BİTKİLERDE DOKU KÜLTÜRÜ

Transkript

1 BİTKİLERDE DOKU KÜLTÜRÜ BESİYERİ HAZIRLAMA KALLUS VE ORGANOGENESİS Hazırlayan: Mutlu Yalçın Can Çolak (12/10/2017)

2 1.Besiyeri (Ortam) Besiyerleri; Mikroorganizmaları, bulundukları ortam dışında ve laboratuvarlarda üretmek için formüle edilmiş, Mikroorganizmaların gereksinimini olan besin ögelerini içeren, ph ı uygun, Besleyici, Katı veya sıvı, yapay ortamlardır. 2

3 Besiyerlerinin çok farklı amaçlarla kullanılabilir. Bunlar mikroorganizmaların; Üretilmesi, geliştirilmesi ve canlılıklarının korunması, Duyarlılık ve sterilite testleri, Saf kültürlerinin elde edilmesi (izolasyonu), Tanımlanmaları (identifikasyon), Sayımları, Yapılarının ve biyokimyasal özelliklerinin incelenmesi, Biyolojik ve metabolik ürünlerinin elde edilmesi Gıda, su ve çevre kontrolleri, Antibiyotik ve vitamin analizleri olabilir 3

4 Mikroorganizmaların kalıtsal yapıları ve enzim sistemleri farklıdır. Fakat tüm mikroorganizmaların bir ortamda gelişebilmesi için; Suya, Bir enerji kaynağına (ışık veya kimyasal), Bir karbon kaynağına, Bir azot kaynağına (organik veya inorganik), Vitamin ve mineral maddelere gereksinimleri vardır. 4

5 Besiyerlerinin bileşiminde mutlaka bulunması gereken maddeler: Su, Karbohidratlar veya karbohidratlar bulunmadığı ya da yetersiz olduğunda proteinler gibi enerji kaynakları, Proteinler, peptonlar, amino asitler vb. organik bileşikler, KNO3, (NH4)PO4 vb. inorganik tuzlar gibi azot kaynağı maddeler, Vitaminler (özellikle B grubu), pürin ve primidin bazları, amino asitler gibi üreme faktörleri, Na, K, Cl, P, Ca, Fe, Mg, S vb. makro elementlerle, Zn, Mg, Br, Mo, Co, Cu, B vb. mikro elementler yani minerallerdir. 5

6 Bitki Doku Kültüründe Ana Parametreler 1. Besiyeri 2. Eksplant Kaynağı 3. Kültür Çevresi 6

7 BESİYERLERİNİN BİLEŞİMİNE GİREN BAŞLICA MADDELER Agar (jeloz): Agar, Gelidium, Euchheuma ve Pterocladia türlerine ait deniz yosunlarından ekstre edilen kuru, müsilaginöz karakterde bir maddedir. Agar sıvı ortamları katılaştırmak amacı ile %2-3 oranında kullanılır. Sıvı besiyerlerinin ph' sını etkilemez C'de erir ve C' de katılaşır. Yarı katı ortamlar için %O miktarlarında sıvı besi yerlerine ilave edilir. Agar kendi hacminin misli suyu katılaştırma özelliğine sahiptir. 7

8 Et Ekstraktı: Yağsız etten hazırlanan ham et suyunun su kısmının uçurulması sonucunda elde edilen koyu renkte macun gibi bir maddedir. Et Ekstraktı bir litreye 10 gr. Kadar katılır. Son yıllarda et ekstrastı toz halinde hazırlanmaktadır. 8

9 Jelatin: Sıvı ortamı katılaştırmak (% 12-15) ve mikroorganizmaların proteolitik etkilerini ölçmede kullanılan jelatin, protein tabiatında bir madde olup, kollagenin sıcak su ile hidrolizasyonundan elde edilir. Jelatinli besiyerleri 100 C' de sterilize edilmelidir. 9

10 Kazein Hidrolizat: Kazeinin (süt proteini) hidrolizasyonundan elde edilir. Bileşiminde fazla miktarda amino asit bulunur. Bunun dışında fosfatlar, tuzlar, üreme faktörleri ve mineral maddeler de vardır. 10

11 Maya Ekstraktı: Ekmek veya bira mayasından otolizasyonla yada asit veya proteolitik enzimlerle hidrolizasyonu ile elde edilir. Amino asitler üreme faktörleri ve inorganik maddeler bulunur. Besiyerlerine % oranında katılır. 11

12 Kan: Çeşitli hayvanlardan steril olarak alınan defibrine kan, katı besi yerlerine %5-l5 oranında ilave edilir. İyi bir üreme ortamı yarattığından hemen bütün organizmalar kanlı besiyerlerinde gelişebilirler. Kan, agar C'ye kadar soğutulduktan sonra katılır. 12

13 Pepton: Peptonlar kazein, fibrin ve kalp kasının proteolitik enzimlerle (Tripsin, pepsin veya papain) hidrolizasyonundan elde edilir. San renkli granüller halinde olup besiyerlerine %l-2 oranında katılır. 13

14 Serum: Sıvı veya katı ortamlara %5-10 oranında ilave edilir. Bileşiminde organik ve inorganik maddelerle üretme faktörleri vardır. Güç üreyen mikroorganizmaların gelişimini kolaylaştırılır. 14

15 Su: Su besiyeri erinin esasını teşkil eder. Eğer besi yerlerinin içinde çok miktarda mineral maddeler veya diğer bileşikler varsa distile su kullanılmalıdır. 15

16 Sodyum Klorür: Besiyerine ozmotik basıncı ayarlamak amacı ile %0.5 oranında katılır. 16

17 Karbon Kaynakları: Fermante olabilen karbonhidratlar mikroorganizmalar için enerji ve karbon kaynağı oldukları gibi, ayrışmaları sonunda meydana gelen organik asitler, besi yerinin ph'sını düşürdüklerinden zararlı etkiye sahiptir. Karbonhidratlar mikroorganizmaları fermantasyon özelliklerinin tayini için besiyerlerine %1 ve üremeyi tembih gayesi ile %0.1 oranında katılır. 17

18 İnorganik Maddeler: Bilhassa sentetik besiyerlerine, mikroorganizmaların ihtiyacına göre bileşikler halinde mineral maddeler ilave edilebilir. Sentetik olmayan besiyerlerine ilave edilen pepton, bulyon, maya ekstraktı, et ekstraktı ve diğer maddelerin bileşiminde yeterli derecede inorganik maddeler bulunmaktadır. 18

19 Besiyeri Formülasyonları Her besiyerinin bileşimi (formülü) bellidir. Kullanım amacına, bileşimine ve hazırlanış şekline göre uygun besiyerinin seçilmesi gerekir. Laboratuvarlarda çok kullanılan bazı Besiyerinin formülleri ve hazırlanışları aşağıda verilmiştir. 19

20 20

21 21

22 Besiyeri Hazırlık Aşamaları Bir gıda maddesinin mikrobiyolojik analizinde sonuçların geçerliliği; Analizlere uygun besi ortamının seçilmesine, Besiyerinin doğru olarak hazırlanışına, doğru kullanımına bağlıdır. Ortam bileşimine giren maddeler ve çözeltiler usulüne uygun olarak hazırlanmalı ve saklanmalıdır. Bilgi ile iyi bir şekilde hazırlanan besiyerlerinde mikroorganizmaları üretmek ve izole etmek daha kolaydır. Besiyerleri çok farklı şekillerde hazırlanabilir ve kullanılabilir. Tartılan besiyeri bileşenleri veya dehidre hazır besiyerlerinin hazırlanmasında sırasıyla; Tartım > Kaba Aktarma > Çözündürme > Berraklaştırma şeklinde yol izlenmelidir. 22

23 2. BESİYERLERİNİN STERİLİZASYONU VE MUHAFAZASI Sterilizasyon : Bir ortamı tüm mikroorganizmalar ve sporlardan arındırmaktır. Kullanıma hazır steril besiyerlerinin ve besiyeri katkıları dışında laboratuvarda hazırlanan tüm besiyerlerinin ve besiyeri katkıları sterilize edilmelidir. Sterilizasyonun amacı : Dehidre besiyeri, besiyeri katkıları ve besiyeri hazırlanırken kullanılan cam araç- gereç, hassas terazi, su, pamuk, vidalı kapak vb.den kaynaklanabilecek tüm mikroorganizmaları yok etmektir. Böylelikle besiyerinde yalnızca örnekten veya ana kültürden gelen mikroorganizmaların gelişmesi sağlanır. 23

24 Besiyerlerinin yapısına ve özelliğine göre farklı yöntemlerle sterilize edilir. Besiyeri sterilizasyonunda; 1.Isıl işlem (basınçlı buhar(otoklav),tindalizasyon,kaynatma) 2. Membran filitrasyon 3.Işınla sterilizasyon yöntemleri kullanılır. Diğer sterilizasyon yöntemleri olan kuru hava sterilizasyonu ve kimyasal maddelerle sterilizasyon yöntemleri besiyeri sterilizasyonu için uygun değildir. 24

25 Besiyerlerinin sterilizasyon sıcaklık derecesi ve uygulama süresi; Besiyeri cinsine, Hazırlanan besiyeri miktarına, Besiyerinin sıvı ya da katı oluşuna, Besiyerinin bulunduğu kabın cinsine göre değişir. 25

26 Otoklavda Sterilizasyon Su banyosunda en çok 100 0C lık sıcaklık sağlandığından besiyerlerinin genellikle otoklavda sterilize edilir. Otoklav, basınçlı buhar üretilen çift cidarlı araçlardır. Otoklavda sterilizasyonun esası havanın su buharı ile yer değiştirmesi ve buhar aracılığı ile ısı aktarımının daha kolay yapılmasıdır. Otoklav ile; Su buharı elde edilir. Su buharı istenen sıcaklıkta ve sürede kontrol altında tutulur. 26

27 27

28 Çeşitli Otoklav Örnekleri 28

29 Filtre ile Sterilizasyon 29

30 Mikrodalga Fırında Sterilizasyon 30

31 3. Kültür Çevresi 31

32 Doku Kültürü Küçük hücre,doku veya organ parçalarını veya organları bitkilerden ayıran ve aseptik koşullar altında sentetik beslenme ortamlarında (besiyeri) kültüre alan bir üretme tekniğidir. 32

33 33

34 34

35 Yüzeysel sterilizasyon (Materyal sterilizasyonu) Kültüre alınan materyalin sterilizasyonudur. Materyalin yüzeyinde mantar sporları ve bakteriler olabilir. Bunları öldürmek için sterilizasyon yapılır. Eksplantlar kış sonunda veya erken ilkbaharda alınırsa bu enfeksiyonlar en az düzeyde olmaktadır. Önce küçük dal parçaları bol su ile yıkanır. Yüzeysel sterilizasyonda %3 lük NaHCl(Çamaşır suyu) %70 lik alkol (etanol) ve saf steril su kullanılmaktadır. 35

36 36

37 37

38 Doku Kültürü İle Üretimin Yararları 38

39 39

40 KALLUS VE ORGANOGENESİS 40

41 Kalluslar, farklılaşmamış ince çeperli parankima hücrelerinin bölünmesi sonucunda meydana gelirler. In vitro şartlar altında eksplantlar üzerinde, yaralanmaya karşı ve büyüme hormonlarının besin ortamına katılmasına yanıt olarak çoğalırlar. Bölünme sonucu meydana gelen kallus (sağdaki petri) 41

42 Kalluslar ayrıca doğadaki bitkilerde oluşan yara dokusu üzerinde gelişerek bu yara dokusunun kapanmasında rol oynarlar. Erythrina (mercan) ağacı kallus oluşumu 42

43 Yapraktan kallus oluşumu Vaskular dokudan kallus oluşumu Kökten kallus oluşumu Embriyodan kallus oluşumu 43

44 Kallus gelişim aşamaları 1. İndüksiyon 2.Hücre Bölünmesi 3. Farklılaşma 44

45 Kalluslarda gelişim aşaması ve farklılaşma 45

46 Kalluslar karanlık ortamlarda uzun süre saklanabilirler. Aydınlık ortamlarda ise sürgün oluşumuna yönelirler. Saklanma sürecinde zamanla fotosentez başta olmak üzere yeteneklerini kaybedebilirler. Uzun süreli saklanan kalluslar bir süre sonra karanlık ortama adapte olabilirler ve karanlıkta stabil halde kendilerini koruyabilirler. 46

47 Kallusun uzun süreli kültüre alınması bazı yapısal değişikliklere yol açmaktadır: Kallus hücrelerinin bölünme ve gelişme için artık hormona gerek duymamaları ve neticede hormon-otonom bir kallusun meydana gelmesi (habituation). Organik potansiyelin yani yeni adventif sürgün veya kök meydana getirme yeteneğinin azalması veya tamamen ortadan kalkması 47

48 Kallus dokusunun yapısında bazı değişikliklerin kendiliğinden ortaya çıkması. Örneğin, nispeten daha küçük hücrelerden meydana gelmiş sık yapılı (compact) bir kallus veya daha büyük ve şeffaf hücrelerden meydana gelmiş gevşek yapılı (friable) bir kallusun meydana gelmesi. Oluşan bu durumda gevşek yapılı kalluslar hücre süspansiyon kültüründe kullanılmaktadır. Ayrıca sadece kültürdeki hormon seviyesiyle oynayarak bu kalluslar elde edilebilir. 48

49 Kallus kültürlerinin düzenli aralıklarla (3 6 hafta) alt kültüre alınması gerekmektedir. Uzun süreli alt kültüre alınan kalluslarda somaklonal varyasyon oranı artmaktadır. Günlere göre kallus gelişimi 49

50 Hücre süspansiyon kültürü Protoplast Eksplant Kallus Somatik Embriyogenez Somatik Organogenez Direkt Organogenez Organogenez 50

51 Organogenesis Somatik hücrelerden ya da dokulardan yapraklar, sürgünler ya da kökler gibi organların oluşmasıdır. * Kallus oluşumuna göre iki farklı gelişim süreci vardır. 51

52 In vitro şartlar altında yapılan bir organogenezde, etkin bir organ oluşumunun yerine getirilebilmesi için; Uygun eksplantın seçilmesi Büyümede aktif maddeler içeren uygun besin ortamı Fiziksel çevre koşullarının kontrolü En önemli şartlar arasındadır. 52

53 İndirekt Organogenesis * Kallus oluşumu içeren organ gelişim sürecidir. * Somaklonal varyasyon sağlamaktadır. Primer eksplant Kallus Organ 53

54 Brokoli bitkisinde indirekt organogenez 54

55 Direkt Organogenez Dedifferentiation: değişime uğramamış ya da özelleşmemiş duruma yeniden dönüş süreci (tersine farklılaşma ya da aynılaşma olarak adlandırılabilir) Differentiation: özel işlevleri olan yeni ve değişmiş doku ve organların büyümesinin başlaması süreci (farklılaşma) 55

56 Organogenez avantajları; Hücre veya dokulardan yeni bitki bireyleri meydana getirmeye imkan tanıdığı için, generatif yoldan çoğaltılması zor olan bitkilerin üretimine kolaylıklar sağlamaktadır. Bitki transformasyon çalışmalarında oldukça önemlidir. Dezavantajı; Bütün bitki türleri için evrensel bir rejenerasyon protokolü yoktur. Her bitki türü, hatta her bitki çeşidi için spesifik bir sistemin optimize edilmesi gerekir. 56

57 TEŞEKKÜRLER 57

58 BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜNDE BESİYERİ VE EKSPLANT SEÇİMİ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Ziraat Fakültesi EYLEM SÜZEN & TUĞBA KURUN

59 İÇİNDEKİLER BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜNÜN TANIMI VE TEMEL AMACI BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜNDE STERİLİZASYON TEKNİKLERİ BESİYERİ ORTAMLARI BİTKİ BESİ ORTAMLARINDA KOMPONENTLER KÜLTÜR ŞARTLARI EKSPLANT KALLUS BİTKİ REJENERASYONU 59

60 DOKU KÜLTÜRÜ Aseptik şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre, doku veya organ gibi kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin üretilmesidir. 60

61 Doku kültürünün temel amacı Yeni çeşit geliştirmek Mevcut çeşitlerde varyabilite oluşturmak Kaybolmakta olan türleri korumak ve çoğaltmak Zor olan türleri üretmek 61

62 Sterilizasyon teknikleri Çalışma ortamının sterilizasyonu Besin ortamlarının, alet ve ekipmanlarının sterilizasyonu Bitki materyallerinin yüzey sterilizasyonu 62

63 Çalışma ortamının sterilizasyonu Steril çalışma alanında kullanılacak yüzeyler kullanımdan en az dakika önce %10luk ticari sodyum hipoklorit solüsyonu veya %70lik alkolle silinir. Kabin içinde UV lambası varsa açılır. Fakat bu sırada kabin içinde hiçbir işlem yapılmaz ve canlı bitki materyali bulundurulmaz. 63

64 Kullanılacak aletler kullanımdan önce etil veya metil alkol içine batırıldıktan sonra alev lambasına tutularak alevle yüzey sterilizasyonuna tabi tutulur. Kültür kapları açıldıktan sonra boğazları ve ağız kısımları aleve tutulmalıdır. Bu işlem kapların ağız kısımlarından kaynaklanabilecek kontaminasyonu engelleyecektir. 64

65 Besin ortamlarının, alet ve ekipmanların sterilizasyonu Besin ortamları, alet ve ekipmanları şu şekilde sterile edilir. Otoklav ve buhar sterilizasyonu Filtre sterilizasyonu Mikrodalga sterilizasyonu Bir diğer yöntemde etilen oksitle yapılan gaz sterilizasyonudur. 65

66 Otoklav ve sıcak hava basıncı sterilizasyonu Besin ortamlarının sterilizasyonu için standart bir işlem olarak otoklavda 15 dakika 105kPa basınçta 121 C de tutulması gerekmektedir. 66

67 300ml den fazla besin ortamı içeren şişelerin kapakları gevşek tutulmalıdır. Otoklav sonrası kapaklar hemen sıkıştırılmalıdır. Bütün ortamlar otoklav edildikten sonra 1-2 saat dışarıda bekletilmeli ve soğutulduktan sonra kullanılıncaya kadar kapalı dolaplarda saklanmalıdır. 67

68 Filtre sterilizasyonu Filtre sterilizasyonu sıvı ortamlar ve ısı ile bozulabilen maddelerin stok solüsyonları için kullanılır. 68

69 Filtre ile sterilize edilen besin ortamlarını herhangi bir kontaminasyon riskinden korumak için bu ortamlar en az 4-5 gün dolapta tutulduktan sonra kullanılmalıdır. Katı ortamlar yapılmak isteniyorsa, sıvı ortamlar çift yoğunlukta hazırlanırlar, yine çift yoğunlukta hazırlanmış ve otoklav edilmiş agar ile kabin içinde karıştırılarak normal yoğunluğu getirilebilirler. 69

70 Mikrodalga sterilizasyonu Tisserat ve ark. 700W gücünde bir ev mikrodalga fırınını kullanarak %3 sakkaroz içeren 100ml besin ortamının 5 dakikada, 250ml ortamın 10 dakikada ve 1 litre ortamın da 15 dakikada başarıyla sterilize edilebileceğini bildirmişlerdir. Aynı şekilde 50ml agar içeren ortamlarda 15 dakikada başarıyla sterilize edilmiştir. 70

71 Bitki materyallerinin yüzey sterilizasyonu Dış şartlardan alınan eksplantlar öncelikle musluk suyu altında en az yarım saat tutulurlar. Tohum ve yumru gibi daha kaba parçalar 1-20 saniye alkol içinde tutulduktan sonra gerçek yüzey sterilizasyonu ortamına konulur. Yüzey sterilizasyonu için en çok kullanılan maddeler etil alkol, sodyum veya kalsiyum hipoklorit, cıva klorür, gümüş nitrat ve hidrojen peroksittir. 71

72 72

73 Besiortamları MS B5 LS WH SH NN 73

74 MS Ortamı Tütün için geliştirilmiş yüksek tuz içerikli bir ortamdır. Özellikle yoğunluklarda birçok bitki türündeki köklendirme çalışmalarında başarıyla kullanılmaktadır. 74

75 B5 Ortamı Soya kallus kültürleri için geliştirilmiş nitrat azotu yüksek bir ortamdır. 75

76 LS ortamı MS ortamının organik bileşikler tarafından faklı bir versiyondur. 76

77 WH ortamı Düşük tuz formülasyonlu ve domates köklerinin kültürü için geliştirilmiş bir ortamdır. 77

78 SH ortamı Hem monokotiledon hem de dikotiledonlar için uygun bir besin ortamıdır. 78

79 NN ortamı Anter kültürü için geliştirilmiştir. 79

80 Bitki besin ortamlarında yer alan komponentler kullanım sıklığına göre sırasıyla; Su Makro elementler Mikro elementler Vitaminler Şekerler Yarı katılaştırıcılar Bitki büyüme düzenleyicileri Tamponlar Amino asitler Kimyasal olarak tanımlanamayanlar. 80

81 Makro ve mikro elementler Makro elementler Azot, fosfor, sodyum, magnezyum, kükürt, kalsiyum. Mikro elementler Demir, manganez, çinko, bor, bakır, molibden, kobalt, iyot. 81

82 Vitaminler Vitaminler enzim reaksiyonlarında katalitik etkiye sahiptirler. Genellikle otoklavdan önce besin ortamına ilave edilirler. Thiamin, nikotinik asit, pridoksin, Myo-inositol ve d- biotin dir. Diğer vitaminler arasında d-pantotenik asit, askorbik asit, a-tokoferol, folik asit, retinol, riboflavin ve kolekalsiferol. 82

83 Şekerler Sakkaroz, glikoz, maltoz, rafinoz, fruktoz. Yarı katılaştırıcılar Agar, agoroz, Sea-Kem agaroz, aljinat, phytagel, silikajel, jelatin ve nişasta. 83

84 Amino asitler Glisin, arginin, glutamin, prolin, aspartik asit. Kimyasal olarak tanımlanamayanlar Hindistan cevizi sütü, kazamino asit, maya özü 84

85 Organik asitler Besin ortamlarında kullanılan organik asitler Fumarik asit, malik asit, sitrik asit ve sodyum piruvattır. Antibiyotikler Genellikle çok hassas ve çok çabuk bozulabilen maddelerdir ve otoklavdan sonra besin ortamına ilave edilmelidirler. Kabeksilin, sefotaksim, eritromisin, geneisin, higromisin, kanamisin, streptomisin ve gentamisin 85

86 Bitki büyüme düzenleyicileri Bitki hormonları bir dokuda üretilip, büyüme ve gelişmenin olacağı diğer dokulara taşınan ve çok düşük konsantrasyonlarda etkili olan bileşiklerdir. 86

87 Oksinler Fotoperyodizim, kendirme, apikal dominans yan sürgünlerin gelişiminin engellenmesi ve hücre gelişiminde etkilidir. Oksinler, doku kültürlerinde tek başlarına kullandıklarında kallus uyarımını, hücre süspansiyonlarının elde edilmesini ve somatik embriyo oluşumunun uyarımını, sitokinlerle birlikte yine kallus oluşumunu, sürgün rejenerasyonunu ve somatik embriyo oluşumunun uyarımını sağlayabilirler. 87

88 Oksinlerin büyümeyi artırıcı etkileri 2 mekanizma ile açıklanmaktadır. Oksinler hücre çeperinde H+ iyonu taşımını arttırıp hücre çeperinin esnekliğini artırarak daha çok su alınmasını sağlarlar. Böylece hücre şişer ve büyür. Büyümenin aynı hızda olabilmesi için gerekli mrna ların sentezini uyarırlar. 88

89 Sitokinin Hücre bölünmesini ve özelleşmemiş genç hücrelerde farklılaşmayı iletir. Sitokininler olarak isimlendirmelerinin nedeni de sitokinezi uyarmasıdır. Sitokininler klorofilin ve hücre proteininin bozulmasını yavaşlatıp RNA sentezini arttırarak yaşlanmanın geciktirilmesi ya da azaltılması şeklinde rol oynamaktadırlar. 89

90 Doku kültürü ortamında oksin/sitokinin oranı yüksek ise köklenme, sitokinin/oksin oranı yüksek ise sürgün oluşumu görülür. Bu iki hormonun oranı dengelenince hücre kütlesi büyümeyi sürdürmekle birlikte faklılaşmaz ve küme oluşturur. Faklılaşmamış bu hücre kümesi kallus olarak isimlendirilir. 90

91 Giberellinler Giberellinler hem hücre bölünmesini uyararak hem de uzamayı sağlayarak gödenin uzamasına neden olur. Tohum çimlenmesinde depo nişastasının hidrolizini gerçekleştiren a-amilaz enziminin oluşumunu sağlayarak, nişastanın embriyo tarafından kolaylıkla kullanılabilen şekerlere dönüşümüne yardımcı olur ve çimlenmeyi kolaylaştırır. 91

92 Absisik asit Donma, yüksek tuz içerikleri ve kuraklık gibi uygun olmayan koşullarda kalan bitkilerde ortaya çıkan değişimleri kontrol eder. Örneğin tuz stresi osmotin denilen yeni bazı proteinlerin sentezlenmesine neden olur. Absisik asit şekerlerin ve aminoasitlerin taşınmasında depo maddelerinin sentezinde ya da her ikisinde etkili olabilmektedir. 92

93 Etilen Meyve olgunlaşması sırasında etilen sentez hızı artar. Kuraklık, su baskını, soğuk veya mekanik bir etki olarak rüzgar gibi stres koşulları etilen sentezini arttırır. Etilen özellikle dikotil bitkilerde yaprakların üst kısmındaki parankimatik hücrelerin uzamasına ve yaprağın kalınlaşmasına neden olurken genellikle köklerin ve gövdelerin uzamasını engeller. Bu durumda gövde ve kök daha kalın bir hal alır. 93

94 Kültür şartları Ortamın fiziksel hali Ortamın ph değeri Nem Işık Sıcaklık 94

95 95

96 BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜNDE EKSPLANT SEÇİMİ 96

97 EKSPLANT Ana bitkiden ayrılıp kültürü yapılan bitki parçası INOKULUM Kültürde olan bir bitki materyelinin alt kültürü 97

98 EKSPLANT Hava kısımları toprak altı kısımlarından daha temizdir. Küçük eksplant kontaminasyon riskine karşı daha iyidir ama yaşama yeteneği azalır. İç dokular daha sterildir. Eksplantlar daima ayni davranışı sergilemezler. 98

99 KALLUS İnce çeperli parankima hücrelerinin kitlesel yapısıdır. Köklerde ve gövdede yaralı bölgede kallus oluşur. 99

100 Yapraktan kallus oluşumu Kökten kallus oluşumu Embiryodan kallus oluşumu 100

101 Kallus, aseptik ortamlar altında düzenli zaman aralıkları ile altkültür yapılıp yeni ortamlara aktarılarak uzun bir süre korunabilir. Fakat dış görünüşe rağmen, kallus değişmez bir doku değildir. Aslında kallus hücrelerini farklılaşmış hücreler yığını olarak değil de, herhangi bir organizasyon göstermemiş hücreler yığını olarak tanımlamak daha doğrudur. 101

102 Hüçre büyüklüğü ve şekli, Vakuolleşme oranı, Sitoplazmik içeriği, Hücre yapısı, Bakımından farklılık gösterir. 102

103 Tipik kallus hücresi fazlaca vakuollü parakima hücresidir ve çok ince çevresel bir sitoplazma katmanı ile hücre duvarına karşı baskılanmış bir çekirdeğe shiptir. 103

104 Bitki Rejenerasyonu Organogenesis Somatik embriyogenesis Protoplast kültürü Haploid hücre kültürü Meristem kültürü (hastalıksız bitki üretimi) 104

105 Organogenesis Hücrelere ve dokulara baskı uygulayıp bazı değişikliklere sebep olarak sürgün veya kök taslağı diye adlandırılan tek kutuplu ve vasküler sistemi kökenini aldığı dokuya bağlı olan bir yapının meydana gelmesine yol açan işlemdir. 105

106 Etkin bir organ oluşumunun yerine getirilebilmesi için gerekli olan şartlardan en önemli olanları arasında; 1. Uygun eksplantın seçimi 2. Büyümede aktif maddeleri içeren uygun bir besin ortamının seçilmesi 3. Fiziksel çevre koşullarının kontrolü 106

107 Uygun eksplantın seçimi Çeşitli faktörler kültüre alınan eksplantın davranışını etkileyebilir. 1. Doku kaynağı olarak kullanılan organ 2. Organın genetik ve fizyolojik yaşı 3. Eksplantın bitkiden alındığı dönem 4. Eksplantın büyüklüğü 5. Eksplantın alındığı bitkinin genel özellikleri 107

108 Besin ortamının seçilmesi Besin ortamının temel özellikleri 4 sınıf altında toplanabilir. 1. İnorganik maddeler 2. Organik maddeler 3. Bitki büyüme düzenleyiciler 4. Doğal kompleksler 108

109 Fiziksel çevre koşullarının kontrolü 1. Ortamın fiziksel hali 2. ph 3. Nem 4. Işık 5. Sıcaklık 6. Kültür kaplarında biriken gazlar 109

110 110

111 Organogenesis Avantaj Hücre veya dokulardan yeni bitki bireyleri meydana getirmeye imkan tanıdığı için, generatif yoldan çoğaltılması zor olan bitkilerin üretimine kolaylıklar sağlamaktadır. Dezavantaj Bütün bitki türleri için evrensel bir rejenerasyon protokolü yoktur. Her bitki türü, hatta her bitki çeşidi için spesifik bir sistemin optimize edilmesi edilmesi gerekir. Bitki transformasyon çalışmalarında oldukça önemlidir. 111

112 Somatik Embriyogenesis Bağımsız vasküler sistemi olan ve kök ile sürgün aksini içeren iki kutuplu bir yapının oluşmasına yol açan bir süreçtir. Vejetatif hücrelerden gelişen embriyolar da somatik embriyo olarak adlandırılır. 112

113 Somatik Embriyogenesis Bireysel bitkilerin hücrelerinden geliştikleri için somatik embriyolardan elde edilen bitkiler genetik olarak klon oluştururlar. Gövde-kök eksenine aynı zamanda sahip olup, asıl doku ile vaskular bağlantıları olmadığından dolayı dokudan kolaylıkla ayrılabilirler. 113

114 Dikotiledon bitkilerde somatik embriyoların gelişim dönemleri globular kalp torpedo kotiledon 114

115 115

116 Somatik Embriyogenesisin Kullanım Alanları Klonal Çoğaltım Sentetik Tohum Üretimi Gen Aktarımı 116

117 ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ Hazırlayan: Emre ERDAĞLI

118 Verimi yüksek bitkilerin tohumlarından veya tohum taslaklarından embriyoların izole edilerek belli ortamlarda kültüre alınması embriyo kültürü olarak tanımlanmaktadır.bu teknik ilk defa 1904 yılında Hannig tarafından uygulanmıştır.embriyo kültürü embriyonel büyüme ve farklılaşma üzerine besinlerin,bitki büyüme düzenleyicilerinin ve diğer kimyasal ve fiziksel faktörlerin etkilerini İncelemek için yararlı bir tekniktir.

119 Embriyo kültürü tipleri; 1-Olgun tohum embriyolarının kültürü 2-Olgunlaşmamış erken bölünme fazındaki proembriyoların kültürü

120 Gelişmesini tamamlamış tohumlardan izole edilen olgun embriyolar,tohumun çimlenmesini engelleyen dormansiyi ortadan kaldırmak amacıyla kültüre alınır.

121 Olgunlaşmamış embriyoların kültürü,genellikle normal koşullarda gelişmesini tamamlayamayan embriyolardan yaşama gücündeki bitkilerin elde edilmesi amacıyla yapılır.

122 Çimlenmesi çok çimlendirilmesi, daha zor olan tohumların Genetik çalışmalarda ıslah süresinin kısaltılması, Yeterince gelişememiş yaşatılması, ve hibrit embriyoların Haploid bitki üretilmesi, Hastalıksız bitki üretimi, Tohumla üretimi zor olan bitkilerin üretimidir

123 GENOTİP: Bazı bitki türlerin de embriyoların in vitro kültürü çok iyi iken bazı türler de çok güçtür.hatta aynı türlerin genotipleri arasında bu açıdan büyük farklılıklar vardır.

124 EMBRİYOLARIN İZOLASYON SIRASINDAKİ GELİŞME DÖNEMİ: Çok küçük olgunlaşmamış embriyoların invitro kültürde geliştirilerek bunlardan bitki elde edilmesi çok zordur. Gelişmeleri ilerlemiş durumdaki embriyoların invitro kültürü daha kolaydır.

125 ANA BİTKİLERİN YETİŞME KOŞULLARI: Embriyo kültürü amacıyla kullanılacak donor bitkiler genellikle serada yetiştirilir.aynı zamanda tarla koşullarında yetiştirilen bitkilerde bu amaçla kullanılabilir.donor bitkilerin büyüme koşullarının iyileştirilmesi endosperm gelişmesinin daha iyi olmasını,dolayısıyla da embriyoların daha iyi büyümesini sağlar.

126 BESİ ORTAMININ BİLEŞİMİ: 1-Olgunlaşmamış embriyolar olgun embriyolara göre daha kompleks besi ortamlarına gereksinim duyarlar.aynı zaman da hem olgunlaşmamış hemde olgun embriyoların in vitro kültürün de besi ortamı makro ve mikro elementleri ile şeker içermelidir. 2-Genellikle PH ı 5-6 arasında değişen katı ortamlar kullanılır. 3-Agarın genellikle %0,6-0,8 konsantrasyonları kullanılır.yüksek agar konsantrasyonları embriyo büyümesini engeller.

127 4-Embriyo kültürü için çok değişik mineral besi ortamları kullanılmaktadır.embriyolar mineral solüsyonlara çok hassas olup,büyümeyi teşvik eden mineral solüsyonlar embriyolarda toksik etki yapabilmekte,toksik etki yapmayan mineral solüsyonlar ise embriyoların normal farklılaşmasını sağlayamamaktadır.bundan dolayı embriyo kültürü için kullanılan mineral solüsyonlarda bu durumların dikkate alınması gerekmektedir.

128 5-Embriyo kültüründe şeker kaynağı olarak genellikle sakkaroz kullanılır.fakat bazı durumlarda fruktoz ve glikoz daha iyi sonuç verebilmektedir.

129 6-Genellikle embriyo kültüründe büyüme düzenleyicilerine ihtiyaç duyulmaz.fakat bazı durumlar da ise besi ortamına ilave edilen düşük dozdaki IAA(indolacetic acid) nın embriyo büyümesini olumlu yönde etkilediği belirlenmiştir. 7-Embriyo kültüründe besi ortamına hindistan cevizi sütü,meyve ve sebze püreleri ile kazein hidrolizat gibi maddelerin ilavesi bazı durumlarda embriyo büyüme ve gelişmesini olumlu yönde etkileyebilir.

130 8-Embriyoların invitro kültürü sırasında büyüme ve gelişme sonucu embriyoların besin maddesi gereksinimleri değişeceği için bazı durumlarda alt kültür gerekli olabilmektedir. SICAKLIK Embriyo kültüründe optimum sıcaklık bitki türüne göre farklılık gösterir. Normal olarak genellikle embriyolar C de kültür edilir.

131 OKSİJEN Oksijen embriyo kültüründe önemli bir faktördür.bazı durumlarda okisijen gereksinimi normal havanın oksijen içeriğinden daha fazla olabilir. IŞIK Bazı durumlarda izole edilmiş embriyolar 7-14 gün süre ile karanlık koşullara ihtiyaç duymaktadırlar.bu karanlık dönemden sonra ışık koşullarında klorofil oluşumu gerçekleşir.

132

133 İn vitro koşullarda vejetatif hücrelerden embriyo oluşumu somatik embriyogenesis olarak tanımlanmaktadır. Somatik embriyoların zigotik embriyolardan en önemli farkı, orijinleri somatik hücreler olduğu için elde edilen bitkilerde genetik açılımın meydana gelmemesi ve bir klon oluşturabilmeleridir. Oysa zigotik embriyolar döllenmiş yumurta hücrelerinden meydana geldiği için gelişen bitkilerde genetik açılım ortaya çıkmaktadır

134 Direkt (doğrudan) somatik embriyogenesis, İndirekt (kallus dokusundan) somatik embriyogenesis olmak üzere iki şekilde meydana gelmektedir. 1) Direkt somatik embriyogenesis: Somatik embriyoların eksplant üzerinde bulunan tek bir hücre ya da hücre gruplarından arada kallus aşaması olmadan doğrudan meydana geldiği durumdur. Bu embriyolar kallustan değil doğrudan eksplant hücrelerinden oluştuğu için genetik özellikleri eksplantın özellikleri ile tamamen aynıdır. 2) İndirekt somatik embriyogenesis: Somatik embriyoların yüksek oksin içeren ortamlarda eksplanttan meydana gelen embriyogenik kallustan oluştuğu durumdur. Kallus aşaması nedeniyle oluşan somatik embriyolarda varyasyon ortaya çıkma olasılığı yüksektir...

135 1) Klonal çoğaltım: Farklı türlerde somatik embriyoların oluşum, çoğalma ve bitkiye dönüşüm protokollerinin geliştirilmesinden sonra somatik embriyogenesis hızlı, yoğun ve bir örnek bitki çoğaltımı için önemli bir kaynak durumuna gelmiştir. 2) Sentetik tohum üretimi: Somatik embriyolar, zigotik embriyolardan farklı olarak çimlenme sırasında besin kaynağı olarak kullanabilecekleri endosperm ya da depo kotiledonlarına ve bir tohum kabuğuna sahip değillerdir. Bu nedenle somatik embriyoların tohum olarak kullanılabilmeleri için ekim sırasında onları koruyacak, çimlenme gerçekleşene kadar canlı tutacak ve bitkilerin ilk gelişmesi sırasında gerekli olan besin maddelerini sağlayacak bir duruma getirilmeleri gerekmektedir. Bu amaçla uygulamada en fazla somatik embriyoların kaplanması işlemi üzerinde durulmaktadır. 3) Gen aktarımı 4) Genetik materyalin muhafazası

136

137 Meristem, Sürgün ve Tomurcuk Kültürü HAZIRLAYAN: NİHAL KÖKEN

138 MERİSTEM KÜLTÜRÜ Meristematik hücreleri kullanarak gerçekleştirilen doku kültürü özellikle virüsten arındırılmış bitkilerin elde edilmesinde yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Apikal sürgün ve kök meristemi hücrelerinin virüs içerme ihtimali oldukça düşüktür.

139 Meristem ve Sürgün Ucu Kültürlerinin Uygulama Alanları : Virüssüz materyal elde etmek Mikro çoğaltım Germplazm muhafazası Genetik transformasyonlar Bitki materyallerinin uluslararası değişimi Bakteri ve mantarlardan arındırılmış bitkilerin üretimi

140 Meristem Ucu Kültürlerinde Başarıyı Etkileyen Faktörler Bitki Materyali - Eksplantın büyüklüğü - Donör bitkinin fizyolojik durumu - Eksplantın alındığı mevsim - Çeşit Kültür Ortamı - Mineral tuzlar - Şekerler - Agar - Büyüme düzenleyicileri Kültür şartları

141 Meristem Ucu Kültürünün Yararları En yüksek genetik kararlılık in vitro klonal çoğaltımda elde edilmektedir. Meristem ucu kültürü ile bulaşık olan bir donör bitkiden viral, bakteriyal, ve fungal patojenler uzaklaştırılabilir. Meristem ucu, soğukta muhafaza ve diğer kültür muhafaza teknikleri için homojen bir doku tipi olması ve küçük olması bakımından çok uygundur. Kimera olan bir materyalin aynen çoğaltımı için meristem ucu kültürü çok uygun bir tekniktir. Meristem ucu kültürleri, karantina uygulamalarına göre uluslararası taşımada çoğunlukla kabul edilen kültürlerdendir.

142 SÜRGÜN UCU KÜLTÜRÜ Büyümekte olan sürgünlerin 2cm den kısa uç kısımlarının steril koşullarda suni besi ortamlarında kültürelde edilerek.bunlardan tam teşekküllü bitkiler elde edilmektedir.

143

144 Tomurcuk Kültürü Büyümekte olan veya dormant durumundaki sürgünlerden izole edilen tepe veya koltukaltı tomurcuklarının steril koşullarda suni besi ortamlarında kültür edilerek bunlardan tam teşekküllü bitkiler elde edilmesidir.

145 Meristem, Sürgün Ucu Ve Tomurcuk Kültürünün Bitki Yetiştirme Ve Islahındaki Kullanım Alanları 1.Mikro çoğaltım 2.Virüssüz bitki eldesi 3.Germplazm muhafazası 4.Gen transferi

146 1-Mikro çoğaltım Organik meristemlerden henüz olgunlaşmamış veya olgunlaşmasını tamamlamış somatik hücrelerden direkt (organogenesis veya somatik embriyogenesis) veya indirekt (kallus,protoplast) yollarla bitkilerin çoğaltılması ve köklendirilmesi işlemine genel olarak mikro çoğaltım denir.

147

148 2-Virüssüz Bitki Elde Edilmesi Bitki kullanım alanı ve ıslah metotlarından biri olan virüssüz bitki eldesi istenilmeyen her türlü hastalıktan,genetik tozlaşmadan vs.arındırılmış ve uzaklaştırılmış olan bitkilerin eldesi ve üretilip çoğaltılmasını sağlar Kısacası virüslere dayanıklı çeşitlerin elde edilmesini ve geliştirilmesini amaçlar.

149

150 Virüssüz Bitki Elde Etme Yöntemi 1.Sıcaklık 2.Hastalıksız bitki elde edilmesinde meristem kültürü 3.Sıcaklık uygulamasından sonra meristem kültürü 4.Kimyasal uygulaması ile birlikte meristem kültürü 5.Adventif sürgün oluşumundan sonra meristem kültürü 6.Meristemlerin virüssüz anaçlara aşılanması

151 Germplazm (genetik Materyal) Muhafazası: Totipotent hücrelerin in vitro kültürü, kallus veya süspansiyon hücreleri şeklinde uzun süreli olarak veya belirli aralıklarla yeniden oluşturularak saklanabilir ve ihtiyaç duyulduğunda bu hücrelerden yeni bitkiler oluşturulabilir.

152 Genetik Materyalin Muhafazası Esnasında Dikkat Edilmesi Gereken Hususlar A-muhafaza edilen materyal herhangi bir değişikliğe uğramamalı B-muhafaza süresi sonunda materyal tekrardan kullanılabilmelidir yani büyüme ve gelişmesi devam edebilmeli C-muhafaza yöntemi farklı koşullarda farklı bitkiler içinde uygulanabilmeli D-uygulanan muhafaza tekniği materyalde seleksiyon etkisi yapmamalı E-uygulanan yöntem çok pahalı olmamalı ve kolay uygulanabilmeli..

153 Genetik Materyalin Meristem, Sürgün Ucu Ve Tomurcuk Şeklinde Muhafaza Edilmesi Yöntemleri 1.Büyümenin yavaşlatılması 2.Çok düşük sıcaklıkta sıvı azot içerisinde muhafaza (cryopreservation) 2.1.Cryopreservation tekniğinin uygulanması 2.1.Steril koşullarda Meristemlerin izolasyon ve kültüre alınması 2.2.Dona karşı kimyasalların kullanılması 2.3.Meristemlerin dondurulması 2.4.Meristem depolama 2.5.Buzun çözülmesi ve Meristemlerin yeniden kültürlenmesi

154 2.3. Meristemlerin Dondurulması -Yavaş Dondurma Bu yöntem fazla miktarda su içeren bitki dondurulmasında kullanılıyor.özel olarak üretilmiş materyaller kullanılıyor.. Meristemler C/dk olacak şekilde yavaş yavaş C kadar soğutuluyor.. Örn:bezelye,çilek Dikkat:Özel yapılmış materyallerdondorucular-sadece burada kullanılıyor.

155 - Hızlı dondurma Bu işlem dona karşı koruyucu maddelerle muhafaza edilmiş meristemlerin sıvı azot içine daldırılması ile olur. Dikkat edilmesi gereken husus dondurma esnasında hücrelerin arasında buzun oluşmasını engelleyerek meristemlerin canlı kalmasını sağlamaktır. Not:Bu yöntem çok sayıda stoplazması bulunan ama az sayıda vakuol bulunan bitkilerde uygulanır. Örnek: Karanfil-ilk kez1976-,patates,çilek

156 -Damla Halinde Dondurma Bu yöntem kassavameristemlerinin dondurulması için geliştirilmiş.dona karşı koruyucu kimyasal çözelti steril bir petrikabına 18μm likşeritler halinde yerleştirilen alimünyumkağıtlar üzerine 2-3μm likdamlalar damlatılır her petrikabına meristem yerleştirilir. Petrikabları0,5 C/dksoğutma hızı

157 2.4. Meristem Depolama Dondurulan meristemler sıvı azot için de depo edilir. Dikkat edilmesi gereken husus meristem bütünüyle azot içinde kalmalıdır..

158 2.5. Meristemlerin Buzunun Çözülmesi ve Yeniden Kültürlenmesi Sıvı azot içindeki meristemler çıkarılır çıkarılmaz c su banyolarına konulur.buzlar çözündükten sonra uygun besi ortamında kültürlere alınır.

159 GENETİK TRANSFORMASYON Gen transferi: Doku kültürlerinin bitkileri iyileştirmede en önemli ve yaygın olarak kullanılan uygulamalarından biriside,gen veya genlerin bitkilere aktarılmasıdır. Monokotiledon ve dikotiledon bitkiler de bir DNA parçasının aktarımında çok farklı yöntemler kullanılır.. Dikotiledon bitkilerde genelde agrobacteriyum bakterisi kullanılıyor.

160

161 4. MERİSTEM VE SÜRGÜN UCU, TOMURCUK KÜLTÜRÜNÜN UYGULANMASI

162 5. Meristem Ve Sürgün Ucu, Tomurcuk Kültüründe Başarı Faktörleri 5.1 Bitki Materyali Eksplantın Büyüklüğü Tomurcuğun Bitki Üzerindeki Yeri Mevsim 5.2 Besi Ortamı 5.3 Genotip

163 5.1 Bitki materyali 5.1 Eksplantın büyüklüğü Genel olarak in vitro kültürde kullanılan eksplant büyüdükçe eksplantın in vitro gelişme şansıda artar. İn vitro çoğaltma amacıyla çok küçük meristemler yerine tomurcuk veya sürgün uçlarının kullanılması gerekir, ama eğer amaç virüssüz bitki elde etmek ise olabildiğince küçük meristemler kullanılmalıdır

164 Tomurcuğun Bitki Üzerindeki Yeri Sürgün ucundan alınan eksplantlar sürgün tabanından alınanlara göre daha genç durumdadırlar.. Genellikle genç gelişme devresi sürgün rejeneresyonu için optimumdur.

165 Mevsim Eksplantın alındığı mevsim oldukça önemlidir. Belirli bir dormansi periyoduna sahip bitkilerde eksplantlar bu dormansi periyodunun sonunda alındığında en iyi sonuçlar elde edilecektir.

166 5.2. Besi Ortamı Besi ortamının mineral madde kompozizyonu ve ilave edilmesi gereken büyüme düzenleyicilerinin çeşidi ve konsantrasyonu bitki türüne ve özelliklede kültür dönemine bağlı olarak değişir.

167 5.2.1 Eksplant Gelişmesi-1.Dönem- Bu evrede bitkide sitokinin eksikliği olur bitkiye sitokinin ilave edilmesi gerekir.. En fazla istimal edilen sitokininler: kinetin, BA(benziladenin), 2iP dir.

168 Sürgün Çoğaltma Dönemi-2.Dönem- Burda da amaç mümkün oldukça çok sayıda sürgün elde etmektir.. Yine sitokinin ihtiyacı vardır Köklendirme Dönemi : Bir önceki aşamada elde edilen sürgünlerin köklendirilmesi amaçlanır. Köklendirmede dikkat edilmesi gereken husus mineral maddelerin konsantrasyonu azaltılmalıdır.. Sitokinin ihtiyacı azdır, burada auxin NAA sık sık ilave edilmelidir.

169 5.3. Genotip Belirli bir türün genotipi için geliştirilen meristem, sürgün ucu ve tomurcuk kültürü tekniği söz konusu türün diğer bir çok genotipi için de kullanılır.

170 TEŞEKKÜRLER

171 1)Organogenesis hücre veya dokulardan yeni bitki bireyleri meydana getirmeye imkan tanıdığı için... çoğaltılması zor olan bitkilerin üretimine kolaylıklar sağlamaktadır. cevap: generatif yoldan 2)Somatik embriyogenesisin kullanım alanları;...,...,... dır. cevap: Klonal Çoğaltım, Sentetik Tohum Üretimi, Gen Aktarımı 3)Bütün bitki türleri için evrensel bir rejenerasyon protokolü.... Her bitki türü, hatta... için spesifik bir sistemin optimize edilmesi edilmesi gerekir. cevap: yoktur, her bitki çeşidi 4)Kültüre alınan eksplantın davranışını aşağıdakilerden hangisi etkilemez? A) Eksplantın bitkiden alındığı dönem B) Eksplantın büyüklüğü C) Doku kaynağı olarak kullanılan organ D) Organın genetik ve fizyolojik yaşı E)Bitkinin türüne cevap:e 5)Küçük eksplant kontaminasyon riskine karşı daha... ama yaşama yeteneği... cevap:iyidir, azalır 6)Kallus, aseptik ortamlar altında düzenli zaman aralıkları ile... aktarılarak uzun bir süre korunabilir. cevap: altkültür yapılıp... yeni ortamlara Tuğba KURUN

172 1. Doku kültürü ortamında..oranı yüksek ise köklenme,..oranı yüksek ise sürgün oluşumu görülür. Bu iki hormonun oranı.hücre kütlesi büyümeyi sürdürmekle birlikte faklılaşmaz ve küme oluşturur. Faklılaşmamış bu hücre kümesi.olarak isimlendirilir. oksin/sitokinin, sitokinin/oksin, dengelenince, kallus 2. Vitaminler genellikle otoklavdan.besin ortamına ilave edilirler. Antibiyotikler otoklavdan..besin ortamına ilave edilmelidirler. Ve bunun sebebi nedir? Önce, sonra antibiyotikler çok hasas ve bozulabilen maddelerdir. Bunun için otoklavdan sonra ortama konulmalıdır. 3. Oksinlerin büyümeyi artırıcı etkileri 2 mekanizma ile açıklanmaktadır. Bu iki mekanizma; Oksinler hücre çeperinde H+ iyonu taşımını arttırıp hücre çeperinin esnekliğini artırarak daha çok su alınmasını sağlarlar. Böylece hücre şişer ve büyür. Büyümenin aynı hızda olabilmesi için gerekli mrna ların sentezini uyarırlar. 4.Besin ortamları, alet ve ekipmanları şu şekilde sterile edilir..: Besin ortamlarının sterilizasyonu için standart bir işlem olarak otoklavda 15 dakika 105kPa basınçta 121 C de tutulması gerekmektedir..: sıvı ortamlar ve ısı ile bozulabilen maddelerin stok solüsyonları için kullanılır..: 700W gücünde bir ev mikrodalga fırınını kullanarak %3 sakkaroz içeren 100ml besin ortamının 5 dakikada, 250ml ortamın 10 dakikada ve 1 litre ortamın da 15 dakikada başarıyla sterilize edilebileceğini bildirmişlerdir. Otoklav ve buhar sterilizasyonu, Filtre sterilizasyonu, Mikrodalga sterilizasyonu 5.Aşağıdakilerden hangisi doğrudur? A) Kullanılacak aletler kullanımdan önce etil veya metil alkol içine batırıldıktan sonra alev lambasına tutularak alevle besin ortamlarının sterilizasyonuna tabi tutulur. B) Sıvı ortamlar yapılmak isteniyorsa, katı ortamlar çift yoğunlukta hazırlanırlar, yine çift yoğunlukta hazırlanmış ve otoklav edilmiş agar ile kabin içinde karıştırılarak normal yoğunluğu getirilebilirler. C) Tohum ve yumru gibi daha kaba parçalar 1-20 saat alkol içinde tutulduktan sonra gerçek alet ve ekipman sterilizasyonu ortamına konulur. D) Filtre ile sterilize edilen besin ortamlarını herhangi bir kontaminasyon riskinden korumak için bu ortamlar en az 4-5 gün dolapta tutulduktan sonra kullanılmalıdır. D şıkkı 6. Aşağıdakilerden hangisi yanlıştır? A)MS: Tütün için geliştirilmiş yüksek tuz içerikli bir ortamdır. Özellikle yoğunluklarda birçok bitki türündeki köklendirme çalışmalarında başarıyla kullanılmaktadır. B) B5: Soya kallus kültürleri için geliştirilmiş nitrat azotu yüksek bir ortamdır. C) WH: Düşük tuz formülasyonlu ve domates köklerinin kültürü için geliştirilmiş bir ortamdır. D) NN: Anter kültürü için geliştirilmiştir. E) LS: Hem monokotiledon hem de dikotiledonlar için uygun bir besin ortamıdır. E şıkkı Eylem SÜZEN

173 1-Apikal sürgün ve kök meristemi hücrelerinin. İçerme ihtimali oldukça düşüktür. Cevap:Virüs 2-Aşağıdakilerden hangisi meristem dondurmasında,kullanılan yöntemlerden değildir? A)Yavaş dondurma B)Hızlı dondurma C)Damla halinde dondurma D)-80 derecede dondurma Cevap:D 3-Meristem,sürgün ucu ve tomurcuk külütüründe.,,.. başarıyı etkiler. Cevap: Bitki Meteryali, Besi Ortamı,Genotip 4-Bir DNA parçasının aktarımında dikotiledon bitkilerde genelde agrobacterium bakterisi kullanılır. Cevap:Doğru 5-Dondurulan meristemler sıvı azot içerisinde muhafaza edilir.muhafaza edilirken meristetemin bütünüyle azot içerisinde kalmasına gerek yoktur. Cevap:Yanlış 6-Meristem ucu kültüründe başarıyı etkileyen faktörlerden biride kültür ortamıdır. Aşağıdakilerden hangisi kültür ortamında olması gerekir? A)Büyüme düzenleyiciler B)Antibiyotik C)Herbisit D)su Cevap: A 7-Aşağıdakilerden hangisi meristem sürgün ucu ve tomurcuk kültürüyle bitki yetiştirme ve kullanım alanlarıdır? 1)Mikro çoğaltım 2)Virüssüz bitki eldesi 3)Germplazm muhafazası 4)Gen transferi 5)Doku kültürü Cevap: A)1-2-3 B) C) D) Pakize Nihal KÖKEN

174 Soru: Sterilizasyon nedir? Besiyeri sterilizasyonunun amacını açıklayınız. Sterilizasyon : Bir ortamı tüm mikroorganizmalar ve sporlardan arındırmaktır. Kullanıma hazır steril besiyerlerinin ve besiyeri katkıları dışında laboratuvarda hazırlanan tüm besiyerlerinin ve besiyeri katkıları sterilize edilmelidir. Sterilizasyonun amacı : Dehidre besiyeri, besiyeri katkıları ve besiyeri hazırlanırken kullanılan cam araçgereç, hassas terazi, su, pamuk, vidalı kapak vb.den kaynaklanabilecek tüm mikroorganizmaları yok etmektir. Böylelikle besiyerinde yalnızca örnekten veya ana kültürden gelen mikroorganizmaların gelişmesi sağlanır. Soru: Doku kültürü ile bitki üretiminin faydalarını ve zararlarını açıklayınız. Faydaları : Generatif ve vegatatif üretim yöntemleri ile çoğalması zor olan bitkilerin üretilmesi Virüslerden arınmış bitkilerin elde edilmesi Bitkilerin ıslahı Eczacılıkta ve kimya sanayisinde farklı çeşitlerde bitkilerin üretilmesi Hızlı üretim Islah Uzun süreli muhafaza Sekonder metabolit üretimi Genetik kaynağı materyalinin uzun süre muhafaza edilebilmesi Zararları : Doku kültürüne alınan bir bitki türü ya da çeşidi üzerinde çalışıldığında ve ileri düzeyde verim elde edildiğinde ticari tür olarak kullanılma potansiyeli çok yüksek olacaktır. Böylelikle diğer tür veya çeşit tohum kullanılmayacağı için doku kültüründe üretilen tüm bitkiler birbirinin klonu olacağı için genetik çeşitlilik azalacaktır. Bir diğer önemli nokta ise doku kültürü laboratuarı kurulması, tesisleşme, tecrübeli laborant ya da bilim insanı temin edilmesi gibi işletme becerisi ve maliyet gerektiren bir organizasyondur. Can ÇOLAK

175 1)Embriyo kültür nedir acıklayınız?çeşitleri nelerdir? Verimi yüksek bitkilerin tohumlarından veya tohum taslaklarından embriyoların izole edilerek belli ortamlarda kültüre alınması embriyo kültürü olarak tanımlanmaktadır.iki çesiti vardir.bunlar; a)olgun tohum embriyolarının kültürü b)olgunlaşmamış erken bölünme fazındaki proembriyoların kültürü 2) Embriyo kültüründe amaç nelerdir? Çimlenmesi çok daha zor olan tohumların çimlendirilmesi, Genetik çalışmalarda ıslah süresinin kısaltılması, Yeterince gelişememiş ve hibrit embriyoların yaşatılması, Haploid bitki üretilmesi, Hastalıksız bitki üretimi, Tohumla üretimi zor olan bitkilerin üretimidir 3) Embriyo Kültüründe Başarıyı Etkileyen Faktörler Nelerdir? GENOTİP EMBRİYOLARIN İZOLASYON SIRASINDAKİ GELİŞME DÖNEMİ ANA BİTKİLERİN YETİŞME KOŞULLARI BESİ ORTAMININ BİLEŞİMİ SICAKLIK OKSİJEN IŞIK 4) SOMATİK EMBRİYOGENESİS nedir? Neden Yapılır? İn vitro koşullarda vejetatif hücrelerden embriyo oluşumu somatik embriyogenesis olarak tanımlanmaktadır. zigotik embriyolar döllenmiş yumurta hücrelerinden meydana geldiği için gelişen bitkilerde genetik açılım ortaya çıkmaktadır.bu yüzden somatik embriyogenesis kullanılmaktadır. 5) Somatik Embriyogenesisin Kullanım Alanları Nelerdir?Acıklayınız? Klonal çoğaltım: Farklı türlerde somatik embriyoların oluşum, çoğalma ve bitkiye dönüşüm protokollerinin geliştirilmesinden sonra somatik embriyogenesis hızlı, yoğun ve bir örnek bitki çoğaltımı için önemli bir kaynak durumuna gelmiştir. Sentetik tohum üretimi: Somatik embriyolar, zigotik embriyolardan farklı olarak çimlenme sırasında besin kaynağı olarak kullanabilecekleri endosperm ya da depo kotiledonlarına ve bir tohum kabuğuna sahip değillerdir. Bu nedenle somatik embriyoların tohum olarak kullanılabilmeleri için ekim sırasında onları koruyacak, çimlenme gerçekleşene kadar canlı tutacak ve bitkilerin ilk gelişmesi sırasında gerekli olan besin maddelerini sağlayacak bir duruma getirilmeleri gerekmektedir. Bu amaçla uygulamada en fazla somatik embriyoların kaplanması işlemi üzerinde durulmaktadır. 3) Gen aktarımı 4) Genetik materyalin muhafazası Emre ERDAĞLI

176 Sorular 1) Kalluslar, farklılaşmamış ince çeperli parankima hücreleri.bölünmesi sonucunda meydana gelirler. 2) Kallus gelişim aşamaları indüksiyon..., hücre bölünmesi..., farklılaşma... olmak üzere 3 e ayrılır. 3) Kallusların uzun süreli kültüre alınması sonucu ortaya çıkan yapısal değişiklikler nelerdir? Kallus hücrelerinin bölünme ve gelişme için artık hormona gerek duymamaları ve neticede hormon-otonom bir kallusun meydana gelmesi (habituation). Organik potansiyelin yani yeni adventif sürgün veya kök meydana getirme yeteneğinin azalması veya tamamen ortadan kalkması. 4) Organogenezin tanımını ve çeşitlerini yazarak, etkin organ oluşumu için gereken şartları yazınız. Somatik hücrelerden ya da dokulardan yapraklar, sürgünler ya da kökler gibi organların oluşmasıdır. Kallus oluşumuna göre iki farklı gelişim süreci vardır.indirektorganogenez ve direkt organogenez. Etkin bir organ oluşumunun yerine getirilebilmesi için; -Uygun eksplantın seçilmesi -Büyümede aktif maddeler içeren uygun besin ortamı -Fiziksel çevre koşullarının kontrolü Mutlu YALÇIN