* Bu çalışma Tarım, Orman ve Köyişleri Bakanlığı tarafından desteklenmiştir. Erol Alaçam. 1, D. Ali Dinç2, Mehm.et Güler2 Saffet Eröz3, A.

Transkript

1 Selçuk Üniversitesi Vet. Fak. Dergisi Cilt: 4, Sayı: ı (9ı- 98), ı988 ANÖSTRÜS DÖNEMİNDE PROGESTAGEN (MAP), PMSG ve GnRH İLE- senkronize EDİLEN KOYUNLARDA RADYOİMMUNOASSAY (RIA) YÖNTEMİ İLE ERKEN GEBELİK TANISI ÜZERİNDE ÇALIŞMA* Erol Alaçam. 1, D. Ali Dinç2, Mehm.et Güler2 Saffet Eröz3, A. Nuri Sezer4 Radioimmunological Diagnosis of Early Pregnancy in Ewes That Previously Synchro~ised by MAP, PMSG and GnRH Hormones Sum.m.ary: In this study ear?y pregnanq diagnosis rate w as de termine d in ewes that previousb synchronised by MAP, P MSG and GnRH and bred naturalb in late anestrous season. Four~y Merino ewes, 5 years old, were usedas materials. Jugular blood samples were collected on 15 th, 16 th and 17 th days, after breedings. Samples were santrifuged in 2000 rp m and plasmas were stored at -20 oc until assay procedures. For the earb pregnanry diagnosis, plasma progesterone and oestradiol 17 ~ levels were determined by RIA method. For this purpose, Mini assay ~ype Gamma counter and ı ıs I Progesterone and Oestradiol 17 ~ assay kits were used. Laboratory results were controlled with lambing results. As a conclusion, the high rate of correct diagnosis were obtained in pregnant and nonpregnant ewes, o/ 0 and % respective?y. While progesterone values were useful for earb diagnosis, oestradiol values were not elear enough to decide the diagnosis. Özet: Bu ;alışmada ge; anöstrüs döneminde MAP, P MSG ve GnRH hormonları ile ova~yunı fonksiyonları 11:yarılıp, doğal aşımla gebe bırakılan koyunlarda, RIA yö'ntemi ile erke1 gebelik tanısı şansları araştırıldı. * Bu çalışma Tarım, Orman ve Köyişleri Bakanlığı tarafından desteklenmiştir. ı Prof.Dr., Selçuk Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Konya. 2 Arş.Gör., Selçuk Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Konya. 3 Vet.Hek., Hayvancılık Merkez Araştırma Enstitüsü, Konya. 4 Uzm.Dr., Özel Nükleer Tıp Merkezi, Konya.

2 9~ Erol Alaçam- D. Ali Dinç-Mehmet Güler- Saffet Eröz- A~ Nuri Sezer Araştırmada mate~yal olarak 40 adet, 5 yaşlı, Aferinos ırkı koyun kullanıldı. Aşımları izleyen 15., 16. ve 17. günlerde jugular kan iirnekleri alınarak plazmaları ık artıldı ve topluca işlenrnek üzere -20 oc derecede derin dondurucıtda saklandı. Gebelik tanısı amacıyla plazma progesteron ve ô'stradiol 17~ yoğunlukları RIA ile araştırıldı. Assay falışmalarında Gamma sayıcı ( Mini-assay, tip 6~20) ile ı2s I Progesteron. ve Östradiol 17 ~ direk hormon analiz kitleri kullanıldı. Hormonanalizlerine göre, progesteron yoğunluğu 2ng 1 ml den yüksek olanlar gebe, düşük olanlar ise gebe değil olarak tanımlandılar. RIA bulguları doğumlar beklenerek karşılaştırmalı olarak değerlendirildi. Çalışma sonunda progesteron değerlerine b akılarak gebe olanlarda o/ , gebe olmayanlarda ise'% oranında bir doğrulukla tanı yapmak mümkiin oldu. Östradiol 17 ~ değerleri ise tek başına tanıya yardımcı olabilecek farklılıklar göstermedi. Giriş Evcil hayvanlarda gebelik tanısı ekonomik yönden büyük önem taşır. Özellikle aşım sezonu kısa süren koyunlarda gebeliğin ya da daha doğru bir yakhışımla gebe kalmayanların erken tanısı önemlidir. Bu sayede gebe kalmamış olanların gebe bırakılınaları için gerekli özenin gösterilmesi mümkün olur. Gebelik tanısı koçun sürü içinde serbest dolaştığı durumlarda önemsenmeyebilir. Ancak modern yetiştiricilikte, kontrollu üremenin yapıldığı sürülerde, koçun kıymetli ve sayıca yetersiz olduğu durumlarda ve sun'i tohumlama uygulamalarında büyük değer taşımaktadır. Çeşitli araştırıcılar (3, 5, 6, ll), koyunlarda gebelik tanısı amacıyla yirmi den fazla yöntem bildirmekle birlikte, Memon ve Ott (3), bunlar arasında en erken ve inanılır tanı şansı verenleri, immunolojik yöntemler, ultrases dalgaları, rekto-abdominal palpasyon ve vaginal biyopsi olarak ileri sürmektedirler. İmmunolqjik yöntemlerden radyoimmunoassay (RIA) ile yapılan çalışmalarda, özellikle gebe olmayan koyunların tanısında o/ 0 90 ın üzerinde bir doğruluğa ulaşılmaktadır (ll). MacDonell (2), aşıını izleyen 15. günde, plazma progesteron yoğunluğunu gebe koyunlarda 4.81 ng 1 ml, gebe olmayanlarda ise 1.41 ng 1 mi olarak belirlemiş tir. Özsar (4), 35 adet Ankara keçisi üzerinde yaptığı çalışmada, östrüs sırasında progesteron düzeylerini ortalama 0.45 ng /ml, lutcal

3 Radyoimmunoassay (RIA) Yöntemi İle Erken Gebelik Tanısı evreele ise en yüksek 3.45 ng 1 ml olarak saptamı tır. Ara tırıcı 21. günde progesteron yoğunluğu 1.5 ng 1 ml ve yüksek olanları gebe olarq;k kabul ederek yüksek oranda doğrulukla tanı koyahildiğini bildirm,ektedir. Thimoiner ve ark. (9), koyunlardan a Jmı izleyen 18. günde top kan örneklerinde progesteron hormonu düzeylerini ara tı ladıkları rarak, gebe olanlarda o/ , gebe olmayanlarda ise 0 /o 100 oranında doğru tanı ya ula mı lardır. Yapılan bir diğer ar a tırmad a ( 1), 46 koyunda a ımı iz~eyen 18. ve 70. günlerde plazma progesteron yoğunlukları ara tırılarak, sırasıyla o/ 0 80 ve % 94 oranlarında gebelik tanısj yapıldığı ileri sürülmektedir. Tamaini ve ark. (8), koyunlarda gebeliğin ilk gününde plazmadaki total östron yoğunluğunun saptarramayacak kadar dü ük olduğunu belirtirlerken, IAEA (1) 'nın hazırladığı RIA laboratuvar teknikleri kitaqında, koyunlarda östron sülfat düzeylerinin ara tırılması ile gebelik tanısı konusunda henüz kesin sonuçlar elde edilemediği ileri sürülmektedir. Gebeliğin daha ileri dönemlerinde yapılan çalı malarda ise; Thimoiner ve ark. (9), koyunlarda gebeliğin günlerinde plazma östrojen düzeylerini ölçmü ler, 0.3 ng 1 ml. den yüksek olanları gebe kabul ederek o/ 0 99 a varan bir isabet elde etmi lerdir. Sunulan çalı manın amacı ise, anöstrüs döneminin sonunda ovaryum fonksiyonları egzogen hormonlada uyarılan koyunlardan doğal a ımları izleyen günlerde toplanan kan örneklerinde progesteron ve östradiol 17 B düzeylerinin ölçülmesi ile erken gebelik tamsı anslarını ara tırmaktır. 1- M ate?~yal : Materyal ve Metot Bu çalı ma Tarım, Orman ve K.öyi leri Bakanlığı, Konya Hayvancılık Merkez Ara tırma Enslitüsü'ne ait 40 adet koyun ~zerinde yapıldı. Merinos ırkından olan bu hayvanlar 5 ya lı olup, ortalama 3 _do~ ğum yapmı lardı. Ara tlrmada cüsse olarak birbirlerine yakın hayvan~ ların seçilmesine özen gösterildi. Koyunların bakım ve beslenme artları normaldi ve seksüel siklusların kontrolu için hormon uygulamalarından önce ve uygulamalar

4 94 Erol Alaçam- D. Ali Dinç-Mehmet Güler- Saffet Eröz- A. Nuri Sezer sırasında ek kesif yem verildi. Yetiştirmede taze sperma ile sun' i tohumlama uygulandığı halde 0eneme hayvanianna dcğal aşım yaptırıldı. 2- kfetot: 2-1. Senkronizasyon ve tohumlama çalışmaları: Çalışma materyali 10 ar koyunluk dört gruha ayrılarak; 1. Gruba: GnRH*, 250 (.Lg i.m. (tek enjeksiyon) uygulandı 2. Gruba: MAP** (medroxyprogesteronacetate), vaginal (13 gün) uygulandı 3. Gruba: MAP UI PMSG*** i.m. uygulandı 4. Gruba: Hiçbir uygulama yapılmadı (Kontrol) Hormon uygulamalarına 1987 Temmuz ayının son yarısında başlandı ve bir taraftan hormon düzeylerinin RIA ile ölçülmesiyle diğer taraftan da grupl~r arasına koç katılarak, bu hayvanların anöstrüste oldukları garanti altına alındı Kan örneklerinin toplanması: Deneme hayvanlarından jugulaı kan örnekleri, aşımları izleyen 15, 16. ve 17. günlerde toplandı. Alınan örnekler 2000 rpm de 20 dakika santrifüje edilerek plazması ayrıldı ve özel plastik assay tüplerine aktarıldı. Örneklemeler tamamlanıncaya kadar kan plazmaları -20C derecede, derin dondurucuda saklandı RIA Çalışmaları: Tüm örnekler toplandıktan sonra K.onya Özel Nükleer Tıp Merkezinde RIA yöntemi ile plazma progesteron ve östradiol 17 ~ düzeyleri tayin edildi. RIA çalışmalarında; Gamma sayıcı (Mini-assay tip, 6-20), derin dondurucu, vorte~s mikser, su banyosu (37 C dereceye ayarh), yaıı ve tam otomatik ayarlanabilir socorex pipetler ( ml) ve aksesuar laboratuvar alteleri ile,. * Fertagyl, enj.sol, Intervet, Hollanda, ** Veramix, sponge, 60 mg, Upjohn, İngiltere. *** Folligon, amp., 1000 UI, Intervet, Hollanda.

5 Radyoimmunoassay (RIA) Yöntemi İle Erken Gebelik Tanısı ızsı Progesteron Analiz Kiti, IMM 1024**** I.25I Östradiol 17 ~ analiz Kiti, IMM 1018**** direkt hormon analiz kitleri kullanıldı. RIA çalışmaları IAEA ( 1) 'nın tarif ettiği şekilde yürütüldü Bulguların değerlendirilmesi: Hormon düzeylerinin ölçülmesinden sonra, deneme hayvanlarımn doğumla:cı beklendi ve laboratuvar bulguları ile karşılaştırılarak doğru tanı oranları belirlendi. Bulgular Toplam 40 adet koyunda, gebelik tanısı an1acıyla belirlenen plazma progesteron ve östradiol 17 ~ değerleri ve diğer çalışma bulguları tablolar ve grafikler biçiminde sunulmuştur. Tablo ı. Gebe ve gebe olmayan koyunlardaki progesteron ve ös tradiol ı 7 ~ değerleri (ı 7. gün). Gebe Hormon (+) Gebe değil (-) n min. max. ort. n min. max. 1 ort , Progesteron (ngfml) lo Östradiol 117B (pg/ml) lo Tablo 2. Gebe koyunlarda örnekleme günlerine göre progesteron ve östradiol 17B değerleri. Hormon n Günler Ortala Progesteron (ng/ml) Östradiol 17B (pgfml) Tablo 3. Gebelik tanısı doğruluk oranları. yönünden RIA testinin ı Hormon -ı-gebe(+)_, Gebe değil(-) ı ~--P_ro~g~e_st_er_o_n ~--~~~0 _8_4_._6_2 ~--- 0 ~;~~8_5_.7_2 ~ **** lmmuchem Corp., A.B.D.

6 96 Erol Alaçam- D. Ali Dinç-Mehmet Güler- Saffet Eröz- A. Nuri Sezer.-. GEBELiK + o-o GEBELiK -. /' Aşı mı ız!eye n günler Grafik 1, Progesteron hormon u eğrileri -- GEBELiK + o--o GEBELiK- ~ o_ C' c---- o (""") o u d L o N lfl o $2 o Aş ımı izleyen günler 17 1~ Grafik 2. Östradiol 17~ hormonu eğrileri.

7 Radyoimmunoassay (RIA) Yöntemi İle Erken Gebelik Tanısı Tartışma ve Souç Modern koyun yetiştiriciliğinde parasal yönden önemli biı yeri olan erken gebelik tanısı konusunda, RIA yönteminin değişik birçok çalışmada o/ 0 90 ın üzerinde bir doğrulukla kullanıldığı bildirilmektedir (1, 4, ll). Bu arada özellikle gebe olmayan hayvanların t~nısında başarı oranının daha da yüksek olduğu ileri sürülmektedir ( 14). l.iteratür çalışmalarda (2, 4, 7), daha çok gebeliğin günleri ata:. sında progesteron hornıonu ölçümleri yapılarak, gebe koyunlarda 4 ng 1 ml veya daha yüksek, gebe olmayanlarda ise l ng/ ml den daha düşük olarak ( ng 1 ml) değerler elde edilmiştir. Sunulan ça:.. lışmada da plazma progesteron hormon u düzeyleri, ı7. günde, gebe olanlar için ort , gebe olmayanlar için ise ort ng 1 ml olarak belirlenmiştit. Çahşm~a sırasında 2 ng 1 ml den yüksek değerler gebe, bundan düşük olanlar ise gebe değil şeklinde tanımlanını tır. Bazı aıaştırıcılar (8, 9, 10), östradiol 17 ~ düzeylerinin tayini ile gebelik tanısı konusunda, erken gebelikte sonuç alınamıyacağını, ancak 100. günden sonra tanıda yardımcı olabil.eceğini ileri sürmektedirler. Sunulan çalışmada 17. günde östradiol 17 ~ düzeyleri, geb~lerde ort pg 1 ml, gebe olmayanlarda ise ort pg 1 mj olarak belirlenmiştir. Östrüse yakın, östradiol 17 B düzeyinin yükseleceği_ vaısayımlyla, gebe olmayan koyunların tanınması amacıyla yaj?ılan bu ölçümlerde, gebe olanlarla olmayanlar sadeec östradiol değerlerine bakılarak ayırt edilememiştir. Araştırıcılar ( 4, 9, ll), RIA yöntemiyle progesteron yoğunl~ğunu ölçerek doğru gebelik tanısı oranlarını, gebelerde % 85 gebe olmayanlarda ise o/ olarak bildirmektedirler. Bu çalışmada da gebe olanlarda % 84.62, gebe olmayanlarda o/ oranında doğru tanı konulabilmiştir. Bazı araştırıcıların ( 1, 9), gebelik ilerledikçe ve özellikle 60. günden sonra progesteron hormonu yoğunluğunun artmasına paralel olarak daha belirgin sonuçlar alınabileceğini öne sürmelerine karşılık, özellikle yerli koyun Jrklarının aşım sezonu içinde az sayıda seksü,el siklus gösterdikleri ve gebelik tanısında amacın, gebe olmayanların mümkün olduğunca erken tanınması olduğu göz önünde tutulursa, araştırmaların hemen tamamı, bu çalışmada da yapıldığı gibi, aşıını izleyen günler arasında yoğunlaştırılmaktadır. Sunulan çalışmada, seksüel siklusların senkronizasyonuna ve uygulanan harmoniara ilişkin olarak, gebelik tanısı amacıyla aranarak

8 98 Erol Alaçam- D. Ali Dinç-Mehmet Güler- Saffet Eröz- A. Nuri Sezer belirlenen hormon değerleriyle, normal olarak sezon içinde gebe bırakılanlar için literatürde belirtilen değerler arasında önemli bir fark görülmedi. Buna karşılık senkronizasyon işlemi hayvanlardan yapılan örneklemeler yönünden büyük kolaylıklar sağlamıştır.!(ontrol grubundaki koyunlarda ise henüz aşım sezonuna girmediklerinden plazma hormon yoğunlukları O. 1 ng /ml den düşük değerler göstermiştir. Sonuç olarak, 40 koyun üzerinde erken gebelik tanısı anıacıyla yapılan bu çalışmada, aşıını izleyen 17. gündeki rakamlar göz önünde tutularak, gebe olanlarda % 84.62, gebe olmayanlarda ise 0 / oranında bir doğrulukla gebelik tanısı sağlanmıştır. RIA ile hormon tayinlerinin değerlendirilmesinde progesteron hormonu düzeyleri tanıyayardımcı bulgular verirken, östradiol 17 ~ düzeyleri ancak progesteronla birlikte değerlendirilebilecek farklılıklar göstermiştir. Kaynaklar ı. International Atom.ic Energy Ageney (ı984) Laboratoıy Training lvfanual on Radioimmunoassay in Animal Reproduction, Technical Report Series, No: 233, Vienna. 2. MacDonell, H. (ı976) Peripheral plasma progesterone in the ewe: It' s application to the diagnosis of early pregnanq following synchronisation treatment, Irish Vet. J., 30, ı ı, ı5. 3. Mem.on, M.A. and Ott, R.S. ( ı980) Methods of pregnancy diagnosis in.sheep and goals, Corr:ell vet., 70, Özsar, S. ( ı983) Ankara keçilerinde erken gebelik tayini ve fertilite kontrolunda radioimmunoassay ( RIA) ile progesteron düzeylerinin saptanmas : RIA tekniğinin keçi serumu için geçerliliğinin kontrolu, Doktora Tezi, Hacettepe Üniversitesi, Ankara, Richardson, C. (ı972) Pregnancy diagnosis in the ewe: A review, Vet. Rec., 90, Robertson, H.A., Chan, j.s.d., Hackett, A.j., Marcus, G.j. and Priesen, H.G. (ı980) Diagnosis of pregnancy in the ewe at mid-gestation, Anim Reprod.Sci., 3, Swenson, M.J. (ı977) Duke's Physiology of Domestic Animals, 9th Ed., Cornell Univ. Press, London, 9ı4. 8. Tam.anini, C., Chiesa, F., Parandi, A. and Galeati, G. (ı 986) Estrone and estrone conjugate plasma levels throughout pregnancy in the goat : Their determination as a pregnancy diagnosis test, Anim. Reprod. Sci., ll, Thim.oiner, j.m., Bosc, M., Dijane, j., Martel, J. and Terqui, M. (ı977) Hormonal diagnosis of pregnancy and number of fetuses in sheep and goats, Symposium of Management of Reproduction in Sheep and Goals, University of Wisconsin, Madison, ıo. Thorburn, G.D., Nicol, D.A., Bassett, j.m., Scgutt, D.A. and Cox, R.I. (ı972) Parturition in the sheep and goat: Changes in corticosteroids, progesterone, oestrogens and prostaglandin, F. J. Reprod. Fert., ı6, 6ı-84. ı ı. West, D.M. (ı980) Pregnancy diagnosis in the ewe, (As quated), D.A. Morrow, Editor, "Current Therapy in Theriogenology", vv.b. Saunders, London,