkar. Şişeyi ve kapağını alevden geçirdikten sonra şişenin ağzını kapayıp bir kenara koy. Bu arada bir elinde içinde sıvı dolu pipet var iken sıvıyı transfer edeceğin şişeyi aç. Pipeti şişenin içine daldırıp sıvıyı transfer et. Pipeti dezenfektan solüsyon içeren kaba koy. Şişenin ağzını ve kapağını alevden geçirip kapat. 7
PİPETLEME Tek Kullanımlık Pipetler Cam pipet gibi kullanılır. Alev aşaması yapılmaz. Kullanıldıktan sonra çift biyoatık torbası geçirilmiş çöp kutusuna veya özel pipet tek kullanımlık çöp kutusuna atılır. Tek kullanımlık pipetin paketi yukarıdan (pipetin tıkaçlı uç tarafı) açılıp pipet yavaşça hiçbir yere temas etmemesi sağlanarak çıkarılır. DÖKME Bir elinizle içine dökeceğiniz kabı diğer elinizle içinden dökeceğiniz kabı tutun: Her iki kabın ağzını teker teker ateşten geçirin. Alıcı kabı bir açı ile tutarken verici kabı alıcı doğru eğip yaklaşık 5 cm yukarıdan tutup yavaşça dökün. Herikikabındaağzınıateşten geçirin. Dökme usulünü transfer edeceğiniz hacim pipetleme yapılamayacak kadar büyükse tercih edin zira bu usül kontaminasyona davetiye çıkaran bir usüldür. 8
FİLTRE STERİLİZASYONU Küçük hacim için şırınga filtresi ile sterilizasyon: Gerekenler: 0.2 um şırınga filtresi Tek kullanımlık steril şırınga Sterilalıcıtüp Tüplük Şırınga filtresinin yalnızca üstünü aç(geniş olan yüzü) Şırıngayı paketinden çıkarıp sıvıyı şırıngaya çek. Şırıngalı filtreye tak. Alıcı tüpü tüplüğün üzerine koyduktan sonra sıvıyı şırıngaya basıp filtreden geçirmek suretiyle tüpe aktar. Tüpün ağzını kapat, üzerini etiketle, şırınga ve filtreyi biyolojik atığa at. FİLTRE STERİLİZASYONU Büyük hacim için vakum filtre ünitesi ile ile sterilizasyon: Gerekenler: Tek kullanımlık 0.2 um filter Vakum filtre ünitesi Vakum pompası Vakum düzeneğini kurulur. Vakum düzeneğinin altında steril şişe veya erlen bulunur. Steril tek kullanımlık filtre pens ile düzeneğin içine yerleştirilir. Steril edilecek solüsyon üst kaba konup vakum açılır. Süzme işi bittiğinde vakum kapatılıp kısa bir süre beklendikten sonra düzenek sökülüp steril solüsyon şişedeyse ağzı steril kapakla kapatılır, erlendeyse steril şişeye aktarılır. 9
KENDİNİZİ KORUYUN Mikroorganizmaların laboratuvar çalışanları ve çevreye verdikleri zarara göre sınıflandırılması: Advisory commitee on dangerous pathogens(acdp) US Department of Health and Human Services(USPHS) World Health Organisation(WHO) USPHS (1974) Class 1 Hiç veya minimal Class 2 Potansiyel Class 3 Özel, kişiye Class 4 Yüksek, kişiye WHO (1979) Risk Grubu 1 Düşük birey Düşük toplum RiskGrubu 2 Orta birey Düşük toplum Risk Grubu 3 Yüksek birey Düşük toplum Risk Grubu4 Yüksek birey Yüksek toplum ACDP (1990) Zararlı Grubu 1 İnsan hastalığı yaratmayacak gibi Zararlı Grubu 2 Laboratuvar çalışanları için hastalık yapabilecek ancak toplum için tehlikeli değil. Zararlı Grubu 3 Laboratuvar çalışanlarına bazı zararlarıolup topluma yayılabilecek olan Zararlı Grubu 4 Laboratuvar çalışanları için ciddi zarar oluştururken toplum için yüksek risk yaratanlar. BİYOGÜVENLİK Mikroorganizmaların laboratuvar çalışanları ve çevreye verdikleri zarara göre sınıflandırılması: Advisory commitee on dangerous pathogens(acdp) US Department of Health and Human Services(USPHS) World Health Organisation(WHO) SEVİYELER ALTYAPI LAB UYGULAMASI GÜVENLİK DONANIMLARI 1 Temel İyimikrobiyoloji tekniği (İMT) 2 Temel İMS + koruyucukıyafet biyozararlı işaretleri 3 İzolasyon Seviye 2 + özel kıyafet, kontrollü giriş 4 Azamiizolasyon Seviye3 + hava engelli giriş, duş çıkışı, özel atık uzaklaştırması Açık tezgahta çalışma Açık tezgah + Potansiyel aerosol için güvenlik kabini Bütün aktiviteler için güvenlik kabini ClassII güvenlik kabini + basınç gradienti 10
BİYOGÜVENLİK Laminar akışlı kabinler Yalnızca ürünü korur. Kesinlikle biyozararlı veya kimyasal zararlı bir reaktifle bu kabinler içinde çalışılmamalıdır. Herhangi potansiyel enfeksiyöz aerosol kullanıcı ve çevreye bulaşır. Yatay hava akışlı tezgahta hedef kullanıcı iken Dikey hava akışlı tezgahta hedef çevre olacaktır. Biyolojik güvenlik kabinleri Hem kullanıcı hem çevre hem de ürün korunabilir. BİYOGÜVENLİK HEPA FİLTRE High Efficiency Particulate Air Boron silikat mikrofiberlerinden oluşmuş alüminyum separatörlerle ayrılmış ince tabakalardan oluşur Havada uçuşan partikül ve mikroorganizmaları filtre eder. 11
BİYOGÜVENLİK KABİNLERİ SINIFLAR ÇALIŞANI KORUYORMU? DENEY MALZEMESİNİ KORUYOR MU? I Kısmen Dolaşan hava bariyeri HEPA filtreli egzos Hayır Sterilolmayan çalışma yüzeyi. Filtre olmamış oda havası çalışma alanında dolaşır. UYGUN OLDUĞU UYGULAMALAR Rutin lab uygulamaları. Kimyasal karsinojenler, düşük seviyeli radyasyon, uçucu çözücülere karşı çalışanı korur. Çeker ocaklara benzer ancak filtrasyonu o denli verimli değildir. II Kısmen Dolaşan hava bariyeri HEPA filtreli egzos Evet Alınan bütün hava filtre olur. Düşük orta risklionkojenik virüsler. Hücre ve bakteri kültürü. III Evet Fizikselbariyer (eldiven kutusu); HEPA filtreli egzos Evet Alınan bütün hava filtre olur. Hava dolaşımı Class II den daha zayıftır; malzeme o kadar korunmaz. Yüksek riskli patojenler. Çok zehirli kimyasal ve karsinojenlerin kullanılması durumunda. BİYOGÜVENLİK KABİNLERİ CLASS I Çalışanın ve çevrenin korunmasını sağlar. Hava akışı çalışana doğru değildir ancak HEPA filtreden geçmediği için ürün korunumu sağlamaz. Çeker ocağa benzer ancak HEPA filtresi ile çevreye çıkan hava temizleyip verir. 12
BİYOGÜVENLİK KABİNLERİ CLASS II Çalışanın, çevrenin ve ürünün korunmasını sağlar. Gelen ve çıkan hava HEPA filtreden geçer. İçeri giren havanın debisine göre IIA, B, B1 ve B2 tipleri vardır. BİYOGÜVENLİK KABİNLERİ CLASS III Çalışanın, ürünün ve çevrenin korunmasını sağlar. Hava geçirmeyecek şekilde kapalıdır. Bütün prosedürler kol uzunluğunda kauçuk eldiven ile gerçekleştirilir. Egzos sisteminde iki HEPA filtre bulunur. Yüksek patojen organizmalar ve çok toksik maddelerin kullanımı bu kabinlerin içinde gerçekleştirilir. 13
BİYOGÜVENLİK KABİNLERİNDE ORTAK ALAN KURALLARINA UYMAK Kabini kullanacak başka kişilerin varlığını unutmadan mümkün olduğunca hızlı kullanmalısınız. Çamaşır suyu,%70 EtOH şişelerini bittikçe doldurmaya üşenmemelisiniz. Kesici ve biyozararlı çöp kutularını boşaltmayı başkalarından beklememelisiniz. İşiniz bitince kendinize ait hiçbir şeyi etrafta bırakmamalı, kabini temizleyip öyle kapatmalısınız. Kabinleri sık kullanıldığı lablarda kabinler gün boyunca açık bırakılabilir. Bu durumda işiniz bittikten sonra kabin içini temizleyip öyle çıkmalısınız. 14