Total protein miktarının bilinmesi şarttır:

Transkript

1

2 Total protein miktarının bilinmesi şarttır: protein veriminin belirlenmesi saflık kontrolu deneylerin optimizasyonu spesifik aktivite tayini ve saflaştırma derecesinin belirlenmesi (enzimler için)

3 KULLANILAN YÖNTEMLER Kjeldahl yöntemi (azot miktarının tayinine dayanır) Kızıl ötesi spektrometri Türbidimetri Fluorimetri Refraktometri Polarografi ZOR, duyarlılığı düşük, hata payı yüksek yöntemler Amino asit analizine dayanarak (asit hidrolizden sonra yapılır. Trp, Cys asit hidrolize duyarlı; Gln, Asn, asit forma dönüşür. Bunlar da hatalar yol açar)

4 Son yıllarda en çok kullanılan yöntemler: UV ve GÖRÜNÜR ALANDA ABSORBSİYONA DAYANAN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER

5 OPTİK ANALİZ YÖNTEMLERİ HAKKINDA KISA BİLGİ: ELEKTROMANYETİK IŞINLAR ile MADDE arasındaki etkileşimden yararlanan yöntemlerdir.

6 ELEKTROMANYETİK IŞIN NE DEMEKTİR?

7 Elektromanyetik Işın: Uzayda büyük bir hızla ilerleyen bir enerji İki önemli karakteri var: 1) Dalga karakteri: Uzayda sinüzoidal (dalga hareketiyle) yayılan elektrik ve manyetik vektörlere sahiptir. Madde ile etkileşiminde elektrik vektörü rol oynar. (lambda)= c/ (nü) = Dalga boyu c= Işık hızı (3x10 10 cm/sn) = frekans (birim zamanda belli bir noktadan geçen dalga sayısı) 2) Tanecik karakteri: Bir ışın demeti çok sayıda tanecikten oluşur. Enerjili bu taneciklere FOTON denir. E = h x h= Planck sabiti (6.626 x j.sn)

8

9

10 MADDE-IŞIN ETKİLEŞİMİ Işının elektrik alanı ile maddenin bağ elektronları arasında gerçekleşir Maddenin yapısına göre değişir.

11 Madde ortamına giren ışın değişime uğrar: Doğrultusu değişir YANSIMA (REFLECTION) KIRILMA (REFRACTION)

12 Başka demetlere ayrılır: ÇİFTE KIRILMAYA UĞRAR (DOUBLE REFRACTION) SAÇILIMA UĞRAR (SCATTERING) KIRINIMA UĞRAR (DIFFRACTION)

13 Kutuplaşma düzlemi değişir: OPTİK ÇEVİRME Kutuplaşma derecesi azalır: DEPOLARİZASYON

14 Bu fiziksel değişimler maddenin enerji düzeylerinde herhangi bir değişime yol açmaz.

15 Işının belli dalga boyları madde tarafından ABSORBLANIR (SOĞURULUR, EMİLİR): ABSORBSİYON Bu enerji maddeyi (yani onu oluşturan atom veya molekülleri) UYARILMIŞ (EKSİTE) hale geçirir. X + h X* Düşük enerji düzeyi (ground: G ile de gösterilir) Yüksek enerji düzeyi (uyarılmış durum: S 1 ile de gösterilir) Tanecik eski haline dönerken bu enerji geri verilir: X* X + ısı

16 Uyarılmış madde bir ışın yayabilir: EMİSYON X* X + h SPEKTROSKOPİK YÖNTEMLERİN TEMELİNDE ABSORPSİYON VE EMİSYON YATMAKTADIR. Bu olaylar enerji düzeyinde değişim yaratır.

17 OPTİK ANALİZ YÖNTEMLERİ Spektroskopik Yöntemler TEMELİ: Enerji düzeyleri arasındaki geçişler sonucu ortaya çıkan SPEKTRUM ölçülür. Spektroskopik Olmayan Yöntemler TEMELİ: Işının YÖNÜNDEKİ veya FİZİKSEL ÖZELLİKLERİNDEKİ DEĞİŞİM ölçülür. Enerji düzeyleri arasında geçişler olmasını gerektirmez.

18 Spektroskopik Yöntemler Spektrofotometri (UV-Visible, IR, X ışını) Kolorimetri Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi NMR Spektroskopisi ESR (Elektron Spin Rezonans) Spektroskopisi (Kütle Spektrometrisi) Emisyon Spektroskopisi Atomik Emisyon Spektroskopisi Fluoresan Spektroskopisi Radyokimyasal Yöntemler ÖLÇÜLEN ÖZELLİK IŞININ ABSORPLANMASI IŞININ YAYILMASI (EMİSYON)

19 Spektroskopik Olmayan Yöntemler Türbidimetri Nefelometri ÖLÇÜLEN ÖZELLİK IŞININ SAÇILMASI Raman Spektroskopisi Refraktometri İnterferometri X ışını Difraksiyonu Elektron Difraksiyonu Polarimetri IŞININ KIRILMASI IŞININ KIRINIMA UĞRAMASI IŞININ KUTUPLANMA ÖZELLİKLERİNİN DEĞİŞİMİ

20 YÖNTEMİN ADI: SPEKTROFOTOMETRİ ALETİN ADI: SPEKTROFOTOMETRE

21 Monokromatör: tek bir dalga boyundaki ışının seçilmesi için kullanılır Döteryum (D2) lamba: UV ışık için Tungsten (W) lamba: görünür ışık için kullanılır.

22 Spektrofotometrenin çalışma prensibi: Lamba tarafından yayılan ışın demeti monokromatör (prizma) yardımıyla tek bir dalga boyundaki ışına (monokromatik ışına) dönüştürülür. Bu ışın örneğin içinde bulunduğu odaya girer. Ölçümü yapılacak örnek, KÜVET içine konulur. Görünür alanda çalışılıyorsa CAM (optik) KÜVET; UV de çalışılıyorsa KUVARTZ (silika) KÜVET kullanılır. Örnekten geçen ışığın şiddeti detektör tarafından algılanır ve kaydedici ya da yazıcıya elektrik sinyali şeklinde gönderilir.

23 Double-beam (Çift ışınlı spektrofotometrelerde ışın hem örnekten hem de kör örnekten (referans) geçirilir.

24 UV-Visible Spektroskopisi ve Lambert-Beer Yasası: Moleküler Biyolojide UV ve görünür ışınlar kullanılarak : Molekülün yapısı hakkında bilgi edinilebilir. (özellikle UV alandaki absorpsiyon önemlidir.) Konsantrasyon (derişim) belirlenebilir Kimyasal reaksiyonun gidişi izlenebilir. Enzim aktivitesi ölçülebilir.

25 Tabakaya gelen ışık Şiddeti: I 0 Tabakadan çıkan ışık Şiddeti: I Homojen bir absorplayıcı ortam

26 Lambert yasası: Homojen bir absorplayıcı ortamdan geçen ışının şiddeti tabaka kalınlığının artması ile üssel olarak azalır: I = I 0 x e -kd I = geçen ışının şiddeti I 0 = gelen ışının şiddeti k = absorpsiyon katsayısı d = tabakanın kalınlığı

27 Beer yasası: Işının şiddeti içerisinden geçtiği maddenin konsantrasyonuna bağlıdır. I = I 0 x e -kc I = geçen ışının şiddeti I 0 = gelen ışının şiddeti k = absorpsiyon katsayısı c = konsantrasyon

28 Bu iki yasanın birleştirilmesiyle : I = I 0 x e -kcd I/I 0 = e -kcd ln I/I 0 = -k x c x d ln I 0 /I = k x c x d I = geçen ışının şiddeti I 0 = gelen ışının şiddeti k = absorpsiyon katsayısı c = konsantrasyon d = ışık yolu (sıvının içinde bulunduğu küvetin genişliği) log I 0 /I = k x c x d k/2.303= (epsilon)

29 Maddenin konsantrasyonu Işık yolu (cm) log I 0 /I = x c x d = A (Absorbans) veya E (Ekstinksiyon) Absorpsiyon (veya Ekstinksiyon) katsayısı Konsantrasyonun (c) birimi g/l olursa, S, spesifik absorpsiyon katsayısı; Konsantrasyonun (c) birimi mol/l olursa, M, molar absorpsiyon katsayısı adını alır.

30 Işık yolu (d) 1 cm olduğunda A yerine OPTİK DANSİTE (O.D.) terimi kullanılır.

31 Optik dansite Konsantrasyon Lambert-Beer yasasından sapmalar: NEDENİ: YÜKSEK KONSANTRASYON YANLIŞ DALGA BOYU SEÇİMİ Pozitif sapma uygunluk Negatif sapma

32 Spektrofotometrik ölçümler iki farklı şekilde yapılabilir: Belli bir dalga boyunda absorbans ölçülür. Konsantrasyon veya absorbsiyon katsayısının belirlenmesine yarar. Belli bir dalga boyu aralığında absorbans taraması yapılır. Böylece ABSORPSİYON SPEKTURUMU elde edilir. Maddenin kimyasal karakteri hakkında bilgi sağlar.

33 PROTEİNLERİN KONSANTRASYONUNU BELİRLEMEK İÇİN KULLANILAN UV-VISIBLE YÖNTEMLER:

34 ÖLÇÜM Protein çözeltisinin UV absorbsiyonunun ölçülmesi Protein çözeltisinin bir belirteçle reaksiyona sokulup oluşan renkli bileşiğin (kromofor) görünür alanda ölçülmesi

35 A 280 /A 260 Oranı (Warburg Christian Yöntemi Tirozindeki fenolik gruplar ve triptofandaki indolik gruplar nedeniyle birçok protein 280 nm de maksimum absorbsiyon gösterir. Bu özellikten yararlanılarak örnekteki protein miktarının yaklaşık olarak bulunması için hızlı bir yöntem geliştirilmiştir. Çok duyarlı olmamakla beraber (duyarlılık: mg/ml), kolaylığı ve hızlı sonuç vermesi nedeniyle çok kullanılan bir tekniktir. Ancak, 260 nm de maksimum absorbsiyon gösteren nükleik asitlerin 280 nm de de absorbsiyon yetekleri olduğu unutulmamalıdır. Bu nedenle nükleik asit artıkları ile kontamine durumdaki ilk kaba ekstrelerle çalışıldığında hatalı sonuçlar elde edilebilir. Bunun önüne geçmek için, Warburg ve Christian (1941) tarafından geliştirilmiş bir seri hata düzeltme faktörü (Tablo 2 ) genel olarak tüm proteinler için kullanılmakta ve bu yöntemde ortaya çıkabilecek hata payı daha aza indirgenebilmektedir.

36 Tablo 2. A 280 /A 260 oranına bağlı olarak, örnekteki nükleik asit % si ve düzeltme faktörlerinin yaklaşık değerleri. (1 cm ışık yolu için geçerli) A 280 /A 260 oranı % Nükleik asit Faktör

37 Protein konsantrasyonu (mg/ml) = Faktör x A 280 veya Protein konsantrasyonu (mg/ml) = 1.5 x A x A 260

38 Biüre Yöntemi Duyarlılığı düşük (1-10 mg/ml) olmakla beraber, pratikliği nedeniyle geniş çapta kullanılan bir yöntemdir. Reaksiyonun esası Cu atomunun peptid azotlarına bağlanması sonucu alkali çözeltide nm de maksimum absorbsiyon gösteren renkli bir kompleks oluşumuna dayanır. Bakır atomlarının ana zincire bağlanması nedeniyle amino asit içeriğinin ölçümler üzerinde herhangi bir önemli etkisi yoktur.

39 Boya-Bağlama (Bradford Yöntemi) Bu yöntem, Coomassie Brilliant Blue G-250 boyasının farklı konsantrasyonlardaki proteinlere bağlanarak, farklı renk şiddetinde (koyulukta) çözeltiler ortaya koymasından yararlanılarak geliştirilmiştir. Boyanın özellikle arjinin gibi bazik amino asitlere ve bazı aromatik amino asitlere bağlanma eğiliminde olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla bu yöntemde proteinin primer yapısının önemi vardır. Duyarlılık sınırları, total reaksiyon karışımında (5.1 ml) g olan bu yöntemde (ki bu da örnek konsantrasyonunun mg/ml arasında olması demektir) asidik boya proteine bağlanır ve nm arasında maksimum absorbsiyon değerleri elde edilir.

40 Lowry Yöntemi Bu yöntem, fosfomolibdotungstik asit (Folin-Ciocalteau Belirteci) çözeltisinin tirozin bakiyeleri ile reaksiyona girerek mavi bir renk oluşturması esasına dayanır. Reaksiyon, bakır ile protein arasında kompleks oluşumu ile başlar, alkali çözeltide, oda temperatüründe 5-10 dakika içinde tamamlanır. Bakırın varlığı yöntemin duyarlılığını 3-15 kat artırmaktadır, çünkü Cu ile yapılan kompleks, Folin belirtecindeki Mo ve WO 4 (wolframid) ile birleşerek yeni bir kompleks ortaya koyar. Ancak analiz edilen örnekteki fenolik maddeler hatalara yol açabilir. Duyarlılık: g/ml