REFRAKTOMETRİ ENSTRÜMANTAL ANALİZ REFRAKTOMETRİ POLARİMETRİ Refraktometri: maddelerin ışığı kırma (refraction) özelliğinden yararlanan enstrümantal analiz yöntemlerinden biridir. Bir maddenin kırma indisi; o maddenin erime, kaynama, donma noktası ve yoğunluğu gibi kendine has bir fiziksel özelliktir ve belli şartlarda sabit bir değerdir. Bu özellikten yararlanılarak maddelerin tanınması veya kalitatif analizler yanında, kırılma indisi ile konsantrasyon arasındaki ilişkiden yararlanılarak kantitatif analizler de yapılabilmektedir. Elektromanyetik radyasyon bir yüzeye çarptığı zaman, ya yukarı doğru yansıtılır, ya da belli bir açı ile kırılarak yoluna devam eder. Bu olayda; yukarı doğru yansıtılan ışına yansıyan ışın (reflected ray), kırılarak yoluna devam eden ışına da kırılan ışın (refracted ray) denilir. Şekilde gösterilen geliş açısı ile (θ 1 ) kırılması açısının (θ 2 ) oranı belli şartlar altında her madde için sabittir ve o maddeye hastır. Buna o maddenin kırılma indisi veya refraktif indeks denir. Ve aşağıdaki bağıntı ile gösterilir: n= Sin (θ 1 ) Sin (θ 2 ) Rekraktif indeks ile ilgili bazı terimler: Refraktif indeks (RI)-Kırılma indisi (n): Geliş açısının sinüsünün kırılma açısının sinüsüne oranıdır. Geliş açısı: Gelen ışının normalle yapmış olduğu açı Kırılma açısı: kırılan ışının normalle yapmış olduğu açı. Normal: gelen ışının, yüzeye düştüğü yerden çizilen dik. Özgül kırılma indisi: bir maddeyi oluşturan her bir atom veya aralarındaki bağların bir kırılma indisi vardır. İşte maddeyi oluşturan tüm atom, atom grubu veya bağlarının oluşturduğu kırılma derecesine o maddenin özgül kırılma indisi denir. Moleküler kırılma indisi: özgül kırılma indisinin, maddenin molekül ağırlığı ile çarpımı ile bulunan bir değerdir Kırılma indisinin ölçülmesi- Refraktometreler Kırılma indisinin tayininde kullanılan aletlere refraktometre denir. Bugün çok basit anlamda ölçüm yapan refraktometreler olduğu gibi tamamen bilgisayarlarla donatılmış ve online (üretim hattına direkt bağlı) sistemler de geliştirilmiştir. 1
Kırılma indisi genellikle saydam cisimlerde ölçülür. Örneğin, organik sıvıların kırılma indisi 1.25 ile 1.80 arasında değişirken, katılarda bu değer 1.3 ile 2.5 arasındadır. Refraktometreler sınır açısı ölçümü prensibine göre çalışmaktadırlar. Her madde belirli şartlar altında ışığı farklı kırmaktadır. Dolayısıyla sınır açısı da her madde için özeldir. Sınır açısı Işınlar çok yoğun ortamdan az yoğun ortama geçerken ışının, normalle yaptığı açı büyür. Geliş açısını yavaş yavaş arttırdığımızda, kırılma açısı da buna paralel olarak yavaş yavaş büyür. Açı arttırma işlemine devam edildiğinde, öyle bir noktaya gelinir ki, artık gelen ışınlar, iki ortamı ayıran yüzeye paralel olarak olarak yoluna devam eder. Yani kırılma açısı 90 olur. Işının geliş açısını daha fazla arttırdığımızda artık kırılma olmaz ve ışınlar yansıyarak aynı ortam içerisinde kalır. İşte kırılmanın olduğu bu son noktadaki açıya sınır açısı veya kritik açı denir. Bu noktadaki kırılma indisi geliş açısına eşittir. Burada sınır açısının oluştuğu yerden itibaren kuvvetli (karanlık) bir bölge oluşur. Bu bölgenin yardımıyla kırılma indisi hesaplanır. Abbe refraktometresi Analiz laboratuvarlarında en yaygın olarak kullanılan refraktometrelerdir. Sınır açısı (kritik açı) ölçüm prensibine dayanır. Bu aletin kırılma indisi ölçüm aralığı genellikle 1.30-1.75 arasındadır. (hiç örnek olmadığında prizmanın kırma indisi 1.75 tir. Bunun üzerinde kırılma indisine sahip olan örnekleri okumaz) Bu sistemlerin RI ölçüm hassasiyetleri aynı aralıkta ±0.0003 tür. Kuru madde konsantrasyonundaki değişmeyi ise yaklaşık 1/1000 hassasiyetle ölçmektedir. Işın kaynağı olarak Na lambası kullanılır (λ=589 nm) Abbe refraktometresinin üstünlükleri a) Kullanılan örnek miktarının çok az olması. Birkaç damla örnek ile ölçüm yapılabilmektedir. b) Bu aletlerin ışık absorpsiyonlarının yüksek olması nedeniyle koyu ve bulanık cisimlerin de ölçümünün yapılabilmesi c) ışının kullanımının standardize edilmiş olması Abbe refraktometresinde okuma işlemi Kullanım öncesi aletin kırılma indisi, saf su ile 1.33 e ayarlanır (toluen kullanılırsa 1.4969) Daha sonra su veya solvent temizlenir ve prizmalar arasına, ölçümü yapılacak madde konularak okuma işlemi gerçekleştirilir. Bu aletlerin standart ölçüm sıcaklığı 20 C dir. Yüksek sıcaklıkta ölçüm yapıldığı zaman, bunun üzerindeki her sıcaklık derecesi için okunan değere, 0.00045 eklenir. Bu amaçla hazırlamış tablolardan da yararlanılabilir. Özellikle okuma yapılırken, sınır açısında karanlık bölge oluşumuna dikkat edilmeli ve daha sonra okuma yapılmalıdır. 2
Ölçümü yapılan madde yağ/yağlı ise prizma ölçüm sonrasında etanol ile temizlenir. Eter veya aseton gibi çabuk buharlaşma özelliğine sahip maddeler temizlemede kullanılmamalıdır. Çünkü bu maddeler çok hızlı bir şekilde buharlaşarak bulunduğu ortamın sıcaklığını değiştirir ve bazı hatalara yol açarlar 14 Kırılma indisine etki eden faktörler a) ortamın sıcaklığı: sıcaklık yükseldikçe RI düşer. Sıcaklıktaki 1 C lik değişme 0.00045 lik bir fark doğurur. Bu nedenle RI ile birlikte ölçüm sıcaklığını da belirtmek gerekir. b) Kullanılan ışının dalga boyu: Dalga boyu, RI Bu nedenle sabit bir dalga boyunda ölçümlerin yapılması gerekmektedir. RI çalışmalarında, standart bir dalga boyu ve sıcaklık kullanılarak RI ölçülür ve şu şekilde belirtilir: c) Konsantrasyon: RI konsantrasyona bağlı olarak değişir. Zaten RI ile kuru madde veya konsantrasyon tayinlerinin esası da bu temele dayanır. Bunu için hazırlanmış tablolardan yararlanılır. n C D C: sıcaklık; D=λ, sodyumun sarı hattı Refraktometrinin kullanım alanları Gıda analizlerinde kırılma indisinin kullanıldığı pek çok alan bulunmaktadır. Süt, yemeklik yağlar, meyve suları, peynir altı suyu, domates ürünleri, reçel ve şurup gibi gıdaların, % kuru madde, konsantrasyon veya briks değerleri gibi pek çok özellikleri kırılma indisinden yararlanılarak belirlenebilmektedir. 3
Yemeklik yağların karakterizasyonu veya saflık kontrolü: örneğin, tereyağının 40 C deki kırılma indisi 1.452-1.462 arasındadır. Bu değer diğer yağlarda daha yüksektir. Dolayısıyla tereyağına başka yağların katılıp katılmadığını anlamak amacıyla RI kullanılabilir. Çünkü sıvı ve katı yağların RI değerleri belli koşullar altında sabittir. RI değeri, yağ asitlerinin doymamışlığı ile de yakından ilgili olduğu için refraktometri yemeklik yağların iyot sayısının belirlenmesi amacıyla da kullanılabilir. Yine yağlarda acılaşmanın bir ölçüsü olarak da RI değerinden faydalanılabilir. Çünkü acılaşma arttıkça, kırılma indisi de artar. Sütün kırılma indisi, 20 C de 1.344-1.348 değerleri arasında değişir. Ancak süte su katıldığı zaman RI de buna paralel olarak düşer. Proteinlerin RI değerleri sabit olduğu için bu yöntemle bazı gıdalarda protein oranlarının tayin edilebilmektedir. Meyve suyu (meyve suyu, pulp, nektar vb) ve şekerli ürünler (reçel, şurup) ile çeşitli domates ürünleri (salça, sos vb) gibi gıdalarda, çözünür kuru madde tayinleri, çok pratik olarak refraktometrelerle yapılmaktadır. POLARİMETRİ Bazı organik ve inorganik kimyasal bileşikler, polarize ışığın düzlemini değiştirebilme özelliğine sahiptir. Böyle bileşiklere optikçe aktif bileşikler denir. Her bir madde veya bileşiğin kendine has bir çevirme derecesi vardır. Maddelerin bu özelliğinden yararlanılarak kimyasal yapı ve konsantrasyon belirleme yöntemlerine polarimetri denilir. Bu teknik kullanılarak, ölçümü yapılabilen optikçe aktif madde veya bileşiklerin polarize ışığı çevirme derecesini tayin etmek amacıyla kullanılan aletlere de polarimetre denilir. Polarize ışın: normal olarak belli bir kaynaktan yayılan ışık, her yöne doğru titreşim gösterir. Eğer bu ışınlar belli bir yöne sevk edilecek olursa, tek bir yönde titreşim gösterirler. Tek yönde hareket eden bu ışınlara polarize ışın denir. Polarimetreler Genel olarak polarimetre 5 bölümden oluşur: 1. ışın kaynağı Polarimetrenin bu bölümü, yeterli kuvvette ve sabit bir dalga boyunda ışın yayan bir lambadır. Bu lamba, Na veya Hg buharı lambaları olabilir Polarizatör: doğal ışığı, polarize ışık haline çevirmek için kullanılan aletlere de polarizatör denilir. 4
Na (sarı ışın) 589 nm dalga boyu Hg (yeşil ışın) 546.1 nm dalga boylu ışınlar kullanılır. Bu ışınlar uygun prizma veya filtrelerle seçilerek polarizöterlere gönderilir. 2. Polarizatör: Polarizatörler doğal ışıktan lineer (doğrusal) polarize ışın elde etmeye yarayan özel prizmalardır. Bu amaçla kullanılan çeşitli prizmalar vardır: Nikol prizması, Glen-Thomson prizması gibi. Plorizatörün yapımında, ışığı çift kırma özelliğine sahip Ca-spar (Ca kalsit) den yapılmış prizmalar kullanılır. Dikdörtgen şeklindeki kristal çapraz şekilde kesilir ve kesilen kısım, aynı yerden kanada balsamı ile tekrar birbirine yapıştırılır. Daha sonra bu kristalin etrafı yansıyan ışınların tutulması amacıyla siyah boya ile kaplanır. Polarizatör adı verilen prizma, polarimetre içinde sabittir, yani hareketli değildir. 3) Numune tüpü uzunluğu 5-40 cm arasında değişen ve iki ucunda (kapak kısımları) ışınların geçmesini sağlayan disklerin bulunduğu vidalı bir cam tüptür. Bazı polarimetrelerde sıcaklığın sabit tutulması amacıyla tüpün etrafında bir su ceketi de bulunmaktadır. Tüp polarizatör ile analizatör arasına yerleştirilmiştir. 4) analizatör: Şekil ve yapısı polarizatör ile aynıdır. Bunların tek farkları; polarizatör sabit; analizatör ise kendi etrafında dönebilme özelliğindedir. Analizatörün bu özelliğinden yararlanılarak okuma işlemi için gerekli olan karanlık ve aydınlık bölgeler elde edilir. Polarizatör ve analizatör olarak kullanılan prizmalar birbirine paralel olduğunda, ışın hiçbir engelle karşılaşmadan analizatöre geldiği için görüş alanı aydınlık olur. Analizatör tekrar çevrilmeye başladığında bu alan kararmaya başlar. Analizatör 90 ve 270 döndürüldüğünde karanlık; 180 ve 360 döndürüldüğünde ise aydınlık alanlar görülür. Sakkarimetreler Okuma sırasında, görüş alanı aydınlıktan karanlığa getirilinceye kadar analizatör çevrilir ve görüş alanı içerisindeki skala üzerinde aydınlığın oluştuğu yerdeki derece, ölçülen örneğin polarize ışığı çevirme derecesidir. Gıda teknolojisi alanında polarimetrenin en fazla kullanıldığı alan şeker endüstrisidir. Bu nedenle doğrudan % şeker konsantrasyonunu belirlemek amacıyla çeşitli polarimetre sistemleri geliştirilmiştir. Genel olarak, polarimetrenin modifikasyonu ile geliştirilen aletlere sakkarimetre denir. 5
Örn: Sacchaar 880 ve polaser türü sakkarometreler; farklı dalga boylu ışınlarla, koyu renkli veya bulanık ortamlarda bile çok etkin ölçümler yapabilmektedirler. Koyu renkli örnekler için 880 nm dalga boylu yakın IR ışınları Normal ortamlarda ise 546, 589 ve 633 nm dalga boylu ışınlar kullanılmaktadır. Polarizasyona etki eden faktörler a) Işığın dalga boyu Dalga boyu kısa olan ışınlar, büyük olanlara göre daha fazla çevrilmeye uğrarlar. Dolayısıyla, polarimetrik ölçümlerin, standart bir dalga boyunda bir ışın kullanılarak yapılması gerekir. Bu amaçla en çok 589 nm dalga boyundaki sodyumun sarı ışığı (D hattı) kullanılır. Bunun dışında Hg buharı lambalarından elde eilen ışınlar da (546.1 nm) kullanılabilmektedir. b) ortamın sıcaklığı Ortam sıcaklığının değişimi ile sıvıların yoğunluk ve özgül ağırlıkları da değişir. Bu değişme ile optikçe aktif maddelerin özgül çevirme derecesi de değişmektedir. Genellikle sıcaklık yükseldikçe özgül çevirme derecesi düşer. Dolayısıyla tüm polarimetrik ölçümlerin sabit bir sıcaklıkta yapılması gerekir. Bunun için de 20 C sıcaklık kullanılır. c) Çözücü (solvent) Optikçe aktif cisimlerin ölçüm için çözündürüldüğü çözücünün, optikçe aktif olmasa bile sonucu etkilediği gözlenmiştir. Dolayısıyla karşılaştırma amacıyla yapılan ölçümlerde, sürekli aynı çözeltinin kullanılması gerekmektedir. Ayrıca, çalışmalarda kör deneme ölçümlerinin de yapılarak, sonucun gerçek okuma değerinden çıkarılması gerekmektedir. d) zaman Yapılan araştırmalarda, bir çok şekerin özgül çevirme derecesinin okuma öncesi bekleme ile değişme gösterdiği bulunmuştur. Ölçümü yapılacak maddenin çözeltisi hazırlanır ve bu andan itibaren polarize ışığı çevirme işlemi başlar. Belirli bir süre sonra sabit bir noktaya gelinir ve artık zamanla çevirme derecesi değişmez. İşte bu sabit okumaya son çevirme açısı denilir. Çevirme derecesinin geçen zamana bağlı olarak gösterdiği bu değişmeye mutarotasyon denir. Bu olay indirgen şekerlede görülür, indirgen olmayanlarda mutarotasyon gerçekleşmez Örneğin, α-glukoz ilk hazırlandığı anda +112.2 lik bir özgül çevime derecesine sahipken, β-glukoz +18.7 özgül çevirme gösterir. Bu şeker çözeltileri, bir süre bekletildikleri zaman +52.7 çevirme derecesinde sabitlenir. Çevirme derecesi sabitlendiği anda ölçüm yapılır. Bu değer glukozun özgül çevirme açısını verir. 6
e) Tabaka kalınlığı Özgül çevirme derecesini önemli derecede etkilemektedir. Polarize ışına maruz kalan tabaka kalınlığı arttıkça, özgül çevirme derecesinin de arttığı gözlenmiştir. Standart ölçümlerde 10 cm (1dm) lik kalınlık esas alınmıştır. f) Konsantrasyon Özgül çevirme derecesi, eriyikteki madde miktarına göre değişir. Genel olarak konsantrasyon arttıkça spesifik (özgül) çevirme derecesi de artar. Ancak birçok polarimetre 5 ve 20 cm lik tüplerle de ölçüm yapabilmektedir. Dolayısıyla, bu değerin konsantrasyon hesabı formülünde yerine konması gerekmektedir. Konsantrasyon hesaplamaları: Yukarıda sıralanan tüm bu faktörler dikkate alınarak polarimetrik ölçüm için gerekli standart şartlar sağlandığında, her bir optikçe aktif maddenin, belirli bir özgül çevirme dercesine sahip olduğu belirlenmiştir. Özgül (spesifik) çevirme derecesi: optikçe aktif bir maddenin 100 gramının, 100 cm 3 suda eritilerek, 1 dm lik polarizasyon tüpüne doldurulduktan sonra 20 C de sodyumun sarı ışığında (λ: 589 nm, D hattı) polarimetre ile verdiği sapma miktarıdır. [ Buna göre, çözeltilerdeki konsantrasyon veya madde tayini şu formülle gerçekleştirilir. t ] 100 1 c l: Polarimetre tüpünün uzunluğu (dm) t: Sıcaklık ( o C) c: Optikçe aktif maddenin konsantrasyonu (g/100ml) : Işığın dalga boyu α: Okunan çevirme açısı (derece) Polarimetrenin kullanım alanları: Kalitatif analizler: optikçe aktif maddelerin polarize ışığı çevirme dereceleri kendine özgüdür ve bir çok organik molekülün tanımlanmasında kullanılır. Örneğin, yapısında asitmetrik karbon atomu bulunduran amino asitler, steroidler, alkoloidler, organik asit ve karbonhidratlar için kullanışlı bir kalitatif analiz yöntemidir. Kantitatif analizler: özellikle sakkarimetreler bu amaçla şeker endüstrisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Çünkü, şeker çözeltilerinin polarize ışığı çevirme dereceleri, bunların konsantrasyonları ile direkt orantılıdır. Konsantrasyon hesabı bölümünde verilen formülün kullanımı dışında, bazı bileşiklerin değişik konsantrasyonları ile çizilen standart eğrilerle de bazı kantitatif tayinler yapılabilmektedir. 7
Yapısal analizler: optik rotasyon, moleküler yapı ve özellikleri ile ilgili olarak meydana gelir. Dolayısıyla, yapısı bilinen moleküllerin optik rotasyonu kullanılarak, bilinmeyen moleküller hakkında bir sonuca gidilebilir. 8