Enzimler ve Enzim Aktivitelerinin Gösterilmesi

Enzimler ve Enzim Aktivitelerinin Gösterilmesi Yazarlar Prof.Dr. Ahmet ÖZATA Yrd.Doç.Dr. Cengiz TÜRE ÜNİTE 3 Amaçlar Bu üniteyi çalıştıktan sonra; enzimin tanımını ve yapısal özelliklerini, enzim aktivitesini tayin yöntemlerini, bazı enzimlerin aktivitelerini hesaplamayı, enzimlerle ilgili deneysel çalışmaları uygulayarak öğreneceksiniz. İçindekiler Giriş 25 Enzim Aktivitelerinin Tayininde Kullanılan Yöntemler 25 Deneyler 28 Özet 33 Değerlendirme Soruları 34 Yararlanılan ve Başvurulabilecek Kaynaklar 34

Çalışma Önerileri Bu ünitedeki deneyleri uygulamadan önce Fen Bilgisi Biyoloji ders kitabınızdaki ilgili konuları mutlaka gözden geçiriniz. ANADOLU ÜNİ VERSİ TESİ

ENZİ MLER VE ENZİ M AKTİ V İ TELERİ N İ N GÖSTERİ LMESİ 25 1.Giriş Vücuttaki biyokimyasal reaksiyonlar protein yapısında organik moleküller olan "enzimler" tarafından katalize edilirler. Kelime anlamıyla enzim "maya=ferment" anlamına gelmektedir. İnsanlar çok eski zamanlardan beri enzimatik reaksiyonlardan yararlanmışlardır. Örneğin; şarap, yoğurt, ekmek, sirke, boza yapımında yine canlılar tarafından üretilen enzimlerden yararlanmışlar, fakat bu olaylarda enzimlerin katalitik etkilerinin nasıl olduğunu bilememişlerdir. Enzimler reaksiyon hızını çok arttırırlar. Örneğin; dakikada 36 milyon molekülü değişikliğe uğratabilmektedir. Enzimlerin etkileyip değişikliğe uğrattığı moleküle "substrat" adı verilir. Enzim biyokimyasal reaksiyonda substratı değiştirip ürüne dönüştürürken kendisi hiç değişikliğe uğramaz. Enzimler substrat dediğimiz molekülden reaksiyon sırasında ya bir yada birkaç atomu veya fonksiyonel bir grubu koparır yada substrata ekler. Enzimler canlı hücreler tarafından biyolojik koşullarda sentez edilirler, fakat aktivite göstermeleri için hücre içinde bulunmaları gerekmez. Enzimlerin aktivite göstermeleri için gerekli olan ve protein yapısında olmayan genellikle metal iyonlarından meydana gelmiş olan yan gruplarına kofaktör adı verilmektedir. Pekçok enzim kofaktör olarak Cu +2, Fe +2, Zn +2 ve Mg +2 iyonlarına gereksinim duyar. Enzimlerin aktivite göstermeleri için gereksinim duydukları organik moleküllere ise "koenzim" adı verilmektedir. Koenzimler enzimlerin kopardığı yada eklediği kimyasal grupların taşıyıcısı olan organik moleküllerdir. Koenzimlerin öncül molekülleri vitaminlerdir. Vitaminler vücutta ufak değişikliklerle koenzimleri meydana getirirler. Eğer enzim koenzimi veya kofaktörü ile birlikte ve katalitik bakımından tamamen aktif durumda ise, enzimin bu haline holoenzim adı verilmektedir. Eğer koenzim ve kofaktör enzimden ayrılacak olursa ve enzimde inaktif hale gelirse, enzimin bu haline de apoenzim adı verilmektedir. 2. Enzim Aktivitelerinin Tayininde Kullanılan Yöntemler Enzim aktivite tayininde çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Aktivite tayinlerinde genellikle ya kaybolan substrat miktarı yada meydana gelen ürün miktarı tayin edilerek enzimlerin aktiviteleri ölçülür. Çoğunlukla hücredeki enzim proteinini tayin etmek çok zordur. Bunun yerine kaybolan substrat veya oluşan ürünü ölçerek enzim hakkında bir fikir sahibi olabiliriz. Enzim aktivite tayininde yöntem seçerken metodun pratik oluşuna ve kısa sürede yapılışına, ayrıca hassas oluşuna da özen göstermek gerekir. Aktivite tayininde kullanılan bazı terimleri ve ne anlama geldiğini inceleyelim: AÇIKÖĞ RETİ M FAKÜLTESİ

26 ENZİ MLER VE ENZİ M AKTİ V İ TELERİ N İ N GÖSTERİ LMESİ Ünite: Bir mikromol substratı bir dakikada ve optimal koşullarda ürüne çeviren enzim miktarı bir ünite olarak kabul edilmektedir. Enzim üniteleri UI şeklinde gösterilmektedir. Spesifik Aktivite: Bir miligram proteinde bulunan enzim ünite sayısı spesifik aktivite olarak kabul edilir. Spesifik aktivite ünite/mg protein olarak kabul edilmektedir. Buna göre spesifik aktiviteyi aşağıdaki gibi yazabiliriz; spesifik aktivite = ünite miligram protein Örneğin; 5 mg proteinde 750 ünite ölçmüşsek, bu enzimin spesifik aktivitesi 150 UI/ mg bulunur. Enzim aktivite tayininde kullanılan yöntemleri yedi başlık altında toplayabiliriz. Spektrofotometrik yöntem, Monometrik yöntem, Thunberg yöntemi, Elektrot yöntemi, Polimerik yöntem, Kromatografik yöntem, Kimyasal tayin yöntemi. Yukarıda kullanılan yöntemler aşağıda kısaca açıklanmışlardır. 2.1. Spektrofotometrik Yöntem Pekçok enzim substratı, ürünü veya koenzimi, görülen ışıkta veya ultraviyole ışıkta bir tepe değeri göstererek, absorbans vermektedir. Bu takdirde ya substratın kaybolması yada ürünün meydana gelişi gibi koenzimdeki değişiklik spektrofotometreden tayin edilir. Spektrofotometrik yöntem kolaylığı, basitliği ve hassas oluşu nedeniyle diğer yöntemlere göre daha çok tercih edilmektedir. Bu yöntemde optik dansite değişimi, belirli miktardaki enzim ünitesini verir. Birçok enzimin aktivite tayini bu yöntem ile yapılmaktadır. 2.2. Monometrik Yöntem Bir komponenti gaz olan enzimlerin aktivitesini ölçmek için kullanılan yöntemdir. Örneğin; oksidazlarla oksijen alınımı ve dekarboksilazlarla karbon dioksit salınımı bu yöntemle ölçülür. ANADOLU ÜNİ VERSİ TESİ

ENZİ MLER VE ENZİ M AKTİ V İ TELERİ N İ N GÖSTERİ LMESİ 27 2.3. Thunberg Yöntemi Çok sayıda dehidrogenaz enziminin aktivitesi bu yöntem kullanılarak ölçülür. Metilen mavisi elektron akseptörüdür. Bu bileşiğin okside durumu renkli, redükte durumu ise renksizdir. Enzim aktivite tayin ortamına belirli miktarda metilen mavisi ilave edilir. Göz ile renk kaybolmasındaki geçen zaman saptanır. Deney havanın oksijeninden korunmak için özel bir tüpte yapılır. Bu özel tüpe "Thunberg tüpü" denir ve yöntemde adını bu tüpten almıştır. 2.4. Elektrot Yöntemi Cam elektrotlarla oluşan ürünlerin ölçülmesi esasına dayanır. 2.5. Polimerik Yöntem Pekçok enzimin substratı optikçe aktiftir. Eğer üründe optik aktivite değişmesi görülecek olursa bu yöntem kullanılmaktadır. Substratın aktif ve ürünün optikçe aktif olduğu durumlarda yine bu yöntem uygulanmaktadır. Eğer substrat ve ürünün ikiside optikçe inaktif ise, o zaman bu yöntemin kullanılması uygun değildir. 2.6. Kromatografik Yöntem Diğer yöntemlerle bir ölçme yapılamadığında bu yönteme başvurulur. Enzim substrat karışımlarından belli zaman aralıklarında örnekler alınır. Kromatografik yöntemde, substrat ve ürün kromatografi kağıdına veya ince tabaka kromatografisiyle birbirinden ayırt edilir. Bazı hallerde radyoaktif substrat kullanıldığı için ayırımdan sonra leke, ya ince tabaka kromatografisinde olduğu gibi kazınacak, yada kağıt kromatografisinde olduğu gibi kesilerek sayım şişelerine koyulacaktır. Radyoaktivite miktarı sayaçta sayılır ve tayini yapılır. Bazı enzim aktivitelerinde ürünün meydana getirdiği lekenin büyümesi ile enzim faaliyeti hakkında bilgi edinilir. 2.7. Kimyasal Tayin Yöntemi Birçok enzim reaksiyon başladıktan sonra belirli zaman aralıklarında karışımdan örnek alıp, substrat ve ürünün kimyasal yöntem ile miktarı tayin edilir. FISKE ve SUBBAROW kolorimetrik yöntemi olarak inorganik fosfat tayinini gerçekleştirmiştir. Fosforilaz, fosfotaz, nükleotidaz enzimlerinin aktivite tayinleri aynı yolla yapılır. Pirofosfat (Ppi) bağı, bir normal HCl ve 100 derecede 10 dakika kaynatılmakla kırılmakta ve inorganik fosfat meydana gelmektedir. İnorganik fosfatın miktarı ise, kolorimetrik yöntem ile tayin edilmektedir. Bu yöntem ATP ve ADP'nin karıştığı bazı kinaz ve sentetaz reaksiyonlarında enzim aktivitesi bu yöntem ile tayin edilir. AÇIKÖĞ RETİ M FAKÜLTESİ

28 ENZİ MLER VE ENZİ M AKTİ V İ TELERİ N İ N GÖSTERİ LMESİ 3. Deneyler Deney 1: Amilaz Aktivitesinin Tayini Alfa ve beta amilazlar, her ikiside nişastanın ve glikojenin alfa-1,4 glikozit bağlarına etki ile onları maltoz ve dekstrinlere parçalarlar. Alfa amilazın sistematik adı 1,4- glukan-4-glukanohidrolaz olup molekül ağırlığı 45.000'dir. Alfa amilaz tükürük, insan pankreası ve Pseudomonas ve Aspergillus mikroorganizmalarından kristalleştirilmektedir. Amilaz enzimleri genel olarak üç grupta toplanır: a. Alfa Amilaz (Endoamilaz): Çok yavaş olarak hidroliz olayına katılırlar. Hasta olarak adlandırılan bir seri üç veya daha fazla alfa-1,4 bağlı glikoz birimlerini taşıyan ürünler açığa çıkarırlar. Buna, özellikle klorür ve bazı iyonlar da aktivatör olarak etki eder. Alfa amilaz glikojenin dokularda yıkılmasında rol oynamaz, zira glikojen 1,4 glikozit bağının yıkılışı dokularda fosforilize olur. Glikojendeki 1,6 bağlarını da yine amilaz değil, ancak amilo 1,6 glikozidaz yıkar. b. Beta Amilaz (Egzoamilaz): Bunlar nişastanın amiloz kısmını maltoza kadar hızlı bir şekilde hidroliz ederler. Polisakkaritte alfa-1,4 glikon bağlarını hidroliz ederek zincirlerin redükte olmayan uçlarında maltoz birimlerini ayırırlar. Bitkisel bir enzimdir ve özellikle bira, malt ekstrelerinde bulunur. c. Gama Amilazlar: Kısa bir süre önce bağırsak ve karaciğerde ortaya çıkan, nişastayı maltoz birimlerine değil glikoz birimlerine kadar parçalamaktadır. Enzim 1,4 ve 1,6 bağlarını hidrolizleyip nişasta ve glikojeni tamamen parçalayabilir. Tüm bu amilaz enzimlerinin etkisiyle oluşan ürünler, çözülebilen nişasta ve maltozdur. Nişasta beta amilaz ile parçalandığı sırada, serbest asetal hidroksili beta durumunda bulunan beta maltozları oluşturduğu halde, alfa amilazla parçalanmasında alfa maltozlar açığa çıkar. İşte amilazların alfa ve beta adı bu neticeden gelmektedir. Tükürük %99.5 su içerir. Ayrıca tükrük amilazı yani pityalin ve birkaç protein (musin bir glikoproteindir), inorganik iyonlar (kalsiyum, potasyum, sodyum ve klorür) ve fosfatları taşır. Bunlardan başka aminoasitler, üre, ürik asit ve kolesterol gibi biyoorganik bileşiklerde tükürükte bulunurlar. Bunların hepsi amilaz enziminin yapısına girmektedir. Araç ve Gereçler: İnsan tükürüğü ve dana salyası, %1 w/v nişasta çözeltisi, %1 w/v (tuz) NaCl, sulu iyot çözeltisi, fosfat tamponu, su banyosu (38 derecede), pipetler (1 mililitrelik ve 5 mililitrelik), dereceli silindir (100 mililitrelik), beher (50 mililitrelik), test tüpü (18x150 mm ve 30 adet), pastör pipeti. ANADOLU ÜNİ VERSİ TESİ

ENZİ MLER VE ENZİ M AKTİ V İ TELERİ N İ N GÖSTERİ LMESİ 29 Uygulama: Toplanan insan tükürüğünün bir mililitresi 100 mililitrelik dereceli silindire pipetlenir. 100 mililitre işaretine kadar sulandırılır ve iyice karıştırılır. Bir test tüpüne 5 mililitre %1'lik nişasta çözeltisi konulur. Üzerine 2 mililitre %1 NaCl ve 2 mililitre fosfat tamponu ilave edilir. İyice karıştırıldıktan sonra 38 C sıcaklıktaki su banyosuna yerleştirilir. Birer mililitre açık sarı iyot çözeltisi taşıyan 10 adet test tüpü hazırlanır. Sulandırılmış tükrüğün 1 mililitresi nişastalı deney karışımına konulur ve zaman kaydedilir. Birer dakika arayla inkübasyon karışımından pastör pipeti ile iki damla alarak iyot çözeltisi bulunan tüplerden birine konulur. İyot çözeltisinde renk değişimi olduğu zaman (akromik nokta) geçen süre kaydedilir ve deneye son verilir (eğer geçen süre 5 dakikadan az veya 20 dakikadan çok ise, tükürüğün değişik sulandırımı kullanılarak 10 dakika civarında bir uç nokta bulunmalıdır). Deney insan tükürüğü yerine dana salyası kullanılarak tekrar yapılabilir. Amilaz Aktivitesinin Hesaplanması Bir amilaz üniti; yöntemde tarif edilen deney koşullarında, 10 dakikada %1'lik nişastanın 5 ml'sini hidroliz eden amilaz miktarı olarak tarif edilir. Amilaz Ünitesi = 100 (sulandırım faktörü) x 10/T (dakika) T = Nişastanın ortamdan kayboluşu için geçen zaman. Eğer nişasta değişik şekilde sulandırılırsa, sulandırma faktörü de ona göre değişir. Çalışmada değişik sulandırma kullanılmadığı için, böyle bir değişiklik yapılmasına gerek kalmamıştır. Tüplerde renk değişiminin olduğu, berraklığın ortadan kalktığı nokta "akromik nokta" adını alır. Bu nokta nişastanın tümünün amilazla şekere dönüştüğü safhadır. Çalışmada, amilaz enzim aktivitesinin ölçülmesinde insan tükrüğü ile dana salyasında aktiviteler ölçülerek, karşılaştırılması yapılır. Enzim aktivitesinin değerlendirilmesi fotoğraflarla belirlenerek, akromik nokta saptanır (Şekil 3.1, 2, 3, 4). İnsan tükürüğü için: (Akromik nokta = 3. tüpte, 3. dakika) Amilaz Ünitesi = 100 x 10/T = 100 x 10/3 = 333,3 ünit Dana salyası için: (Akromik nokta = 2. tüpte, 2. dakika) Amilaz Ünitesi = 100 x 10/T = 100 x 10/2 = 500 ünit AÇIKÖĞ RETİ M FAKÜLTESİ

30 ENZİMLER VE ENZİM AKTİVİTELERİNİN GÖSTERİLMESİ Şekil 3.1: İnsan Tükürüğünde Amilaz Aktivitesinin Fotoğrafla Belirlenmesi ( Akromik Noktanın 3. Tüpte Görülmesi ) Şekil 3.2: Enzim Aktivitesinin Durdurulduğu Tüpler. (4. Tüpten İtibaren) ANADOLU ÜNİVERSİTESİ

ENZİMLER VE ENZİM AKTİVİTELERİNİN GÖSTERİLMESİ Şekil 3.3: Dana Salyasındaki Amilaz Enzim Aktivitesinin Fotoğrafla Belirlenmesi (Akromik Noktanın 2. Tüpte Görülmesi) Şekil 3.4: Enzim Aktivitesinin Durduğu Tüpler (3. Tüpten İtibaren) AÇIKÖĞRETİM FAKÜLTESİ 31

32 ENZİ MLER VE ENZİ M AKTİ V İ TELERİ N İ N GÖSTERİ LMESİ Amilaz, nişasta ve glikojene etkili bir enzimdir. Pankreatik sekresyonun nişasta parçalayıcı etkisi, pankreatik alfa amilaza bağlıdır. Nişasta ve glikojeni maltoz, maltotroz alfa-1,4 bağları ile bağlı 3 adet alfa-glikoz kalıntısı ve dallı 1,6 oligosakkaritler ve bir miktar glikoza parçalayıcı etkisi tükürük amilazınınkine benzemektedir. Yapılan çalışmada analiz materyali olarak, insan tükürüğü ile dana salyası kullanılmıştır. Kullanılan dana salyasında mukus oranının fazla olması ve saf dana salyasının elde edilmesinin zor olması nedeniyle, amilaz enzim aktivitesi kesin olarak saptanamayıp yaklaşık bir değer elde edilmiştir. İnsan tükürüğündeki amilaz düzeyi, dana salyasına göre daha fazladır ve daha çabuk parçalanmanın gerçekleşmesi gerekir. En azından reaksiyonun gerçekleşmesi için aralarında 30 dakika gibi bir zaman sürecinin geçmesi beklenir. Halbuki bulunan değer sadece bir dakikalık farktır. Bu yüzden sadece renk değişimine göre değerlendirme yapabiliriz. Amilaz miktarı hakkında kesin bir karşılaştırma yapamayız. Deney 2. Katalaz Aktivesinin Tayini ve Kimyasal Katalizör Manganez Dioksitle Karşılaştırılması Bu çalışmalarda katalaz denilen bir enzimin deney tüpünde basit kimyasal reaksiyonu hızlandırdığını görecek ve aynı reaksiyonu çabuklaştıran inorganik bir katalizörü, katalazla karşılaştırma fırsatı bulacaksınız. Aktif kimyasal bir madde olan hidrojen peroksit, hücrede meydana gelen kimyasal reaksiyonlardan aralıksız olarak oluşan bir yan üründür. Hidrojen peroksit zehirlidir; eğer derhal atılmaz veya parçalanmazsa, hücrelere zarar verir. Bir katalizör bulunduğu zaman, hidrojen peroksit oksijen ve suya ayrılarak zararsız hale gelir. Araç ve Gereçler : karaciğer, patates, havuç, kuru soğan v.b. bitkisel ve hayvansal dokuları, %3 hidrojen peroksit çözeltisi, manganez dioksit (toz), bitkisel ve hayvansal dokular, ince kum, küçük deney tüpleri, tüplük, pens, bunzen beki, havan. Uygulama: İki deney tüpü alarak her ikisine de 2 ml kadar hidrojen peroksit çözeltisinden koyunuz. Tüplerden birine az miktarda (0.1 gr) ince kum atınız. Eğer bir sonuç elde ederseniz kaydediniz. İkinci tüpe aynı miktarda manganez dioksit katınız. Ne olduğunu gözleyiniz ve kaydediniz. Yanmakta olan küçük bir tahta parçasını tüpün ağzına tutunuz. Diğer bir deney tüpüne 2 ml kadar hidrojen peroksit çözeltisinden koyunuz. Pensle küçük bir karaciğer parçası alarak hidrojen peroksit tüpüne atınız. Bir kaç dakika gözleyiniz ve sonucu yazınız. Şimdi bir önceki deneyde kullandığınız büyüklükte bir karaciğer parçasını bir havana koyarak dövünüz. Bunu taze hidrojen peroksit ihtiva eden bir deney tüpüne ANADOLU ÜNİ VERSİ TESİ

ENZİ MLER VE ENZİ M AKTİ V İ TELERİ N İ N GÖSTERİ LMESİ 33 koyunuz. Dövülmüş karaciğerin faaliyetini, daha önce gözlediğiniz parça karaciğerin faaliyeti ile karşılaştırınız. Şimdi diğer bir karaciğer parçası alarak bir kaç dakika kaynar suda tutunuz. Bundan sonra kaynamış karaciğeri hidrojen peroksite koyunuz ve karaciğer enziminin hidrojen peroksiti parçalayıp parçalamadığını gözleyiniz. Bu deneyleri diğer canlı dokularla tekrarlayınız. Her materyalin faaliyetini şekilde gördüğünüz gibi basit bir tablo haline getiriniz. Reaksiyonların hızlarını gösteren bir cetvel yapınız. Tablo 3.1: Değşik Materyallerde Enzim Aktivitesi Varlığının Tabloda Gösterilmesi KARACİĞER PATATES PARÇA DÖVÜLMÜŞ KAYNAMIŞ Özet Enzimler biyokimyasal reaksiyonların hızını artıran ve protein yapısında olan biyokatalizörlerdir. Enzimlerin değişikliğe uğrattığı moleküle substrat; enzim aktivitesi sonucu oluşan maddeye ürün, enzim aktivitesi için gerekli olan metal iyonu ve organik moleküllere ise kofaktör ve koenzim adı verilir. Enzim aktivitesi ya ortamda azalan substrat miktarına göre yada ortamda oluşan ve giderek artan ürün miktarına göre belirlenir. Bu iki elemanı belirleyen yöntemler ise, spektrofotometrik yöntem, monometrik yöntem, thunberg yöntemi, elektrot yöntemi, polimerik yöntem, kromatografik yöntem ve kimyasal tayin yöntemi olarak sınıflandırılır. Amilaz enzim aktivitesinin tayininde nişastanın glukoz birimlerine parçalandığı, iyot ile oluşan rengin ortadan kalkması ile belirlenmiştir. Katalaz enzim aktivitesinin tayininde ise, hidrojen peroksitin enzim aktivitesi sonucu parçalanması ile oluşan su ve oksijenden, oksijenin varlığı alev ile kanıtlanarak enzim aktivitesi gösterilmiştir. AÇIKÖĞ RETİ M FAKÜLTESİ

34 ENZİ MLER VE ENZİ M AKTİ V İ TELERİ N İ N GÖSTERİ LMESİ Değerlendirme Soruları 1. Enzimlerin kimyasal yapısı aşağıdakilerden hangi gruba girer? A. Karbonhidratlar B. Proteinler C. Yağlar D. Nükleik asitler E. Vitaminler 2. Enzimin substratını, ürününün veya koenziminin maksimum absorbans verdiği dalga boyundaki absorbans değişikliklerini belirleyerek yapılan enzim aktivite tayin yöntemine ne ad verilir? A. Elektrot yöntemi B. Kromatografik yöntem C. Kimyasal tayin yöntemi D. Monometrik yöntem E. Spektrofotometrik yöntem 3. Amilaz aktivitesi tayin edilen deney tüpünde rengin tamamen açılması neyi gösterir? A. Nişastanın tamamının parçalandığını B. Glikozun parçalandığını C. Enzimin aktivite göstermediğini D. Glikozun tüpte azaldığını E. Koenzim ve kofaktörlerin azaldığını 4. Amilaz enziminin substratı aşağıdakilerden hangisidir? A. Aminoasit B. Glikoz C. Nişasta D. Gliserol E. Selüloz 5. Katalaz enzim deneyinde hangi ürünler oluşur? A. Glikoz B. Aminoasit C. Hidrojen peroksit D. Su ve oksijen E. Manganez Yararlanılan ve Başvurulabilecek Kaynaklar Atalay A., (1978) Deneysel Biyokimya, Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Yayınları Ders Kitapları Dizisi: 5. Karlson P., (1992) Tıp ve Fenciler İçin Biyokimya, Ed: Telefoncu A., Sermet Matbaası, Kırklareli. Değerlendirme Sorularının Yanıtları 1.B 2.E 3.A 4C 5.D ANADOLU ÜNİ VERSİ TESİ