T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI

T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI Leptinotarsa decemlineata (Say) (COLEOPTERA: CHRYSOMELIDAE) LARVALARINDA FUNGAL ENFEKSİYONA KARŞI OLUŞAN NODÜLASYON REAKSİYONUNDA EİKOSANOİDLERİN ROLÜ CEMİL BENGİN YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ Şubat-2006 KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI Leptinotarsa decemlineata (Say) (COLEOPTERA:CHRYSOMELIDAE) LARVALARINDA FUNGAL ENFEKSİYONA KARŞI OLUŞAN NODÜLASYON REAKSİYONUNDA EİKOSANOİDLERİN ROLÜ CEMİL BENGİN YÜKSEK LİSANS TEZİ Kod No: Bu Tez 14/ 02/ 2006 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oy Birliği ile Kabul Edilmiştir. İmza İmza İmza Doç. Dr. Yrd. Doç. Dr. Yrd. Doç. Dr. Hasan TUNAZ M. Kubilay ER İskender TİRYAKİ DANIŞMAN ÜYE ÜYE Yukarıdaki imzaların adı geçen öğretim üyelerine ait olduğunu onaylarım. İmza ve Mühür Prof. Dr. Özden GÖRÜCÜ Enstitü Müdürü Bu çalışma K.S.Ü Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Proje No: 2004 / 3-12 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER... ÖZET... ABSTRACT... ÖNSÖZ... ÇİZELGELER DİZİNİ... ŞEKİLLER DİZİNİ SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ. SAYFA I III IV V VI VII VIII 1. GİRİŞ... 1 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR... 3 2.1. Yurt İçinde Yapılan Çalışmalar... 3 2.2. Yurt Dışında Yapılan Çalışmalar... 3 3. MATERYAL ve METOT... 8 3.1. Materyal... 8 3.2. Metot. 9 3.2.1. Nodülasyon Denemesi.. 9 3.2.2.Kontrol Denemeleri... 10 3.2.3. Farklı Dozlardaki Beauveria bassiana Blastosporlarının Nodülasyon Reaksiyonundaki Etkisi..... 10 3.2.4. Farklı Eikosanoid Biyosentez İnhibitörlerinin Nodülasyon Reaksiyonundaki Etkisi..... 10 3.2.5. Zamanın Nodülasyon Oluşumundaki Etkisi. 10 3.2.6. Phenidone (Eikosanoid biyosentez inhibitörü) Doz Denemesi.. 10 3.2.7. Eikosanoid Substratı Arakidonik Asidin Nodülasyon Reaksiyonundaki Rolü.... 11 3.2.8. İstatistiki Analiz. 11 4. BULGULAR 12 4.1.Kontrol Denemeleri Bulguları..... 12 4.2. Farklı Dozlardaki Beauveria bassiana Blastosporlarının Nodülasyon Reaksiyonundaki Etkisi... 12 4.3. Farklı Eikosanoid Biyosentez İnhibitörlerinin Nodülasyon Reaksiyonundaki Etkisi. 12 4.4. Zamanın Nodülasyon Oluşumundaki Etkisi 12. 4.5. Phenidone un Farklı Dozlarının Nodülasyon Reaksiyonundaki Etkisi. 14 4.6. Eikosanoid Substratı Arakidonik Asidin Nodülasyon Reaksiyonundaki Rolü... 14 5. SONUÇ VE ÖNERİLER... 16 KAYNAKLAR... 19

EKLER. 22 ÖZGEÇMİŞ. 23

KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ ÖZET Leptinotarsa decemlineata (Say) (COLEOPTERA:CHRYSOMELIDAE) LARVALARINDA FUNGAL ENFEKSİYONA KARŞI OLUŞAN NODÜLASYON REAKSİYONUNDA EİKOSANOİDLERİN ROLÜ CEMİL BENGİN DANIŞMAN: Doç. Dr. Hasan TUNAZ Yıl: 2006 Sayfa: 23 Jüri: Doç. Dr. Hasan TUNAZ : Yrd. Doç. Dr. M. Kubilay ER : Yrd. Doç. Dr. İskender TİRYAKİ Bu tez nodülasyonun böceklerde fungal enfeksiyona karşı önemli bir hücresel savunma mekanizması olup olmadığını belirlemek için yapılmıştır. Bu amaçla, fungal enfeksiyonlara karşı patates böceği (Leptinotarsa decemlineata) larvalarındaki nodülasyon reaksiyonunda eikosanoidlerin rolü test edilmiştir. Beauveria bassiana blastosporlarının L. decemlineata larvalarına enjeksiyonundan önce eikosanoid biyosentez inhibitörlerinin enjekte edilmesi fungal saldırılara karşı oluşan nodül sayısını kontrol larvalarına oranla önemli ölçüde azaltmıştır. Eikosanoid biyosentezinin temel enzimleri fosfolipaz A 2, cyclooxygenase ve lipooxygenase enzim inhibitörleri larvalara uygulandığında fungal enfeksiyonlara karşı oluşan nodülasyon reaksiyonunda kontrol larvalarına oranla azalma görülmüştür. Bu bulgular nodül oluşumunda cyclooxygenase ve lipooxygenase enzimlerinin her ikisinin de rol aldığını göstermiştir. Hem cyclooxygenase hem de lipooxygenase inhibitörü olan phenidonun nodülasyonu engelleyici etkisi enjeksiyondan 30 dakika sonra görülmüş ve nodülasyon oluşumunu kontroldeki böceklere göre önemli ölçüde azaltmış, 8 saat boyunca bu etki sürmüştür. Dexamethasonun nodülasyon oluşumu üzerine engelleyici etkisi eikosanoid substratı olan doymamış yağ asidi arakidonik asit uygulanması ile ortadan kaldırılmıştır. Bu bulgular, eikosanoidlerin L. decemlineata larvalarında fungal enfeksiyonlara karşı böcek hücresel bağışıklık reaksiyonunda rol aldığını göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Nodülasyon, Eikosanoid, Beauveria bassiana, Leptinotarsa decmlineata, Blastospor

UNIVERSITY OF KAHRAMANMARAŞ SUTCU IMAM INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF PLANT PROTECTION MSc THESIS ABSTRACT EICOSANOID MEDIATE NODULATION REACTION TO FUNGAL INFECTIONS IN LARVAE OF Leptinotarsa decemlineata (Say) CEMİL BENGİN Supervisor : Assoc. Prof.Dr. Hasan TUNAZ Year :2006 Pages :23 Jury : Assoc. Prof.Dr. Hasan TUNAZ : Assist. Prof.Dr. M. Kubilay ER : Assist. Prof.Dr. İskender TİRYAKİ This thesis is based on the understanding that nodulation is the most important cellular defense reaction to fungal infection in insects. On the basis of this understanding, it was hypothesized that nodulation reactions to fungal infections are mediated by eicosanoids in larvae of Leptinotarsa decemlineata. Here, it is reported that inhibition of eicosanoid biosynthesis in larvae of L. decemlineata immediately prior to intrahemocoelic injections of the fungus, Beauveria bassiana, sharply reduced the nodulation reaction to the fungal challenges. Separate treatments with specific inhibitors of the major enzymes involved in eicosanoid biosynthesis, including phospholipase A 2, cyclooxygenase, and lipoxygenase, reduced nodulation reactions to fungal infections. These findings support the view that nodule formation is a complex process involving lipoxygenase and cyclooxygenase products. The inhibitory influence of phenidone, the dual cyclooxygenase and lipoxygenase inhibitor, was apparent within 30 minutes of injection, and nodulation was significantly reduced, relative to control insect, over the first 8 hours after infection. The inhibitory effect of dexamethasone on nodulation was reversed by treating fungus-injected insects with the eicosanoid-precursor polyunsaturated fatty acid, arachidonic acid. These findings in the insect support the hypothesis that eicosanoids mediate insect cellular immune reactions to fungal infections in L. decemlineata. Key Words:Nodulation, Eicosanoid, Beauveria bassiana, Leptinotarsa decmlineata, Blastospore

ÖNSÖZ Bu çalışmada Leptinotarsa decemlineata (say) (Coleoptera:Chrysomelidae) larvalarında fungal enfeksiyona karşı oluşan nodülasyon reaksiyonunda eikosanoidlerin rolü araştırılmıştır. Tez aşamasında her türlü yardımını esirgemeyen Bitki Koruma Bölüm Başkanı sayın Doç. Dr. Ali Arda IŞIKBER e, tez olarak bana bu araştırma konusunu veren Yüksek Lisans programı süresince yardımlarını esirgemeyen, çalışmalarım esnasında her türlü desteğini aldığım, her türlü özveriyi bana gösteren hocam Doç. Dr. Hasan TUNAZ a, ve çalışmamın büyük kısmında özellikle entomopatojenik fungusun hazırlanmasında her türlü katkıyı sağlayan ve aynı zamanda tezimin jüri üyesi olan sayın hocam Yrd. Doç. Dr. M. Kubilay ER e ve ayrıca tezimi değerlendiren jüri üyesi sayın Yrd. Doç. Dr. İskender TİRYAKİ ye teşekkürlerimi sunuyorum. Gerek arazi çalışmalarında gerekse laboratuar çalışmalarında bana yardımcı olan Araş. Gör. Abdurrahman ADİN ve Araş. Gör. Ayşegül KARCI ya ve Bitki Koruma Bölümündeki Yüksek lisans yapan arkadaşlara teşekkür ediyorum. Ayrıca Arş. Gör. Ziya DUMLUPINAR, Ziraat Mühendisi Hacı Mehmet Beydemir, Ziraat Mühendisi Hasan MARAL, Gökhan ALTUN ve Emrah ALTUN a teşekkürlerimi sunarım. Son olarak, tezimin her aşamasında ve hayatta beni her konuda destekleyen aileme teşekkürlerimi sunuyorum. Şubat 2006 KAHRAMANMARAŞ CEMİL BENGİN

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. L. decemlineata larvalarında yapılan kontrol denemeleri sonucunda oluşan nodül sayısı ortalamaları.. 12

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Denemelerde kullanılan Patates böceği L. decemlineata (Say) larvası 8 Şekil 3.2. Patates böceği larvasının yağ dokusunda fungus blastosporlarına karşı oluşan nodül görünümü. 9 Şekil 4.1. Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin in balstosporlarının farklı dozlarına karşı patates böceğinde oluşan nodülasyon tepkisi. 13 Şekil 4.2. Farklı eikosanoid biyosentez inhibitörlerinin patates böceği larvalarının fungal sporlara karşı oluşturduğu nodülasyon reaksiyonundaki etkisi. 13 Şekil 4.3. Phenidone un zamana bağlı olarak nodülasyon sayısı üzerine etkisi 14 Şekil 4.4. Phenidone un değişik dozlarının nodül oluşumu üzerine etkisi... 15 Şekil 4.5. Eikosanoid substratı arakidonik asidin patates böceği larvalarının fungal sporlara karşı oluşturduğu nodülasyon reaksiyonundaki rolü... 15

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ aasit :Arachidonic asit dex :Dexamethasone esc :Esculetin etoh :Ethanol ibup :Ibubrofen indom :İndomethacin ml :Mililitre nap :Naproxen phen :Phenidone pir :Piroxicam µg :Mikrogram µl :Mikrolitre

1. GİRİŞ Bakteri, fungus ve diğer birçok mikroorganizmada hastalık yapan etmenlerdir. Böceklerin omurgalılar ve diğer omurgasızlar gibi kendilerini hastalıklardan korumak için bağışıklık sistemleri bulunmaktadır. Böceklerdeki bağışıklık hücresiz ve hücresel diye ikiye ayrılmaktadır. Bunlar bazen humoral (antibakteriyel) ve hücresel bağışıklık olarak da adlandırılır (Gupta, 1986). Hücresiz bağışıklık bakterilere karşı böcekler tarafından üretilen antibakteriyel proteinlerdir. Kan hücrelerinin oluşturduğu hücresel bağışıklık siteminde bağışıklık sistemi böcekteki kan hücreleri ile bakteri hücrelerinin direk ilişkisi sonucunda oluşturulmaktadır. Böcek kan hücrelerinin tanımlanması ve sınıflandırılması birçok çalışma ile geniş olarak ortaya konmuştur (Stanley-Samuelson, 1994a, b, c). Fakat sınıflandırmada bilim adamları arasında farklı görüşler vardır. Bir Lepidoptera türü olan Manduca sexta L. (Lepidoptera: Sphingidae) da beş değişik kan hücresi olduğu belirtilmiştir. Bunlar prohemositler (prohemocytes), sferositler (spherulocytes), enositler (enocytoids), plazmotositler (plasmotocytes) ve granulositlerdir (granulocytes) (Dunn, 1986). Bunların arasından sadece plazmotositler ve granulositlerin hücresel bağışıklıktan sorumlu olduğu belirtilmiş ve bunlar için birleşik olarak immunositler (immunocytes) tanımlamasını önerilmiştir, fakat bu iki kan hücresinin bağışıklıktaki rolü arasında kesin farklılıklar bulunduğundan dolayı iki değişik grup olarak tanımlanmıştır. Omurgasız canlılar olan böceklerde hücresel savunma mekanizması kendi arasında üçe ayrılır. Bunlar fagositik özellik (phagocytosis), nodülasyon reaksiyonu (nodulation) ve enkapsülasyon (encapsulation) dur ( Gupta, 1991). Böceklerde nodülasyon oluşturma sistemi böcek hücrelerinin hastalıklara karşı oluşturduğu en hızlı savunma mekanizmasıdır. Vücut sıvısındaki hemositlerin nodülasyon oluşturması bakteri, fungus ve protozoa ların saldırılarına karşı oluşturulur. Nodülasyon oluşması hemositlerin bakteri hücresi veya fungus sporların etrafını sararak bir araya toplanıp mikroagregatlar oluşturması ile başlar; bu genellikle granulositlerin, mikrop hücrelerinin veya sporlarının etrafını sarması sonucu oluşmaktadır. Bu mikroagregasyonun daha fazla olması hemositlerin daha çok sayıda mikrop hücrelerini hapsetmesiyle sonuçlanır. Bu işlem tipik olarak plazmotosit hücre tipinin mikroroganizmaya bağlanması ile son bulur ve plazmotosit hücreleri profenoloksidaz (prophenyloxidase) aktivasyonu sonunda siyahlaşır (melanize olur). Gelişmiş nodülasyon genellikle hücre duvarına ve organlarına bağlanmış şekilde görülür. Eikosanidler 20 karbonlu arakidonik asit ve diğer iki doymamış yağ asisinden oluşan moleküllerdir (Stanley-Smaulelson, 1994b). Böceklerin hastalılara karşı (bakteri) oluşturduğu hücresel bağışıklıklardan nodülasyon oluşturulması ve nodülasyon oluşumunda eikosanidlerin (20 karonlu yağ asitleri) rolü laboratuvar koşullarında bir çok böcek türünde çalışılmıştır (Miller ve ark., 1994, 1996, 1999;Tunaz ve ark., 1999, 2003; Tunaz ve Stanley, 1999; Bedick ve ark., 2001). Eikosanoid biyosentez yolu ek 1 de gösterilmektedir. Bu çalışmalar eikosanoidlerin böceklerin bakteriyel hastalıklara karşı oluşturduğu hücresel savunma mekanizmalarında etkili olduğunu göstermiştir.

Böceklerin bakteriyel hastalıklara karşı oluşturduğu hücresel bağışıklardan nodülasyon oluşturmasında eikosanidlerin rolünün yanı sıra, fungal hastalıklara karşı oluşturulan nodülasyon reaksiyonunda da eikosanidlerin etkisinin olduğu belirtilmiştir (Lord ve ark, 2002; Dean ve ark, 2002). Fungal patojen Beauveria bassiana ya karşı hücresel reaksiyon oluşumunda bir eikosanoid biyosentez yolu olan lipooxygenase enziminin rolü olduğu belirtilmiştir (Lord ve ark., 2002). Böceklerin hastalıklara karşı oluşturduğu hücresel bağışıklıklardan olan nodülasyon oluşumunda eikosanoidlerin rolü daha önce yapılan çalışmalarda genellikle entomopatojen bakterilerde ortaya konmuştur. Bildiğimiz gibi böceklerde bakterilerin yanı sıra protozoalar ve funguslar gibi entomopatojenler de hastalık oluşturmaktadır ve fungal hastalıklara karşı eikosanidlerin etkisi sınırlı sayıda test edilmiştir. Bu yüzden daha önce sınırlı sayıda yapılan çalışmalara bir katkı sağlamak için bu araştırmada böceklerin fungal etmenlere karşı hücresel bağışıklıklarından nodülasyon reaksiyonunda eikosanidlerin rolü araştırılmıştır.

2.1. Yurt içinde Yapılan Çalışmalar 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Tunaz ve ark. (2003), yaptıkları çalışmada mısır kurdu (Ostrinia nubilalis) larvalarına eikosanoid biyosentezini engelleyen kimyasallar enjekte etmişler ve daha sonra Serratia marcescens bakterisi şırınga ile böceklere verilmiştir ve nodülasyon oluşumu eikosanid biyosentezini engelleyen inihibitörlerin verilemediği böceklere oranla önemli oranda azalmıştır. Eikosanoid biyosentezi oluşma esnasındaki enzimler olan fosfolipaz A 2 (PLA 2 ), cyclooxygenase (sayklooksicenaz), lipoxygenase (lipoksicenaz) ı engelleyen inhibitörler olan dexamethasone (deksamethason), indomethacin (indomethasin) ve phenidone (fenidon) larvalara verilmiştir ve bu larvalarda nodülasyon oluşumu inhibitör verilmeyen larvalara oranla önemli ölçülerde azalmıştır. Bu çalışmada mısır kurdunun bakteriyel enfeksiyona karşı koyma mekanizmalarından biri olan nodülasyon tepkisinde eikosanoidlerin etkili olduğunu göstermiştir. Tunaz ve ark. (2004), çalışmanın amacı, çam kese böceğinde fungal hastalıklara karşı oluşturulan hücresel bağışıklıklardan nodülasyon reaksiyonunda eikosanoidlerin rolünü ortaya koymak ve bu böceklerde mücadelede kullanılması muhtemel entomompatojenik funguslarla birlikte eikosanoid biyosentezini engelleyen inhibitörlerin muhtemel kullanılabilirliğini araştırmaktır. Nodülasyon reaksiyonu bakteri enfeksiyonlarının yanı sıra fungus enfeksiyonlarına karşı da böceklerde geliştirilen hücresel bir dirençtir. Yapılan bu çalışmada çam kese böceği larvalarına şırınga ile eikosanoid biyosentezini engelleyen kimyasallar (52µg/larva) enjekte edildikten sonra aynı larvalara şırınga ile fungus (Beauveria bassiana 1.5x 10 7 blastospor/ml den her bir larvaya 5µl) verilmesi bu böceklerde nodülasyon oluşumunu önemli derecede (yaklaşık %70) azaltmıştır. Bu çalışma çam kese böceğinde fungus enfeksiyonlarına karşı oluşan hücresel bağışıklıklardan nodülyon reaksiyonunda eikosanoidlerin rol aldığını göstermiştir. 2.2. Yurt Dışında Yapılan Çalışmalar Stanley-Samuelson ve ark. (1991), Manduca sexta larvalarında eikosanoid biyosentezinde rol alan, fosfolipaz A 2 (PLA 2 ), cyclooxygenase ve lipoxygenase gibi spesifik enzim inhibitörlerinin bu böceğin larvalarına enjekte edilmesinden sonra böceklerin Serratia marcescens bakterisi ile bulaştırılması sonucunda böceklerin kanlarından bakterinin uzaklaştırılamadığını gözlemişler ve bakteriden dolayı böceklerde ölüm oranında artış olduğunu bildirmişlerdir. Larvaların eikosanoid biyosentezi için gerekli olan 20 karbonlu yağ asitlerini içerdiği tespit edilmiştir ve bunların arakidonik asidi prostogalandinlere çevrilebildiği söylenmiştir. Bu çalışmadaki sonuçlarda bakteriyel enfeksiyonlara karşı bu böceğin hücresel bağışıklığında eikosanoidlerin etkili olduğu ortaya çıkmıştır. Miller ve ark. (1994), böceklerde nodülasyon oluşumunda ekikosanoidlerin rol aldığını belirtmişlerdir. Nodülasyonun böcekler ve diğer omurgasızlarda bakteriyel enfeksiyona karşı hücresel bir tepki olduğu belirtilmiştir. Çalışmada Serratia marcescens ile enfekteli Manduca sexta larvalarına eikosanoid biyosentezi inhibitörleri enjekte edildiğinde enjekte edilmeyenlere oranla nodülasyon oluşumunda kuvvetli bir şekilde azalma gözlemlenmiştir ve eikosanoid biyosentezinin engellenmesi ile enfeksiyondan bir saat sonra kan hücrelerinin mikrop hücresi etrafında toplanması (nodülasyon başlangıcı) azalmıştır. Eikosanoidlerin sentezinde rol alan PLA 2, cyclooxigenase ve lipoxygenase gibi

enzimlerin özel inhibitörleriyle yapılan ayrı ayrı uygulamalarda böceklerin nodülasyon oluşturmasında azalma olmuştur. Bu çalışma nodülasyon oluşumunda eikosanoidlerin rol aldığını göstermiştir. Stanley-Samuelson ve ark. (1996), böceklerdeki eikosanoidlerin nodül oluşumunda etkili olduğunu söylemişlerdir. Eikosanoidler 20 karbonlu doymamış yağ asidinin oksijenli (20:3n-6,20:4n-6 ve 20:5n-3) metabolitleridir. Memelilerde eikosanoidler farmakolojik olarak çok iyi bilinirken omurgasızlar ve böceklerdeki bu bileşiklerin önemi hakkında araştırma yapılmıştır. Miller ve ark. (1996), Tenebrionidae familyasına ait Zophobas atratus un larvalarında bakteriyel enfeksiyonlara eikosanoidlerin oluşturduğu nodülasyon tepkileri incelemişlerdir. Çalışmada nodülasyonun böcekler ve diğer omurgasızlarda bakteriyel enfeksiyonlara karşı vücutta oluşan ve gözle görülebilen hücresel bir savunma tepkisi olduğu bildirilmiştir. Zophobas atratus un larvalarındaki eikosanoid biyosentezi engellenerek daha sonra ısı ile öldürülmüş Serratia marcescens bakterisinin kana verilerek bakterilere karşı oluşan nodülasyonu azaltıldığı tespit edilmiştir. Phospholipase A 2, cyclooxygenase ve lipoxygenase inhibitörleri ile ayrı ayrı yapılan denemelerde nodülasyon kontrollere oranla azalmıştır. Bu bulgular nodülasyon oluşumunda lipoxygenase ve cyclooxygenase enzimlerinin arakidonik asiti prostaglandinlere çevirdiği gözlemlenmiştir. In vitro çalışmaları Zophobas atratus un larvalarında prostaglandin sentezlenmiştir. Bu çalışma bu böceğin bakteriyel hastalığa karşı oluşturduğu hücresel savunma mekanizması olan nodülasyon reaksiyonunda eikosanoidlerin etkili olduğunu göstermiştir. Jurenka ve ark. (1997), Agrotis ipsilon ve Pseudaletia unipuncta nın bakteriyel enfeksiyonlara karşı mikroagregasyon ve nodülasyon tepkisi oluşturmasında eikosanoidlerin rolünü incelemişlerdir. Nodülasyonun böcekler ve diğer omurgasızlarda bakteriyel enfeksiyonlara karşı görülen bir hücresel savunma mekanizması olduğu söylenmiştir. Pseudaletia unipuncta da ve Agrotis ipsilon da eikosanoid biyosentezinin engellenmesi ile böcek kanında bakteriyel hastalıklara karşı oluşan nodülasyon tepkisinin azaldığı belirtilmiştir. Beş eikosanoid biyosentez inhibitörü, dexametasone (phospholipase A 2 inhibitörü), indomethacin, ibuprofen (cyclooxygenase inhibitörleri), phenidone (cyclooxygenase ve lipoxygenase inhibitörü ) ve eicosatetraynoic asit ( bir arakidonik asit anologudur ve tüm arakidonik asit metabolizmasını engeller) bakteri ile enfekteli böceklerdeki nodülasyonu çok büyük ölçüde azaltttığı ve dexamethasone nin P.unipunctata da etkisinin arakidonik asit uygulanarak ortadan kaldırıldığı ve nodül oluşumunun yeniden meydana geldiği gözlenmiştir. Bu çalışma eikosanoid biyosentez sisteminin böceklerde var olduğunun bir göstergesidir. Bu çalışmada elde edilen bulgular eikosanoidlerin böceklerdeki hücresel bağışıklık reaksiyonunda görev aldığını desteklemiştir. Miller ve ark. (1999), kara çekirgelerinin (Gryllus assimilis) erginlerinde bakteriyel enfeksiyona karşı hücresel bağışıklardan nodülasyon reaksiyonunda eikosanoidlerin rolü çalışılmışlardır. Eikosanoid biyosentezi inhibitörü dexamethasone böceğe enjekte edilince etkisi iki saat içinde görülmüş ve bakteriye karşı oluşan nodül sayısında önemli bir şekilde düşüş olduğu belirtilmiştir. Bu çalışmanın sonunda da eikosanoidlerin holometabol böceklerin yanı sıra hemimetabol böceklerde de bakterilere karşı oluşan hücresel savunmalardan nodülasyon reaksiyonunda rol aldığı ortaya konmuştur.

Tunaz ve ark. (1999), çalışmada 17 yıllık ağustos böceği Magicicada septendicum ve M. cassini erginleri kullanılmıştır. Eikosanoid biyosentez inhibitörleri Serratia marcescens bakterisi bulaştırılmadan önce bu böceklere enjekte edildiğinde böceklere karşı hücresel savunma mekanizması olan nodülasyon reaksiyonunu durdurmuştur. Bu çalışma farklı bir yaşam tarzı olan exopterygota türüne ait böceklerde yapılmış ve çalışmanın sonunda eikosanoidlerin böceklerin çoğunda bakteriyel enfeksiyona karşı oluşan hücresel bağışıklık reaksiyonunda rol aldığını göstermiştir. Tunaz ve Stanley (1999), nodülasyonun böceklerdeki bakteri enfeksiyonuna hücresel savunma tepkisinin ilk oluşum şekli olduğu belirtilmiş ve Amerikan hamam böceğinin (Periplanta americana) erginlerinde bakterilerin enfeksiyonuna karşı nodülasyon reaksiyonunda eikosanoidlerin rol aldığı bulunmuştur. Bu çalışmada Amerikan hamam böceğinin erginlerinde bakteriyel enfeksiyonlara karşı nodülasyon tepkisinin oluşumu test edilmiştir ve eikosanoidlerin hamam böceklerinde bakteriyel enfeksiyona karşı oluşan hücresel bağışıklık tepkisinde rol aldığı belirtilmiştir. Stanley ve ark. (1999), Colias eurytheme larvasında bakteriyel enfeksiyonlara karşı nodülasyon reaksiyonunda rol aldığı ve nodülasyonun böceklerde bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilk baskın hücresel savunma mekanizması olduğu söylenmiştir. C. eurytheme larvalarına eikosanoid biyosentez inhibitörü dexamethasone uygulamasının Serratia marcescens tarafından neden olan bakteriyel enfeksiyonlara karşı oluşan nodülasyon reaksiyonunu azalttığı söylenmiştir. Dexaethasonun nodülasyon reaksiyonunu engelleme etkisi bakteri enfekteli böceklerde eikosanoid substratı olan arakidonik asit uygulayarak ortadan kaldırılmıştır. C. eurytheme larvalarında eikosanoid biyosentezinin gerçekleştiği in vitroda tespit edilmiştir. Kelebek larvalarındaki bakteriyel enfeksiyonlara karşı oluşan hücresel savunma mekanizmasında eikosanoidlerin rol aldığı tespit edilmiştir. Bedick ve ark. (2000), Serratia marcescens bakterisinin hücre duvarında bulunan lipopolisakaritlere karşı böcek hücresel bağışıklık reaksiyonunda eikosanoidlerin etkisi araştırılmıştır. Nodülasyonun hücresel mikroagregatların oluşumu ile başladığı ve böceklerdeki bakteriyel enfeksiyonlara karşı birincil hücresel savunma reaksiyonu olduğu söylenmiştir. Bazı lipopolisakaritlerin (LPS) bakteriyel hücre parçalarının böcek ve memelilerde savunma reaksiyonu oluşmasını teşvik ettiği belirtilmiştir. Yapılan denemeler LPS e mikroagregasyon reaksiyonunda eikosanaidlerin rol aldığını göstermektedir. Zophobas atratus larvasına LPS enjeksiyonu (Serratia marcescens bakterisinden alınan) sonucu doza bağlı mikroagregasyon oluşumu gerçekleştiğini söylemişlerdir. Bakteri hücresinin özel bir kısmına, hücresel savunma tepkilerinde eikosanaidlerin rol aldığını bu çalışma sonuçları göstermektedir. Bedick ve ark. (2001) yeni ergin olmuş bal arılarında bakteriyel enfeksiyonlara karşı nodülasyon tepkisinde eikosanoidlerin etkileri araştırılmıştır. Nodülasyonun böceklerdeki bakteriyel enfeksiyonlara karşı hücresel savunma mekanizmasında oluşan ilk tepki olduğu söylenmiştir. Sosyal bir böcek olan bal arısı Apis mellifera nın erginlerinde bakteriyel saldırılara nodülasyon reaksiyonunda eikosanoidlerin etkili olduğuna dair hipotez test edilmiştir. Yeni ergin olan arılara eikosanoid biyosentez inhibitörü olan dexametasone bakteriyel enfeksiyonlara nodülasyon tepkisini azaltmıştır. Yaşlı ergin arılarda ise bakteriyel saldırılara karşı nodülasyon oluşmadığı belirtilmiştir. Bu çalışmada ergin olan bal arılarının bakteriyel enfeksiyonlara karşı oluşturduğu nodülasyon tepkisinde

eikosanoidlerin rol aldığını ve nodülasyonun böceğin yaşam döngüsünün tüm aşamalarında oluşmadığı gözlemlenmiştir. Dean ve ark. (2002), patojen fungus Metarhizium anisoplia ya karşı Manduca sexta tarafından oluşturulan hücresel bağışıklık reaksiyonunun eikosanoid biyosentezi inhibitörleri kullanımıyla engellendiğini ortaya koymuştur. Metarhizium anisoplia konidileri uygulanması sonucu larvanın ağırlığının azaldığı ve larvanın ölümüne neden olduğu belirlenmiştir. Larvalara eikosanoid biyosentez inhibitörü dexamethasone ve fungus birlikte enjekte edildiği zaman larvaların ağırlık kaybının daha çok arttığı ve ölüm oranında da artış olduğu bulunmuştur. Fungus birlikte eikosanoid biyosentez inhibitörleri (esculetin, phenidone, iboprofen ve indomethacine) ile uygulama sonucu etki mekanizması farklı inhibitörler olmasına rağmen hastalığın gelişmesi nedeni ile ağırlık kaybı olmuştur. M. anisoplia nın konidilerinin in vitroda enjeksiyonu nodül oluşumunu teşvik etmiştir. Bu çalışma bir fungal entomopatojenin etkisinin konukçu böceğin bağışıklık sistemini baskı altına aldığında artacağını göstermiştir. Lord ve ark. (2002), fungal patojen Beauveria bassiana ya karşı hücresel reaksiyon oluşumunda bir eikosanoid biyosentez yolu olan lipooxygenasenin rolü araştırılmıştır. Bu çalışmada bakterilere karşı böcek hücresel bağışıklık sisteminin tepkilerinin olması için eikosanoidlerin gerekli olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmada nodülasyon reaksiyonunda etkili olan eikosanoidlerin, özellikle lipoxygenase (LOX) biyosentez yolunun Manduca sexta da nodülasyon reaksiyonu oluşturmasında diğer bir eikosanoid biyosentez yolu olan cylooxygenase (COX) biytosentez yolundan daha önemli olduğu belirlenmiştir. Nodülasyon reaksiyounun gerçekleşmesinde önemli olan LOX biyosentez ürünleri 5 (s)-hydroperoxyeicosa-6e,8z,11z,14z-tetraenoic asit (5-HPETE), LOX biyosentezini engelleyen caffeic asit, esculetin ve fossolipaz A 2 inhibitörü dexamethasone tarafından engellenerek Manduca sexta larvalarında Beauveria bassiana nın blastosporlarına karşı oluşan nodülasyon reaksiyonunu azalttığı belirlenmiştir. Park ve ark. (2003), Xenorhabdus nematophilus un eikosanoid biyosentezini engelleyerek tütün boynuz kurdu Manduca sexta da oluşan enfeksiyonlara karşı nodülasyon reaksiyonunu baskı altına aldığı belirtilmiştir. Xenorhabdus nematophilus bakterisi önemli bir böcek patojenidir. Bu bakteri hücresel savunma oluşturmada gerekli olan eikosanoidlerin biyosentezini engelleyerek böcek hücresel bağışıklık reaksiyonuna zarar verdiği belirtilmiştir. Tütün boynuz kurdu Manduca sexta nın 5. dönem larvasına hem canlı hem de sıcaklıkla öldürülmüş X. nematophilus bakterisi enjekte edildiğinde larvalarda melanizasyon meydana geldiği ve nodülasyon reaksiyonu oluştuğu belirtilmiştir. Nodülasyon reaksiyonunun canlı bakteri uygulamasında daha az çıktığı (yaşayan bakteri uygulanan larvalarda larva başına ortalama 20 nodül, sıcaklıkla öldürülmüş bakteri uygulamasında ortalama 80 nodül bulunmuştur) belirlenmiş ve canlı X. nematophilus un nodül oluşumunu engellemesinin organik bir faktörden dolayı gerçekleştiği söylenmiştir. Bu araştırmadaki bulgular X. nematophilus un eikosonoid biyosentezini engelleyerek tütün boynuz kurdunda nodülasyon reaksiyonunun baskı altında tutulmasına sebep olmuştur. Park ve Kim (2000), entomopatojenik nematod Steinernema carpocapsae ve bu nematod ile simbiyotik yaşayan Xenorhabdus nematophilus bakterisi ile enfekteli Spodoptera exiqua nın eikosanoidler tarafından bu hastalığı oluşturan bakteriden kurtarıldığı bildirilmiştir. X. nematophilus un böcek kanında septisemiye neden olan

patojenik bir bakteri olduğu ve böcek ölümüne yol açtğı söylenmiştir. X. nematophilus bakterisinin böcek hücresel bağışıklık sisteminde rol alan eikosanoidlerin oluşumunu engellediği belirtilmiştir. Canlı X. nematophilus bakterisinin ve sıcaklıkla öldürülmüş olan formu böceğe enjekte edilmiştir. Canlı bakteri verilen böceklerde oluşan nodül sayısının sıcaklıkla öldürülmüş bakteri enjekte edilen böceklerdeki nodül sayısından daha az oluştuğu tespit edilmiştir. Bu çalışmadaki sonuçlar eikosanoidlerin S. exiqua nın bakterilere karşı bağışıklık tepkisinde bir rol oynadığını ve X. nematophilus un eikosanoid biyosentez yolunu engellediği belirlenmiştir. Garcia ve ark. (2004), Trypanosoma rangeli ile enfekteli Rhodnius prolixus un kanında mikroagregasyon reaksiyonu ve prophenoloxidase sistemi üzerine eikosanoid biyosentez inhibitörlerinin etkisi araştırılmıştır. Kan sıvısındaki prophenoloxidase (propo) ve kan hücrelerinin nodülasyon reaksiyonu üzerine araştırmalar yapılıp Trypanosoma rangeli ile infekteli Rhodnius prolixus un ölüm oranı ve parazitlenmesi incelenmiştir. R. prolixus larvalarına fosfolipaz A 2 inhibitörü dexamethasone, spesifik cyclooxygenase inhibitörü indomethacin ve seçici olmayan lipoxygenase inhibitörü NDGA uygulanması sonucunda T. rangeli ile enfekteli larvaların kan hücrelerinin mikroagregasyonunda azalma olduğu belirlenmiştir. Ayrıca dexamethasonun ağızdan verilmesiyle ortaya çıkan etkiler arakidonik asit uygulanması ile yok edilmiştir. T. rangeli nin kandaki propo sistemini zayıflattığı ve ölüm oranının artmasına neden olduğu belirlenmiştir. Protozoaların böceği parazitlemesine karşı bağışıklık tepkilerinin eikosanoid biyosentezini içeren fizyolojik bir sistem olduğu ilk defa bu çalışmada belirtilmiştir.

3. MATERYAL ve METOT 3.1. Materyal Organisma: Çalışmada Kahramanmaraş ın Göksun ilçesinde patates tarlalarından toplanan Coleoptera takımına ait patates zararlısı Leptinotarsa decemlineata (Say) (şekil 3.1) türüne ait 4. dönem larvalar ve Deuteromycetes sınıfından entomopatojen fungus Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin kullanılmıştır. Yağ altında eğik agar stok kültür içinde tutulan fungus, buradan alınıp patates dextrose agar (PDA) ortamında alt kültüre alındı. Bu ortamda büyüyen fungus miselleri blastospor üretimi için iki farklı ortama alındı. Bu ortamlar bir litre için aşağıdaki şekilde hazırlanmıştır (Goettel ve ark., 1997); 1-) 10 gr pepton, 20 gr glikoz, 10 ml %1 lik tween 80, 2 gr yeast extract 2-) 10 gr pepton, 20 gr glikoz, 10 ml %1 lik tween 80 Bu ortamlardan 20ml hazırlanarak 50ml lik erlen mayer içerisine konulup ağızları pamuk ve alüminyum folyo ile kapatılıp otoklavda 121 C bir atmosfer basınç altında steril edildi. Bu ortamlardaki blastosporlar 25 ±1 ºC ve karanlık bir ortamda orbital karıştırıcı ile dakikada 90 devir hızında 10 gün süre ile çalkalanarak blastosporlar elde edildi. Steril kabinde erlen mayer içindeki ortamlardaki blastosporlar tülden geçirilip süzüldükten sonra ağzı kapalı olarak santrifüj edildi dibe çöken blastosporların üstündeki sıvı ortam 1 ml lik mikro pipet yardımıyla alınmıştır ve altta kalan blastosporlar salin içine konulmuştur. Hazırlanan bu süspansiyon Thoma lamı ile ışık mikroskobu altında sayılarak spor yoğunluğu belirlenmiştir. Konsantrasyonu belirlenen süspansiyon steril kabin içinde 2x10 6 blastospor/ml yoğunluğuna %0.6 lık salin (tuz) kullanılarak seyreltilmiştir. Elde edilen blastosporlar böceklere uygulanana kadar 4 ºC de muhafaza edilmiştir. Kimyasallar: Çalışmada bağışıklık sistemini engelleyici kimyasal inhibitörler olan dexamethasone ((11β, 16α)-9- fluoro-11,17,21-trihyddroxy-16-methylpregna-1,4-dione), phenidone (1-pheny-3-pryazolidinone), indomethacin (1-P-(chlorobenzyl)-5-methoxy-2- methyl-3-indolyl-acetic acid), esculetin (6,7-dihydroxycoumarin), piroxicam (3,4- benzothiazine-3-carboxamid 1,1-dioxide), naproxin(o-2-(6-methoxy-naphthyl) propionic acid ), ibuprofen (α-methyl-4 (2-methylpropyl) benzeneacetic acid) ve eikosanoid biyosentez substratı arachidonic (arakidonik) asit (5,8,11,14-eicosatetraenoic acid) kullanılmıştır. Kimyasallar Sigma firmasından temin edilmiştir. Şekil 3.1. Denemelerde kullanılan patates böceği L. decemlineata larvası

3.2. Metot 3.2.1. Nodülasyon Denemesi Nodülasyon gözlemi Miller ve Stanley (1998) tarafından belirtilen yöntem ve sıra takip edilerek yapılmıştır. Tüm denemelerde 4. dönem patates böceği larvasından 10 ar adet kullanılmıştır. Patates böcek larvaları araziden getirilir getirilmez denemelerde kullanılmıştır. Eikosanoid biyosentez inhibitörleri (dexamethasone, phenidone, indomethacin, esculetin, piroxicam, naproxin, ibuprofen), kontrol olarak kullanılan % 70 lik ethenol (etoh), entomopatojen fungusun blastosporları ve eikosanoid biyosentez substratı arakidonik asit patates böceği larvalarının derilerinin altına ensülin enjektörleri ile verilmiştir. Enjeksiyondan sonra patates böceğinin vücudunda oluşan nodüller (şekil 3.2) böcek vücudu kesilerek stereo mikroskop altında sayılmıştır. Enjeksiyondan önce patates böcekleri buz üzerinde tutulmuştur ve sonra böceğin iğnelenecek kısmı etoh ile steril edilmiştir. Deneme kullanılan 4. dönem patates böceği larvalarına önce fosfolipaz A2 (PLA2) inhibitörü dexamethason veya cyclooxygenase inhibitörü indomethacin, naproxin inhibitörleri, lipoxygenese inhibitörü esuletin ya da cyclooxygenase ve lipoxygenase inhibitörü phenidone dan biri böceğe enjekte edilmiştir. Kontrol olarak kullanılan aynı dönem patates böceği larvalarına ise bu inhibitörlerin taşıyıcısı olan ethenol enjekte edilmiştir. Böceklere kimyasalların enjekte edilmesinden sonra fungusun blastosporları hem deneme grubuna hem de kontrol grubu böceklere 2x10 6 blastospor/ml konsantrasyonunda ensülin iğnesi ile 10µl dozunda enjekte edilmiştir. Larvalar 4 saat boyunca oda sıcaklığında besin maddesi olarak patates yaprağı verilerek bekletilmiştir. Daha sonra larvalar stereo mikroskop altında kesilerek nodül gözlemi için sayım yapılmıştır. Sayım sırasında larvanın vücudundaki siyahlaşmış, kahverengileşmiş yani melanize olmuş nodüller sayılmıştır. Larvaların dorsal (sırt) kısmından açılarak test böceklerinin önce yağ dokusu üzerindeki nodüller sayılmıştır. Daha sonra böceklerin sindirim kanalı uzaklaştırılıp sindirim kanalının altında kalan nodüller stereomikroskop altında sayılmıştır. Yağ dokusu üzerinde nodül görünümü Şekil 3.2. Patates böceği larvasının yağ dokusunda fungus blastosporlarına karşı oluşan nodül görünümü

3.2.2. Kontrol Denemeleri Patates böceği larvalarında gerek doğal nodülasyonun ve gerekse de enjekte edilen kimyasallara karşı nodül oluşup oluşmadığını kontrol etmek için çeşitli denemeler yapılmıştır. Bunun için böceklere herhangi bir uygulama yapılmadan böcekler doğrudan alınarak dissect edilip stereo mikroskop altında nodüller için kontrol edilmiştir. Ayrıca enjeksiyon yaralanmalarının ve ethenolün nodülasyon üzerindeki etkisini kontrol etmek için ethenol her larvaya 10µl enjekte edilerek 4 saat sonra nodülasyon için larvalar dissect edilerek mikroskop altında kontrol edilmiştir. Son olarak eikosanoid biyosentezini engelleyen kimyasalların (dexamethasone, phenidone, indomethacine, naproxin, esculetin, ibuprofen, piroxicam) larvalarda oluşan nodülasyon üzerinde etkisi olup olmadığını test etmek için böceklere sadece bu kimyasallar ayrı ayrı 104 µg/10µl dozunda enjekte edilerek 4 saat sonra nodülasyon için dissect edilerek nodüller mikroskop altında sayılmıştır. Denmelerde her uygulama için 10 ar adet patates böceği kullanılmıştır. Her böceğe yapılan uygulama bir tekerrür olarak kabul edilmektedir. 3.2.3. Farklı Dozlardaki Beauveria bassiana Blastosporlarının Nodülasyon Reaksiyonundaki Etkisi Entomopatojenik bir fungus olan B. bassiana nın blastosporlarının 2x10 7 /ml, 2x10 6 /ml ve 2x10 5 /ml konsantrasyonları patates böceği larvalarına ensülin iğnesiyle 10µl enjekte edilmiştir. Bu konsantrasyonlar patates böceğine enjekte edildikten 4 saat sonra böcekler kesilmiş (dissect) stereo mikroskop altında oluşan nodüller sayılarak tespit edilmiştir. 3.2.4. Farklı Eikosanoid Biyosentez İnhibitörlerinin Nodülasyon Reaksiyonundaki Etkisi Bu aşamada böcekler iki gruba ayrılmıştır. Grubun birine eikosanoid biyosentezini engelleyen kimyasallar (dexamethasone, phenidone, indomethacine, naproxin, esculetin, ibuprofen, piroxicam) 104 µg/10µl enjekte edilirken diğer gruba ise bu kimyasalları çözen ethanol 10µl enjekte edilmiştir. Bu enjeksiyonlardan hemen sonra her iki gruba da aynı miktarda entomopatojen fungus blastosporları (2x10 6 blastospor/ml) ensülin iğnesiyle 10µl enjekte edilmiştir. 4 saat sonra bu böcekler dissect edilerek stereo mikroskop altında nodülasyon reaksiyonu için kontrol edilmiştir. 3.2.5. Zamanın Nodülasyon Oluşumundaki Etkisi İki gurup patates böceği larvasına ya 10µl ethenol veya eikosanaid biyosentezini engelleyen phenidone 104µg/10µl etoh içinde enjekte edilmiştir. Bu enjeksiyondan hemen sonra iki gruba da entomopatajen fungus blastosporları 2x10 6 /ml blastospordan ensülin iğnesiyle 10µl enjekte edilmiştir. Her uygulamadan 0.5,1, 2, 4, 8 saat sonra kontrol (etoh enjekte edilen) ve deneme grubu dissect edilerek stereo mikroskop altında nodülasyon için kontrol edilmiştir. Her zaman dilimi için 10 ar adet larva kullanılmıştır. 3.2.6. Phenidone (Eikosanoid biyosentez inhibitörü) Doz Denemesi Eikosanoid biyosentezini engelleyen phenidone patates böceğinin 4. dönem larvasına 0.104µg/10µl etoh, 1.04µg/10µl etoh, 10.4µg/10µl etoh, 104 µg/10µl etoh ve kontrol olarak da sadece 10µl etoh enjekte edilmiştir. Daha sonra bu böceklere 2x10 6 blastospor/ml ensülin iğnesiyle 10µl dozu enjekte edilmiştir. 4 saat sonra bu böcekler

dissect edilerek stereo mikroskop altında bu dört değişik dozun nodülasyon üzerindeki etkisi kontrol edilmiştir. Her doz için 10 ar adet larva kullanılmıştır. 3.2.7. Eikosanoid Substratı Arakidonik Asidin Nodülasyon Reaksiyonundaki Rolü İki gurup patates böceğinin 4. dönem larvasının bir grubuna ethenol diğer grubu ise fosfolipaz A2 enzimi inhibitörü dexamethason 104µg/10µl ethenol Hamilton enjektör ile verilmiştir. Daha sonra entomopatojen fungus blastosporları, 2x10 6 blastospor/ml ensülin iğnesiyle 10µl enjekte edilmiştir. Balastosporlar verildikten hemen sonra dexamethason enjekte edilen grup tekrar iki alt gruba ayrılmıştır. Bu alt gruplardan birisine kontrol gurubu olarak 5µl ethenol diğerine ise 5µg eikosanoid substratı arakidonik asit 5µl ethenol içinde enjekte edilmiştir. 4 saat sonra böcekler nodülasyon için dissect edilerek nodüller mikroskop altında sayılmıştır. 3.2.8. İstatistiki Analiz Veriler genel lineer model uygulaması kullanılarak test edilmiştir ve karşılaştırmalar LSD testine göre yapılmıştır (SAS Institute Inc., 1989).

4. BULGULAR 4.1. Kontrol Denemeleri Bulguları Çizelge 4.1. çeşitli kontrol denemelerinin sonuçlarını göstermektedir. Tarladan getirilip hiçbir uygulama yapılmadan dissect edilen (açılarak) patates böceklerinin hiçbirinde nodül gözlemlenmemiştir. Ethenol uygulanan larvalarda her bireyde ortalama 67 adet nodül gözlemlenmiştir. Yalnızca saline (fungus blastoospor çözücüsü) uygulanan larvalarda ortalama 15.3 adet nodül gözlemlenmiştir. Yalnızca Eikosanoid biyosentez inhibitörü phenidonun böceğe enjekte edilmesinden sonra larvada 46 adet nodül gözlemlenmiştir. 2x10 6 blastospor/ml dozu larvalara 10µl enjekte edildiğinde 119.8 adet nodül gözlemlenmiştir. Kontrol denemeleri arasında önemli farklılık bulunmuştur (p<0.001). Çizelge 4.1. L. decemlineata larva ve erginlerde yapılan kontrol denemeleri sonucunda oluşan nodül sayısı ortalamaları Larva ( L. decemlineata) Nodül sayısı * Uygulamasız Fungus ( B. bassiana) Ethenol ( %70) Saline ( %0.6 ) Phenidone (104µl/10µl) 0 119.8 ± 7.9 a 67.0 ± 6.1 b 15.3 ± 2.5 c 46.0 ± 6.2 d * ± standart hata, n=10 4.2. Farklı Dozlardaki Beauveria. bassiana Blastosporlarının Nodülasyon Reaksiyonundaki Etkisi Mililitrede 2x10 5 blastospor dozu uygulanan her böcekte ortalama 43.0 nodül, 2x10 6 dozu uygulanan her böcekte ortalama 113.1 nodül ve 2x10 7 dozunda ise ortalama 89.7 nodül gözlemlenmiştir (Şekil 4.1). En yüksek dozlar olan 2x10 7 /ml ve 2x10 6 /ml fungus konsantrasyonuna karşı oluşan nodül sayısı bakımından istatistiki olarak fark bulunmadığından denmede 2x10 6 blastospor/ml konsantrasyonu kullanılmıştır. 4.3. Farklı Eikosanoid Biyosentez İnhibitörlerinin Nodülasyon Reaksiyonundaki Etkisi Şekil 4.2 de görüldüğü gibi fungal enfeksiyona nodül oluşturma tepkisi olayında yedi tane eikosanoid biyosentez inhibitörlerünün etkisine bakıldığında; kontroldeki böceklerle (ethenol) karşılaştırdığımızda nodülasyonu en fazla azaltan phenidone olmuştur. Diğer inhibitörlerde nodülasyonu azaltmış fakat phenidon kadar etkili olmamıştır. Bu inhibitörler arasında istatistiksel olarak fark sadece phenidone da görülmüştür (p<0.001). 4.4. Zamanın Nodülasyon Oluşumundaki Etkisi Şekil 4.3 de görüldüğü gibi phenidon inhibitörü ve kontrol olarak etoh kullanılarak zamanın nodülasyon üzerine etkisine bakılmıştır. Phenidone uygulaması sonucunda patates

böceği larvalarında yarım saat sonra kontrol edilen böceklerde ortalama 14.4 adet nodül elde edilmiş ve bu sayı 8 saat sonra ortalama 54 nodül sayısına yükselirken etoh uygulanan kontrol larvalarında bu sayı yarım saatte yaklaşık 49 nodül olmuş ve bu sayı 8 saat sonunda 147 nodül sayısına yükselmiştir. Her zaman diliminde etoh uygulanan kontrol larvaları ile karşılaştırıldığında phenidone uygulanan larvalar istatistiksel olarak daha az sayıda nodül oluşturmuştur (p<0.001). Enjeksiyondan 4 ile 8 saat sonra kontrol edilen larvalarda nodül sayısı bakımından istatistiksel bir farklılık bulunmamıştır. Bu yüzden tüm denemelerde 4 saat sonucunda böcekler dissect edilerek nodülasyon gözlemi yapılmıştır. Nodül Sayısı/Larva 140 120 100 80 60 40 20 0 2x10 5 2x10 6 2x10 7 B. bassiana (Blastospor konsantasyonu/ml) Şekil 4.1. Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin in balstosporlarının farklı dozlarına karşı patates böceğinde oluşturduğu nodülasyon tepkisi. Hata barları (T) şekilde gösterilmektedir (n=10). 200 Nodül Sayısı/Larva 160 120 80 40 0 Ethenol Naproxen Piroxicam Ibuprofen Esculetin Uygulamalar Phenidone Dexamethasone İndomethacine Şekil 4.2. Farklı eikosanoid biyosentez inhibitörlerinin patates böceği larvalarının fungal sporlara karşı oluşturduğu nodülasyon reaksiyonundaki etkisi. Hata barları (T) şekilde gösterilmektedir (n=10).

180 160 Ethenol+Fungus Nodül Sayısı/Larva 140 120 100 80 60 40 20 0 0,5 1 2 4 8 Zaman (Saat) Phenidone+Fungus Şekil 4.3. Phenidone un zamana bağlı olarak nodülasyon sayısı üzerine etkisi. Hata barları(t) şekilde gösterilmektedir (n=10). 4.5. Phenidone un Farklı Dozlarının Nodülasyon Reaksiyonundaki Etkisi Şekil 4.4 de görüldüğü gibi fungal enfeksiyona karşı nodül oluşturma tepkisi olayında eikosanoid biyosentez inhibitörü phenidone un etkisi doza bağlı olarak gösterilmiştir. Dört farklı phenidone dozu uygulanmıştır. Kontroldeki patates böceği larvalarında oluşan nodül sayısı 156 iken en yüksek phenidone dozunda (104 µg/10µl) ortalama her böcekte 36 adet nodül oluşumu gözlemlenmiştir. Böylelikle phenidone dozu arttıkça nodülasyonun azaldığı ve phenidonun nodül oluşumunu doza bağlı olarak azalttığı gözlemlenmiştir. 4.6. Eikosanoid Substratı Arakidonik Asidin Nodülasyon Reaksiyonundaki Rolü Dexamethasone PLA 2 enzimini inhibe ederek memelilerde eikosanoid biyosentezini engellemektedir. Denemede dexamethasone enjekte edilen patates böceklerine, eikosanoid substratı bir doymamış yağ asidi olan arakidonik asit verilmiştir. Denemede patates böceklerine dexamethasone enjekte edildikten sonra fungusun blastosporları enjekte edilmiş ve bu uygulamadan sonra arakidonik asit enjeksiyonu yapılmıştır. Arakidonik asit ethenol içinde çözüldüğü için arakidonik asit enjeksiyonunun kontrolü olarak kontrol gurubuna da üçüncü enjeksiyon olarak ethanol enjekte edilmiştir. Şekil 4.5 de görüldüğü gibi arakidonik asit uygulamasının nodülasyon üzerine dexamethasonun etkisini ters çevirdiği gözlemlenmiştir. Ethanol uygulanan guruptaki ortalama nodül sayısı 124 dexamethason uygulanan guruptaki ortalama nodül sayısı 75 ve arakidonik asit uygulanan böceklerdeki ortalama nodül sayısı ise 186 olmuştur. İkinci kontrol gurubunda ise ortalama nodül sayısı 91.8 olarak gözlemlenmiştir. Böylece

eikosanoid biyosentezinin substratı olan arakidonik asit uygulamasının yeniden nodül oluşumuna neden olduğu ve böceğin fungal enfeksiyona karşı hücresel bağışıklık geliştirdiği gözlemlenmiştir. Nodül Sayısı/Larva 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 0,104 1,04 10,4 104 Phenidone ( µg/larva) Şekil 4.4. Phenidonun değişik dozlarının nodül oluşumu üzerine etkisi. Hata barları (T) şekilde gösterilmektedir (n=10). 250 Nodül Sayısı/Larva 200 150 100 50 0 Ethenol+Fun Dex+Fun Dex + Fun+ Ethenol Dex+Fun+Aaasit Uygulamalar Şekil 4.5. Eikosanoid Substratı Arakidonik Asidin patates böceği larvalarının fungal sporlara karşı oluşturduğu nodülasyon reaksiyonundaki rolü (Dex:dexamethasone, Fun:fungus, Aasit:arakidonik asit). Hata barları (T) şekilde gösterilmektedir (n=10).

5. SONUÇ VE ÖNERİLER Eikosanoidler böceklerin bakteri, fungus ve protozoa enfeksiyonlarına yağ dokusunda oluşturdukları nodülasyon olayında rol almaktadır. Bu çalışmada ise eikosanoidlerin entomopatojenik funguslara karşı nodülasyon oluşumunda rolü olup olmadığı araştırılmıştır. Eikosanoidlerin bakteriyel enfeksiyonlara karşı böceklerde nodülasyon reaksiyonunda rol aldığını ve böceklerin eikosanoid biyosentezi için gerekli enzimlere ve yağ asidi taşıyıcılarına ihtiyaçları olduğu belirlenmiştir (Miller ve ark.,1996). Eikosanoidlerin bakterilere olduğu kadar funguslara karşı da nodülasyon oluşturmada rol aldığı söylenmiştir (Lord ve ark., 2002; Dean ve ark., 2002). Bu çalışmada L. decemlineata (Say) larvalarında fungal enfeksiyona karşı oluşan nodülasyon reaksiyonunda eikosanoidlerin rolü araştırılmıştır. Çalışmanın sonuçları L. decemlineata larvalarında fungal enfeksiyona karşı oluşan nodülasyon reaksiyonunda eikosanoidlerin rolü olduğunu desteklemektedir. L. decemlineata larvalarına fungus blastosporları enjekte edilmeden önce phenidone uygulanması sonucu tüm zamana bağlı uygulamalarda larvalardaki nodülasyon oluşumu kontrole göre önemli derecede azalmıştır. Bu da gösteriyor ki eikosanoid biyosentezinin engellnemesi nodülasyon oluşmasını erken evrede engellemekte ve bu engelleme bir kaç saat sürmektedir. Yine bu çalışmanın sonucuna göre fungus blastosporlarına karşı oluşan nodül sayısının bir üst sınırı olduğu gözlemlenmiştir. Patetes böceği larvaları 4 saat sonunda maksimum 150-170 nodül üretmiştir. Bu sonuçlar Dean ve ark., (2002) ve Lord ve ark., (2002) nin sonuçları ile karşılaştırıldığında fungus sporlarına karşı oluşan nodül sayısı bakımından farklılıklar olduğunu göstermiştir. Lord ve ark., (2002) M. sexta larvlarına B. bassiana blastosporlarını uyguladıklarında larvalar B. bassian ya karşı maksimum yaklaşık 500 nodül oluşturmuştur. Yine Dean ve ark. (2002) da M. sexta larvalarına Metarhizium anisoplia uygulandığında larvalar bu fungus un konidilerine karşı maksimum 110 nodül oluşturmuştur. Bu sonuçlar gösteriyor ki M. sexta larvalarında oluşan nodül sayısı farklı fungus türlerine karşı farklı sayıda olmuştur. Ayrıca bu çalışmada patates böceği larvaları da B. bassiana ya karşı farklı sayıda nodül üretmiştir. Böceklerde entomopatojenik mikroorganizmalara karşı oluşan nödül sayısındaki farklılığın böceğin kan hücresi sayısındaki farklılıktan olabileceği bildirilmiştir (Howard ve ark., 1998). Eikosanoid biyosentez (EB) engelliyicilerinin tıbbi ilaçlardaki öneminden dolayı bu inhibitörlerle ilgili birçok araştırma yapılmıştır ve piyasada birçok eikosanoid biyosentez inhibitörü mevcuttur. Bu inhibitörlerin eikosanoid biyosentezini engelleme etkisi birbirinden farklıdır. Örneğin inhibitörlerden dexamethasone EB için gerekli olan fosfolipaz A 2 enzimini inhibe etmektedir. Diğer birçok inhibitör EB için gerekli cyclooxgenase (saykloksiginaz) enzimini inhibe etmektedir (Schnitzer, 2001). Bu yüzden farklı inhibitörlerle yapılan bu çalışmada yedi farklı inhibitörde de nodül sayısında kontrole göre bir azalmanın olduğu tespit edilmiştir. Fakat inhibitörler arasında nodülasyon reaksiyonunu azaltma oranı farklı olmuştur. İnhibitörlerden indomethacin, ibuprofen, naproxin ve piroxicam EB için gerekli cyclooxgenase enziminin inhibitörleridir. Diğer yandan phenidone EB için gerekli cyclooxygenase ve lipoxygenase enzimlerinin inhibitörleridir. Phenidonun nodül oluşumunu engelleme etksi diğer inhibitörlerden çok daha fazla olmuştur. Bu da gösteriyor ki patates böceği larvalarında nodül oluşumunda EB için cyclooxgenase ve lipoxygenase enzimleri gereklidir. Eikosanoid substratı olan arakidonik asitin patates böceği larvalarının fungal sporlara karşı oluşturduğu nodülasyon reaksiyonuna etkisi denemesi L. decemlineata larvalarında fungal enfeksiyona karşı oluşan nodülasyon reaksiyonunda eikosanoidlerin rolü olduğunu desteklemiştir. Dexamethasone hücresel fosfolipidlerden arakidonik asiti

sentezleyen fosfolipaz A 2 enzimini inhibe etmektedir. Arakidonik asit oluşumu EB için ilk adımdır. Eğer arakidonik asit oluşumu engellenirse EB enzimi; cyclooxgenase enzimi substratı arikodonik asit sentezini engellemektedir. Dexamethasone uygulanan patetes böceği larvalarına arakidonik asit enjekte edildiğinde bu larvalarda dexamethasonun etkisi oratadan kalkmış ve larvalar fungus blastosporlarına karşı nodül oluşturmuşlardır. Bu sonuçlar L. decemlineata larvalarında fungal enfeksiyona karşı oluşan nodülasyon reaksiyonunda eikosanoidlerin rolü olduğunu desteklemektedir. Kontrol denemeleri sonucunda hiçbir uygulama yapılmadan dissect edilen larvalarda nodülasyon oluşumu gözlenmemiş olup denemede kullanılan larvaların diğer uygulamalara göre çok az sayıda nodül oluşturduğu görülmüştür. Yalnızca fungusun patates böceğinin larvasına uygulanması sonucu elde edilen nodül sayısı ortalama 119.8 olmuştur. Buda yalnız başına yapılan uygulamalar arasında en çok nodül oluşumunun fungusun blastosporlarına karşı oluştuğunu göstermektedir. Bir eikosanoid biyosentez inhibitörü olan phenidon ise yalnız başına patates böceği larvasına enjekte edildiğinde ortalama 46 adet nodül meydana gelmiştir. Eikosanoid biyosentez inhibitörlerinin içinde çözündürülüp verildiği etoh ise yalnız başına ortalama 67 nodül oluşumuna neden olmuştur. Phenidon ve Etoh karşılaştırıldığında ise phenidonun etoh e karşı oluşturulan nodül oluşumunu da azalttığı söylenebilir ve ayrıca phenidon ortalamasının 46 çıkmasının bir nedeni de içinde çözündüğü Etoh den kaynaklandığı görülmektedir. Bu sonuçlar benzer çalışmalar olan Bedick ve ark,. (2001) ve Tunaz ve ark., (2003) sonuçları ile pareleldir. Fungusun farklı oranlardaki dozlarına patates böceğinin larvalarının tepkisi farklı olmuştur. 2x10 5 konsantrasyonuna karşı patates böceğinde oluşan nodül sayısı 43, 2x10 6 konsantrasyonuna ortalama 113.1 nodül ve 2x10 7 konsantrasyonuna ise ortalama 89.7 nodül gözlemlenmiştir Lord ve ark., (2002) B. bassiana fungusunun blastosporları 4x10 7 / ml dozunda kullanılmıştır ve B. bassiana blastosporlarına karşı ortalama 450 nodül oluştuğunu belirtmişlerdir. Lord ve arkadaşlarının 2002 yılında yaptıkları bu çalışmada, bu çalışmada belirtilen, nodül sayısından fazla sayıda nodül elde edilmiştir. Bunun nedeni ise muhtemelen kullanılan dozun 2x10 6 dozundan fazla olmasından kaynaklanmaktadır ve ayrıca denemede kullandığımız patates böceği larvalarının büyüklük olarak diğer denemede kullanılan lepidopter larvasından çok daha küçük olmasından kaynaklanabilir. Ayrıca 4x10 7 konsantrasyonuna 450 nodül oluşturabilen bir böceğin kan hücrelerinin patates böceğininkinden kat kat fazla olması mümkündür. Metarhizium anisopliae entomopatojenik fungusun M. sexta larvalarına 30000 (3x10 4 ) konidi enjeksiyonu sonucu 24 saatte 108 nodül oluştuğu belirtilmiştir (Dean ve ark., 2002). Buda böceklerin entomopatojen fungusların konidilerine karşı nodülasyon oluşturma olayında blastosporlardan daha fazla tepki verdiğini ortaya koyabilir. Bu nedenle konidilerle blastosporlar arasında eğer spor yoğunluğu açısından eşitlik sağlanıp aynı sayıda spor aynı böceğe uygulanıp aynı sayıda nodülasyon oluşturup oluşturmadığına bakılırsa, entomopatojenin farklı olan bu sporlarının hücre duvarları arasındaki yapısal farktan kaynaklanıp kaynaklanmayacağı belirlenebilir. Bakteri yüzeyi lipopolisakkaritler taşır, fungus hücre duvarı ise β1,3-glukanlar taşır (Lord ve ark. 2002). M. sexta da bakteri ve funguslara karşı özel reseptörler tanımlanmıştır. Bu özel reseptörler; Immunolectin-1 bakteri ve yeast (maya) e bağlanır immunolectin 2 ise lipopolisakkaritlere spesifik reseptörlerdir (Yu ve ark., 1999; Yu ve Kanost 2000). Verilen bu bilgilere dayanarak böceklerdeki nodülasyon oluşumunda entomopatojenlerin sporlarının yapısının da önemli olduğu sonucu çıkarılabilir.