TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BROYLER RASYONLARINA KATILAN FİTAZ ENZİMİ VE SİTRİK ASİDİN VERİM PERFORMANSI, BAZI KAN VE KEMİK MİNERAL DÜZEYLERİ İLE TİBİAL DİSKONDROPLAZİ ÜZERİNE ETKİSİ Ali SÖĞÜT HAYVAN BESLEME VE BESLENME HASTALIKLARI ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANI MAN Prof. Dr. akir Doğan TUNCER 2008 ANKARA

2 i Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı Doktora Programı çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma aşağıdaki jüri tarafından Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir. Tez Savunma Tarihi : 01/02/2008 Prof. Dr. akir Doğan TUNCER Ankara Üniversitesi Jüri Başkanı Prof. Dr. Ahmet ERGÜN Ankara Üniversitesi Üye Prof. Dr. İrfan ÇOLPAN Ankara Üniversitesi Üye Prof. Dr. Necmettin CEYLAN Ankara Üniversitesi Üye Doç. Dr. Tülin GÜNGÖR Kırıkkale Üniversitesi Üye

3 ii ÖNSÖZ Türkiye de 1960 lı yıllarda temelleri atılan ve 1970 lerde endüstriyel anlamda üretime başlayan kanatlı sektöründe; 1985 li yıllardan itibaren üretimde kalite anlayışı değişmeye başlamış, önceleri ilkel usullerle gerçekleştirilen üretimden günümüzde çok modern sistemlerle yapılan üretim ve kesim-işleme yöntemlerine geçilmiştir. Başta hayvan ıslahı ve besleme çalışmaları olmak üzere kuluçka ekipmanı, koruyucu sağlık uygulamaları, kümes ve bakım şartları ile ürünlerin işlenmesinde sağlanan gelişmeler ürün kalitesini yükseltmek suretiyle katma değeri artırmıştır. Yaşanan bu gelişmelerin yanında kırmızı ete göre, beyaz ette maliyetin de düşük olması 2000 li yıllara kadar kırmızı et lehine olan kişi başı hayvansal protein tüketimini beyaz et lehine çevirmiştir. Ne var ki ülkemizde yıllık beyaz et tüketimi halen 14 kg civarındadır. Bu miktar AB ne üye ülkelerin ortalama tüketim değeri olan kg ile karşılaştırıldığında çok yetersiz kalmaktadır. Bilindiği üzere kanatlı sektöründe yem maliyeti toplam işletme giderlerinin % kadarını oluşturmaktadır. Böylesine büyük olan besleme kaynaklı giderlerin azaltılmasına yönelik çalışmalar her zaman öncelikli araştırma konusu olmaktadır. Bundan başka, gelişen toplum bilinci çevre kirliliğine karşı insanların duyarlılığını da artırmaktadır. Kanatlı gübresiyle çevreye atılan fazla miktarda fosfor su kaynaklarında önemli kirlenmelere yol açmaktadır. Gerek yem maliyetinin düşürülmesi, gerekse çevreye atılan fosforun azaltılması amacıyla kanatlı rasyonlarında inorganik fosfor yerine fitaz enzimi kullanımı büyük oranda kabul görmüştür. Ayrıca, Avrupa Birliği nde rasyonlara antibiyotiklerin katılımını sınırlayan yasaklamalar ve bu doğrultuda ülkemizdeki uygulamalar yemlere koruyucu olarak organik asitlerin katılımını artırmıştır. Organizmada vücut dokularına tamamen mobilize olabilen organik asitlerden özellikle sitrik asidin fosfor yararlanılabilirliği üzerine etkisi çok eskiden beri bilinmekte olup, metabolizmadaki etki şekli henüz tam olarak bilinmemektedir. Bununla

4 iii beraber inorganik fosfor yerine kullanılabilirliğine yönelik araştırmalar yapılmaktadır. Broylerler üzerinde yapılan bu çalışma ile fosfor düzeyi azaltılmış rasyonlara fitaz enzimi ve sitrik asit ilavesinin performans, bazı doku mineral düzeyleri ve tibial diskondroplazi üzerine etkisi araştırılmıştır. Doktora öğrenimim süresince her türlü konuda yardımlarını esirgemeyen çok değerli danışman hocam Sayın Prof. Dr. akir Doğan TUNCER e, Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Ahmet ERGÜN e, Anabilim Dalı öğretim üyeleri Prof. Dr. İrfan ÇOLPAN, Prof. Dr. Sakine YALÇIN, Prof. Dr. Gültekin YILDIZ, Prof. Dr. Kemal KÜÇÜKERSAN, Prof. Dr. Seher KÜÇÜKERSAN, Prof. Dr. Adnan EHU ya, Dr. Pınar SAÇAKLI ya, tez izleme komitesi üyesi Sayın Prof. Dr. Necmettin CEYLAN a, İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Aydın GÜREL e, Kırıkkale Üniversitesi Veteriner Fakültesi Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Doç. Dr. Tülin GÜNGÖR e, Anabilim Dalımızda görevli araştırma görevlisi B. Hakan KÖKSAL a ve diğer doktora öğrencisi ve teknik personel arkadaşlara, Sayın Ayşe AKSOY a, Sayın İbrahim GÖKTA a, Patoloji Anabilim Dalı Asistanı Sayın Banu YARDIMCI ya, Dr. Ahmet KİREMİTÇİ ye, Veteriner Hekim Aydın KAYALI ya, Veteriner Hekim Mustafa GERGER e, Sayın Hayal ÜNKAZAN a, Sayın Ahmet KILIÇASLAN a, Sayın Ahmet ÇORAK a, Sayın Osman AYKUT a ve sevgili eşim Nurgül SÖĞÜT ve biricik kızlarım Bahar ve Yağmur SÖĞÜT e çok teşekkür ederim. Ali SÖĞÜT

5 iv İÇİNDEKİLER Sayfa No: Kabul ve Onay...i Önsöz...ii İçindekiler...iv Simgeler ve Kısaltmalar...vi ekiller Dizini... vii Çizelgeler Dizini... viii 1.GİRİ Fitaz Enzimi Fitaz Enzimi Aktivitesi ve Fosfor Değerlendirilebilirliğini Etkileyen Faktörler Rasyonun Ca ve P Düzeyi ile Ca:P Oranı Vitamin D 3 ve Metabolitleri Yemin Yapısı ve İşlenmesi Kanatlının Yaşı ve Cinsiyeti Kanatlı Rasyonlarında Fitaz Enzimi Kullanımı Sitrik Asit Kanatlı Rasyonlarında Sitrik Asit Kullanımı GEREÇ ve YÖNTEM GEREÇ Hayvan Materyali Yem Materyali YÖNTEM Deneme Hayvanlarının Beslenmesi ve Deneme Süresi Araştırma Rasyonlarının Hazırlanması Karma Yemlerin Besin Madde Miktarlarının Belirlenmesi Canlı Ağırlık ve Canlı Ağırlık Artışının Belirlenmesi Yem Tüketimi ve Yemden Yararlanma Oranının Belirlenmesi... 23

6 v Kesim İşlemi ve Tibiaların Ayrılması Sıcak Karkas Randımanının Belirlenmesi Tibia Külü, Kalsiyum, Fosfor, Mangan ve Çinko Düzeylerinin Belirlenmesi Kan Serumunda Kalsiyum ve Fosfor ile Kan Plazmasında Çinko ve Mangan Düzeylerinin Belirlenmesi Dışkıda Fosfor Düzeylerinin Belirlenmesi Tibial Diskondroplazi İnsidensinin Belirlenmesi Ölüm Oranlarının Belirlenmesi İstatistik Analizler BULGULAR TARTI MA Canlı Ağırlık ve Canlı Ağırlık Artışı Yem Tüketimi Yemden Yararlanma Oranı Sıcak Karkas Randımanı Ölüm Oranı Tibia Külü, Kalsiyum, Fosfor, Çinko ve Mangan Düzeyleri Kan Serumunda Kalsiyum ve Fosfor ile Kan Plazmasında Çinko ve Mangan Düzeyleri Dışkıda Fosfor Düzeyleri Tibial Diskondroplazi İnsidensi SONUÇ ve ÖNERİLER ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR ÖZGEÇMİ... 67

7 vi SİMGELER VE KISALTMALAR AOAC : Association of Official Analytical Chemists ATP : Adenozin Tri Fosfat CA : Canlı ağırlık CAA : Canlı ağırlık artışı dl : Desilitre DNA : Deoksiribo Nükleik Asit F : Fitaz enzimi F+SA : Fitaz+Sitrik asit g : Gram HP : Ham protein IAEA : International Atomic Energy Agency IUB : International Union of Biochemists kg : Kilogram KM : Kuru madde ME : Metabolik enerji µg : Mikrogram mg : Miligram NK : Negatif kontrol NRC : National Research Council PK : Pozitif kontrol RNA : Ribo Nükleik Asit SA : Sitrik asit TD : Tibial diskondroplazi TK : Tibia külü TSE : Türk Standartları Enstitüsü YP : Yararlanılabilir fosfor YT : Yem tüketimi YYO : Yemden yararlanma oranı

8 vii EKİLLER DİZİNİ Sayfa No: ekil 1.1. Fitik asidin (myo-inositol-1,2,3,4,5,6- hekzakis dihidrojen fosfat) kimyasal yapısı... 1 ekil 1.2. Fitik asitlerin protein, mineral ve nişasta ile oluşturduğu kompleks yapı ekil 1.3. Fitatın, fitaz enzimi ile inositol, inorganik fosfor ve divalent elementlere hidrolizi... 5 ekil 1.4. Sitrik asidin kimyasal yapısı ekil 3.1. Gruplara ait ortalama dışkı fosfor düzeyleri (Kuru maddede, %) ekil 3.2. Tibiadan alınan kesitte histopatolojik inceleme sonucu normal görünüm ekil 3.3. Tibiadan alınan kesitte histopatolojik inceleme sonucu, kondrositlerde diskondroplastik değişiklikler, lakunlarda bozulma ve düzensizlikler... 39

9 viii ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa No: Çizelge 1.1. Yem hammaddelerinin fitat fosfor düzeyi ve fitaz enzim Aktiviteleri... 2 Çizelge 2.1. Araştırmada kullanılan rasyonların bileşimi, (%) Çizelge 3.1. Karma yemlerin metabolize olabilir enerji değerleri (kcal/kg) ile ham besin madde miktarları (%) Çizelge 3.2. Grupların haftalık ortalama canlı ağırlıkları, (g) Çizelge 3.3. Grupların haftalık ortalama canlı ağırlık artışları, (g) Çizelge 3.4. Grupların haftalık ortalama yem tüketimleri, (g) Çizelge 3.5 Çizelge 3.6. Çizelge 3.7. Çizelge 3.8. Çizelge 3.9. Grupların haftalık ortalama yemden yararlanma oranları, (kg yem/ kg canlı ağırlık artışı) Gruplarda kesilen hayvanların ortalama sıcak karkas randımanı (%)35 Gruplardaki hayvanların ortalama tibia külü, kalsiyum, fosfor, çinko ve mangan düzeyleri Gruplardaki hayvanların kan serumu ortalama kalsiyum ve fosfor (mg/dl), kan plazması ortalama çinko ve mangan düzeyleri (µg/dl) Gruplardaki hayvanların ortalama dışkı fosfor düzeyleri (Kuru maddede,%) Çizelge Gruplardaki hayvanların tibialarından elde edilen preparatların histopatolojik incelemesi sonucu tibial diskondroplazi insidensi, (%)... 37

10 1 1. GİRİ Metabolizmada kalsiyumdan sonra en yüksek düzeyde yer alan fosforun yaklaşık % 80 kadarı kemik ve dişlerde bulunmaktadır. Bu mineral kalsiyumla beraber kemik oluşumu ve gelişiminde önemli fonksiyonlara sahiptir. Fosforun geriye kalan bölümü (% 20) vücut sıvılarında ve yumuşak dokularda bulunur (Underwood ve Suttle, 1999). Enerji metabolizması için büyük önem taşıyan ve bir çok enzimin yapısında bulunan fosfor (Nelson, 1967), DNA ve RNA sentezinde önemli görevler üstlenmektedir (Scott ve ark., 1982). Fosfor, kanatlı hayvanlarda iştahın normal seyri, yem tüketimi, kemiklerin gelişimi ve güçlenmesi, yumurta kabuk kalitesi ve hayvan sağlığı için esansiyel bir elementtir. Tohumlarda inositol halkalarına bağlı olarak depolanır. Her inositol halkasına altı adet fosfor bağlanarak fitik asidi oluşturur. Fitik asidin tuzlarına fitatlar denir. Sistematik adı myo-inositol- 1,2,3,4,5,6- hekzakis dihidrojen fosfat olan fitik asidin kimyasal yapısı ekil 1.1 de gösterilmiştir (Graf, 1986). ekil 1.1. Fitik asidin (myo-inositol- 1,2,3,4,5,6- hekzakis dihidrojen fosfat) kimyasal yapısı. Bitkilerde fosfor ve enerji depolamak, olgunlaşma dönemine doğru hızlı biyosentez için ATP sağlamak, hücresel gelişimin kontrolü için gerekli divalent katyonları tutmak ve filizlenme sonrası serbest bırakmak, tohumlarda inorganik fosfor oranını düzenlemek gibi fizyolojik görevler üstlenen

11 2 (Cosgrove ve Irving, 1980) fitik asitlerin besleme bakımından hem besin maddesi hem de anti-besinsel faktör olduğu bildirilmektedir (Pallauf ve Rimbach, 1997). Besin maddesi olarak düşünüldüğünde; hayvan yemleri için fitik asitler fosfor içeriklerinden dolayı temel fosfor kaynağıdır (Reddy ve ark., 1982). Bitkisel kökenli yem maddelerinde bulunan fitik asidin fosfor içeriği % 28.2 olup, toplam fosforun yaklaşık % i fitat fosforu şeklindedir (Ravidran ve ark., 1995). Bazı tahıl ve yağlı tohumlarda bulunan fitat fosforu ve fitaz enzim düzeyleri Çizelge 1.1 de verilmiştir (Ravidran ve ark., 1995; Cowan, 1998). Bitkisel yem maddelerindeki toplam fosfor seviyesi çoğu hayvanın fosfor gereksinimini karşılayacak düzeyde olup, bu durum ruminantlar gibi fitin molekülündeki fitat fosforunun serbest bırakılmasını sağlayabilen hayvanlar için geçerlidir (Ketola ve Harland, 1993). Ancak fitat fosforunun kanatlılar ve domuzlar gibi tek mideli hayvanlarda yararlanılabilirliği değişken ve oldukça düşüktür. Çizelge 1.1. Yem hammaddelerinin fitat fosfor düzeyi ve fitaz enzim aktiviteleri. Yem hammaddeleri Fitat fosforu Fitaz enzim aktivitesi (U/kg) (KM nin % si) (Toplam P un % si) Enerji yemleri Mısır Arpa Buğday Yulaf Sorgum Çeltik Buğday kepeği Tapioka (Cassava) Yağlı tohum küspeleri Soya küspesi Ayçiçeği küspesi Kolza küspesi Pamuk tohumu küspesi Yerfıstığı küspesi

12 3 Bitkilerde fitik asitler anti-besinsel olarak düşünüldüğünde; fitat fosforunun kendisi iyi bir şekilde değerlendirilemediği gibi, bazı esansiyel besin maddelerinin yararlanılabilirliğini de sınırlayıcı bir faktör olarak rol oynamaktadır. Fitat fosforu vücutta erimeyen fosfatın şekillenmesine yol açarak kalsiyum ve fosforun yararlanılabilirliğini düşürmektedir. Fitik asitler sindirim sistemi ortamında pepsin-tripsin gibi proteolitik enzimler (Singh ve Krikorian, 1982) ile protein ve amino asitler üzerinde de negatif bir etki yaratmaktadır (O Dell ve Borland, 1976; Knuckles ve ark., 1985). Fitik asitler; fitat-protein veya fitat-mineral-protein kompleksini oluşturarak protein değerlendirilebilirliğini azalttığı gibi nişasta ile kompleks oluşturarak nişasta sindirimini de engellemektedir (Thompson ve ark., 1987). Fitat fosforunun olumsuz etkilerinden birisi de şelatların oluşmasına yol açmak suretiyle nötr ph'da di ve trivalent katyonlarla erimeyen tuzlar meydana getirmesidir (Vohra ve ark., 1965; Oberleas,1973). Fitat fosfor hidrolizini engelleyen katyonların nötr ph (7.0) koşullarında bu etkileri bakımından, Zn 2+ > Fe 2+ > Mn 2+ > Fe 3+ > Ca 2+ > Mg 2+ şeklinde bir derecelendirme yapılmaktadır (Maenz ve ark., 1999). Oluşan şelatların bağırsak ortamında çökmesiyle söz konusu minerallerin emilimi de olumsuz yönde etkilenir (Oberleas,1973). Fitik asitlerin protein, mineral ve nişasta ile oluşturduğu kompleks yapı ekil 1.2 de gösterilmiştir (Thompson, 1986). ekil 1.2. Fitik asitlerin protein, mineral ve nişasta ile oluşturduğu kompleks yapı.

13 4 Fitat fosfor kullanılabilirliğinin kanatlılarda düşük olması, çevresel kirlilik bakımından da büyük önem taşımaktadır. Tatlı sularda yaşayan yosun ve benzeri bitkiler için fosfor sınırlayıcı bir besin maddesidir. Gübre ile atılan sindirilemeyen fosforun akarsulara ve göllere karışmasıyla bu suların fosfor düzeyi yükselmekte, bu durum tatlı sularda yosun üretiminin artmasına yol açmaktadır. Artan yosun üretimi ile ölmüş bitki materyali daha fazla miktarda dibe çöker ve ortamdaki aerobik bakterilerin çoğalarak oksijeni kullanmasına neden olur. Bunun sonucu olarak ortamın oksijen içeriği azalır, tatlı sularda canlı ölümleri artar, ekolojik denge bozulur ve çevre kirliliği sorunları ortaya çıkar (Sharpley ve ark., 1994; Sharpley ve ark., 1999). Özellikle aşırı derecede büyüyen mavi-yeşil algler toksin ürettiklerinden insan ve hayvan sağlığı için önemli tehlike unsurlarıdır (Kotak ve ark., 1993) Fitaz Enzimi Enzim adı Yunanca da içinde-maya anlamına gelen en-zyme teriminden türemiştir. Enzimler tabiatta bitkiler ve hayvanlar tarafından üretilen, hemen hemen tüm canlı ve dokularda bulunan protein yapısında kompleks bileşikler olup, belirli koşullarda (sıcaklık, nem ve ph gibi) biyolojik katalizör olarak görev alır ve spesifik substratlarla aktif duruma geçerler (Anonim, 2006a). Fitaz enzimi (myoinositol hekzafosfat fosfohidrolaz), fitatı inositol ve inorganik fosfata hidrolize eden bir enzimdir. Fitazlar, fitik asidin fosfat gruplarının bir veya daha fazlasını hidrolize ederek inorganik fosfor ve inositol pentafosfattan inositol monofosfata (IP5 den IP1 e) doğru daha düşük yapıdaki fosforik esterlerin ortaya çıkmasına yol açar. Bu reaksiyon serbest miyositolün açığa çıkmasını sağlar (Harland ve Morris, 1995). Hayvanların sindirim sistemine 4 farklı şekilde fitaz enzimi aktivitesi sağlandığı bildirilmektedir (Angel ve ark., 2005). Bunlar; 1) yem hammaddelerinde doğal olarak mevcut olan, 2) rasyona ekzojen olarak ilave edilen, 3) sindirim sistemindeki mikrofloralar tarafından endojen olarak üretilen, 4) bağırsak mukozası membranına bağlı olan fitaz enzimi aktiviteleridir. Fitaz enzimi

14 5 bitkilerde, hayvanlarda ve mikroorganizmalarda farklı dağılımlarda bulunmaktadır. Fitin defosforilasyonunu inositol halkalarının değişik bölümlerinden başlatması ve farklı düşük inositol izomeri meydana getirme özellikleri bakımından birbirinden farklı iki fitaz enzimi olduğu bildirilmiştir (IUB, 1979). Bunlar a 3-fitaz enzimi (EC ) ve a 6-fitaz enzimi (EC ) olup, a 3-fitaz enzimi fitin defosforilasyonunu ilk önce 3 pozisyonundan başlatıp sırasıyla 1,2,4,5,6-pentakisfosfat ve inorganik fosfat, a 6-fitaz enzimi ise fitin defosforilasyonunu 6 pozisyonundan başlatıp sırasıyla 1,2,3,4,5-pentakisfosfat ile inorganik fosfat meydana getirir. Genelde 3-fitazlar tam bir defosforilasyon sağlayamazken, 6-fitazların fitik asit defosforilasyonunu tam olarak gerçekleştirebildiği bildirilmektedir (Wodzinski ve Ullah, 1996). Normalde 3-fitazlar bakteriler tarafından üretilmekte, 6-fitazlar ise bitkilerde bulunmaktadır (Reddy ve ark., 1982; Nayini ve Markakis, 1986). Ancak bu genel kuralın dışında da üretimin olduğu ve 3-fitaz enzimi aktivitesine değişik soya tohumlarında (Phillippy ve ark., 1988), 6-fitaz enzimi aktivitesine ise Escherichia Coli de (Greiner ve ark., 1993) rastlandığı ifade edilmektedir. Etkinlik bakımından mikrobiyel fitazın ph 2-6 aralığında, bitkisel kökenli fitazın ise ph 5 civarında optimum olduğu ileri sürülmektedir (Wodzinski ve Ullah, 1996). Fitatın, fitaz enzimi ile inositol, inorganik fosfor ve diğer divalent elementlere hidrolizi ekil 1.3 de gösterilmiştir (Lei ve Porres, 2003). ekil 1.3. Fitatın, fitaz enzimi ile inositol, inorganik fosfor ve divalent elementlere hidrolizi.

15 6 Ruminantlar, rumende bulunan mikroorganizmaların fitaz enzimi üretebilmeleri nedeniyle bitkisel kökenli yem maddelerinde bulunan fitik asit formundaki fosfordan yaklaşık olarak % oranında yararlanabilmektedirler (McDonald ve ark., 1987). Ancak endojen fitaz aktivitesi çok düşük olan kanatlılarda bitkisel kaynaklı yem maddelerindeki fosforun değerlendirilmesi yetersiz kalmaktadır (Nelson, 1967; Maenz ve Classen, 1998). Bu nedenle kanatlı rasyonlarına dışardan inorganik fosfor kaynağı katılması zorunlu bir hale gelmektedir. Ancak kanatlı rasyonlarına dışardan fitaz enzimi ilave etmek suretiyle inorganik fosfor katılması zorunluluğu kısmen yada tamamen ortadan kalkabilmektedir. Böylece çevre kirliliği bakımından önem taşıyan fosfor atılımı yaklaşık % 42 oranında azaltılabilmekte (Simons ve ark., 1990), protein ve mineral sindirimi artırılabilmektedir (Yi ve ark., 1996; Sebastian ve ark., 1997). Fitaz enziminin elde edilmesinde kullanılan en önemli kaynak Aspergillus niger adlı mantardır. Fitaz enzimi toz, granül (ısıya dayanıklı kaplama ) veya sıvı formda üretilmektedir. Enzim formu ve veriliş şekli enzim aktivitesini ve bu aktivitenin ısıl işlemler sonucunda korunma yeteneğini büyük ölçüde etkilemektedir (Haefner ve ark., 2005). Yem işleme aşamasında meydana gelen ph ve ısı değişiklikleri (Wodzinski ve Ullah, 1996), sindirim sisteminin üst kısımlarındaki düşük ph ortamı (Phillippy, 1999) ve peletleme ısısının 75 0 C yi aşması gibi durumlarda (Pointillart, 1993) korunmamış fitaz enzimi aktivitesinde azalma meydana geldiği bildirilmiştir Fitaz Enzimi Aktivitesi ve Fosfor Değerlendirilebilirliğini Etkileyen Faktörler Kanatlı sindirim sisteminde fitaz enzimi aktivitesinin sınırlı kalmasına ilişkin olarak genelde iki neden gösterilmektedir (Zyla ve ark., 2001). Birincisi, fitaz enziminin rasyonlara ilave edilen inorganik fosforla interaksiyonu olup, fitaz enzimi etkinliği ile yemdeki inorganik fosfor düzeyleri arasında negatif korelasyon olduğu bildirilmektedir. Başka bir deyişle rasyon inorganik fosfor

16 7 seviyesi yeterliyse, fitaz enzimi ilavesi önemli bir katkı sağlamamaktadır. Fitaz enzimi sadece yararlanılabilir fosfor (YP) bakımından yetersiz olan rasyonlara katıldığında önemli derecede etkili olmaktadır. İkincisi, yemdeki fitatların tam olarak hidrolize olmayışıdır. Nitekim, deneme yemlerine inorganik fosfor kaynağı ilave edilmeden yeme fitaz enzimi katılmasının piliç performansındaki düşüklüğü gideremediği, yemlerdeki yararlanılabilir fosfor düzeylerinin düşük kalmasının iştahı, dolayısıyla yem tüketimini azalttığı, sonuçta verim performansında ciddi gerilemelere sebep olduğu bildirilmektedir ( enköylü, 2002). Tek mideli hayvanlar için kompleks bir işlem olan fitat fosforunun hidrolizi; rasyonun Ca ve P seviyesi, Ca:toplam P oranı, vitamin D tipi ve seviyesi, yemin işleme şekli ve yapısı, hayvanın yaşı ve cinsiyeti, endojen ve ekzojen fitaz enzimi mevcudiyeti gibi faktörlerden etkilenebilmektedir (Jubarah ve ark, 2004; Angel ve ark., 2005) Rasyonun Ca ve P Düzeyi ile Ca:P Oranı Kanatlılarda fitat fosfor hidrolizini etkileyen en önemli faktörlerden birisi rasyonun Ca ve P düzeyidir. Kalsiyum fosfora oranla daha fazla etkili olmakta, rasyonun yüksek düzeyde Ca içermesi fitat hidrolizini tamamen inhibe edebilmektedir. Sebastian ve ark. (1996b) tarafından yapılan bir çalışmada, P bakımından yetersiz 3 farklı düzeyde Ca (% 0.6, 1.0 ve 1.5) içeren broyler rasyonlarına fitaz enzimi ilave edilmiş (600 U/kg yem), optimum büyüme performansı ve mineral değerlendirilebilirliği, % 0.6 Ca içeren rasyonla elde edilmiştir. McGuaing ve ark. (1972) broyler rasyonlarında Ca düzeyinin % 0.6 dan % 1.5 düzeyine çıkarılmasıyla bağırsaktaki fitaz enzimi aktivitesinin % 75 azaldığını belirlemişlerdir. Bu sonuç, rasyonun Ca düzeyinin yüksek olması durumunda, fitaz enzimi etkinliğinin azalabileceğini göstermektedir. Yüksek Ca seviyesinin fitaz enzimi etkinliğine negatif etkisinde başlıca 3 faktörün rol alabileceği değişik araştırmacılar tarafından ileri sürülmektedir. Bunların, 1) sindirim sisteminde

17 8 Ca un fitatlarla kompleks oluşturmak suretiyle çöküntüye yol açması (Wise, 1983), 2) Ca un bağırsak ph sını artırmak suretiyle mineral çözünebilirliğini ve yararlanılabilirliğini azaltması (Shafey ve McDonald, 1991), 3) Ca un fitaz enziminin etkili olduğu bölgede fitaz enzimiyle yarışmak suretiyle direkt etki yapması (McGuaig ve ark., 1972) neticesinde oluşabileceği bildirilmiştir. Fitat fosfor yarayışlılığına rasyonun Ca:toplam P oranının da önemli bir etkisi olabileceği ve optimum fitaz enzimi aktivitesi için bu oranın 1.1:1 ile 1.4:1 aralığında kalması gerektiği bildirilmektedir (Qian ve ark., 1997). Nitekim broylerler üzerinde yapılan bir çalışmada (0-21.gün) Ca:toplam P oranının söz konusu aralıklarda olması kaydıyla rasyona fitaz enzimi ilavesinin canlı ağırlık (CA), yem tüketimi (YT), kemik külü ile Ca ve P alıkonmasını olumlu yönde etkilediği belirlenmiştir (Qian ve ark., 1997). Ancak bu oranın genişletilmesiyle (1.7:1 ve 2.0:1.0 aralığına) tüm bu parametrelerin olumsuz yönde etkilendiği bildirilmiştir. Rama Roa ve ark. (1999) % 1 Ca içeren rasyonlarla beslenen broylerlerde YP düzeyinin % 0.45 den % 0.30 a düşürülmesi ile canlı ağırlık artışının (3-30. günlerde) % 17.3 gerilediğini, rasyondaki Ca düzeyinin % 0.75 e indirilmesi ile bu kaybın sadece % 6.8 olduğunu ortaya koymuşlardır. Bu çalışmada en iyi performansın Ca:YP oranının 2:1 olması halinde alınabileceğini bildirmişlerdir Vitamin D 3 ve Metabolitleri Vücutta Ca ve P metabolizmasında düzenleyici bir görevi olan vitamin D nin kemiklerin normal kalsifikasyonu için gerekli olduğu çok eskiden beri bilinmektedir. Kanatlı rasyonlarına vitamin D 3 kaynağı olarak genellikle kolekalsiferol katılmaktadır. Son yıllarda vitamin D 3 ün metabolitleri olan 25-hidroksikolekalsiferol (Angel ve ark., 2001; Applegate ve ark, 2003), 1α-hidroksikalsiferol (Biehl ve ark., 1995; Biehl ve Baker, 1997) ve 1.25-dihidroksikolekalsiferol ün (Roberson ve Edwards,1994; Mitchell ve Edwards, 1996a,b; Biehl ve Baker., 1997) kanatlı rasyonlarındaki etkileri de

18 9 araştırma konusu olmuştur. Vitamin D 3 kanatlılarda tek başına fitat fosfor yarayışlılığını artırdığı gibi, fitaz enzimiyle birlikte kullanıldığında söz konusu etki bakımından sinerjik bir katkı sağladığı bildirilmektedir (Qian ve ark., 1997). Angel ve ark. (2001) broyler rasyonlarının kilogramına 500 U Aspergillus ficuum ve 70 µg 25-hidroksikolekalsiferol katılmasının monokalsiyum fosfattan gelen inorganik fosforun % 0.09 una; Mitchell ve Edwards (1996a) ise, 600 U Aspergillus ficuum ve 5 µg dihidroksikolekalsiferol ün dikalsiyum fosfattan gelen inorganik fosforun % 0.20 sine eşdeğer bir katkı sağlandığını ortaya koymuşlardır Yemin Yapısı ve İşlenmesi Fitaz enzimi aktiviteleri bakımından yem maddeleri arasında olduğu gibi bunların çeşitleri arasında da oldukça farklılıklar vardır. Diğer tahıllarla kıyaslandığında buğday ve çavdar kepeğinde endojen fitaz enzimi aktivitesi oldukça yüksektir (Viveros ve ark., 2000; Greiner ve Egli, 2003). Barrier- Guillot ve ark. (1996a,b) endojen fitaz enzimi aktivitesi düşük olan buğday çeşidine göre, yüksek endojen fitaz enzimi aktivitesine sahip buğday çeşidinde P sindirilebilirliğinin yaklaşık % 50 oranında fazla olduğunu bildirmişlerdir. Termal stabilitesi sınırlı olan fitaz molekülünün 60 0 C civarında bir ısıya maruz kaldığında aktivitesinde kayıplar oluşmaya başladığı saptanmıştır (Ullah ve Mullaney, 1996). Cavalcanti ve Behnke (2004) hiçbir ısıya maruz kalmadan elde edilen buğday kepeğinde fitaz enzimi aktivitesinin 5.7 FTU/g olduğunu, bunun 80 0 C ısıya maruz kalması durumunda aktivitenin 0.7 FTU/g a düştüğünü, 90 0 C ısıya çıkıldığında ise aktivitenin tamamen yok olduğunu belirlemişlerdir C ısıya maruz kalma durumunda bile bu yem maddesindeki endojen fitaz enzimi aktivitesinin 3.3 FTU/g a düştüğü bildirilmiştir.

19 Kanatlının Yaşı ve Cinsiyeti Kanatlılarda fitat fosforundan yararlanmayı etkileyen diğer bir faktör yaş olup, civciv döneminde 1/3 olan yararlanma oranı, ergin tavuklarda 1/2' ye yükselmektedir. Bu durum, genç hayvanlara göre yaşlılarda yemin sindirim sisteminden daha yavaş geçmesi (Washburn, 1991; Almirall ve Garcia, 1994), ilerleyen yaşlarda daha fazla tahıl tüketimi sonucu fitaz enzimi aktivitesinin muhtemelen daha yüksek olması veya ticari fitaz enzimi kullanımına daha uygun ph ortamının sağlanması ile açıklanmaktadır (Zyla, 1992; Radcliffe ve ark., 1998). Ayrıca, erkeklerdeki fitat fosfor yarayışlılığının dişilere göre daha yüksek olduğu bildirilmektedir. Nitekim Sebastian ve ark. (1996a), P bakımından yetersiz rasyonlara fitaz enzimi ilavesinin canlı ağırlığı erkeklerde % 13.2, dişilerde ise % 5.8 oranında artırdığını saptamışlardır. Ancak, ergin yumurta tavuklarında yaşlanmayla birlikte fitat fosforundan yararlanmada düşme olduğu bildirilmektedir. Scheideler ve Sell (1987) tarafından yapılan çalışmalarda 34 haftalık yaşta % 46.7 olan fitat fosfor alıkonmasının, 52 ve 72 haftalarda sırasıyla % 16.5 ve % 9.1 olduğu saptanmıştır. Yumurta tavuklarında yaşlanmayla birlikte fitat fosforundan yararlanmada düşme meydana gelmesinin nedeni tam olarak bilinmemektedir Kanatlı Rasyonlarında Fitaz Enzimi Kullanımı Eksojen fitaz enziminin, fitat fosfor yarayışlılığını artırdığı Nelson ve ark. (1968) tarafından ispat edilmesine rağmen, rasyonlara inorganik P katılmasının daha ekonomik olması fitaz enzimi kullanımının sınırlı kalmasında etkili olmuştur. Ancak son yıllarda çevre bilincinin gelişmesi ile birlikte Avrupa nın bazı bölgeleri ve Amerika da fosfor kirliliğini azaltma yönündeki baskıların artması, bu arada gelişen biyoteknoloji sayesinde üretilen ticari fitaz enziminin inorganik fosfora göre ekonomik bakımdan da avantajlı bir hal alması (Bedford, 2000), özellikle domuz ve kanatlılarda fitat

20 11 fosfor yarayışlılığını artırmak amacıyla söz konusu enzimin kullanımını oldukça yaygınlaştırmıştır. Yan ve ark. (2001) broylerlerde 3-6 haftalarda % (% 0.05 aralıklı) aralığında YP düzeyine sahip rasyonlara 800 U/kg fitaz enzimi katılmasının CA, yemden yararlanma oranı (YYO) ve tibia külüne (TK) etkisini araştırmışlardır. Çalışma sonucunda fitaz enzimi ilavesi yapılmayan gruplarda, optimum CA, YYO ve TK değerleri sırasıyla % 0.330, ve düzeylerinde YP içeren rasyonlarla sağlanırken, fitaz enzimi ilavesiyle söz konusu parametrelerde optimum sonuçlara sırasıyla % 0.240, ve düzeylerinde YP içeren rasyonlarla besleme yapılan gruplarda ulaşıldığı bildirilmiştir. Ayrıca, rasyondaki YP düzeyinin düşük olması, dışkıdaki P düzeyinin de belirgin bir şekilde azalmasına neden olmuştur. Broyler rasyonlarına fitaz enzimi ilavesinin fitat fosfor hidrolizi üzerine etkisini belirlemek amacıyla yapılan bir çalışmada (Sohail ve Roland, 1999) % 0.75 Ca, iki farklı YP (% ve % 0.325) ile 3 farklı fitaz enzimi düzeyi (0; 300 ve 600 FTU /kg yem) içeren deneme rasyonları ile % 0.85 Ca ve % YP içeren pozitif kontrol grubu rasyonları karşılaştırılmıştır. Çalışmada, 3-6 haftalar arasında % YP ve % 0.75 Ca içeren rasyonlarla beslenen broylerlerde performans ve kemik dayanıklılığı pozitif kontrole göre olumsuz yönde etkilenmemiştir. Ancak, YP düzeyinin % e, Ca düzeyinin ise % 0.75 e düşürüldüğü rasyonlarla beslenen hayvanlarda CA, YT, YYO ve kemik dayanıklılığında önemli derecede azalma gözlenmiştir. Fitaz enzimi ilavesi düşük düzeyde YP içeren rasyonlarla beslenen hayvanlarda canlı ağırlıkta iyileşmeye yol açmış, fakat normal düzeyde YP içeren rasyonları alan hayvanlarda canlı ağırlığı etkilememiştir. YP düzeyi % olan rasyonlara göre, YP düzeyi % olan rasyonlara fitaz enzimi ilavesinin (300 FTU/kg yem) broylerlerde kemik mineral düzeyi, kemik yoğunluğu, kemik dayanıklılığı ve yaşayabilirlik üzerine olumlu etkisi daha belirgin olmuştur. Çalışma sonucunda azalan düzeylerde YP ve Ca içeren broyler piliç rasyonlarına fitaz enzimi ilavesinin performans

21 12 ve kemik gücünü artırıp, fosfor eksikliğine bağlı semptomları önlediği, ancak 300 ve 600 FTU/kg yem düzeyleri arasında fark olmadığı saptanmıştır. Dilger ve ark. (2004) mikrobiyel fitaz enziminin etkisini belirlemek amacıyla yaptıkları bir çalışmada, broyler civcivler ilk 7 gün NRC nin (1994) önerdiği normal düzeyde Ca ve P içeren rasyonlarla beslenmiş, günler arasında deneme rasyonları uygulanmıştır. Denemede yer alan pozitif kontrol grubuna % 0.5 YP ve % 1 Ca, negatif kontrol grubuna % 0.12 YP ve % 0.51 Ca, 1. ve 2. deneme gruplarına ise negatif kontrol grubuna ilave olarak, sırasıyla 500 ve 1000 FTU/kg yem mikrobiyel fitaz enzimi ilave edilen rasyonlar yedirilmiştir. On dört gün sürdürülen deneme sonucunda fitaz enzimi ilavesinin CA, YT, YYO ve tibia külünü artırdığı belirlenmiştir. Bundan başka, fitaz enzimi ilavesinin fosfor, triptofan ve valin in bağırsak sindirimini yükselttiği, kuru madde, fosfor, azot ve bazı amino asitlerin alıkonmasını artırdığı saptanmıştır. Akyürek ve ark. (2005) tarafından mikrobiyel fitaz enziminin etkisini belirlemek amacıyla broylerler üzerinde yapılan bir çalışmada, pozitif kontrol grubu % 0.45 YP, negatif kontrol grubu % 0.35 YP ve deneme grubu % 0.35 YP+fitaz enzimi (0.5 kg/ton yem) içeren rasyonlarla beslemeye tabi tutulmuştur. Yirmi bir gün (0-3 hafta) sürdürülen deneme sonucunda fitaz enzimi ilavesi canlı ağırlık artışına (CAA) önemli bir katkı sağlamamış, P ve Ca yarayışlılığını önemli derecede (P<0.05) artırmıştır. Bundan başka, fitaz enzimi ilavesiyle ham yağın bağırsak (ileum) sindirilebilirliğinin önemli derecede iyileştiği saptanmıştır. Leske ve Coon (1999) mısır, soya küspesi, buğday, razmol, arpa, pirinç kepeği ve kanola dan oluşan 7 ayrı yem maddesinde fitaz enziminin (600 FTU/kg yem) fitat fosfor hidrolizine etkisini incelemek amacıyla broylerler üzerinde yaptıkları bir çalışmada, % 30.8, 34.9, 30.7, 29.1, 32.2, 33.2 ve 36.7 olan fitat fosfor hidrolizinin fitaz enzimi kullanımı sonucunda, sırasıyla % 59.0, 72.4, 46.8, 52.2, 71.3, 48.0 ve 55.8 e yükseldiği; % 34.8,

22 , 16.0, 31.9, 40.3, 15.5 ve 39.4 olan toplam P alıkonmasının ise fitaz enzimi kullanımı sonucunda sırasıyla % 40.9, 58.0, 33.8, 43.4, 55.5, 26.5 ve 45.7 ye çıktığı belirlenmiştir. Bu araştırmacılar tarafından yumurtacı tavuklar üzerinde yapılan çalışmalarda ise mısır, soya küspesi ve pirinç kepeğinde % 25.7, 23.0 ve 36.1 olan fitat fosfor hidrolizinin fitaz enzimi (300 FTU/kg yem) kullanımı sonucunda sırasıyla % 62.4, 52.0 ve 50.9 a yükseldiği, % 36.8, 28.6 ve 35.9 olan toplam P alıkonmasının ise sırasıyla % 53.4, 44.7 ve 43.0 e çıktığı saptanmıştır. Shirley ve Edwards (2003) tarafından broylerler (0-16.gün) üzerinde yapılan bir çalışmada, pozitif kontrol grubuna % 0.7 toplam P ve % 0.88 Ca, negatif kontrol grubuna % 0.46 toplam P ve % 0.88 Ca, deneme gruplarına ise negatif kontrol grubu rasyonlarına ilave olarak sırasıyla 93.75, 187.5, 350, 750, 1500, 3000, 6000, U/kg yem miktarında fitaz enzimi katılması ile canlı ağırlık artışı 287 g dan 515 g a, yem tüketimi 381 g dan 595 g a, yemden yararlanma oranı den kg a, plazma P düzeyi 2.5 ml/dl den 7.1 mg/dl ye, tibia külü oranı % 26 dan % 41 e, tibia külü miktarı g/tibiadan g/tibiaya, toplam P alıkonması % 51 den % 80 e, fitat P kullanımı % 40 dan % 95 e, N alıkonması % 58 den % 78 e, yemde zahiri metabolik enerji miktarı ise 3216 kcal/kg dan 3415 kcal/kg a çıkmıştır. Negatif kontrol grubunda % 80 olan fosfor yetersizliğine bağlı raşitizm düzeyi ise fitaz enzimi ilavesiyle % 3 e düşmüştür. Viveros ve ark. (2002) broylerlerde farklı YP düzeyi ile fitaz enziminin performans üzerine etkisini incelemek amacıyla yaptıkları çalışmada, başlangıç döneminde (0-3. hafta) kontrol grubuna normal düzeyde (% 0.45) YP içeren rasyon vermişlerdir. Aynı çalışmada deneme grubu rasyonlarına sırasıyla % 0.35 YP; % 0.22 YP; % 0.35 YP+500 U/kg yem fitaz enzimi ve % 0.22 YP+500 U/kg yem fitaz enzimi katılmıştır. Gelişme döneminde (4-6. hafta) ise kontrol grubuna normal düzeyde (% 0.37) YP uygulanmış, deneme gruplarına yine sırasıyla % 0.27 YP; % 0.14 YP; % 0.27 YP+500 U/kg yem fitaz enzimi ve % 0.14 YP+500 U/kg yem fitaz enzimi içeren

23 14 rasyonlar verilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları yetersiz düzeyde yararlanılabilir fosfor içeren rasyonlara fitaz enzimi ilavesinin genelde performans parametrelerini iyileştirdiğini göstermiştir. Broylerlerde fitaz enziminin etkisini araştırmak amacıyla yapılan bir çalışmada, etlik civciv başlangıç yemi, etlik civciv büyütme yemi, etlik piliç geliştirme yemi ve etlik piliç bitirme yemi olmak üzere 4 dönemde pozitif kontrol grubuna sırasıyla % 0.50, 0.45, 0.45 ve 0.42 YP, negatif kontrol grubuna % 0.30, 0.29, 0.26 ve 0.26 YP, 3 deneme grubuna ise pozitif kontrol grubuna verilen YP a ek olarak sırasıyla 300, 500, 700 U/kg yem fitaz enzimi içeren rasyonlar uygulanmıştır. Çalışma sonucunda, normal düzeyde YP içeren broyler rasyonlarına fitaz enzimi ilavesinin pozitif kontrol grubuna göre, CA ve YYO nı önemli derecede artırdığı, deneme gruplarında YT, tibia külünde Ca, P, Mg miktarlarını yükselttiği, karkas randımanı oranını artırdığı, serum P konsantrasyonunu matematiksel olarak yükselttiği saptanmıştır (Midilli ve ark., 2003). Yumurta tavuklarında (72.hafta) yapılan bir çalışmada ise, kontrol grubuna % 0.61 P, birinci deneme grubuna % 0.51 P ve ikinci deneme grubuna % 0.51 P+300 U/kg yem fitaz enzimi içeren rasyonlar verilmiştir. On iki hafta sürdürülen bu deneme sonucunda, rasyonlara fitaz enzimi ilavesinin yumurta verim performansını etkilemediği, ancak P sindirimini artırdığı belirlenmiştir (Azman ve ark., 2005). Mohanna ve Nys (1999) tarafından yapılan bir çalışmada, broyler rasyonlarına bitkisel ve mikrobiyel fitaz enzimi ilavesinin çinko yarayışlılığını artırarak tibia çinko düzeyini yükselttiği belirlenmiştir. Bazı çalışmalarda (Scheideler ve Ferket, 2000; Punna ve Roland, 2001) ise rasyona fitaz enzimi katılmasının tibial diskondroplazi (TD) insidensi ve şiddetini azaltabileceği ileri sürülmüştür. Tibial diskondroplazinin etiyolojisi tam olarak bilinmemekle beraber, bu olgu genellikle hızlı

24 15 büyümenin etkisiyle doğal olarak oluşmaktadır. Nitekim, ülkemizde 42 günlük broylerler üzerinde yapılan bir çalışmada (Yalçın ve ark., 1996) TD insidensinin % 59 olduğu, erkek ve dişi hayvanlar arasında insidens bakımından önemli bir farklılık bulunmadığı bildirilmiştir. Hastalığın oluşumunda çevresel, genetik ve besleme faktörlerinin etkili olduğu da bildirilmiştir (Praul ve ark., 2000). Söz konusu olgu, tibianın üst kısımlarında kondrositlerin normal gelişimini tamamlayamaması sonucu kemiğin eğrilmesiyle ortaya çıkan bacak problemlerinden olup (Whitehead, 2004), önemli ekonomik kayıplara yol açmaktadır Sitrik Asit Fitaz enziminin kanatlılarda fosfor yarayışlılığını artırdığı ve ticari anlamda kullanılabilirliğinin kabul gördüğü bilinen bir durumdur. Ancak fitaz enzimi aktivitesinin bir çok etkene bağlı olarak değişkenlik göstermesinin yanında, yem maliyetini düşürme arayışları gibi sebeplerden dolayı fosfor yarayışlılığını artırıcı alternatif yöntemler geliştirilmeye çalışılmaktadır. Bu alternatif yöntemlerden bir tanesi organik asitlerin kullanımıdır. Özellikle son yıllarda, kanatlı rasyonlarına antibiyotiklerin katılımına getirilen kısıtlamalarla organik asitlerin kullanımının oldukça yaygınlaştığı söylenebilir. Organik asitler yemlerin ve sindirim sisteminin asitliğini artırarak zararlı mikroorganizmaların gelişimi için elverişli ortamı kısıtlar. Ayrıca, vücutta tamamen metabolize olmak suretiyle ekstra enerji sağlayarak etkili olurlar. Organik asitlerin verim performansına etkilerini incelemek amacıyla bir çok çalışma yapılmış olup (Giesting ve Easter, 1985; Patten ve Waldroup, 1988; Skinner ve ark., 1991; Jongbloed ve ark., 2000; Ceylan ve ark., 2003; Saçaklı ve ark., 2006), genellikle olumlu sonuçlar elde edilmiştir. Ancak organik asitlerin fitat fosfor hidrolizini artırıcı etkilerine yönelik araştırmalar oldukça azdır. Sitrik asit, zayıf asiditeye sahip bir organik asit olup, çoğu meyve ve bitkide mevcuttur. Daha çok turunçgil meyvelerinde, özellikle de limonda

25 16 bulunmakta, sitrik asit düzeyi kuru maddede yaklaşık %8 oranına ulaşmaktadır. Sitrik asit ilk kez 1784 de İsveç li kimyacı Carl Wilhelm Scheele tarafından limon suyunun kristalize edilmesiyle izole edilmiş, yine ilk olarak 1860 da İtalya meyve endüstrisinde endüstriyel amaçlı sitrik asit üretimi gerçekleştirilmiştir. Daha sonra C. Wehmer 1893 de penisiliumların şekeri kullanarak sitrik asit ürettiğini bulmuştur. Birinci Dünya Savaşı nedeniyle İtalya turunçgil ihracaatını kesene kadar, sitrik asidin mikrobiyel üretimi ticari anlamda yapılmamış, ancak 1917 de James Currie nin Aspergillus niger türünü keşfinden iki yıl sonra bu tekniğin kullanımı ile endüstriyel manada sitrik asit üretimine geçilmiştir. Hala sitrik asit üretiminin en geniş kullanımı bu yöntemle yapılmaktadır. Sitrik asitler vücutta kreps siklusunda ara ürün olarak ortaya çıkar ve hemen hemen tüm yaşamsal olaylarda rol alır. Ticari amaçlı olarak sitrik asitler daha çok gıdalarda ve bazı içeceklerde koruyucu ve asidik (ekşi) tadlandırıcı olarak kullanılmaktadır. Sitrik asidin kimyasal yapısı ekil 1.4 de gösterilmiştir (Anonim, 2006b). Sitrik asit anhidrus=c 6 H 8 O 7 ekil 1.4. Sitrik asidin kimyasal yapısı.

26 17 Sitrik asidin fitat fosfor hidrolizini artırdığı ilk olarak ratlar üzerinde yapılan çalışmalarla ortaya konmuştur (Shohl, 1937; Pileggi ve ark., 1956). Son yapılan çalışmalarda da P bakımından yetersiz mısır+soya temeline dayalı kanatlı rasyonlarına sitrik asit ilavesinin Ca, P, Zn alıkonmasını artırdığı, TK ve tibia Ca ve P düzeyini yükselttiği bildirilmiştir (Brenes ve ark., 2003). Sitrik asidin mineral değerlendirilebilirliğini artırma mekanizması tam olarak bilinmemekle beraber, bu etkisi hakkında iki ayrı olası görüş ileri sürülmektedir. Birincisi, iyi şelatör özelliği olan sitrik asitlerin sindirim sisteminde Ca ile kompleks yapmak suretiyle, söz konusu mineralin fitatlar üzerindeki olumsuz etkisini (Ca-fitat şelatı oluşumunu) azalttığı, dolaylı yoldan fitatların endojen fitaza daha duyarlı hale gelmesini sağladığıdır (Pileggi ve ark., 1956; Erdman, 1979). İkincisi, sitrik asitlerin sindirim sistemi ph sını düşürerek fitik asitlerin minerallerle çözünmeyen fitat tuzları meydana getirmelerini engelleyip, endojen fitaz enzimi hidrolizine maruz kalmalarını artırarak etkili olduğudur (Cosgrove ve Irving, 1980; Ravindran ve ark., 1995; Maenz ve ark., 1999; Applegate ve ark., 2003). Ancak, sitrik asitler organik asit olup hızla vücuda metabolize olduklarından sindirim sistemine bu yönde önemli bir etkileri olamayacağı da ileri sürülmektedir (Brenes ve ark., 2003) Kanatlı Rasyonlarında Sitrik Asit Kullanımı Boling-Frankenbach ve ark. (2001) sitrik asidin Ca ve P yarayışlılığına etkisini belirlemek amacıyla broylerler üzerinde yaptıkları çalışmada, mısır+soyaya dayalı P bakımından yetersiz (% 0.2 YP) rasyonlara (8-22. gün) % 2, 4, 6 düzeylerinde sitrik asit ilavesinin CA ve TK nü doğrusal orantıda artırdığı saptanmış, ancak Ca bakımından yetersiz (% 0.1 oranında artırılarak oluşturulan ve % aralığında Ca içeren) rasyonlara % 6 oranında sitrik asit ilavesinin CA ve TK ne önemli bir katkı sağlamadığı bildirilmiştir. Snow ve ark. (2004) tarafından erkek broylerler (8-21. günlerde) üzerinde yapılan bir çalışmada, herhangi bir inorganik P kaynağı katılmadan hazırlanan ve mısır+soyaya dayalı % 0.13 YP içeren kontrol grubu

27 18 rasyonlarına % 3 ve 4 oranında sitrik asit ilavesinin fitat fosfor yarayışlılığını artırdığı, CAA ve TK oranını yükselttiği belirlenmiştir. Rafacz-Livingston ve ark. (2005a) % 0.13 ve 0.23 YP içeren broyler rasyonlarına % 4 oranında sitrik asit ilavesinin CA ve TK nü önemli oranda artırdığını belirlemişlerdir. Yararlanılabilir fosfor oranı % 0.18 ve 0.28 olan rasyonlara % 3 sitrik asit ilavesinin de TK nü önemli oranda artırdığı, ancak bu etkinin % 0.18 YP içeren grupta daha fazla olduğu gözlenmiştir. Ayrıca, % 0.18 YP içeren ticari broyler rasyonlarına sırasıyla % 1, 2, 3 ve 4 oranında sitrik asit ilavesinin doğrusal olarak TK nü artırdığı, % 3 sitrik asit ilavesiyle söz konusu bu artışın % 41 olduğu saptanmıştır. Mısır+soyaya dayalı P bakımından yetersiz (% 0.35 ve % 0.25) iki farklı düzeyde YP içeren broyler rasyonlarına % 2 oranında sitrik asit ilavesinin Ca, P ve Zn alıkonmasını sırasıyla % 3, 3 ve 4 oranlarında artırdığı, TK, tibia Ca ve P oranlarını % 2 yükselttiği, plazma Ca, Mg ve Zn düzeylerini sırasıyla % 10, 4 ve 5 oranlarında artırdığı, alkalin fosfataz aktivitesini ise % 13 kadar azalttığı belirlenmiştir (Brenes ve ark., 2003). Broylerler üzerinde yapılan bir başka çalışmada ise (Boling ve ark., 2000a), mısır+soyaya dayalı P bakımından yetersiz (% 0.1 YP) rasyonlara % 6 sitrik asit ilavesinin TK nde % 43, CA ta ise yaklaşık % 22 oranında artış sağladığı belirlenmiştir. Diğer taraftan, % 6 sitrik asitle birlikte fitaz enzimi ilavesinin (1450 U/kg yem) performansa pozitif bir etki yaptığı bildirilmiştir. Boling ve ark. (2000b) tarafından yumurtacı tavuklar üzerinde yapılan bir çalışmada, % 3.8 Ca ve % 0.1 YP içeren negatif kontrol grubu rasyonlarına % 1, 2, 3 ve 4 oranında sitrik asit ilavesi ile performans kriterleri bakımından negatif kontrol grubuna benzer sonuçlar alındığı, bulguların % 0.45 YP içeren pozitif kontrol grubuna göre ise önemli derecede düşük bulunduğu bildirilmiştir.

28 19 elat yapan bileşiklerle (sitrik asit, malik asit, glikoz) fitaz enziminin kombine etkisini belirlemek amacıyla in vitro olarak yapılan bir çalışmada (Ekholm ve ark., 2003), sitrik asit+fitaz enzimi kombinasyonunun kalsiyum, magnezyum, çinko ve manganın yarayışlılığını artırdığı, potasyumun yarayışlılığına ise herhangi bir etkisinin olmadığı belirlenmiştir. Bu araştırmada, broyler rasyonlarına fitaz enzimi ve sitrik asit katmak suretiyle bitkisel yem maddelerinde bulunan fitat fosforundan yararlanmayı artırmak, söz konusu yem katkı maddelerinin broylerlerde verim performansının yanında kalsiyum, fosfor, çinko ve mangan elementlerinin yarayışlılığı ile kanatlı yetiştiriciliğinde önemli bir metabolizma hastalığı olan tibial diskondroplazi insidensi üzerine etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.

29 20 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. GEREÇ Hayvan Materyali Araştırmada toplam 400 adet karışık cinsiyette günlük yaşta Ross 308 broyler civciv kullanılmıştır. Araştırma her biri 80 adet broyler civcivden oluşan 1 pozitif kontrol, 1 negatif kontrol ve 3 deneme grubu olmak üzere toplam 5 grup halinde yürütülmüştür. Her bir grup, her birinde 20 şer civciv bulunan 4 tekrar grubundan oluşturulmuştur Yem Materyali Araştırmanın civciv döneminde (0-3 hafta) % 22 ham protein ve 3100 kcal/kg metabolik enerji ile % 1.00 kalsiyum, % 0.67 toplam fosfor ve % 0.45 yararlanılabilir fosfor; piliç döneminde (4-6 hafta) ise % 20 ham protein ve 3200 kcal/kg metabolik enerji ile % 1.00 kalsiyum, % 0.57 toplam fosfor ve % 0.36 yararlanılabilir fosfor içeren pozitif kontrol grubu (PK) rasyonları hazırlanmıştır. Negatif kontrol grubu (NK) rasyonları ise, pozitif kontrol grubunun tüketeceği rasyonun enerji ve protein düzeylerinin korunmasına özen gösterilerek, civciv döneminde (0-3 hafta) % 0.53 toplam fosfor ve % 0.31 yararlanılabilir fosfor; piliç döneminde (4-6 hafta) ise % 0.43 toplam fosfor, % 0.22 yararlanılabilir fosfor düzeyi olacak şekilde hazırlanmıştır. Toplam fosfor:kalsiyum oranını pozitif kontrol grubuna benzer bir seviyede tutmak için bu grubun kalsiyum düzeyi civciv ve piliç döneminde % 0.78 e düşürülmüştür. Fitaz enzimi ve sitrik asidin fitat fosfor yarayışlılığına yönelik araştırmalarda, her iki katkı maddesinin de rasyona ilave edilmesi durumunda yemde inorganik fosfor düzeyinin % 0.10 civarında azaltılabileceği yönünde bildiriler nedeniyle, bu çalışmada pozitif kontrol grubuna göre negatif kontrol ve deneme gruplarında rasyon yararlanılabilir fosfor düzeyi civciv ve piliç dönemlerinde % 0.14 oranında düşük tutulmuştur.

30 21 Fitaz enzimi (F), sitrik asit (SA) ve fitaz enzimi+sitrik asit (F+SA) ten oluşan deneme grubu rasyonları ise, negatif kontrol grubu rasyonlarına sırasıyla 500 U/kg fitaz enzimi, % 2 sitrik asit ve 500 U/kg fitaz enzimi+% 2 sitrik asit ilavesi yapılarak hazırlanmıştır. Karma yemler Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı Deneme Ünitesi nde hazırlanmıştır YÖNTEM Deneme Hayvanlarının Beslenmesi ve Deneme Süresi Araştırma, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı Deneme Ünitesi nde gerçekleştirilmiştir. Her bir bölmedeki hayvanlara grup yemlemesi uygulanmış ve tüketebilecekleri miktarlarda yem ve su sürekli olarak önlerinde hazır bulundurulmuştur. Deneme 42 gün sürdürülmüştür. Denemede altlık olarak odun talaşı kullanılmış ve aydınlatma gündüz gün ışığı, gece normal ampullerle sağlanmıştır. Denemede 24 saatlik aydınlatma planı uygulanmıştır. Ortamın ısıtılmasında elektrikli ısıtıcılardan yararlanılmıştır. Kümes sıcaklığı ilk üç günde 32 0 C (± 1 0 C) de tutulmuş, daha sonra bu sıcaklık kademeli olarak azaltılarak 14. günde 25 0 C ye, daha sonra 20 0 C ye düşürülmüş ve bu sıcaklık araştırmanın sonuna kadar sürdürülmüştür. Denemenin 0-7. günleri arasında plastik civciv yemlikleri, günleri arasında ise oluklu metal yemlikler kullanılmıştır. Hayvanların içebileceği kalitedeki su plastik suluklarda sürekli olarak hayvanların tüketimine sunulmuştur. Deneme süresince günlük olarak ölümler olası nedenleri ile kaydedilmiştir.

31 Araştırma Rasyonlarının Hazırlanması Araştırma rasyonlarının formulasyonu civcivlerin besin madde gereksinimleri dikkate alınarak hazırlanmıştır. Karma yemlere fitaz enzimi, sitrik asit ve diğer yem katkı maddeleri ilavesi, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı Deneme Ünitesi nde gerçekleştirilmiştir. Rasyonların kimyasal bileşimi Çizelge 2.1 de gösterilmiştir. Çizelge 2.1. Araştırmada kullanılan rasyonların bileşimi, (%) Gruplar (0-3 hafta) Gruplar (4-6 hafta) Yem maddeleri Pozitif kontrol % Negatif kontrol % Fitaz Enzimi % Sitrik Asit % Fitaz Enzimi + Sitrik Asit % Pozitif kontrol % Negatif kontrol % Fitaz Enzimi % Sitrik Asit % Fitaz Enzimi + Sitrik Asit % Mısır Soya küspesi (%44 HP) Tam yağlı soya Bitkisel yağ Kireç taşı ,40 1,40 1,40 1, DCP 1,50 0,70 0,70 0,70 0,70 1, ,30 Tuz Vitamin karması Mineral karması Metiyonin Antikoksidiyal Fitaz Sitrik asit Toplam Kimyasal kompozisyon Hesapla bulunanlar ME, kcal/kg Ham protein, % Ca, % Toplam P, % Yararl. P, % Metiyonin+sistin,% Lizin, % Brovit Vitamin ticari isimli vitamin premiksi: Her bir kilogram vitamin karmasında IU Vitamin A, IU Vitamin D 3, 30 g Vitamin E, 3 g Vitamin K 3, 2 g Vitamin B 1, 5 g Vitamin B 2, 40 g Niasin, 12 g Kalsiyum-D-Pantotenat, 5 g Vitamin B 6, g Vitamin B 12, 0.75 g Folik asit, 0.05 g Biotin, 50 g Vitamin C içermektedir. 2 İntemin K 750 ticari isimli mineral premiksi: Her bir kilogram mineral karmasında 160 g Mangan, 120 g Demir, 120 g Çinko, 10 g Bakır, 0.4 g Kobalt, 2 g İyot, 0.3 g Selenyum içermektedir. 3 Natuphos 500-BASF ticari isimli fitaz enzimi: Her bir kilogram yeme 500 IU enzim aktivitesi sağlamaktadır. 4 Citrabold-Sitric-Acid Anyhydrus ticari isimli sitrik asit.

32 Karma Yemlerin Besin Madde Miktarlarının Belirlenmesi Araştırmada kullanılan karma yemlerin besin madde miktarları Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı ile Türkiye Atom Enerjisi Kurumu Sarayköy Nükleer Araştırma ve Eğitim Merkezi Laboratuvarları nda AOAC de (1984) belirtilen yöntemlere göre belirlenmiştir. Metabolize olabilir enerji düzeylerinin hesaplanmasında TSE nin (1991) önerdiği formül kullanılmıştır. Kalsiyum düzeyleri atomik absorbsiyon spektrometrede (Thermo, M Series v1,23), P düzeyleri ise spektrofotometrede (Shimatzu 770 CL, Serial no:u ) belirlenmiştir Canlı Ağırlık ve Canlı Ağırlık Artışının Belirlenmesi Canlı ağırlık artışının belirlenmesi amacıyla, denemenin başında ve deneme süresince haftada bir kez (7, 14, 21, 28, 35 ve 42. günlerde) yapılan tartımlarla canlı ağırlıklar belirlenmiştir. Tartımlar arasındaki farktan canlı ağırlık artışları hesaplanmıştır Yem Tüketimi ve Yemden Yararlanma Oranının Belirlenmesi Yem tüketiminin belirlenmesi amacıyla her alt grubun bir hafta içerisinde tükettiği yem miktarı, o hafta içerisinde her alt gruba verilen toplam yem miktarından çıkartılarak her alt grubun bir hafta içerisinde tükettiği yem miktarı bulunmuştur. Bu miktar alt gruplar ve gruplar itibariyle mevcut hayvan sayısına bölünerek yem tüketimleri, alt grupların ve grupların ortalamaları olarak hesaplanmıştır. Hayvanların, deneme başlangıcından itibaren iki tartım aralığında tükettikleri ortalama yem miktarı, yine bu iki tartım aralığında belirlenen ortalama canlı ağırlık artışına bölünerek yemden yararlanma oranları hesaplanmıştır.