İZMİR İLİNDE SATIŞA SUNULAN ET VE ET ÜRÜNLERİNDE Escherichia coli O157:H7 ARANMASI VE SAPTANMASI

Transkript

1 EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ) İZMİR İLİNDE SATIŞA SUNULAN ET VE ET ÜRÜNLERİNDE Escherichia coli O157:H7 ARANMASI VE SAPTANMASI Seçil BAYAR Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: Sunuş Tarihi: Tez Danışmanı: Doç. Dr. Mustafa ATEŞ Bornova-İZMİR

2 III Seçil BAYAR tarafından Yüksek Lisans tezi olarak sunulan İzmir İlinde Satışa Sunulan Et ve Et Ürünlerinde Escherichia coli O157:H7 Aranması ve Saptanması başlıklı bu çalışma E.Ü. Lisansüstü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliği ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Eğitim ve Öğretim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan değerlendirilerek savunmaya değer bulunmuş ve tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oybirliği/oyçokluğu ile başarılı bulunmuştur. Jüri Üyeleri: İmza Jüri Başkanı : Doç. Dr. Mustafa ATEŞ Raportör Üye: Prof. Dr. İsmail KARABOZ Üye : Yard. Doç. Dr. H. Halil BIYIK

3 IV

4 V ÖZET İZMİR İLİNDE SATIŞA SUNULAN ET VE ET ÜRÜNLERİNDE Escherichia coli O157:H7 ARANMASI VE SAPTANMASI BAYAR, Seçil Yüksek Lisans Tezi, Biyoloji Anabilim Dalı Tez Yöneticisi: Doç. Dr. Mustafa ATEŞ Haziran 2007, 89 sayfa Bu çalışmada, İzmir ilinde satışa sunulan et ve et ürünlerinde Escherichia coli O157:H7 nin aranması ve saptanması gerçekleştirilmiştir. Bunun için, kasap ve marketlerden farklı zamanlarda sağlanan 10 adedi kuzu kıyma, 10 adedi dana kıyma, 22 adedi sosis, 26 adedi salam, 18 adedi dana döner ve 14 adedi sucuk olmak üzere toplam 100 adet et ve et ürünü örneği incelenmiştir. Ayrıca bu örneklerde tespit edilen toplam aerobik mezofilik bakteri sayıları ile E.coli O157:H7 nin varlığını arasındaki korelasyon araştırılmıştır. Örneklerin analizinde, ilk önce toplam aerobik mezofilik bakteri sayımları gerçekleştirilmiştir. Daha sonra Sorbitol negatif ve Dryspot E.coli O157 latex test kiti ile tepkime veren koloniler E.coli O157 olarak tanımlanmıştır. O157:H7 ID Agar ile ikinci bir doğrulama testi yapılmıştır. E.coli O157:H7 kuzu kıyma örneklerinde %20 (2/10) oranında, dana kıyma örneklerinde %40 (4/10) oranında, dana döner örneklerinde %11,1 (2/18) oranında, sosis örneklerinde ise %9,05 (2/22) oranında tespit edilirken 26 adet salam ve 14 adet sucuk örneğinin hiç birinde E.coli O157:H7 varlığı tespit edilmemiştir. Elde edilen sonuçlar, E.coli O157:H7 açısından pozitif örneklerde toplam aerobik mezofilik bakteri sayıları ile E.coli O157:H7 nin varlığı arasında bir bağlantı olmadığını göstermiştir. Anahtar Kelimeler: E.coli O157:H7, et ve et ürünleri, korelasyon

5 VI

6 VII ABSTRACT INVESTIGATION AND DETERMINATION OF Escherichia coli O157:H7 IN MEAT AND MEAT PRODUCTS WHICH SOLD IN IZMIR BAYAR, Secil MSc in Biology Department Supervisor: Ass. Prof. Dr. Mustafa ATES June 2007, 89 pages In this study, the investigation and determination of E.coli O157:H7 was done in meat and meat products which sold in Izmir. Therefore 10 calf minced meat, 10 lamb minced meat, 22 sausage, 26 salami, 18 Turkish calf doner and 14 spicy sausage samples was obtained from retail markets and butcheries in different times in Izmir. Furthermore, the correlation between the numbers of total aerobic mesophilic bacteria which were fixed in these samples and the presence of E.coli O157:H7 was investigated. In the analysis of samples first, the count of total aerobic mesophilic bacteria was done. Later the colonies that were sorbitol (-) and made agglutination with Dryspot E.coli O157 latex agglutination test kit were identified as E.coli O157. After the second confirmation test was done with O157:H7 ID Agar. E.coli O157:H7 (20%) was found in the lamb minced meat. In calf minced meat samples E.coli O157:H7 (40%) was found. E.coli O157:H7 (11.1%) was found in the Turkish calf doner. In sausage samples E.coli O157:H7 (9.05%) was found E.coli O157:H7. However E.coli O157:H7 wasn t determining in spicy sausage and salami samples. Results reveal that in the samples which are positive for E.coli O157:H7, there is no connection between the numbers of total aerobic mesophilic bacteria and the presence of E.coli O157:H7. Key Words: E.coli O157:H7, meat and meat products,correlation

7 VIII

8 IX TEŞEKKÜR Tez konumun belirlenip yürütülmesinde bana destek olan ve yardımlarını esirgemeyen kıymetli hocam sayın Doç. Dr. Mustafa ATEŞ e, her zaman yardımlarını esirgemeyen Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bölümü eğitim elemanlarına ve araştırma görevlilerine, çalışmalarım sırasında bana yardımcı olan tüm arkadaşlarıma en içten dileklerimle teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca tez çalışmalarım süresince beni maddi-manevi destekleyen ve karşılaştığım güçlükleri benimle paylaşan ve bulunduğum yere gelmemde büyük emekleri olan kıymetli aileme tüm kalbimle teşekkür ederim.

9 X

10 XI İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET. V ABSTRACT VII TEŞEKKÜR.. IX ŞEKİLLER DİZİNİ. XV ÇİZELGELER DİZİNİ XVII 1.GİRİŞ 1 2.LİTERATÜR ÖZETİ Escherichia coli İle İlgili Genel Bilgiler Morfolojik ve biyokimyasal özellikleri Antijenik yapı Escherichia coli nin Patojenik Grupları Enteroinvaziv E.coli (EIEC) Enteropatojenik E.coli (EPEC) Enteroagregatif E.coli (EAggEC, EAEC) Enterotoksijenik E.coli (ETEC) Diffüz Adherent E.coli (DAEC) Enterohemorajik E.coli (EHEC) E.coli O157:H Non-O157 E.coli serotipleri E.coli O157:H7 enfeksiyonunun kaynakları ve salgınlar Biyokimyasal ve antijenik özellikleri Gelişmesi ve canlı kalması Asit toleransı NaCl toleransı...24

11 XII İÇİNDEKİLER(Devam) Sayfa Sıcaklığın etkisi Kontrolü Yaptığı hastalıklar Hemorajik Kolitis E.coli O157:H7 nin neden olduğu kansız diyare E.coli O157 nin asemptomatik infeksiyonları Hemolitik Üremik Sendrom Trombotik Trombositopenik Purpura Virulans faktörleri Kromozomda lokalize olan virulans faktörleri Shiga toksin (stx) ve stx çeşitleri Enterosit silme lokusu (Locus of Enterocyte Effacement=LEE) Plazmitin aracılık ettiği virulans faktörleri Enterohemolizin (Ehly) Tip ІІ salgılama sistemi (ETP) Katalaz peroksidaz (KatP) Serin proteaz (EspP) Diğer kromozomal ve plazmidal virulans faktörleri Belirlenmesi Klasik yöntemler Gelişmiş ve hızlı testler E.coli O157:H7 enfeksiyonunu önleme yolları..56

12 XIII İÇİNDEKİLER(Devam) Sayfa Tedavi prensipleri MATERYAL VE METOD Materyal Et ve et ürünleri Tamponlanmış Peptonlu Su (TPS) Cefixime-Vancomycin ilaveli Tamponlanmış Peptonlu Su (CV-TPS) Plate Count Agar (PCA) Cefixime/K-Tellurit Sorbitol MacConkey Agar (CT-SMAC ) O157:H7 ID Agar (O157 H7 ID-F) Nutrient Agar (NA) Dryspot E.coli O157 Latex test Metod Örneklerin alınımı Homojenizasyon ve seyreltme işlemleri Toplam aerobik mezofilik bakteri sayımı E.coli O157:H7 zenginleştirme prosedürü E.coli O157:H7 izolasyon prosedürü Dryspot E.coli O157 Latex test ile doğrulama testi Stok kültürlerin hazırlanması ve bu kültürlerin O157:H7 ID Agar üzerinde yeniden doğrulanması 69

13 XIV İÇİNDEKİLER(Devam) Sayfa 4. BULGULAR TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR.85 7.ÖZGEÇMİŞ..89

14 XV ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa Şekil 2.1: Patojenik E.coli gruplarının patogenezi 14 Şekil 2.2: Shiga toksinin yapısı.35 Şekil 2.3: TTSS (Type III Secretion System=Tip Üç Salgılama Sistemi).39 Şekil 2.4: LEE lokusu ve bu lokusta kodlanan proteinler 40 Şekil 2.5: E.coli O 157:H7 konukçu-hücre etkileşimi..42 Şekil 2.6: Tir proteininin yapısı 43 Şekil 2.7: Pedestal yapısı..43 Şekil 2.8: Uluslar arası referans strain E.coli O 157:H7 nin virulans faktörlerinin genetik yerleşimi 47 Şekil 4.1: Et ve et ürünlerinde E.coli O 157:H7 nin dağılımı (%)...71

15 XVI

16 XVII ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1: Diyarejenik E.coli gruplarının neden olduğu salgınlardaki karakteristik özellikler ve kaynaklar veya araçlar 13 Çizelge 2.2: Shigatoksin üreten E.coli serotipleri 17 Çizelge 2.3: Patojenik E.coli lerin büyüme sınırı parametreleri.25 Çizelge 4.1: İncelenen et ve et ürünlerinde E.coli O157:H7 dağılımı.71 Çizelge 4.2: İncelenen kuzu kıyma örneklerinde, örneklerin E.coli O157:H7 açısından durumu ve toplam aerobik mezofilik bakteri sayıları.72 Çizelge 4. 3: İncelenen dana kıyma örneklerinde, örneklerin E.coli O157:H7 açısından durumu ve toplam aerobik mezofilik bakteri sayıları.72 Çizelge 4. 4: İncelenen sucuk örneklerinde, örneklerin E.coli O157:H7 açısından durumu ve toplam aerobik mezofilik bakteri sayıları...73 Çizelge 4. 5: İncelenen sosis örneklerinde, örneklerin E.coli O157:H7 açısından durumu ve toplam aerobik mezofilik bakteri sayıları.74 Çizelge 4. 6: İncelenen salam örneklerinde, örneklerin E.coli O157:H7 açısından durumu ve toplam aerobik mezofilik bakteri sayıları.75 Çizelge 4. 7: İncelenen dana döner örneklerinde, örneklerin E.coli O157:H7 açısından durumu ve toplam aerobik mezofilik bakteri sayıları 76 Çizelge 4. 8: E.coli O157:H7 açısından pozitif olan et ve et ürünlerinde toplam aerobik mezofilik bakteri sayılarının ortalaması 77

17 XVIII

18 1 1. GİRİŞ Escherichia coli (E.coli), Gram negatif, Enterobacteriaceae ailesi içerisinde Escherichia genusuna bağlı, fakültatif anaerob, çoğunlukla hareketli, sporsuz, çubuk şeklinde bir bakteridir. Son yıllarda, konakçı hücrelerine bakteriyal yapışma modellerini, bağlanmanın etkilerini, toksin üretimi ve yayılmasını kapsayan virulans faktörlerini içeren virotipik sınıflandırmaya göre, sindirim sistemi hastalıklarına yol açan E.coli nin 5 virotipi bildirilmektedir. Bunlar, ETEC (Enterotoksijenik E.coli), EPEC (Enteropatojenik E.coli), EIEC (Enteroinvasiv E.coli), EHEC (Enterohemorajik E.coli) ve yeni tanımlanan EAggEC (Enteroaggregative E.coli) dir (Temelli, 2002). EHEC nin patojenik E.coli nin ayrı bir sınıfı olarak tanımlanması iki anahtar epidemiyolojik gözlemin sonucudur. Bunlardan ilki 1983 yılında Riley ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir. Bu bilim adamları, şiddetli ve kramplı karın ağrıları ve sulu ishali takip eden kanlı ishal ile karakterize edilen farklı bir sindirim sistemi hastalığının iki salgınını araştırmışlardır. Bu hastalık, Hemorajik Kolitis (HC) olarak adlandırılmakta ve bir fast food restoran zincirindeki pişirilmemiş hamburgerlerin vücuda alınmasıyla ilişkilendirilmektedir. Bu tür hastalığa sahip hastalardan alınan dışkı örneklerinde nadir olarak izole edilmiş E.coli serotipi, O157:H7 bulunmuştur. İkinci anahtar gözlem 1983 yılında Karmali ve arkadaşları tarafından yapılmıştır. Bu bilim adamları dışkıda fekal sitotoksin ve sitotoksin- üreten E.coli ile bağlantılı olan Hemolitik Üremik Sendrom (HUS) un seyrek görülen durumları arasındaki ilişkiyi rapor etmişlerdir. HUS un (Böbrek yetersizliği, mikroangiopatik anemi ve trombositopeni ile karakterize edilir ve üçlü bir sendrom olarak tanımlanır.) tipik olarak kanlı ishal hastalıklarından önce oluştuğu ve Hemorajik Kolitis ten (HC) ayırt edilmesinin imkansız olduğu bilinmektedir. Biri E.coli serotipine diğeri ise özgül bir sitotoksine dayanan bu iki anahtar klinik mikrobiyolojik gözlem, intestinal ve renal hastalıklara yol açan bağırsak patojeni sınıfının önemini arttırmaktadır. Karmali ve arkadaşları tarafından kullanılan sitotoksin analizi, ilk kez 1977 de Konowalchuk ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir. Bu araştırıcılar kültüre 1

19 2 edilmiş Vero hücreleri üzerinde geri dönüşümsüz sitopatik etki üreten bazı E.coli suşlarından elde edilmiş kültür filtratlarının, CHO ya da Y- 1 hücreleri üzerinde sitopatik etki göstermeyen ETEC LT den tamamen farklı olduğunu rapor etmişlerdir. Aynı dönemde O Brien ve arkadaşları, belirli E.coli suşlarının özütlerinin HeLa hücrelerine sitotoksik olduğunu ve bu sitotoksik aktivitenin saf Shigella dysenteria 1 (Shiga) toksinine (Stx) karşı hazırlanmış antitoksinle nötralize edilebileceğini açıklamışlardır. Bu bilim adamları daha sonra ishalli hastalıklardan izole edilen bazı E.coli suşlarının Shiga benzeri bir toksin (SLT=SBT) ürettiklerini rapor etmişlerdir. Buna Konowalchuk ve arkadaşları tarafından bildirilen ve Vero sitotoksin üreten bir suş da dahildir. Daha sonra O Brien ve arkadaşları Shiga-benzeri toksin ve Vero toksinin aynı toksin olduğunu göstermişlerdir. Riley ve arkadaşları ise O157:H7 nin bu toksini ürettiğini saptamışlardır. Bağımsız olarak Johnson ve arkadaşları Kanada da ki Hemorajik Kolitisli (HC) hastalardan izole edilen suşların Vero hücreleri üzerinde aktif olan bir sitotoksin ürettiklerini rapor etmişlerdir. Karmali ve arkadaşları bu patojenle ilgili olarak yayınladıkları makalede, HUS ve HC arasındaki yaygın virulans faktörünün Vero sitotoksin/shiga benzeri toksin olduğunu ve intestinal ve böbreklerle ilgili dokuların zarar görmesinden yine bu patojenin sorumlu olduğunu açıklanmışlardır (Nataro ve Kaper, 1998). Stx ailesi, immunolojik olarak çapraz olmayan tepki veren ve Stx1 ve Stx2 olarak adlandırılan 2 büyük grup içerir. Tek bir EHEC suşu sadece Stx1, sadece Stx2 yi yada bu toksinlerin ikisini yada Stx2 nin bir çok formunu ifade edebilmektedir EHEC den elde edilen Stx1, S.dysenteria 1 nın Shiga toksini ile hemen hemen aynıdır (Bazı suşlardan elde edilen Stx1 ler, tek bir aminoasit bazında farklılık gösterebilirler. Bununla beraber diğer suşlardan elde edilen Stx1 ler dizilim çeşitliliği göstermezler.). Prototipik Stx1 ve Stx2, A ve B alt birimi bazında % 55 ve 57 baz dizilimi benzerliğine sahiptir. Stx1 oldukça iyi korunmuş olup Stx2 içerisinde baz dizilimlerinde çeşitlilik söz konusudur (Nataro ve Kaper, 1998). 2

20 3 Birçok ülkede (Arjantin, Avustralya, Belçika, Danimarka, Almanya, İsviçre, İsrail, Güney Afrika ve İtalya), E.coli O157:H7 ile kontamine olmuş gıdaların tüketilmesi sonucu ortaya çıkan çok sayıda gıda zehirlenmesi bildirilmiştir. E.coli O157:H7, ABD de her yıl kişinin hastalanmasına ve 900 kişinin ölümüne ve yaklaşık milyon dolar ekonomik zarara neden olmaktadır. İngiltere de sadece 1996 yılında 506 vakaya, İskoçya da yılları arasında 700 kişinin hastalanmasına, Japonya da da 7000 okul çağındaki çocuğun zehirlenmesine neden olmuştur (Alişarlı ve Akman, 2004). Etken, vücuda alındıktan sonra inkübasyon periyodu 3-8 gün arasında değişmekte ve genellikle krampla seyreden karın ağrısı, kusma, mide bulantısı, gastroenteritis, ishal, kanlı ishal ve hemorajik kolit gibi klinik semptomlara neden olmaktadır. Bunlardan hemorajik kolit, yaklaşık 5-10 gün sonra ilerleyerek Hemorajik Üremik Sendroma (HUS) dönüşebilmekte, bu da şiddetli anemi ve böbrek yetmezliği ile komplike olabilmektedir. HUS semptomları gösteren özellikle okul çağındaki çocuklar ile yaşlı bireylerin yaklaşık %5 i akut dönemde ölmekte, VTEC O157 ile enfekte olan insanların ise yaklaşık %50 si hastanelerde tedavi edilmektedir. EHEC, ayrıca Trombotik-Trombositopenik Purpura (TTP) ya neden olmakta, özellikle yaşlı bireylerde beyin trombozlarına neden olarak ölüm şekillendirmekte ve letaliteyi arttırmaktadır (Alişarlı ve Akman, 2004). EHEC; gıdadan, sudan ve insandan insana bulaşabilmektedir. Birçok duruma sığır orijinli kontamine gıdaların vücuda alınması neden olmaktadır. Amerika da evde yada bir restoranda hazırlanmış pişirilmemiş hamburgerlerin vücuda alınması salgınların en önemli nedenlerindendir. Kuzey Amerika dan rapor edilen en büyük salgın, Aralık 1992 ve Ocak 1993 de bir fast-food restoran zincirinden yenen hamburgerlerden kaynaklanmıştır. Yapılan başka bir çalışmada evde hazırlanan hamburgerlerin seyrek görülen O157:H7 enfeksiyonlarının en önemli kaynağı olduğu gösterilmiştir. Fakat bu çalışmayı yapanların belirtiklerine göre bazı enfeksiyonlar, pişirilmemiş hamburgerlerin doğrudan vücuda alınmasından değil, gıdayı hazırlayan 3

21 4 insanlar tarafından gıdaların karşıt kontaminasyona maruz bırakılmasından kaynaklanmaktadır. Bu kişiler çiğ kıymayı elledikten sonra ellerini yıkamadıkları için böyle bir kontaminasyona neden olmaktadır. Rosto eti ve çiğ süt gibi sığır orijinli diğer gıdalar, sığırlardan, kuşlardan veya koyunlardan elde edilmiş diğer tip etler doğrudan salgınlarla bağlantılıdır (Nataro ve Kaper, 1998). Başlangıçta hamburgerlerle bağlantılı salgınlarla karşılaştırıldığında EHEC nin neden olduğu hastalıklardaki aracıların çeşitliliği zamanla artmaktadır. Son yıllardaki salgınlar, mayonezin, pastorize edilmemiş elma suyunun ve fermente edilmiş sert salamların tüketilmesiyle bağlantılıdır. Bahsedilen son iki aracı E.coli O157:H7 nin önemli bir özelliğini ortaya çıkarmıştır. Bu özellik, gıdalarda diğer patojenlerin yaşamlarını sürdüremediği düşük ph koşullarında E.coli O157:H7 nin büyüyebilmesidir. Bu organizma asidik koşullara adapte olabilmekte ve bu durum organizmanın birkaç gün için ph 3,4 hayatta kalabilmesine olanak sağlamaktadır. Yeşillikler gibi çiğ sebzelerin bazı salgınlarda aracılık ettiği bilinmektedir. Japonya da son yıllarda görülen 9000 vakada, pişirilmemiş kırmızı turp filizinin bu vakalardaki aracılardan biri olduğu saptanmıştır. Bu vakaların birçoğunda aracılık eden meyve ve sebzelerin sığır dışkısıyla kontamine olduklarına inanılmaktadır. Hastalık için düşük enfeksiyon dozunun yeterli olması, pişirilmemiş gıdaların tüketilmesi ile beraber enfeksiyonların ortaya çıkmasındaki en önemli etkenlerdir. Michigan ve Virginia da görülen 2 O157:H7 salgını alfalfa filizinin tüketilmesiyle bağlantılıdır. Yenilenebilir sular, kuyu suyu ve belediye su sistemleri gibi su kaynakları da salgınlarla bağlantılıdır. Belediye su sisteminin neden olduğu bir salgın, 243 kişiyi etkilemiş 4 kişinin ölümüne neden olmuştur. Bu salgın, uygun olmayan bir şekilde tamir edilmiş su sisteminden klorlanmamış suyun dağıtımı sonucu ortaya çıkmıştır. Saklanmakta olan gıdaların kontaminasyonu, sebzelerin çiğ yenmesi ve su çeşitli enfeksiyon kaynaklarındandır. Ancak halkın bu kaynaklardan korunması oldukça güç olacaktır. Bu çalışmada, gelişmiş ülkelerde dahi gıdalardaki kontaminasyon oranı devamlı yükselen ve halk sağlını gittikçe daha fazla tehdit eden bir bakteri olan E.coli 4

22 5 O157:H7 nin dana ve kuzu kıyma, sosis, dana döner, salam ve sucuk örneklerindeki varlığı ve bu örneklerde tespit edilen toplam aerobik mezofilik bakteri sayısı ile E.coli O157:H7 nin varlığının korelasyonu araştırılmıştır 5

23 6 2. LİTERATÜR ÖZETİ 2.1. Escherichia coli İle İlgili Genel Bilgiler E.coli bütün dünyada üzerinde en çok çalışılan canlı türlerinden biridir. İlk kez 1885 yılında Dr. Thedor Escherichia tarafından izole edilmiştir. Önemi, sadece gıda mikrobiyolojisinde lokal kirliliğin belirlenmesindeki kullanımından değil, bundan daha önemli olarak genetik yapısı en iyi bilinen canlı türü olmasından dolayı genetik araştırmalarda kullanılmasından gelmektedir (Halkman ve ark., 1994 ). Enterobacteriaceae familyasının Koliform grubu içinde yer alır. Koliform grup denince, aerob ve fakültatif anaerob, Gram negatif, spor oluşturmayan ve 35 o C de 48 saat içinde laktozdan gaz ve asit oluşturan tüm çubuk bakteriler anlaşılır. Bu tanım içinde E.coli Tip I ve Tip II, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae ve Citrobacter freundii bakterileri koliform grubunu oluşturur. Koliform içinde sadece E.coli doğrudan barsak kökenlidir. Grubun diğer üyeleri doğal olarak toprakta bulunabilir. Bu nedenle gıdalarda, içme ve kullanma sularında, deniz ve göllerde E.coli bulunmasına izin verilmez (Halkman ve ark., 1994 ). E.coli, insan ve hayvan gastrointestinal florasının devamlı bir elemanıdır ve burada predominant fakültatif bir organizmadır. Fakat konakçı organizmayla kurulan denge bozulduğunda E.coli gastrointestinal kanal dışına çıkarak, yerleştiği sistemle ilgili klinik tablolara sebep olabilir (Tabak,2000) Morfolojik ve biyokimyasal özellikleri E.coli; Gram negatif, fakültatif anaerob, çoğunlukla hareketli, sporsuz, 1-2 mm çapında S tipi koloniler yapan, boyu 2 µm ve eni 1-1,5 µm olan basil şeklinde bir bakteridir ( E.coli glikoz, laktoz, maltoz, mannitol, ksiloz gibi şekerleri asit ve gaz yaparak fermente ederken sükroz, salisin, rafinoz gibi şekerlere etkisi değişkendir. Adenitol, inozitolü genellikle fermente etmezler. Nişastadan gaz oluşturmazlar. İndol pozitiftir. 6

24 7 Metil-Red testi pozitif, Vages-Proskauer testi negatiftir. Sitratlı besiyerinde ürerler. Böylece IMVIC testleri(++--) dir. Üre besiyerinde üreyi kullanamadığı için üreyemez, KCN testi negatiftir. Genellikle H 2 S oluşturmaz. Dezenfektanlara, bazı boya maddelerine (malaşit yeşili, fuksin vb.), safra ve safra tuzlarına ve %7 NaCl ye karşı duyarlı, fakat ısı ve soğuğa dirençlidir ( Antijenik yapı Doğal yaşam ortamı bağırsaklar olan E.coli, diğer barsak bakterileri gibi çeşitli antijenlere sahiptir. Bunlar: O Antijenleri : Somatik antijen olup, ısıya ve alkole dayanıklı, formale dayanıksız, lipopolisakkarit yapısındadır. Bu antijene göre gruplara ayrılır. H Antijenleri : Kirpik antijenleri olup hareketli kökenlerde bulunur. Protein yapısında ve 100 o C de ısıtılmaya, alkol ve proteolitik fermentlere dayanıksız, formole dayanıklıdır. K Antijenleri : Kapsül antijeni olup, polisakkarit yapısında ve ısıya dayanıklıdır derecede bir-iki saat kaynatmakla ortadan kaldırılabilir. Bu antijene sahip bakteriler somatik antiserumları ile aglütinasyon oluşturmaz. Fimbria Antijenleri : Özellikle mannaz rezistant fimbriaları bulunan bakterilerde görülür ( Escherichia coli nin Patojenik Grupları İnsanlarda diyareye neden olan E.coli serotipleri patojenik, enteropatojenik, enterovirulent, diyarejenik serotipler olarak adlandırılmaktadır. Bu serotipler virulans özellikleri, patojenite mekanizması, klinik sendromlar ve O:H serotiplerine göre başlıca; Enteroinvaziv (EIEC), Enteropatojenik (EPEC), Entero-agregativ (EAggEC, EAEC), Enterotoksijenik (ETEC), Diffüz Adherent (DAEC), Enterohemorajik (EHEC) olmak üzere 6 ana grup altında toplanmaktadır. Bununla birlikte, diyareye neden olan serotiplerin bu şekilde kesin bir ayrımı yoktur. Bu gruplara ilaveten 7

25 8 fakültatif enteropatojenik (FEEC), verotoksin oluşturanlar (VTEC), önceleri shiga benzeri toksin oluşturanlar (= shiga like toxin; SLTEC) olarak adlandırılmış olmakla beraber son zamanlarda doğrudan shiga toksin (Stx; çoğul formda Stxs) oluşturanlar (STEC) şeklinde tanımlanmış olması, diyare oluşturanlar (DEC) gibi grupların başka gruplar ile tarif edilebilmesi, diyareye neden olan E.coli lerin enfeksiyon veya intoksikasyon etmeni olarak gruplandırılması bu konudaki terminolojiyi zorlamaktadır (Halkman ve ark., 2001) Enteroinvaziv E.coli (EIEC) EIEC ilk olarak 1944 yılında parakolon basil olarak tanımlanmış daha sonra E.coli O124 olarak tanılanmıştır de EIEC suşlarının tipik EIEC enfeksiyonu olan kanlı ishale neden olduğu ve fakir ülkelerde yüksek oranda görüldüğü saptanmıştır. EIEC suşları genel olarak hareketsizdir ve O28ac, O29, O112ac, O121, O124, O135, O136, O143, O144, O152, O159, O164, O167 i içeren az sayıda O grubu bulunmuştur. EIEC suşları, enterositleri kaplamakta ve onların şeklini değiştirerek bu hücrelerin ölümüne neden olmaktadır. EIEC nin invaziv karakteri 140MDa luk bir invazyon plazmidi tarafından yönetilmektedir. Bu plazmid Tip III Sekresyon Sistemini (Type III Secrection System=TTSS) ve kendi TTSS efektör proteinlerini kodlar. TTSS aynı zamanda Salmonella ve Yersinia da ki sisteme benzerdir. Buna ilaveten Shigella spp. ile EIEC suşları arasında fenotipik ve genotipik benzerlikler bulunmaktadır (Eklund, 2005) Enteropatojenik E.coli (EPEC) İlk olarak 1945 yılında John Bray tarafından Bacillus coli nepolitanum ismiyle yaz ishaline neden olan etken olarak rapor edilmiştir. Günümüzde EPEC, gelişmekte olan ülkelerdeki çocuklarda görülen ishalin yaygın etkenidir. Bu ishalde ölüm oranı %30 civarındadır. Sporadik EPEC enfeksiyonları ise endüstriyel ülkelerde görülmektedir. Bununla birlikte endüstriyelleşmiş ülkelerde EPEC nin neden olduğu 8

26 9 salgınlar çok seyrektir. Bu patojenin tanılanması O26, O55, O86, O111, O114, O119, O125, O126, O127, O128, O142 i içeren serotipik O gruplarına dayanmaktadır. Günümüzde EPEC nin belirlenmesi konukçu hücrelerdeki tutunma silinme lezyonlarını kodlayan eae geninin kromozomda bulunması ve Stx üretiminin olmaması ile gerçekleşir. Buna ilave olarak demet oluşturan pilusların (bundleforming pili= BFP) aracılık ettiği plazmidal EPEC yapışma faktörünü ifade eden suşlar tipik EPEC suşları olarak tanımlanırken, EAF-plazmidinden yoksun olan suşlar ise atipik EPEC suşlar olarak tanımlanmaktadır. Endüstriyel ülkelerde atipik EPEC in yaygınlığı gelişmekte olan ülkelerle kıyaslandığında daha yüksektir (Eklund, 2005) Enteroagregatif E.coli (EAggEC, EAEC) Gelişen dünyamızda özellikle çocuklarda görülen akut ve uzun süreli ishalin en önemli etkenidir. Ayrıca turist ishalinin en yaygın nedenidir den beri gelişmekte olan ülkelerde ortaya çıkan salgınlarda etkinliği artmıştır. EAEC suşları yaklaşık 90 tane tanımlanmış serotipi içeren oldukça heterojen bir gruptur. Bu serotipler içinde en yaygın olanlar O15:H18, O44:H18, O77:H18, O111:H12, O125 ve O126 dır. EAEC bağırsak epitel hücrelerine karakteristik olarak ot yığınlarına benzeyen kümeler halinde yapışmalarıyla tanınmaktadır. Patogenez sırasında, EAEC, bağırsak mukozasına plazmid tarafından kodlanan agregatif (kümeler halinde) yapışma fimbriası (AAF/I-AAF/III) ile yapışır. Bu yapışma mukus biyofilmi oluşumunu, inflamasyona bağlı olarak mukozal toksisiteyi ve sitokin salınımını arttırmaktadır. EAEC nin diğer virulans faktörleri; plazmidal enterotoksin (PET) ve enteroagregatif ısıya dirençli toksin 1 (EAST- 1). Bazı EHEC suşlarının da EAST- 1 oluşturduğu saptanmıştır (Eklund, 2005) Enterotoksijenik E.coli (ETEC) ETEC suşlarının insanlardaki ishalli hastalılarla olan ilişkisi 1960 larda ortaya çıkarılmıştır. O zamandan beri ETEC enfeksiyonlarının gelişmekte olan ülkelerde 9

27 10 ortaya çıkma oranı artmıştır. ETEC turist ishalinin en yaygın etkenidir ve endüstrileşmiş ülkelerde ara sıra görülen salgınların nedenidir. Patogenez sırasında, ETEC, fimbrial kolonizasyon faktölerini (CFs) ve ilgili kolonizasyon faktör antijenlerini kullanarak bağırsak epitel hücrelerine kolonize olmaktadır. Buna ilave olarak ETEC suşları, plazmid tarafından kodlanan ısıya dirençli (Heat Stabile Toxin=ST) ve/veya ısıya duyarlı (Heat Labile Toxin= LT) toksinler üretirler. ST ve LT toksinleri STa, STb ve LT-I, LT-II olmak üzere alt gruplara ayrılmaktadır. Bunlardan LT-I, kolera toksini ile %75 amino asit benzerliğine sahiptir. Bundan başka ETEC nin bazı suşları EAEC grubunun karakteristik toksini olan EAST-1 i üretmektedir. (Eklund, 2005) Diffüz Adherent E.coli (DAEC) Hücre çözen E.coli olarak bilinmektedir. 12 aylık çocuklarda ishale neden olmaktadır ve gelişmiş ülkelerdeki önemli patojenlerden biridir. Kesin patogenezi hakkında çok az şey bilinmektedir. Fakat DAEC suşları; epitel hücreleri üzerindeki yaygın yapışma şekilleri, α-hemolizin üretimi ve sitotoksik nekroz faktör 1 ile karakterize edilmektedir. Buna ilave olarak bütün kromozom ve plazmitlerin aracılık ettiği fimbrial adhezin F1845 ve plazmitten kodlanan adhezin (AIDA- 1) yaygın yapışma fenotipi ile ilgilidir (Eklund, 2005) Enterohemorajik E.coli (EHEC) İlk olarak 1977 yılında Vero (Afrika yeşil maymunu) hücrelerine sitoksik etki gösterdiği ve bu hücrelerin ölümüne neden olduğu için verotoksin (VT) adı verilen bir toksin ürettiği saptanmıştır. O nedenle bu patojenlere verositotoksijenik E.coli (VTEC) adı verilmiştir. Verotoksinin saflaştırılması ve karakterizasyonu çalışmalarında O Brien ve arkadaşları verotoksinin yapı ve biyolojik aktivite bakımından Shigella dysenteriae tip 1 tarafından üretilen Stx toksini ile büyük benzerlik gösterdiğini saptamışlardır. Bu yeni toksin aynı zamanda anti-stx ile 10

28 11 nötralize olabilmiş ve bu nedenle Shiga benzeri toksin (Shiga-like toxin=slt) olarak adlandırılmıştır. SLT toksinlerinin 2 ana grubu olduğu saptanmıştır. Bunlar SLT-I ve SLT-II veya bilinen adıyla VT1 ve VT2 dir. Günümüzde bu toksinler Stx1 ve Stx 2 olarak ayrılmış ve çeşitli varyantları içerdiği saptanmıştır (Eklund, 2005). İlk çalışmalarda ishalli hastalardan izole edilen E.coli suşları Stx üretmiştir. Fakat ishalli hastalıklarda EHEC nin etiolojik veya Stx in varlığının olası patolojik önemi hakkında önemli bir kanıt yoktur de A.B.D de 2 Hemorajik Kolitis salgınına shigatoksijenik E.coli O157:H7 serotipinin neden olduğu saptandıktan sonra EHEC nin insanlardaki enfeksiyon hastalılarla olan bağıda açıkça ortaya konmuştur. Aşağı yukarı aynı zamanlarda Hemolitik Üremik Sendrom (HUS) adı verilen ve hastalarda şiddetli klinik sonlara neden olan bir hastalığın dışkıda bulunan fekal sitoksin ve sitotoksin üreten E.coli ile bağlantılı olduğu saptanmıştır. Bundan başka, Kanada da Johnson ve arkadaşları Hemorajik Kolitisli hastalardan izole ettikleri E.coli O157:H7 suşlarının vero hücreleri üzerinde aktif olan bir sitotoksin ürettiklerini rapor etmişlerdir. O zamandan beri EHEC, sadece neden olduğu şiddetli hastalıklarla değil aynı zamanda düşük enfeksiyon dozu ve insidansının dünya çapında artmasıyla da önem kazanmıştır. Ve shigatoksijenik E.coli nin yaklaşık 450 tane O:H serotipi bulunmuştur (Eklund, 2005). EHEC bakterileri bazı kromozomal ve plazmidal virulans faktörlerine sahiptir. Bununla birlikte, temel virulans faktörleri oldukları düşünülen Stx1 ve/veya Stx2 veya bunların varyantlarının üretimi kromozomda lokalize olmuş stx genlerinin bir faj aracılığıyla kodlanmasıyla gerçekleşmektedir. Yapışma mekanizması veya enterohemolizin (Ehly) gibi diğer toksinlerinin üretimi ise çoğaltıcı virulans faktörler olarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, EHEC nin ve Stx ailesinin nomenklatürü kompleks bir sonuçtur. Enterohemorajik E.coli (EHEC) terimi shiga- benzeri toksinüreten E.coli (Shiga-like toxin-producing= SLTEC) veya Shiga toksini- üreten E.coli i (sinonimi verotoksijenik E.coli ) göstermek için kullanılmaktadır. Örneğin, EHEC, STEC olarak düşünülmektedir. Çünkü STEC intimini kodlayan eae genini taşır ve 11

29 12 insana patojendir. Dünya Sağlık Örgütüne (WHO 1998) göre EHEC, Stx-üreten E.coli bakterileridir (Eklund, 2005). 12

30 Çizelge 2.1: Diyarejenik E.coli gruplarının neden olduğu salgınlardaki karakteristik özellikler ve kaynaklar veya aracılar (Eklund, 2005) Grup Diyare ile Salgınları etkileyen aracılar, kaynakları ve faktörler Temel virulans faktörleri: kromozomal/plazmidal Virulans faktörün biyolojik etkisi ilişkilendirildiği yıl EPEC 1945 İşlem görmemiş su gıda, sütten yapılmış gıdalar, toz ve aerosoller Tutunma ve bağlanma yeteneği(a/e) EPEC Yapışma Plazmiti (EAF) Demet oluşturan pilus (BFP) LifA/Efa Yapışma, mikrovillusların yıkımı, iyon salınımı Yapışma Yapışma Yapışma 13 ETEC 1961 İşlem görmemiş su, gıda, sütten yapılmış gıdalar Isıya- duyarlı/ dirençli enterotoksin (LT, ST) Isıya- dirençli enterotoksin (EAST) Fimbrial kolonizasyon faktörleri (CFs) EIEC 1971 Su, gıda, İnsandan insana Vir/Ics gen bölgesi Restoran yemekleri IpaA, IpaB, IpaC, IpaD, IpaH Shigella enterotoksin 1 (ShET1) EAggEC 1987 Su, gıda, İnsandan insana Isıya- dirençli enterotoksin (EAST) Restoran yemekleri Kümler halinde Yapışma Fimriası (AAF) Plazmidal enterotoksin EHEC 1982 Kasaplarda satılan etler, hamburgerler, sığır eti, fermente Shiga toksini (Stx) edilmiş sosisler, beyaz turp filizi, pastorize edilmemiş Tutunma ve Silme yeteneği (A/E) gıdalar, klorlanmamış su, salatalar Enterohemolisin (Ehly) E.coli salgı proteini (EspP) Katalaz Peroksidaz (KatP) ToxB Efa-1/LifA DAEC 1993 Çevre, nemli mevsim Fimbrial adezin F1845 Yaygın yapışmadaki adezin (AIDA-I) İyon salınımı İyon salınım Kolonizasyon Membran kırılmaları, hücre içi hareket İnvazyon, olası inflamasyon İyon salınımı İyon salınımı Yapışma Serin proteaz, iyon salınımı, sitotoksisite Protein sentezini inhibe den rrna, apoptosis Yapışma, mikrovillusların yıkımı, iyon salınımı Eritrositlerin lizizi Serin proteaz, koagulasyon faktör V in yıkımı İmmün yanıt peroksidazlarının indirgenmesi Yapışma Yapışma Yapışma Yapışma 13

31 14 Şekil 2. 1: Patojenik E.coli gruplarının patogenezi (Nataro ve Kaper, 1998). 14

32 E.coli O157:H7 E.coli nin özel bir serotipi olan O157:H7 serotipi son yılların en önemli gıda kaynaklı patojeni olarak kabul edilmektedir. E.coli O157:H7 serotipi ilk kez ABD de 1982 yılında 2 salgında 47 vaka ile görülmüş, bunun hemen arkasından çeşitli ülkelerde de benzeri salgınlar izlenmiştir. Daha öncekiler benzemeyen hastalığın aniden ortaya çıkması ve çeşitli analizler ile bu bakterinin diğer E.coli serotiplerinden ayrılığının gösterilmesi O157:H7 serotipinin muhtemelen laboratuar kaçkını bir bakteri olduğunu düşündürmektedir (Noveir ve ark., 2002). E.coli O157:H7 serotipinin bugün gıdalar ile insanlara bulaşan patojenler arasında en önemlilerinden biri olması, sadece diğerlerine göre her bakımdan daha fazla patojeniteye sahip olmasından değil aynı zamanda ısıl işleme oldukça dirençsiz olmasına rağmen başta yetersiz pişirilmiş hamburgerler olmak üzere et ürünleri ile salgınlara veya bireysel hastalanmalara neden olabilmesinden kaynaklanmaktadır. Bu önemi nedeniyle ABD de kırmızı etlerinde ışınlanmasına izin verilmiştir (Halkman ve ark., 2001). Bugün için süt ineklerinin bağırsakları E.coli O157:H7 serotipinin muhtemel kaynağı kabul edilmektedir. İnek dışkısı ile süte, ete, toprağa, suya ve dolayısıyla her yere bulaşan bu serotip sonuçta, yıllarında görülen salgında olduğu gibi, bitkisel ürünlerle de insanlar taşınabilmektedir (Noveir ve ark., 2002). Japonya da yaz aylarında ortaya çıkan ve kadar kişinin zehirlenmesine neden olan, şu ana kadar her yaştan 11 kişinin ölümüne yol açan ve giderek yayılan salgının etkeninin E.coli O157:H7 serotipi olduğu saptanmıştır. Japonya da alınan önlemler arasında ellerin sabunla yıkanması, suyun kaynatılarak içilmesi, sebzelerin iyi yıkanması ve çiğ et yenilmemesi vardır (Halkman ve ark., 1996) Non-O157 E.coli serotipleri EHEC serotipleri tarafından ortaya çıkan enfeksiyonlardan çoğunlukla E.coli O157:H7 serotiplerinin izole edilmesi, bu serotiplerin virulansının daha yüksek olduğu 15

33 16 fikrini akla getirmekle birlikte diğer serotiplerin sorbitolü fermente etmeleri nedeniyle izolasyon ve identifikasyonlarında kullanılabilecek biyokimyasal bir metodun yokluğu, bu serotiplerin tespiti amacıyla doğrudan ürettikleri Stx i veya Stx genini tespit etmeye yönelik yöntemlerin kullanılması zorunluluğunu doğurmuştur (Tabak, 2000). Yaklaşık 200 civarı serotipe ait E.coli suşları Stx eksprese edebilmektedir. Fakat bu serotiplerin çoğunda Stx- pozitif ve Stx-negatif suşlar da bulunabilmektedir. Bu serotiplerin 50 den fazlası insanlarda görülen kanlı ishal veya HUS ile bağlantılıdır. İnsanlardaki hastalıklarla ilişkili olan en yaygın non-o157:h7 serotipleri O26:H11, O103:H2, O111:NM ve O113:H21 serotipleridir. Bu organizmalara bağlı olarak ortaya çıkan son salgınlar Japonya, Almanya, İtalya, Avustralya, Çek Cumhuriyeti ve Amerika Birleşik Devletlerinde rapor edilmiştir. Bu salgınların ortaya çıkabilmesi için 5 ile 234 arası organizma yeterli olabilmektedir. Bu salgınların çoğunda enfeksiyonun kaynağı saptanamamıştır. Kuzey Amerika da görülen HUS olaylarının %20-25 nin non-o157:h7 EHEC nedeniyle oluştuğu düşünülmektedir. Şili, Arjantin ve Avustralya gibi bazı ülkelerde non-o157:h7 EHEC serotipleri HUS olaylarının büyük bir kısmının nedenidir. Non-O157:H7 EHEC suşları sık sık kansız ishalli hastalardan izole edilmektedir. Belçika da yapılan bir çalışmada fecesten izole edilen Stx-üreten E.coli suşlarının %62 sinin non-o157:h7 buna karşılık sadece %32 sinin O157:H7 olduğu saptanmıştır. Seattle da non-o157:h7 Stx-üreten E.coli suşları rutin dışkı örneklerinin %1.1 de bulunmaktadır. Bu izolasyon oranı Shigella ve Yersinia spp. den yüksek (%0,2) buna karşın Campylobacter (%2,5) ve Salmonella (%3,4) spp. veya E.coli O157:H7 (%2,9) den düşüktür. Boston ve Virjinya da hastalardan izole edilen Stx-üreten bütün E.coli izolatlarının yaklaşık yarısı non-o157:h7 serotipleridir (Nataro ve Kaper, 1998) İnsanlarda hastalık tablosu yaratabilme yeteneğine sahip non-o157 E.coli serotipleri arasında en sık rastlanan serotipler ve ürettikleri toksin tipleri çizelge 2. 2 de gösterilmiştir (Tabak, 2000). 16

34 17 Çizelge 2. 2: Shigatoksin üreten E.coli serotipleri (Tabak, 2000) Serotip Stx Tipi Serotip Stx Tipi E.coli O103:H2 1 E.coli OX3:H21 2 E.coli O113:H21 1,2 E.coli O83:H1 1,2 E.coli O165:H25 1,2 E.coli O171:NM 2 E.coli O111:NM 1,2 E.coli O5:NM 1 E.coli O4:NM 1,2 E.coli O26:H11 1 E.coli O45:H2 1 E.coli O125:NM 1 E.coli O126:H27 1 E.coli O145:NM 2 E.coli O121:H19 1,2 E.coli O50:H7 1 E.coli O91:H21 2 E.coli O111:H8 1,2 E.coli O146:H21 1 E.coli O137:H41 1,2 Bugün patojen ve patojen olamayan EHEC serotiplerinin ayrımında kullanılan en az iki ilave virulans faktörü daha mevcuttur; 1. eae geni tarafından kodlanan A/E fenotipi 2.EHEC hemolisini ve çeşitli yapışma faktörlerini eksprese edebilen po157 plazmidi Bu ilave özellikler sırasıyla eae ve pcvd419 probları kullanılarak saptanabilirler. Bu çalışmaların ortak sonucu; hayvan ve et ürünlerinden izole edilen non-o157 E.coli serotiplerinin çok azında eae veya po157 genleri mevcutken insanlarda hastalık etkeni olan non-o157 serotiplerininse hemen hepsinin po157 genleri taşıdığı şeklindedir. Ancak bu faktörleri taşımayan bazı non-o157 serotiplerinin de hastalık yapma yeteneğine sahip olmasından dolayı başka bilinmeyen virulans faktörlerinin mevcut olabileceği akılda tutulmalıdır (Tabak, 2000). E.coli O157:H7 patojenitesini araştıran bir çok çalışma, kromozoma entegre bakteriyofajla kodlanan Stx in üzerinde yoğunlaşmasına rağmen, kromozom ve 60 17

35 18 MDa plazmidi tarafından kodlanan enterohemolisin gibi ek virulans faktörleri mevcuttur (Tabak, 2000) E.coli O157:H7 enfeksiyonunun kaynakları ve salgınlar Bu patojenin başlıca kaynağının daha çok genç sığırlar olmak üzere koyun, keçi, geyik, kuzu, tavuk, domuz, kedi, köpek ve martılar olduğu bilinmektedir. Genelde dışkıdaki yaygınlığın % 0-10 oranında değişmekle beraber, genç hayvanlarda daha fazla olduğu, sığır dışkısında 5 o C de 70 güne kadar canlılığını koruyabildiği ve verotoksin üretme kapasitesini kaybetmediği ortaya konulmuştur. Epidemiyolojik olarak insanlara geçiş, direkt olarak meslekle ilgili hayvanla temas şeklinde, indirekt olarak dışkı ve atıklarla kontamine olmuş gıdaların, içme ve halka açık yüzme havuzu olarak suların alınması durumunda, çiğ ya da yetersiz pişirilmiş gıdaların hazırlanması sırasında temas edilen araçlar veya eller vasıtasıyla oluşabilen kros kontaminasyonlar ile ve en önemlisi kişiden kişiye temas (oral-fekal yolla) aracılığıyla olmaktadır. Ayrıca asemptomik taşıyıcı olan enfekte insanlar da patojenin geçişinde rol oynamaktadırlar (Temelli, 2002). E.coli O157:H7 enfeksiyonlarının önemli bir kaynağı, hayvansal orijinli gıdalardır. Bu patojenin geçişindeki başlıca gıdalar; sığır eti ve ürünleri ile işlenmemiş çiğ süt ve ürünleridir. Birçok salgında, yetersiz pişirilmiş hamburgerlerin şüpheli gıda olduğu bildirilmektedir. Bunun yanında soğuk sandviçler, hot dogs, rosto, kurutulmuş kürlenmiş salam, kurutulmuş fermente sucuk, çiğ sütten yapılan peynirler, yoğurt, alfalfa ve beyaz turp filizi, pastörize olmayan meyve suları ( elma, portakal), çiğ taze meyve ve sebzeler (marul), mayonez, elma şırası, pişmiş mısır, kanatlı hayvan, domuz, geyik, kuzu etleri de çeşitli salgınlarda kaynak olarak gösterilmektedir (Temelli, 2002). Kesimhanelerde derinin yüzülmesi ve iç organların çıkarılması sırasında sığır eti kontamine olabilmektedir. Etin parçalanması, kıyılması sırasında yüzeyden iç kısımlara geçen bakteri, yeterli ısıl işleminin yapılmadığı durumlarda canlılığını 18

36 19 sürdürmekte ve halk sağlığı açısından önemli bir risk oluşturmaktadır. Güney Yorkshire da Sheffield bölgesindeki yerel mezbahalardan alınan sığır etlerinin tüketimi ile 1992 Mayıs- Haziran aylarında gözlenen salgınların incelenmesi sonuncunda, 2103 sığır rektal svab örneğinin 84 ü (%4) E.coli O157:H7 bakımından pozitif, pozitif örneklerin 78 inin (%93) ise verotoksin ürettikleri tespit edilmiştir yılında New York da çocuk kampında, dondurulmuş kıymadan kaynaklanan E.coli O157:H7 enfeksiyonun gözlendiği bildirilmektedir. Bundan başka, 1994 de fermente salam tüketimine bağlı bir salgın da rapor edilmektedir (Temelli, 2002). Meyve ve sebzelerin kontaminasyonu, sığır ve diğer ruminantların ekili alanlara girmeleri, çiftçilerin gübrelerden uygunsuz bir şekilde yararlanmaları ve arazi sulamada atık suların kullanılması sonucunda şekillenmekte, bunlara uygulanan kesme ve dilimleme işlemleri sonucu salınan sular, bakterinin gelişmesine olanak sağlamaktadır. Dünyadaki E.coli O157:H7 ye ait en büyük salgın, 1996 da Japonya da beyaz turp filizlerinden kaynaklanan 9451 adet enfeksiyon vakasının gözlenmesiyle ortaya çıkmıştır de Michigan ve Virginia da birbirini takip eden salgınlarda, sorumlu gıdanın aynı tohumlardan gelişen alfalfa filizleri olduğu, kontaminasyonun hasat sırasında veya sonrasında elle müdahale edilmesi ve işlenmesi sonucunda ortaya çıktığı, bakteri sayısının artışında filizlenme dönemindeki nem ve ısı şartlarının önemli bir etken olduğu belirtilmektedir in sonlarında Güneydoğu Massachusetts de, pastörize edilmemiş taze sıkılmış elma suyunun tüketilmesi sonucu 18 kişinin etkilendiği, 4 çocukta HUS un geliştiği salgında, elmaların yerden fekal kontaminasyona maruz kaldığı ve yıkanmadığı tespit edilmiştir de Kanada da yine bu tip bir salgın gözlenmiştir (Temelli, 2002). Çiğ süt ve ürünlerine bakterinin bulaşması, meme başlarından, sağım makineleri ile alet ve ekipman hijyeni, yetersiz pastörizasyon, pastörizasyon sonrası kontaminasyon ile olabilmekte, son yıllarda bu ürünlerin tüketimine bağlı salgınlar sıklıkla gözlenmektedir da Minesota da çiğ süt tüketen 2 kişide HUS şekillenmesi sonucunda bakterinin ilk kez çiğ süt ile ilişkisi ortaya çıkarılmıştır. 19

37 20 Pastörize sütten kaynaklanan bir diğer salgında, 100 den fazla kişi enfekte olmuş, 9 kişide HUS gelişmiş ve 1 yaşlı kadında TTP gözlenmiştir. Güney Kanada da anaokulu çocuklarında, çiftlikte taze çiğ süt tüketiminden kaynaklanan bir enfeksiyon bildirilmiştir de Batı ve Orta Wisconsin de 4 adet E.coli O157:H7 enfeksiyonunda şüpheli gıdanın, süt imalathanelerinde 60 günden daha az olgunlaşma periyodunda tutulan taze peynirler olduğu rapor edilmiştir (Temelli, 2002). Genellikle su kaynaklı hastalık salgınları, su kaynağının (kaynak, kuyu suyu) ya yetersiz korunmasından yada distilasyon, karbonasyon, ozonasyon, filtrasyon gibi uygulamaların yetersizliğinden şekillenmektedir. Atıkların taşması, seller ve yüzey suları ile karışması sonucu bakteriyal populasyonun toprağa geçmesiyle, yeraltı (kaynak) suları kontamine olmaktadır. Bakteri ve virüsler, yeraltı sularında yüzey sularına göre daha uzun süre canlı kalabilmekte ve büyük bir tehlike oluşturmaktadırlar yılını yaz aylarında Oregon da yapay göldeki fekal kontaminasyon sonucu, 21 çocuğun enfekte olduğu, aynı yıl Missouri de kaynak sularının dezenfekte edilmemesi sonucu 243 kişinin etkilendiği ve 4 kişinin öldüğü salgınlar bulunmaktadır. Ayrıca Güney Afrika da da içme ve sulama sularının kontaminasyonu sonucu 2000 adet E.coli O157:H7 vakası bildirilmiştir (Temelli, 2002) Biyokimyasal ve antijenik özellikleri E.coli O157:H7 serotipi diğer E. coli lerden; 44,5 o C ve üzerinde gelişememesi, sorbitolü fermente edememesi, β-glucuronidase enzimine sahip olmaması, buna karşın eae genine sahip olması, 60 mda plazmid taşıması ve yaygın olarak görülmeyen Dalton moleküler ağırlıkta OMP ekspresyonu ve enterohemolisin üretimi ile ayrılır. E.coli lerin %95 i sorbitolü 24 saat içinde fermente ederken E.coli O157:H7 sorbitolü 48 saat içinde fermente edememektedir. Bununla beraber Birleşmiş Milletler Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ne göre SLTEC O157 suşları arasında sorbitol pozitif olanlara da rastlanılmaktadır. E.coli O157:H - suşları sorbitol pozitiftir. Yine 20

38 21 E.coli lerin %97 si β- glucuronidase enzimi içerirken E.coli O157:H7 serotipi β- glucuronidase negatiftir. Yeni bir tip hemolisin olarak kabul edilen enterohemolisin, verotoksin pozitif E.coli O157:H7 ve E.coli O157:H - serotipleri tarafından üretilirken, bu özellik diğer E.coli lerde yoktur. Enterohemolisin sadece eritrositleri yıkanmış kanlı agar petrilerinde belirlenebilir. Bu şekilde 33 adet verotoksik E.coli O157:H7 ya da E.coli O157:H - izolatının 32 adedinin enterohemolisin ürettiği gösterilmiştir. Bunların dışında E.coli O157:H7 serotipi diğer E.coli lere göre safra tuzlarına daha az dayanıklıdır. Antijenik yapısı diğer E.coli ler ile kesin bir ayrım sağlar (Halkman ve ark., 2001). E.coli nin florojenik MUG belirteci uida geni tarafından kodlanan β- glucuronidase enziminin aktivitesine bağlıdır. EHEC E.coli O157:H7 de bu genin varlığı gösterilmiş olmakla beraber, yapılan sekans analizleri bu serotipte uida geninde birkaç baz mutasyonu olduğunu göstermiştir. Bu nedenle E.coli O157:H7 serotipinde diğer E.coli lerde tipik olan MUG reaksiyonu negatiftir (Halkman ve ark., 2001). E.coli O157:H7 nin O157 antijenik determinantı bakterinin selüler lipopolisakkaritinin polisakkarit kısmında bulunur. Yapısal analizler sonucunda bu determinant D-glukoz, L-fukoz ( 6-deoksi-L-galaktoz), 2-asetamido-2-deoksi-Dgalaktoz,4-asetomido-4,6-dideoksi-D mannoz(1:1:1:1) dan oluşan ve tekrarlanan tetrasakkarid ünitelerinin doğrusal polimeri olarak tanımlanmıştır (Halkman ve ark., 2001). MUG negatif E.coli O157 izolatlarının verotoksin pozitif olduğu söylenebilir. Bir çalışmada 188 E.coli O157 serotipinin MUG ve verotoksin testleri yapılmış, bunlardan 155 E.coli O157:H7, 10 E.coli O157:H -, ve 1 E.coli O157:H (rough) olmak üzere166 adedi MUG negatif ve verotoksin pozitif iken, diğer 22 izolat (2 O157:H7, 1 O157:H, 19 diğer H tipleri; H6, H16, H19, H25, H42, H45) MUG pozitif ve verotoksin negatif olarak bulunmuştur (Halkman ve ark., 2001). 21

39 22 E.coli suşları arasında serolojik bir bağlantı olduğu ilk kez 1921 de Dodgeon ve arkadaşları tarafından belirtilmiş, sonra 1937 de Lowel E.coli nin kapsül ve somatik olmak üzere 2 çeşit antijeni olduğunu ileri sürmüş, 1943 de ise Kaufmann flagella antijenini de göstermiştir. Buna göre E.coli de O1-O171 arasında gösterilen 165 somatik O antijeni, K1- K90 arasında gösterilen 90 kapsül antijeni ve H1-H56 arasında gösterilen 56 flagella H antijeni saptanmıştır. Çeşitli araştırmalar ile 171 O antijeni belirlenmiş ise de bunlarda, 31, 47, 67, 72, 94 ve 122 numaralılar listeden çıkarılmış ve 165 O antijeni kalmıştır. En son çalışmalar göre bugün 174O, 56 H ve 80 K antijeni olduğu saptanmıştır. E.coli nin somatik O antijenleri ile Salmonella, Shigella, Citrobacter ve Providencia cinsi bakteriler arasında önemli ölçüde çapraz reaksiyonlar bulunmaktadır. Termostabil özellik gösteren O antijenlerinden en çok rastlanan 25 kadar antijendir. Hücre zarında, kılıfında ya da kapsülde bulunan kapsül K antijenleri L, B ve A grubundadır. Bunlardan L ve B grubu yüzeysel somatik antijenler, A grubu ise kapsül antijenleridir. K antijenleri de termostabil özellik gösterir. Kapsül antijenleri içinde ayrıca Vi, a, β, F antijenleri de vardır. Monofazik olan H antijenleri ise sadece hareketli türlerde bulunur ve ısıya duyarlıdır. Flagellar H antijenleri birbirleri ve diğer bakterilerin H antijenleri ile çapraz reaksiyon vermezler. E.coli O157 ile Escherichia cinsi içindeki diğer 4 sorbitol negatif türün antijenik ilişkisinin araştırıldığı bir çalışmada 24 E.hermanii, 12 E.fergusonii, 12 E.vulneris ve 1 E.blattae izolatı poliklonal antiserum ile tüpte aglütinasyon ve lateks lam aglütinasyon testine alınmışlardır. Bunlarda sadece 4 E.hermanii izolatı serolojik olarak çapraz reaksiyon vermiştir. Bunlar ilaveten Citr.freundii suşlarınında E.coli O157 antiserumu ile aglütinasyon verdiği bildirilmektedir (Halkman ve ark., 2001) Gelişmesi ve canlı kalması E.coli O157:H7 serotipi de diğer E.coli ler gibi optimum olarak 37 o C da ve ph 7.2 da gelişir. E.coli O157:H7 serotipinin gelişmesi üzerine yapılan çalışmaların çoğu bu serotipin izolasyon çalışmalarına yöneliktir (Halkman ve ark., 2001). 22

40 Asit toleransı Çeşitli araştırmalar gıda kaynaklı Hemorajik Kolit vakalarında anahtar rol oynayan E.coli O157:H7 nin aside dirençli olduğunu ve bu toleransının midenin kuvvetli asit ortamından rahatlıkla geçmesini sağladığını göstermiştir. Bu bakterinin aside direnci insanlarda enfeksiyon dozunun çok düşük olmasını etkileyen bir faktör olarak kabul edilmektedir. Salmonella nın tersine olarak 1-2 ph olan insan midesinde yaklaşık 3 saat süren sindirim sırasında canlı kalabilmesi ve buradan bağırsağa geçmesi bu ilişkiyi açıklamaktadır. Benzer şekilde mayonez, fermente etler, cottage peyniri gibi asitli gıdalarda diğer patojenler inhibe olurken, bunun E.coli O157:H7 nin rahatlıkla gelişebilmesi için bir avantaj olduğu gösterilmiştir. Bu özelliği ile elma suyu ve geleneksel olarak güvenli kabul edilen fermente et ürünlerinde canlılığını koruyabilmektedir. ph sı 3,6-4,0 olan elma şarabında 8 o C da 31 gün canlı kalabilen E.coli O157:H7 nin %40 dan fazla mayonez içeren ph 5,40-6,07 olan et salatasında canlılığını uzun süre koruyabildiği, ph4,2 de birkaç hafta canlı kalabildiği, hatta et salatasının karakteristik ph sın da gelişebildiği, sırasıyla asetik, laktik ve sitrik asitlerin etkili olduğu belirlenmiştir (Halkman ve ark., 2001). Sığırların sindirim-boşaltım sistemlerindeki düşük ph ve organik asitler varlığının daha sonra karkasa bulaşma potansiyeli olan E.coli O157:H7 serotipi ve diğer patojenlerin aside dirençliğini artırabileceği düşünülmektedir. Yapılan çeşitli çalışmalar bu bakterinin aside toleransının artırabileceğini, asit cinsinin aside olan tolerans artırımında etkili olduğu ve suş farklılıklarının aside dirençlikte önemli olduğunu göstermiştir (Halkman ve ark., 2001). E.coli O157:H7 suşlarının ekstrem asit (ph3) koşullarda canlılıklarını sürdürebilmelerinin araştırıldığı bir çalışmada asitle indüklenmiş oksidatif sistem, asitle indüklenmiş arjinine bağlı sistem ve glutamata bağlı sistem olmak üzere önceden karakterize edilen 3 asit dirençlilik sistemi test edilmiştir. Çeşitli asit direnç sistemlerinin patojen E.coli nin mide (ph 1-3) ve barsak (ph4,5-7) ortamlarındaki asit streslerinde canlılığını korumasında etkili olduğu, bir kez indüklendikten sonra 23

41 24 asit direnç sisteminin 4 o C da ki soğuk depoda aktif halde uzun süre stabil kaldığı ve bu bulgunun özellikle gıda endüstrisi için önemli olduğu belirtilmiştir. Benzer şekilde aside direncin gelişme fazı ile doğrudan ilgili olduğu ve en yüksek direncin durma fazında olduğu belirlenmiş, aside bir kez direnç kazanıldıktan sonra bunun soğuk depo ortamlarında da korunduğu, sığırların sindirim ve boşaltım sistemlerinde asidik ortama direnç kazanan bu patojenin karkas bulaşması halinde soğuk depo ortamında canlılığını uzun süre koruyacağı ve etten elde edilecek asitli ürünlerde de ortam sıcaklığı gibi diğer koşulların uygun hale gelmesi ile gelişmesini rahatlıkla sürdürebileceği gösterilmiştir (Halkman ve ark., 2001) NaCl toleransı E.coli O157:H7 serotipi yüksek tuz konsantrasyonlarına da direnç göstermektedir. Glass ve ark. tarafından yapılan araştırmada E.coli O157:H7 nin %6,5 NaCl da gelişebildiği, NaCl ün inhibisyon etkisinin %8,5 derişimde başladığı, 200 ppm nitrit ve %4,0 NaCl içeren, ph sı 5,6 olan sıvı besiyerinde gelişebildiği, %3,5 NaCl ve 69 ppm sodyum nitritli ve ph sı 4,8 olan fermente sucukta indirgendiği ancak 4 0 C da 2 ay süren depolama sırasında kullanılan starter kültüre bağlı olmaksızın tümüyle inhibe olmadığı bulunmuştur. Bir başka çalışmada mtsb broth besiyerine ilave edilen %3,5 ve %6,5 NaCl konsantrasyonlarında saat inkübasyon süresi sonunda E.coli O157:H7 serotipinin 10 8 kob/ml düzeyine eriştiği saptanmıştır. Bir başka araştırmada ise gelişme üzerine düşük sıcaklık ve yüksek tuz konsantrasyonunun etkisi piliç ekstrakt broth ve triptik soya (TS) broth besiyerinde incelenmiş, 37 o C da piliç ekstrakt broth besiyerinde %8; 10 o C da piliç ekstrakt brothda %6 ve TS brothda %4 NaCl konsantrasyonunda E.coli O157:H7 nin inhibe olduğu, bakterinin 4 o C da gelişemediği gösterilmiştir. Buna karşı bir görüş ise E.coli O157:H7 nin aside kayda değer ölçüde yüksek bir direnç göstermediği ve %6,5 NaCl içeren TS broth besiyerinde gelişemediği belirtilmektedir (Halkman ve ark., 2001). 24

42 Sıcaklığın etkisi E.coli O157:H7 serotipinin normal gelişme sıcaklığının birkaç derece fazlasında inkübasyona bırakıldığı bir çalışmada hücrelerin yeni bir grup protein sentezleyerek daha sonra kendileri için öldürücü olabilecek sıcaklıklara karşı daha iyi direnç gösterdikleri bulunmuştur. Aerobik ve anaerobik koşullarda gelişen E.coli O157:H7 ye ısı şok uygulanmasının ısıl işlemde canlı kalabilen bakteri sayısını artırdığı, bakteriye uygulanan ılımlı bir ısı şokunun bakterinin inhibisyonu için seçilen proses sıcaklığında canlı kalabilme yeteneğini yükselttiği görülmüştür. TS broth ve işlenmiş salama ısıl işlem ile strese sokulmuş E.coli O157:H7 nin inokule edildiği bir çalışmada ise TS broth besiyerinde ph ve su aktivitesine bağlı olmaksızın 5 o C da depolanmanın E.coli O157:H7 nin canlılığını iyi bir şekilde koruduğu, işlenmiş salamda su aktivitesi ve ph nın canlılık azalmasında 1-2 log birimi etkili olduğu gösterilmiştir (Halkman ve ark., 2001). Çizelge 2.3: Patojenik E.coli lerin büyüme sınırı parametreleri Minimum Maksimum Sıcaklık ( o C) 7-8 a b ph 4.4 c 9.0 A w 0.95 Sodyum klorid %2.5 NaCl de büyüme hızlı %6.5 NaCl de büyüme yavaş %8.5 NaCl de büyüme yok a. Sütte 6.5 o C de büyüme tespit edilmiştir. b. EHEC in bazı suşlarında büyüme için maksimum sıcaklık 44 0 C den daha düşüktür. c. E.coli O157:H7 nin 4.4 ten daha düşük ph larda da canlı kaldığı saptanmıştır (Bell, 2002). 25

43 Kontrolü Asitlik ve tuza olan direncin tersine olarak E.coli O157:H7 serotipi yüksek sıcaklığa Salmonella dan daha fazla duyarlıdır ancak donma sıcaklıklarına kayda değer ölçüde dirençlidir ve -20 o C da 9 ay süre ile sayıda çok az bir azalma ile canlılığını koruyabilmektedir (Halkman ve ark., 2001). Yapılan bir çalışmada araştırıcılar hamburgerlerin merkezine E.coli O157:H7 inokule etmişler, hamburgerleri üretici firmanın önerisine göre pişirmişler ve sonuçta bu pişirme sonunda E.coli O157:H7 nin hamburgerlerde belirlenemediğini, ancak üretici önerisinin altında pişirme sonucunda E.coli O157:H7 nin canlı kalabileceğini göstermişlerdir. Pişirme için 68,3 o C da 15 saniyenin yeterli olduğu, köftelerin ızgaraya konulmadan önce bir süre oda sıcaklığında bekletilmesi ile ısıl işleme direncin azaldığı gösterilmiştir (Halkman ve ark., 2001). Çiğ süte aşılanan E.coli O157:H7 serotipi ve diğer bakterilerin HTST yöntemi kullanılarak pastörizasyon ile termal inaktivasyonunun araştırıldığı bir çalışmada 16,2 saniye sürede E.coli O157:H7 de 60,0 o C da en çok 2 log birimi 63,0 o C da en çok 4 log birimi canlılık azalması olduğu, 64,5 o C da ise başlangıçta 10 5 kob/ml olan canlılığın tümüyle ortadan kaldırıldığı bulunmuştur (Halkman ve ark., 2001). Bu bakterinin ışınlama uygulamalarına dirençsiz olduğu ve dolayısıyla başta et ürünleri olmak üzere ışınlamanın gıdalar için kayda değer bir hijyen güvencesi sağlayacağı çeşitli araştırmalar ile gösterilmiştir. 60 Co ya da 137 Cs kaynağından elde edilen ışınlar ile gıdaların korunması oldukça yaygın bir uygulama olup, başta E.coli O157:H7 olmak üzere pek çok patojenin özellikle katı gıdalardaki eleminasyonu için kullanılmaktadır. Genel olarak donma sıcaklığı altında olan gıdaların ışınlanması daha az etkili iken, ABD de E.coli O157:H7 enfeksiyonlarını önlemek için kırmızı etlerin ışınlanmasına izin verilmiştir (Halkman ve ark., 2001). E.coli O157:H7 suşlarının aside dirençliliği ışınlamaya dirençliliğini etkilemektedir. ph ya bağlı durma fazı asit dirençliğinin ışınlama dirençliliği ile 26

44 27 kıyaslandığı bir çalışmada suş farklılıklarının önemli olduğu, aside direnç kazanmanın ışınlamaya da direnç kazandırdığı tespit edilmiştir (Halkman ve ark., 2001). Aroma kayıplarına neden olduğu için hammaddeye ısıl işlem uygulanamayan elma şaraplarında UV nin etkisinin incelendiği bir çalışmada 254 nm dalga boyundaki UV lambası ile sağlanan ışınlama ile E.coli O157:H7 de 3,81 log azalma sağlandığı ve UV lambanın bu amaçla kullanılabileceği gösterilmiştir (Halkman ve ark., 2001). Laktik asit bakterilerinin fermantasyon boyunca E.coli O157:H7 üzerindeki antagonistik etkisi pek çok çalışma ile araştırılmaktadır. Laktik asit bakterileri psikrotrof ve patojenleri buzdolabı sıcaklığında dahi inhibe edebilen metabolitleri salgılama özellikleri ile tanınmaktadır. Örneğin Lactobacillus lactis in ürettiği H 2 O 2 in pek çok patojen üzerinde inhibisyon etkisinin olduğu kanıtlanmıştır (Halkman ve ark., 2001). Yapılan bir araştırmada pastörize edilmiş ve çiğ yağlı ve yağsız süte 2 farklı konsantrasyonda aşılanmış bu sütler farklı sıcaklıklarda 28 güne kadar inhibisyona bırakılmıştır. Deneme sonuçlarında E.coli O157:H7 nin 5 o C da gelişmediği hatta 28 gün sonunda 2 log kob azalması olduğu, 8 o C da ilk 4 günde yaklaşık 1-2 log kob artma olduğu 22 o C da ise 4 gün içinde ph ın 4 katına düşmesi sonunda E.coli O157:H7 nin sayısında sayısın da hızla azalma olduğu, pastörize edilmemiş sütte ise refakatçı floranın varlığına ve bunların antagonistik etkisine bağlı olarak pastörize süttekine göre daha yavaş geliştiği belirlenmiştir. Benzer bir çalışma labneh peynirleri ile yapılmış, E.coli O157:H7 populasyonunun fermantasyon sırasında arttığı ve bir gecelik soğuk depoda bekletme sırasında aynı kaldığı, sonra giderek azaldığı ve 2 gün sonra 2-4 logaritma birimi azaldığı ve 4 gün sonra belirlenemeyecek sayıya indiği ve dolayısı ile geleneksel labneh peynirinin bu patojen açısından güvenilir olduğu gösterilmiştir. Bu bulgulara karşı ticari laktik asit starter kültürü ile inokule edilmiş sütte 4 ve 7 o C lar da 5 gün süre sonunda starter kültürün bu patojenin canlılığını etkilemediği gösterilmiştir (Halkman ve ark., 2001). 27

45 28 Bir diğer çalışmada starter katılmış ve katılmamış sucuklara farklı düzeylerde E.coli O157:H7 aşılanmış ve fermantasyon boyunca sayı incelenmiş, bulgular bu serotipin sucuk olgunlaştırma süresi içinde tümüyle ortadan kalktığını göstermiştir. Buna karşın bu bakterinin aside dirençli olduğu için geleneksel olarak güvenli olduğu kabul edilen fermente etlerde canlılığını koruduğuna ilişkin bulgular olduğuna yukarıda da değinilmiştir (Halkman ve ark., 2001). E.coli O157:H7 ilave edilmiş kıymalarda refakatçi floranın etkisini araştırıldığı bir çalışmada yüksek sayıdaki refakatçi floranın hem aerobik hem de anaerobik koşullar altında E.coli O157:H7 nin gelişmesini inhibe ettiğini, refakatçi floranın %80 Lactobacillus sakei olmak üzere laktik asit bakterilerinden oluştuğu, kıymaların doğal refakatçi florasının E.coli O157:H7 gelişmesi üzerinde etkili olduğu gösterilmiştir. Benzer şekilde E.coli O157:H7 nin yoğurt, ekşi krema ve tereyağında aynı düzeyde asitlendirilmiş skim milk ortamına göre daha fazla inhibe olduğu, Pediococcus acidilactici kullanılarak yapılan laboratuar ölçekli sosis fermantasyonunda E.coli O157:H7 gelişmesinin nitrit varlığı ile engellenebildiği bulunmuştur. Enterohemorajik E.coli nin süt ve kıymada gelişmesi üzerine düşük sıcaklık ve refakatçi floranın etkilerinin incelendiği bir çalışmada düşük sayıda refakatçi flora varlığında 8 0 C da gelişme olduğu, ancak bu sıcaklıkta yüksek sayıda refakatçi flora varlığında gelişmenin olmadığı, yüksek sayıdaki refakatçi floranın E.coli nin gelişmesini engellediği, yüksek refakatçi flora varlığı veya 5 o C düşük sıcaklıkta gelişme olmasa dahi canlılığın korunduğu, sonuçta 5 o C da korumanın gıdalarda riski koruduğu, 8 o C ve üzerindeki sıcaklıkların ise riski artıracağı gösterilmiştir (Halkman ve ark., 2001). E.coli O157:H7 inhibisyonu için çeşitli kimyasallar denenmektedir. Bunlar arasında klor özellikle içme ve kullanma suları için başarılı olarak tanımlanırken, çeşitli dezenfektanların organik asitler göre daha etkili olduğu belirtilmektedir. Yağlı ve yağsız sığır etleri için klor heksidin, bağ doku için hidrojen peroksit, elma şaraplarında %0,1 sodyum benzoat çözeltisi etkili dezenfektanlar olarak 28

46 29 değerlendirilmiş ayrıca et endüstrisinde kullanılan gıda katkılarından emülsifer olarak kullanılan monolaurin ve baharat ekstraktı olan eugenol de yine etkili bileşikler olarak belirlenmiştir (Halkman ve ark., 2001). Çeşitli bitkilerin E.coli O157:H7 üzerindeki etkileri araştırılmaktadır. Ticari ürün olan protecta one ve protecta two adlı bitki ekstraktları ete aşılanmış E.coli O157:H7 üzerine %2,5 konsantrasyonda püskürtülmüş ve ilk gün etki görülmemekle beraber 4 o C da 7 günlük depolama sonunda bu bakteride 1,3 log/cm 2 düzeyinde indirgeme sağlanmış ve bitki ekstraktlarının bir miktar indirgeme yapabileceği belirtilmiştir. Buna karşı %1 konsantrasyondaki sarımsak tozu çözeltisinin 6 saat gibi bir süre içinde 10 7 kob/ml düzeyindeki E.coli O157:H7 yi tümüyle öldürdüğü, dolayısı ile sarımsağın gıda korumada etkili olduğu gösterilmiştir. Turpgiller (Crucifera) familyası üyelerinde bulunan ve gerek sıvı ortamlarda gerek buhar formunda kuvvetli bir antimikrobiyal etkisi olduğu bilinen allyl isothicyate ın E.coli O157:H7 üzerindeki etkisinin buhar formunda ve bakteri gelişme fazında iken yüksek düzeyde olduğu bulunmuştur. Benzer bir araştırmada ise % 0,1 asetik asit içeren sirkenin E.coli O157:H7 nin gelişmesini engellediği gösterilmiştir (Halkman ve ark., 2001). E.coli O157:H7 ye özgü bakteriyofajlar ile yapılan çalışmalarda bakteriyofajın sadece E.coli O157:H7 serotiplerine özgü olduğu, bakteriyofajın E.coli O157 olmayan bakterileri lize etmediği ve dolayısı ile bakteriyofaj uygulaması ile bu bakterinin hayvanlarda ve gıdalarda diğer mikrofloraya zarar vermeden kontrol altına alınabileceği gösterilmiştir (Halkman ve ark., 2001). Bdellovibrio spp. nin Gram negatif bakterilerin periplazmasında gelişmektedir. Bu özellikleri nedeni ile kontaminasyonda etkili olan paslanmaz çelik tank yüzeylerinden E.coli O157:H7 nin arındırılabileceği düşünülmüş, Bdellovibrio: E.coli O157:H7 oranı 10:1 olarak yapılan denemede E.coli O157:H7 nin 24 saat süre içinde 3,61 log birimi, indirgendiği gösterilmiştir (Halkman ve ark., 2001). 29

47 Yaptığı hastalıklar E.coli O157:H7 enfeksiyonları gençlerde daha etkilidir. Japonya da yapılan araştırmalarda gençlerin ve çocukların E.coli O157:H7 serotipinin yapmış olduğu hastalıklara duyarlığı açık bir şekilde gösterilmiştir. Dışkılarında bu bakteriye rastlanan 20 yaş altındaki kişilerin %80 den fazlası tipik semptomları gösterirken, yine dışkılarında E.coli O157:H7 serotipi bulunan yaş arasındaki kişilerin %70 i tipik semptomları göstermemiştir (Halkman ve ark., 2001). Diyarejenik E.coli lerin (DEC) neden olduğu gıda kaynaklı hastalıkların klinik, halk sağlığı ve ekonomik önemi vardır. Sadece E.coli O157:H7 serotipinin neden olduğu hastalıkların tedavi giderleri ve iş gücü kaybı bedelinin yılda milyon US$ olduğu tahmin edilmektedir (Halkman ve ark., 2001). Bu serotipin yapmış olduğu başlıca hastalıklar; Hemorajik Kolitis 1982 de Oregon ve Michigan da çeşitli kanlı ishal sendromları olan iki olayda spesifik restoran zincirlerindeki hamburger tüketimi sonucunda gözlenmiştir. Hemorajik Kolitis in sendromları çeşitli abdominal kramplar, kanlı dışkı ve çok az ateştir. Vakaların yarısında dışkıdan E.coli O157:H7 izole edilmiş ve bu vakaların hiç birinde sağlık kontrolünün olmadığı görülmüştür. Sonradan bu serotipin Stx ürettiği gösterilmiştir. Stx çok çeşitli çalışmalar sonucu Hemorajik Kolitisin önemli bir sebebi olarak gösterilmiştir (Kapper, 1998). Hemorajik Kolitis aniden ortaya çıkan kramplı karın ağrıları ile başlar ve saat içinde sulu diyare ile devam eder. Diyare sırasında görülen kan artar ve dışkı zamanla tümüyle kan olur. Hastalığın ortaya çıkması genellikle 3-9 gün (ortalama 4 gün), hastalık süresi 2-9 gündür. Hastalığın ortalama 8 gün sürdüğü şeklinde kaynaklara da rastlanmaktadır. Kramplı karın ağrılarının doğum sonrasına benzer yoğunlukta olduğu ve apandisit ağrısından daha şiddetli olduğu bildirilmektedir. Bu 30

48 31 hastalık Shigelloziste tanımlanan dizanteri ve invaziv E.coli nin neden olduğu gastroenteritisten ateş olması ve kanlı dışkı ile ayrılmaktadır (Halkman ve ark., 2001) E.coli O157:H7 nin neden olduğu kansız diyare E.coli O157:H7 enfeksiyonlarının çoğu sulu diyareyle başlayıp daha sonra kanlı diyare ile seyreder. Sporadik vakaların büyük kısmında E.coli O157:H7 enfeksiyonlu hastaların %95 den fazlası kanlı diyarelidir. Benzer çalışmalarda, epidemiler sırasında enfekte kişilerin %17-30 unda ve sporadik vakaların %4-5 inde kan görülmez. Bu enfeksiyonlarda kanlı diyarenin daha yüksek oranda bulunmasının nedeni; kanlı diyarenin tıbbi olarak daha çok önem arz etmesi ve doktorların bu gibi vakaları daha çok dikkate alıp kültür isteminde bulunmalarından kaynaklanmaktadır. Kansız diyareli kişilerde, kanlı diyareli kişilere oranla daha az sıklıkta HUS ve TTP gibi komplikasyonlar görülür. Kansız diyare, E.coli O157:H7 dışındaki diğer EHEC serotiplerinde daha fazla gözlenir. Bununla birlikte kansız diyare E.coli O157:H7 nin neden olduğu hastalıkların hem sporadik hem epidemik olanlarında görülmektedir (Arslantürk, 1996) E.coli O157 nin asemptomatik enfeksiyonları E.coli O157:H7 genellikle semptomu olmayan kişilerden izole edilmez. Bununla beraber, epidemiler sırasında bazen semptomsuz kişilere rastlanılmaktadır. Bir araştırmada üç anaokulunda iyi pişirilmemiş sütlerin içilmesi sonucu oluşan E.coli O157:H7 epidemisi sırasında semptomsuz çocukların dışkısında E.coli O157:H7 izole edilmiş ve benzer şekilde bakım evlerindeki epidemilerde de semptomsuz kişilerde E.coli O157:H7 serotipi saptanmıştır. Diğer bakım evlerindeki epidemilerde enfekte hamburger yiyen asemptomatik kişilerin dışkısından E.coli O157:H7 izole edilmiştir. Asemptomatik enfeksiyonların sık tekrarlanması çok az bir olasılıktır (Arslantürk, 1996). 31

49 32 SLT- 1 ve SLT- 2 ye karşı oluşan antikorların sağlıklı kontrol grubunda %14-20 oranında mevcut olması, EHEC in tüm dünyada yayılmış olmasının serolojik göstergesidir. Asemptomik enfeksiyonlar EHEC e karşı önceden oluşan bağışıklıktan salgınlar EHEC in geçici olarak intestinal mukozaya kolonize olmasıyla ortaya çıkar (Arslantürk, 1996) Hemolitik Üremik Sendrom İlk olarak 1955 de tanımlanmıştır. HUS çocuklardaki akut renal yetmezliğin önemli nedenlerinden birisidir. İngiltere de çocuklarda yapılan bir çalışmada, HUS un akut renal yetmezliğin en sık ve en önemli nedeni olduğu saptanmıştır. Sıklıkla yaz aylarındaki sporadik vakalar ve küçük epidemiler halinde görülür. Bu sendrom sıklıkla kanlı diyareyle seyreden gastroenteriti takiben akut olarak başlayan mikroanjiopatik hemolitik anemi, trombositopeni ve renal yetmezlik ile karakterize edilir. Bu sendromun etkeni E.coli O157:H7 dir. Epidemilerin çıktığı bölgelerdeki hastalarda bu komplikasyonların gelişme oranı etkilenen populasyona göre değişiklik gösterir. Yayılım hızı toplum arasında çok düşüktür. Genellikle çocuklarda ve yaşlı insanlarda yüksektir (Arslantürk, 1996). Yaşlılarda HUS; ateş ve TTP olmak üzere iki ilave semptom ile görülür. Bu durumda yaşlılarda ölüm oranı ortalama %50 ye çıkmaktadır (Halkman ve ark., 2001). Klinik olarak HUS gösteren hastalarda, ciddi bir hastalık seyri veya bazen sarılık ve sıklıkla yüksek tansiyon oluşmaktadır. Hastaların sıklıkla diyaliz ve kan nakline gereksinim duydukları ve kalp yetmezliği, koma, kalp krizi gibi kardiovasküler ve merkezi sinir sistemi hastalıklarının gelişebildiği bildirilmektedir (Özbaş, Aytaç, 1995). HUS insandan insana bulaşan ve küçük epidemiler oluşturan mevsimsel dağılım gösteren bir sendrom olup, toksinlerle oluşmaktadır. İngiltere de ve Amerika da birkaç çalışmada ve Kanada da yapılan bir çalışmada klasik HUS lu hastaların %90 ında verotoksin üreten E.coli saptanmıştır. Bu sendrom yüksek oranda verotoksin 32

50 33 üreten iki patojenle (E.coli ve S.dysenteriae) ilişkilidir. HUS lu hastaların dışkısından verotoksin saptanabilmektedir. Yine bu hastalarda toksini nötralize eden antikorlar vardır (Arslantürk, 1996) Trombotik Trombositopenik Purpura TTP, mikroanjiopatik hemolitik anemi, trombositopeni, nörolojik hastalık, renal hastalık ve ateş ile karakterize edilir. TTP, birçok yönüyle HUS a benzerdir. Fakat sıklıkla erişkinlerde görülür, çoğu zaman ateşle birliktelik gösterir ve hastalığın öncesinde HUS un bir belirtisi olan diyare gibi bulgular görülmez. Yapılan çalışmalarda hastaların %14 ünde karın ağrısı olduğu saptanmıştır (Arslantürk, 1996) Virulans faktörleri E.coli O157:H7 nin virulans faktörleri, kromozomda ve plazmitte lokalize olanlar olmak üzere 2 ana gruba ayrılmaktadır (Eklund, 2005) Kromozomda lokalize olan virulans faktörleri EHEC in en önemli bakteriyel virulans faktörünün lizogenik, lambdoid bakteriyofajlar tarafından kodlanan Stx1, Stx2 veya bunların varyantlarının üretimi olduğu önerilmiştir. Diğer önemli virulans faktörü ise kromozomda lokalize olan ve intimini (E.coli bağlanma ve tutunma proteini) kodlayan eae geninin kullanımıdır. Bu proteinler EHEC nin bağırsak epitel hücrelerinin yüzeyine bağlanmalarını sağlamaktadır (Eklund, 2005) Shiga toksin (Stx) ve stx çeşitleri EHEC suşlarının en önemli özelliği, Stx toksinlerinin ana grupları olan ve antijenik olarak birbirlerinden ayrılan Stx1 ve Stx2 i üretmeleridir. EHEC bakterilerinin Stx1 i Shigella dysenteriae serotip 1 tarafından üretilen Shiga toksinine çok benzemektedir. Stx1 ler arasında ve özellikle Stx2 de 10 tane varyant 33

51 34 tanımlanmıştır. Ana varyant grupları; Stx1c, Stx1d, Stx2c, Stx2dac, Stx2e, Stx2f veya Stx2g dir. Amino asit sequens seviyeleri karşılaştırıldığında Stx1 ve Stx2 toksinleri birbirlerine yaklaşık %59 benzerdir. Buna karşın Stx2 varyantları ile Stx 2, % gibi bir benzerliği paylaşmaktadır. Stx grup genleri ya lambdoid bakteriyofajları yada kromozom üzerinde lokalize olmuştur. Ek olarak; EHEC, birden daha fazla Stxkodlayan bakteriyofaj taşıyorsa, birden fazla Stx i eksprese edebilmektedir (Eklund, 2005). Stx toksinleri bir A alt birimi ve pentamerik bir B alt birimini içeren holotoksinlerdir. 5 li B alt birimi kalın halka şeklinde bir yapı oluşturur ve A-alt biriminin C-ucu bu halkaya kovalent olmayan bir şekilde bağlanmaktadır. Ökaryotik hücre membranlarındaki Stx aile üyeleri için olan reseptör globotriosilseramittir (Gb3). Sadece domuz edema hastalık toksini olan Stx2e uzun glikolipit olan globotetraosilseramite (Gb4) bağlanır. Hedef hücreye bir kere bağlandıktan sonra, Stx toksin molekülleri bağırsak epitel hücrelerinin endositik mekanizması tarafından veziküller ile birleştirilir, taşıyıcı Golgi ağı ve Golgi cisimciğinden endoplazmik retikulum ve nüklear membrana transfer edilmektedir. Daha sonra, Stx A alt birimi proteaz tarafından parçalanır ve katalitik olarak aktif A 1 ve A 2 fragmentleri oluşur. Toksinin salınan A1 alt birimi, protein sentezinin peptid zinciri uzama basamağını etkiler ve bu olay hücrenin ölümüyle sonuçlanır. Bununla birlikte, bazı hücrelerde toksin vezikülleri lizozomlar tarafından etkisiz hale getirilebilmektedir. Kan akışı ile birlikte Stx toksini spesifik Gb3 reseptörlerince zengin organlara (örneğin böbrekler) taşınmaktadır. Her ne kadar Stx1 ve Stx2 benzer etki tarzına sahiplerse de toksisitelerinin ortaya çıkışı farklı olabilmektedir. Stx1 ile karşılaştırıldığında, Stx2 insan renal mikrovasküler endotelyal hücrelerine 1000 kat daha toksiktir (Eklund, 2005). 34

52 35 Şekil 2. 2: Stx toksininin yapısı a) Stx1 toksinin kristal yapısı, b) Shiga toksin Stx1'in B alt birimlerinin hücre zarı tarafından bakıldığı haliyle görünümü (tr.wikipedia.org) a)b altbirimleri resmin altında, A altbirimi üsttedir. B altbirimleri reseptörlerine bağlandıklarında hücre zarı resmin alt tarafında bulunur. b)resmin sadeliği için A alt birimi gösterilmektedir, normalde resim düzleminin arka tarafında yer alır. Önde görünen şeker molekülleri Gb3 reseptörlerinin bağlandığı yerlerde bulunmaktadır. 35

53 de, kromozomlarında entegre halde lambda bakteriyofajı taşıyan E.coli O26:H11 ve E.coli O157:H7 salgın suşlarında Stx üretimi için gerekli olan genetik bilgi bulunmuştur. Son 10 yılda, 60 Kb boyutundaki (stxa; A alt birimini, stxb, B alt birimini kodlar.) bazı lambda bakteriyofajları tarafından kodalanan Stx toksinleri bulunmuştur. Bu bakteriyofajlar, E.coli dahil bir çok enterik bakterinin konukçu hücrelerinin lizogenizasyonuna neden olabilmektedir. Stx genleri, lambda bakteriyofajının spesifik bir gen bölgesinde (geç faz bölgesi) yer almaktadır. Lambda faj DNA sı bakteriyal konukçu hücrenin kromozomal genomuna entegre olduğunda, stx genleri genetik kontrol altında sessiz kalmaktadır. Fakat faj, replikatif veya litik döngüyü başlattığı zaman oldukça fazla bir şekilde eksprese olurlar ve bunun sonucunda faj üretimi ve bakteriyal liziz gerçekleşmektedir. Litik döngünün başlaması ultraviyole (UV) ışığı veya antibiyotikler gibi DNA ya zarar verici ajanlarla bakterilerin karşı karşıya kalmasından sonra ortaya çıkmaktadır. Litik döngü sonucunda, bakteriyofaj partiküllerinin yeni jenerasyonu ve Stx çevreye salınmaktadır (Eklund, 2005). Stx1 ve stx2 nin çeşitli varyantları tanımlanmıştır. Bu varyantlar A veya B alt birimlerindeki bir veya iki amino asit farklılıklarına göre ayrılmaktadırlar. Bununla birlikte, bu ayrımların bazı farklı tipleri nomenklatürde bu toksinleri ayırt etmek için kullanılmakta ve bu da resmi olmayan bir nomenklatür yaratmaktadır. Bununla birlikte, genomik restrüksiyon profillerine dayanarak bazı stx ayrımları yapılabilmektedir. Örneğin;stx 1 /stx 1vO111 (bundan sonra stx 1 ), stx 2, stx 2c /stx 2vha /stx 2vOX393 (bundan sonra stx 2c ), stx 2vhb, stx 2vO111 /stx 2OX392 ( bundan sonra stx 2vO111 ve stx 2vOX392 ), stx 2e ve stx 2ev genleridir. Ek olarak, Stx ve VT toksinlerinin sinonimlerine dayanarak, Pierard ve arkadaşları tarafından bulunan yeni toksinler VT2-Ount (bundan sonra stx 2d-ount) ve VT2d-OX3a (bundan sonra stx2d-ox3a) olarak ayrılmıştır. HUS hastaları veya önemli semptomlara sahip hastalarla ilişkilendirilen en geçerli toksinler Stx2, Stx2c ve Stx2dac toksinleridir. Buna karşın, Stx toksininin B alt biriminin Stx2d-Ount varyantı insanlarda daha ılımlı semptomlar gösteren bir hastalığa neden olmaktadır. 36

54 37 Stx2e tipik olarak domuzlarda edema hastalığına neden olmaktadır. Stx2f temel olarak güvercin ölümleri ile ilişkilidir ve Stx2g ise bir toksin olarak tanımlanmış ve öküzlerde bulunmuştur (Eklund, 2005). Bununla birlikte, her ne kadar Stx üretiminin EHEC in ana virulans faktörü olduğu düşünülse de, HUS veya diyareli hastalardan izole edilen suşlar arasında shiga toksini üretmeyen O157:H - E.coli suşları bulunmuştur. Nitekim, duyarlı hastalarda önemli semptomlara neden olan ve Stx olmayan virulans özellikleri daha bilinememektedir. Bununla birlikte, stx genlerinin kaybı bazı suşlar arasında çok hızlı bir şekilde ortaya çıkmaktadır. Suşların izolasyonu veya depolanması sırasında STEC suşlarında stx genlerinin kaybı, bu suşların virulansının çalışılmasına yardımcı olacağı düşünülmektedir. Bu suşlar tanıda stx negatif varyantalar olarak görünür fakat klinik ve epidemiyolojik olarak stx pozitif suşlardır (Eklund, 2005) Enterosit silme lokusu ( Locus of Enterocyte Effacement = LEE) Birçok EHEC straini enterosit silme lokusunun (LEE) patojenite adasına (PAI) sahiptir. Bu lokus, tip III sekresyon sistemini (TTSS) kodlar. Bu sistem virulans determinantlarının salgılanması ve taşınımı ile EPEC tarafından üretilenlere benzer olan efektör proteinleri ile bağlantılıdır. LEE; intestinal epitel hücrelerine yapışma ile ilgili proteinlerin oluşumu, konukçu sinyal transdüksiyon yol izlerinin başlaması ve A/E lezyonlarının oluşumunu içermektedir. Her ne kadar E.coli tarafından salgılanan EspA, EspB, EspD, intimin, transfer intimin reseptörü (Tir) gibi proteinlerin benzerliği 67% den 88% e çıkmışsa da, EHEC ve EPEC in LEE lokuslarından kodlan proteinlerin sequensleri %94 oranında tanımlanmıştır. TTSS in bileşikleri (Esc/Sep proteinleri), EspB, Tir ve olası diğer proteinlerin ökaryotik hücreye taşınması için bir yapı meydana getirir. Bundan başka E.coli tip II sekresyon sistemi adı verilen ikinci bir gizemli TTSS bulunmuştur. Bu yeni sistem potansiyel olarak 37

55 38 E.coli O157:H7 ve non-o157 nin LEE lokusu içindeki genlerin ifade edilmesini etkileyebilmektedir (Eklund, 2005). 38

56 39 Şekil 2. 3: TTSS (Type III Secretion System=Tip Üç Salgılama Sistemi) ( 39

57 40 Şekil 2.4: LEE lokusu ve bu lokusta kodlanan proteinler (bmc.ub.uni-potsdam.de) 40

58 41 Patogenez sırasında, E.coli tarafından salgılanan EspA tüp benzeri bir yapı (translocon) oluşturur ve EspB, EspD, ve Tir gibi diğer proteinlerin konukçu membranına geçmesini sağlar. Bu transferden sonra, Tir (Trans İntimin Reseptörü) membrana bağlanır ve ilmik şeklinde bir yapı oluşturur. Bu yapının N ve C uçları konukçu hücrenin sitoplazmasında iken orta kısmına eae geni tarafından kodlanan dış membran proteini olan intimin bağlanır. Bu bağlanma konukçu hücrenin sinyal yol izlerini uyarır, uyarma sonucunda hücrenin sitoiskeletinde değişiklikler meydana gelir. Bunlar, aktinin depolimerizasyonu, mikrovillusların kaybolması, pedestal bir yapı oluşması ve konukçu hücrenin ölümüdür (Eklund, 2005). EHEC suşlarında, LEE tarafından kodlanan proteinlerin ekspresyonu için istenen ve yine LEE tarafından kodlanan bir regülatör (Ler) vardır. EPEC ve EHEC in bir parçası olan Ler, plazmid tarafından kodlanan regülatör (Per) ile ilişkilidir. Ler in aynı zamanda A/E lezyonu için temel olmayan ilave virulans faktörlerinin ekspresyonunu düzenlediği saptanmıştır (Eklund, 2005). LEE ile ilişkili genler ( yapışma proteinini (intimin) kodlayan eae geni ve alt tipleri) tanı ve epidemiyolojik bir önem taşımaktadır. LEE lokusu taşıyan E.coli soyuna bağlı olarak, LEE bölgesinin büyüklüğü ( 36 dan 111 kb a kadar) çeşitlilik göstermektedir ve 17 farklı intimin tipi bulunmuştur. HUS ve Hemorajik Kolitis salgınlarında en çok karşılaşılan O157:H7/H -, O111:H -, O26:H11/H - gibi EHEC serotipleri arasında en tipik intimin alt tipleri eae-α, -β ve γ dır. HUS hastalarından izole edilen O157, O26, O103, O111 ve O145 gibi önemli EHEC serogruplarında eae geninin varlığı LEE nin patojenitesini desteklemektedir. Bununla birlikte, Stx üreten suşların LEE negatif serogruplarının bulunduğu ve bu gruplarında hastalıkla ilişkili olduğu ortaya çıkmıştır. Örneğin; O grubu içerisinde bulunan O103 ve O174 vg.. İlave olarak, her ne kadar LEE in en temel yapışma mekanizmalarından biri olduğu düşünülse de, yeni tanımlanan ve LEE in dışında kodlanan yapışma faktörlerinin ve fimbrianın, EHEC in patojenitesini yönettiğinden şüphe edilmektedir (Eklund, 2005). 41

59 42 Şekil 2. 5: E.coli O157:H7 konukçu-hücre etkileşimi a)ehec O157: H7 konukçu çevresel uyarılara karşılık verir ve dış membranına adezin moleküleri eksprese eder. b) EHEC O157: H7 konukçu hücre yüzeyinde bulunan mikrovilluslara bağlanır. c) LEE4 (EspA, D, B translokon), mrna (mavi ile gösterilen) TTSS in iç membranına tranfer edilir. Meydana gelen Esp proteinleri iğne benzeri bir kompleksin içerisinden dışarıya gönderilir. Bu yolla taşıma ve salgılama birleşir. d) EHEC O157: H7, uzun bir EspA flamenti oluşturur. Bu flament, konukçu hücre içine taşınan intimin reseptörünün (Tir) enfeksiyonuna izin vermektedir. Bu reseptör hücreye membran kısmından girmektedir. Daha sonra EHEC O157: H7 Tir-intimin etkileşimi sayesinde konukçu hücreye sıkıca bağlanmaktadır. e) Konukçu hücrenin sitoiskeleti, EHEC O157: H7 in konukçu hücre membranına bağlanması ve bunun sonucunda A/E lezyonunun oluşması ile yeniden düzenlenmektedir. (Quantrell, et all., 2004.)1A A. B. C. D. E. ) 42

60 43 Şekil 2.6. Tir proteinin yapısı Şekil 2.7. Pedestal yapısı Şekil 2.6 ve 2.7 Tir proteini ve pedestal yapısı ( Plazmitin aracılık ettiği virulans faktörleri EHEC suşları, plazmidin aracılık ettiği birçok protein taşımaktadır. Bunlar; EHEC-hlyA tarafından kodlanan Ehly, etpd tarafından kodlanan Tip II Salgılama Sistemi (ETP), clya tarafından kodlanan hemolitik protein ( sitolizin A) ve stce tarafından kodlanan esteraz inhibitör- spesifik metalloproteaz dır. Bununla birlikte, SF O157:H - suşlarının sadece fimbrianın ekspresyonu için özel olan bir gen bölgesini taşıdığı gösterilmiştir. EHEC suşlarından farklı olarak SF O157 izolatlarında plazmidin aracılık ettiği katalaz peroksidaz (KatP, katp) ve serin proteaz (EspP, espp) yoktur (Eklund, 2005) Enterohemolizin (Ehly) EHEC suşları yaygın olarak 60 Mda luk bir plazmite sahiptir. Bu plazmid enterohemolitik fenotipten sorumlu 4 tane okunan gen bölgesi (open readin frame = 43

61 44 ORFs) taşımaktadır. Ehly proteinini kodlayan bu genler EHEC- hlyc, EHEC-hlyA, EHEC- hlyb olarak isimlendirilmiştir. Bu genler E.coli α-hemolizin genleri ile oldukça ilişkilidir. E.coli α-hemolizin operonundaki genlere olan bu benzerliklerinden dolayı bu şekilde isimlendirilmişlerdir. Ehly proteini por oluşturucu bir rol oynar, ökaryotik hücrelerde sitolizin olan RTX toksin içinde yeniden yapılanır, eritrositleri lizize eder ve EHEC bakterilerinin patojenik bir mekanizması olduğu düşünülür. EHEC-hly genlerinin okunan gen bölgelerinde meydana gelen mutasyonlar, enterohemolitik fenotipin indirgenmesine veya kaybolmasına neden olmaktadır. EHEC suşları arasında EHEC-hlyA nın bulunması ve Ehly üretimi tipiktir. Buna karşın, SF O157:H - suşlarında, suşlar tipik olarak EHEC-hlyA ya sahiptir fakat bu genlerin enterohemolitik aktivitesi açıkça gösterilmemiştir.(eklund, 2005) Tip II salgılama sistemi (ETP) Tip II salgılama yol izi sistemi, gram-negatif bakterilerde patojenite faktörlerinin bakteriyal hücre dışına taşınmasını sağlar. Yapılan DNA analizleri, EHEC suşlarının plazmitlerinde ki ETP sistemine ait 13 tane okunan gen bölgesi bulunduğunu ortaya çıkarmıştır. Buradaki genler sırasıyla etpc den etpo a kadar sıralanmıştır. Bununla birlikte, ETP sisteminin tam fonksiyonu ve spesifitisi tam olarak anlaşılamamıştır (Eklund, 2005) Katalaz peroksidaz (KatP) KatP, bifonksiyonel, bakteriyal bir katalaz peroksidazdır. Bir aminoterminal sinyal peptid içerir. Bu peptidin sitoplazmik membrana transfer edildiği düşünülmektedir. NSF O157 suşlarından farklı olarak KatP, E.coli O157 in vahşi tiplerinin periplazmasında temel olarak bulunmaktadır. SF O157 izolatlarında ise tipik olarak katp genleri yoktur (Eklund, 2005). 44

62 Serin proteaz (EspP) Diğer Esp protenilerinden ( EspA, EspB, EspD) farklı olarak salgılanan serin proteaz EspP ye plazmid aracılık etmektedir. EspP, in vitroda insan koagulasyon faktör V i parçalayabilmekte ve Hemorajik Kolitis in şiddetini arttıran yardımcı virulans faktör olabilmektedir. Örneğin, EHEC enfeksiyonuna yakalanmış 6 çocuktan 5 inin serumu saflaştırılmış EspP proteini ile reaksiyon vermiştir. Bununla birlikte, NSF O157 suşlarından farklı olarak, SF O157 izolatlarında tipik olarak espp genleri yoktur (Eklund, 2005) Diğer kromozomal ve plazmidal virulans faktörleri EHEC in içerdiği virulans faktörlerine diğer bir örnek, endotoksinler gibi yapısal yüzey proteinleridir. İlave olarak, EHEC bakterileri arasında başka birçok virulans faktörleri tanımlanmıştır. Bazı suşlarda, limpostatin üretimi ve efa1 tarafından kodlanan yapışma EHEC faktörü (Efa1) saptanmıştır. Bunun yanı sıra virulans plazmid po113 tarafından kodlanan yeni STEC kendi kendini aglütine eden adezin Saa ın patogeneze katılabildiği bulunmuştur. po113 plazmiti büyük hemolizin plazmiti olarak bilinmekte ve LEE-negatif suş olan O113:H21 den izole edilmektedir. Bu suş, HUS salgınlarından sorumludur. Son yıllarda po113 ün nükleotid dizilimi saptanmıştır. Bunun sonucunda EspP gibi patojenik transfer bölgeleriyle yüksek oranda benzerlik taşıdığını gösterilmiştir. Bu plazmid, yeni bir tip IV pilus biyosentez lokusu taşımaktadır. Bu lokus, elverişli plazmid transferinde gerekmektedir. Diğer virulans faktörü olarak, EAEC grubunun ısıya dayanıklı enterotoksini (EAST), EHEC suşları arasında da saptanmıştır. Bunun dışında, yeni bir virulans toksinin üretimi, subtilaz veya sitolizin A (ClyA), bazı EHEC suşlarının veya Stx-negatif E.coli O157 suşlarının virulansına yardımcı bir faktör olabilmektedir. İlave olarak, SF EHEC O157:H - suşlarında bulunan plazmidal sfp gen bölgesinin (sfpa, sfph, sfpc, sfpd, sfpj ve sfpg) mannoza dayanıklı hemaglütinasyonu ve fimbrianın ekspresyonunu yönettiği belirlenmiştir. İlginç olan bu gen bölgesinin katp ve esp gen 45

63 46 bölgelerinin yakınlarında olmasıdır. Birçok SF O157:H - suşu, CDT-V ile ayrılan yeni tip bir toksin olan CDT toksinini kodlayan kromozomal gen bölgesine sahiptir. Bu toksin E.coli O157:H7 de seyrek olarak bulunmaktadır. Plazmid po157 in aracılık ettiği yeni tanımlanan toksinler arasında, ToxB ye ait geniş bir clostradial toksin ailesi tanımlanmıştır. Bu A-B toksinleri hücreye girişte rol oynar. Buda hücre sitoiskeletinin düzenlenmesi ve diyarenin oluşmasıyla sonuçlanabilmektedir (Eklund, 2005). 46

64 Şekil 2. 8: Uluslar arası referans strain E.coli O157:H7 in virulans faktörlerinin genetik yerleşimi (Eklund, 2005)

65 Belirlenmesi E.coli O157:H7 serotipinin çeşitli gıda, klinik ve çevre örneklerinde aranmasına yönelik olarak kısaca klasik ve gelişmiş olarak 2 ana grupta toplanabilecek çeşitli yöntemler bulunmaktadır. Diğer bakterilerin aranmasında olduğu gibi E.coli O157:H7 serotipi aranmasında da klasik yöntemler ile gelişmiş yöntemler kıyaslandığında klasik yöntemler sarf malzemesi gideri açısından avantajlı ancak iş gücü maliyeti, analizin duyarlığı ve süre açısından dezavantajlıdır. (Halkman ve ark., 2001) Klasik yöntemler E.coli O157:H7 nin belirlenmesi için kullanılan klasik yöntemlerin büyük çoğunluğu selektif zenginleştirme ve katı besiyerine ekim aşamalarını içeren var/yok testleri şeklindedir. Bu testlerde analiz edilen belirli bir miktar örnekte bu bakterinin varlığı ya da yokluğu araştırılır. Buna göre materyalde E.coli O157:H7 nin varlığının gösterilmesi sırasıyla selektif bir sıvı besiyerinde zenginleştirme, selektif ve ayırt edici bir katı besiyerine ekim, şüpheli kolonilerin biyokimyasal ve/veya lateks agglutinasyon testleri ile E.coli O157 olarak belirlenmesi ve en son olarak izolatın H7 antijeni içerip içermediğinin belirlenmesidir. E.coli O157 olduğu saptanan izolatların verotoksin analizlerinin de yapılması gerekmektedir (Halkman ve ark., 2001). Klasik yöntemlerle E.coli O157:H7 izolasyonunda yoğun refakatçi flora varlığına bağlı olarak sıklıkla sahte negatif sonuçlar alınabilmektedir. Benzer şekilde analiz edilen diğer mikroorganizmalarda da olduğu gibi, selektif zenginleştirme ortamı olarak kullanılan besiyerinde E.coli O157:H7 serotipi ile aynı düzeyde gelişebilen E.coli tip 1, Citr. freundii, Enterobacter spp., Hafnia alvei gibi yakın akraba türler selektif katı besiyerinde de rahatlıkla gelişebilmekte ve eğer başlangıçta E.coli O157:H7 sayısı bu flora içinde yeterli bir oranda değil ise bu bakterilerin baskılaması nedeni ile analiz sonucu hatalı olarak negatif alınmaktadır (Halkman ve ark., 2001). Refakatçi floranın E.coli O157:H7 belirlenmesindeki maskeleme şeklindeki olumsuzluğu yanında sıvı besiyerinde doğrudan bu bakterinin gelişmesini engellemek 48

66 49 ve dolayısı ile belirlenmesini tümden olanaksız kılmak gibi olumsuzlukları da vardır. Klasik yöntemlerle analiz edilen örnekte E.coli O157:H7 varlığının belirlenmesi bir anlamda refakatçi floranın baskılanabilmesi ile doğrudan ilişkilidir (Halkman ve ark., 2001). Gıdalarda fekal koliform ve dolayısı ile E.coli nin belirlenmesi için kullanılan inkübasyon sıcaklığı olan 44-45,5 o C sıcaklık sınırı refakatçi floranın gelişimini baskılarken, E.coli nin gelişimini teşvik etmekte, ancak E.coli O157:H7 bu sınırda zayıf olarak gelişmektedir (Halkman ve ark., 2001). E.coli O157:H7 serotipinin klasik yöntemlerle belirlenmesi amacı ile kullanılan selektif besiyerleri içinde modifiye EC (mec) broth, modifiye triptikaz soy (mts) broth, LST broth, EZ coli zenginleştirme besiyeri ve özellikle kümes hayvanları ile yapılan analizlerde önerilen piliç ekstrakt broth bulunmaktadır. Genel olarak 1:9 oranında besiyeri ile homojenize edilen örnek 37 o C da 24 saat inkübasyona bırakılmakta, bu sürenin sonunda selektif bir katı besiyerine ekilmektedir. mtsb brotha 0,05 mg/l Cefixime, 10 mg/l Cefsuladin ve 8 mg/l Vancomycin ilavesi ile ön zenginleştirme besiyeri daha da selektif hale getirilebilmektedir. Zenginleştirme kültürlerinin hidrofobik grid membran filitreden (HGMF) geçirilip, bu filitrelerin selektif katı besiyeri üzerine yerleştirilmesi de yaygın uygulama bulmaktadır (Halkman ve ark., 2001). Selektif katı besiyeri olarak bugün en yaygın kullanılan sorbitol MacConkey (SMAC) agar ve bu besiyerinin çeşitli modifikasyonlarıdır. Bu besiyerinin standart MacConkey agardan farkı bileşiminde laktoz yerine sorbitol bulunmasıdır. E.coli O157:H7 serotipi sorbitol negatif olduğu için bu besiyerinde renksiz koloniler oluşturmakta, buna karşı sorbitolü kullanan bakterilerin oluşturduğu asitlik bir ph indikatörü yardımı ile kolonilerin kırmızı görülmesine neden olmakta, böylece E.coli O157:H7 serotipi sorbitol pozitif bakterilerden ayırt edilmektedir. Her ne kadar E.coli lerin çoğu sorbitolü fermente edebilir iken %6 kadar E.coli sorbitol negatiftir. Bu atipik suşlar da gıdalarda bulunabilmektedir. Bu nedenle her sorbitol negatif E.coli 49

67 50 suşu O157:H7 serotipi olarak değerlendirilmemeli, basit olarak MUG testi ile izolatın E.coli tip 1 olup olmadığı kontrol edilmelidir (Halkman ve ark., 2001). Standart MacConkey agar ve dolayısı ile SMAC agar besiyerleri sırası ile laktoz ve sorbitol reaksiyonlarına dayalı olarak yeterli düzeyde bir ayırt edici özellik sağlamakla beraber, her iki besiyeri de oldukça zayıf bir selektivitiye sahiptir ve dolayısı ile hedef bakteri yanında akraba pek çok bakterinin de gelişmesine izin vermektedirler. Bu nedenle SMAC agar besiyeri çeşitli selektif katkılar ile desteklenmekte ve böylece besiyerine refakatçi floranın daha yüksek düzeyde baskılanmasını sağlayacak selektivite kazandırılmaya çalışılmaktadır. Bu katkılar arasına antiserum, 5-bromo-4-chloro-3-indoxyle-β-D-glucuronic acid cyclohexyl ammonium salt; BCIG, cefixime ve tellurite, ramnoz ve cefixime ve MUG çeşitli araştırmalarda denenmiştir. Bunlar arasında yeni bir sefalosporin olan cefixime sorbitol negatif olan Proteus spp. nin inhibisyonu için önemlidir. Tellurit ile desteklendiğinde E.coli O157:H7 dışında kalan ve başta yükseltilmiş inkübasyon sıcaklığı olmak üzere diğer yöntemler ile baskılanamayan diğer E.coli leri de önemli ölçüde etkilemektedir (Halkman ve ark., 2001). SMAC dışında, phenol red sorbitol (PRS) + MUG agar, L-EMB agar, hemorragic colitis (HC) agar, enterohemorrhagic E.coli (EHEC) agar, BCM O157 agar, CHROMagar O157, modifiye edilmiş EMB (memb) agar, Fluorocult E.coli O157 agar, standart enterik agar ve purple agar base+ %1 sorbitol besiyeri kombinasyonlu besiyerleri de çeşitli denemelerde kullanılmıştır (Halkman ve ark., 2001). Klasik yöntemle E.coli O157:H7 aranmasında son aşama selektif katı besiyerinden izole edilen şüpheli kolonilerin tanımlanmasıdır. Bu tanımlama O157 serotipi biyokimyasal testler ile yapılabileceği gibi doğrudan lateks aglütinasyon testi ile de yapılabilmekte, ancak O157 olduğu belirlenen izolatın H7 olup olmadığı H7 antiserumu ile belirlenebilmektedir (Halkman ve ark., 2001). 50

68 51 E.coli O157:H7 serotipi E.coli tip 1 den β-glucuronidase enzimi içermemesi ve sorbitol negatif olması ile ayrılır. Bir diğer deyiş ile E.coli tip 1 in belirlenmesine yönelik tüm temel identifikasyon testleri E.coli O157:H7 serotipi belirlenmesi için de kullanılabilir. Buna göre E.coli O157:H7 serotipinde MUG, hidrojen sülfür oluşturma, Voges-proskauer, sorbitol testleri negatif, laktoz, glikozdan gaz oluşturma, indol, metil red, hareket ve lisin dekarboksilaz testleri ise pozitiftir. Aynı biyokimyasal test sonuçlarını veren diğer bakteriler Kluyvera ascorbata ve Kluyvera cryocrescens olmakla beraber bu türler rutin gıda kontrollerinde selektif zenginleştirme ve selektif katı besiyerine geçme aşamalarında inhibe olmaktadırlar (Halkman ve ark., 2001). E.coli O157 suşlarının serolojik esaslarla belirlenmesinde en yaygın olarak kullanılan latex agglutinasyon kiti iki adet latex solüsyonu içermektedir. Bunlardan test solüsyonu, E.coli O157 antijenine özel tavşan antikorları ile kaplanmış latex partiküllerinden oluşmakta iken, kontrol solüsyonu ise pre-immun halde tavşan globulinleri içermektedir. Test edilen kültürler SMAC agar üzerinde geliştirildikten sonra, sorbitol negatif olan koloniler, latex testine tabi tutularak test sonucu 1 dakika içinde tespit edilebilmektedir. Fekal örneklerde bulunabileceği gibi daha çok çiğ süt ve dana eti gibi gıdalardan izole edilen E.hermannii sorbitol negatif olup E.coli O157 antiserumu ile agglutine olabilmekte ve böylece E.coli O157 ile karıştırılabilmektedir. Buna göre özellikle gıdalarda bulunan E.hermannii nin izolasyonu için kullanılan SMAC besiyerlerinin yanı sıra sellobiyoz-macconkey agar bazı araştırmacılar tarafından kullanılmaktadır. Böylece E.hermannii sellobiyoz fermentasyonu ile E.coli O157 den ayırt edilmektedir. E.coli O157:H7 serotipi ile E.hermannii arasındaki serolojik benzerlik sahte identifikasyon sonuçlarına neden olmaktadır. E.coli O157 olarak tahmin edilen kültürlerin sarı pigment oluşturma, sellobiyoz fermentasyonu ve KCN de gelişme testlerinin de yapılması önerilmektedir (Halkman ve ark., 2001). Yapılan bir çalışmada araştırıcılar sığır dışkısından izole ettikleri ve E.coli ler içinde sadece O157:H7 serotipine özgüllük gösteren spesifik bir kolifajın E.coli O157 51

69 52 identifikasyonunda başarı ile kullanılabileceğini göstermişlerdir (Halkman ve ark., 2001). E.coli O157 olarak saptanan izolatın H7 olup olmadığının saptanmasında H7 antiserumu çeşitli besiyerlerine katılarak immobilizasyon testi uygulanmaktadır (Halkman ve ark., 2001) Gelişmiş ve hızlı testler Klasik yöntemlerle bir çok enfeksiyon teşhis edilebilmekte ise de bunlar bazen yetersiz kalabilmekte ve özellikle refakatçi floranın maskelemesi nedeniyle çoğu kez sahte negatif sonuçlar alınabilmektedir. Bu nedenle, giderek gelişen analiz teknikleri içinde başta DNA esaslı testler ve immuno enzimatik yöntemler olmak üzere çeşitli analiz yöntemleri üzerinde çalışılmakta, bunlardan bir kısmı ticari olarak üretilip pazarlanmaktadır. Bu yöntemlere son zamanlarda yeni serolojik metotlar, özellikle, immunoassay, radioimmunoassay (RIA), floresan immunoassay (FIA), enzim immunoassay (EIA), immun peroksidaz testleri vs. katılarak bakterilerin belirlenmesinde daha güvenli ve erken sonuçlar alınmaktadır. Ancak, bu testler pahalı olduğu gibi yetişmiş personele ve iyi donatılmış laboratuarlara gereksinim duymaktadır (Halkman ve ark., 2001). İmmunolojik belirleme ve identifikasyon sistemleri analiz süresinde kayda değer bir kısalma sağlamaktadır. Bunlar arasında latex aglütinasyon, ELISA, koloni immunblot analizleri, direkt immunofloresan filtre ve immun yakalama teknikleri E.coli O157:H7 analizlerinde kullanılmaktadır. Bu amaçla O ve H antijenlerine karşı monoklonal ve poliklonal antiserumlar geliştirilmiştir. Bu sistemlerde 1 gecelik inkübasyon sonrasında 1 kob/g dan daha az sayıda olan E.coli O157:H7 varlığı belirlenebilmektedir. İmmunokimyasal analizlerde O157 serotipinin sadece O antijenine yada O157:H7 nin tüm antijenlerine karşı antikorlar kullanılmaktadır (Halkman ve ark., 2001). 52

70 53 Doyle ve Schoeni tarafından geliştirilen yöntem E.coli O157:H7 ile doğal olarak kontamine olmuş çiğ et ve çiğ sütlerde başarılı bir şekilde kullanılabilmektedir. Bu uygulamada saatlik selektif zenginleştirmeden sonra kültürün çeşitli dilüsyonları HGMF den geçirilmekte, bu filtreler nitroselüloz kağıt üzerinde ve bir selektif besiyerinde 37 o C da 24 saat süre inkübe edilmekte, her nitroselüloz kağıt için VT-1 ve VT-2 antiserumları kullanılarak immunblotlar hazırlanmakta, HGMF lerdeki immunpozitif kolonilerin E.coli O157:H7 olup olmadığı biyokimyasal, serolojik ve verositotoksisite testleri ile doğrulanmaktadır. Bu yöntem ile gıdalarda E.coli O157:H7 varlığı başarı ile gösterilmekle beraber, rutin kullanımının uygun olmadığı bildirilmektedir. Buna benzer bir uygulamada HGMF de gelişen E.coli O157 kolonilerinin belirlenmesi için immunolojik yöntemle boyamada H7 dışındaki serotipleri de içeren spesifik MAb kullanılmaktadır. Bu yöntemde HGMF de gelişen koloniler petride yeniden üretilip immunolojik olarak boyanmakta, kullanılan MAb tüm E.coli O157 serotipleri ve N grup Salmonella suşları ile reaksiyona girdiği için immun pozitif koloniler yine biyokimyasal ve serolojik yöntemlerle kontrol edilmektedir. Enterohemorajik E.coli O157:H7 ve O26:H11 için üretilen spesifik bir MAb E.coli O157 antijeni ya da O157 poliklonal antikorları ile çapraz reaksiyona giren diğer bakteriler ile çapraz reaksiyon vermemekte, MAb özel olarak sadece enterohemorajik E.coli O157:H7 ve O26:H11 serotipinde bulunan 2 dış membran proteini ile reaksiyona girmektedir. Bu yüksek spesifikliğinden dolayı MAb gıda ve klinik örneklerde bu E.coli serotiplerinin hızlı belirlenmesi için yararlı bir immunoassay olarak tanımlanmaktadır (Halkman ve ark., 2001). USDA ve FSIS (ABD Tarım Bakanlığı Gıda Güvenliği ve Kontrolü Şubesi) etlerden E.coli O157:H7 izolasyonu için geliştirdiği yöntem 3M petrifilm E.coli petrileri ve poliklonal O157 antikor ile immunolojik boyama esasına dayanmaktadır. Zenginleştirme kültürünün çeşitli dilüsyonları petri film petrilerine ekilmekte, oluşan koloniler doğrudan temas ile nitroselüloz kağıtlara alınmakta, buradaki immun pozitif koloni beneklerine uyan petri film petrilerindeki koloniler ve zenginleştirme 53

71 54 kültüründen bu kez SMAC-BCIG agara ekim yapılmakta, şüpheli koloniler EMB agar ile PRS-MUG agar besiyerlerine sürülmekte, tipik E.coli O157:H7 kolonileri lateks aglütinasyon testine alınmakta, ayrıca biyokimyasal ve serolojik olarak doğrulanmaktadır (Halkman ve ark., 2001). E.coli O157:H7 nin zenginleştirme ve katı besiyeri kullanılmadan antikordirek epifluoressent filtre tekniği (Ab-DEFT) ile doğrudan sayımı mümkündür. Bu analiz yöntemi ile 15 dakika süre ile tripsin ve Triton X-100 ile muamele edilen kıyma 5 mm por çaplı ön filitreden sonra 0,2 mm por çaplı siyah polikarbonat filtreden geçirilmekte ve son filtre doğrudan fluorescein ile işaretlenmiş anti-o157 poliklonal antikor ile boyanıp yıkanmakta ve epifloresan mikroskopta incelenmekte, böylece 1 saatten daha az bir süre içinde analiz tamamlanmaktadır (Halkman ve ark., 2001). SLT- 1 ve SLT- 2 antikorları için ELISA yöntemleri kullanımı HeLa hücre sitotoksisitesi nötralizasyon analizleri ile benzer sonuçlar vermiştir. Gerek ELISA uygulamaları gerek nötralizasyon testleri enfekte olmuş hastaların belirlenmesinde duyarlı değillerdir. Bununla beraber E.coli O157 lipopolisakkarit antikorları için ELISA tekniklerinin her ikisi de duyarlı ve spesifik olarak bulunmuş ve E.coli O157:H7 ile enfekte olmuş kişilerin belirlenmesinde antitoksik antikorlardan muhtemelen daha yararlı olarak yorumlanmıştır. (Halkman ve ark., 2001) İmmunolipozomlar kullanılarak geliştirilen ve bir kolorimetrik immuno analiz yöntemi olan immunoliposome sandwich assay ile E.coli O157:H7 nin yıkama ve inkübasyon aşamalarına gerek duyulmadan 8 dakika gibi kısa bir süre içinde belirlenebileceği ve immunopolizomların sadece E.coli O157:H7 ile bağlanabileceği ve hiçbir çapraz reaksiyon alınmadığı transmisyon elektron mikroskobik analizler ile gösterilmiştir (Halkman ve ark., 2001). Dışkı örneklerinde E.coli O157:H7 nin belirlenebilmesi için geliştirilmiş ve 1 saatten daha az sürede sonuç veren hızlı bir ELISA yönteminde diğer enterik patojenler ile çapraz reaksiyon alınmamıştır. Bu yöntem dışkılarda E.coli O157 nin 54

72 55 aranması için doğru ve kolay uygulanabilir olarak değerlendirilmiştir (Halkman ve ark., 2001). E.coli O157 nin hızlı ve basit olarak belirlendiği bir diğer enzim immunoassay sistemi polymacron dur. Bu sistemin esası test örneğinin sodyum cholate ile 100 o C da 10 dakika ısıtılması ile ekstrakte edilen E.coli O157 antijeninin immuno enzimatik yöntemle belirlenmesidir (Halkman ve ark., 2001). Yine ticari bir kit olan EZ Coli ise standart mikropipette bulunan E.coli O157 için spesifik olan hızlı immunoassay yöntemi olup E.coli O157 ve laktozu fermente eden diğer koliform bakteriler için selektif olan tek aşamalı zenginleştirme besiyeri ve E.coli O157 aranmasında 6 aylık raf ömrüne sahip mikropipet ucu formunda bir mikrofilament ELISA testi olan EZ coli detektör uç olmak üzere iki unsurdan oluşmaktadır. EZ coli kitinin başarılı bir kit olarak tanımlanmasına karşın, bir başka çalışmada EZ coli kiti ile pozitif sonuç alınan örneklerde standart kültürel yöntemlerle E.coli O157 izole edilememiş, dolayısı ile bu kitin kullanımı doğrulama açısından endişe ile karşılanmıştır. EZ Coli ticari kiti dışında benzer şekilde geliştirilmiş olan başka ticari kitler de vardır. Bunlardan BioMerieux un Mini Vidas sistemi ve Organon Teknika nın EHEC-TEK sistemi en çok kullanılanlar arasındadır. Her ne kadar Mini Vidas için 7 basamaklı, EHEC-TEK için 11 basamaklı bir işlem uygulanırken EZ coli için 14 basamak bulunmakta ise de analiz sürelerinin Mini Vidas da 45 dakika, EHEC-TEK de 90 dakika iken EZ coli de sadece 9-10 dakika olması EZ coli için büyük bir üstünlük sağlamaktadır (Halkman ve ark., 2001). İmmunomanyetik ayırım yöntemi ile çalışan sistemler üzerinde son yıllarda yoğun bir ilgi vardır. İmmunomanyetik ayırım yönteminde O157 spesifik antikorların paramanyetik parçacıklara tutturulması şeklinde bir selektif zenginleştirme ile dışkıda 10 7 kob/g koliform bakteri bulunurken 10 2 kob/g düzeyindeki E.coli O157:H7 belirlenebilmiştir. Bu yöntem pek çok araştırıcı olarak güvenilir ve duyarlı olarak bulunmuş ve doğrulama için doğrudan izolasyon sağlaması nedeni ile diğer gelişmiş analiz yöntemlerine göre avantajlı olarak tanımlanmıştır. Electrochemi luminescence 55

73 56 (ECL) ile kombine edilmiş immunomanyetik ayırım (immunomagnetic seperation = IMS) sistemi olan bir ticari sensör ile gıdalarda E.coli O157 1 saatten daha az sürede belirlenebilmektedir (Halkman ve ark., 2001). Nükleik asit esaslı analizler ağırlıklı olarak DNA Stxs geni ya da eae genine spesifik DNA probu kullanan yöntemler ve PCR analizleri olarak 2 gruba ayrılır. Bunlardan Stxs genine özel nükleik asit esaslı testler sadece Stxs üreten patojenlere spesifik olmakla beraber, 60 kadar farklı E.coli serotipi ile hatta Citr. freundii nin de Stx II varyantlarını üretebilmesi nedeni ile bu testler doğrudan O157:H7 belirlenmesinde kullanılamamaktadır. Aynı şekilde eae genine spesifik yöntemlerde de sadece E.coli O157:H7 değil, diğer EPEC serotipleri de pozitif sonuç verebilmektedir. Oysa β-glucuronidase (uida) geni ile ilgili analizlerde böyle bir kısıtlama yoktur. Son olarak sadece E.coli O157:H7 serotipinin uida geninin belirli bir bölgesine duyarlı olan 18 bp lik oligpnükleotid DNA probu PF-27 nin oldukça başarılı bir şekilde kullanılabildiği belirtilmektedir. Multiplex PCR analizleri duyarlı, spesifik ve O157:H7 serotipinin fenotipik varyantlarını belirleyebilecek düzeyde iken, bu sistemin çok kompleks ve gıdalar ile klinik örneklerin rutin analizlerinde kullanılamayacak kadar pahalı olduğu belirtilmektedir (Halkman ve ark., 2001). Enterohemorajik E.coli dışındaki pek çok VTEC suşunun insanları hastalandırmadaki önemi ve bu suşların Hemorajik Kolit ve HUS ile ilişkisinin bilinmemesi nedenleri ise gıdalardaki verotoksijenik E.coli lerin belirlenmesi daha yararlı olabileceği görüşü de vardır. VT-1 ve VT-2 yi kodlayan DNA nın kullanıldığı gen prob analizlerinde sadece enterohemorajik E.coli serotipleri olan O157:H7 ve O26:H11 değil tüm VT-1 ve VT-2 üreten E.coli ler belirlenebilmektedir (Halkman ve ark., 2001) E.coli O157:H7 enfeksiyonunu önleme yolları Enfeksiyonu önlemek için, tarımsal üretimden, gıdaların işlenmesi ve hazırlanmasına kadar olan prosesin, her basamağında kontrol önlemlerinin alınması 56

74 57 gerekmektedir. Hijyenik kesim uygulamaları ile karkasın dışkı ile kontaminasyon riski azaltılmaktadır. Çiftliklerde, gıda işlek yerlerinde ve kreşlerde çalışan personelin, güvenli gıda sağlama teknikleri, çiğ ve pişmiş gıdalardan kaynaklanabilen direkt ve indirekt çapraz kontaminasyonlar ve personel hijyeni konularında eğitilmesi, bakterinin insanlara geçişini minimuma indirgemede önem taşımaktadır. Enfeksiyonun yayılmasını engellemek için, özellikle çocukların tuvalet sonrasında, yemek öncesinde, çiftlik hayvanları ve çiğ gıdalarla temastan sonra ellerini sabunla uygun bir şekilde yıkaması sağlanmalıdır (Temelli, 2002). Gıdalarda bulunan EHEC i elimine etmek için uygulanan en etkili metodun ısıtma (pişirme veya pastörizasyon) olduğu bildirilmektedir. Pastörize edilmemiş süt ürünleri ve meyve suları ile yetersiz pişirilmiş kıyma, et ürünleri ve hamburgerlerin tüketiminden kaçınılmalıdır. Özellikle bu tip gıdalara uygulanan ısı işleminin ürünün her yerinde (merkezi dahil) 70 o C ve üzerinde olması, etin pembe renginin kaybolup gri-kahverengiye dönüşmesi ve et suyunun tamamen uzaklaşması ile yeterli pişirme sağlanabilmektedir (Temelli, 2002). Klorlanmamış suların, içilmemesi veya gıda işlek yerlerindeki ekipmanların yüzey temizliğinde kullanılmaması, klor veya diğer etkili dezenfektanların uygulandığı suların tüketilmesi gerekmektedir. Tahıl, meyve ve sebzelerin sulanmasında kullanılan atık suların belli işlemlerden geçirilmesi önerilmektedir. Şüpheli suların tüketilmeden önce mutlaka kaynatılması sağlanmalı, bunun yanında işlem görmemiş havuz veya göl sularında yüzmenin patojen geçişi için bir risk olduğu öğretilmelidir (Temelli, 2002) Tedavi prensipleri EHEC serotipleri ile ortaya çıkan enfeksiyonların tedavisinde temel stratejiyi oluşturan 3 amaç; 1) Gastrointestinal semptomların ciddiyet ve süresini azaltmak, 2) HUS gibi sistemik komplikasyonların gelişmesini önlemek, 57

75 58 3) Enfeksiyonun yakın çevredekilere bulaşmasına engel olmaktır. Antibiyotik kullanımı her üç amaca da hizmet etmektedir. HUS gelişmiş hastalardaki antibiyotik kullanımının, hastalık semptomlarında belirgin azalma sağladığını bildiren yayınlar mevcuttur. Fakat EHEC infeksiyonlarında antibiyotik kullanımının HUS tablosu gelişmesini önlemekte yetersiz kaldığı görüşü, aksi görüşlere rağmen geçerliliğini korumaktadır. EHEC serotiplerinin bir çok antibiyotiğe duyarlı olmalarına rağmen akut gastroenterit tedavisinde antibiyotik kullanımı tavsiye edilmektedir. Bu öneri ile uyumlu başka çalışmada, 1996 yılındaki Japonya da ki bir salgın sırasında spesifik bir antibiyotik olan FOFAMİSİN kullanımının HUS gelişme riskini azalttığı bildirilmiştir (Tabak, 2000). Bazı retrospektif çalışmalarda ise antibiyotik kullanan hastaların HUS açısından risk altında oldukları bildirilmiştir. Fakat bu çalışmalar prospektif çalışmalar değil, randomize çalışmalar olup, hastaların klinik tablolarının ciddiyeti, onları antibiyotik kullanmak zorunda bırakmıştır. Antibiyotik kullanımının zararı iki şekilde açıklanabilir; birincisi bakteriyal liziz sonucu açığa çıkan toksinin yarattığı tahribat ikincisi de antibiyotik kullanımı ile baskı altına alınmış gastrointestinal flora etkisi ile toksin emiliminde artış olmasıdır (Tabak, 2000). EHEC e bağlı gelişen renal yetmezlik için önerilen dializ, hemofiltrasyon, eritrosit ve platelet transfüzyonu gibi destekleyici yöntemlerdir. Daha ciddi vakalar ise renal transplantasyona ihtiyaç duyabilirler (Tabak, 2000). Ümit veren bir tedavi yöntemi ise Synsorb-Pk dır. Synsorb-Pk, Stx reseptörü olan Gb3 analogu sentetik maddedir ve barsak lümenine Stx i bağlayarak emilmeden atılmasını sağlamaktadır (Tabak, 2000). 58

76 59 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Et ve et ürünleri Çalışmada materyal temini için İzmir ilinin çeşitli market ve kasaplarından farklı zamanlarda 10 adedi kuzu kıyma, 10 adedi dana kıyma, 22 adedi sosis, 26 adedi salam, 18 adedi dana döner ve 14 adedi sucuk olmak üzere toplam 100 adet et ve et ürünü örneği temin edilmiştir Tamponlanmış Peptonlu Su (TPS) (Merck) gr/litre Pepton 10.0 NaCl 5.0 Na 2 HPO KH 2 PO4 1.5 Bir denemede TPS toplam 495 ml olarak hazırlanmıştır. Dehidre besiyeri 9,9g/495 ml konsantrasyonda distile su içinde eritilmiştir. 450 ml si 10-1 lik seyreltmede kullanılmak üzere 500 ml erlene alınmış, geri kalan 45 ml ileri seyreltmeler için 5 tüpe eşit paylaştırılmıştır. İçerisinde TPS bulunan erlen ve tüpler otoklavda 121 o C de 15 dakika steril edilmiştir. Sterilizasyon sonrası 25 o C de ph7.2±0,2 dir Cefixime-Vancomycin ilaveli Tamponlanmış Peptonlu Su gr/litre Pepton 10.0 NaCl 5.0 Na 2 HPO

77 60 KH 2 PO4 1.5 mg/litre Cefixime 0.55 Vancomycin 8.0 ph7.2 ± 0.2 Zenginleştirme işlemi için 10-1 lik seyreltme TPS suyuna 500 ml için 0,05 mg/l Cefixime ve 8 mg/l Vancomycin ilave edilmiştir Plate Count Agar (PCA) (Difco) gr/litre Tripton 5.0 Yeast ekstract 2.5 Glukoz 1.0 Agar 9.0 ph 7.0±0.2 Bir denemede PCA toplam 75 ml olarak hazırlanmıştır. Dehidre besiyeri 1,31g/75 ml konsantrasyonda distile su içinde eritilmiştir ve otoklavda 121 o C de 15 dakika steril edilmiştir. Sterilizasyon sonrası 25 o C de ph7.0±0,2 dir. PCA petrilere 45 0 C iken dökülmüştür Cefixime/K-Tellurit Sorbitol MacConkey Agar (CT-SMAC) gr/litre Pepton 20.0 Sorbitol 10.0 Safra tuzları 1.5 NaCl 5.0 Nötral red 0.03 Kristal viyole

78 61 Agar 15.0 mg/litre Cefixime 0.05 K-tellurit 2.5 ph 7.1±0.2 Bir deneme için toplam 30 ml CT-SMAC Agar kullanılmıştır. Fakat diğer denemelerde düşünülerek 500 er ml lik 3 şişede toplam 1500 ml CT-SMAC Agar hazırlanmıştır. Her bir 500 ml lik ortam için 25,75g/500 ml olacak şekilde dehidre besiyeri yeri distile suda eritilmiş ve otoklavda 121 o C de 15 dakika steril edilmiştir. Sterilizasyon sonrası 25 o C de ph7.1±0,2 dir. Hazırlanmış besiyeri berrak ve kırmızı renklidir. Otoklav sonrasında 45 o C ye soğutulan besiyeri içine (500 ml besiyeri için) 0,5 ml K-Tellurit ve 250 µl Cefixime ilave edilmiştir. CT ilave edilmiş besiyeri petri kaplarına ml/petri olacak şekilde dökülmüş ve bu petri kapları oda sıcaklığında bırakılmıştır O157:H7 ID Agar (O157 H7 ID-F) (Biomerix) gr/litre Jelatin pepton 5.5 Yeast ekstract 6.0 NaCl 5.0 Na 2 CO Nötral red 0.01 Sodyum deoksikolat 1.5 Karbohidrat karışımı 24.0 Aktivatör karışımı 0.25 Kromojenik substratların karışımı 0.25 Agar

79 62 ph 7.1 O157:H7 ID agar 200 ml lik bir şişe içerisinde donmuş bir halde temin edilmiştir. Deneme sırasında içerisinde kaynayan su bulunan sıcak su banyosunda erimesi için 45 dakika tutulmuştur o C ye ayarlanmış ve termostatik olarak kontrol edilen su banyosuna konmadan önce 15 saniye oda sıcaklığında bekletilmiştir. Besiyerinin sıcaklığı 45 o C ye ulaştığında steril petri kaplarına 30 er ml dökülerek besiyeri paylaştırılmıştır. Hemen kullanılmayacak olan ve içerisinde besiyeri bulunan petriler buzdolabında muhafaza edilmiştir Nutrient Agar (NA) (Difco) gr/litre Lab-Lemco powder 1.0 Yeast ekstract 2.0 Pepton 5.0 NaCl 5.0. Agar 15.0 ph 7.4±0.2 Denemede toplam 500 ml NA hazırlanmıştır. 500 ml lik besiyeri şişesinde dehidre besiyeri 14g/500 ml konsantrasyonda distile suda eritilmiştir. Daha sonra besiyeri şişesi içerisindeki ortam kaynayıncaya kadar mikrodalga fırında tutulmuştur. Bunun nedeni ortamın tüplere dağıtımı esnasında sorun yaşanmasını engellemektir. Ortam her birine 5 ml besiyeri olacak şekilde 100 tüpe bölüştürülmüştür. Bu tüpler otoklavda 121 o C de 15 dakika steril edilmiştir. Otoklavlandıktan sonra tüpler, içindeki besiyeri kapağa değmeyecek şekilde yatırılmış ve bu halde soğumaya bırakılmıştır. Ekim için hemen kullanılmayacak tüpler buzdolabında saklanmıştır. 62

80 Dryspot E.coli O157 Latex test (DR 120M) Kit içeriği 1.DR 121 M Dryspot E.coli O157 reaksiyon kartları 2.DR 122M Pozitif kontrol şeritleri (strips) 3.DR 123M Negatif kontrol şeritleri 4.Karıştırma çubuklar 5.Plastik poşet klipsleri 63

81 Metod Örneklerin alınımı İzmir ilinin çeşitli market ve kasaplarından farklı zamanlarda 10 adedi kuzu kıyma, 10 adedi dana kıyma, 22 adedi sosis, 26 adedi salam, 18 adedi dana döner ve 14 adedi sucuk olmak üzere toplam 100 adet 50 şer gramlık et ve et ürünü örneği steril torbalara konularak laboratuara getirilmiştir Homojenizasyon ve seyreltme işlemleri Steril torbada laboratuara getirilen analizi yapılacak 50 gr lık örnek steril Waring markalı blendera konulmuş 2 dakika HI ayarda parçalanarak analize uygun boyuta getirilmiştir. Daha sonra bu örnek içerisinde 450 ml tamponlanmış peptonlu su (TPS) bulunan erlene aktarılıp karıştırılarak homojen hale getirilmiş ve bu sayede 10-1 lik seyreltme hazırlanmıştır. Elde edilen bu 10-1 lik seyreltmeden içerisinde 9 ml TPS bulunan tüpe 1ml alınarak 10-2 lik seyreltme hazırlanmıştır. Bu seyreltme tekniği kullanılarak 10-5 e kadar seyreltme yapılmıştır Toplam aerobik mezofilik bakteri sayımı Toplam aerobik mezofilik bakteri sayımı için, hazırlanan her seyreltmeden ( ) 1 ml alınmış ve steril petri kabına aktarılmıştır. Her petrinin üzerine steril şartlarda 45 o C civarında ml PCA (Plate Count Agar) dökülmüştür. Bu petriler o C de saat inkübasyona bırakılmıştır. Bu sürenin sonunda toplam aerobik mezofilik bakteri sayımları yapılmıştır E.coli O157:H7 zenginleştirme prosedürü Toplam aerobik mezofilik bakteri sayımı için yapılan işlemden sonra zenginleştirme işlemi için 10-1 lik seyreltme TPS suyuna 500 ml için 0,05 mg/l 64

82 65 Cefixime ve 8 mg/l Vancomycin ilave edilmiştir. Zenginleştirme yöntemi gereğince bu seyreltme 37 o C de saat inkübasyona bırakılmıştır E.coli O157:H7 izolasyon prosedürü Zenginleştirme işlemi sonrasında 10-1 lik seyreltmeden 0,1 ml alınarak içinde oda sıcaklığında donmuş halde ml CT-SMAC (Cefixime-Tellurit içeren Sorbitol MacConkey Agar) bulunan steril petri kabına konulmuş ve yayma yöntemiyle ekim yapılmıştır. Ekim sırasında steril halde cam L-baget kullanılmıştır. Petriler 24 saat o C de inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda E.coli O157 kolonileri CT-SMAC üzerinde 1-2 mm çapında saman sarısı renginde/renksiz olarak gözlenmiştir. Her petriden 5 tipik E.coli O157:H7 kolonisi alınarak doğrulama testi yapılmıştır Dryspot E.coli O157 Latex test ile doğrulama testi 1. DR 121M kartlar poşet üst kısımdan açılarak çıkarılmış, gerekli miktarda kart alındıktan sonra nem almaması için poşetin ağzı kitin içinden çıkan klipslerle kapatılmıştır. 65

83 66 2. Reaksiyon kartında bulunan test ve kontrol dairelerine birer damla fizyolojik tuzlu (%0,85 NaCl ağırlık/hacim ) su damlatılmıştır. 3. Steril öze kullanarak şüpheli kolonilerden 2-5 adet alınmış, test halkasındaki ve kontrol halkasındaki fizyolojik tuzlu su içinde parçacık kalmayacak şekilde süspanse edilmiştir. Bu işlemler sırasında her iki dairedeki kültür ayrı bir öze ile karıştırılmıştır. 66

84 67 4. Kitin içinden çıkan karıştırma çubuklar yardımıyla fizyolojik tuzlu su ve kültür süspansiyonu kurutulmuş mavi parçacıklar ile halkanın ucuna kadar yayılmıştır. Kart 60 saniye boyunca dairesel olarak karıştırılmış ve normal ışık altında aglutinasyon incelenmiştir. 67

85 68 60 saniye içinde test halkasında gözlenen aglutinasyon suşun E. coli O157 olduğunu gösterir. 60 saniye geçtikten sonra oluşan aglutinasyon dikkate alınmamamıştır. 68