T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ İSTANBUL TIP FAKÜLTESİ Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı

Transkript

1 T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ İSTANBUL TIP FAKÜLTESİ Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi ne Başvuran Pediyatrik Yaş Gruplarında Biyokimyasal Testlerin Referans Aralıkları Çalışması UZMANLIK TEZİ Dr. Müge KANMAZ-ÖZER Tez Danışmanı: Prof. Dr. Ümit TÜRKOĞLU İstanbul 2013

2

3 T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ İSTANBUL TIP FAKÜLTESİ Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi ne Başvuran Pediyatrik Yaş Gruplarında Biyokimyasal Testlerin Referans Aralıkları Çalışması UZMANLIK TEZİ Dr. Müge KANMAZ-ÖZER Tez Danışmanı: Prof. Dr. Ümit TÜRKOĞLU İstanbul 2013

4 I ÖNSÖZ Kendisiyle çalışmaktan mutluluk duyduğum değerli hocam ve tez danışmanım Prof. Dr. Ümit Türkoğlu na, Hiçbir zaman bilgisini ve tecrübesini benden esirgemeyen, benim için duygu ve zekânın mükemmel birleşimini temsil eden, çalışma ahlakı ve prensipleriyle de örnek aldığım değerli hocam Prof. Dr. Figen Gürdöl e, Anabilim Dalı na girişimden itibaren beni kucaklayıp sımsıkı sarılan desteklerini her zaman hissettiren iki değerli hocam Prof. Dr. Semra Doğru-Abbasoğlu ve Prof. Dr. Pervin Vural'a, Çalışmamın veri ayıklama işlemlerinin mimarı Doç. Dr. Gökhan Silahtaroğlu'na, Birlikte güzel günler geçirdiğim tüm asistan arkadaşlarım ve Anabilim Dalı nın diğer çalışanlarına; Ayrıca elmanın öteki yarısı, en iyi arkadaşım, sevgili eşime ve ikimizin "Magnum Opusu" canım kızım Tulca Derin e en içten teşekkürlerimi sunarım Dr. Müge KANMAZ-ÖZER İstanbul, 2013

5 II İÇİNDEKİLER ÖZET... 1 ABSTRACT GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER Normal değer, Referans değer ve Referans aralıkları Normal değer Referans değer Referans aralıkları Referans birey, örnekleme yöntemleri, örnek sayısının tespiti ve gruplama Referans bireyin tanımı ve seçim yöntemleri Bireye ve topluma dayalı örnekleme A priori (test öncesi) ve posteriori(test sonrası) örnekleme Rastgele ve rastgele olmayan örnekleme Direkt ve indirekt örnekleme Yeterli örnek sayısının tespiti Referans bireylerinin gruplandırılması Pediyatrik çağda referans aralıklarının oluşturulması Örneklerin toplanması ve Analiz Preanalitik evre Analitik evre Postanalitik evre Referans aralıklarının istatistiksel analizi Dağılımın değerlendirilmesi Aykırı değerlerin tespiti Dixon Aralık İstatistiği Horn algoritması Gruplama ihtiyacının tespiti Referans aralığı hesaplanmasında kullanılacak yöntemlerin seçimi Genel Hesaplama Robust Metodu Bootstrap Metodu Nonparametrik Persentil Metodu GEREÇ VE YÖNTEMLER Gereçler Çalışma grubu Örneklerin toplanması ve serum eldesi Kullanılan cihaz ve kitler Biyokimyasal testlerin ölçüm metodları Albumin ölçümü Alkalen Fosfataz ölçümü Alanin Transaminaz ölçümü... 29

6 III Aspartat Transaminaz ölçümü BUN tayini CK ölçümü γ-Glutamil Transferaz ölçümü Glikoz ölçümü HDL Kolesterol ölçümü Kreatinin ölçümü Laktat Dehidrogenaz ölçümü LDL Kolesterol tayini Total bilirubin ölçümü Total Kolesterol ölçümü Total protein ölçümü Trigliserit ölçümü Ürik asit ölçümü VLDL Kolesterol tayini İstatistiksel analiz incelemeler BULGULAR ALB Referans Aralıkları ALP Referans Aralıkları ALT Referans Aralıkları AST Referans Aralıkları BUN Referans Aralıkları CK Referans Aralıkları GGT Referans Aralıkları GLU Referans Aralıkları HDL-K Referans Aralıkları KRE Referans Aralıkları LDH Referans Aralıkları LDL-K Referans Aralıkları TBİL Referans Aralıkları TG Referans Aralıkları TKOL Referans Aralıkları TPRO Referans Aralıkları ÜRAS Referans Aralıkları VLDL-K Referans Aralıkları TARTIŞMA ve SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ... 79

7 IV KISALTMALAR LİSTESİ ALB ALP ALT AST BUN CK GGT GLU HDL-K KRE LDH LDL-K TBİL TKOL TPRO TRİG ÜRAS VLDL-K IFCC CLSI WHO SD YD TE %CV Mod r IQF VBA nm NADH + NAD ADP ATP G6P NADP + NADPH G6PD AST K ARL ÜRL Albümin Alkalen Fosfataz Alanin Transaminaz Aspartat Transaminaz Kan Üre Azotu Kreatin kinaz γ -Glutamil Transferaz Glikoz Yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol Kreatinin Laktat dehidrojenaz Düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol Total Bilirubin Total Kolesterol Total Protein Trigliserid Ürik Asit Çok düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol Uluslararası Klinik Kimya Federasyonu Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü Dünya Sağlık Örgütü Standart sapma Yenidoğan Toplam Hata Varyasyon katsayısı Tepe değer Ret kriteri Çeyrekler arası parmaklık Görsel Basit Uygulamalar Nanometre İndirgenmiş nikotin adenin dinükleotid Nikotin adenin dinükleotid Adenin difosfat Adenin trifosfat Glikoz-6fosfat +1 değerlikli nikotin adenin dinükleotid fosfat İndirgenmiş nikotin adenin dinükleotid fosfat Glikoz-6fosfat Dehidrojenaz AST kadın Alt referans limit değer Üst referans limit değer

8 V LBS NCEP HIS Laboratuvar Bigi Sistemi Ulusal kolesterol eğitim programı Hastane Bilgi Sistemi ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 2.1. Normal dağılım grafiği Şekil 2.2. Negatif ve pozitif yönlü asimetrik dağılım Şekil 2.3. Negatif ve pozitif yönlü dikey çarpıklık grafikleri TABLOLAR LİSTESİ Tablo 2.1. Örnek çalışma dışı bırakma kriterleri Tablo 2.3. Kiloya göre çocuklarda alınabilecek limit kan miktarları Tablo 2.4. Referans aralıkları çalışmasında etkili olan preanalitik faktörler Tablo Referans kitlesinin yaşlara göre dağılımı Tablo Referans kitlesinin yaşlara göre dağılımı Tablo Referans kitlesinin yaşlara göre dağılımı Tablo Yaş gruplarına göre hesaplanmış yeterli örnek sayıları Tablo Yaş gruplarına göre hesaplanmış yeterli örnek sayıları Tablo 3.5. Uygulanan işlemlerde AST K yaş gruplarındaki veri sayıları. Tablo Birleştirilmiş AST K yaş gruplarına ait Kolmogorov-Smirnov Testi Tablo Logaritmik dönüşüm sonrası AST K yaş gruplarına ait normalite testi Tablo Üretici firma ALB referans aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette ALB referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette ALB referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Üretici firma ALP referans aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette ALP referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette ALP referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Üretici firma ALT referans aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette ALT referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette ALT referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları.

9 VI Tablo Üretici firma AST referans aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette AST referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette AST referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Üretici firma BUN referans aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette BUN referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette BUN referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Üretici firma CK referans aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette CK referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette CK referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Üretici firma GGT referans aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette GGT referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette GGT referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette GLU referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette GLU referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette HDL-K referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette HDL-K referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Üretici firma KRE referans aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette KRE referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette KRE referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Üretici firma LDH referans aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette LDH referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette LDH referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette LDL-K referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette LDL-K referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette TBİL referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette TBİL referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette TG referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette TG referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Üretici firma TKOL referans aralıkları.

10 VII Tablo Erkek cinsiyette TKOL referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette TKOL referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Üretici firma TPRO referans aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette TPRO referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette TPRO referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Üretici firma ÜRAS referans aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette ÜRAS referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette ÜRAS referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Erkek cinsiyette VLDL-K referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları. Tablo Kadın cinsiyette VLDL-K referans limitleri ve bunlara ait güven aralıkları.

11 1 ÖZET Amaç: Bu çalışmada, İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Çocuk Biyokimya Laboratuarı nda ile tarihleri arasında çalışılmış 18 teste ait ölçüm sonuçlarını kullanarak bu testlerin indirekt referans aralıklarının hesaplanması ve elde edilen referans aralıklarının, literatürdeki ve analizör firmaların sağlamış oldukları referans aralıkları bilgileri ile karşılaştırılması amaçlanmaktadır. Gereç ve Yöntem: Bu tarihler arasında laboratuvarımıza başvuran 0-18 yaş çocukların albumin(alb), alkalen fosfataz(alp), alanin transaminaz(alt), aspartat transaminaz(ast), kan üre azotu (BUN), kreatin kinaz(ck), ɤ-glutamil transferaz(ggt), Glikoz(GLU), yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol(hdl-k), kreatinin(kre), laktat dehidrojenaz(ldh), düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol(ldl-k), total bilirubin(tbil), total kolesterol(tkol), total protein(tpro), trigliserit(trig), ürik asit(üras), çok düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol(vldl-k) testlerine ait, ayıklanmış adet sonuç dâhil edildi. Cinsiyete göre yaş grupları ayırıldı. Gruplar aralarındaki anlamlı fark açısından incelendikten sonra, yeterli sayıya sahip olmayanlar çalışmadan çıkarılırken, aralarında anlamlı fark olmayan gruplar birleştirildi. Birleştirilmiş yaş gruplarının alt ve üst limit değerleri ve bunlara ait %90 güven aralıkları Medcalc istatistik programı kullanılarak hesaplandı. Bulgular: ÜRAS hariç bütün testlerde, üretici firmanın sunmuş olduğu referans aralıklarına göre farklılıklar tespit edildi. Ancak en çarpıcı bulgular lipit parametrelerinde gözlendi. HDL kolesterol alt sınırında, risk sınırlarının daha altında düşüklük ve LDL kolesterolde üst sınırda yükseklik gözlenmiştir. ALT ve AST üst limitlerinde düşüklük tespit edilirken, bazı yaşlarda GGT, LDH, CK, KRE, BUN, TG ve TBİL'de düşüklük, TKOL, ALB, TPRO ve GLU'da yükseklikler bulunmuştur. Sonuç: Çalışmamızda elde ettiğimiz pediatrik yaş gruplarına ait referans aralıkları toplumumuza özgü pediatrik referans aralıklarının belirlenmesi için planlanan çok merkezli proje için bir ön çalışmadır.

12 2 ABSTRACT Objective: This study aimed to calculate the reference intervals of 18 tests in pediatrics via indirect method on test results performed at Istanbul University, Istanbul Medical Faculty, Pediatry Laboratory, between and period and to compare these reference intervals with the reference intervals stated in literature provided by the manufacturer. Materials and Methods: depoluted results of albumin(alb), alkaline phosphatase(alp), alanine transaminase(alt), aspartat transaminase(ast), blood urea nitrogen(bun), creatin kinase(ck), ɤ-glutamil transferase(ggt), Glikoz(GLU), high density lipoprotein colesterol(hdl-k), creatinine(kre), laktat dehidrogenase(ldh), low density lipoprotein colesterol (LDL-K), total bilirubin(tbil), total colesterol(tkol), total protein (TPRO), triglyceride(trig), uric acid(üras), very low density lipoprotein colesterol (VLDL-K) tests obtained by the laboratory information system were included our study. Dataset separated into different age groups in different gender. The groups had included insufficient number and exhibited no statistical difference were combined, if not were excluded. Rreference intervals were calculated using Medcalc statistic software. Results: Except URAS, for all tests differences were detected. Most striking results were in lipid parameters. The lower limit of HDL-K was lesser and the upper limit of LDL-K was more even than the cardiovasculary risk limits. TG was exhibiting the limits of the manufacturers. Upper limit of ALT and AST were low and for some ages GGT, LDH, CK, KRE, BUN, TG ve TBİL limits were low and TKOL, ALB, TPRO ve limits were high. Conclusion: The referance limitss of pediatrics we obtained in our study is a preliminary study for establishing the referance intervals of our own society via a project will be performed multicentrically.

13 3 1. GİRİŞ ve AMAÇ Son 20 yıldır klinik laboratuvarlar majör teknolojik değişikliklere ve biyolojik belirteç çeşitliliğindeki muazzam artışa şahit olmuştur. Neredeyse tüm pediyatrik hastalıkların tarama, teşhis ve takibi, değişen derecelerde özgüllük ve duyarlılığa sahip, geniş yelpazeli biyolojik belirteç ölçümü gerektirmektedir. Bu biyolojik belirteçler klinik laboratuvarlarda ölçülür ve önemli klinik kararlara rehberlik ederler. Klinisyenler hastalarının teşhis, tedavi, izlem ve yatış-çıkış gibi kritik aşamalarının en az %60'ında, klinik laboratuvarlarda ölçülen bu test sonuçlarını yorumlayarak karara varmaktadır (33). Test sonuçlarının kıyaslanmasında, toplum kökenli referans aralıkları klinik karar verme aşamalarında kullanılan en sık laboratuvar aracı haline gelmiştir. Referans aralığı, Uluslararası Klinik Kimya Federasyonu (IFCC) tarafından, bir analitin, belirli bir toplumu yansıtan ve yüzdeliklere ayrılmış referans bireylerine ait ölçümlerin, alt %2,5 ve üst %97,5 arasında kalan, orta %95'inin bulunduğu alt ve üst referans limit değerleri olarak tanımlanmaktadır. Hem IFCC hem de Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI), referans bireylerinin seçimi, örneklerin toplanma aşamasındaki işlemler, analitik yönteme ait değişkenlerin kontrolü, elde edilen verilerin istatistiksel açıdan incelenmesi ve gözlemlenen referans aralığı değerlerinin sunumu ile ilgili kapsamlı bilgi sağlamaktadır ve IFCC, her laboratuvarın kendi referans aralıklarını oluşturmasını tavsiye etmektedir (98, 86, 96, 97, 99, 25, 19). Klinik laboratuvarlardaki kalitenin elde edilmesi amacıyla da referans aralıklarının oluşturulması, uluslararası standardizasyon kuruluşlarının gündemindedir (67). Referans aralıklarının geleneksel çalışma yöntemleriyle oluşturulmasında, ideal olarak prospektif bir çalışmayla, toplumu yansıtan ve sağlıklı olduğu bilinen, aydınlatılmış onam alınmış 120 referans bireyine ihtiyaç vardır. Bu sayı hem dağılımın orta %95 ini hem de alt ve üst limit değerlerinin %90 güven aralığını belirlemede önemlidir (98). Referans bireylerinin bir araya getirilmesi aşamasında, referans aralığı değerlerinde değişkenliğe neden olabilecek özellikler gruplama ihtiyacını doğurur. Örneğin, metabolizmalarındaki farklılıklar nedeniyle geriyatrik ve pediyatrik çağdaki referans aralıklarının tespitinde yaş gruplamaları gereklidir (94). Bu yaş gruplamalarında, her cinsiyet ayrı grupları ifade eder. Oluşturulmuş her grubun içindeki alt grupların herbiri için 120 sağlıklı gönüllüyü bir araya getirme zorunluluğu ve pediyatrik yaşta alınabilecek kan miktarının sınırlı olması, pediyatrik yaş gruplarında

14 4 geleneksel yöntemlerle referans aralıkları oluşturulmasını etik açıdan imkânsız hale getirmiştir (101). Her test için üretici firma tarafından belirlenmiş bir referans aralığı mevcuttur. Ancak bu aralığın, hitap ettiğimiz toplumun referans aralığını tam anlamıyla yansıtabildiğini söyleyemeyiz. Referans aralıklarının oluşturulması zor, zaman alıcı ve yüksek maliyetlidir (88). Bu nedenle çok az laboratuvar kendi referans aralıklarını oluştururken, çoğunluğu literatürde belirtilmiş veya analizör firmalarca öne sürülmüş referans aralıklarını sahiplenmektedir. Bu referans aralıkları çoğunlukla ölçüm-bilimsel ya da etnik köken farklılıkları içermekte veya düşük hacimli örnek sayısı ile elde edilmiş aralıklardır (34). Referans aralığında farklılıklara neden olan metodolojik veya metodolojik olmayan pek çok faktör vardır. Coğrafi farklılıklar, toplumsal farklılıklar, laboratuvarlar arası farklılıklar, diyet özelliklerindeki farklılıklar, teknik şartlardaki farklılıklar bunlardan bazılarıdır. İdeal olan her laboratuvarın kendi referans aralığını belirlemesidir. Bu nedenle kendi toplumumuzun referans değerlerini belirlemeli ve bu değerleri kullanmalıyız. Referans aralıkları çalışmasında, referans bireylerinin seçimi direkt veya indirekt olabilir. Direkt yöntem, belirlenmiş kriterler kullanarak, sağlıklı olarak tanımlanmış kişilerden, bir hazırlık döneminin ardından örnek alımının gerçekleştirildiği yöntemdir. Indirekt yöntem ise hem sağlıklı hem de sağlıksız bireyleri içeren tıbbi veri bankasını kullanır. Indirekt yöntemler, bankadaki veri kümesinin, parametrik dağılım gösteren sağlıklı bireyler ile rastgele patolojik bireyleri içerdiği varsayımına dayanır. Yeterli sayı içeren veri kümesinde bu yöntemler uygulandığında sağlıklı ve sağlıksız örnekler güvenilir şekilde birbirinden ayrılabilir. Patolojik örneklerin sağlıklı topluma ait referans aralıklarına etkisi bu durumda söz konusu değildir. Sağlıklı örneklere ait altta yatan dağılım istatistik yöntemlerle kestirilebilir ve bu dağılımın 2,5 ile 97,5 yüzdelikleri, referans aralıklarını tanımlar (128). Bu çalışmanın amaçları: İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi, Çocuk Biyokimya Laboratuvarında, yılları arasında yapılmış, albumin (ALB), alkalen fosfataz (ALP), alanin transaminaz (ALT), aspartat transaminaz (AST), kan üre azotu (BUN), kreatin kinaz (CK), ɤ-glutamil transferaz (GGT), Glikoz (GLU), yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol (HDL-K),

15 5 kreatinin (KRE), laktat dehidrojenaz (LDH), düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol (LDL- K), total bilirubin (TBİL), total kolesterol (TKOL), total protein (TPRO), trigliserit (TRİG), ürik asit (ÜRAS), çok düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol (VLDL-K) olmak üzere toplam 18 adet biyokimya test sonuçlarını içeren hastane veri bankası bilgilerini kullanarak, pediyatrik yaş gruplarındaki referans aralıklarının belirlenmesi, Bu referans aralıklarının analizör firmalar tarafından sunulmuş literatürdeki referans aralıkları bilgileri ile karşılaştırılmasıdır.

16 6 2. GENEL BİLGİLER 2.1 Normal Değer, Referans Değer ve Referans Aralığı Günümüz terminolojisinde kullandığımız referans aralıkları kavramının oluşturulmasında rol oynayan kilometre taşlarının anlaşılması, bu kavramın içinin doldurulması ve ileride yapılandırılabilmesi için önemlidir Normal Değer Normal değer kavramı ilk olarak 1969 da Gräsbeck ve Saris tarafından, belirli bir grup bireyde yapılan analit ölçümlerindeki değişkenliği tarif etmek amacıyla öne sürülmüştür (39). Bu kavram zamanla "referans aralıkları" adıyla terminolojide kendine yer bulmuştur. "Normal değer" terimi, bir bireyin sağlıklı döneminden elde edilmiş değer, ideal sağlık durumundaki bireylerden elde edilmiş değer, bireyin temsil ettiği toplumdan elde edilmiş değer ya da istatistiksel olarak çan eğrisi dağılımı içinde yer alan değer gibi pek çok ifade karmaşasını engelleyememektedir. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), sağlığı; sadece hastalık durumunun yokluğu şeklinde değil, fiziksel, zihinsel ve sosyal refah durumu olarak tanımlamaktadır (114). Bir bireyin sağlığının normal olduğunu belirlemek zordur. Klinisyen için laboratuvar verilerini yorumlamada bir kıyaslama teşkil etmesi ve normal kelimesinin oldukça göreceli bir kavramı ifade etmesi nedeniyle normal değer yerine "referans değer" terimi benimsenmiştir Referans Değer Referans değer, örnek referans grubundaki bireylerde yapılan özel ölçümler veya gözlemlerin sonucunda elde edilen değerdir. Referans değer verilerinin istatistiksel dağılımı ise Referans dağılım"dır. Referans değer terimi, bu değerlerin hangi temele göre elde edildiğini ya da hangi grubu temsil ettiğini gösteren bir tanımlayıcı arkasına eklenerek kullanılmaktadır. Bu tanımlayıcılar her referans değerin sağlıklı toplumla ilişkili olmadığını kanıtlamaktadır (98). Diğer bir ayırım da bireyin ve toplumun referans değerleri arasındadır. Bireyin referans değeri, bireyin daha önce tanımlanmış sağlık durumuna ilişkin kendi değeridir. Toplumun referans değeri ise tanımlanmış belirli sağlık durumundaki bireyleri içeren gruplardan elde

17 7 edilmiş değerlerdir. Referans değerlerin başına hiçbir tanımlayıcı konmadan kullanıldığı zaman toplumun referans değerleri kastedilmektedir Referans Aralığı Bir analitin belirli bir toplumu yansıtan ve yüzdeliklere ayrılmış referans bireylerinin, alt %2,5 ve üst %97,5 arasında kalan, orta %95'inin bulunduğu alt ve üst referans limit değerleridir (99). Şu halde referans aralığı, referans bireylerin oluşturduğu örnek referans dağılımından belirli istatistiksel yöntemlerin kullanılması ile elde edilen referans değerlerinin tanımlandığı aralıktır (19) Referans birey, örnekleme yöntemleri, örneklem sayısının tespiti ve gruplama Referans bireyin tanımı ve seçim yöntemleri Referans birey, belirlenen referans toplumu en iyi şekilde temsil edebilmesi için, iyi tanımlanmış kriterler (dâhil etme ve dışlama kriterleri) temelinde seçilmiş, ölçümün gerçekleştirildiği bireydir. Referans toplum, istatistiksel bir çalışmada, genelde varsayılan ve hedef alınan, ancak ulaşılması çok zor ya da imkânsız olan kitleyi temsil eder (77). İdeal olan tüm toplumun muayene edilmesi ve kriterlere uyanlar arasından referans bireylerin rastgele belirlenmesidir. Fakat bu birçok nedenden dolayı pratikte mümkün değildir. Bundan dolayı referans toplumu en iyi şekilde temsil eden referans bireylerinin seçiminde farklı yöntemler geliştirilmiştir. Referans toplum, hastane dışı yani sağlıklı varsaydığımız toplum ya da hastane toplumu olabilir. Klinik laboratuvarların referans toplumu olarak kendilerine başvuru yapmış kişileri kullanmasının, hitap ettikleri toplumu daha iyi yansıtabileceğini öne süren araştırmaların çoğu klinik ile uyumlu ve anlamlı referans aralıkları sunmuşlardır (71, 40, 41). Örneklemeler, referans bireyleri seçiminin yapılış yöntemine göre isimlendirilir. Bu yapılan işlemin kısa sözlü ifadelerle anlatılması imkânını sağlar Bireye ve topluma dayalı örnekleme Genellikle bir test sonucunun yorumlanmasında tüm toplumu yansıtan referans değerlerle kıyaslama yapılıyorsa da bireye ait özelliklerin (yaş, cinsiyet, özgeçmiş, başka sağlık sorunları vb.) de gözönünde bulundurulması gerekir. Bir testin belirli bir kişi için

18 8 normal değerinin ne olduğu, test o kişiye daha önce uygulanmamışsa kesin olarak bilinemez. Bu değerin önceden biliniyor olması idealdir. Bireyin daha önce sağlıklı zamanında elde edilmiş sonuçları referans değer olarak kullanılabilir. Bu örnekleme yöntemi bireye dayalı örneklemedir. Test değerinde sonradan meydana gelen önemli değişiklikler, bu referans sınırları aşılmadığı sürece hastalık lehine değerlendirilmez. Ancak bu değişiklikler şahısta meydana gelen önemli gelişmelerin erken habercisi olabilir A Priori (Test Öncesi) ve Posteriori (Test Sonrası) Örnekleme Analiz yöntemi ile ilgili bilgiler çok sayıda ve çok iyi biliniyorsa referans bireyler tanımlanmış kriterlere göre seçilir ve örnekler toplanır. Bu tip bir örnekleme ileriye dönük bir ayırım işlemidir ve A priori örnekleme olarak nitelendirilir. Analiz yöntemi ayrıntılı bilinmediğinde ve hakkında yeterli bilgi toplanamıyorsa, bireylerden örnekler alınır, ayırma işlemi ve alt gruplama daha sonra yapılır. Bu tip bir örnekleme, geriye yönelik örneklemedir ve posteriori örnekleme olarak nitelendirilir (74) Rastgele ve Rastgele Olmayan Örnekleme Rastgele olan yöntemde, grup üyelerinin hepsinin referans grubun kriterlerini sağladığı düşünülerek örnekler toplanır ve analiz edilir. Elde edilen veriler istatistiksel analiz ile değerlendirilir ve referans aralıkları hesaplanır. Rastgele olmayan yöntemde ise seçilen toplumdan grup oluşturmak için bireylerin önceden hangi kriterleri sağladığı saptanır. Rastgele olmayan örnekleme çoğunlukla uygulanan yöntemdir Direkt ve İndirekt Örnekleme Direkt örnekleme yönteminde referans bireyler sağlık durumları tanımlanmış kriterlere göre belirlenerek toplumdan (ideal olarak rastgele) seçilir. IFCC, referans değerlerin hesaplanmasıyla ilgili standartlarda referans bireylerinin direkt örnekleme ile seçilmelerini önermektedir. Bu yöntemin dezavantajlarından biri, yapılan yaş gruplamalarının keyfi olmasıdır. Bireylerin sağlık durumunun belirlenmesinde kullanılan kriterler, çalışmaya dâhil etme ve çalışmadan dışlama kriterleri olarak nitelendirilir. Genel toplumda referans aralıklarının hesaplanması için kullanılabilecek pek çok dışlama kriteri vardır (Tablo 2.1.) (42).

19 9 Tablo 2.1. Genel toplumda referans aralıklarının oluşturulmasında kullanılabilecek örnek dışlama kriterleri. 42, 86 Risk Faktörleri Şişmanlık Hipertansiyon Genetik risk faktörleri Çevre veya meslek ile ilgili riskler Özel fizyolojik ve psikolojik durumlar Gebelik / Laktasyon Stres Egzersiz İlaçlar ve Alışkanlıklar Hikâye Genel ilaçlar Hormon ilaçları Takviye beslenme ürünleri Sigara, alkol ya da uyuşturucu kulanımı v.s. Yakın zamanda geçirilmiş hastalık, ameliyat, transfüzyon Kronik Hastalıklar ve Patofizyolojik Bozukluklar Böbrek yetersizliği Konjestif kalp hastalıkları Kronik akciğer hastalıkları Karaciğer hastalıkları Malabsorbsiyon sendromları

20 10 Kullanılacak dışlama kriterleri, hangi referans aralığının belirlenecek olmasına göre değişkenlik gösterir. Örneğin; epidemiyolojik anketler ve önleyici tıp programları sağlıklı bireylerdeki referans aralıklarını gerektirirken, klinik bir karar durumunda belirli hastalıklar içerisinden ayrılan referans aralıkları ve bu gruba ait dışlama kriterleri gerekli olacaktır (86). İndirekt örnekleme yöntemi, IFCC tavsiyesine alternatif olarak öne sürülmüştür. Bu yöntemde laboratuvarda ölçümü yapılmış hastalara ait test sonuçları sağlıkla ilişkili olarak "patolojik" ve "patolojik olmayan" şeklinde ayrıştırıldıktan sonra istatistiksel prosedürler uygulanarak indirekt referans limitleri değerlendirmesi yapılır (31). Bu yöntemin temeli, analiz sonuçlarının kayıtlı bulunduğu veri banaksından bireylere teker teker bakılmaksızın belli kurallara uygun şekilde test sonuçlarının seçimidir. Bu yöntem laboratuvar veri bankasının çoğunlukla patolojik olmayan sonuçları içermesi gerçeğine dayanır. Test sonuçlarının sıklık dağılımlarında, dağılım eğrisinin aşırı uçları istatistiksel prosedürler uygulanarak çıkarılabilir. Böylece patolojik sonuçlardan ayıklanmış veri elde edilir (6). Sağlıklı gönüllülerden örnekleri bir araya getirmenin çok zor olduğu pediyatrik yaş grupları gibi durumlarda kullanılır (54, 102). İndirekt örnekleme yoluyla veri toplanmasında da uyulması gereken bazı hususlar vardır. Bunları şöyle sıralayabiliriz; 1. Örneklerin dağılımı, referans toplumun bir parçası olmalıdır. 2. Referans dağılımı örneği tek tepeye sahip olmalıdır, ancak yatık bir dağılım olabilir. Dağılımın içinde homojeniteyi bozacak gruplaşmalar olmamalıdır. 3. Verilerin yoğunlaştığı bölge, dağılımın tepesine (mod) uymalıdır. Tepeden uzak bölgedeki birikmeler büyük olasılıkla hastalıkla ilişkili verilerdir. 4. Total dağılım ile örnek dağılımın tepe değerleri birbirlerine yakın olmalıdır. Çalışma planlama aşamasında iki tepeli ya da çoklu tepe içeren dağılıma neden olabilecek gruplamalar planlanmalıdır. Referans değerler belirlenirken projenin amacına göre bu örneklem stratejilerinden biri, diğerlerine üstün olabilir.

21 11 Hem direkt hem de indirekt yöntemde örneklem grubunun genişliği, gruplama sayısı ve uygulanan dışlama kriterlerinin yapısı ile belirlenir. Ne kadar sağlıklı veri seçimi yapılırsa sonraki basamaklarda dağılımda gruplaşmaya ve uç değerlere o kadar az rastlanılır Yeterli örnek sayısının tespiti İstatistiksel çalışmalarda tüm topluma, başka bir deyişle tüm verilere ulaşılamadığı durumlarda çalışmalar örneklem üzerinde yürütülür. Böyle bir durumda çalışmada kullanılacak olan örnek miktarının, normal dağılım göstermesi şartıyla, 30 olması parametrik testlerin uygulanması için yeterli olarak kabul görse de özellikle retrospektif çalışmalarda, olanak varsa istatiksel güvenilirliğin artması için daha fazla miktarda veri toplanmalıdır. Örnek sayısının hesaplanması yapılan çalışmaya göre değişmektedir. Örneğin, yapılan çalışma belli bir oranın belirlenmesi ise farklı bir denklem, bir ortalama ya da alt üst sınır değerlerin tespiti ise farklı bir denklem kullanılır. Ayrıca, toplumun standart sapmanın (SD) bilinip bilinmemesine göre de kullanılacak olan denklem değişir. Ortalama veya alt-üst sınır değerlendirmesi için kullanılan denklem aşağıda verilmiştir (73, 117). Denklemde σ toplumun SD'ını, E hata payını ve Z α/2 ise standart normal dağılımın α/2 tablo değerini temsil etmektedir. Z α/2 değeri %95 güven aralığı için 1.96, %99 güven aralığı içinse 2.58 olacak şekilde kullanılır (73, 117, 10). Toplumun SD'sının bilinmediği durumlarda SD yerine, σ = ranj 4 kullanılabilir. Örneğin, 1-3 yaş erkek bebeklerde serum kreatinin aralıkları ile ilgili bir çalışma yapılmak isteniyor. Çalışmanın %99 güven seviyesinde, hata payıyla başarılı olması için gereken en az veri sayısını hesaplarken; çocuklarda (tüm toplum) serum kreatinin değerinin SD'sı bilinmediği için, kreatinin genel toplumdaki referans aralığı olan 0,3-0,7 mg/dl kullanılarak, Ranj ve SD aşağıdaki gibi hesaplanacktır. Ranj = = 0.4 σ = = 0.1

22 12 Ranj değeri azaldıkça E değerinin daha düşük rakamlar seçilmesi gerekir. Bu örnekte hata payı, referans değerlere uygun olarak seçilmiştir. Denklemde değerleri yerine koyduğumuzda, hesaplama aşağıdaki gibi olacaktır: Bunun anlamı şudur: Eğer 2662 denekle çalışılırsa ve sonuçta söz gelimi referans değerleri olarak bulunursa bu değerlerin %99 güven seviyesinde ±0.005 hatayla doğru kabul edebiliriz. Yani alt sınır , üst sınırsa bandında olabilir. Paydadaki E değerinin artırılması, toplanması gereken veri sayısını azaltırken, sonuçlardaki hata payını artıracaktır Referans bireylerinin gruplandırılması Birçok analit için var olan uygulama, farklı iki grubun referans aralıklarının eşit kabul edilmesidir. Örneğin, erişkin kadın ve erkekdeki sodyum konsantrasyonları gibi. Bu durum aslında kullanılması gereken istatistiksel analizin (nonparametrik) çok fazla sayıda örneklem grubu gerektirmesi nedeniyledir. Bazı analitler ise oluşturulmuş grupların kıyaslanabilir olup olmadıklarını belirleyecek bir analiz olmaksızın yapılmış bir gruplamaya sahiptir. Örneğin, kadın ve erkeklerdeki testesteron düzeylerinin anlamlı olarak fark içerdiği aşikârdır. Elbette böyle durumlarda grupları birleştirmek uygun değildir. Diğer analitler için, sodyum konsantrasyonu gibi, cinsiyetleri ayırmanın gerekli olup olmadığını belirlemek istatistiksel analiz gerektirir (63). Referans aralıkları tayininde gruplama gerektirebilme ihtimali içeren pek çok durum söz konusudur. Gruplara ayırmada en önemli ve en sık kullanılan iki ölçüt cinsiyet ve yaştır. Yenidoğan, infant (İNF), puberte, premenopozal, menopozal ve yaşlılık dönemlerinde metabolizmadaki değişim daha belirgindir (4). Kemik yaşı, boy ve vücut kitle indeksi gibi ölçütler, çocukların sınıflandırılması için, gerçek yaştan daha iyi belirleyicidirler (127). Referans aralıklarının içerdiği alt grupların var olup olmadığının tespiti amacıyla kullanılan çok çeşitli metodlar kullanılarak yapılmış pekçok çalışma bulunmaktadır (37, 75, 43).

23 Pediyatrik Çağda Referans Aralıkları Oluşturulması Ceriotti ve arkadaşları, her referans aralığı çalışmasının ön değerlendirmesinde göz önünde bulundurulması gereken dört kriter listelemiştir: Referans bireylerinin seçimi, çalışma planı, verinin analitik kalitesi, verinin istatistik açıdan analizi (15). Ne yazık ki günümüzde pediyatrik yaş gruplarında bu kriterleri tam anlamıyla gerçekleştirilebilmiş yaş ve cinsiyete özgü referans aralıkları çalışması çok nadirdir (70). Bu çalışmalar çok merkezli ve büyük maliyeli çalışmalardır. Bu çalışmalarda en çok endişe karşılaştırılabilirlik üzerinedir. Çünkü bu çalışmalarda yapılan analit ölçümleri farklı yerlerdeki farklı analizör ve metodlarla gerçekleştirilmektedir. Pediyatrik yaş gruplarında, yaş ve cinsiyete özgü referans aralıklarının henüz oluşturulamamış olmasının nedenlerini Ceriotti ve arkadaşlarının öne sürdüğü kriterler içindeki her başlıkta ayrı ayrı incelemek doğru olacaktır. Bu aşamada erişkin referans aralıkları pediyatrik çağ için sıklıkla yetersizdir. Çocuklar küçük erişkinler değildir. Metabolizmaları bir değişim ve gelişim süreci içindedir. Pediyatrik çağda, özellikle anne karnı dışındaki hayata adaptasyonun çok önemli olduğu yeni doğan döneminde ciddi metabolik farklılıklar söz konusudur. Çocuklar sıklıkla erişkinlerden farklı ve sıklığı daha düşük hastalıklara yakalanırlar. Yeni doğan dönemde bağışıklık sistemi açısından hassastırlar ve enfeksiyona sıklıkla farklı şekillerde cevap verirler. Prematüre doğum, gelişimini tamamlamamış organlar nedeniyle bilhassa merkezi sinir sistemi ve akciğerleri etkileyebilen bir takım hastalıkların gelişimi ile neticelenebilir. Pediyatrik çağda kanser, genetik değişimlerin çevresel faktörlerden daha önemli olduğu bir takım farklılıklardan kaynaklanır. Kistik Fibroz ve Orak Hücre Anemisi gibi metabolik ve genetik hastalıklar çocukluk çağında tanı alan hastalıklardır. Bazı ülkelerde oluşturulan yeni doğan tarama programları test menüsündeki genişlemeyle birlikte dünya çapında daha çok yaygınlaşmaya başlamıştır. Cinsiyet hormonları, büyüme hormonu ve kemik alkalen fosfataz seviyeleri, çocukluk çağındaki büyüme-gelişme ve puberte süresince yaş ve cinsiyetle ilişki olarak değişkenlik gösterir. Birçok hormonal, kimyasal, serolojik, koagülatif ve hematolojik belirteç yaşa özgü referans aralıklarının konusudur. Bu nedenle pediyatrik referans aralıklarının oluşturulması yalnız yaş, cinsiyet ve etnik köken değil, aynı zamanda beslenme, metabolizma, büyümegelişme, hastalık sıklıkları, kan alımı, test performansı ve test yorumlanmasını da göz önünde bulundurularak gerçekleştirilmelidir. Günümüze dek elde edilmiş pediyatrik referans

24 14 aralıklarında kritik boşluklar bulunmaktadır. Bu boşluklar, infant ve çocuklardan gereksiz kan alınmasına, enfeksiyon riskine, stresli teşhis prosedürlerine veya yetersiz tedaviye konu olabilir (54). Pediyatrik çağda, kan alınacak çocuğun sahip olduğu maksimum kan içeriği dikkate alınarak, tek seferde ya da belirli zaman aralıklarıyla en fazla alınabilecek kan miktarları Tablo 2.3.' te sunulmuştur. Ancak bu değerler premarürelerde kilolarına bakılmaksızın daha düşüktür. Ayrıca kullanılacak kan alım tekniği yenidoğan (YD) ve infantlarda erişkinden farklılıklar içerir (82, 64). Tablo 2.3. Pediyatrik yaş gruplarında kiloya göre toplam kan miktarı ve en fazla alınabilecek kan miktarları. 64 Çocuk Ağırlığı (kg) Ortalama kan hacmi (ml) Tek seferde alınan kan hacm i(ml) 2.5/kg 3.0/kg 0, haftasüresince alınan toplam kan hacmi (ml) <1.8 < 207 < 4 < 5 < 5 < ,

25 15 WHO, çocuklardan klinik araştırma amaçlı güvenle kan alımı konusunda 2011 yılında bir dizi tavsiyede bulunmuştur. Buna göre, çocuklardan alınması gereken kan miktarının dikkatlice değerlendirilmesi gerektiği belirtilmektedir. Var olan sınırlı kanıtlara dayanarak 24 saat içindeki kan alımları için tüm kan hacminin %1'i ile %5'i arasında, sekiz hafta süresince ise tüm kan hacminin <10%'u minimum risk limiti olarak öne sürülmektedir. Hasta çocuklarda daha düşük limitler tavsiye edilirken, doğum sonrası yeni doğanlardan 24 saat içinde en fazla 3mL/kg alınması önerilmektedir (64) Örneklerin Toplanması ve Analiz Referans aralıkları çalışmasında bir testin analiz işlemlerinde geçirdiği tüm aşamalar analitik açıdan kaliteli verilerin elde edilmesinde önem taşır ve standardize edilmelidir. Bu aşamalardaki standardın oluşturulmasında önemli olan faktörler her aşama için ayrı ayrı değerlendirilir. Bu aşamaların referans aralıkları çalışmalarında kesin bir şekilde belirlenmesi tavsiye edilmiştir (98, 86) Preanalitik Evre Preanalitik aşama, alınan örnekten ölçüm işleminin yapılması anına kadar geçen süreyi tanımlar. Referans aralıklarına etkileri açısından standardize edilmesi gereken preanalitik faktörler Tablo 2.4.'te sunulmuştur. Bu aşamaların hepsi ölçülecek analite göre değişkenlik gösterir (96, 100). Preanalitik aşamada standart yaklaşımların belirlenmemiş olması, analitik hatalara neden olacaktır. Analitik olarak farklı ölçümlerin olması da postanalitik aşamada değerlerde saçılmalar veya birden fazla tepe içeren dağılım gibi ayıklanması güç durumlar olarak karşımıza çıkacaktır.

26 16 Tablo 2.4. Referans aralıkları çalışmasında etkili olan preanalitik faktörler. Bireylerin hazırlanması Açlık-tokluk, Örnek alım zamanı, Egzersiz düzeyinin alım öncesi belirli bir süre içindeki miktarı ve sıklığı, Kullanılan ilaçların varlığı, Biyolojik ritimler, Mevsimsel değişimler. Örneklerin Alımı Örnek tipi Örneklerin alınması gereken tüpler, Örnek alım yöntemi, Örneklerin kimliklerinin kaydedilmesi, Örnek alım saati, Turnike süresi, Alım aşamasındaki vücut postürü, Alım esnasında eklenmesi gereken maddeler. Laboratuvara ulaştırma aşaması Ulaştırma yöntemi ve şartları, Laboratuvara ulaşma zamanı, Ulaşım esnasında dikkat edilmesi gerekenler. Örneklerin analize hazırlanması ve saklanma koşulları Pıhtılaşma süresi, Santrifüj devir ve süresi, Sulandırma varlığı ve katsayısı, Saklama ısısı ve süresi. 96, 100

27 Analitik Evre Bu aşama, referans aralıkları çalışmasına konu olan analitin ölçüm aşamasıdır. Referans aralıkları çalışmasının güvenilirliği, yapılan çalışmada doğruluk ve tekrarlanabilirliğin sağlanmasını gerektirmektedir (73). Doğruluk ve tekrarlanabilirliğin izlenmesi amacıyla kalite kontrol prosedürleri uygulanır. Referans aralıkları çalışması yapılan laboratuvarın bu prosedürleri gerçekleştirirken belirli araçları kullandığı varsayılsa da aşağıda sıralanmış durumların gerçekleştirilmiş olması şarttır. 1-Kalibrasyon materyalleri dikkatlice tanımlanmalı ve nonspesifik bileşenlerin okumaya eşlik edebileceği göz önünde bulundurulmalıdır. 2-Hesaplamanın temeli (örneğin molar lineer absorbans) dikkatlice belirlenip test edilmelidir. 3-Uygun kontrol örnekleri ticari olarak alınmalı veya kullanıcı tarafından hazırlanmalı. Bu kontrol örnekleri, referans aralıkları çalışması yapılan örneklere benzer özellikteki yapıya (matriks) sahip olmalıdır. 4-Kontrol prosedürü detaylı tarif içermelidir. Bu tarif, kontrol dışı durumlardaki karar kurallarını ve bir alarm durumunda yapılması gerekenleri de mutlaka içermelidir. Birden fazla laboratuvarın katılmış olduğu referans aralıkları çalışmalarında, öncelikle yapılacak ölçüm sonuçlarının karşılaştırılabilirliği değerlendirilmeli, eğer karşılaştırılabilirlik yetersiz ise analitik sistemde uygun değişiklikler gerçekleştirilmeli, ardından karşılaştırma çalışması ile laboratuvarlar arası anlamlı ölçüm farkının olmadığı desteklenmelidir (97). Analitik hatalar sistematik ve rastgele hatalar olmak üzere iki çeşittir. Bu iki hatanın toplamı ise toplam hata adını alır (TE). Sistematik hatalar, analiz sonucunu sabit ve belirli düzeyde değiştiren, nedeni bilinen, ölçülebilen, kesin değerlere sahip hatalardır. Bütün değerler belirli oranda ve belirli yönde saptığı için ortalama değer de kaymıştır. Rastgele hatalar, her fiziksel veya kimyasal ölçümde bulunabilen, düzeltilemeyen ve kontrol edilemeyen birçok değişkene bağlı hatalardır. Sistematik hataların varlığı analizin doğruluğunu etkiler ve ölçülen değerlerin ortalaması kayar ve bir fark(bias) oluşur. Rastgele hata ise analizin kesinliği (ya da tekrarlanabilirliğini) etkiler ve SDdaki değişme ile kendini gösterir. Bu nedenle rastgele hataların varlığını göstermede standart hatadaki % değişimin göstergesi olan varyasyon katsayısı (%CV) kullanılır. Doğruluk, kesinlik, hassasiyet,

28 18 doğrusallık, geri elde, interferans karakteristikleri belirlenmiş olmalı ve izlenebilirliği günlük kalite kontrol verileriyle kanıtlanmalıdır (123, 122, 124) Postanalitik Evre Otomatize cihazlarla donatılmış, laboratuvar bilgi sistemi bulunan laboratuvarlarda bu evrede hata olasılığı oldukça düşüktür. Ancak çıkan sonuçlar el ile kayıt ediliyorsa laboratuvar çalışanının dikkatsizliği veya dalgınlığı hata oranını artırmaktadır Referans Aralıklarının İstatistiksel Analizi Dağılımın değerlendirilmesi Referans aralıkları çalışmasında, verilerin elde edilmesinden sonra ilk yapılması gereken verilerin dağılımının incelenmesidir. Bunun için, aritmetik ortalama, tepe değer (Mod) ve ortanca değerler hesaplanır. Ardından SD hesaplanıp dağılımda bu değerlerin ne şekilde yer aldığı incelenir. Veriler normal (Gaus) dağılımı gösteriyorsa, dağılım ortalamaya göre simetriktir ve aritmetik ortalama, tepe değer ve ortanca değerler birbirine eşittir. Verilerin %68,2 'si -1SD ve +1SD arasında, %95,4 'ü -2SD ile +2SD arasında, %99,7 'si, -3SD ile +3SD arasında yer alır (Şekil 2.1.). Şekil 2.1. Normal dağılım grafiği.

29 19 Mükemmel bir Gaus dağılımında asimetri (skewness) ve dikey çarpıklık (kurtosis) skorlarının her ikisi de sıfıra eşittir. X ekseninde, dağılımın sağa veya sola doğru kuyruğunun olması asimetri skorunun pozitif veya negatif değerler almasına neden olur (Şekil 2.2.). Dağılım eğrisindeki tepe noktasının keskin veya basık olması dikey çarpıklık skoru ile değerlendirilir. Bu skor Gaus dağılımında sıfıra eşittir ve oluşturduğu şekil mezokolik olarak ifade edilir. Sivri tepeli bir dağılım grafiğinde dikey çarpıklık pozitif olarak değerlendirilir ve Leptokurik olarak adlandırılır. Basık tepeli bir dağılım grafiğinde ise dikey çarpıklık negatif olarak değerlendirilir ve platikurik olarak adlandırılır (Şekil 2.3.). Normal dağılımda asimetri ve dikey çarpıklık skorlarının standart hatanın iki katından fazla olmaması istenir. Şekil 2.2. Negatif ve pozitif yönlü asimetrik dağılım grafikleri. Şekil 2.3. Negatif ve pozitif yönlü dikey çarpıklık grafikleri.

30 20 Normal dağılım söz konusu ise, 2,5 ve 97,5 uncu yüzdelikler arası, basit bir işlem ile aritmetik ortalama ± (1.96xSD) sınırlarına tekabül eder. Referans aralıkları çalışmasında verilerin normal dağılım göstermemesi gözlenen zorluklardandır. Bu durum sonuçların aktarım hataları, hemoliz, lipemi gibi düşük veya uygun olmayan kalitedeki örnekler sonucu oluşan preanalitik hatalar, yaş, beslenme ya da polimorfik proteinler gibi (Örneğin Haptoglobin, Lipoprotein a, Homosistein ve diğerleri) özel genler tarafından ifade edilen analitlerin ölçümünde fizyolojik olarak ortaya çıkabilir (43, 88). Ölçülen analit konsantrasyonundaki exponansiyel artış da nonparametrik dağılıma neden olacaktır. Bu durum referans aralığının kolayca ortalama±(1.96xsd) şeklinde hesaplanmasına engel olur Aykırı değerlerin tespiti Veriler normal dağılıma sahip değilse, en sık uygulama normal dağılımı elde etmek için verilerin logaritma veya benzer diğer fonksiyonlar kullann tekniklerle, aslında içerdikleri normal dağılıma ulaşmaktır (59, 79, 13, 109). Ortalama ve SD hesap edildikten sonra veriler tekrar anti logaritmalarına dönüştürülür. Bu hesap sadece normal dağılıma dönüşüm başarılıysa geçerlidir. Ancak yapılan işlemlerin uygunluğu her zaman doğrulanmalıdır. Bu amaç için oluşturulmuş deneysel Gaus dağılımı ile hipotetik Gaus dağılımını kıyaslayan bir birçok test vardır (23, 85, 22). Bunlardan en sık kullanılanları; Kolmogorov-Smirnov, Anderson-Darling, Shapiro-Wilk ve D'Agostino-Pearson testleridir. Verilerin var olan dağılımı normal değil ve dönüştürme ile normal dağılım elde edilemiyorsa o zaman, "aritmetik ortalama ± (1.96xSD)" işlemi bu hesaplamada geçerli olamaz. Böyle bir çalışma sonucu elde edilen referans aralıkları, olması gereken değerlerden aşağı veye yukarıda kalacaktır. Bu durumun nedenlerinden biri de aykırı değerler (outliers) olarak nitelendirilen, altta yatan dağılıma doğrulukla ait olmayan değerlerdir. Bu değerler ortalama, SD ve dönüşümü belirleyen parametreleri etkilemiştir (8). Ancak aykırı değerler istatistiksel olarak ayırdedilmeden çıkarılmamalıdır. Aykırı değer tepitinde en sık kullanılan iki test Dixon'ın aralık istatistiği ve Horn'un algoritmasıdır. Her iki test CLSI yönergesi tarafından tavsiye edilmiş testlerdir (19).

31 Dixon Aralık İstatistiği Yöntem ilk kez Dixon tarafından öne sürülmüş ve diğer araştırmacılar tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntemde değerin reddedilmesi ret (r) kriterinin 0,3'ten büyük olması ile belirlenir. Bu test korumacı bir yaklaşıma sahiptir. Çoklu aykırı değer varlığında, aykırı olarak belirlenen veri sayısı sınırlıdır. Bu yöntemde ret kriteri 0,3'ten büyük ise o veri aykırı olarak nitelendirlir (82, 100). r kriteri = D R D: En uç değer ile bir sonraki değer arasındaki mutlak fark R: Tüm değerler içinde iki taraftaki uç değer arasındaki fark Horn algoritması Bu algoritma Tukey'in çeyrekler arası parmaklığını (IQF) kullanır. Bu parmaklıkta alt ve üst olmak üzere iki adet sınır değer, ret kriteri değerleridir ve hesaplanmasında 25. ve 75. yüzdelikler kullanılır. Bu metod çoklu aykırı değerleri tespit eder (63). Bu metoda göre, Alt sınır = Q 1-1,5 x IQR Üst sınır = Q 3 + 1,5 x IQR IQR = Q 3 - Q 1 Q 1: En küçük çeyreklik değeri, Q 3 : En büyük çeyreklik değeri, IQR: Çeyrekler arası aralık Gruplama ihtiyacının tespiti Referans aralıklarında, önemli farklara neden olabileceği umulan fizyolojik temelli alt sınıflama yapmanın gerekliliği incelenmelidir. Gruplama, homojen alt grupların oluşmasını ve bireyler arası değişkenliklerin azaltılmasını sağlar. Gruplama her alt grupta en az 40 birey varsa yapılabilir. Gruplama ihtiyacının tespitinde göz önünde tutulması gereken sadece ortalamalar olmamalı aynı zamanda SD'lar da olmalıdır. Ancak en önemli gruplama kriteri

32 22 her alt grubun referans aralıklarının alt gruplama yapılmadan önceki birleşik grup referans aralıklarının alt ve üst limitlerinin dışında kaldığının incelenmesidir (75, 16). Gruplama ihtiyacının varlığını düşündüren durumlar; 1. Sinton Metodu: Alt grup ortalamaları birleşık grubun alt ve üst limitleri arasındaki farkın %25'ini aşması. (Normal dağılım gerektirir.) 2. Harris Boyd metodu: Büyük SD içeren gruba ait SD 'nın, küçük SD içeren gruba ait SD'a oranının 1,5'tan büyük olması. Bu durumda alt gruplar arası ortalamalara bakılmaz. 3. Lahti metodu: Altgrup ortalamalarını kullanarak elde edilen Z değerinin 3 ten büyük olması. Her grupta 120 örnek sayısı sağlandığında tavsiye edilir. Bu yöntem, subgruplar eşit hacimde ve gaus dağılımı gösteriyorsa en iyi yanıt verir. Z = (Ortalama 1 -Ortalama 2 ) [(SD 2 1 /n 1 )+ (SD 2 2 /n 2 )] 1/2 Ancak eğer bir alt grubun %4,1 'inden fazlası ya da %0,9 'undan azı, birleşik grubun üst veya alt limitleri dışında kaldıysa gruplama önerilmez Referans aralığı hesaplanmasında kullanılacak yöntemin seçimi Referans aralıklarının hesaplanmasında kullanılacak yöntemin seçimi örneklem sayısı ve verilerin dağılımına göre gerçekleştirilir Genel Hesaplama Bu yöntem ancak ve ancak verilerin normal dağıldığı veya normal dağılıma dönüştürülebilmesinin mümkün olduğu durumlarda kullanılabilir. Bu yöntemde referans limit değerleri için basitçe mean ± SD x 1,96 hesaplaması yapılır ve en az örnek sayısı 30 olmalıdır. IFCC, dağılıma bakılmaksızın, bu yöntem yerine Robust veya nonparametrik metod olarak adlandırılmış diğer yöntemlerin kullanılmasını tavsiye etmektedir (99) Robust Metodu Bu yöntem de genel hesaplama yöntemindeki gibi verilerin normal dağıldığı durumda kullanılır, ancak dağılımı oldukça kuyruklanmış negatif ve pozitif yönlü asimetrik dağılımlarda da işlevsel olduğu öne sürülmektedir (57). Aslında normal dağılmış ama %10'a

33 23 kadar tek taraflı aykırı veriler içeren durumlarda işlevsel olduğu öne sürülmüş olsa da referans aralığı hesaplamasında aykırı değerler açısından yine de şüphe içerdiğini öne süren yayınlar da mevcuttur (61, 60). Bu yöntem, simetrik bir dağılımın orta değerinin kestirimi üzerine kuruludur ve verinin konumu ve dağılımının kestirimi için tekrarlamalı aşamalar içerir. Örneklem sayısının 40'tan fazla, 120'den az olması durumunda tercih edilir. Bu yöntemde alt ve üst limit değerleri kapsayan %90 güven aralığının hesaplanması mümkün değildir (61). CBstat, Reference value advisor freeware, MedCalc gibi, bu yöntemle hesaplama yapılabilen pekçok klinik laboratuvar yazılım programı mevcuttur Bootstrap Metodu Bu yöntemin temel prensibi, basit bir açıklama ile, bir bilgisayar aracılığıyla, orjinal olarak gözlemlenmiş veriler içinden rastgele seçilen verilerin tekrarlayan seferlerde yeniden seçilmesidir. Her değer seçilebilmek için eşit olasılık içerir. Belirli sayıda tekrarın ardından tekrar tekrar seçilen değerlerin ortalaması alınarak hesaplama yapılır (78, 84). Yöntemin en büyük avantajı düşük sayıdaki örnek hacmi ile non parametrik dağılımda %90 güven aralığı ile referans aralığı limit değerlerinin hesaplanmasıdır. Veri ayısı 20 ile 40 arasındaki normal dağılım göstermeyen verilerde kullanılır (21) Nonparametrik Persentil Metodu Hem IFCC hem de CLSI tarafından ugulanması tavsiye edilen metodtur. Bu yöntemde, dağılımın her %1'lik kısmına denk gelen değer 1 persentili ifade eder. 2,5 ve 97,5 Persentiller %95'lik referans aralığı sınırlarını ifade eden, alt ve üst limit değerlerin oluşturulmasında kullanılır. Veriler her persentilde rastlanma sıklıklarına göre düzenlenir ve kademeler (rank) oluşturulur. Kademeler, bu limit değerlerin yer aldığı %90 güven arlıklarının oluşturulmasında kullanılır. Güven aralıklarının oluşturulabilmesi için veri sayısı en az 120 olmalıdır (54, 84, 63). Bu yöntem, verilerin belirli dağılım şekli içermesi varsayımına dayanmaz. Bu nedenle bir dizi avantajı vardır. Örneğin, veriler asimetrik dağılım göstermiş olsa da persentiller hesaplanabilir ve dağılımdaki aşırı uç değerlerden etkilenmez (62).