T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ. Bitki Koruma Anabilim Dalı (DOKTORA TEZİ)

Transkript

1 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Bitki Koruma Anabilim Dalı (DOKTORA TEZİ) BATI ANADOLU BÖLGESİ DOMATES ÜRETİM ALANLARINDA GÖRÜLEN STOLBUR HASTALIĞININ YAYGINLIĞININ BELİRLENMESİ, TANILANMASI VE TAŞINMA YOLLARI ÜZERİNDE ÇALIŞMALAR Nilay ÖZDEMİR Sunuş Tarihi : 11 Ocak İZMİR

2 II

3 III Nilay ÖZDEMİR tarafından DOKTORA TEZİ olarak sunulan Batı Anadolu Bölgesi Domates Üretim Alanlarında Görülen Stolbur Hastalığının Tanılanması, Yaygınlığının Belirlenmesi ve Taşınma Yolları Üzerinde Çalışmalar adlı bu çalışma, Lisansüstü Eğitim ve Öğrenim Yönetmeliği nin 12 inci madde ( c ) ve ( d ) bentleri ve Enstitü yönergesinin ilgili hükümleri dikkate alınarak; Jüri Başkanı: Prof.Dr. Hikmet SAYGILI Raportör: Yrd. Doç.Dr. Hüseyin TÜRKÜSAY Üye : Prof. Dr. Yusuf KARSAVURAN Üye : Prof. Dr. Fikrettin ŞAHİN Üye : Doç. Dr. Yeşim AYSAN tarafından değerlendirilmiş olup, yapılan Tez Savunma Sınavında aday oy birliği/oy çokluğu ile başarılı bulunmuştur.

4 IV

5 V ÖZET Batı Anadolu Bölgesi Domates Üretim Alanlarında Görülen Stolbur Hastalığının Yaygınlığının Belirlenmesi, Tanılanması ve Taşınma Yolları Üzerinde Çalışmalar. ÖZDEMİR, Nilay Doktora Tezi, Bitki Koruma Anabilim Dalı Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Hikmet SAYGILI Ocak, 2008, 133 sayfa. Domates Dünya da ve Türkiye de geniş ekim alanlarında üretimi yapılan önemli bir sebzedir. Domates stolbur hastalığı da fitoplazmaların neden olduğu önemli hastalıklardan biridir. Bu hastalık nedeniyle bazı bölgelerde özellikle sanayi domatesi üretiminde zaman zaman önemli ürün kayıpları meydana gelmektedir. Bu çalışmada, domates stolbur hastalığı nın ülkemizdeki yaygınlığını belirlemek, önemli belirtilerini ortaya koymak, tarlada yayılma yollarını belirlemek ve hastalığın erken teşhisi için patojenin genetik profillerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla, ülkemizde domates üretiminin yoğun olarak yapıldığı Batı Anadolu Bölgesi nde domates stolbur hastalığı nın yoğun olarak görüldüğü Bursa ve Çanakkale illerinin domates üretimi yapılan ilçe ve köylerinde yılları arasında toplam 4 üretim sezonunda,

6 VI Haziran- Eylül ayları arasında survey yapılmıştır. Araziden toplanan stolbur hastalığı belirtisi veren domates bitkileri, domates tohumları, yabancı otlar ve böcekler materyal olarak kullanılmıştır. Domates bitkisi, yabancı otlar ve böceklerden genomik DNA elde edilerek PCR yöntemi ile P1/P6, P1/P7 üniversal primer setleri kullanılarak stolbur hastalığına neden olan fitoplazmanın tanılaması yapılmıştır. Çalışmalarımız sonucunda, domates stolbur hastalığının, Bursa ili Karacabey, Yenişehir ilçeleri ve köylerinde, Çanakkale ili Biga ilçesi ve köylerinde yoğun olarak görüldüğü saptanmıştır. Domates bitkisinin yaprak, çiçek ve meyvesinde stolbur patojeni saptanmıştır. Domates stolbur hastalığının tohumla taşınmadığı bulunmuştur. Çiçekli parazit bitkilerden Orobanche ramosa (Canavar Otu) Cuscuta campestris (Küsküt), yabancı otlardan, Setaria spp. (Yapışkan Otu), Chenopodium album (Sirken), Datura stramonium (Şeytan Elması), Polygonum persicaria (Çoban Değneği) Amaranthus albus (Horozibiği) türleri stolbur hastalığının alternatif konukçusu olarak saptanmıştır. Domates stolbur hastalığının potansiyel vektörü olarak, Typhlocyba quercus böcek türü belirlenmiştir. Bu çalışma sonucunda, tohum hariç, yabancı ot, domates bitkileri ve vektör böceklerden P1 / P6 ve P1 / P7 ( 1500 bp., 1800 bp. sırasıyla) primer setleriyle PCR dan amplikon elde edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Domates, Stolbur, Fitoplazma, Polimeraz Zincir Reaksiyonu ( PCR), Vektör ve Alternatif Konukçu

7 VII ABSTRACT THE INVESTIGATIONS ON THE TRANSMISSION, IDENTIFICATION AND EPIDEMI OF TOMATO STOLBUR DISEASE WHICH WAS SHOWN TOMATO AREAS ON WESTERN ANATOLIA. ÖZDEMİR, Nilay Ph. D. Thesis, Plant Protection Department Supervisor: Prof. Dr. Hikmet SAYGILI January,2008, 133 pages. Tomato (Lycopersicon esculentum Mill) is one of the most important vegetable crops grown in Turkey and in the world. Tomato stolbur disease is one of the economically important diseases caused by phytoplasmas. Tomato stolbur disease is serious disease of tomato causing yield lose in some areas where prossesing tomato in particularly grown. The objectives of the present study are; 1) to determine the characteristic symptoms and distribution of tomato stolbur disease in Turkey. 2) to investigate spreeding ways of disease in the field conditions. 3) to identify genetic profiles of causal agent, which can be utilized for early diagnosis of disease.

8 VIII In the spring and summer season of , a survey was carried out in tomato production areas, especially in Western Anatolia region, Bursa and Çanakkale. Tomato plants, weeds and pests were collected from commercial tomato fields with stolbur disease observed. Total genomic DNA s were isolated from plants and insects samples and then amplified by universal primer sets ( P1/P6 and P1/ P7) specific for phytoplasma. The data showed that tomato stolbur disease was distributed in tomato production areas in the provinces of Bursa ( Karacabey and Yenişehir respectively) and Çanakkale ( Biga). The role of seed in spreading of disease was not comfirmed. Dodder (Cuscuta campestris), broomrape (Orobanche ramosa), jimsonweed (Datura stramonium), ladysthumb (Polygonum persicaria), foxtails (Setaria spp.), lambsquarters (Chenopodium album), pigweed ( Amaranthus albus) were determined as alternative host of tomato phytoplasmas among the plant species tested. Only one, Tyhlocyba quercus among 22 insect species collected from tomato fields were found to be potentional vector of tomato stolbur disease. The results showed that all aboveground part of diseased tomato plants, except seeds, weeds and vector pests give a unique PCR amplicon (1500 and 1800 bp ) with P1/P6 and P1/P7 primer sets, respectively. Key Words: Stolbur, Tomato, Phytoplasma, Polymerase Chain Reaction (PCR), Vector and Alternatif Host

9 IX TEŞEKKÜR Bana bu konuda çalışma olanağı veren, çalışmamın her aşamasında bana değerli bilgilerini aktaran ve yol gösteren hocam Sn. Prof. Dr. Hikmet SAYGILI ya, çalışmam sırasında bana her konuda yardımda bulunan Yeditepe Ü. Genetik ve Biyomühendislik bölümü bölüm başkanı hocam Sn. Prof. Dr. Fikrettin ŞAHİN e, laboratuvar çalışmalarımda ve her türlü konuda benden yardımını esirgemeyen Atatürk Ü. Biyoteknoloji Uyg. ve Arş. Merkezinde çalışan sevgili arkadaşım Uzm. Dr. Belinda AYDIN a, laboratuvar çalışmalarımı yaptığım Tohum Teknolojisi Araş. ve Uyg. Merkezi yetkilileri ve çalışanlarına, çalışmamızda böceklerin toplanmasında ve her konuda yardımcı olan bölüm başkanımız hocam Sn. Prof. Dr. Yusuf KARSAVURAN a ve böceklerin teşhisini yapan 19 Mayıs Ü. öğretim üyesi Prof. Dr. Ünal ZEYBEKOĞLU na, beni yetiştirip bugünlere gelmem için her türlü desteği sağlayan annem ve babam Nihal İrfan KIRSOY a, çalışmam sırasında vermiş oldukları destek ve göstermiş oldukları sabır için sevgili eşim Mesut ÖZDEMİR ve biricik kızım ŞengülNaz ÖZDEMİR e çok teşekkür ederim. Bornova Nilay ÖZDEMİR

10 X

11 XI İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET...V ABSTRACT...VII TEŞEKKÜR... IX İÇİNDEKİLER... XI ŞEKİLLER DİZİNİ...XV ÇİZELGELER DİZİNİ...XVII 1. GİRİŞ LİTERATÜR BİLDİRİŞLERİ Etmenin Tanımı İle İlgili Bildirişler Patojenin Temel Özellikleri İle İlgili Bildirişler Domates Stolbur Hastalığı İle İlgili Bildirişler Tanı Metotları İle İlgili Bildirişler Moleküler Yöntemler İle İlgili Bildirişler Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR ) İle İlgili Bildirişler MATERYAL VE METOT Materyal Metot... 29

12 XII İÇİNDEKİLER ( devam) Sayfa Örneklerin Toplanması ve Muhafazası Tanı Domates Stolbur Hastalığının Belirtilerinin Saptanması Moleküler Tanı PCR- RFLP ( Restriction Fragment Lenght Polymorphism) Tohumdan Tanı ARAŞTIRMA BULGULARI Domates Stolbur Hastalığının Belirtileri İle İlgili Bulgular Moleküler Tanı İle İlgili Bulgular PCR RFLP İle İlgili Bulgular Tohumla Taşınma İle İlgili Bulgular TARTIŞMA VE SONUÇ...98 KAYNAKLAR DİZİNİ EKLER Ek Yılında Bitki Örneklerinin Alındığı Yerler Ek Yılında Bitki Örneklerinin Alındığı Yerler Ek Yılında Bitki Örneklerinin Alındığı Yerler Ek Yılında Bitki Örneklerinin Alındığı Yerler ÖZGEÇMİŞ...133

13 XIII ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Mikoplazmaların Katı Besiyerinde Görünümü... 6 Şekil 2.2. Floem Dokusunda Fitoplazma... 8 Şekil 2.3. Avrupa Ülkelerinde Domates Stolbur Hastalığı Görülen Ülkeler... 9 Şekil 2.4. Patates Yumrusunda Stolbur Hastalığının Belirtileri Şekil 3.1. Domates Stolbur Hastalığı Sürveyi Yapılan Bir Tarladan Görünüm Şekil 3.2. Domates Bitkileri ve Yabancı Otların Oda Sıcaklığında Gölgede Kurutulma Şekli Şekil 3.3. Domates Meyvelerinin Gölgede Kurutulma Şekli Şekil 3.4. Gölgede Kurutulan Örneklerin Toz Haline Getirilmesi Şekil 3.5. Toz Haline Getirilen Örneklerin Steril Kavanozlarda Saklanması Şekil 3.6. PCR Reaksiyonunun Şematik Olarak Gösterilmesi Şekil 3.7. DNA Peletlerinin Kurutulması Şekil 3.8. Hastalıklı Bitkiden Alınan Domates Meyvesi ve Sağlıklı Bitkiden Alınan Domates Meyvesi Şekil 3.9. Domates Tohumlarının Ayrımı Şekil Domates Tohumlarının Gölgede Kurutulması Şekil Domates Tohumlarının Steril Kavanozlarda Buzdolabında Saklanması Şekil Stolburlu ve Sağlıklı Meyvelerden Ayrılan Tohumların Viyollerdeki Görünümü Şekil Domates Fidelerinin Polietilen Poşetlerdeki Görünümü Şekil Su-Agarda Sağlıklı ve Stolburlu Tohumların Görünümü Şekil 4.1. Domates Bitkisinde Gelişme Geriliği Şekil 4.2. Domates Bitkisinde Çalımsı Görünüm Şekil 4.3. Domates Bitkisinde Yapraklarda Sararma... 60

14 XIV ŞEKİLLER DİZİNİ ( devam) Sayfa Şekil 4.4. Domates Bitkisinde Yapraklarda Yukarıya Doğru Kıvrılma...61 Şekil 4.5. Domates Bitkisinde Yapraklarda Mor Renk Oluşumu...62 Şekil 4.6. Domates Bitkisinde Yapraklarda Küçülme...63 Şekil 4.7. Domates Bitkisinde Taç Yaprakların Yeşil Renge Dönüşmesi...64 Şekil 4.8. Domates Bitkisinde Çanak Yaprakların Genişlemesi...64 Şekil 4.9. Domates Bitkisi nde Kese Yapısı...65 Şekil Domates Çiçeklerinde Yaprak ımsı Gelişme Belirtisi ( Phyllody)...66 Şekil Domates Bitkisinde Meyve Azlığı Belirtisi...67 Şekil Domates Bitkisinde Dişi Kısırlık Belirtisi...67 Şekil Domates Meyvelerindeki Belirtiler...68 Şekil Domates Bitkisinde Küçük Meyve Görüntüsü...69 Şekil Domates Meyvesinde Deformasyon...70 Şekil Domates Meyvesinde Buruşma Belirtisi...70 Şekil Domates Meyvesinde Tohum Bağlamama Görüntüsü...71 Şekil Sağlıklı Domates Meyvesiyle Stolbur Hastalığı Görülen Domates Meyvesi Arasındaki Fark Şekil Erken Dönemde Stolbur Etmeninden Etkilenen Domates Bitkisinin Görünümü...73 Şekil Domates Yapraklarının P1-P7 Primer Seti İle 16S-23S rdna PCR Elektroforez Sonuçları...74 Şekil Domates Yapraklarının P1-P6 Universal Primer Seti İle 16S-23S rdna PCR Elektroforez Sonuçları...75 Şekil Domates Çiçeklerinin P1-P7 Universal Primer Seti ile 16S-23S rdna PCR elektroforez sonuçları...76

15 XV ŞEKİLLER DİZİNİ ( devam) Sayfa Şekil Domates Çiçeklerinin P1-P6 Universal Primer Seti İle 16S-23S rdna PCR Elektroforez Sonuçları Şekil Domates Meyvelerinin P1-P7 Universal Primer Seti İle 16S-23S rdna PCR Elektroforez Sonuçları Şekil Domates Meyvelerinin P1-P6 Universal Primer Seti İle 16S-23S rdna PCR Elektroforez Sonuçları Şekil Cuscuta campestris (Küsküt) Şekil Orobanche ramosa (Canavar otu) Şekil Amaranthus albus ( Horozibiği) Şekil Setaria spp. (Yapışkan Otu) Şekil Datura stromonium ( Şeytan Elması) Şekil Polygonum persicaria (Çoban Değneği) Şekil Chenopodium album (Sirken) Şekil Alternatif Konukçu Bitkilerde P1-P7 Universal Primer Seti İle 16S-23S rdna PCR Elektroforez Sonuçları Şekil Alternatif Konukçu Bitkilerde P1-P6 Universal Primer Seti İle 16S-23S rdna PCR Elektroforez Sonuçları Şekil Vektör Böceklerde P1-P6 Universal Primer Seti İle 16S-23S rdna PCR Elektroforez Sonuçları Şekil PCR- RFLP Sonucu Şekil Tohumların Viyollere Dikildikten Sonraki Görünümü Şekil Viyollere Ekilen Tohumların Çimlenme Görüntüsü Şekil Domates Fidelerinin Viyollerdeki Görünümü Şekil Domates Fidelerinin Polietilen Torbalara Aktarılması Şekil Shasta Çeşidinin Sağlıklı Ve Stolburlu Tohumlarından Yetişen Fidelerin Görünümü... 93

16 XVI ŞEKİLLER DİZİNİ ( devam) Sayfa Şekil Riogrande Çeşidinin Sağlıklı Ve Stolburlu Tohumlarından Yetişen Fidelerin Görünümü...93 Şekil Domates Fidelerinin Gelişme Durumu...94 Şekil Hastalıklı Bitkiden Alınan Tohumdan Yetişen Bitki...94 Şekil Sağlıklı Bitkiden Alınan Tohumdan Yetişen Bitki...95

17 XVII ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 1.1. Türkiye de ve Dünya da Yıllık Domates Üretim Alanı Ve Üretim Miktarı... 1

18 1 1. GİRİŞ Domates (Lycopersicon esculentum Mill), ülkemizde üretimi yapılan sebzeler arasında ilk sıralarda gelmektedir. Domates kullanım alanı çok geniş olan bir sebzedir. Taze tüketiminin yanında işlenmiş olarak salça, ketçap, konserve sanayiinde ve dondurulmuş ve kurutulmuş olarak da kullanılmaktadır. Çizelge 1.1. Türkiye de ve Dünya da Yıllık Domates Üretim Alanları ve Üretim Miktarları ( Anonim, 2005). Yıllık Üretim Alanı (ha) Yıllık Üretim Miktarı (ton) TÜRKİYE , DÜNYA 4, , Çizelge 1.1 de görüldüğü üzere, 2005 yılı verilerine göre domates üretim alanı, ülkemizde ha, dünyada ise 4, ha dır. Bu verilere göre dünya daki domates üretim alanlarının %6 sı Türkiye de bulunmaktadır yılı verilerine göre domates üretim miktarı ise Türkiye de 10, ton, dünya da 126, ton olarak saptanmıştır. Dünyadaki domates üretiminin %8 i Türkiye de üretilmektedir. ( Anonim, 2005). Türkiye ekonomisinde çok önemli bir yeri olan domates, yetiştirildiği bölgelerde çiftçinin önemli gelir kaynaklarından birisini

19 2 oluşturmaktadır. Başta Marmara Bölgesi olmak üzere Ege ve Akdeniz bölgelerinde ve Türkiye de birçok bölgede domates üretimi yapılmaktadır. Akdeniz bölgesinde daha çok örtü altı domates yetiştiriciliği yaygındır. Marmara ve Ege Bölgelerinde ise sanayiye yönelik domates üretimi yapılmaktadır (Vural ve ark., 2000). Üretim alanı ve üretim miktarı bakımından ülkemizde önemli bir yere sahip olan domates bitkisinde görülen verim ve kalite kayıplarının en önemli nedenlerinden biri bitki hastalıklarıdır. Domates bitkisinde verim ve kalitede kayıplarına neden olan çok sayıda patojen vardır. Bazı ülkelerde domates ve patates in önemli hastalıklarından olan fitoplazmaların neden olduğu stolbur hastalığı, ülkemizde de özellikle sanayi domatesinin yoğun olarak yetiştirildiği Marmara bölgesinde yıldan yıla değişen oranlarda görülmekte ve bazı yıllar oldukça önemli ürün kayıplarına neden olmaktadır (Yorgancı ve ark., 1990). Fitoplazmalar tarafından oluşturulan hastalıkların teşhisi ve mücadelesi oldukça zordur. Dünya da son yıllarda bu tip hastalıkların belirlenmesinde moleküler teknikler kullanılmaya başlanmıştır (Marcone et al., 1997). Ülkemizde domateste önemli ürün kayıplarına neden olan stolbur hastalığının teşhisi ve tanılanması üzerine bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmanın amacı, dünyada en çok kullanılan PCR tekniğini kullanarak domates stolbur hastalığının tanısı için spesifik yöntem

20 3 geliştirmektir. Ayrıca proje içerisinde hastalığın yaygınlığı, yayılmasında rolü olduğu düşünülen yabancı ot ve böcek türlerinin saptanması da amaçlanmıştır. Potansiyel vektör böceklerin saptanması için yapılacak çalışmalar TUBİTAK tan destekli TOGTAG 3390 no lu proje içerisinde yürütülmüştür. Yapılan araştırmalarda domates stolbur hastalığının tohumla taşınıp taşınmadığı kesin olarak bilinmemektedir. Bu çalışmamızda hastalığın taşınmasında tohumun etkisi de araştırılmıştır.

21 4 2. LİTERATÜR BİLDİRİŞLERİ 2.1. Etmenin Tanımı İle İlgili Bildirişler Patojenin temel özellikleri ile ilgili bildirişler Stolbur hastalığı etmeni, taksonomik olarak bakteriler içerisinde, Tenericutes bölümünde, Mollicutes sınıfında, familyası henüz tanımlanmamış ve cins olarak ta fitoplazma grubunda yer almaktadır. Dünya da stolbur hastalığı etmeni hastalık oluşturduğu bitkilere göre farklı isimler almıştır. Patates ve domateste stolbur, domateste iri tomurcuk (big bud), erkekleşme ve odunsu meyve, tütünde ise erkekleşme gibi isimler almıştır. EPPO verilerine göre, domates iri tomurcuk hastalığının belirtileri dünyanın her yerinde stolbur hastalığına benzediği rapor edilmiştir. Stolbur kelimesi Rusçadır. İngilizceye iri tomurcuk (big bud) olarak çevrilmiştir. Bazı araştırıcılara göre domates iri tomurcuk (big bud) ve domates stolbur sinonimdir (Anonim, 2006). Bitkilerde görülen büyüme bozuklukları, yaprakların sararması ile teşhis edilen hastalıklara uzun yıllar virusların neden olduğu düşünülüyordu. Hastalık etmenlerinin aşı yoluyla ve böceklerle taşınabilmeleri bu düşünceyi kuvvetlendiriyordu yılında Japon bilim adamları yeni bir hastalık etmeni olan mikoplazmaların bitkilerde sarılık hastalığına neden olduğunu bulmuşlardır. Bu hastalık ile enfekteli

22 5 bitkilerin floeminde mikoplazma benzeri organizmaların bulunmaları, bu hastalığa virusların neden olduğu düşüncesini değiştirmiştir. Uzun yıllar virusların neden olduğu düşünülen sararmalara mikoplazma benzeri organizmaların (MBO) neden olduğu saptanmıştır (Hull,1972; Fidan, 1984). Konukçu bitkilerde yayılma şekli sistemiktir. Fitoplazmalar, genel olarak floem dokusunda bulunur. Vektörleri hastalık etmenini aldıktan sonra devamlı taşıyıcısı olurlar. Bitkideki inkubasyon periyodu sıcak aylarda (Temmuz-Ağustos) gün, diğer aylarda genel olarak daha uzundur (Anonim, 2007a). Buchanan ve Gibbons ( 1975), bitkilerde görülen mikoplazma benzeri organizmaları bakteriler içerisine almıştır. Mikoplazma türleri parazitik ve saprofitik olarak yaşayabilirler. Genellikle hareketsizdirler. Katı besiyerinde koloni oluştururlar (Fidan, 1984). Mikoplazmaların DNA ve RNA içermeleri ve nukleuslarının membransız olmalarıyla bakterilere benzetilirler. Ancak bakterilerin gerçek hücre duvarına sahip olmaları, mikoplazma benzeri organizmaların hücre duvarı yerine üç tabakalı membrana sahip olmaları onları birbirinden ayıran özelliklerdir (Hull, 1972).

23 6 Mikoplazma benzeri organizmalar elektron mikroskopta görülebilen 3 katlı membrana sahiptirler. Bitkilerdeki mikoplazma benzeri organizmaların şekil ve büyükleri farklıdır. Basit şekilli, küçük küresel, büyük küresel ve iplik şekilleri vardır. Çapları 60 nm. den 1100 nm.ye kadar değişmektedir ve şeffaftırlar. Katı besiyerlerinde kolonileri çoğu mikoplazmada ortası kabarık yanları basık sahanda yumurta görünümündedir ( Şekil 2.1). Şekil 2.1. Mikoplazmaların Katı Besiyerinde Görünümü (Anomim, 2007b). Fitoplazmalar (mikoplazma benzeri organizmalar), floemle sınırlı, dünya çapında çok sayıda hastalıkla tanınan prokaryotlardır. (Mc Coy et al., 1989; Schneider et al., 1999). Mollicutes sınıfında yer alan bitki patojeni bakterilerdir. Hücre çeperi olmayan gruba dahil organizmalar filogenetik yapısı ile ilgili olarak düşük (Guanin + Sitozin) G+C içeriği, gram (+) bakterilerdir (Weisburg et al., 1989; Pracros et al., 2006). Bağ, meyve ağaçları, süs bitkileri ve sebzeler gibi çok sayıda bitkiyi

24 7 etkileyen 100 lerce hastalığa fitoplazmaların neden olduğu saptanmıştır (McCoy et al.,1989; Lee et al.,2000; Seemüller et al.,2002 ;Pracros et al., 2006). Mikoplazma benzeri organizmalar genellikle iletim demetlerinde bulunurlar ve çoğu floemde sınırlanmıştır. Yapılan araştırmalarda, mikoplazma benzeri organizmaların domates köklerindeki paranşim hücrelerinde, yonca kök hücrelerinde ve floem dokularında bulunduğu saptanmıştır (Şekil 2.2) (Fidan, 1984). Konukçu bitkide fitoplazmalar floem içerisinde yer alırlar, köklere ve bitkinin üst kısmına kadar taşınırlar. Fakat asla meristem içerisine yerleşemezler. (Kuske and Kirkpatrick, 1992 ; Christensen et al., 2004; Pracros et al., 2006). Fitoplazmalar genellikle çiçek dokusunda saptanmıştır. ( Cordova et al., 2003; Pracros et al., 2006). Fitoplazma enfeksiyonunun floem fonksiyonlarının ve karbonhidrat taşınmasının bozulması ile sonraki aşama fotosentezi etkilediği düşünülmüştür (Lepka et al.,1999; Maust et al.,2003; Pracros et al., 2006).

25 8 Şekil 2.2. Floem Dokusunda Fitoplazma (Razin,1985). Bu organizmalar besiyerinde gelişmediği için ve biyokimyasal özellikleri yüzünden esas olarak geleneksel taksonomi ile sınıflandırılmaları güçtür. Bu sebepten fitoplazmalar onların yaprak emici vektörleri veya daha sık olarak bitkide meydana getirdiği belirtilerine göre gruplandırılmışlardır ( Kirkpatrick, 1989; Schneider et al., 1999).

26 9 Ulusal Kayıtlar Ulusal Olmayan Kayıtlar Var. Var Sadece Birkaç Bölgede Var. Sadece Birkaç Bölgede Var. Şekil 2.3. Avrupa Ülkelerinde Domates Stolbur Hastalığı Görülen Ülkeler (Anomim, 2006). Şekil 2. 3 de Avrupa ülkelerinde domates stolbur hastalığının bulunduğu ülkeler görülmektedir. Haritada da görüldüğü gibi, Türkiye de domates stolbur hastalığı ulusal kayıtlara göre, sadece bazı bölgelerde görülmektedir ( Anonim, 2006). Domates te fitoplazma enfeksiyonları Akdeniz havzasının birçok bölgesinde görülmektedir (Zimmermann-Gries and Kleis, 1978; Alivizatos, 1989; Vibio et al., 1996; Del Serrone et al., 2001; Ghandi et al., 2003).

27 10 Eroğlu ve Soran (1992), Silivri ve çevresinde domateslerde hastalık taraması amacıyla yaptıkları çalışmada, domateslerde fungal, viral ve bakteriyel patojenler saptanmışlardır. Stolbur hastalığı en çok rastlanan ve yüksek ürün kaybına neden olan hastalık olarak rapor edilmiştir Domates Stolbur hastalığı ile ilgili bildirişler Stolbur hastalığının domateste başlangıç belirtileri büyümekte olan genç sürgünlerde, yapraklarda küçülme, hafif menekşe renk alma, ileri aşamada tamamen değişime uğrama ve hafif kıvrılma şeklindedir. Hastalığın ileri dönemlerinde çiçekte deformasyon, genel olarak çanak yapraklarda anormal büyüme, taç yapraklarda tamamen veya kısmen şekil değişikliği, dişi ve erkek organlarda deformasyon, kısırlaşma, erken enfeksiyonlarda (çiçeklenme periyodundan önce) hiç bir çiçeğin oluşmadığı görülür. Böyle durumlarda meyve oluşmamaktadır. Geç enfeksiyonlarda inkubasyon periyodundan önce döllenmiş meyveler oluma kadar gelebilir. Böyle meyvelerin bir kısmı tamamen sertleşmiştir (odunlaşmış), meyve tatsız ve susuzdur. Belirtiler yaz aylarında çok belirgindir. Hastalık nedeniyle köklerde bir ölüm meydana gelmez. Hastalığın ülkemiz için ekonomik önemi büyüktür. Hastalık domateste % oranında verim düşüklüğüne neden olmaktadır. Hastalık Marmara ve Trakya bölgesinde çok yaygın görülmektedir (Anonim, 2007c).

28 11 Fitoplazmalar sararma, bodurlaşma, çalılaşma ve çiçeklerde kusurlu oluşum gibi fitoplazma grup veya izolatlarına özel çok sayıda belirti oluşumuna sebep olabilir (Lee et al., 2000). Stolbura neden olan fitoplazma etmeninin enfeksiyonunun güçlü ve belirgin bir şekilde çiçek morfolojisini etkilediği gözlenmiştir (Pracros et al., 2006). Yıllardır stolbur hastalığının, konukçuları içinde domatesin de bulunduğu birçok bitkide çiçeklerde şekil bozukluğuna neden olduğu bilinmektedir. (Valenta et al; 1961; Pracros et al., 2006). Domates büyük tomurcuklanma hastalığı (Tomato Big Bud=TBB) mikoplazma benzeri (MBO) bir hastalık etmeni olup, domates bitkilerini etkilediği ilk olarak İtalya da tespit edilmiştir. Hastalık etmeni yaprak pireleri (Circulifer tenellus) tarafından sağlıklı bitkilere taşınır. İnfektelenen bitkilerde bodurlaşma, uç kısımlardaki sürgünlerde çalımsı bir görünüm, mor renklenme, uç gövdelerde kalınlaşma ve yaprak kenarlarında yukarı doğru kıvrılma şeklinde belirtiler ortaya çıkar. En çarpıcı belirtisi ise büyük, şişkin yeşil çiçek gözleridir ve bu gözler normal olarak gelişmeyi başaramaz ve meyve bağlamaz. Bitkilerde boğum araları kısaldığından çalımsı görünür ve küçük yapraklara sahiptir. Yapraklar şekilsiz ve yeşil-sarı renklidir. Havai kökler üst gövde de gelişebilir (Anonim, 2007a). Domateste stolbur hastalığının önemli belirtileri arasında yapraklarda kaşık gibi kıvrılmalar, yaprakların özellikle alt yüzeyinde antosiyan

29 12 (morarma) oluşumu, yaprağın üst yüzeyinin ise açık renkte kalışı, cılızlaşmış, sararmış ve morarmaya başlamış, büyüme ucu ve çiçeklerin çanak yapraklarında aşırı gelişme yer almaktadır. Diğer belirtileri ise, çiçek tomurcuklarının sertleşmesi ve dik durması, çanak yaprakların birbirleri ile kaynaması, balon gibi genişlemesi ve normale oranla daha irileşmesi, taç yapraklar ve stamenlerin yeşil renkte ve küçük kalmalarıdır. Böyle çiçekler genellikle meyve bağlamaz. Enfeksiyon, çiçek açma ve meyve bağlama sırasında olursa, küçük meyveler oluşur ve bunların renkleri açık olur. Ayrıca bu meyveler sert ve lezzetsiz olur. İçlerinde de normale oranla daha az sayıda tohum bulunur. Hastalıklı bitkiler, parsellerde rastgele dağılmış olarak bulunur (Marcone and Ragozzino, 1995; Alan, 2005). Avusturalya da domates te rastlanan hastalığa çiçek demetlerinin irileşmesi nedeniyle iri tomurcuk olarak adlandırılmıştır ( Hill, 1943). Stolbur hastalığı görülen bitkilerde, çoğunlukla gözlenen örneklerde, yeşil çiçeklerin gelişimi ve normal çiçek renginin kaybı nedeniyle çiçek anormallikleri, bazı durumlarda kusurlu stamen ve carpellere bağlı olarak bitkide kısırlaşma gibi belirtiler gözlenmiştir (Pracros et al., 2006) yılından itibaren İtalya nın kuzeyinde, geniş alanlarda domates üretimi yapılan bir bölgesinde stolbur hastalığının belirtilerine rastlanmıştır. Stolbur enfeksiyonunun tipik belirtileri olan yapraklarda

30 13 sararma ve küçülme, kısırlaşma veya meyvede deformasyon ve bodurlaşma gibi belirtiler gözlenmiştir (Favali et al., 2000). Lübnan da yıllarında domates tarlalarında fitoplazma surveyi yapılmıştır. Survey yapılan domates tarlalarının %25 inde domateslerde bodurlaşma, sararma, yapraklarda morarma, aşırı sürgün oluşumu, çanak yaprakların aşırı büyümesi ve çiçeklerde kısırlaşma gibi belirtiler gözlenmiştir (Choueiri et al., 2007). Kültür bitkilerinden patates, domates, biber, patlıcan, tütün; yabancı otlardan Convolvulus arvensis L. (Tarla sarmaşığı), Datura spp. (Şeytan elması türleri), Cuscuta spp. (Küsküt türleri), stolbur hastalığının en önemli konukçuları olarak saptanmıştır. Stolbur hastalığının patateste ilk belirtileri uç yapraklarda renk değişimi, hafif külah gibi kıvrılma şeklinde gözlenmiştir. Tohumluktan gelen hasta bitkide ilk belirtilerden sonra solma başladığı ve yumru bağlamadan, çiçeklenme devresinde bitki öldüğü saptanmıştır. Hastalığın, uç yapraklardaki renk değişimi ve külah şeklinde kıvrılma ile boğum aralarında kısalma, boğumlarda kalınlaşma ve koltuk sürgünlerinin kalınlaşması ile başladığı ve ileri safhalarda koltuk yumrularının oluştuğu görülmüştür. Daha sonra toprak ve hava şartlarına bağlı olarak hızlı veya yavaş bir solma gözlenmiştir. Aynı dönemde kök boğazında havai yumruları da oluşmaya başlamıştır. Solma ile birlikte kökler tamamen ölmüştür. Stolonlara bağlı olan olgunlaşmamış yumrularda pörsüme meydana gelmiştir. Hastalık epidemi yıllarında % oranında gözlenmiştir. Böyle yıllarda tohumluk patates üretiminde zarar ortalama olarak aynı oranda ortaya

31 14 çıkmıştır. Yemeklik patatesler depolama değerini büyük oranda kaybetmiştir. Epidemi yıllarında çok erkenci patates çeşitlerinde, yani vektörün bölgede görüldüğü tarihte olum devresine girmiş patateslerde zarar çok daha az gözlenmiştir. Geç çeşitlerde veya vejetatif gelişme periyodu uzun olan çeşitlerde zarar çok yüksek olduğu görülmüştür. Böyle çeşitlerde genel olarak patatesin gelişme periyodu, vektörün çıkış tarihi ve MBO'nın inkubasyon süresi arasında iyi bir ilişki olduğu ve bu ilişki bitkinin aleyhine, hastalığın lehine olduğu düşünülmektedir (Anonim, 2007a) yılında yapılan bir çalışmada, Amerika da Texas ve Nebraska da patateste önemli kayıplara neden olan yeni bir hastalık saptanmıştır. Yeşil aksamda (toprak üstünde) görülen belirtiler, bodurlaşma, renk açılması, yeni çıkan sürgünlerde mor renk oluşumu, boğumların şişmesi, yan dallarda aşırı çoğalma sonucu çalı görünümü ve koltuk yumruları olarak rapor edilmiştir (Lee et al., 2006) yılında Polonya da Zandarski tarafından yapılan bir çalışmada, zorunlu kontrol gerektiren bir organizma olan patateslerde sorun olan stolbur fitoplazması için Bitki Koruma servisleri tarafından patateslerde kontroller yapılmıştır. Çok geniş konukçu dizisine sahip ve yaşamını hem kültür bitkisinde hem de yabani bitkilerde sürdürebilen fitoplazmanın kontroller sayesinde hızlı saptamanın hastalıklı noktaların yok edilmesi ve hastalığın önlenmesi açısından önemi vurgulanmıştır.

32 yılında Polonya da patateslerde yapılan bir çalışmada, patateslerde havai yumru oluşumu ve üst yapraklarda kıvrılma gözlenmiştir. Benzer belirtileri veren ve yaygın görülen bir patojen olduğu için patates stolbura neden olan fitoplazma veya Rhizoctonia solani olabileceği düşünülmüştür. Patateste stolburun Temmuz-Ağustos aylarında yağmurlu ve soğuk havaların hastalığın gelişmesi için uygun olduğu sonucuna varılmıştır ( Zandarski, 2000). Biberde hastalığın ilk belirtileri yapraklarda renk açılması, renkte donuklukla başlamaktadır. Sarı, yeşil renkte damarlar belirginleşir, yapraklar aşağıya doğru kıvrılır. Bunu yaprak dökümü izler. Kök sisteminde mantarlaşma ve ölüm görülür. Bitkide solma ve ölüm meydana gelir. Vejetatif gelişme periyodunun başında enfekte olmuş bitkilerde meyve oluşmaz veya çok küçük ve deforme olmuştur. Geç enfeksiyonlarda oluşan meyvelerde erken kızarma görülür. Hastalığın tohumluk ve salçalık (kırmızı) biber ekiminde ekonomik önemi büyüktür. Çünkü stolbur nedeniyle solma genel olarak biberde tohum oluşması devresinde yani biberler kırmızılaşmaya başladığı dönemde görülür. Hastalıklı bitkilerden elde edilen tohumlarda çimlenme oranı düşüktür. Ancak hastalık tohumla geçmez. Her türlü vegetatif parçayla geçer (Anonim, 2007a). Hastalığın tütünde en belirgin belirtileri çiçek demetinde ve çiçekte görülür. Çiçek demetinde fazla dallanma ve çiçek saplarının kısalması sonucu çalı görünümü meydana gelir. Çiçekte taç yaprağı deforme olur. Çoğu zaman yeşil renk alır. Erkek ve dişi organlarda

33 16 anormallikler görülür. Dişi ve erkek organlar küçülür. Aralarındaki oran bozulur. Bazen dişicik borusu erkek organ taşıyıcılarından çok uzun veya kısadır, yumurtalık bozulmuştur. Genel olarak hastalık belirtisi gösteren çiçekte döllenme ve tohum bağlama meydana gelmez. Erken enfeksiyonlarda vejetatif gelişmede duraklama görülür ve bitki çiçeklenmez. Hastalık nedeniyle bitkide solma ve ölüm görülmez (Anonim, 2007a). Patlıcan da hastalık belirtileri genel olarak yapraklarda sararma, küçülme, dökülme şeklindedir. Vejetatif gelişmede duraklama görülür. En tipik belirtisi meyvenin sertleşmesidir. Köklerde giderek ölüm ve mantarlaşma meydana gelir. Sonuçta bitki solar ve ölür (Anonim, 2007a). İspanya da biber bitkilerinde ( Capsicum annum) etmeni fitoplazma olan stolbur hastalığının belirtilerine rastlanmıştır. Kısa boğum araları, yeşil çiçek demetleri ve fitoplazma hastalıklarına özgü diğer belirtiler gözlenmiştir (Castro and Romero, 2002). Çanakkale ilinde domates stolbur hastalığının yaygınlık durumunun belirlenmesi ve hastalığın aşı yoluyla, küskütle ve tohumla taşınma oranlarının saptanması ile ilgili bir çalışma yılları arasında yürütülmüştür. Bu amaçla, 2002 yılında Çanakkale ilinde domatesin yoğun olarak yetiştirildiği alanlarda survey çalışması yapılmıştır yılında ise Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi Ziraat Fakültesi ne ait uygulama bahçesinde hastalığın taşınma yollarını

34 17 saptamak için deneme kurulmuştur. Denemede aşı yoluyla taşınma için 25, küsküt ile taşınma için 20 bitki kullanılmıştır. Ayrıca tohumla taşınmayı belirlemek amacıyla infekteli bir bitkiden elde edilen 160 tohum ekilmiştir. Yapılan survey çalışması sonucunda bölgede stolbur hastalığının 2002 yılı içinde ortalama infeksiyon oranı % 0,38 olarak belirlenmiştir. Taşıma denemelerinde ise hastalığın aşı yoluyla % 96 oranında, küsküt ile % 85,7 oranında taşındığı; tohum yoluyla ise taşınmanın olmadığı saptanmıştır (Afat, 2004). Lübnan da yıllarında biber tarlalarında yapılan survey sonucunda, biber tarlalarının %27 sinde bodurlaşma ve yapraklarda sararma gibi belirtiler gösteren bitkilere rastlanmıştır (Choueiri et al., 2007).

35 18 Yapılan araştırmalar sonucunda, domates stolbur hastalığı nın doğada Cicadellidae familyası üyesi böceklerle yayıldığı saptanmıştır. Ana vektör Hyalesthes obsoletus olarak tespit edilmiştir. Diğerleri Eucelis plebejus, Macrosteles leavis, Aphrodes bicinctus olarak bulunmuştur. Bu vektörlerin hepsinin ülkemizde bulunduğu saptanmıştır. H. obsoletus Marmara ve Trakya bölgesinde çok yoğun ve yaygın olduğu gözlenmiştir. Tarla sarmaşığı, H. obsoletus' un kış konukçusu olarak tespit edilmiştir. Aynı zamanda stolbur etmeninin de konukçuluk ettiği saptanmıştir. Doğada diğer yayılma yolunun da küsküt olduğu bulunmuştur. Bunlar dışında hastalığın tohumla taşınmadığı, her türlü vegetatif bitki parçası ile taşınabildiği ve mekanik yolla ve temasla geçmediği sonucuna varılmıştır (Anonim, 2007a) yıllarında Yenişehir (Bursa) Karacaali ve Karaköy de yapılan bir çalışmada stolbur hastalığının taşınmasında önemli rol oynayan vektörler araştırılmıştır. Stolbur hastalığının etmeni olan mikoplazmalar, vektör böceğin vücudunda persistent olarak taşınmakta ve bu böcek kışı çoğu kültür bitkisi olmayan yabancı otlarda geçirdikten sonra yaz başında beslenmek üzere domates ve patatese gelerek hastalığı taşımaktadır. Dikim tarihinin ayarlanması suretiyle zararın en aza indirilmesi hedeflenmiştir. Bu sebeple farklı dikim tarihlerinin etkisini araştırmak için bir deneme planlanmış ve yürütülmüştür. Çalışma sonunda Cicadellidae familyası üyelerinin haziran ayı başında en yüksek populasyonda olduğu gözlenmiştir (Yorgancı ve ark., 1990).

36 yıllarında Erzurum ve çevresinde patateslerde yapılan bir survey çalışması sonunda 22 tür Cicadellidae, 5 afit, 4 adet delphacid ve cixid, 3 adet tettigometrid ve 1 adet cercopid ve triozid toplanmış ve listelenmiştir. En önemli türler Hyalesthes obsoletus, Empoasca decipiens, Nealiturus haemotoceps ve triozidlerden Bactericera nigricornis, Macrosteles laevis ve Aphrodes bicinctus türleri saptanmıştır. Bunların vektör olduğu ispat edilmemiştir (Özbek ve ark., 1987). Patates stolbur hastalığının etmeni mikoplazma (fitoplazma)'dır. Etmen konukçu bitkide sistemik olarak bulunmaktadır. Genel olarak floem dokusunda bulunur. Vektörleri hastalık etmenini aldıktan sonra daima taşıyıcısı olurlar. Hastalık patates yapraklarında renk değişimi, hafif külah gibi kıvrılmalar şeklinde deformasyonlar oluşmaktadır. Tohumluktan gelen hasta bitkide ilk belirtilerden sonra solma başlar ve yumru bağlamadan çiçeklenme devresinde bitki ölür ya da ipliksi sürgün oluşur, yeşil aksam oluşmaz. Aynı yıl enfekte olmuş bitkilerde hastalığın tüm dönemlerini görmek mümkündür. Uç yapraklardaki renk değişimi ve külah şeklinde kıvrılma ile boğum aralarında kısalma, boğumlarda kalınlaşma ve koltuk sürgünlerinin kalınlaşması başlar, ileri safhalarda koltuk yumruları görülür. Aynı dönemde kök boğazında havai yumrular da oluşmaya başlar, solma ile birlikte kökler de tamamen ölür. Stolonlara bağlı olarak olgunlaşmamış yumrularda pörsüme meydana gelir. Hastalığın depodaki belirtisi iplik şeklinde çimlenmedir (Şekil 2.4). Yemeklik patatesler depolama değerini büyük ölçüde kaybeder. Yaprak pire'leri (Cicadellidae) bu hastalığın vektörü olup, doğada diğer sağlıklı

37 20 bitkilere bulaşmasına sebep olur. En önemli vektör Hyalesthes obsoletus tur. Euscelis plebejus, Macrosteles leavis, M.fascifrons, Aphrodes bicinctus ve H.mlokosiewiczii hastalığı taşıyan vektörlerdir. Vektörlerin hepsinin ülkemizde bulunduğu saptanmıştır. Doğada diğer yayılma yolu küskütlerdir, tarla sarmaşığı H.obsoletus'un kış konukçusudur. Bunların dışında hastalığın tohumla geçmediği, her türlü vejetatif bitki parçası ile hastalığın taşındığı ve mekanik yolla taşınmadığı belirtilmiştir (Şahin et al., 2006; Anonim, 2007d). A B Şekil 2.4. Patates Yumrusunda Stolbur Hastalığının Belirtileri (A: Stolburlu Yumru; B: Sağlıklı Yumru) (Anonim, 2007d). Solanacealerde stolbur patojeninin yaşam döngüsünün karakteristiklerini saptamak amacıyla, Rusya nın Samara bölgesinde stolbur hastalığı nın yaşam çemberinin karakteristikleri üzerine 1992 ve

38 yılları sürecinde tarlada ve serada yürütülmüştür. İnfekteli domates ve patates bitkilerinin maximum sayısı (%20 30) de not edilmiştir. Sadece %60 domates bitkisinde tipik stolbur belirtileri gözlenmiştir. Doğal alanda 27 familyaya ait 93 yabancı otta fitoplazma etmeninin belirtileri bulunmuştur. Bunlar arasında Cirsium arvense (Köygöçüren), Taraxacum officinale (Aslandişi), Convolvulus arvensis (Tarla Sarmaşığı) gibi türler saptanmıştır ( Bogoutdinov, 2003). Özsu ile beslenen böcekler, domates ve biber dahil bir çok sebzede yaygın olan önemli zararlılardır. Emgileriyle yaptıkları zararın yanında virüs ve fitoplazma hastalıklarına vektörlük ederek de zararlı olurlar. Macaristan da 2001 yılında yapılan bir çalışmada domates yetiştirme sezonunda 2 domates tarlasında emici böcek populasyonu surveyi yürütülmüştür. 3 tane böcek toplama yöntemi kullanılmıştır. Malaise tuzağı, emme tuzağı, sarı yapışkan tuzak kullanılmıştır. Toplanan türlerden dominant olanı Empoasca solani, alt dominant tür ise Eupteryx atropunctata olarak saptanmıştır. Empoasca decipiens ve Psammotettix alienus türleri önemli sayıda toplanmıştır. Tuzaklarla örnek toplamaya göre özsu ile beslenen böcekler ürüne mayıs sonu ve haziran başı gibi göç etmişlerdir. Birey artışının ağustos başına kadar sürdüğü saptanmıştır. Birey sayısı domates yetiştirme sezonunun sonuna doğru düşüş göstermiştir. Yaygın görülen 2 türün de en yüksek sayısı ağustos ayı başında saptanmıştır (Der et al., 2003). Domates stolbur hastalığı, İtalya da ilk kez 1998 yılında seralardaki domateslerde gözlenmiştir. Domates stolbur hastalığının, aster sarılığı

39 22 grubunda yer aldığı belirtilmiştir. Bu hastalığın vektörlerle özellikle Hyalesthes obsoletus (Familya: Cixiidae) ve aşı yoluyla taşındığı saptanmıştır. Tüm üründe büyük kayıplara sebep olmuştur. Konukçunun yabancı otlar olduğu belirlenmiştir. Tanılanması verdiği belirtiler yardımıyla yapılmıştır (Martini et al., 1999). Rusya da 1997 yılında yapılan tarla çalışmalarında domateslerde birçok kültür bitkisinin ve yabancı otların konukçuluk ettiği stolbur hastalığı görülmüş. Hastalığın Cicadellidae familyası üyeleriyle yayıldığı ve hastalığın yayılmasında mevsim faktörlerinin de rol oynadığı belirtilmiştir (Khromova, 1998). Macaristan da fitoplazma hastalığı belirtisi gözlenen biber, havuç, domates, kereviz, şeytan elması (Datura stramonium) ve aslandişi ( Taraxacum officinale) bitkileri toplanmıştır ve universal primer seti (fp1/rp7) ve spesifik primer seti ( FSTOL/rSOLS) kullanılarak PCR yapılmıştır. PCR ile fitoplazma saptanmış ve PCR ile saptanan fitoplazma RFLP ile karakterize edilmiştir. Toplanan tüm bitkilerde tipik stolbur fitoplazması tanımlanmıştır. Ayrıca bu çalışmada fitoplazmaların küskütle taşındığı saptanmıştır (Viczion et al., 1998). Lübnan da domates ve biber tarlalarında yapılan fitoplazma surveyi sonucunda, fitoplazmanın küsküt tarafından domateslere taşındığı saptanmıştır (Choueiri et al., 2007).

40 23 Rusya nın Kabardino- Balkaria mevkii nde 1997 yılında yapılan tarla çalışmalarında domatesi etkileyen fitoplazmaların kaynağı olarak yabancı otların ve çok sayıda ürünün rol oynadığı görülmüştür. Kısaca bu çalışmada mevsimsel olaylar, Cicadellidae lerle taşınma ve onların kontrolü, patojenlerin çeşitli reaksiyonlarının etkili olduğu saptanmıştır (Khromova, 1998) Tanı Metotları İle İlgili Bildirişler Moleküler yöntemler ile ilgili bildirişler Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR ) ile ilgili bildirişler Fitoplazmaların saptanması ve sınıflandırılmasında klasik moleküler biyoloji metotlarından yararlanılmıştır (Lee et al., 1998; Seemüller et al., 1998). Fitoplazmalar, obligat parazit oldukları için standart besiyerlerinde çoğaltılmaları mümkün değildir. Ancak bu hastalıkların simptomları genellikle virüs hastalıklarına çok benzediği için yapılan teşhisler çoğunlukla alternatif yorumlara açıktır ve bilimsel değildir. Son yıllarda ileri moleküler tekniklerin geliştirilmesi ile kültüre alınamayan organizmaların (fitoplazma, virüs ve viroid gibi) tanısı ve hastalığın teşhisinde yeni bir çığır açılmıştır (Namba et al., 1993).

41 24 Fitoplazmaları in-vitro koşullarda kültüre almak zor olmasına rağmen fitoplazmaları saptamak ve tanılamak için alternatif metotlar vardır. Hem serolojik hem de DNA hibridizasyon metotları eskiden bu amaç için kullanılmıştır (Kirkpatrick et al., 1987; Clark et al., 1989; Kuske et al., 1991; Kirkpatrick, 1992). PCR (Polimeraz Chain Reaction) ayrıca fitoplazmaya konukçuluk yapan diğer alternatif bitki türlerinin ve vektör böceklerin saptanmasında kullanılmıştır (Deng and Hiruki 1991; Ahrens and Seemüller 1992; Schaff et al., 1992; Firrao et al., 1993; Lee et al., 1993; Liu et al., 1994; Lorenz et al., 1995;). İtalya da 1998 yılında yapılan bir çalışmada tipik stolbur belirtileri gösteren domates bitkilerinden alınan floem boruları içindeki fitoplazma hücreleri PCR ile tanımlanmıştır. Bu belirtiler tipik olarak domates stolbur hastalığı ve etmende stolbur fitoplazma alt grubunun üyesi olarak tanımlanmıştır (Albanese et al., 1998). Doi et al., (1967) de yaptıkları bir çalışmada, fitoplazmaları sınıflandırmak ve tanımlamak için çok sayıda metodun, fitoplazmaların bulunmasından bu zamana kadar kullanıldığı belirtilmiştir. Bitki patojeni fitoplazmaların, PCR ile tanımlanmış ve hepsinin 16SrRNA grubuna ait oldukları belirtilmiştir. Fitoplazmalar ilk önce kendi içlerinde oluşturdukları belirtilere, konukçularını etkileme durumuna göre ve spesifik vektör böceklere göre ayrılmışlardır. Fakat son yıllarda fitoplazmaların gelişmesi spesifik serolojik ve DNA analiz testleri özelikle fitoplazmaları tanımlamak ve sınıflandırmak için geliştirilmiştir (Kirkpatrick, 1989).

42 25 Domates te morfometry ve flow cytometry ile arbuscular stolbur grubu fitoplazmalara karşı mycorrizal fungusların koruyucu etkisi saptamıştır. Bitkide arbuscular mikoriza mantarı beslendiği zaman fitoplazmaların bitkiye daha az zarar verdiği görülmüştür (Lingua et al., 2002). Sınıflandırmanın bitki belirtilerine dayanarak yapılmasına rağmen bu yeterli değildir, çünkü yalnız patojenden ziyade bitki - patojen etkileşimi tanımlanmalıdır. Bu durum özellikle laboratuarda bitki mikoplazmology olarak tanımlanan DNA çoğaltılan moleküler teknikler kullanılmaya başlandığı zaman değişmiştir. Bu metodun amacı az sayıda örnekle çalışmaktır (Lee et al., 1993; Schneider et al., 1993; Gundersen et al., 1994; Schneider et al., 1995). PCR, muhafaza edilen geni çoğaltarak çok sayıda fitoplazmanın saptanması ve tanımlanmasını sağlamıştır (Gundersen and Lee, 1996; Poggi Pollini et al., 2001; Abou- Jawdah et al., 2002; Castro and Romero, 2002; Harrison, 2002). Ürdün ün doğu bölgesinde ilk kez 2003 yılında domateslerde domates iri tomurcuk hastalığına rastlanmıştır. Enfekteli bitkilerde, saçak köklerde çoğalma, kaliksin irileşmesi ve çiçek taç yapraklarının yeşil kalması gibi belirtiler göstermiştir. Domates te görülen bu hastalıkta fitoplazmaların varlığı PCR kullanılarak ispatlanmıştır. Çoğaltılmış DNA ürünü P1 ve P7 primer çiftiyle 1,8 kb. de direkt PCR yapılarak, R16F2/

43 26 R2 primer çiftiyle 1,2 kb. de nested PCR ile elde edilmiştir (Ghandi et al., 2003). In-vitro koşullarda fitoplazmaları kültüre almak mümkün olmadığı için tanılamak zordur. Son zamanlarda, DNA a dayalı yöntemler fitoplazmaları saptama, tanılama ve sınıflandırmada kullanılmaktadır. Özellikle 16SrDNA nın sequence analizi ve sınırlayıcı yeri birçok fitoplazmanın ayrımında ve filogenetik sınıflandırmasında yararlanılmıştır (Lee et al., 1998; Seemüller et al., 1998). Brezilya da ortaya çıkan birçok bitki hastalığında fitoplazmalar saptanmıştır. İri tomurcuğun belirtileri görülen domates bitkilerinde bulunan 16SrIII grubu fitoplazma 16SrDNA PCR ve RFLP ile tanımlanmıştır (Amaral Mello et al., 2006a). Bolivya da yılları arasında yapılan survey de, domateste yaprak iplikleşmesi, çalılaşma, küçük yapraklılık belirtilerine rastlanmış. Çiçekler salkım görünümünde değildir. Meyve boyutları küçülmüştür. Enfekteli bitkiler, virüs kiti kullanılarak ELISA ve elektron mikroskobuyla taranmıştır. Enfekteli bitkilerden DNA elde edilip, nested PCR ile test edilmiştir. PCR da üniversal rdna primerleri P1/ P7 ve R16F2n / R16R2 primer setleri kullanılmış. Ampliconlar 1250 bp da gözlenmiştir. Yapılan sequence sonucuna göre %91 olasılıkla 16SrI Aster sarılığı grubundan olabileceği sonucuna varılmıştır (Jones et al., 2005).

44 27 Doğal koşullarda, fitoplazmalar bitkiler arasında Psyllidae, Cicadellidae ve Cixidae familyalarında yer alan floemden beslenen böceklerle taşınırlar (Cordova et al., 2003). Mikoplazma benzeri organizmaların vektörler tarafından alınmaları, çoğalmaları ve bitkilere taşınmaları için uzun bir süre geçmektedir. Bu süre gün ve ayla ifade edilebilir. Böceklerde mikoplazma benzeri organizmalara karşı etkin savunma mekanizmaları olmadığı yapılan laboratuar çalışmalarında bulunmuştur. Böylece mikoplazma benzeri organizmalar vektörleri üzerinde zararlı etki oluşturabilirler (Fidan, 1984). Fitoplazmaların moleküler ve filogenetik karakterlerini karşılaştırma amacıyla yapılan bir çalışmada, tanımlanmış fitoplazmalar tarafından meydana getirilen belirtiler; deneme konukçu bitkiler ana fitoplazmayı bulaştırma tekniği, doku kültürü veya doğada fitoplazmaları yayma yolları bulunmaktadır. Fitoplazmaların teşhisi ve sınıflandırma için farklı methodların kullanımı tartışılmıştır. Ekonomik olarak önemli hastalıklar arasında, elm yellows grubu (tropikal hastalıklar, Avrupa meyve ağacı hastalığı), aster sarılığı grubu (çiçekler, sebzeler, tarla bitkileri, odunsu bitkiler ve orman ağaçlarında görülen fitoplazma hastalıkları), stolbur grubu (Solanaceae, Lavandula spp., ve şeker pancarı) yer almaktadır (Cousin and Boudon- Padieu, 2001). Brezilya da Sao Paulo bölgesinde domates bitkilerinde sararma, sürgünlerde aşırı çoğalma sonucu çalılaşma, çanak yaprakların

45 28 deformasyonu, yapraklarda azalma, çiçekler ve meyvelerde domates iri tomurcuk (big bud) hastalığı nın belirtilerine rastlanmıştır. Örnekler toplanarak tanılama ve teşhiş için universal primer seti kullanılarak PCR ve RFLP yöntemleriyle analizler yapılmıştır. PCR sonucu fitoplazmanın 16SrIII grubunun üyesi olduğu belirlenmiştir (Amaral Mello et al., 2006b). İspanya da biberlerde rastlanan fitoplazma etmeninin PCR ile çoğaltma, sequence ve filogenetik analizleri sonucunda 16SrVI grubunda olabileceği ve stolbur grubu olan 16SrXII grubundan farklı olduğu kanısına varılmıştır (Castro and Romero, 2002).

46 29 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Çalışmamızda yılları arasında domates üretim sezonunda domates stolbur hastalığı görülen tarlalardan hastalık belirtisi taşıyan yaklaşık 1200 adet domates bitkisi, alternatif konukçu bitkiler ve yabancı otlar toplanmıştır. Ayrıca domates stolbur hastalığının potansiyel vektörlerini saptamak amacıyla 22 türe ait böcek toplanmıştır. Domates örnekleri; yaprak, çiçek ve meyve olarak ayrılmıştır. Toplanan tüm örnekler çalışmamızda materyal olarak kullanılmıştır. Çalışmamızda, soğutmalı santrifüj, spektrofotometre, otoklav, otomatik termocycle sistem, elektroforez sistemi, jel görüntüleme sistemi, su banyosu, otomatik pipetler, magnetik karıştırıcı, ph metre, derin dondurucu, -40, -80 buzdolabı, hassas terazi, buzdolabı, mikrodalga fırın gibi alet ve cihazlar kullanılmıştır Metot Örneklerin toplanması ve muhafazası Temmuz ve Eylül ayları arasında 20 gün süre arayla Bursa ve Çanakkale bölgelerinde domates üretim alanları gezilmiştir. Stolbur belirtileri görülen tarlalardan hastalıklı domates örnekleri ve buralarda

47 30 bulunan potansiyel alternatif konukçu türleri ve böcek örnekleri toplanmıştır. Gezilen tarlalardan hastalık yoğunluğu saptanmıştır (Şekil 3.1). Şekil 3.1. Domates Stolbur Hastalığı Görülen Bir Tarladan Görünüm. Yaptığımız literatür araştırmasında örnek alma ve saklama yöntemleri ile ilgili bir bilgiye rastlanmamıştır. Ancak sözlü olarak bazı araştırıcılarla yaptığımız görüşmeler sonucu aldığımız örneklerin 2 şekilde saklandığını gözlemledik. Örneklerden bir kısmı oda koşullarında gölgede kurutulduktan sonra toz haline getirilerek DNA izolasyonu yapılıncaya kadar steril kavanozlarda saklanmıştır (Şekil 3.2, Şekil 3.3,

48 31 Şekil 3.4, Şekil 3.5). DNA kalitesini karşılaştırma açısından örneklerin bir kısmı ise - 40 C derin dondurucuda saklanmıştır. Şekil 3.2. Domates Bitkileri ve Yabancı Otlar Oda Sıcaklığında Gölgede Kurutulma Şekli. Şekil 3.3. Domates Meyvelerinin Gölgede Kurutulma Şekli.

49 32 Şekil 3.4. Gölgede Kurutulan Örneklerin Toz Haline Getirilmesi Şekil 3.5. Toz Haline Getirilen Örneklerin Steril Kavanozlarda Saklanması Bu bitkilerden izole edilen genomik DNA örnekleri fitoplazma genetik materyallerinin amplifikasyonunda kullanılan primerler ile test edilmiştir. Bu amaçla daha önce yapılan bilimsel çalışmalarda başka kültür bitkilerinde hastalık oluşturan fitoplazmaların tanısında kullanılan ve prokaryotik organizmalarda üniversal olarak bulunan 16S rdna baz

50 33 dizilerinden elde edilmiş primerler potansiyel olarak test edilmiş ve domates stolbur hastalığının teşhisi için spesifik bir PCR yöntemi geliştirilmeye çalışılmıştır. Daha sonra bu metot kullanılarak, stolbur hastalığının bu bölgedeki biyolojisi, yayılma yolları, konukçu çevresi saptanmaya çalışılmıştır. Domates stolbur hastalığının potansiyel vektörlerinin saptanması amacıyla domates üretim sezonunda stolbur hastalığı görülen tarlalardan toplanan böceklerin tür teşhisleri yapılmıştır. PCR analizi yapmak üzere oda sıcaklığında saklanmıştır Tanı Domates Stolbur hastalığının belirtilerinin saptanması Arazide domates stolbur hastalığı görülen tarlalarda domates bitkisinin yaprak, çiçek ve meyveleri incelenmiştir. Domates bitkisinin yaprak, çiçek ve meyvelerinin stolbur hastalığının belirtilerini taşıdığı gözlenmiştir Moleküler tanı Çalışmamızda, domates stolbur hastalığı etmeninin tanısını yapmak için PCR dan yararlanılmıştır.

51 34 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), genetik materyaller (DNA ve RNA) üzerinde seçilmiş bir veya birden fazla bölgenin in vitro şartlar altında oligonükleotit primer ve Taq polimeraz enzim kullanılarak bir otomatik termocycle sistem (PCR aleti) yardımıyla çoğaltılma (sentezlenme= amplifiye etme) yöntemidir. İlk olarak Kary Mullis bu tekniğe bugünkü ismini vermiş ve uygulamaya koymuştur ve bu fikri ile 1993 yılında Nobel Kimya Ödülü nü kazanmıştır. Bu teknikte tek bir gen bölgesi çoğaltılabileceği gibi, genin sadece bir parçası da çoğaltılabilir. PCR ile genellikle 10 kilobaz (kb) uzunluğa kadar DNA bölgeleri çoğaltılabilmektedir, ancak bazı metodlarla bu uzunluk 40 kb a kadar ulaşabilmektedir. PCR nin prensibi; tekrarlanan üç basamağa dayanır (Şekil 3.6). A. Denatürasyon: Bu basamakta PCR reaksiyonu içinde yer alan çift zincirli kalıp DNA nın birbirinden ayrılması sağlanır. Genelde C de, dakika denatürasyon yeterlidir. Alternatif olarak denatürasyonu kolaylaştırmak için reaksiyona gliserol, dimetilsülfoksid (DMSO) ve formamid gibi kimyasallar eklenebilir. B. Primerlerin yapışması (annealing): Bu basamakta birbirinden ayrılmış DNA zincirlerine primerlerin C de bağlanması gerçekleştirilir. Optimal annealing sıcaklığı Tm (melting temperature) derecesinden 5 C daha düşüktür dakika annealing için yeterlidir. Eğer spesifik olmayan PCR ürünleri elde ediliyorsa her defasında annealing derecesi 1 2 C artırılarak optimize edilebilir.

52 35 C. Zincir uzaması-polimerizasyon (extention): Zincir uzaması taq polimerazın aktivitesinin en yüksek olduğu C arasında gerçekleştirilir. 2 kb a kadar olan PCR ürünlerinin oluşturulması için bir dakika süre yeterlidir. Daha uzun DNA parçalarının çoğaltılabilmesi için bu süreye her kb için bir dakika eklenmelidir.

53 36 Şekil 3.6. PCR Reaksiyonunun Şematik Olarak Gösterilmesi

54 37 Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamamlayıcı bir çift sentetik oligonükleotid primer (18-20 baz uzunluğunda) kullanılarak; bu iki primer ile sınırlandırılan genin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır (Birben, 2006). PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile çalışmaya olanak sağlamaktadır. PCR tekniği ile laboratuar tanısında çok büyük bir hız ve kesinlik kazanılmış; birçok durumda radyoaktivite kullanımını gereksiz hale gelmiştir (Birben, 2006). Seroloji (ELISA) dışındaki diğer moleküler metotlar ile tanısı mümkün olmayan birçok obligat fungal ve bakteriyel mikroorganizmaların ve kültür ortamlarında çoğaltılamayan (virüs, viroid, mikoplazma ve riketsia) patojenlerin oluşturduğu hastalıkların teşhisi PCR ile kolayca yapılabilmektedir (Şahin ve ark., 2000). PCR, tohum saflığının belirlenmesinde, çeşitli türlerin tanısında ve türler arasındaki genetik akrabalığın belirlenmesinde kullanılmaktadır (Birben, 2006). Patojen-konukçu arasındaki uyumlu reaksiyonu kodlayan bazı genler (patojenite, virülanslık, avirülanslık, toksin, enzim ve hormon üretimini kodlayan) vardır. Farklı patojenlerde bu tür genlerin baz dizilişleri, genlerin kromozom üzerindeki dağılımları ve tekrarlanma sıklıkları hakkında elde edilen genetik bilgiler patojenin kimliğini açıklamaktadır. Buna ek olarak virüs ve viroidlerin dışındaki normal hücre (prokaryot ve ökaryot) yapısına sahip mikroorganizmaların rdna genlerinin kromozomal DNA üzerindeki dağılımı ve tekrarlanma sıklığı

55 38 bu organizmaların taksonomik sınıfları ve tanılarında belirleyici bir faktördür. Bu nedenle yukarıda bahsedilen genlerden bir veya bir kaçı için spesifik olarak sentezlenen oligonükleotit primerler yardımı ile farklı patojenlerden izole edilen genetik materyaller PCR ile kolayca amplifiye edilmektedir. Daha sonra elde edilen PCR ürünlerinin agaroz jel üzerinde elektroforez edilmesiyle patojene spesifik DNA bant veya bant profilleri belirlenerek hastalığa neden olan etmenin tanısı ve aynı zamanda da hastalığın teşhisi yapılabilmektedir (Şahin ve ark., 2000). DNA izolasyonunda kullanılan çözeltilerin hazırlanışı Çalışmamızda kullanılan çözeltilerin hazırlanış şekilleri aşağıdaki gibidir; 1. TE (10mM Tris, 1 mm EDTA, ph: 8) Çözeltisi: 0.24 gr. Tris ve gr. EDTA saf su içerisinde çözüldü ve ph 8 e ayarlandı. Son hacim 200 ml ye tamamlanarak otoklavda sterilize edildi. 2. Kloroform : İzoamilalkol (24:1) Çözeltisi: 24 ml kloroform ve 1 ml izoamilalkol karıştırılarak hazırlandı. 20 o C de muhafaza edildi. 3. %70 lik Etil Alkol: 70 ml etil alkolün hacmi steril distile su ile 100 ml ye tamamlandı. -20 o C de muhafaza edildi. 4. Bromfenol Blue Çözeltisi: 0.25 gr. bromfenol blue, 0.25 gr. xylene cyanol FF ve 30 ml gliserol ün toplam hacminin 100 ml ye

56 39 tamamlanmasıyla hazırlandı. Çözelti otoklavda sterilize edildikten sonra + 4 o C de muhafaza edildi xTBE Tamponu: 100 ml 10xTBE nin hacmi steril distile su ile 2 L ye tamamlanarak hazırlandı. 6. %95 lik Etil alkol : %99,5 luk etil alkolden 95 ml. saf su ile hacmi 100 mlt ye tamamlanarak hazırlandı. 7. 0,5 M NaOH: 1 gr. NaOH ın hacmi saf su ile 50 ml ye tamamlanarak hazırlandı. 8. Ekstraksiyon Tamponu ( 100 mm Tris-HCl, 20 mm EDTA, 1,5 M NaCl, %2 lik CTAB, %3 lük β-merkaptoethanol): 2,42 gr. Tris, 1,5 gr. EDTA, 17,6 gr. NACl ve 4 gr. CTAB 100 ml. saf suda çözüldü. ph: 8 e ayarlandıktan sonra son hacim 200 ml ye tamamlanarak hazırlandı. Çözelti otoklavda sterilize edildikten sonra oda sıcaklığında saklandı. 9. 3M Na-Asetat: 81,66 gr. Na-Asetat 100 ml. saf suda çözüldü. ph: 8 e ayarlandıktan sonra toplam hacim 200 ml ye tamamlandı. Çözelti otoklavda sterilize edildikten sonra oda sıcaklığında saklandı M Tris-HCl : 12,11 gr. Tris alıp 80 ml. saf suda çözülerek ph:8 e HCl ile ayarlandıktan sonra hacmi 100 ml ye tamamlanarak

57 40 hazırlandı. Çözelti otoklavda sterilize edildikten sonra oda sıcaklığında saklandı ,5 M EDTA: 18,61 gr. EDTA alıp 80 ml. saf suda çözüldü. ph: 8 e NaOH ile ayarlandıktan sonra son hacim 100 ml ye tamamlandı. Çözelti otoklavda sterilize edildikten sonra oda sıcaklığında saklandı. 12. % 10 luk SDS: 10 gr. SDS ye 100 ml saf su eklenerek %10 luk SDS hazırlandı M NaCl: 29,22 gr. NaCl ün hacmi saf su ile 100ml ye tamamlanarak hazırlandı. Otoklavda sterilize edildikten sonra oda sıcaklığında saklandı. 14. %10 luk PVP: 10 gr. PVP nin hacmi saf su ile 100 ml ye tamamlanarak hazırlandı. 15. BSA: 1 ml. suda 20 mg. olacak şekilde hazırlandı. 20 mg. = 0.02 gr. => 0.02 gr./ 1ml distile steril su ile hazırlandı. Otoklavlanmadan, oda sıcaklığında saklandı mm MgCl: 1 M lık MgCl çözeltisinden 25 µl. alıp hacmi distile steril su ile 1000µl ye tamamlanarak hazırlandı. 20 C de muhafaza edildi.

58 41 DNA izolasyon yöntemleri Bitkiden DNA izolasyonu Domates bitkisinden ve yabancı otlardan DNA elde etmede saf DNA elde etmek ve zamandan tasarruf edebileceğimiz yöntemi saptamak amacıyla üç tane DNA elde etme yöntemi denenmiştir. Kuru domates örnekleri yaprak, meyve ve çiçek olarak ayrılarak, yabancı otlar ise tüm kısımlarıyla DNA elde etme işleminde kullanılmıştır. Ayrılan bitki kısımları toz haline getirilmiştir. Araziden topladığımız bitkilerin stolbur hastalığını taşıyıp taşımadıklarını PCR yöntemini kullanarak tesbit etmek amacıyla bitkiden DNA izolasyonunda ilk olarak aşağıdaki protokolden yararlanılmıştır (Khoodoo et al., 2005). 1. Ezilen örnekler 2 ml lik tüplerin içerisine konulmuştur ml lik ependorf tüplere konulan örneklerin üzerine içerisinde tüp başına NaCl 100 µl, Tris-HCl 200 µl, EDTA 100 µl, PVP 250 µl, Sarkasil (SDS) 150 µl, Etil Alkol % 95 lik 201 µl, son olarak Mercaptoethanol 10 µl ile yapılan solüsyondan eklenmiştir. 3. Tüp sayısı arttıkça, solüsyonun miktarı o oranda arttırılmıştır. 4. Vortekste ( karıştırıcıda) iyice homojen olması sağlanmıştır.

59 42 5. Daha sonra 40 C de su banyosunda en az 1 saat bekletilmiştir. 6. Su banyosundan çıkan tüplere, tüpler doluncaya kadar chloroform isoamilalkol eklenmiştir. 7. Chloroform isoamilalkol eklenen tüpler 20 dk. shaker da (karıştırıcı) karıştırılmıştır. 8. Karıştırma işleminden sonra devirde (rpm) 10 dk. santrifüj edilmiştir. 9. Santrifüjden sonra üst faz boş tüplere aktarıldı. Diğer kısım atılmıştır. 10. Hesaplanan oranda NaCl eklendi. Bu aşamada her işlemi yaparken tüpler buz içerisinde bekletilmiştir. 11. NaCl ekledikten sonra tüplere CTAB eklendi. Daha sonra tüpler çalkalanmıştır C su banyosunda 10 dk. bekletilmiştir. 13. Su banyosundan sonra tüpler doluncaya kadar fenol kloroform izoamilalkol ilave edilmiştir. 14. Shaker da 30 dk lık karıştırma işlemi yapılmıştır. 15. Daha sonra örnekler rpm de 20 dk. santrifüj edilmiştir. 16. Santrifüjden sonra üst faz buz içerisinde bekleyen tüplere aktarıldı. Diğer kısım atılmıştır. 17. Tüplerin üzeri doluncaya kadar izoproponal ile tamamlandı. Bu işlemler sonunda tüpler ( 20 C) de derin dondurucuda bir gece bekletilmiştir. 18. Ertesi gün buzdolabında bekletilen DNA lar rpm de 10 dk. santrifüjlenmiştir.

60 Santrifüjden sonra örneklerin üzerindeki sıvı atıldı. İçine 500µl. %70 lik etil alkol eklenmiştir. 20. Daha sonra rpm de 10 dk. santrifüjlenmiştir. 21. Sanrifüjden sonra üstteki kısım dökülüp tekrar 500µl. etil alkol eklenmiştir. 22. Tekrar rpm de 10 dk. santifüjlendi. Santrifüjden sonra üstteki süpertenant (sıvı) atılıp tüpler ters çevrilip ağızları açık peçete üzerinde kurutulmaya bırakılmıştır. 23. Kurutulmuş DNA lar TE tamponu ile çözülmüştür. 24. Örnekler TE tamponu ile çözüldükten sonra -20 C de saklanmıştır. Bitkiden DNA izolasyonunda ikinci yöntem olarak Fermentas DNA Purification Kitinden yararlanılmıştır. Kısa sürede DNA elde etme imkânı sağlaması nedeniyle bu yöntem denenmiştir. Bu yöntemde aşağıdaki protokol izlenmiştir. 1. Toz haline getirilmiş bitki dokusundan mg. 1,5 ml lik ependorf tüp içine konulmuştur. 2. Üzerine 200µl. TE tamponu eklenmiştir µl. örnek karışımına 400 µl. lysis çözeltisi eklenmiştir. 4. Daha sonra örnekler 65 C de su banyosunda 5 dk. inkübe edilmiştir. 5. İnkübasyondan sonra tüplere 600 µl. soğuk kloroform eklenmiştir. 6. Daha sonra örnekler rpm de 2 dk. santrifüjlenmiştir.

61 44 7. Bu arada 80 µl. 10x Precipitation çözeltisi 720 µl. steril su ile karıştırılarak çöktürme çözeltisi hazırlanmıştır. 8. Santrifüjden sonra tüplerin üzerindeki DNA içeren üst faz yeni bir tüpe aktarıldı ve üstüne 800 µl. precipitation çözeltisi eklenmiştir. 9. Daha sonra rpm de 2 dk. santrifüjlenmiştir. 10. Santrifüjden sonra süpernatant tamamen uzaklaştırılıp DNA peleti 100 µl.1,2 M NaCl çözeltisi ile çözülmüştür. 11. Üzerine 300 µl. soğuk %95 lik etanol eklenmiştir. 12. Bu aşamadan sonra tüpler DNA nın çökmesi için 20 C derin dondurucuya konulmuştur. 13. Buzluktan çıkarılan örnekler rpm de 3 4 dk. santrifüjlenmiştir. 14. Santrifüjden sonra etanol dökülmüştür. 15. Oda sıcaklığında tüpler ters çevrilip DNA lar kurutulmuştur. 16. Kurutulmuş DNA lar TE tamponu ile çözüldükten sonra -20 C de derin dondurucuda muhafaza edilmiştir. Bitkiden en saf DNA elde etmek ve pratikte kısa sürede sonuç alabilmek amacıyla üçüncü yöntem olarak aşağıdaki protokol takip edilmiştir (Warude et al., 2003). 1. 0,1 gr. örnek ependorf tüpe alınmıştır. 2. Üzerine içerisinde % 0,3 lük β-merkoptoetanol bulunan extraksiyon tamponundan 1000 µl. eklenmiştir.

62 45 3. Tüpteki karışım homojen hale gelinceye kadar vortekste karıştırılmıştır. 4. Daha sonra 65 C de 1 saat su banyosunda inkübe edilmiştir. 5. İnkübasyondan sonra tüplere eşit hacimde kloroformizoamilalkol ( 24:1) çözeltisi eklenmiştir. 6. Tüpler 700 rpm de 25 C de 10 dk. santrifüjlenmiştir. 7. Santrifüj sonucu 3 lü faz oluştu. Üstteki sulu faz temiz tüpe aktarılmıştır. 8. Sulu fazın aktarıldığı tüplerin üzerine tekrar eşit hacimde kloroform- izoamilalkol ( 24:1) eklenmiştir. 9. Tüpler 700 rpm de 25 C de 10 dk. santrifüjlenmiştir. 10. Üstteki faz tekrar temiz bir tüpe aktarılmıştır. 11. Tüplere DNA yı çöktürmek için 1/10 hacim Na- Asetat ve 2 hacim soğuk etil alkol ilave edilmiştir. 12. İyice karışmaları sağlandıktan sonra 5 10 dk. oda sıcaklığında bekletilmiştir. 13. Tüpler 700 rpm de 4 C de 5 dk. santrifüjlendi. Üstteki süpernatant uzaklaştırılmıştır. 14. Pelet % 70 lik etil alkol ile yıkanmıştır rpm de 4 C de 10 dk. santrifüjlenmiştir. 16. Santrifüj sonunda süpernatant uzaklaştırıldı ve peletin tamamen kuruması sağlanmıştır ( Şekil 3.7). 17. DNA peleti 50 µl. TE tamponu ile çözüldü. Çözünen DNA lar -20 C de derin dondurucuda saklanmıştır.

63 46 Şekil 3.7. DNA Peletlerinin Kurutulması Böceklerden DNA izolasyonu Domates stolbur hastalığının taşınmasında büyük rol oynayan vektör böceklerin saptanması amacıyla stolbur hastalığı görülen tarlalardan çok sayıda böcek toplanmıştır. Böcek toplarken atrap, japon şemsiyesi ve D-Vac gibi aletler kullanılmıştır. Bu aletlerle yakalanan böcekler aspiratör veya emgi şişesiyle emilip etil asetatla öldürülmüştür. Bu böceklerin teşhisleri yapılmıştır. Survey yapılan tarlalarda yoğun olarak görülen böcek türleri, Alebra albostriella, Tyhlocyba quercus, Psammotettix comitans, Parabolocratus storai, Peragallia sinuata, Aphrodes histrionicus, Psammotettix provincialis, Agallia consobrina, Doratura homophylla, Issus lauri, Leodelphax striatella, Cicadula divaricata dır. Bu türler içerisinden Tyhlocyba quercus türü domates stolbur hastalığının vektörü olarak saptanmıştır.

64 47 Domates stolbur hastalığının sağlıklı bitkilere taşınmasında rolü olduğu düşünülen potansiyel vektör böcekleri saptamak amacıyla araziden toplanan böcekler teşhis edildikten sonra DNA elde etmek için aşağıdaki protokol izlenmiştir ( Tanne et al., 2001). 1. 0,5 lik ependorf tüpe 1-2 böcek alınmıştır. 2. Tüplere böcekler konduktan sonra 10 µl. 0,5 M NaOH ekleyip pipet ucuyla böcekler iyice ezilmiştir. 3. Daha sonra içine 30 µl. 1M. Tris-HCl eklenip vorteksle karıştırılmıştır. 4. Karışım 15 dk. 65 C de su banyosunda bekletilmiştir. 5. Su banyosundan sonra 10 dk rpm de santrifüjlenmiştir. 6. Böcekler santrifüjden çıktıktan sonra üst kısımdaki sıvı kısım temiz tüplere alınmıştır. 7. Temiz tüplere alınan üst fazın 2 katı kadar % 70 lik etil alkol tüplerin üstüne eklenmiştir. 8. Daha sonra buzlukta 1 saat beklemeye bırakılmıştır. 9. Buzluktan çıktıktan sonra rpm de 10 dk. santrifüje konulmuştur. 10. Daha sonra üst kısım atılıp DNA peleti oda sıcaklığında kurumaya bırakılmıştır ( Şekil 3.7). 11. Kurutulan DNA peleti 30 µl. TE çözeltisiyle çözüldükten sonra -20 C derin dondurucuda saklanmıştır.

65 ve 280 nm de ultraviyole ışık absorbsiyon yöntemiyle dna konsantrasyonlarının ölçülmesi ve çalışma solüsyonlarının hazırlanması DNA miktarı, direkt olarak 260 nm deki absorbans ölçümüyle belirlendi. Genetik materyalin temizliği ise 280 nm de okunan absorbans değeriyle tespit edildi. İki kuars küvet içerisine 1000 µl TE çözeltisi konuldu. Program sıfırlandıktnan sonra kuars tüplerden bir tanesi kör olarak kullanılmak üzere spektrofotometre makinesinde bırakıldı. Diğer kuars küvete 998 µl TE ve 2 µl DNA eklenerek karışımın homojen olması sağlandıktan sonra 260 ve 280 nm de absorbansı ölçüldü ve her iki değerde kaydedildi. A 260 ve A 280 değerlerine bakılarak A 260 / A 280 = 1-2 olan örnekler çalışma solüsyonu hazırlamak için kullanıldı. DNA örneğinin konsantrasyonu (µg / ml) DNA Konsantrasyonu (µg/ml) = A 260 x Seyrelme Faktörü (500) x 50 (Nükleik Asit Katsayısı) formülü kullanılarak stok solüsyonun DNA konsantrasyonu belirlendi. DNA çalışma solüsyonunun konsantrasyonu ( ng / µl ) İstenen Konsantrasyon (200 ng/µl) x İstenen Hacim (100 µl)/stok DNA Konsantrasyonu (µg/ml) formülü ile DNA çalışma solüsyonu hazırlandı. Hesaplama sonucu elde edilen değer, stok DNA çözeltisinden alınacak miktarı verdi. Bu miktar TE çözeltisi ile 100 µl ye

66 49 tamamlanarak 200 ng/µl konsantrasyondaki DNA çalışma solüsyonu hazırlandı. DNA tüpleri 20 o C de muhafaza edildi. Primer çalışma konsantrasyonu ( µm / ml ) Primer konsantrasyonu (nmol) x 2 = Gerekli TE tamponu formülü kullanılarak 500 µm/ml konsantrasyonda stok primer çözeltisi hazırlandı. Bu çözelti 2 eşit hacme ayrıldı. C 1 x V 1 = C 2 x V 2 formülü ile önce 100 µm/ml, sonra 5 µm/ml konsantrasyonunda primer çalışma solüsyonu hazırlandı. 5 µm/ml ve 200 µl lik primer çözeltisi PCR çalışmasında kullanılmak üzere 20 o C de saklandı. Master mix in hazırlanması PCR ı yapılacak her bir örnek için 3 µl 10 x PCR tamponu (100 mm Tris HCl, 500 mm KCI, 15 mm MgCl 2, % 0.01 jelatin ph: 8.3), 0.9 µl dntp (deoksinükleotidtrifosfatlar: datp, dgtp, dctp, dttp 10mM), 4 µl primer P1 (forward 5 -AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GATT-3 ), ( Deng and Hiruki, 1991), 3 µl primer P6 ve P7 (reverse 5 -CGG TAG GGA TAC CTT GTT ACG ACT TA-3 ; 5-CGT CCT TCA TCG GCT CTT 3 ) (Deng and Hiruki 1991, Smart et al. 1996), 1µl DMSO, 0,75 µl MgCl 2, 0,3 µl taq DNA polimeraz ve µl steril distile su ile 25 µl lik reaksiyon karışımı hazırlandı. Karışıma son olarak 5 µl template DNA (200 ng/µl) eklenerek son hacim 30 µl ye tamamlanmıştır.

67 50 Kullanılan PCR programı PCR için hazırlanan örnekler, 94 o C de 5dk. denetürasyon, bunu takiben 36 döngü olacak şekilde 94 o C de 1 dk.denatürasyon, 56 o C de 1:15 dk bağlanma ve 72 o C de 1:40 dk. uzama basamakları ve son olarak 72 o C de 10 dk uzama basamağından sonra örnekleri + 4 o C de muhafaza edecek şekilde programlanan PCR termocycler cihazına yerleştirilmiştir. Seçilen programda hedef bölgelerin amplifikasyonu yapılmıştır. 16S 23S rdna PCR ürünlerinin elektroforez jelde yürütülmesi 1,5 g agaroz üzerine 100 ml 0.5 x TBE tamponu ilave edilmiştir. Karışım mikrodalga fırında agaroz tamamen çözülünceye kadar kaynatılmıştır. 50 o C ye kadar soğutulan agaroz jel içerisine 4 µl etidium bromide ilave edilmiştir. Karışım içerisine tarak yerleştirilmiş elektroforez jel küvetine dökülmüştür. 30 dk. kadar jelin donması beklenmiştir. Donan jelden tarak dikkatlice çıkarıldıktan sonra, jel 0.5 x TBE tamponu içeren tanka yerleştirilmiştir. Jeldeki ilk çukura, bant uzunluğu olan PCR marker dan 10µl yüklenmiştir. Diğer çukurcuklara ise her bir örnek için 3 µl bromfenol blue ve 15 µl PCR ürünü karıştırılarak pipetlenmiştir. Elektroforez jel düzeneği 100 volta ayarlanarak örnekler 2 saat yürütülmüştür. Jelde bulunan ve ethidium bromür ile boyanan DNA

68 51 bantları jel dokümantasyon sisteminde UV ışığı altında görüntülenip bilgisayar ortamında analiz edilmiştir PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) PCR sonucu elde edilen amplikonlar arasında tür farkı olup olmadığını saptamak amacıyla PCR-RFLP yöntemi kullanılmıştır. Bu işlemde aşağıdaki protokolden yararlanılmıştır. PCR ile domates bitkisi ve şeytan elması yabancı otundan elde edilen amplikonlar Bio Basic INC. EZ- 10 Spin Column DNA Gel Extraction kiti ile jelden izole edilmiştir. Kitle yapılan işlemlerin sırası aşağıda verilmiştir. 1. Jelde görüntülenen amplikonlar UV ışığı altında temiz bir bistüri ile kesilerek temiz bir ependorf tüpe aktarılmıştır hacim jele (100mg/100 ml) karşılık gelecek şekilde 400 ml binding Buffer ll eklenmiştir. 3. Agaroz tamamen çözününceye kadar arasıra karıştırılarak C'de 10 dk inkübe edilmiştir. 4. Karışıma spin columna eklenmiştir ve 2 dk bekletilmiştir rpmde 1 dk santrifüjlenmiş ve alttaki çözelti atılmıştır µl. wash solution eklenmiştir ve 8000 rpm de 1dk santrifüjlenmiştir. Tüpteki çözelti atılmıştır basamak tekrar edilmiştir.

69 52 8. Kalan yıkama tamponunu tamamen uzaklaştırmak için rpm de 30sn daha santrifüj yapılmıştır. 9. Kolon yeni bir tüpe aktarılmıştır. 10. Üzerine kolonun merkezine gelecek şekilde µl. elution buffer eklerek oda sıcaklığında 2dk inkübe edilmiştir. 11. DNAyı elür edebilmek için rpm de 1 dk santrifüjlenmiştir. 12. Elde edilen DNA -20 C de saklanmıştır. Bu işlemler sonucunda domates bitkisi ve şeytan elması yabancı otundan 2 saf amplikon elde edilmiştir. Daha sonra elde edilen amplikonları kesmek için Alul, Rsal ve Tru1l restriksiyon enzimleri kullanılmıştır. Bu işlemlerin sırası aşağıda verilmiştir. 1. Alul ve Rsal 37 C de Tru1l'de 65 C de çalıştığı için örnekler bu enzimlerle 1 gece bekletilmiştir. 2. Her bir tüpe 20 µl. template DNA, 4 µl. buffer, 2 µl. restriksiyon enzim, 14µl. distile su karıştırılmıştır. 3. Daha sonra tüpler içlerindeki restriksiyon enzime ait sıcaklıkta inkübasyona bırakılmıştır. 4. Ertesi gün tüpün içindeki kesilmiş amplikonlar %2 lik agaroz jelde 60 voltta yürütülmüştür. 5. Saf amplikonların kesilmiş hali UV ışık altında görüntülenmiştir.

70 Tohumdan tanı Stolbur hastalığı görülen tarlalardan, hastalıklı ve sağlıklı meyve örnekleri de toplanmıştır. Toplanan domates meyvelerinin tohumları çıkarılıp, ekim dönemi gelinceye kadar buzdolabında kuru bir ortamda saklanmıştır (Şekil 3.8, Şekil 3.9, Şekil 3.10, Şekil 3.11). Araziden toplanan meyvelerden ayrılan domates tohumları, ekim zamanları geldiğinde (Şubat ayı sonu- Mart ayı başı) sağlıklı ve hastalıklı meyvelerden alınan tohumları ayrı ayrı viyollere ekilerek tohumdan çıkacak bitkinin stolbur hastalığını taşıyıp taşımadığı, sağlıklı olan bitkilerle kontrollü olarak yapılmıştır (Şekil 3.12.). Her çeşitten 50 şer tohum viyollere ekilmiştir. Mart ayı başında viyollere ekilen domates tohumlarından elde edilen fideler Mayıs ayı başında büyük saksı şeklinde polietilen torbalara şaşırtılmıştır. Torbalar toprak, kum ve yanmış hayvan gübresi karışımı ile doldurulmuştur. 6 farklı çeşidin sağlıklı meyvelerinden alınmış tohum ve 6 farklı çeşidin stolburlu meyvelerinden alınmış tohum olmak üzere toplam 12 çeşit, 3 tekerrürlü olarak yetiştirilmiştir. Gözlemler bitkilerin gelişme döneminin sonuna kadar devam etmiştir ( Şekil 3.13). Laboratuar koşullarında da stolburlu ve sağlıklı domates tohumları 1-2 dakika %70 lik etil alkolde bekletilmiştir. İçerisinde su-agar bulunan erlenlere steril kabinde her kaba 5 tohum olacak şekilde, 5 erlene sağlıklı, 5 erlene hastalıklı tohumların ekimi yapılmıştır (Şekil 3.14). Kotiledon yaprakları çıkınca toplanıp DNA elde edilerek PCR

71 54 yapılmıştır. Çıkan sonuçlara göre, hastalığın tohumla taşınıp taşınmadığı belirlenmeye çalışılmıştır. A B Şekil 3.8. Hastalıklı Bitkiden Alınan Domates Meyvesi (A) ; Sağlıklı Bitkiden Alınan Domates Meyvesi (B) Şekil 3.9. Domates Tohumlarının Ayrımı

72 55 Şekil Domates Tohumlarının Gölgede Kurutulması Şekil Domates Tohumlarının Steril Kavanozlarda Buzdolabında Saklanması

73 56 Şekil Hastalıklı ve Sağlıklı Meyvelerden Ayrılan Tohumların Viyollerdeki Görünümü Şekil Domates Fidelerinin Polietilen Poşetlerdeki Görünümü

74 57 Şekil Su-Agarda Sağlıklı ve Stolburlu Tohumların Görünümü

75 58 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1. Domates Stolbur Hastalığının Belirtileri İle İlgili Bulgular Ülkemizde domates stolbur hastalığının belirtilerini ortaya koyan bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu nedenle çalışmamızda öncelikle domates stolbur hastalığının belirtilerini saptamaya çalıştık. Domates stolbur hastalığının en dikkati çeken belirtilerinden bir tanesinin gelişme geriliği olduğu gözlenmiştir. Şekil 4.1 de görüldüğü gibi sağdaki sağlıklı domates bitkisi, soldaki ise stolbur hastalığı görülen domates bitkisidir. Stolbur hastalığının bitkide gelişme geriliği meydana getirdiği sağlıklı bitkiyle karşılaştırıldığında çok belirgin bir şekilde görülmektedir. B A Şekil 4.1. Domates Bitkisinde Gelişme Geriliği ( A: Stolburlu Domates Bitkisi; B: Sağlıklı Domates Bitkisi)

76 59 Domates stolbur hastalığının önemli belirtilerinden bir tanesi de aşırı sürgün oluşumu sebebiyle ortaya çıkan çalımsı görünüm olarak saptanmıştır (Şekil 4.2). Tarlada stolbur hastalığı görülen bitkiler diğer sağlıklı bitkilerin arasından aşırı sürgün oluşumu ve boğum aralarının kısalması sonucu bitkinin uç kısımlarının çalı görünümünü alması nedeniyle kolaylıkla ayırt edilebilmişlerdir. Şekil 4.2. Domates Bitkisinde Çalımsı Görünüm Domates stolbur hastalığının yapraklarda sararma meydana getirdiği gözlenmiştir. Yapraklarda damar aralarında meydana gelen sararma belirtisinin domates stolbur hastalığının tanısında virüs hastalıkları ile karıştırılmasına neden olan belirtilerden biri olduğu saptanmıştır (Şekil 4.3).

77 60 Şekil 4.3. Domates Bitkisinde Yapraklarda Sararma Stolbur hastalığının tarlada en belirgin belirtilerinden bir tanesinin yaprakların kaşık gibi yukarıya doğru kıvrılması olarak saptanmıştır. Bu şekilde belirti veren yaprakların kalın ve sert yapıda oldukları gözlenmiştir. Yukarıya doğru kıvrılma belirtisi daha çok yaşlı yapraklarda görülmüştür (Şekil 4.4).

78 61 Şekil 4.4. Domates Bitkisinde Yapraklarda Yukarıya Doğru Kıvrılma Domates stolbur hastalığının dikkati çeken diğer bir belirtisi ise; antosiyan birikimi sonucu yapraklarda mor renklenme olarak gözlenmiştir ( Şekil 4.5).

79 62 Şekil 4.5. Domates Bitkisinde Yapraklarda Mor Renk Oluşumu Yaptığımız arazi çalışmalarında gözlemlediğimiz önemli belirtilerden bir tanesi ise, stolbur hastalığına çiçek bağlama döneminden daha önce yakalanmış bitkilerde meydana gelen küçük yapraklılık belirtisidir. Şekil 4. 6 da görüldüğü gibi; soldaki sağlıklı domates yaprağı ile karşılaştırıldığında sağdaki stolbur hastalığından etkilenmiş domates yapraklarının boyut olarak çok küçük oldukları görülmüştür. Yapraklar adeta maydanoz yaprağına benzemiştir. Literatürde domateste maydanoz yapraklılık olarak geçen belirti olduğu düşünülmektedir.

80 63 A B Şekil 4.6. Domates Bitkisinde Yapraklarda Küçülme (A:Sağlıklı Domates Yaprağı; B:Stolburlu Domates Yaprağı) Yaptığımız çalışmada, domates stolbur hastalığının en çok domates çiçeklerini etkilediği gözlenmiştir. Stolbur hastalığının domates çiçeklerinde meydana getirdiği ilk belirti normalde sarı olan çiçek taç yapraklarının yeşil renge dönüşmesidir (Şekil 4.7). Hastalığın çiçekte meydana getirdiği ve çiçeğin deformasyonuna neden olan, stolbur hastalığının karakteristik belirtilerinden bir tanesi de çiçek çanak yapraklarında meydana gelen genişlemedir (Şekil 4.8). Bu şekilde deforme olmuş çiçeklerin meyve bağlamadıkları gözlenmiştir.

81 64 Şekil 4.7. Domates Bitkisinde Taç Yaprakların Yeşil Renge Dönüşmesi Şekil 4.8. Domates Bitkisinde Çanak Yaprakların Genişlemesi

82 65 Domates stolbur hastalığının önemli belirtilerinden bir tanesi de kaliks in kalınlaşması sonucu oluşan tipik kese görünümü olarak saptanmıştır. Literatürde big bud olarak geçen ve domates stolbur hastalığına iri tomurcuk isminin verilmesine neden olan belirti olduğu düşünülmektedir (Şekil. 4.9). Şekil 4.9. Domates Bitkisi nde Kese Yapısı Yapılan arazi çalışmalarında, domates stolbur hastalığının çiçek çanak yapraklarının normal uzunluğuna göre daha uzun bir yapıda olduğu gözlenmiştir. Literatürde phyllody olarak geçen bu belirtinin stolbur hastalığının karakteristik belirtilerinden olduğu düşünülmektedir.

83 66 Bu belirtiyi gösteren çiçeklerin meyve bağlamadığı saptanmıştır (Şekil 4.10). Şekil Domates Çiçeklerinde Yaprakımsı Gelişme Belirtisi (Phyllody) Domates stolbur hastalığına halk arasında ve literatürde erkekleşme denilmesine neden olan belirti Şekil 4.11 ve Şekil 4.12 da görülmektedir. Dişi kısırlığı olarak adlandırılan bu belirti sonucunda meyve azlığı meydana geldiği ve bu durumun ürün kaybına neden olduğu gözlenmiştir.

84 67 Şekil Domates Bitkisinde Meyve Azlığı Belirtisi Şekil Domates Bitkisinde Dişi Kısırlık Belirtisi

85 68 Domates meyve bağladıktan sonra gerçekleşen enfeksiyonlarda meydana gelen meyvelerdeki deformasyonlar dikkati çeken belirtiler arasındadır (Şekil 4.13). Şekil Domates Meyvelerindeki Belirtiler Domates stolbur hastalığının en belirgin belirtileri çiçekte ve meyvede görülmüştür. Yaptığımız arazi çalışmalarındaki gözlemlerimize göre, enfeksiyon domates bitkisi meyve bağlamadan önce gerçekleşmiş ise çiçeklerde meydana gelen deformasyon nedeniyle o bitkinin meyve bağlamadığı gözlenmiştir. Oluşan meyvelerinde küçük kaldığı tespit edilmiştir (Şekil 4.14). Geç enfeksiyonlarda ise bitki ilk meyvelerini vermiş fakat meyvelerin kabuğunun kalın ve sert yapıda olduğu gözlenmiştir. Gözlemlerimize göre, domates bitkisinin meyveleri kızarmaya başladığı dönemde meydana gelen enfeksiyonlarda

86 69 meyvelerin su oranı azalmış ve bu meyveler içlerinde su az olduğu için buruşma belirtisi göstermiştir. Bu tip meyvelerin tohum bağlamadığı ve pazar değerinin düştüğü gözlenmiştir (Şekil 4.15; Şekil 4.16, Şekil.4.17). Şekil Domates Bitkisinde Küçük Meyve Görüntüsü

87 70 Şekil Domates Meyvesinde Deformasyon Şekil Domates Meyvesinde Buruşma Belirtisi

88 71 Şekil Domates Meyvesinde Tohum Bağlamama Görüntüsü Domates stolbur hastalığı görülen bitkiden alınan meyve ile sağlıklı domates bitkisinden alınan meyvelerin içini kestiğimiz zaman Şekil 4.18 de görüldüğü gibi, stolbur hastalığı görülen meyvenin iç kısmında beyazlama olduğu ve sağlıklı meyveye göre daha küçük ve cılız yapıda tohumlara sahip olduğu gözlenmiştir.

89 72 A B Şekil Sağlıklı Domates Meyvesiyle Stolbur Hastalığı Görülen Domates Meyvesi Arasındaki Fark (A: Stolburlu Meyve, B: Sağlıklı Meyve) yılları arasında domates üretim sezonunda yaptığımız arazi çalışmalarında domates stolbur hastalığının en dikkati çeken ve %100 ürün kaybına neden olan belirtilerinden bir tanesi Şekil da görülmektedir. Stolbur etmeninin enfeksiyonu, domates bitkisi meyve bağlamadan önce gerçekleşmiş ise, o bitkiden hiç ürün alınamadığı gözlenmiştir.

90 73 Şekil Erken Dönemde Stolbur Etmeninden Etkilenen Domates Bitkisinin Görünümü 4.2. Moleküler Tanı İle İlgili Bulgular Domates bitkisinden moleküler tanı bulguları Domates bitkisinin yaprak, çiçek ve olmak üzere farklı kısımlarından ayrı ayrı izole edilen genomik DNA üzerindeki 16S-23S rdna bölgesi P1 P7 ve P1-P6 universal primer setleri kullanılarak PCR termocycler cihazında amplifiye edilmiştir. PCR sonucu oluşan amplikonlar elektroforez sisteminde jelde yürütülerek domates stolbur patojenine ait DNA bantları elde edilmiştir. Jel dökümantasyon sisteminde görüntülenen bant profilleri bilgisayar ortamında

91 74 değerlendirilmiştir. Domates yaprak, çiçek ve meyvelerine ait P1-P6 ve P1-P7 universal primer setleriyle yapılan 16S-23S rdna PCR sonuçları Şekil 4.20, Şekil 4. 21, Şekil 4. 22, Şekil 4. 23, Şekil 4. 24, Şekil 4. 25, de verilmiştir. Çalışmamızda elde edilen sonuçların doğru olduğundan emin olmak için stolbur hastalığı nın ticari olarak piyasada bulunan pozitif ve negatif kontrolleri kullanılmıştır (Loewe, Almanya). Domates yapraklarından P1-P7 primer seti ile 1800 bp de tek bant elde edilmiştir. P1-P6 primer seti ile 1500 bp de tek bant elde edilmiştir. Her iki primer setiyle de aynı domates yaprak örneklerinden sonuç alınmıştır. Domates yaprak örnekleri arasında bant sayısı ve uzunluğu açısından herhangi bir farklılık görülmemiştir (Şekil 4.20, Şekil 4. 21). Şekil Domates Yapraklarının P1-P7 primer seti ile 16S-23S rdna PCR elektroforez sonuçları. M: Marker 1. kuyu: Negative Kontrol 2. kuyu: Pozitif Kontrol kuyular: Domates Yaprak Örnekleri (Marker Bant Uzunluğu bp.)

92 75 Şekil Domates Yapraklarının P1-P6 Universal Primer Seti ile 16S-23S rdna PCR elektroforez sonuçları. M: Marker 1. kuyu: Pozitif Kontrol 2. kuyu: Negatif Kontrol kuyular: Domates Yaprak Örnekleri (Marker Bant Uzunluğu bp.) Domates çiçeklerinden P1-P7 primer seti ile 1800 bp de tek bant elde edilmiştir. P1-P6 primer seti ile 1500 bp de tek bant elde edilmiştir. Her iki primer setiyle de domates çiçek örneklerinden aynı sonuç alınmıştır. Domates çiçek örnekleri arasında bant sayısı ve uzunluğu açısından herhangi bir farklılık görülmemiştir. Domates çiçekleriyle domates yapraklarından elde edilen sonuçlar arasında da bir fark gözlenmemiştir (Şekil 4.22, Şekil 4. 23).

93 76 Şekil Domates Çiçeklerinin P1-P7 Universal Primer Seti ile 16S-23S rdna PCR elektroforez sonuçları. M: Marker 1. kuyu: Negatif Kontrol 2. kuyu: Pozitif Kontrol kuyular: Domates Çiçek Örnekleri (Marker Bant Uzunluğu bp.)

94 77 Şekil Domates Çiçeklerinin P1-P6 Universal Primer Seti ile 16S-23S rdna PCR elektroforez sonuçları. M: Marker 1. kuyu: Negatif Kontrol 2. kuyu: Pozitif Kontrol kuyular: Domates Çiçek Örnekleri (Marker Bant Uzunluğu bp.) Domates meyvelerinden de P1-P7 primer seti ile 1800 bp de tek bant elde edilmiştir. P1-P6 primer seti ile ise 1500 bp de tek bant elde edilmiştir. Her iki primer setiyle de sadece 19 numaralı domates meyve örneğinden sonuç alınmıştır. Domates meyve örneklerinden alınan sonuçlar primer setlerine göre farklılık göstermiştir. Domates meyve örnekleri arasında bant uzunluğu açısından herhangi bir farklılık görülmemiştir. Domates meyve örnekleriyle, domates çiçekleri ve domates yapraklarından elde edilen sonuçlar arasında da bir fark gözlenmemiştir (Şekil 4.24, Şekil 4. 25).

95 78 Şekil Domates Meyvelerinin P1-P7 Universal Primer Seti ile 16S-23S rdna PCR elektroforez sonuçları. M: Marker 1. kuyu: Pozitif Kontrol 2. kuyu: Negatif Kontrol kuyular: Domates Meyve Örnekleri (Marker Bant Uzunluğu bp.) Şekil Domates Meyvelerinin P1-P6 Universal Primer Seti ile 16S-23S rdna PCR elektroforez sonuçları. M: Marker 1. kuyu: Pozitif Kontrol 2. kuyu: Negatif Kontrol kuyular: Domates Meyve Örnekleri (Marker Bant Uzunluğu bp.)

96 79 Alternatif konukçu bitkilerden moleküler tanı bulguları yılları arasında domates stolbur hastalığının yoğun olarak görüldüğü Marmara bölgesinde, stolbur hastalığı görülen tarlalarda alternatif yabancı otları saptamak amacıyla gözlem yapılmıştır. Stolbur hastalığı görülen domates tarlalarında yabancı otlardan Chenopodium album (Sirken), Datura stramonium (Şeytan Elması), Portulaca oleraceae (Semizotu), Solanum nigrum (Köpek Üzümü), Xanthium strumarium (Domuz Pıtrağı), Echinocloa spp. (Darıcan), Setaria spp. (Yapışkan Otu), Convolvulus arvensis (Tarla Sarmaşığı), Polygonum persicaria (Çoban Değneği), Amaranthus albus (Horozibiği) gibi türlere çok rastlanmıştır. Çiçekli parazit bitkilerden ise Orobanche ramosa (Canavar Otu) ve Cuscuta campestris (Küsküt) en çok rastlanan türler olmuştur. Yapılan PCR çalışmalarımız sonucunda yabancı otlardan Chenopodium album (Sirken),Datura stramonium (Şeytan Elması), Setaria spp. (Yapışkan Otu), Polygonum persicaria (Çoban Değneği), Amaranthus albus (Horozibiği) isimli 5 yabancı ot türü ve çiçekli parazit bitkilerden ise Orobanche ramosa (Canavar otu) ve Cuscuta campestris (Küsküt) domates stolbur hastalığının alternatif konukçusu olarak saptanmıştır ( Şekil 4.26, Şekil 4.27, Şekil 4.28, Şekil 4.29, Şekil 4.30, Şekil 4.31, Şekil 4.32).

97 80 Şekil Cuscuta campestris (Küsküt) Şekil Orobanche ramosa ( Canavar otu)

98 81 Şekil Amaranthus albus ( Horozibiği) Şekil Setaria spp. ( Yapışkan Otu),

99 82 Şekil Datura stromonium ( Şeytan Elması) Şekil Polygonum persicaria ( Çoban Değneği),

100 83 Şekil Chenopodium album ( Sirken) Arazi çalışmalarımızda stolbur hastalığı görülen tarlalardan yabancı ot, çiçekli parazit bitkiler ve domates dışındaki bitkilerden örnekler alınmıştır. Bu bitkilerden izole edilen genomik DNA üzerindeki 16S-23S rdna bölgesi P1 P7 ve P1-P6 universal primer setleri kullanılarak PCR termocycler cihazında amplifiye edilmiştir. PCR sonucu oluşan amplikonlar elektroforez sisteminde jelde yürütülerek domates stolbur patojeninin taşınmasında vektör görevi gören alternatif konukçu bitkilere ait DNA bantları elde edilmiştir. Jel dökümantasyon sisteminde görüntülenen bant profilleri bilgisayar ortamında değerlendirilmiştir. Alternatif konukçu bitkilere ait P1-P6 ve P1-P7 universal primer setleriyle yapılan 16S-23S rdna PCR sonuçları Şekil 4.33, Şekil de verilmiştir.

101 84 Laboratuar çalışmamızda elde edilen sonuçların doğru olduğundan emin olmak için domates örneklerinde de kullandığımız stolbur hastalığı nın ticari olarak piyasada bulunan pozitif ve negatif kontrolleri kullanılmıştır (Loewe, Almanya). Alternatif konukçu bitkilerden P1-P7 primer seti ile 1800 bp de tek bant elde edilmiştir. P1- P6 primer seti ile 1500 bp de tek bant elde edilmiştir. Primer setleriyle elde edilen sonuçlarda farklılık gözlenmiştir. Domates yaprak, çiçek ve meyve örnekleri ile alternatif konukçu bitkilerden elde edilen bantlar arasında bant uzunluğu açısından herhangi bir farklılık görülmemiştir (Şekil 4.33, Şekil 4. 34). Yaptığımız çalışmada, domates stolbur hastalığının alternatif konukçuları olarak Şekil de de görüldüğü gibi, çiçekli parazit bitkilerden Orobanche ramosa (Canavar otu, Orobanchaceae familyası) ve Cuscuta campestris (Küsküt, Cuscutaceae familyası) alternatif konukçu olarak saptanmıştır. Şekil 4.34 de görüldüğü gibi domates stolbur hastalığı nın görüldüğü tarlalardan topladığımız yabancı otlardan hastalığa alternatif konukçuluk eden türler, Setaria spp. (Yapışkan Otu, Poaceae familyası), Chenopodium album (Sirken, Chenopodiaceae familyası), Datura stramonium (Şeytan Elması, Solanaceae familyası), Polygonum persicaria (Çoban Değneği, Polygonaceae familyası) Amaranthus albus (Horoz İbiği, Amaranthaceae familyası ) olarak tespit edilmiştir.

102 Şekil Alternatif Konukçu Bitkilerde P1-P7 Universal Primer Seti ile 16S-23S rdna PCR elektroforez sonuçları. M: Marker 1. kuyu: Pozitif Kontrol 2. kuyu: Negatif Kontrol 3. kuyu: Domates Yaprak 4. kuyu: Küsküt 5. kuyu: Canavar Otu, 6. kuyu: Çoban Çantası, 7. kuyu: Köpek Üzümü, 8. kuyu: Ayrık, 9. kuyu:tarla Sarmaşığı, 10. kuyu: Güneş Dikeni, 11. kuyu: Yabani Hardal, 12. kuyu: Domuz Pıtrağı, 13. kuyu: Semiz Otu, 14. kuyu: Çatal Otu, 15. kuyu: Ayçiçeği Yaprak (Marker Bant Uzunluğu bp.) 85

103 86 Şekil Alternatif Konukçu Bitkilerde P1-P6 Universal Primer Seti ile 16S-23S rdna PCR elektroforez sonuçları. M: Marker 1. kuyu: Pozitif Kontrol, 2. kuyu: Negatif Kontrol, 3. kuyu: Horoz Kuyruğu, 4. kuyu: Şeytan Elması, 5. kuyu: Canavar Otu, 6. kuyu: Yapışkan Otu, 7. kuyu: Sirken, 8. kuyu: Çoban Değneği, 9. kuyu: Domates Çiçek, 10.kuyu: Darıcan, 11.kuyu: Bambul Otu, 12. kuyu: Semiz Otu (Marker Bant Uzunluğu bp.).

104 87 Böcekler ile ilgili bulgular TUBİTAK tan destekli TOGTAG 3390 no lu proje içerisinde yürütülen domates stolbur hastalığının potansiyel vektör böceklerinin saptanması amacıyla domates üretim sezonunda stolbur hastalığı görülen tarlalardan çok sayıda böcek toplanmıştır. Bu böceklerden izole edilen genomik DNA üzerindeki 16S-23S rdna bölgesi P1 P7 ve P1-P6 universal primer setleri kullanılarak PCR termocycler cihazında amplifiye edilmiştir. PCR sonucu oluşan amplikonlar elektroforez sisteminde jelde yürütülerek domates stolbur patojeninin taşınmasında vektör görevi gören böceklere ait DNA bantları elde edilmiştir. Jel dökümantasyon sisteminde görüntülenen bant profilleri bilgisayar ortamında değerlendirilmiştir. Vektör böceklere ait P1-P6 universal primer setiyle yapılan 16S-23S rdna PCR sonuçları Şekil 4.35 de verilmiştir. Laboratuar çalışmalarımız elde edilen sonuçların doğru olduğundan emin olmak için domates örnekleri ve alternatif konukçu bitkilerde de kullandığımız stolbur hastalığı nın ticari olarak piyasada bulunan pozitif ve negatif kontrolleri kullanılmıştır (Loewe, Almanya). Vektör böceklerden P1-P6 primer seti ile 1500 bp de tek bant elde edilmiştir. P1- P7 primer setiyle sonuç alınamamıştır. Domates yaprak, çiçek ve meyve örnekleri, alternatif konukçu bitkiler ile vektör böceklerden elde edilen bantlar arasında bant uzunluğu açısından herhangi bir farklılık görülmemiştir (Şekil 4.35).

105 88 Yaptığımız çalışmada, domates stolbur hastalığının vektörü olan böcek türü Şekil de görüldüğü gibi, Tyhlocyba quercus türü stolbur hastalığının potansiyel vektörü olarak saptanmıştır. Şekil Vektör Böceklerde P1-P6 Universal Primer Seti ile 16S-23S rdna PCR elektroforez sonuçları. M: Marker 1. kuyu: Negatif Kontrol, 2. kuyu: Pozitif Kontrol, 3. kuyu: Domates Yaprak, 4. kuyu: Tyhlocyba quercus 14. kuyu: Tyhlocyba quercus ( Marker Bant Uzunluğu bp.) 4.3. PCR-RFLP Bulguları RFLP, bir DNA parçasının herhangi bir restriksiyon enzimi ile kesilmesi olayıdır. Çalışmamızda P1-P6 primer setiyle domates bitkisi ve şeytan elması yabancı otundan elde edilen amplikonlar Alul, Rsal ve Tru1l restriksiyon enzimleri ile karıştırılmıştır. Şekil da görüldüğü gibi her üç enziminde her iki amplikonu kestiği görülmüştür. Bu sonuca

106 89 dayanarak elde edilen amplikonlar arasında tür farkı olmadığı saptanmıştır. Şekil PCR - RFLP Sonucu 4.4. Tohumla Taşınma İle İlgili Bulgular Domates stolbur hastalığının tohumla taşınıp taşınmadığını saptamak amacıyla, domates üretim sezonunda yaptığımız arazi çalışmaları sırasında sağlıklı meyvelerden ve stolbur hastalığı görülen bitkilerin meyvelerinden tohumlar alınmıştır. Bu tohumlar gölgede kurutululduktan sonra buzdolabında ekim zamanına kadar saklanmıştır. Şubat ayı sonunda tohumlar içerisinde torf bulunan viyollere sağlıklı ve stolburlu tohumlar ayrı ayrı ekilmiştir (Şekil 4.37).

107 90 Şekil Tohumların Viyollere Dikildikten Sonraki Görünümü Düzenli bakım işlemleri yapılmıştır. 20 Mart tarihinde ilk çıkışlar başlamıştır. Sağlıklı meyveden alınan tohumlar ile stolburlu meyveden alınan tohumlar arasında çıkış açısından bir fark gözlenmemiştir (Şekil 4.38).

108 91 Şekil Viyollere Ekilen Tohumların Çimlenme Görüntüsü Viyollere ekilen tohumlardan çıkan fideler, saksı büyüklüğünde polietilen torbalara şaşırtılacak büyüklüğe gelinceye kadar bakım işlemlerine devam edilmiştir. Fideler yeterli büyüklüğe erişince içerisinde kum, toprak ve yanmış hayvan gübresi karışımı bulunan polietilen torbalara şaşırtılmıştır. 6 farklı çeşidin sağlıklı meyvelerinden alınmış tohum ve 6 farklı çeşidin stolburlu meyvelerinden alınmış tohum olmak üzere toplam 12 çeşit, 3 tekerrürlü olarak yetiştirilmiştir (Şekil. 4.39, Şekil 4.40).

109 92 Şekil Domates Fidelerinin Viyollerdeki Görünümü Şekil Domates Fidelerinin Polietilen Torbalara Aktarılması

110 93 Gözlemler polietilen torbalarda gelişen domates fidelerinin her aşamasında devam etmiştir. Çalışmamızda kullandığımız farklı çeşitlerin sağlıklı olanlarla karşılaştırma yapılarak gelişmeleri takip edilmiştir (Şekil 4.41, Şekil 4.42, Şekil 4.43). Şekil Shasta Çeşidinin Sağlıklı Ve Stolburlu Tohumlarından Yetişen Fidelerin Görünümü Şekil Riogrande Çeşidinin Sağlıklı Ve Stolburlu Tohumlarından Yetişen Fidelerin Görünümü

111 94 Şekil Domates Fidelerinin Gelişme Durumu Şekil Hastalıklı Bitkiden Alınan Tohumdan Yetişen Bitki

112 95 Şekil Sağlıklı Bitkiden Alınan Tohumdan Yetişen Bitki Domates stolbur hastalığının tohumla taşınıp taşınmadığını saptamak amacıyla yaptığımız çalışma meyve bağlama dönemine kadar devam etmiştir. Şekil 4.44 ve Şekil 4.45 de görüldüğü gibi sağlıklı meyvelerden alınan tohumdan yetişen bitki ile stolburlu meyveden alınan tohumdan yetişen bitkide gelişme bakımından hiçbir fark gözlenmemiştir. Stolburlu meyveden alınan tohumlardan yetişen bitkilerde domates stolbur hastalığının belirtisine benzer belirtilere rastlanmamıştır. Laboratuar koşullarında erlenler içerisinde yetiştirilen sağlıklı ve hastalıklı tohumlar çimlendikten sonra ilk çıkan kotiledon yapraklar