PARAOKSONAZ POLİMORFİZMİNİN VE PARAOKSONAZ ENZİM AKTİVİTESİNİN PESTİSİTLERE MARUZ KALAN BİREYLERDE ARAŞTIRILMASI

Transkript

1 PARAOKSONAZ POLİMORFİZMİNİN VE PARAOKSONAZ ENZİM AKTİVİTESİNİN PESTİSİTLERE MARUZ KALAN BİREYLERDE ARAŞTIRILMASI Seda ZENGİN SUNAY DİSİPLİNLERARASI ADLİ TIP ANABİLİM DALI ADLİ KİMYA VE ADLİ TOKSİKOLOJİ DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Halil GÜMÜŞ 2010-ANKARA

2 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PARAOKSONAZ POLİMORFİZMİNİN VE PARAOKSONAZ ENZİM AKTİVİTESİNİN PESTİSİTLERE MARUZ KALAN BİREYLERDE ARAŞTIRILMASI Seda ZENGİN SUNAY DİSİPLİNLERARASI ADLİ TIP ANABİLİM DALI ADLİ KİMYA VE ADLİ TOKSİKOLOJİ DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof.Dr. Halil GÜMÜŞ 2010-ANKARA

3 ii

4 iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay... ii İçindekiler... iii Önsöz... vii Simgeler ve Kısaltmalar... viii Şekiller... x Çizelgeler... xi 1. GİRİŞ Pestisitler Organik Fosforlu Pestisitler (OP) Paraoksonun Yapısı OP ların Toksik Etki Mekanizması Türkiye de Pestisit Kullanımı ve OP Zehirlenmeleri Paraoksonaz (PON) Tarihçesi Adlandırılması Paraoksonaz Genleri ve Proteinleri PON1 in Biyokimyasal Yapısı PON1 in HDL ye Bağlanması PON1 in Sentezi ve Salgılanması PON1 in Fonksiyonları, Katalizlediği Reaksiyonlar Hidrolitik Aktivite; Organofosfatlara Karşı Koruma... 17

5 iv Ksenobiyotik Metabolizması Üzerine Etkisi Bakteriyel Endotoksinlerden Kaynaklanan Toksisiteye Karşı Koruma Oksidatif veya Peroksidatif Aktivite; LDL ve HDL Oksidasyonunun Önlenmesi Genetik Polimorfizm Polimorfizm Çeşitleri Tek Nükleotid Değişim (Single Nucleotide Polymorphism: SNP) PON1 Polimorfizmi Kodlama Alanındaki Polimorfizmler Promotor Bölge Polimorfizmleri PON1 Polimorfizmlerinin OP lulara Karşı Korumadaki Durumları GEREÇ VE YÖNTEM Gereçler Kullanılan Kimyasal Maddeler Kullanılan Araç ve Gereçler Deney Protokolü Örneklerin Toplanması Kan Örneklerinin Saklanması Yöntem Asetilkolinesteraz Aktivite Tayini Paraoksonaz Aktivite Tayini Paraoksonaz Aktivite Tayininin Standardizasyonu PON1 192 Q/R Gen Polimorfizminin Belirlenmesi Kan Örneklerinden DNA İzolasyonu... 39

6 v Genomik DNA nın Agaroz Jel Elektroforezi ile Belirlenmesi %0,5 lik Agaroz Jel Hazırlanması Agaroz Jel e Yüklemek için Örnek Hazırlanması ve Yürütme Koşulları PCR Primerler PCR Bileşenleri ve PCR Programı PCR Ürünü için Agaroz Jel Hazırlanması PCR Ürününün RFLP Yöntemi ile Kesimi BspPI Restriksiyon Enziminin Özellikleri BspPI Enzim ile Kesim İşlemi BspPI Enzimi ile İnkübasyondan Sonra Agaroz Jel Hazırlanması İstatistiksel Analiz BULGULAR Toplumumuz Bireylerinde PON1 192Q R Polimorfizmini Belirlemek Amacıyla Yapılan Analiz Sonuçları Genomik DNA nın Agaroz Jel Elektroforezi ile Belirlenmesinin Sonuçları PCR Reaksiyonu ile PON1 192 Q R Gen Bölgesi Amplifikasyon Sonuçları BspPI Restriksiyon Enzimi ile PON1 192 Q R Gen Bölgesinde Amplifiye Edilen Bölgenin Kesim Sonuçları Genotiplere göre PON1 ve AChE Enzim Aktivitelerinin Sonuçları Kronik Olarak OP lulara Maruz Kalan Bireyler ve Kontrol Grubu Arasındaki PON1 192Q/R Polimorfizmi ile AChE, PON1 Enzim Aktivite Sonuçlarının Karşılaştırılması 56

7 vi TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR EKLER ÖZGEÇMİŞ... 87

8 vii ÖNSÖZ Karşılaştığım her türlü zorlukta benden desteğini ve bilgisini esirgemeyen, çalışma azmiyle örnek aldığım; tüm akademik hayatım boyunca rastladığım en değerli hocam; Ankara Üniversitesi Adli Tıp Enstitüsü Müdürü, Sayın Prof. Dr. Tülin SÖYLEMEZOĞLU na; Güler yüzü ve samimiyetiyle bana güç veren sevgili danışman hocam Prof. Dr. Halil Gümüş e; Uzun zamandır tanımakla gurur duyduğum, bilime verdiği önemle bana her zaman yardım elini uzatan Mikrobiyoloji Uzmanı Sayın Dr. Abbas TANER e; Yaşama dair sahip olduğu bakış açısıyla fark yaratan, zor zamanlarımda gösterdiği iyi niyet ve hoşgörüyle yaşamım boyunca hep hatırlayacağım derin izler bırakan, Sayın Biyokimya Uzmanı Dr. Deniz ALPAY a ve bana karşı sahip oldukları derin anlayışla gösterdikleri emekler için tüm mesai arkadaşlarıma; Bu tez çalışması için gerekli materyallerin toplanmasında dostluk, sevgi ve yardımlarını esirgemeyen Biyokimya Uzmanı Dr. Ayça DOĞAN, Veteriner Hekim Dr. Naci YAMAN; arkadaşım Biyolog Ferahnaz Gencay YILMAZ, eşi Ziraat Mühendisi Basri YILMAZ ve Ercan NOGAY a, Tez çalışmamın her aşamasında yanımda olan, çalışkanlığı ve bilime duyduğu heves ve sevgi ile her zaman takdir ettiğim, sevgili arkadaşım Biyolog Dr. Zeliha KAYAALTI na; Laboratuar deneylerinde destek olan Biyolog Ayşe KARAKUŞ, Miyase ODABAŞI ve Dr. Görkem MERGEN e; Gösterdiği büyük sabır, iyi niyet ve harcadığı tüm emekler için; sevgili eşim Oktay SUNAY a; Her koşulda yardım ve desteklerini hep yanımda bulduğum sevgili aileme; Teşekkür ederim.

9 viii SİMGELER VE KISALTMALAR DNA Deoksiribonükleik asit RNA Ribonükleik asit SNP Tek nükleotid poimorfizm (Single Nucleotid Polymorphism) A Adenin C Sitozin T Timin G Guanin Q Glutamin R Arjinin L Lösin M Metiyonin ARE Arilesteraz PON1 Paraoksonaz1 PON2 Paraoksonaz2 PON3 Paraoksonaz3 OP Organik fosforlular CYP 450 Sitokrom P450 HDL Yüksek yoğunluklu lipoprotein LDL Düşük yoğunluklu lipoprotein Apo AI Apolipoprotein AI Apo AII Apolipoprotein AII Apo J Apolipoprotein J AChE Asetilkolinesteraz PCR Polimeraz zincir reaksiyon (Polymerase chain reaction) dntp Deoksiribonükleozidtrifosfatlar PAF Platelet aktive edici faktör CLA-1 CD36 ve Lizozomal integral membran protein-ii SR-B1 Scavenger Reseptör sınıf B tip 1 UZEM Ankara Sağlık Bakanlığı, Ulusal Zehir Danışma Merkezi NM394 Kinolon antibiyotiği

10 ix LPS CD14 LD KVH SDS bp PCR TBE HPSF F primer R primer dntp RFLP EDTA DTNB Lipopolisakkarit Spesifik bağlayıcı protein Bağ eşitsizliği Kardiyovasküler hastalıklar Sodyum dodesil sülfat Baz çifti (base pair) Polimeraz zincir reaksiyon (Polymerase chain reaction) Tris-Borikasit-Edta Yüksek Performanslı Tuz Free (High Performance Salt Free) Forward Primer (İleri doğru olan primer) Reverse Primer (Aksi yönde olan primer) Deoksiribonükleozidtrifosfatlar Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi Etilendiamintetraasetik asit 5,5'ditiyobis 2-nitrobenzoik asit

11 x ŞEKİLLER Şekil.1.1. OP bileşiğinin genel formülü... 4 Şekil.1.2. Paraoksonun (O,O-dietil-O-p-nitrofenil fosfat) kimyasal yapısı... 5 Şekil 1.3. OP ve AChE arasında oluşan anahtar reaksiyonlar... 6 Şekil.1.4. PON1 geninin 7. kromozom üzerindeki yeri Şekil.1.5. PON1 in yapısı Şekil 1.6a. PON1 proteininin üç boyutlu yapısı Şekil.1.6b. 6 lı ß pervane yapısının yandan görünümü Şekil.1.7. PON1 in HDL ye bağlanması. H1 ve H2 helikslerinin HDL ile etkileşimi Şekil.1.8. Hücre membranında bulunan PON1 in HDL ye transferi Şekil.1.9. Paraoksonun Enzimatik Hidrolizi Şekil Sinir gazlarının hidrolizi Şekil İnsektisitlerde yaygın olarak kullanılan okson metabolitlerinin Detoksifikasyonu Şekil Aromatik esterlerin hidrolizi Şekil Lakton hidrolizi Şekil Transisyonla tek nükleotid değişimin gösterilmesi Şekil PON1 geninin polimorfik bölgeleri Şekil.2.1. PON1 in paraoksonaz aktivitesi Şekil.2.2. İnsan serum PON1 enziminin paraoksonaz aktivitesine göre Michaelis- Menten grafiği Şekil.2.3. İnsan serum PON1 enziminin paraoksonaz aktivitesine göre Lineweaver- Burk grafiğigrafiği Şekil.2.4. Agaroz jel kuyucuklarına örneklerin yüklenmesi Şekil.2.5. BspPI restriksiyon enziminin tanıma bölgesi ile kesim noktasının şematik gösterimi Şekil bp.lik amplifikasyon ürününün, BspPI enzimi ile kesim sonucunda oluşan oligonükleotid uzunlukları Şekil.3.2. Kontrol ve OP maruz kalan grupta PON1 aktivitesi Şekil.3.3. Kontrol ve OP maruziyeti olan grupta AChE aktivitesi... 58

12 xi ÇİZELGELER Çizelge.1.1. Organik fosfor bileşiklerinin tehlike ve kimyasal özelliklerine göre sınıflandırılması... 3 Çizelge.1.2. Zehirlenme vakalarının Tarım İlaçları Türüne Göre Dağılımı, Çizelge.1.3. PON1 Polimorfizm Adlandırması ve Enzim Aktivitesi Çizelge.2.1. Amplifikasyonda kullanılan primerler ve özellikleri Çizelge.2.2. PCR bileşenleri ile stoktaki ve reaksiyondaki konsantrasyonları Çizelge.2.3. BspPI enzimi ile kesim işlemindeki bileşenler ve reaksiyondaki konsantrasyonları Çizelge.3.1. Kullanılan primerler ile amplifiye edilen bölgenin baz dizilimi Çizelge.3.2. PON1 192Q/R polimorfizmi ile oluşan genotipler ve BspPI enzimi ile kesim sonucundaki oligonükleotid uzunlukları Çizelge.3.3. Toplumumuz bireylerinde PON1 192Q/R polimorfizmi ile oluşan genotiplerin frekansı Çizelge.3.4. Toplumumuz bireylerinde PON1 192Q/R polimorfizmi ile oluşan alellerin frekansı...53 Çizelge.3.5. Çalıştığımız populasyonun Hardy-Weinberg dengesinde olup olmadığının tespiti Çizelge.3.6. Toplamda ve iki grup arasında PON1 192 Q/R genotip frekansları Çizelge.3.7. Genotiplere göre PON1 ve ACHE aktivite sonuçları Çizelge.3.8. Kontrol ve OP maruz kalan grupta PON1 ve AChE aktiviteleri Çizelge.3.9. Kontrol ve maruz kalan grup arasında genotipe göre AChE ve PON1 aktivite düzeylerinin karşılaştırılması Çizelge R + ve R bireylerin gruplar arasında PON1 ve AChE aktivitelerinin karşılaştırılması Çizelge Türk Populasyonundaki OP lara maruz kalan ve kalmayan gruplar arasındaki PON 192Q/R polimorfizmlerinin alel ve genotip frekans dağılımları Çizelge PON1 192Q/R polimorfizmi ile PON/ACHE aktivite sonuçlarının gruplar arasında karşılaştırılması... 61

13 1 1. GİRİŞ 1.1. Pestisitler: Pestisitler insan ve hayvan vücudu ile tarımda besinlerin üretimi, tüketimi, depolanması sırasında onları bozan ve yok eden haşareleri, mikroorganizmaları ve diğer zararlıları (pestleri) yok etmek için kullanılan fiziksel, kimyasal ve biyolojik savaş maddeleri olarak tanımlanmaktadır. Birleşik Devletler Çevre Koruma Ajansı (EPA) pestisitleri herhangi bir pestten korunmak, pesti parçalamak, uzaklaştırmak veya azaltmak için kullanılan herhangi bir madde veya madde karışımı olarak tanımlamaktadır. Pest terimi zararlı, yıkıcı veya sorun teşkil eden hayvan, bitki veya mikroorganizmaları da içerir (Marrs ve Balantyne, 2002). Tüm dünyada onlarca değişik kimyasal formulasyona sahip bu türden madde, her yıl yaklaşık 1.5 milyon ton civarında üretilmekte ve 30 milyon dolarlık bir ticari hacim oluşturmaktadır (Meister ve Sine, 1999; McKenzie, 2001). Mevcut tarım alanlarından yüksek verim sağlamak amacıyla kullanılan pestisitlerin bilinçsiz ve denetimsiz kullanımının insan sağlığına ve çevreye olumsuz etkileri göz ardı edilmemelidir. Tarım alanları dışında bahçelerde ve seralarda, ormancılıkta, evlerde, okullarda, işyerlerinde ve otellerde böcekleri yok etmekte ve endüstride kozmotik, şampuan ve yiyecek paketlemede; ayrıca yoğun biçimde halk sağlığını korumada vektör kontrolü için kullanılmaktadırlar (Last ve Wallace, 1992). Pestisitler kullanım amaçları ve kimyasal yapılarına göre sınıflandırılırabilir: 1. İnsektisitler (böcekleri öldürenler) Organik fosforlular (OP) Karbamatlar Klorlu hidrokarbonlar veya organoklorlular Piretrium ve sentetik piretroidler

14 2 2. Herbisitler (Zararlı otları yok edenler) Parakuat Dikuat Klorfenoksi Dinitrofenoller Klor tuzları 3. Rodentisitler (Kemirgenleri öldürenler) Oksikumarin türevleri Monokarboksilli florürler Striknin 4. Fungusitler (Mantarları yok edenler) Ditiokarbamatlar Pentaklorofenol Hekzaklorobenzen Fitalimid Çizelge 1.1 de OP bileşikleri etkilerine ve kimyasal özelliklerine göre sınıflandırılmıştır. Pestisitlere çeşitli seviyelerde maruz kalınabilir: 1- Herhangi bir kanunun veya çalışmanın engelleyemeyeceği miktarlarda kaza ile ve/veya intihar zehirlenmeleri 2- Mesleki maruziyet (üretim, karıştırma/ yükleme, uygulama, hasat ve ürünlerin işlenmesi, depolama) 3- Spreyleme ile ilaçlamalarda hedeften sapma yüzünden çevredeki canlıların maruz kalması.

15 3 4- Bir ajanın yanlış veya yasadışı kullanımı sonucu pestisit atıkları içeren gıdaları tüketen toplumun maruziyeti ve maruz kalanlarda kabul edilen tolerans seviyeri üstünde artık konsantrasyonu birikimi (Whitford, 2002; Krieger, 2000). Sınıf 1a. Aşırı tehlikeli Kimyasal özellik Sınıf 1b. Çok tehlikeli Kimyasal özellik Chlorfenvinphos Fosfat Azinphos-ethyl Fosfonotionat Coumaphos Fosfotioat Azinphos-methyl Fosfotioat Demeton Fosfotioat Bromophos-ethyl Fosfotioat Disulfoton Fosfotioat Demeton-S-methyl Fosfotioat Ethoprophos Fosfotioat Dichlorvos Fosfat Fenamiphos Fosforamid Dicrotophos Fosfat Fensulfothion Fosfotioat Fenthion Fosfotioat Fonophos Fosfonotionat İsofenphos Fosforamidotionat Leptophos Fosfonotionat Methamidophos Fosforamidotionat Mephosfolan Fosforamid Methidathion Fosfotioat Mevinphos Fosfat Monocrotophos Fosfat Parathion Fosfotioat Omethoate Fosfonotionat Parathion-methyl Fosfotioat Pirimphos-ethyl Fosfotioat Phorate Fosfotioat Propetamphos Fosforamidotionat Phosfolan Fosfonoamidotionat Thiometon Fosfotioat Phosphamidon Fosfat Triazophos Fosfonat Prothoate Fosfotioat Vamidothion Fosfotioat Sulfotep Fosfotioat TEPP Fosfat Terbufos Fosfotioat Trichloronat Fosfonotioat Sınıf II. Orta derecede tehlikeli Kimyasal özellik Sınıf III. Hafif tehlikeli Kimyasal özellik Chlorpyrifos Fosfotioat Acephate Fosforamidotionat Diazinon Fosfotioat Bromophos Fosfotioat Dichlofenthion Fosfotioat Malathion Fosfotioat Dimethoate Fosfotioat Pirimiphos-methyl Fosfotioat Ethion Fosfotioat Trichlorfon Fosfonat Fenitrothion Fosfotioat Phosmet Fosfotioat Sınıf IV. Akut Kimyasal Phoxim Fosfonoamidotionat tehlike yok özellik Profenofos Fosfotioat Chlorphoxim Fosfotioat Prothiofos Fosfotioat Chlorpyrifos methyl Fosfotioat Sulprofos Fosfotioat Temephos Fosfotioat Tetrachlorvinphos Fosfat Çizelge 1.1. Organik fosfor bileşiklerinin tehlike ve kimyasal özelliklerine göre sınıflandırılma (Güven, 2004) Organik Fosforlu Pestisitler (OP): Organofosfor bileşikleri genelde esterler, amidler ve fosforik asidin tiol türevleridir. Birçok organofosfat, yüksek derecede lipid çözünürlüğüne sahiptir ve deri, oral

16 4 mukoza membranları, konjoktiv; gastrointestinal ve solunum yolları tarafından kolayca emilir (Kamanyire ve Karalliedde, 2004). Genel formülleri çoğunlukla aynıdır; merkezde fosfat atomu bulunur ve fosfat atomunun oksijen veya sülfürle çift bağ yapmasına göre farklı adlandırılır (Şekil.1.1.). OP, P=O (fosfat) formunda iken yalnızca asetilkolinesterazları etkileyebilir. Genel olarak kullanıldığı insektisitlerde P=S (fosfotionat) formun oksijen analoglarına dönüşmesi gereklidir. R1 ve R2 grupları genelde alkil veya aril gruplarıdır. X grubu geniş bir değişkenlik göstermekle birlikte genelde alifatik, aromatik ve heterosiklik grupları tanımlamaktadır (Dragonov ve La Du, 2004). R1-R2= Metil, etil, izopropil X= Değişken grup Şekil.1.1. OP bileşiği genel formülü Paraoksonun Yapısı: Molekül ağrlığı ve kapalı formulü C 10 H 14 NO 6 P olan paraoksonun kimyasal adı o,o-dietil-o-p-nitrofenil fosfattır (Şekil 1.2.). Paraokson, asetilkolinesteraz inhibitörü olarak davranan bir parasempatomimetiktir. Bir OP oksonudur ve insektisit parationun aktif metabolitidir. Aynı zamanda glaukomaya karşı oftalmik ilaç olarak da kullanılır. Paraokson, asetilkolinesterazı inhibe eden insektisitler arasında en kuvvetlilerinden birisidir, sinir ajanı sarinin yaklaşık %70 kuvvetindedir ve bu yüzden insan ve diğer

17 5 hayvanlarda zehirlenme riskinden dolayı günümüzde nadiren kullanılmaktadır. Deri tarafından kolayca emilir ve Güney Afrika hükümetince uygulanan, Avrupalılar'ın başkalarından ayrılması döneminde Güney Afrikalı kimyasal silahlar programında suikast silahı olarak kullanılmıştır (Kousba ve ark., 2004). Şekil.1.2. Paraoksonun (O,O-dietil-O-p-nitrofenil fosfat) kimyasal yapısı OP ların Toksik Etki Mekanizması: OP lerin etki mekanizması sinir sistemindeki asetikolinesteraz (AChE) ve butirilikolinesteraz ın (BuCHe) inhibisyonu ile ilişkilidir. OP lar ve AChE arasında meydana gelen reaksiyonlar Şekil 1.3. te gösterilmiştir (Kamanyire ve Karalliedde, 2004). OP lara akut maruziyet, sinir uçlarındaki asetilkolin nörotransmitterinin hidrolizinden sorumlu enzim asetilkolinesterazın (AChE) inhibisyonuna sebep olur; bu da muskarinik ve nikotinik reseptörlerin aşırı uyarılmasıyla sonuçlanır. OP zehirlenmelerinin klinik özellikleri kolinerjik krizler formunda ortaya çıkar ve atropinle tedavi edilebilir. Bazı çalışmalar OP lerin insan sağlığı üstünde zararlı

18 6 kronik etkilerinin nörofizyolojik, endokrin, gelişim ve bağışıklık bozuklukları (bazı kanserler de dahil) olduğunu rapor etmiştir (Chia ve ark., 2009). Şekil 1.3. OP ve AChE arasında oluşan anahtar reaksiyonlar Organik fosforlu insektisitlere maruz kalmada AChE inhibisyonunun ölçümü başlıca biyolojik izleme yöntemidir. Bu inhibisyonda o toplum için kabul edilen baz AChE seviyesinin %70 i maruziyetin referans değeri olarak kabul edilir. OP bileşiklerinin aşağıdaki etkileri hayvanlarda tespit edilmiştir ve teorik olarak insanlarda da görülebilecek olası etkilerdir: 1- Diğer esterazlarının fosforilasyon ile inaktivasyonu 2- γ-aminobutirik asit (GABA) ve glutamat gibi nörotransmiterlerin salınımının değişmesi 3- GABA ve dopamin reseptörlerinin sayılarının artması 4- M2/M4 muskarinik reseptörlerde agonist olarak davranmak 5- Mitokondrial enzimler, respirasyon ve ATP yenilenmesinin inhibisyonu

19 7 6- Mast hücre degranülasyon indüksiyonu ve olası sonucu olarak histamin veya histamin benzeri bileşiklerinin salınımına neden olmak 7- Nitrik oksit inhibisyonu 8- Akciğerlerdeki sülfaktan ile etkileşim 9- Fospolipaz A 2 inhibisyonu 10- T lenfosit fonksiyonu gibi humoral ve hücresel immünite ile etkileşim (Karalliedde, 1999) Türkiye de Pestisit Kullanımı ve OP Zehirlenmeleri: Ülkemizde tarımsal amaçla 1483 ilaçta 346 aktif madde kullanılmaktadır. Bunların yaklaşık 30 tanesi 100 tonun üzerinde tüketilmektedir TİSİT verilerine göre 53 adet organofosforlu pestisitin üretimi için ruhsat verilmiştir (TİSİT, 1996) yılı UZEM (Ankara Sağlık Bakanlığı, Ulusal Zehir Danışma Merkezi) başvurularında tarım ilaçları 2. sırada yer almaktadır (Çizelge 1.2). Bu gruba ait mesleki zehirlenmelerin arası erkeklerde toplanması tarım işçilerinin ilaçlama sırasında yeterli korunma önlemlerini almadıklarını düşündürmektedir. Vakaların %30.85 i intihar (kasti), %61.79 u kaza, %0.03 ü iyatrojenik, %2.05 i mesleki (üretim, formülasyon, hazırlama, taşıma, yükleme, uygulama sırasında deri ve solunum yoluyla maruz kalma), %2.63 ü çevresel, %1.00 i yanlış kullanım, %0.05 i advers etki, %0.22 besin zehirlenmesi %1.32 si ise diğer ve bilinmeyen nedenlere bağlı zehirlenmelerdir. Tarım ilaçlarında insektisitler, en fazla (%47.66) zehirlenmelere yol açan gruptur. İnsektisitler içinde organik fosforlular (%20.98) ve sentetik piretroitler (%18.46) ilk sıradadır. Rodentisitler %28.17 oranı ile tarım ilaçlarının en fazla zehirlenmeye yol açan ikinci grubudur (Özcan ve İkincioğlulları, 2008).

20 8 Çizelge.1.2. Zehirlenme vakalarının Tarım İlaçları Türüne Göre Dağılımı, 2008 (Özcan ve İkincioğlulları, 2008) 1.2. Paraoksonaz (PON): Paraoksonaz (PON1) bazı aktif, nörotoksik organofosfat (OP) insektisidlerinin ve savaş gazlarının detoksifikasyonu için insan ve hayvan serumunda bulunan kritik bir enzimdir (Brophy ve ark., 2000). PON un primer fizyolojik rolü henüz tam olarak belirlenmemesine rağmen; insektisit ve sinir gazı yapımında yaygın olarak kullanılan organofosfat bileşiklerinin hidrolizini katalizlemekte ve bu nedenle in vivo ksenobiyotik metabolizması ve toksikolojik çalışmalar için büyük önem taşımaktadır (Başkol ve Köse, 2004) Tarihçesi: Paraoksonaz, ilk olarak Aldridge W.N tarafından 1953 yılında p-nitrofenil asetat, propiyonat ve bütirat ı hidroliz eden A-esteraz olarak teşhis edilmiştir. İnsan serumunda ilk kez 1961 de Uriel tarafından elektroforez sonrası HDL

21 9 immunopresipitatlarında saptanmıştır (Uriel, 1961) yılında, Oooms ve Boter tarafından, paration ve paraokson hidrolizindeki stereospesifikliği ile tanımlanmıştır. Enzim paraokson, metil paraokson ve klormetil paraoksona yüksek derecede seçicilik gösterdiği için, paraoksonaz olarak adlandırılmıştır. Mackness ve ark. yaptıkları çalışmalar ile, 1985 te PON un HDL üzerinde bulunduğunu, 1988 de PON un HDL üzerinde apo A-I e bağımlı olarak aktivite gösterdiğini ve 1991 yılında da LDL üzerindeki lipoperoksit birikimini azalttığını bulmuşlardır. Aynı zamanda Macness ve ark, tarafından farklı popülasyonlarda polimorfizm analizleri yapılarak, alellik formları belirlenmiş ve popülasyon çalışmaları enzim aktivitesiyle HDL, apo A-I, apo AII arasında istatistiksel ilişki gösterilmiştir. İmmunoaffinite kromotografi çalışmaları insan serum paraoksonazının gerçekte apolipoprotein AI ve klusterin (apolipoprotein J) içeren HDL tipleri ile ilişkili olduğunu ve PON un total HDL nin çok küçük bir bölümünü oluşturduğunu göstermiştir (Mackness ve ark., 1996). Daha sonra yapılan çalışmalarda, başta kardiyovasküler hastalıklar olmak üzere çeşitli hastalık durumlarında enzim aktivite düzeyleri incelenmiş, antioksidan metabolizmayı içeren lipoproteinlerle ve lipid peroksidasyon arasındaki ilişki araştırılmış, enzimin aminoasit dizisi belirlenmiştir Adlandırılması: PON1 organofosfat bileşiklerinden paraokzonu (paraoksonaz aktivitesi, EC ) hidrolize etme yeteneğinden dolayı bu ismi almıştır. Paraokson (o,o-dietil-o-pnitrofenil fosfat), insektisid parationun toksik metabolitidir. PON1, fenilasetat gibi aromatik esterleri de hidrolize edebildiğinden (arilesteraz aktivitesi, EC ), her iki bileşiği de hidrolize eden enzim için A-esteraz terimi kullanılmaya başlamıştır (Van Himbergen ve ark., 2006) Paraoksonaz Genleri ve Proteinleri: Paraoksonaz için ilgili insan geni HUMPONA dır. Gen kromozom 7q21.3 üstünde (Şekil.1.4.), AChE ve β-glukoronidaz ve sistik fibrosis riskini arttıran gen ile aynı

22 10 bölgede bulunur ve PON1, PON2 ve PON3 olmak üzere bilinen üç üyeye sahiptir. Bu genler büyük yapısal benzerlikler göstermektedir ve ortak evrimsel öncülden gen dublikasyonlarının meydana gelmesiyle oluşur. PON1, PON2 ve PON3 genleri memeliler arasında; nükleotid seviyesinde %81-90, aminoasit seviyesinde %79-90 benzerlik gösterir (Mackness ve ark., 2000). Şekil.1.4. PON1 geninin 7. kromozom üzerindeki yeri PON1 de 106. kodonda lizin bulunurken, PON2 ve PON3 te lizin bulunmamaktadır. PON1 ve PON3 karaciğer ve plazmada bulunmasına karşılık, PON2 nin karaciğer, böbrek, kalp, beyin, testis dokularında özellikle endotel tabakasında bulunduğu ve aortik düz kas hücrelerinde de yer aldığı immünohistokimyasal yöntemle gösterilmiştir (Hong- Liang ve ark., 2003). Serumda daha az seviyelerde bulunan PON3; PON1 ile karşılaştırıldığında paraokson ve fenilasetat substratları için düşük spesifik aktiviteye sahip olmasına rağmen dihidrokumarin substratı için özel bir spesifik aktiviteye sahiptir. Dolayısıyla serumda PON1 dominant PON enzimi olsa da, PON3 ün ihmal edilemez bir düzeyde PON1 aktivitesine dahil olduğunu söylemek mümkündür (Rainwater ve ark., 2009) PON1 in Biyokimyasal Yapısı: Paraoksonaz (PON1) kalsiyuma bağımlı hidrolaz ve antioksidatif aktiviteye sahip bir glikoproteindir. Bu aktivitelerin her ikisi de ayrı yapısal alanlarla ilişkilidir. Karaciğerde sentezlenen ve dolaşıma verilen PON1 serumda HDL ye bağlı olarak bulunur. PON1, hidrofobik N-terminal bölgesi aracılığıyla HDL-lipidlerine kolayca bağlanabilmektedir ve bu bağlanma ilgisindeki etki HDL içerisinde şekil ve

23 11 büyüklük değişimine neden olur. PON1 i bağlayan HDL alt birimleri, Apolipoprotein AI (Apo AI) ve Apo J (klusterin) proteinlerini de içerdiğinden, Apo AI ve Apo J nin bağlanmada rol oynayabileceği düşünülmektedir (Li ve ark.2000; Deakin ve James, 2004). İnsan serum paraoksonaz enzimi PON1, kda molekül ağırlığında, 354 aminoasitten oluşan bir glikoproteindir. Ağırlığının %15.8 ini oluşturan karbohidrat üniteleri, 4 farklı konumda proteine bağlı olarak bulunur. İzoelektrik noktası 5.1 dir. Aminoasit içeriği, yüksek miktarda bulunan lösin dışında bir özellik göstermez (Gan ve ark., 1991) PON1 yapısında üç sistein rezidüsü vardır: Cys-42 ve -353 arasında bir disülfid bağı varken Cys-284 serbesttir Yapısında bulunan üç sistein aminoasidinden 284. pozisyondaki serbest iken, diğer ikisi (Cys ) arasında disülfit bağı bulunur (Şekil.1.5.). Protein yapısındaki tek disülfit bağı, polipeptit zincirinin siklik yapıda olmasına neden olur. Serbest sistein, esteraz aktif merkezinin anahtar bileşeni olarak substrat tanınması ve bağlanması için gereklidir (Rodrigo ve ark., 2001). PON1 in ince yapısı 4 adet zincirden oluşmuş 6 adet β- kırmalı yapıdan meydana gelmiştir (Şekil.1.5.). Aminoterminaline yakın 6D tabakasında bulunan Cys42 kalıntısı ve 6C tabakasında bulunan Cys353 kalıntısı arasında disülfit bağıyla bu yapı stabilize edilir. N terminal ve C terminal uçlarının bu şekilde kovalent bağlanması β- kırmalı yapılı enzimlerde nadirdir ve PON ailesinde korunmuştur (Harel ve ark., 2004 ; Kuo ve La Du, 1998). PON1 aktivitesi için kalsiyum (Ca +2 ) gereklidir. Bu özelliğiyle Co +2, Mn +2, Mg +2 kulllanan diğer esteraz tipi enzimlerden ayrılır. Üç boyutlu yapıda; β-kırmalı tabakaların merkezinde 7.4A aralıklı iki adet Ca +2 iyonu bulunmaktadır. Bunlardan

24 12 Şekil.1.5. PON1 in yapısı.arg; Arginin, Cys; Sistein, Gln; Glutamin, Leu; Lösin, Lys; Lizin, Met; Metiyonin biri (Cal 1) en üstte, diğeri (Ca2) merkezde bulunmaktadır (Şekil.1.6.). Ca2 yapısal kalsiyum olup yapıdan uzaklaştırılması dönüşümsüz denaturasyona neden olmaktadır. Ca1 ise katalitik etkinlikte görev alan kalsiyumdur. Bu kalsiyum iyonu A uzaklıkta 5 adet amino asit kalıntısı (Asn224, Asn270, Asn168, Asp269 ve Glu 53) ile etkileşim halindedir. Aynı kalsiyum iyonu bir su molekülü ile fosfat iyonunun oksijeni ile etkileşmektedir. İki kalsiyum iyonu farklı afiniteye sahiptir. Ca1 in bağlanması Ca2 den daha fazladır. PON1 in organofosfat substratlarına karşı hidrolitik aktivitesi kalsiyuma bağımlı iken, lipid peroksitlerin birikimini önlemede kalsiyumun gerekli olmadığı bildirilmektedir (Harel ve ark., 2004). PON1 in yapısında 3 tane hidrofobik heliks yapısı (H 1, H 2 ve H 3 ) vardır (Şekil.1.5.). H 2 ve H 3 hidrofobik heliksler aktif bölgede bulunmaktadır; bunlar aynı zamanda

25 13 sonlanma noktalarıdır ve aktif bölgenin yapısının belirlenmesi, enzimin HDL ye bağlanması gibi kritik rollere sahiptir (Harel ve ark., 2004). PON1 sentezlendiğinde monomerik yapı şeklindedir. Eğer HDL ye bağlanmazsa oligomerizasyon yapabilir. Bu olay in vitro deterjanlı ortamda H 2 ve H 3 heliksleri ile detarjan misellerine bağlanarak gerçekleşir (Josse ve ark., 2002). PON1 üzerinde 4 tane potansiyel N-glikozillenme bölgesi vardır. İki tanesi (Asn 227 ve Asn 270) β-kırmalı tabakaların merkezinde, diğer ikisi yüzeye bakan bölgede (Asn 253 ve Asn 324) yer almaktadır. PON1 memeli hücrelerinde ekspre edildikten sonra bu noktalardan glikozillenir. PON ailesinin hidrolitik aktivitesi için glikozilasyon önemli değildir (Aharoni ve ark., 2004). Ancak enzimin yapısında bulunan bu karbohidrat moleküllerinin hücre membranlarına spesifik olmayan bağlanmada veya kararlığı ve çözünürlüğü arttırmada etkili olabilir (Jonas, 2000). Şekil.1.6. PON1 proteininin üç boyutlu yapısı. (a) 6 lı ß pervane yapısının üstten görünümü. N, C terminali ve merkezde 2 kalsiyum iyonu (Ca1, yeşil;ca2, kırmızı) (b) 6 lı ß pervane yapısının yandan görünümü. H1, H2, H3 helikslerinin görünümü (Josse ve ark., 1999).

26 PON1 in HDL ye Bağlanması: Karaciğerde sentezlendikten sonra kana salınan PON1 ve PON 3, spesifik olarak HDL ye bağlanırlar. HDL periferal hücrelerden kolesterolün taşınmasını sağlayarak ve kendisine bağlı platelet aktive edici faktör (PAF), PON1 ve PON3 gibi enzimler ile LDL in oksidasyonunu önler (Lund-Katz ve Phillips 2010). HDL yaklaşık 10 nm çapında, bileşiminde öncelikle membran bileşenleri (fosfolipidler, kolesterol ve kolesterol esterleri), apolipoprotein A1 ve aromatik helikslerin yer aldığı bir partiküldür. HDL ye bağlı olan enzimlerden üç boyutlu yapısı ilk aydınlatılan PON1 enzimidir (Borhani ve ark., 1997). Şekil.1.7. PON1 in HDL ye bağlanması. H1 ve H2 helikslerinin HDL ile etkileşimi. PON1, N-terminal hidrofobik sinyal dizisine sahiptir. PON1 salınımından önce bu bölgenin çıkarılmasıyla oluşturulan mutant-pon1 in HDL ye bağlanamadığı gösterilmiştir. Bu da, PON1 in HDL ye hidrofobik N-terminal sinyal dizisi ile

27 15 bağlandığını göstermektedir. N-terminalin tamamı membranı geçen heliks yapıdadır (Sorenson ve ark., 1995) (Şekil.1.7.). N-teminal yapının kalıntısı hidrofilik heliks yapıdadır ve heliks1 (H 1 ) olarak adlandırılmaktadır. Heliks H 2 de H 1 gibi amfipatik yapıdadır. H 1 ve H 2 yapılarının birbirine yakın hidrofobik kısımları bir araya gelerek potansiyel membrana bağlanma yüzeyi oluştururlar. H 2 deki Try185, Phe186, Try190, Trp194, Trp202 ve H1 deki Lys21 ile HDL ye tutunmaktadır. Hepatositlerin zarlarındaki fosfolipid çift tabakasında bulunan PON1 hidrofobik N-terminal sinyal dizisi ile HDL deki fosfolipidlere bağlanır (Harel ve ark., 2004) PON1 in Sentezi ve Salgılanması: PON1 karaciğer tarafından üretilip kana verildiğinden dolayı, serumdaki PON1 seviyesini belirleyen başlıca faktör karaciğer fonksiyonlarıdır. Serumdaki PON seviyesi ve aktivitesi bireyler arasında çok değişkendir. Bunun nedeni enzim aktivitesini ve peptit konsantrasyonunu etkileyen PON1 geninin kodlanma ve promotor bölgesinde çok sayıda polimorfizm göstermesidir. PON1 in serumdaki aktivitesini ve konsantrasyonunu belirleyen promotor aktivitesi üzerinde en önemli polimorfizm -107 pozisyonundadır (Deakin ve ark., 2003). PON1 sentezinde önemli olan bir diğer faktör karaciğer hücrelerindeki kolesterol dengesidir. Ayrıca PON1 in karaciğerden sentezini diet, yaşam biçimi ve herhangi bir hastalık durumu da etkilemektedir (Cabana ve ark., 2003). Çeşitli faktörler PON1 sekresyonunun mekanizmasında rol alarak serumda enzim düzeyinin tayinini sağlar. Lipoproteinlerin yokluğunda az miktarda PON1 sekrete edilir. Hücrelerden sekrete edilen PON1 i fosfolipid miçeller ve HDL sekresyonu stimüle ederken, LDL ve ApoA1 etki göstermez (Şekil 1.8) (Deakin ve James, 2004).

28 16 PON1 kardiyovasküler hastalıklara karşı bağımsız koruyucu bir rol üstlenen HDL nin antiaterojenik etkisine katkıda bulunur. In vitro çalışmalar göstermiştir ki paraoksonaze substratları yüksek derecede heterojendir ve bazıları aterosklerotik lezyonların gelişimine katkıda bulunur. PON1 in bu koruyucu rolü genetik olarak oluşturulmuş hayvan modellerinde gösterilmiştir. İnsanlarda, PON Q/R192 ve Met55Leu polimorfizmleri, kardiyovasküler hastalığa yatkınlığın artmasında farklı PON-1 aktivitesi seviyeleri ve konsantrasyonları ile birlikte etkin görünmektedir. CLA-1 (CD36 ve Lizozomal integral membran protein-ii Analogous-1) geni, murin SR-B1 (Scavenger Reseptör sınıf B tip 1) geninin insan homoloğudur. SR-B1, moleküler seviyede tespit edilen en yüksek eğilimli HDL reseptörüdür. CLA-1 reseptörü serbest kolesterolün seçici tutulumu, yerel ve okside kolesterol esterlere aracılık ederek HDL-ortamlı ters kolesterol transportta kilit rol oynar. CLA-1 geninin birçok polimorfik varyantları tespit edilmiştir bunlardan bazıları plazma lipoproteinlerdeki fenotipik değişimler ile ilişkilidir. Her iki gen de kompleks HDL metabolik yoluna ve tahminen oksidatif strese karşı defans mekanizmasına iştirak eder (Esparragón ve ark., 2006). Şekil.1.8. Hücre membranında bulunan PON1 in HDL ye transferi (Memişoğulları ve Orhan, 2010)

29 PON1 in Fonksiyonları, Katalizlediği reaksiyonlar: Serum PON1 in başlıca üç fonksiyonu vardır: 1- Hidrolaz aktivitesi 2- Arilesteraz aktivitesi 3- Arildialkil fosfataz aktivitesi PON1 aromatik karboksilik asit esterleri, organofosfatları, insektisitleri, laktonları ve cyclic- carbonate ilaçların hidrolizini katalizler. Antiaterojenik aktiviteye sahip olup; plazmadaki LDL nin lipitleri oksitlemesinde ve LDL nin lipit bileşenlerinin oksidasyonundan oluşan toksik ürünleri inaktive etmede etkilidir. Ayrıca bakteri endotoksinlerine karşı koruyucu olarak hareket eder (La Du ve ark., 1999) Hidrolitik aktivite; Organofosfatlara Karşı Koruma: PON1 akut seviyede nörotoksik olarak bilinen birçok OP pestisidlerin toksik okson türevlerini metabolize edebilir. PON1 in en iyi bilinen koruyucu fonksiyonu, sinir ajanları, aromatik karboksilik asit esterleri ve insektisitler gibi organofosfatlara (OP) ters bağlanıp hidroliz ederek, dolaşıma giren organofosfatların nörotoksisitesini engellemektir (Costa ve ark., 2003). OP lular in vivo olarak sitokrom p-450 bağımlı mikrozomal monooksijenazlar ile oksidatif desülfirasyon tepkimesiyle, oldukça toksik oksijen analoglarına (okson) aktive olurlar (oksidatif desülfirasyon). PON1 paratiyonun oksidatif desülfirasyonu ile oluşan paraoksonu hidroliz ederek p-nitrofenol ve dietilfosfat oluşumuna yol açar (Şekil.1.9.) (Furlong ve ark., 2000). Paraokson, asetilkolini yıkan kolinesterazların güçlü inhibitörüdür ve ardışık nöron overstimülasyonu ile sinaptik bileşkelerde asetilkolin birikimine yol açar.

30 18 Reaksiyonun daha çok tion ve oksonları detoksifiye edebilen enzimlerin (glutatyon S- transferaz, monooksijenaz, PON1) yer aldığı karaciğerde olduğu düşünülmektedir. Memelilerde hepatik yıkımdan kaçan okson, organofosfat etki alanına ulaşmadan önce, kanda serum PON1 enzimi ile hidroliz edilebilir. PON1 in paraoksona etkisi ile oluşan hidrolitik ürünler paraoksonun kendisine göre daha az zararlıdır (Dragonov ve La Du, 2004). Şekil.1.9. Paraoksonun Enzimatik Hidrolizi İnsektisit olarak yaygın şekilde kullanılan paratiyon, diazinon ve klorpirifos gibi OP bileşiklerinin yanında somon, sarin tabun gibi sinir gazları da PON1 in başlıca substratlarındandır (Şekil.1.10.) (Dragonov ve La Du, 2004). Ancak memelilerde bulunan PON1 in bu substratlara karşı affinitesi düşük olduğundan, tarımsal alanda çalışanlarda organofosfat zehirlenmelerine sık rastlanır. Bununla beraber kronik olarak düşük dozda OP türevlerine maruz kalanlarda, PON1 in daha etkili olduğu bildirilmektedir (Başkol ve Köse, 2004).

31 19 Şekil Sinir gazlarının hidrolizi. İnsan PON1 enzimi ayrıca paration, diazinon ve klorpirifos gibi çok sayıda insektisitin toksik okson metabolitlerini hidrolizleyebilmektedir (Şekil 1.11) (Mutch ve ark., 2007). Şekil İnsektisitlerde yaygın olarak kullanılan okson metabolitlerinin detoksifikasyonu PON1 enzimi ayrıca sınıflandırılmada yer aldığı A-esteraz grubunda bulunması ile fenilasetat gibi ester substartlarını da hidrolizleyebilmektedir (Şekil.1.12.). PON1 in paraoksonaz aktivitesi, substrat olarak paraokson kullanıldığında ölçülen aktivite olup, PON1 in arilesteraz aktivitesi ise fenilasetat substrat olarak kullanılması ile ölçülen aktivitedir (Gan ve ark., 1991).

32 20 Şekil Aromatik esterlerin hidrolizi. Memelilere kıyasla böceklerin de içinde bulunduğu omurgasızlarda, kuşlarda, balıklarda serum PON unun bulunmamasına bağlı olarak OP zehirlenmesine yatkınlığın daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Saf insan serum PON l enziminin bazı OP bileşiklerini hidroliz ettiği gösterilmesine rağmen, insan OP metabolizması ile ilişkisi tam olarak açıklanamamıştır. Farklı popülasyonlarda izlenen aktivite değişkenliği OP hidroliz hızlarında farklılık ile birlikte olabilmekte ve bu insanlarda seçici toksisiteyi etkileyebilmektedir (Mackness ve ark., 1996) Ksenobiyotik Metabolizması Üzerine Etkisi: PON1 bazı lakton ve siklik karbonatları içeren ilaçları ve ilaç ön maddelerini de hidroliz edebilmektedir (Şekil 1.13). Örneğin, siklik karbonat olan prulifloksasin i aktif kinolon antibiyotiği NM394 e hidroliz eder. Yine diüretik bir ilaç olan spironolakton ve 3-hidroksimetilglutaril-KoA redüktaz inhibitörleri olan mevastatin, lovastatin ve simvastatin bu enzim tarafından hidrolizlenir. Önceleri yapılan çalışmalarda bu hidroksimetil glutaril-koa redüktaz inhibitörlerinin hidroliz edilmesi, söz konusu enzimin statinaz aktivitesi olarak tanımlanmıştır. Ayrıca PON1 glukokortikoid δ-laktonların istenmeyen sistemik etkilerinin metabolize edilmesinde rol oynamaktadır (Dragonov ve La Du 2004). Laktonların isosterik formları olan laktamlar oksijen halkası yerine azot halkası ihtiva ederler. Laktamlar PON1 in substratını oluşturmazlarken enzimi inhibe ederler. İn vitro çalışmalarda δ -

33 21 valerolaktam, ε kaprolaktam ve hidroksikinolin gibi laktamlar PON1 enziminin güçlü inhibitörleridir (Billecke ve ark., 2000). Ksenobiyotiklerin biyotransformasyonunu sağlayan oksidasyon, redüksiyon, hidroliz ve konjugasyon gibi reaksiyonların sıklıkla böbreklerde ve özellikle proksimal tübüllerde gerçekleştiği bilinmektedir. İmmunohistokimyasal olarak, glomerüler yumak ve proksimal tübüllerin epitel hücrelerinde lokalize olduğu gösterilen PON1 in, ksenobiyotiklerin detoksifikasyonuna fonksiyonel katkısının olabileceği düsünülmektedir. Renal epitelyum hücrelerinde anyon transport sistemleri ve PON1 in benzer intrasellüler dağılıma sahip olması; ksenobiyotiklerin biyotransformasyonunda ve toksik etkilerine karsı organizmanın korunmasında PON1 in önemli rol oynayabileceği görüşünü desteklemektedir (Başkol ve Köse, 2004). Şekil Lakton hidrolizi Bakteriyel Endotoksinlerden Kaynaklanan Toksisiteye Karşı Koruma: PON1 gram (-) bakterilerin hücre duvarlarından salınan lipopolisakkaritlerin oluşturduğu bakteriyel endotoksinlere karşı koruma sağlar (La Du ve ark., 1999). LPS makrofajlarla etkileşime girer ve sitokin salınımını başlatır.(tnf-α, IL-1, IL-6). Bunun sonucunda septik şokun semptomları gelişir. Lipopolisakkarit inaktivasyonu

34 22 immunolojik olmaktan çok enzimatik bir reaksiyondur ve PON1 enzimatik olarak LPS yi inaktif hale getirir. Böylece makrofajların yüzeyi üstündeki CD14 spesifik bağlayıcı proteinleri ile etkileşimini engeller (Ginsberg ve ark., 2009) Oksidatif veya peroksidatif aktivite; LDL ve HDL oksidasyonunun önlenmesi: HDL, antioksidant ve antiinflamatuvar özelliklere sahiptir ve LDL oksidasyonunu buna bağlı olarak da arterosklerozisi geciktirir. HDL nin oksidatif modifikasyonu; ters yönde kolesterol taşıma fonksiyonunda bozulmalara yol açar. Paraoksonaz, HDL yi oksidasyondan koruyarak HDL-K nin ters kolesterol taşıma fonksiyonunun devamını sağlar. Bu durum makrofajlarda kolesterol birikimini engelleyerek köpük hücre oluşumunu ve ateroskleroz gelişimi yavaşlatmaktadır (Aviram ve ark., 1998). PON1 in, Cu +2 nin indüklediği lipoprotein oksidasyonunu in vitro olarak inhibe ettiği ve nonkompetetif PON1 inhibitörlerinin serbest radikal oluşumunu ve Cu +2 nin indüklediği HDL oksidasyonunu arttırdığı gösterilmiştir. Ayrıca, PON1 in makrofajlardan kolesterol çıkısını artırdığı da bildirilmiştir (La Du, 1992). PON1 in HDL vasıtasıyla antioksidan etkiye katkıda bulunduğu ve HDL nin inhibitör etkisinde, metal iyon şelasyonu ve/veya peroksidaz benzeri aktivite ile ilişkili olabileceği ileri sürülmektedir. HDL-PON1, uzun zincirli okside fosfolipidleri hidroliz edebilme yeteneğine sahiptir (Watson ve ark., 1995). Paraoksonaz arterosklerozise karşı koruyuculuğunu sahip olduğu laktonaz aktivitesi ile göstermektedir. Enzim 4 atomdan 7 atoma kadar değişen lakton halkası ihtiva eden en az 30 çeşit laktonu hidrolizleyebilmektedir (Jakubowski, 2000).

35 Genetik Polimorfizm: Hücrelerde kromozomlarda yer alan DNA, (Deoksiribonükleik asit) tüm organizmalar ve bazı virüslerin canlılık işlevleri ve biyolojik gelişmeler için gerekli olan genetik talimatları taşıyan bir nükleik asittir (Alberts ve ark., 2002). DNA üzerinde belli bölgelere karşılık gelen genler, regülasyonu ve transkripsiyonunun karmaşıklıklarını içeren, aynı sınıftan (protein veya RNA) işlevsel ürünler şifreleyen, potansiyel olarak birbiriyle örtüşen genom dizilerinin birleşimidir (Gerstein ve ark., 2007). Polimorfizm, popülasyonda %1 den daha sık görülen genetik değişikliklerdir. Bir genin alelleri ya da bir kromozomun homologlarıyla birleşen çeşitli fenomik formların varlığı yani bir lokusta bir alelden fazlasının bulunması olgusudur. Eğer bireyler arasında DNA sekansındaki fark bir hastalık ile ilişkilendirilirse ve bu değişim X ışını, radyasyon, ultraviyole, bazı ilaç ve kimyasallar, ani sıcaklık gibi dış ajanlar nedeniyle oluşuyorsa genel olarak mutasyon olarak adlandırılır. İnsan vücut çatısı özelliklerindeki belirgin farklılıklardan da anlaşılacağı gibi DNA diziliminde normal bir değişkenlik vardır. DNA dizilimindeki değişkenlik yani polimorfizm, yaklaşık her 500 nükleotidde bir görülür. Kuşkusuz, her genomda DNA kopma ve eklenmeleri ya da tek baz değişiklikleri vardır. Sağlıklı toplumlarda bu değişiklikler kodlanmış proteinin işlevinde herhangi bir değişikliğe neden olmayan noktalarda veya DNA nın kodlayıcı olmayan bölgelerinde görülür (Devrim ve Kaya, 2004) Polimorfizm Çeşitleri: Popülasyon içerisindeki polimorfizmler oluş nedenlerine göre; tek nükleotid değişim (Single Nucleotide Polymorphism-SNP), insersiyon ve delesyon olmak üzere üç başlık altında gruplandırılabilirler.

36 Tek Nükleotid Değişim (Single Nucleotide Polymorphism: SNP): İki eşdeğer DNA sekansındaki tek bir baz varyasyonudur. Tüm genetik varyasyonların %90 ını oluşturur. İnsan genomunda milyon SNP olduğu tahmin edilmektedir. İki farklı birey arasında 1250 bp de bir farklılık olduğu tahmin edilir (Thorisson ve Stein, 2003). SNP ile sonuçlanan iki tip nükleotid baz değişimi vardır: Transisyon değişimi pürinler arasında (A, G) veya primidinler arasında (C, T) oluşur. Bu tip değişim, bütün SNP lerin üçte ikisinde mevcuttur. Transversiyon değişimi ise bir pürin ile bir primidin arasında oluşur. Şekil Transisyonla tek nükleotid değişimin gösterilmesi Gen kodlayan bölgelerde görülen SNP varyantları, bir proteinin amino asit sekansını değiştirmekte ve protein fonksiyonunu doğrudan etkilemektedir. Gen kodlayan bölgelerdeki SNP lerin sayısının dolaylarında olduğu tahmin edilmektedir. Bazı SNP ler promotor bölgesindedir ve proteinin regülasyonunu ve ekspresyonunu etkilemektedir. Popülasyonlar arasında görülen genetik farklılıklar, hastalıklara karşı duyarlılık, direnç ve hastalık prognozunu etkileyebilmektedir. Epidemiyolojik ve biyomedikal

37 25 araştırmalar, farklı popülasyonlarda hasta bireyler ve sağlıklı kontroller arasındaki SNP farklılıklarını ortaya koymaktadır. Kanser, diabetes mellitus, alzheimer, migren ve bazı kardiyovasküler hastalıklar SNP ile yakın ilişkilidir (Wright, 2005). SNP taramalarında, hangi varyant alellerin hastalıkla yakın ilişkili olduğu belirlenebilmektedir. Çeşitli hastalıklara özgü SNP profilleri belirlenmiştir. DNA örneklerinde spesifik SNP alelleri incelenerek bireylerin hastalıklara yatkınlıklarını belirlemek amacıyla tarama yapılabilmektedir (Wang ve Moult, 2001). Sonuç olarak hastalıkların etiyolojisinin anlaşılmasında veya ilaçların etkinliğinin, toksik maddelerin etki mekanizmalarının araştırılmasında genotipik varyasyonların tanımlanması yararlı olacaktır. İnsersiyon: DNA dizisine bir veya daha çok baz çiftinin eklenmesidir. DNA polimerazın kayma yapması sonucu insersiyonlar sık olarak mikrosatellit bölgelerinde olabilir. İnsersiyonlar, büyüklük olarak tek bir baz çiftinden tüm bir kromozoma kadar olabilir. İnsersiyonların bir genin protein kodlayan bölgesinde meydana gelmesi özellikle zararlı olabilir. Eğer eklenen nükleotitlerin sayısı 3'e (yani bir kodondaki nükleotit sayısına) tam bölünmezse genin normal okuma çerçevesinde bir değişim (Çerçeve kayma mutasyonu) meydana gelir. Çerçeve kayma mutasyonları, mutasyonu izleyen, genin kodladığı tüm aminoasitlerin değişmesine neden olur. Genelde insersiyon ve onu izleyen çerçeve kayma mutasyonu, genin çevirisinin erken bir bitiş kodonuna rastlamasına neden olur, bunun sonucu kısa bir protein üretilir. Bu kısa proteinler genelde normal hatta bozuk olarak dahi işlev veremezler, insersiyonun olduğu gene bağlı olarak çeşitli genetik bozukluklar meydana gelir. Eğer insersiyon sonucu okuma zinciri değişmezse çerçeve içi insersiyon meydana gelmiş olur; giren nükleotit sayısı 3'e tam bölünür. Eğer eklenen nükleotitler bir bitiş

38 26 kodonu kodlamıyorsa protein çevirisi normal yerinde sonlanır. Ancak, insersiyonun büyüklüğüne bağlı olarak üretilen proteinin işlevini değiştirebilecek yeni amino asitler eklenmiş olabilir (Pierce, 2008). Delesyonlar: DNA dizisi içerisinden nükleotidlerin kırılıp ayrılması, genin normal uzunluğundan daha kısa olmasına neden olur. Eğer bu gen, protein kodlayan yapısal bir gense, proteinin amino asit dizisinde azalma olur ve proteinde fonksiyon bozukluğu görülür (Emir ve Özden, 2006) PON1 Polimorfizmi: Literatürde kodlama alanında 2 adet, kodlanmamış alanda en az 13 adet ve tek nükleotid polimorfizmi (SNP) olarak 150 nin üstünde PON1 polimorfizmi rapor edilmiştir (Şekil 1.15) (Jarvik ve ark., 2003). Her biri hakkındaki bilgiler büyük değişkenlik göstermektedir. Yüksek veya düşük metabolizörler için gen frekansları farklı etnik ve coğrafik kökenli gruplar arasında değişir. Temelde PON1 genininin kodlama bölgesinde kendiliğinden olan mutasyonlar sonucu iki aminoasitin yer değiştirmesiyle; 55. ve 192. pozisyonlarda olmak üzere iki genetik polimorfizm vardır. 192 ve 55 kodonları, PON1 geninin iki iyi çalışılmış polimorfizm alanlarıdır. Çünkü bu iki alloenzimin çeşitli substratlara karşı affiniteleri ve katalitik aktiviteleri farklılık göstermektedir (Humbert ve ark., 1993). Şekil PON1 geninin polimorfik bölgeleri

39 Kodlama alanındaki polimorfizmler: Kodon 192 deki tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) glutaminden(q) arjinin (R) substitisyonuna yol açar (Huen ve ark., 2010). Pozisyon 55 teki L/M polimorfizmi; Lösin/Metiyonin değişiminden kaynaklanır ve plazma PON1 protein seviyeleri ile ilişkilidir; fakat katalitik verimliliği etkilemez. Her iki polimorfizm çeşitli patofizyolojik durumlarla ilgilidir (Humbert ve ark., 1993; Garin ve ark., 1997; Mackness ve ark., 1998) Promotor bölge polimorfizmleri: PON1 gen ekspresyonu aynı zamanda promotor alanlardaki polimorfizmlerden de etkilenir. Çizelge 1.3. de özetlendiği gibi, PON1 geninin 5 promotor alanında 5 polimorfizm tespit edilmiştir: -107/-108 (C/T), -126 (C/G), -160/-162 (A/G), -824/- 832 (A/G) ve -907/-909 (C/G) (Leviev ve James, 2000; Suehiro ve ark., 2000). Promotor bölgesindeki bu polimorfizmler serum PON1 aktivite ve konsantrasyonunda önemli farklara yol açmaktadır. PON1-108 SNPsi, PON1 miktarında en belirgin etkiye sahiptir; arilesteraz (ARE) aktivitesinde ölçüldüğü kadarıyla, değişkenliğin %22.4 ünden sorumludur. PON1-108CC genotipi, PON1-108TT ye göre, 2 kat daha yüksek PON1 seviyeleri sağlar (Brophy ve ark., 2001; Deakin ve ark., 2003). ARE aktivitesindeki -162 ve -909 pozisyonlarındaki SNP lerin ilişkisi, bunların PON1-108 SNP si ile güçlü bağ eşitsizliğindendir (LD) (Brophy ve ark., 2001; Holland ve ark., 2006). Benzer biçimde kodlama SNP PON1 L55M de ARE aktivitesi ile ilişkilidir buna rağmen bu etkinin çoğu PON1-108 ile LD ye yüklenebilir. Polimorfizmler PON1 geninin 3 okunmayan alanında da tespit edilmiştir fakat bunların önemi bilinmemektedir (Brophy ve ark., 2001). PON1 geninin kodlama ve promotor bölgelerindeki bu polimorfizmler substrata özel PON1 enzim aktivitesini etkiler (Ferre ve ark., 2003; Costa ve ark., 2005). Çizelge

40 PON1 varyantlarının ve bunların enzim aktivitesi üstündeki etkilerini göstermektedir PON1 Polimorfizmlerinin OP lulara karşı korumadaki durumları: Diazinon, klorpirifos ve paration gibi tionat yapısındaki pestisitler temelde karaciğerde sitokrom P450 (CYP P45O) tarafından yüksek derecede toksik okson metabolitlerine aktive edilir. Eşzamanlı olarak, P450 ler OP ların toksik olmayan metabolitlere detoksifikasyonunu kataliz eder (Mutch ve ark., 2007). İki izozime sebep olan 192 pozisyonundaki amino asit substitisyonlarının OP oksonlarına karşı hidrolitik aktivitesi farklıdır (Humbert ve ark., 1993). Daha çok çalışılmış olan PON1 192Q/R polimorfizminde, 192. pozisyonda arjinin bulunan homozigot bireylerin (R genotipi) serumunda paraoksonu hidroliz eden aktivitesi yüksek, glutamin bulunan homozigot bireylerde (Q genotipi) aktivite daha düşük, heterozigot bireylerde ise orta düzeyde aktivite görülmüştür (Mackness ve ark., 1996). PON1 in R alelinin kodlandığı proteinin paraokson hidroliz aktivitesi Q alele göre sekiz kat daha yüksektir (Ombres ve ark. 1998). Bunun yanında Q izoformu hücre dışında diazoksonu, somon ve sarini R izoformundan daha hızlı hidrolize eder (Davies ve ark., 1996). Fenilasetat ve dihidrokumarinde ise farklılık görülmez. Tek bir aminoasitteki değişimin enzim aktivitesini bu kadar fazla etkilemesi enzimin yapısına bağlanmıştır pozisyondaki arginin aktif bölgenin önemli bir yerindedir (Schmidt ve ark., 1998). PON1 R192 homozigot bireylerin plazması çok düşük sarin hidrolizi gösterirken, PON1 Q192 homozigot bireylerin plazması yüksek seviyelerde sarin hidrolizi gösterir. Somon hidroliz hızları bazı PON1 192Q homozigotlarında PON1 192R homozigotlarına göre

41 29 daha yüksektir. Bu gözlemler ajan hidroliz hızları yüksek olan şahısların, düşük hızlı hidrolize sahip şahıslara göre daha dayanıklı olabileceği sonucunu ortaya çıkarır. Yani PON1 192Q homozigotu, PON1 192R homozigotuna göre sarin maruziyetine daha dayanıklı olabilir (Mutch ve ark., 2007). Klorpirifos oksonu hidrolize etme hızını belirlemede fonksiyon genotipten daha önemlidir. Li ve arkadaşları PON1-192 genotipinden bağımsız olarak, klorpirifos oksonu hidrolizi için katalitik verimliliğin diazokson veya paraoksona göre daha fazla olduğunu göstermiştir. Bunlar yaklaşık 3 ve 55 kat daha az verimle hidrolize olmuştur. Bunun anlamı düşük konsantrasyonlu klorpirifos okson, genotipten bağımsız olarak, PON1 tarafından verimli şekilde hidrolize edilir. RR homozigotları, satüre substrat konsantrasyonlarında paraoksona karşı daha yüksek hepatik aktiviteye sahiptir. Buna rağmen, RR proteine sahip şahıslar, QQ homozigotuna sahip olan şahıslara nazaran paraokson toksisitesine daha yatkındır diyemeyiz çünkü bu oksona karşı PON1 in bütünsel katalitik verimliliği çok zayıftır (Li ve ark., 2000). Daha çok karaciğerde bol miktarda bulunan karboksilesterazlar ve kolinesterazlar, temelde hücre içinde paratiyona maruz kalmanın ardından görece düşük seviyelerde oluşan paraoksonun yıkılmasını etkiler (Chambers ve ark., 1994). Bu fikre destek olarak, Karanth ve ark. tarafından yapılan bir çalışmada hem PON1 hem de karboksilesterazlar tarafından indirgenen paraoksonun aksine klorpirifos-oksonun etkili detoksifikasyonundaki önemi vurgulanmıştır (Karanth ve ark.,2001). Öte yandan klorpirifos oksonu aktiviteye özel olarak, R192 alloform, Q192 alloforma göre daha yüksek bir hidroliz katalitik verimliliğine sahipken; bunun aksine diazoksona karşı aktivitesi düşüktür. İnsan Q192 alloformuna sahip transgenik farelerin, R192 alloformuna sahip olanlara göre klorpirifos oksona daha duyarlı olduğu gözlenmiştir (Cole ve ark., 2005).

42 30 Alel a Nükleotid değişimi Amino asit değişimi Fenotipe etkisi PON1-kodlama bölgesi*192q Hiçbiri (atipik) Hiçbiri Referans fenotip PON1-kodlama bölgesi*192r A dan G ye Glutamin den Arginin e Artan Paraokson fakat azalan sarin, soman PON1-kodlama bölgesi*55l Hiçbiri (atipik) Hiçbiri Referans fenotip PON1-kodlama bölgesi*55m T den A ya Leucine den Methionine e Azalan PON1 mrna ve serum enzim seviyeleri PON1 5 upstream 108T Hiçbiri (atipik) Hiçbiri: Kodlamayan Referans fenotip PON1 5 upstream 108C T den C ye Hiçbiri: Kodlamayan 1.9 kat artan ekspresyon seviyesi PON1 5 upstream 126BAC Hiçbiri (atipik) Hiçbiri: Kodlamayan Referans fenotip PON1 5 upstream 126C2 C den G ye Hiçbiri: Kodlamayan Belirgin bir değişim yok PON1 5 upstream 162YAC-A1 Hiçbiri (atipik tip) Hiçbiri: Kodlamayan Referans fenotip PON1 5 upstream 162; 5 farklı SNP 4 farklı nükleotidde Hiçbiri: Kodlamayan 3.6 kata kadar artan ekspresyon seviyesi çeşitli değişimler PON1 5 upstream 832C1 Hiçbiri (atipik) Hiçbiri: Kodlamayan Referans fenotip PON1 5 upstream 832; 3 farklı SNP 4 farklı nükleotidde Hiçbiri: Kodlamayan Belirgin bir değişim yok çeşitli değişimler PON1 5 upstream 909BAC Hiçbiri (atipik) Hiçbiri: Kodlamayan Referans fenotip PON1 5 upstream 909F G den C ye Hiçbiri: Kodlamayan 1.8 kat azalan ekspresyon seviyesi PON2 *148A Hiçbiri (atipik) Hiçbiri Karakterize edilmemiştir PON2 *148G ala dan gly a Karakterize edilmemiştir PON2 *311C Hiçbiri (atipik) Hiçbiri Karakterize edilmemiştir PON2 *311S G den C ye cys den ser e Karakterize edilmemiştir a Alel ismindeki numara SNP nin oluştuğu kodona karşılık gelir (Ginsberg ve ark., 2009) Çizelge.1.3. PON1 Polimorfizm Adlandırması ve Enzim Aktivitesi

43 31 PON1-55 kodlama bölgesinde veya _108C/T düzenleyici bölgesindeki polimorfizmler gibi diğer polimorfizmlerin veya diette antioksidanların tüketimi gibi çevresel etkilerin, RR daki yüksek aktiviteyle ilgili olabilir (Aviram ve ark., 2000). 40 geniş ailede 1406 dan fazla şahısta yapılan genetik analizlerde, PON1-192 polimorfizminin paraokson hidrolizindeki varyasyonların %60 ından sorumlu olduğu görülmüştür fakat diazokson hidrolizlerindeki varyasyonların sadece %30 undan sorumlu olduğu belirtilmiştir. Bunun yanında PON1-55 polimorfizmi paraokson hidrolizindeki varyasyonların yaklaşık %17 sinden fakat diazokson hidrolizlerindeki varyasyonların sadece %1 inden sorumludur. Bu gözlemler fenilasetat ve diazokson hidrolizi, paraokson ve diazokson hidrolizi ve klorpirifos okson ve diazokson hidrolizi arasındaki düşük korelasyonu hakkındaki mevcut veriyi destekliyor ve çevresel; henüz bilinmeyen genetik faktörlerin diazoksonu hidrolize etme kapasitesini belirlemede PON1-192 genotiplerinden daha önemli olduğunu önermektedir (Ginsberg ve ark., 2009). M/L55 polimorfizmi substratla ilişkiyi değiştirmez. Enzimin düşük serum aktivitesi ve konsantrasyonuyla ilişkilidir. M aleli taşıyanlarda düşük PON1 mrna seviyeleri bulunmuştur. L aleli taşıyanlar daha stabildir ve proteolize daha dayanıklıdır. Bu da yüksek serum aktivitesine sahip olmalarını açıklayabilir (Serrato ve Marian, 1995). Paraoksonaz alloenzimlerin LDL yi oksidasyondan koruma kapasitesi paraokson hidrolitik aktivitesi ile tamamen terstir. PON155MM / PON1 192QQ alloenzimlerinin diazokson, soman ve sarin gibi sinir gazlarını hidroliz etme kapasiteleri düşükken LDL yi oksidasyondan koruma da daha aktif rol üstlenirler; bunun da nedeninin Q alloenziminin lipid peroksitleri metabolize etme aktivitesinin yüksekliği olduğu ileri sürülmüştür; (Garin ve ark., 1997). Q alelinin PON1 in ateroskleroza karşı koruyucu etkisinden sorumlu olduğu, R alelinin ise kardiyovasküler hastalık riski ile ilişkili olduğu pek çok çalışmada bildirilmiştir. Macknesss ve arkadaşları normolipidemik kişilerde RR genotipine sahip kişilerin

44 32 HDL sinin LDL oksidasyonuna karşı koruyucu etkisinin QQ genotipine sahip kişilere göre daha düşük olduğunu bulmuşlardır (Mackness ve ark., 2000). Sigara içiminin PON1 derişimi ve aktivitesini azalttığı ve bu etkisinin geri dönüşümsüz olduğu saptanmıştır. Serum PON1 düzeyleri diyet, akut faz proteinleri, gebelik, apo A1 metabolizmasını etkileyen bozukluklardan etkilenmektedir (Sutherland ve ark., 1999). Diyabetiklerde, KVH olanlarda, hiperkolesterolemide, ileri yaşta, obezitede, menopozda ve böbrek yetmezliklerinde PON1 düzeyinin azaldığı tespit edilmiştir (Mackness ve ark., 1998; Aviram, 1999). Ailesel hiperkolesterolemililerde PON1 aktivitesinin, kontrol grubundan daha düşük olduğu gösterilmiştir (Mackness ve ark., 1991). Yapılan bir çalışmada; hiperlipideminin atorvastatin ile tedavisi lipid profilinde olumlu değişikliklere yol açtığı ve aterosklerozda protektif rol üstlendiği belirtilen PON1 düzeyini artırdığı bildirilmektedir (Özkan ve ark., 2004). Organik fosforlu insektisitler gerek zehirlenmelere neden olmaları, gerekse insan sağlığı açısından önem taşımaktadırlar, diğer taraftan benzer yapıdaki birçok kimyasal savaş ajanı da aynı mekanizma ile toksik etki göstermektedir. Bu bileşiklerin biyotransformasyonunda PON1 enzimi önemli rol oynarken, toksik etkilerini de asetil kolinesteraz enzimini inhibe ederek göstermektedirler. Bu çalışmanın amacı organik fosforlu insektisitlerle zehirlenen veya maruziyeti bilinen işyerlerinde çalışan kişilerin PON1 genetik polimorfizmi ile birlikte ve bu polimorfizmin enzim aktivitesine yansımasını belirleyerek, toplumumuzun organik fosforlu bileşiklerden etkilenme olasılığı profilini çıkarmaktır.

45 33 2.GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Gereçler Kullanılan Kimyasal Maddeler Paraokson Sigma Asetil tiyoklorür iyodür Sigma DTNP Sigma Restriksiyon Enzimi (BspPI) (Fermentas ER1322) Primerler Alpha DNA, Montreal Etanol Merck Agaroz Prona Trizma Base Merck Borik asit Merck EDTA Merck DTT Sigma Etidyum Bromür Applichem 6X loading çözeltisi Qiagen Saf etanol Scharlau, Dop DNA s RNA s free water Qiagen Hot Star Taq DNA polimeraz Qiagen Fenol-kloroform-izoamil alkol (25:24:1) Applichem Sodyum dodesil sülfat (SDS) Applichem Sodyum klorür (NaCl) Merck Proteinaz K Merck 100 bp ladder Fermentaz Ammonyum dihidrojen fosfat Merck Triton X Scharlau Pb/Cd/Cu/Zn Standart AA Standart Etanol pour SCP Science

46 34 HNO 3 (%65 lik) Merck Kullanılan Araç ve Gereçler Spektrofotometre Schimadzu modeli UV-1208 Laminar Flowkabin Esco Thermal Cycle PCR cihazı Techne Tc 512 Jel Görüntüleme cihazı Syngene Yatay elektroforez cihazı Scie-Plas Güç Kaynağı Bio-Rad Su banyosu Nüve Bm 402 Otoklav Nüve Soğutmalı santrifüj cihazı Hettich Mikrodalga fırın Arçelik Elektrikli hassas terazi Schimadzu Libror Vorteks karıştırıcı Biosan ph metre Mettler Toledo Laptop Cooler ( 20 C) Sigma 1.5 ml. ve 0.2 ml lik ependorf steril tüpler Axygen Genuine Pirojen free filtreli, pipet uçları Finntip (10 l, 100 l, 1000 l.) Otomatik mikropipet Ependorf, Thermo, Tipor-V Etüv Memmert Santrifüj Heraeus Sepatech Labofyge 200 Manyetik Karıştırıcı Mirak Ph metre Seven Multi Mettler Toledo Su Purifikasyon Sistem Human Up 900 Mikrodalga fırın Mars X Press Hassas terazi Mettler Toledo 4 Digit

47 Deney Protokolü Örneklerinin Toplanması Çalışmada kullanılan kan örnekleri, 2009 yılı içerisinde, Ankara Meslek Hastalıkları Hastanesi ne başvuran kronik olarak organik fosforlu ilaçlara maruz kalan hastalardan toplandı. Kontrol grubuna ait kan örnekleri de yine aynı hastaneye rutin kontrol için gelen OP maruziyeti veya herhangi bir sistemik hastalığı olmayan sağlıklı kişilerden alındı. Kontrol ve hasta grubu olarak seçilen hastaların her birinden; biri asetilkolinesteraz, diğeri genetik analiz için 2 adet EDTA lı 4.5 ml mor tüp, paraoksonaz enzim aktivite tayini için 1 adet jelli 5 ml biyokimya tüpü alındı. Jelli biyokimya tüpleri 4400 rpm de 10 dk. santrifüj edilerek, serumlar jelsiz düz tüplere (katkısız) aktarıldı, üzerleri etiketlenerek analiz yapılıncaya kadar (-)20 o C de muhafaza edildi. EDTA lı mor tüplerden genetik için kullanılacak olanlar etiketlenerek analiz yapılıncaya kadar (+) 4 o C de saklandı. Asetilkolinesteraz için alınan EDTA lı mor tüpler en kısa sürede laboratuvara ulaştırılarak; 3 kez serum fizyolojik ile yıkama işlemi yapılarak, ayrılan eritrositler yine (-) 20 o C de analiz yapılıncaya kadar muhafaza edildi. Kontrol grubu ve hastalardan toplanan EDTA lı mor tüplerden alınan yaklaşık 100 µl. kan örneği kurutma kağıdı üzerine damlatıldıktan sonra oda koşullarında kurutuldu ve kontaminasyonu önlemek için ayrı ayrı zarflara konularak paketlendi. Analiz süresine kadar oda koşulunda muhafaza edildi. Kronik olarak OP lu pestisitlere maruz kalan ve kontrol grubundaki bireylerin yaş ortalaması 38 olup; 7 kadın (%12.9) ve 47 erkekten (%87) oluşmaktaydı.

48 Kan Örneklerinin Saklanması Türk toplumundan rasgele seçilmiş gönüllü bireylerden 4.5 ml. kan örneği EDTA lı vakumlu tüpler içerisine alındı ve üzerleri etiketlenerek +4 C de muhafaza edildi. Bu çalışma; Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik kurulunun tarih, sayılı kararı ile yürütülmüştür Yöntem Çalışmamız enzim aktivite tayini ve genetik analiz olmak üzere iki aşamadan oluşmaktadır. İlk kısımda paraoksonaz ve asetil kolinesteraz aktivite tayini yapılmış; ikinci kısımda PON1 192 Arginin Glutamin (Q/R) gen polimorfizmi belirlenmiştir Asetilkolinesteraz Aktivite Tayini: Eritrosit asetilkolin esteraz aktivitesi, substrat olarak kullanılan asetil tiyokolinin enzimatik hidrolizi sonrasında oluşan serbest sülfidril gruplarının DTNB (5,5'ditiyobis 2-nitrobenzoik asit) ile tepkimeye girmesi esasına dayanan bir yöntem kullanılarak ölçüldü. 50 mm Hepes tamponu (ph:7.4) içinde son konstrasyonu 1mM olan DTNB reaksiyon ortamını oluşturdu. Reaksiyon ortamına son konsantrasyonu 2 mm olacak şekilde asetil tiyokolinin ve uygun miktarda örnek ilavesi ile reaksiyon başlatıldı. Reaksiyon sonunda oluşan TNB nin verdiği sarı renk 412 nm de spektrofotometrik olarak ölçüldü (Lewis ve ark., 1981). TNB için molar absorbtivite katsayısı Є 412= M -1 cm -1 olarak alındı. Asetil tiyokolinesteraz etkinliğinin bir birimi, bu ölçüm koşullarında dakikada oluşan 1 μmol TNB olarak tanımlanmıştır. Sonuçlar gr hemoglobin başına U olarak ifade edildi (U / gr Hb).

49 Paraoksonaz Aktivite Tayini: Paraoksonaz aktivitesinin ölçümü, sentetik substrat olarak kullanılan paraoksonun enzimatik hidrolizi sonucu oluşan p-nitrofenolün spektrofotometrik olarak ölçülmesi esasına dayanır. Paraokson substratı ile PON1 in paraoksonaz aktivitesinin saptanmasında kullanılan yöntemin tepkimesi aşağıda verilmiştir: Şekil.2.1. PON1 in paraoksonaz aktivitesi Paraoksonaz aktivitesi 2 mm CaCl 2 ve 1 M NaCl içeren 0.1 M Tris-HCl (ph 8.5) tamponu içinde ölçüldü. Tepkime ortamına uygun miktarda enzim örneği eklendikten sonra, son konsantrasyonu 1.2 mm olacak şekilde paraokson (Sigma- Aldrich, MO, ABD) ilavesi ile tepkime başlatıldı ve oluşan tepkime ürünü 4- nitrofenol 412 nm de spektrofotometrik olarak ölçüldü (Gan ve ark,. 1991). P- nitrofenol için molar absorbtivite katsayısı Є412= M-1 cm-1 olarak alındı. Paraoksonaz aktivitesinin bir birimi (bir ünite paraoksonaz), bu ölçüm koşullarında dakikada bir nmol paraoksonu hidroliz eden enzim miktarı olarak tanımlanmış ve enzim aktivitesi nmol/min/ml (U/ml) şeklinde ifade edilmiştir. Paraoksonaz enziminin Km, Vmax sabitleri yukarıda verilen deney ortamları kullanılarak paraoksonaz aktivitesi için ph 8.5 ve 37 ºC, ölçüldü. Paraoksonaz aktivitesi ölçülerek yapılan kinetik çalışmalarda, son hacmi 1 ml olan ölçüm ortamı 2 mm CaCl2 ve 1 M NaCl içeren 0.1 M Tris-HCl tamponu (ph 8.5), 0-2 mm arasında paraokson ve uygun miktarda enzim içermekteydi. Spektrofotometrede 37 ºC de 3 dakika inkübe edilen aktivite karışımına paraokson substratının pipetlenmesi ile başlatılan tepkime, 3 dakika süreyle izlendi.

50 38 Bütün bulgular üç ölçümün ortalamasıdır. Paraoksonaz aktivitesi için ilk hızlar mg enzim proteini başına dakikada oluşan nmol ürün (U/mg protein) olarak hesaplandı Paraoksonaz Aktivite Tayinin Standardizasyonu: Paraoksonun substrat olarak kullanıldığı kinetik çalışmalarda, ilk hızlar 37ºC de, 2 mm CaCl2, 1 M NaCl içeren 100 mm Tris/HCl tamponunda (ph 8.5) ölçüldü. Tepkime ortamına yukarıdaki karışımın pipetlenmesinden sonra sabit miktarlarda enzim eklendi ve dengeye ulaşması için 37ºC de 3 dakika bekletildi. Tepkime son derişimi 0-2 mm arasında olacak şekilde paraokson ilave edilerek başlatıldı. Tepkime ortamının son hacmi 1 ml idi ve tepkime spektrofotometrede 3 dakika süreyle izlendi. Ölçülen absorbans değişimi değerlerinden yararlanılarak her substrat derişimine karşılık gelen ilk hızlar hesaplandı. İlk hız (v) değerlerinin paraokson derişimine karşı grafiklemesi ile Michaelis-Menten grafiği çizildi (Şekil 2.2). Şekil.2.2. İnsan serum PON1 enziminin paraoksonaz aktivitesine göre Michaelis-Menten grafiği. Enzimin kinetik sabitleri, 1/V değerlerine karşı 1/[S] değerlerinin grafiklenmesi ile elde edilen Lineweaver-Burk doğrusundan (Şekil 2.3) yararlanılarak saptandı. Lineweaver-Burk doğrusunun 1/V eksenini kesim noktasından enzimin maksimum

51 39 hızı (Vm), 1380±75 nmol/dak/mg protein; 1/[S] eksenini kestiği noktadan Km değeri, 0.8±0.06 mm olarak saptandı. Şekil.2.3. İnsan serum PON1 enziminin paraoksonaz aktivitesine göre Lineweaver-Burk grafiği PON1 192 Q/R Gen Polimorfizminin Belirlenmesi: Kan örneklerinden DNA İzolasyonu Kan örneklerindeki nükleer DNA yı açığa çıkarabilmek amacıyla fenol-kloroformizoamil-alkol ekstraksiyon yöntemi kullanıldı l sıvı kan örneğinin üzerine 1000 l. TE konularak rpm de 1 dakika santrifüj edildi. Alt faz 100 l kalıncaya kadar üst faz atıldı. Bu işlem 3 defa tekrarlandı. 2. Üzerine;

52 40 45 l NaCl (1 M), 40 l SDS (%20 lik) 400 l TE ve 10 l proteinaz K eklenerek kısaca vortekslendi C lik su banyosunda saat inkübe edildi, 4. Fenol-kloroform-izoamil alkol karışımından 500 l ilave edildi ve kısaca vortekslendi rpm de 2 dakika santrifüj edildi. 6. Alt faz hareket ettirilmeden üst faz yeni bir ependorf tüpe alındı ve alt faz atıldı l soğuk saf etil alkol ilave edildi rpm de 10 dakika santrifüj edildi. 9. Alkol oluşan pelete zarar vermeden dikkatli bir şekilde atıldı l %70 lik oda sıcaklığında etil alkol ilave edildi rpm de 5 dakika santrifüj edildi. 12. Ependorf tüpün içerisinde bulunan tüm alkol dikkatlice atıldı. 13. Tüpün dibinde kalan alkol de tamamen uçurulduktan sonra 100 l DNAse- RNAse free su ilave edildi.

53 41 Tüm DNA örnekleri analizlere alınıncaya kadar C de muhafaza edildi Genomik DNA nın Agaroz Jel Elektroforezi ile Belirlenmesi Kan örneklerinden genomik DNA nın izole edilip edilmediğinin analizi %0.5 lik agaroz jel elektroforezi ile belirlendi %0.5 lik Agaroz Jel Hazırlanması gr agaroz tartıldı ve 120 ml 1X TBE çözeltisi içerisinde çözüldü. 2. Mikrodalga fırında ağzı alimünyum folyo ile kapatılıp üzerinde delikler açılarak maksimum ayarda kaynatıldı. 3. Çözelti oda sıcaklığında C ye düşünceye kadar bekletildi. 4. Üzerine 10 l EtBr (10 mg/ml) eklendi ve hafifçe çözelti pembeleşip homojen karışım sağlanıncaya kadar çalkalandı. 5. Kalıbın bariyerleri takıldı ve jel tarakları yerleştirildikten sonra agar kalıba döküldü. Jel üzerinde hava kabarcıkları oluşmuş ise, jel katılaşmaya başlamadan hemen pipet ucu yardımı ile patlatıldı. 6. Jelin katılaşması için oda sıcaklığında dakika bekletildi. 7. Taraklar ve bariyerler çıkarılarak kalıp elektroforez tankına yerleştirildi. Jel kuyucuklarının, yürüme tankının katot elektrot (-) tarafına yerleştirilmesine dikkat edildi.

54 42 8. Jelin üzerini 2 3 mm kaplayacak miktarda tank içerisine 1X TBE çözeltisi eklendi Agaroz Jel e Yüklemek İçin Örnek Hazırlanması ve Yürütme Koşulları cm uzunluğunda parafilm kesilerek buz kalıbı üzerine yerleştirildi l 6X Jel Loading Buffer ve 5 l DNA örneği parafilm üzerine konuldu ve homojenizasyon için mikropipet yardımı ile yavaşça karıştırıldı. 3. Toplam 6 l karışım dikkatli bir şekilde, jeli delmeden, jel kuyucuklarına yerleştirildi. Şekil.2.4. Agaroz jel kuyucuklarına örneklerin yüklenmesi 4. Tank kapağı kapatıldı, anot ve katot uçlarının bağlantıları takıldı. 5. Güç kaynağı 100 volt ve 70 ampere ayarlanarak, numuneler 45 dakika jel üzerinde yürütüldü.

55 43 6. UV ışığında, Jel görüntüleme cihazında sonuçlar değerlendirildi PCR PCR işlemi TECHNE TC 512 Thermal Cycle cihazı ile gerçekleştirildi ve aşağıda belirtilen işlemler uygulanarak hedeflenen DNA bölgesinin her biri 2 35 defa çoğaltıldı. Her PCR analizinde kontrol amacıyla, pozitif ve negatif örnekler de kullanıldı. PCR işleminde kontaminasyonu önlemek amacıyla; PCR ve DNA izolasyonları farklı ortamlarda yapıldı, Her analiz öncesi ve sonrasında kullanılacak çalışma ortamı ve otomatik pipetler alkol ile temizlendi, Steril tüpler ile filtreli pipet uçları kullanıldı, Amplifikasyon ve enzim kesim işlemleri hava sirkülasyonlu laminar kabin içerisinde yapıldı, işlem öncesi ve sonrasında en az 45 dakika UV ışık kaynağı çalıştırıldı, Analizler sırasında steril, pudrasız eldivenler kullanıldı ve sık sık eldivenler değiştirildi Primerler Amplifikasyon için Forward (F: direkt) ve Reverse (R: karşıt) primerleri kullanıldı. Primer çiftinden F primer DNA nın bir ipliğine bağlanırken, R primer DNA nın diğer ipliğine bağlanır. Primerlerin bağlanmasıyla hedeflenen bölgenin çoğaltılması başlatılmış olur.

56 44 Primerler HPSF (High Performance Salt Free) yöntemi ile Montreal deki Alpha DNA firmasına sentezlettirildi. Kullanılan primerler ve özellikleri aşağıdaki çizelgede gösterilmiştir. ÖZELLİKLER F PRİMER 5 -tattgttgctgtgggacctgag- 3 R PRİMER 5- cctgagaatctgagtaaat ccact-3 Uzunluk 22 bp 24 bp GC içeriği %50 %41.6 Erime Sıcaklığı (Tm) 62.3 o C 58.0 o C Primerler arası Tm farkı 4.3 o C PCR ürününün uzunluğu ( ) bazlar arasındaki sekansı 238 bp 5 TATTGTTGCTGTGGGACCTGAGcacttttatggcacaaatgatcac tattttcttgacccctacttacaatcctgggagatgtatttgggttta gcgtggtcgtatgttgtctactatagtccaagtgaagttcgagtggtg gcagaaggatttgattttgctaatggaatcaacatttcacccgatggc aagtatgtgaactctctgaaatgtagtggatttactcagattctcagg 3 Çizelge.2.1. Amplifikasyonda kullanılan primerler ve özellikleri PCR Bileşenleri ve PCR Programı Standart bir PCR reaksiyonun PCR Buffer, MgCl 2, dntp karışımı, Hot Star Taq DNA Polimeraz, F Primer, R Primer ve DNA bileşenleri bulunmaktadır. Çalışmada kullanılan 50 µl lik PCR reaksiyonunun bileşenleri, bileşenlerin stok konsantrasyonları, reaksiyondaki miktarları ile reaksiyon karışımındaki final konsantrasyonlarına ait bilgiler aşağıdaki çizelgede verilmiştir.

57 45 BİLEŞEN Stok Konsantrasyon Reaksiyona Konulan Miktar 50 µl lik Reaksiyon Karışımındaki Final Konsantrasyon 10 X PCR Buffer 10X 5 µl 1X MgCl 2 25 mm mm dntp karışımı 2mM µm F Primer 10 pmol/ µl 1 µl 10 pmol R Primer 10 pmol/ µl 1 µl 10 pmol Hot Star Taq DNA Polimeraz DNA Steril H 2 O 5 U/ µl 0.25 µl 1.25 U 50 µl ye tamamlayıncaya kadar ~200 ng Çizelge.2.2. PCR bileşenleri ile stoktaki ve reaksiyondaki konsantrasyonları PCR programı aşağıda belirtilen şekilde gerçekleştirildi C de C de 10 dakika 1 dakika C de 1 dakika 35 döngü C de C de 1 dakika 5 dakika C de dakika PCR ürünleri, agaroz jel elektroforezinde yürütülünceye kadar -20 o C de muhafaza edildi.

58 PCR Ürünü İçin Agaroz Jel Hazırlanması PCR ürünleri %2 lik agaroz jel elektroforezi ile analiz edildi. Bunun için 2.4 gr agaroz tartılarak 120 ml 1XTBE içerisinde çözüldü ve bölüm de yapıldığı şekilde işleme devam edildi. 7 μl PCR ürünü ile 1 l 6X Jel Loading Buffer karıştırılarak jel kuyucuklarına yüklendi. Her 6 numuneden sonra 100 bp DNA ladder ı kullanıldı. 1 l DNA ladder ı, 1 l 6X Jel Loading Buffer ve 6 l distile su karıştırılarak yükleme yapıldı. Jel, 100 Volt ve 70 Amperde 1 saat yürütüldükten sonra sonuçlar UV ışığında, jel görüntüleme sistemi ile değerlendirildi PCR Ürününün RFLP Yöntemi ile Kesimi Çalışmamızda, PON1 192 Arginin Glutamin (Q/R) gen polimorfizmini belirlemek için, amplifikasyon sonucunda oluşan PCR ürünü, BspPI Restriksiyon enzimi ile kesildi. PCR ürününün RFLP yöntemi ile kesim işleminde negatif ve pozitif örnekler de kontrol amacıyla analizlere alındı BspPI Restriksiyon Enziminin Özellikleri BspPI, Bacillus species d 1-34 bakterisinden elde edilmiş bir restriksiyon endonükleaz enzimidir. BspPI enzimi 5 ucundan GGATC sekansını tanıyarak 4. bazdan, 3 ucundan da CCTAG sekansını tanıyarak 5. bazdan diziyi keser. Şekil.2.5. BspPI restriksiyon enziminin tanıma bölgesi ile kesim noktasının şematik gösterimi.

59 BspPI Enzim ile Kesim İşlemi Amplifikasyon ürünün kesimi için 30 μl lik reaksiyon karışımı hazırlandı. Reaksiyon bileşenleri, BİLEŞEN 10X tampon Tango BspPI PCR ürünü dh 2 O Stok Konsantrasyon 10X 3 U/ µl 30 µllik Reaksiyon Karışımındaki Final Konsantrasyon 1X 3 Unit 12 µl 16 µl Çizelge.2.3. BspPI enzimi ile kesim işlemindeki bileşenler ve reaksiyondaki konsantrasyonları İnkübasyon; 55 o C de 4-5 saat yapılmış ve ürünler analizlerde kullanılıncaya kadar +4 o C de muhafaza edilmiştir BspPI Enzimi ile İnkübasyondan Sonra Agaroz Jel Hazırlanması BspPI enzimi ile kesim işleminden sonra oluşan oligonükleotidlerin analizleri, bölüm de anlatıldığı şekilde %2 lik agaroz jel elektroforezi ile gerçekleştirildi. Sonuçlar UV ışığında, jel görüntüleme sistemi ile değerlendirildi.

60 İstatistiksel Analiz PON1 geni 192 Q/R polimorfizminin genotip ve alel frekansları Hardy-Weinberg dengesi (eşitliği) kullanılarak hesaplanmıştır. Eritrosit AChE ve serum PON1 enzim aktiviteleri ile aynı bireylerin PON1 192Q/R gen bölgesi polimorfik genotip özellikleri arasındaki ilişki Oneway Anova testi ile belirlendi. Analizler SPSS Version.16 paket programında değerlendirildi ve anlamlılık düzeyi α=0.05 esas alınarak yapıldı.

61 49 3.BULGULAR Çalışma grubumuz 54 kontrol ve OP lulara kronik olarak maruz kalan 54 kişiden oluşmaktadır. Maruz kalan ve kontrol grubunun büyük çoğunluğu erkektir (%87). Toplam bireylerin yaş ortalaması 38.20±7.97, kontrol grubunun yaş ortalaması 38.17±8.19, maruz kalan grubun yaş ortalaması ise 38.24±7.83 dir Toplumumuz Bireylerinde PON1 192Q R Polimorfizmini Belirlemek Amacıyla Yapılan Analiz Sonuçları: Genomik DNA nın Agaroz Jel Elektroforezi ile Belirlenmesinin Sonuçları Çalışmada kullanılan 108 örneğin tamamı, izolasyon işleminden sonra agaroz jel elektroforezinde tayin edildi. Her bir örneğin DNA larının izole edildiği görüldü PCR Reaksiyonu ile PON1 192 Q R Gen Bölgesi Amplifikasyon Sonuçları PON1, 7. kromozomun 7q21.3 bölgesinde lokalize olmuş bir gendir. Bu gen üzerinde birçok SNP tespit edilmiştir ve bu polimorfizmlerden birisi de 192. aminoasitteki Glutamin (Q) Arjinin (R) değişimidir. Bu tek nükleotid değişimde, homozigot tipik bireylerde A aleli bulunurken, homozigot atipik bireylerde G aleli bulunmaktadır. Kullanılan primerler ile amplifiye edilen bölgenin baz dizilimi aşağıdaki tabloda gösterilmiştir. (Çizelge.3.1)

62 50 Primerler F Primer R Primer 7. Kromozomda Primerlerin Bağlandığı Nokta 5 -TATTGTTGCTGTGGGACCTGAG-3 5 -CCTGAGAATCTGAGTAAATCCACT-3 Amplifiye Edilen Bölge 238 bp TATTGTTGCTGTGGGACCTGAGcact tttatggcacaaatgatcactatttt cttgacccctacttacaatcctggga gatgtatttgggtttagcgtggtcgt atgttgtctactatagtccaagtgaa gttcgagtggtggcagaaggatttga ttttgctaatggaatcaacatttcac ccgatggcaagtatgtgaactctctg aaatgtagtggatttactcagattct CAGG Çizelge.3.1.Kullanılan primerler ile amplifiye edilen bölgenin baz dizilimi Toplumumuz bireylerinde PON1 192 Q R polimorfizmini göstermek amacıyla, bu noktayı da içeren 238 bp lik bölge amplifiye edildi ve sonuçlar jel görüntüleme sisteminde, UV ışık altında değerlendirilerek fotoğraflandı (Şekil.3.1) Şekil bp.lik amplifikasyon ürününün, BspPI enzimi ile kesim sonucunda oluşan oligonükleotid uzunlukları; M: 100 bp lik Ladder; 1: QR genotip; 2 ve 4: QQ genotip; 3: RR genotip.

63 BspPI Restriksiyon Enzimi ile PON1 192 Q R Gen Bölgesinde Amplifiye Edilen Bölgenin Kesim Sonuçları PON1 192 Q R polimorfizminin olduğu bölgeyi de kapsayacak şekilde çoğaltılan 238 bp lik PCR ürünü, A G polimorfizmini belirlemek amacıyla; BspPI enzimi ile 55 o C de 4-5 saat inkübe edildi. BspPI enzimi 238 bp lik PCR ürününü; 5 ucundan GGATC sekansını tanıyarak 4. bazdan, 3 ucundan da CCTAG sekansını tanıyarak 5. bazdan keser. 5 GGATC (N) CCTAG (N) 5 5 Bireyler PON1 192Q/R pozisyonunda homozigot tipik genotipli ise (A/A) ise; PON1 192Q/R pozisyonunda A/A genotipine sahip bireylerde 238 bp. lik PCR ürününde GGATC dizisi bulunmadığından BspPI enzimi fragman üzerine bağlanamaz dolayısı ile bu bölgedeki kesim işlemini gerçekleştiremez. Sonuçlar jel görüntüleme cihazında UV ışık altında görüntülendiğinde, PON1 192Q/R pozisyonunda homozigot tipik genotipli bireylerde sadece 238 bp.lik DNA fragmanı gözlenmektedir. Bireyler PON1 192Q/R pozisyonunda homozigot atipik genotipli ise (G/G) ise; BspPI enzimi 238 bp lik PCR ürününü 5 ucundan GGATC dizilimini tanıyarak 5. bazdan keser ve bunun sonucu olarak da 238 bp lik amplifikasyon ürünü; 176 bp ve 62 bp lik iki oligonükleotid parçası şeklinde agaroz jel üzerinde görüntülenir. Bireyler PON1 192Q/R pozisyonunda heterozigot genotipli ise (A/G) ise; Bu genotipe sahip bireylerin tek DNA ipliğinde A, diğer DNA ipliğinde G bazı olduğundan; BspPI enzimi ile kesim sonucunda; bir DNA ipliği, A genotipli

64 52 bireylerde olduğu gibi, 238 bp bp olarak tek oligonükleotid şeklinde görülür. Diğer DNA ipliği ise G genotipli bireylerde olduğu gibi, 176 bp ve 62 bp olarak iki oligonükleotide ayrılır. Dolayısı ile agaroz jel üzerinde ve UV ışık altında heterozigot genotiplilerin oligonükleotid bantları; 238 bp, 176 bp ve 62 bp olarak görülmektedir. PON1 192Q/R polimorfizmi ile oluşan genotipler ve BspPI enzimi ile kesim sonucunda oluşan oligonükleotidlerin uzunlukları aşağıdaki çizelgede belirtilmiştir (Çizelge.3.2). GENOTİP Homozigot tipik (Q/Q) (A/A) Homozigot atipik (R/R) (G/G) Heterozigot (Q/R) (A/G) BsgI enzimi ile kesim sonucunda oluşan oligonükleotid uzunlukları 238 bp (enzim ile kesim olmuyor) 176 bp ve 62 bp 238 bp, 176 bp ve 62 bp Çizelge.3.2. PON1 192Q/R polimorfizmi ile oluşan genotipler ve BspPI enzimi ile kesim sonucundaki oligonükleotid uzunlukları Çalışmamız sonucunda; Toplumumuz bireylerinin (n:108) PON1 192Q/R polimorfizminin %56.5 u homozigot tipik (QQ) ; %34.3 ü heterozigot (QR), %9.3 homozigot atipik (RR) olarak bulunmuştur (Çizelge 3.3.).

65 53 Polimorfizm QQ (Homozigot tipik) QR (Heterozigot) RR (Homozigot atipik) Genotip Frekansı (n:108) n % Çizelge.3.3. Toplumumuz bireylerinde PON1 192Q/R polimorfizmi ile oluşan genotiplerin frekansı Toplumumuz bireylerinde PON1 192Q/R polimorfizmi ile oluşan alel frekansları ise (n:108); Q alel frekansı; %93.5 (n:98), R alel frekansı ise %43.5 (n:47) olarak belirlenmiştir. (Çizelge.3.4). Alel (Q/R) Alel Frekansı (n:108) n % Q R R R Çizelge.3.4. Toplumumuz bireylerinde PON1 192Q/R polimorfizmi ile oluşan alellerin frekansı

66 54 Yapılan istatistiksel analizler sonucunda kontrol grubunun, maruz kalan grubun ve toplam çalışılan populasyonun Hardy-Weinberg dengesinde olduğu bulunmuştur (Çizelge 3.5) (p>0.05). AA (Homozigot tipik) (n) AG (Heterozigot) (n) GG (Homozigot atipik) (n) Toplam (n) P Exact test Kontrol grubu Gözlenen Beklenen Maruz kalan grup Gözlenen Beklenen Toplam Gözlenen Beklenen Çizelge 3.5. Çalıştığımız populasyonun Hardy-Weinberg dengesinde olup olmadığının tespiti Kontrol ve maruziyeti olan grupta genotip frekans dağılımı farklılık göstermemiştir: Kontrol grubundaki QQ homozigot tipik birey sayısı 32 (%59.2), QR heterozigot birey sayısı 18 (%33.3), RR homozigot atipik birey sayısı ise 4 (%7.4) olarak bulunmuştur. OP maruziyeti olan gruptaki QQ genotipini taşıyan birey sayısı 29 (%53.7), QR genotipini taşıyan birey sayısı 19 (%35.1), RR genotipini taşıyan birey sayısı ise 6 (%11.1) olarak bulunmuştur. (Çizelge 3.6).

67 55 QQ (Homozigot tipik) QR (Heterozigot) RR (Homozigot atipik) R + R - Kontrol (n:54) 32 (%59.2) 18 (%33.3) 4 (%7.4) 22(%40.7) 32(%59.2) OP Maruz kalanlar (n:54) Toplam (n:108) 29 (%53.7) 19 (%35.1) 6 (%11.1) 25(%46.2) 29%53.7) 61 (%56.5) 37 (%34.3) 10 (%9.3) 47(%43.5) 61(%56.5) Çizelge.3.6. Toplamda ve iki grup arasında PON1 192 Q/R genotip frekansları Genotiplere göre PON1 ve AChE enzim aktivitelerinin sonuçları Çalışmada kullanılan toplam 108 örneğin ortalama PON aktivite düzeyi ±34.96 (nmol/min/ml) olarak bulunmuştur. Homozigot tipik bireylerde (n: 61) PON1 aktivite düzeyi ortalaması ±32.30; heterozigot bireylerde (n: 37) PON1 aktivite ortalaması ±34.97; homozigot atipik bireylerde (n: 10) PON1 aktivite ortalaması ise ±37.17 olarak bulunmuştur (Çizelge.3.7). Toplam 108 örneğin AChE aktivite ortalaması 33.49±6.89 U/gr Hb olarak bulunmuştur. Homozigot tipik bireylerde (n: 61) AChE aktivite düzeyi ortalaması 32.92±7.19; heterozigot bireylerde (n: 37) AChE aktivite ortalaması 33.65±6.43; homozigot atipik bireylerde (n: 10) AChE aktivite ortalaması ise 36.40±6.58 olarak bulunmuştur (Çizelge.3.7).

68 56 QQ (Homozigot tipik) (n:61) QR (Heterozigot) (n:37) RR (Homozigot atipik) (n:10) PON1 Aktivite (nmol/min/ml) _ X SS _ X SS _ X SS AChE Aktivite (U / gr Hb) Çizelge.3.7. Genotiplere göre PON1 ve AChE aktivite sonuçları 3.2. Kronik olarak OP lulara maruz kalan bireyler ve kontrol grubu arasındaki PON1 192Q/R polimorfizmi ile AChE, PON1 enzim aktivite sonuçlarının karşılaştırılması Çalışmamız sonucunda kontrol grubundaki PON1 aktivite ortalaması ±40.91 (nmol/min/ml) olarak bulunmuştur. Genotiplere göre PON1 aktivite sonuçları ise; homozigot tipik bireylerde PON aktivite ortalaması ±32.30; heterozigot bireylerde ±34.97; homozigot atipik bireylerde ±37.17 dir. R aleli taşıyan bireylerin (R + ) PON1 aktivite ortalaması ±38.37, R aleli taşımayan bireylerin (R - ) PON1 aktivite ortalaması ±39.16 olarak bulunmuştur (Çizelge 3.10). Kronik OP maruziyeti olan grupta PON aktivite ortalaması ±25.29 (nmol/min/ml) olarak bulunmuştur (Çizelge 3.8). Genotiplere göre PON aktivite sonuçları ise; homozigot tipik bireylerde ±20.97, heterozigot bireylerde ±20.87, homozigot atipik bireylerde ise ±41.29 olarak belirlenmiştir. R + bireylerin PON1 aktivite ortalaması ±27.43; R - bireylerin PON1 aktivite ortalaması ±20.97 olarak bulunmuştur (Çizelge 3.10).

69 57 Şekil.3.2. Kontrol ve OP maruz kalan grupta PON1 aktivitesi Kontrol grubundaki AChE aktivite ortalaması 35.03±6.02 (U/gr Hb) olarak bulunmuştur. Genotiplere göre AChE sonuçları homozigot tipik bireylerde 35.24±5.99, heterozigot bireylerde 35.16±6.18, homozigot atipik bireylerde 32.82±6.73 olarak bulunmuştur. R + bireylerin AChE aktivite ortalaması 34.74±6.18; R - bireylerin AChE aktivite ortalaması ise 35.24±5.99 olarak belirlenmiştir (Çizelge 3.9). Kronik OP maruziyeti olan grupta ise AChE aktivite ortalaması 31.95±7.41 (U/gr Hb) olarak bulunmuştur (Çizelge 3.8). Genotiplere göre maruz kalan gruptaki AChE sonuçları ise homozigot tipik bireylerde 30.37±7.62, heterozigot bireylerde 32.21±6.49, homozigot atipik bireylerde ise 38.78±5.81 dir. R + bireylerin AChE aktivite ortalaması 33.79±6.84; R - bireylerin AChE aktivite ortalaması ise 30.72±7.62 olarak bulunmuştur (Çizelge 3.10).

70 58 Şekil.3.3. Kontrol ve OP maruziyeti olan grupta AChE aktivitesi Bu sonuçlara göre; PON1 ve AChE aktivite sonuçları kronik olarak OP lulara maruz kalan grupta maruziyeti olmayan kontrol grubuna göre istatistiksel olarak oldukça anlamlı bir şekilde düşük bulunmuştur (p<0.05) (Şekil 3.2 ve Şekil 3.3.) Toplumumuz bireylerinde tespit edilen PON pozisyonundaki Q R polimorfizmi ile PON1 ve AChE aktivite sonuçları arasında da anlamlı bir ilişki olduğu tespit edilmiştir. R aleli taşıyan bireylerin (R + ) PON1 ve AChE aktivite seviyeleri, R aleli taşımayanlara (R - ) göre anlamlı olarak yüksek bulunmuştur (Çizelge 3.10 ve Çizelge 3.12)(p<0.05).