GASTROENTERİT ETKENİ OLABİLEN PATOJEN ESCHERİCHİA COLİ LERİN ARAŞTIRILMASI

Transkript

1 T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI Tez Yöneticisi Prof. Dr. H. Murat TUĞRUL GASTROENTERİT ETKENİ OLABİLEN PATOJEN ESCHERİCHİA COLİ LERİN ARAŞTIRILMASI (Uzmanlık tezi) Dr. Gülten AYDIN TUTAK EDİRNE 2010

2 TEŞEKKÜR Yetişmemdeki katkılarından dolayı, Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D. Başkanı ve tez yöneticisi olan Prof. Dr. H. Murat TUĞRUL a,eğitimim sırasında bilgilerinden yararlandığım Prof. Dr. Metin OTKUN a, Doç. Dr. Müşerref OTKUN a, Doç. Dr. Şaban GÜRCAN a, Doç. Dr. Nermin ŞAKRU ya, Doç. Dr. Neşe AKIŞ a, çalışmalarım sırasında yardımcı olan Doç. Dr. Figen KULOĞLU na, Yrd. Doç. Dr. Hakan KUNDURACILAR a, Yrd. Doç. Dr. Tammam SİPAHİ ye, Dr. Canan ERYILDIZ ve Melek TİKVEŞLİ başta olmak üzere yardımlarını esirgemeyen bütün çalışma arkadaşlarıma en içten duygularımla teşekkür ederim.

3 İÇİNDEKİLER GİRİŞ VE AMAÇ... 1 GENEL BİLGİLER... 3 MİKROBİYAL FLORA... 6 İSHAL ETKENİ OLARAK ESCHERİCHİA COLİ... 7 PATOGENEZ... 7 LABORATUVAR TANI TEDAVİ VE KORUNMA GEREÇ VE YÖNTEMLER BULGULAR TARTIŞMA SONUÇLAR ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR EKLER

4 KISALTMALAR AAF A/E bfp CFA DAEC eae EAEC EAF EAST E.coli EHEC EİEC EPEC ETEC HÜS LEE LT MAC MUG SMAC PZR ST : Agregatif Adherence Fimbria : Attaching/Effacing : bindle forming pilus : Colonization Factor Antigens : Diffüz adherens Escherichia coli : effacing and attaching : Enteroagregatif Escherichia coli : Enteropathogenic Escherichia coli Adherence Factor : Enteroagregatif sitotoksin : Escherichia coli : Enterohemorajik Escherichia coli : Enteroinvazif Escherichia coli : Enteropatojenik Escherichia coli : Enterotoksijenik Escherichia coli : Hemolitik Üremik Sendrom : Locus of Enterocyte Effacement : Labil Toksin : MacConkey Agar : 4-methyl-umbelliferyl-D-glucuronide : Sorbitollü Mac Conkey Agar : Polimeraz Zincir Reaksiyonu : Stabil Toksin 4

5 STEC Tir VTEC : Shiga toksin üreten Escherichia coli : Transloke intimin reseptörü : Verotoksijenik Escherichia coli 5

6 GİRİŞ VE AMAÇ Dünyada ölüme neden olan hastalıkların ikinci sırasında ishale yol açan infeksiyonlar gelir. Bu infeksiyonlar özellikle yaşlılarda ve 5 yaş altı çocuklarda önemli mortalite ve morbidite nedenidir. Özellikle Asya ve Afrika gibi gelişmekte olan bölgelerde ishal nedeni ile heryıl 4-6 milyon çocuğun öldüğü tahmin edilmektedir. 5 yaş altı çocuklarda ishal nedeni ile ölüm oranı Türkiye de %15.4 iken dünya genelinde %16.8 olduğunu Dünya Sağlık Örgütü nün 2004 mortalite verileri göstermiştir (1,2). İshal, bağırsakta peristaltik hareketin artması, emilimin azalması veya sekresyonun artması sonucu dışkı miktarının fazlalaşması ile günlük dışkı sayısının artması ve dışkı kıvamının bozularak yumuşak ve sulu bir görünüm alması olarak tanımlanır. Bakteri, virüs ve parazit gibi pek çok etken ishale neden olabilmektedir. Gelişmekte olan ülkelerde bakteriler ve parazitler, hem gelişmiş hem de gelişmekte olan ülkelerde ise virüsler genel olarak ishal etkenidirler (3,4). İshal ile ilişkili hastalık etkeni olarak Escherichia coli (E. coli), son 25 yıl içerisinde önemini dikkate değer şekilde arttırmıştır. Bunun nedeni hangi türünün nasıl bir mekanizmayla ishale neden olduğuna dair elde edilen bilgilerin giderek artmasıdır. İshal etkeni olan bakteriler içinde Campylobacter, Salmonella, Shigella, Yersinia, Vibrio gibi özgül etkenlerin yanı sıra normal florada yer almaları nedeni ile laboratuvar tanısı daha zor olan E. coli lerin de önemli bir yer tuttukları bilinmektedir. Diğer patojenlerden farklı olarak laktoz pozitif ve bağırsak florasının bir üyesi olması nedeniyle bu bakteriye ait ishal olgularının kanıtlanması, ancak bu bakterinin virülans faktörlerinin gösterilmesi ile mümkün olmaktadır. 1

7 Bir ishal olgusunda başka bir patojen etken belirlenememesi halinde izole edilen E. coli nin patojen gruba dahil olup olmadığının belirlenmesi tanı ve tedavi açısından önemlidir (1). Ülkemizde ishale neden olan patojen E. coli lerin prevalansı ve önemi konusunda çalışmalar sınırlıdır. Son yıllarda bu konudaki tanı yöntemlerinde önemli değişiklikler olmuştur. Yeni tanı yöntemleri eşliğinde ishal yapan E. coli lerin tanımlanması tedaviye önemli katkılar sağlayacaktır. Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi (GÜTF) Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı ında yapılmış bir çalışmada çocuk ve erişkin değişik yaş gruplarındaki hastalardan gönderilen dışkı kültürleri ishale neden olan E. coli ler açısından lam aglütinasyon yöntemi ile taranmış, aynı çalışmada ishal yapan E. coli ler %44 oranında bulunmuştur. İshal olgularında, diğer patojen E. coli serogruplarına göre Enteropatojenik E.coli (EPEC) kökenlerine anlamlı düzeyde daha çok rastlanmıştır. 6 adet O111, 4 adet O44, 4 adet O1, 2 adet O126 ve 2 adet O26 kökeni tanımlanmıştır (5). İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi ve Cerrahpaşa Tıp Fakültesi nin birlikte yaptığı bir çalışmada ishalli hastalardan ve sağlıklı bireylerden alınan dışkı örnekleri Verotoksijenik E. coli (VTEC) varlığı açısından Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile incelenmiş, 9 dışkı örneği PZR yöntemi ile VTEC açısından pozitif bulunmuş, bunlardan 2 köken E. coli O157 olarak tanımlanmıştır (6). Bu çalışmamızda E. coli lerin hakim olduğu dışkı kültürleri değerlendirilmeye alınarak ayrılan bakterilerin seogruplandırılması ve moleküler incelemesi, böylece ishal etyolojileri arasında E. coli lerin oranı ve hangi serotiplerin yöremizde ishal etkeni olarak ön plana çıktığının belirlenmesi amaçlanmıştır. Böylece çeşitli zorlukları nedeniyle etyolojik tanısı atlanan ve ülkemizde de oldukça sık görülen ishal olgularının etyolojisinde, patojen E. coli serogruplarına bağlı ishallerin yöremizdeki muhtemel sıklığı belirlenecek, konu ile ilgili klinisyen ve laboratuvar sorumlularının dikkati bu probleme yöneltilmiş olacaktır. 2

8 GENEL BİLGİLER Bağırsak infeksiyonları, konak ve mikroorganizma arasındaki etkileşim sonucunda üç klasik yoldan biriyle, normal bağırsak fizyolojisinin değişmesiyle meydana gelir. Birincisi; bağırsak lumeni içindeki toksin veya az sayıda invazif organizmalarla (örnek olarak: Giardia, Cryptosporidium) üst ince bağırsaklarda hassas bir dengede olan su ve elektrolitlerin bağırsak lümenine kaybı. İkincisi; İleal veya kolonik mukozanın inflamatuvar veya sitotoksik hasarı. Üçüncüsü; Sağlam mukozadan retiküloendoteliyal sistem içerisine penetrasyon yoluyla gerçekleşir. Bu üç bağırsak infeksiyonu tipi Tablo 1 de özetlenmiştir (7). Enterobacteriaceae familyasında yer alan Escherichia cinsi, adını Theodora Escherich den alır. Tek veya çiftler halinde bulunan gram negatif basillerdir. E. coli insan sindirim sisteminde bulunan fakültatif anaerob bir bakteridir ve Enterobacteriaceae familyasında en sık izole edilen patojendir (8). Peritriş kirpikleri ile hareketli, gram negatif ve ortalama 2-6 µm eninde bir basil olan E. coli aerobik koşullarda inkübe edildiğinde, 37 ⁰C de genel kullanım besiyerleri veya seçici besiyerlerinde kolayca ürer. 1-2 µm çapında S koloniler yapar ⁰C de üreyebilmeleri ve özellikle 44 ⁰C de de üreyebilmeleri benzer bazı bakterilerden (Enterobacter ve Serratia) ayırt edici bir özelliktir. Diğer Enterobacteriaceae üyelerinin de ürediği ve morfolojik olarak bağırsak patojenlerinin ayrımının yapıldığı MacConkey agar (MAC) veya Eosin-Methylene-Blue (EMB) agarda izole edilir. Birçok şekeri asit ve gaz yaparak parçalarlar. E. coli türlerinin ancak %90 ı laktoz pozitiftir. Bazı ishal yapıcı E. coli türleri örneğin enteroinvazif Escherichia coli (EİEC) laktoz negatiftir. İndol testi ise E. coli 3

9 lerde %99 pozitiftir ve E. coli leri diğer Enterobacteriaceae türlerinden ayırt edebilecek tek ve en iyi test olarak değerlendirilir (8). Tablo1. Bağırsak infeksiyonlarının üç tipinin karşılaştırılması (7) Mekanizma Tip 1 Tip 2 Tip 3 Noninflamatuvar (enterotoksin veya aderens/yüzeysel invazyon) 4 İnflamatuvar (invazyon, sitotoksin) Penetrasyon Yerleşim Proksimal ince bağırsak Kolon Distal ince bağırsak Hastalık Sulu diyare Dizanteri Tifo Dışkı analizi Fekal lökosit yok, laktoferrin yok veya az yüksek Örnekler Vibrio cholerae, Escherichia coli (ETEC, LT,ST) Clostridium perfringens Bacillus cereus Staphylococcus aureus Giardia lamblia Rotavirus Norwalk-like virus Cryptosporodium parvum E.coli (EPEC, EAEC) Microsporidia Cyclospora cayetanensis Fekal polimorfonükleer lökositler, laktoferrin yüksek Shigella E.coli (EİEC, EHEC) Salmonella enteritidis Vibrio parahaemolyticus Clostridium difficile Campylobacter jejuni Entamoeba histolytica Fekal mononükleer lökositler, laktoferrin yok Salmonella typhi Yersinia enterocolitica Campylobacter fetus EPEC: Enteropatojenik Escherchia coli, ETEC: Enterotoksijenik Escherchia coli, EHEC: Enterohemorajik Escherichia coli, EİEC: Enteroinvazif Escherchia coli, EAEC: Enteroagregatif Escherichia coli, LT: Labil Toksin, ST: Stabil toksin. Metil krmızısı testi olumlu, Voges Proskauer olumsuzdur. Simon un sitratlı besiyerinde üremezler, bu durumda İMVİC testi sonucu ++-- dir. Bazı kökenleri dışında üreyi parçalamazlar ve KCN testi olumsuzdur (8). Mikroskobik incelemede kapsül görülmesi nadir olmasına rağmen birçok köken polisakkarit yapıda ancak serolojik deneylerle ortaya konabilen M ve K antijeni içeren

10 mikrokapsüle sahiptir. H antijeni içeren E. coli kökenleri çoğunlukla fimbria oluşturur ve bunlar protein yapıdadır. Fimbrialar hücrelere ve yüzeye tutunma özellikleri ile virulansta rol oynarlar (8). Escherichia türleri oldukça dirençli bakterilerdir. 60 ⁰C ısıda 30 dk, oda ısısında uygun ortam koşullarında uzun süre canlı kalabilirler. E. coli kökenlerinin çoğu bakteriden bakteriye kolayca geçebilen direnç plazmidleri taşıdıklarından özellikle hastane ortamında çeşitli antimikrobiklere karşı kolayca direnç geliştirirler (8). Escherichia coli ilk olarak ishalli bebeklerin dışkısından izole edilmiş ve bundan kısa bir süre sonra sağlıklı çocuk ve erişkinlerin dışkılarından da izole edilebildiği gösterilmiştir. Bu durum patojen olmayan kökenlerle ishale neden olan kökenlerin birbirinden ayrılmasının ne kadar önemli olduğunu açığa çıkarmıştır. E. coli kökenleri sahip oldukları antijenik özelliğine göre serolojik olarak serogrup ve serotiplerine ayrılır. O somatik antijenine göre serogruplarına, H kirpik antijenine göre serotiplerine ayrılır. O antijenleri ısıya dayanıklı lipopolisakkarit yapıda antijenlerdir. Kaynatmaya ve alkole dirençli, formole dayanıksızdır. E. coli lerde 170 den fazla O antijeni belirlenmiştir. Hareketli kökenlerdeki H kirpik antijenleri protein yapıda ve termolabildir, alkole dayanıksızdır. 60 a yakın H antijeni belirlenmiştir. Çoğu köken üçüncü bir antijen olarak kapsüler K antijenini içerir. K antijeni de patogenezde önemli olmasına karşın serotiplendirmede nadiren kullanılır. Yaklaşık 80 çeşidi saptanmıştır. Fimbria antijenleri çok sayıda fimbria oluşturan bakterilerde O aglütinasyonunu engelleyebilen, oda sıcaklığında oluşturulmayıp 37 ⁰C de oluşturulan, protein yapıda, çeşitli hücrelere bakterinin aderensini sağlayan antijenlerdir. Lipopolisakkarit yapısındaki O antijenleri ısıya dayanıklıdır bu nedenle kaynatılmış bakteri immunizasyon, aglutinasyon ve aglutinin absorbsiyonu için uygundur. Lam aglutinasyonu için serum fizyolojikte spontan aglutinasyon göstermeyen düz koloniler seçilir. Kültürler O antiserumu elde etmek için 2. 5 saat süreyle 100 C de ısıtılır ve aynı kültür aglutinasyon için formalinle muamele edilir veya 100 C de ısıtılır. Sonuçlar 50 C de bir gece inkübasyondan sonra okunur (8,9). Tüp aglutinasyonu veya plastik kuyucukta yapılan aglutinasyon primer tarama metodu olarak kullanılacağı gibi O antijeninin araştırılmasında titrasyon amacı ile de kullanılabilir Sıklıkla eşit miktarda (örneğin 0. 2 ml) bakteri süspansiyonu ve serum dilüsyonu karıştırılır ve tavsiye edilen ısı ve zaman süresince inkübe edilir (9). Aglutinasyon deneyinde titrasyon tekniği yaygın olarak kullanılır, bu amaçla genelde tüp kullanılır, ancak son zamanlarda plastik kuyucuklar kullanılmaya başlanmıştır. Bir seri tüpte 0.2 ml antiseruma aynı miktardaki sıklıkla ml de organizma içeren bakteriyel 5

11 süspansyion iki kat sulandırılarak eklenir. Standart yoğunlukta bakteri kullanılması tavsiye edilir. Tetkik edilen karışımdaki antijene bağlı olarak 37 ⁰C veya 50 ⁰C de belirtilen zaman süresince inkübe edilir. Titre, çıplak gözle görülebilen karşılıklı en yüksek dilüsyonda aglutinasyona neden olan serumun relatif gücünü gösterir. Dilüsyonlarındaki önemsiz düzeydeki değişkenlik aglutinasyon titrelerinin yanlış sonuç vermesine neden olur, bir aşamada pozitif olan diğerinde negatif olabilir (9). Süt çocuğu gastroenteritinin epidemiyolojisini aydınlatmak için serolojik tiplendirme ilk olarak Goldschmidt tarafından 1933 yılında kullanılmıştır. Ancak bu konudaki asıl ilerleme Kauffman tarafından 1944 yılında E. coli nin serotiplerinin ayrıntılı olarak şematize edilmesi ile kaydedilmiştir. Halen modifiye edilmiş şekliyle bu şema kullanılmaktadır. Bu şemaya göre E. coli ler O (somatik), H (flagella), K (kapsül) yüzey antijenlerine göre sınıflandırılırlar. Başlangıçta O antiserumu ile aglütinasyon vermeyen ısıtıldıktan sonra aglütinasyon veren türlerin K antijenine sahip olduğu düşünülür. O ve H antijenlerinin özgül kombinasyonu izole edilen bir E. coli nin serotipini tanımlar. Antijenler tek başlarına virulansı göstermezler. Ancak özgül virulan klonlarla ilişkili kromozomal göstergelerdir. Birçok E. coli kökeni patojen olmadığı ve değişik hastalıklarda farklı kökenler etken olduğu için salgınlarda ve çeşitli hastalıklarda üreyen E. coli kökenlerinin sınıflandırılması önemlidir. Kauffman ın yaptığı bu çalışmadan sonra 1945 yılında Bray ve 1948 yılında Giles ve Sangster tarafından çocuklarda görülen iki ishal salgınının hangi E. coli kökeninden kaynaklandığı belirlenebilmiştir (1,8). MİKROBİYAL FLORA Gastrointestinal sistem çok fazla miktarda ve çeşitlilikte normal flora elemanlarını içerir. Normal bir konakta mide asiditesi kolonizasyonu çoğu kez önemli ölçüde önlese de birçok bakteri bu engeli aşar ve alt gastrointestinal sistemde yerleşerek oranın kalıcı flora elemanlarına dahil olur. Normalde üst ince bağırsak bölümü, az sayıda flora elemanları içerir ( /ml kadar bakteri, esas olarak streptokoklar; laktobasiller ve maya); ancak distal ileum içerisinde /ml kadar baskın olarak Enterobactericeae ailesindeki bakteriler ve Bacterioides spp. bulunur (2). Süt çocukları genellikle doğumdan kısa bir süre sonra insan epitelyal florasında yer alan Stafilokoklar, Corynebacterium spp. ve diğer gram pozitif organizmalar (bifidobakteriumlar, klostridiumlar, laktobasiller, streptokoklar) ile kolonize olur. Zamanla intestinal flora içeriği değişir. Erişkin kalın bağırsak normal florası relatif olarak yaşamın ilk 6

12 yıllarında daha ziyade Bacterioides, Clostridium, Peptostreptococcus, Bifidobacterium ve Eubacterium u içeren anaerobik türlerle kolonize olur (2). Escherichia coli ve diğer Enterobactericeae ailesindeki bakteriler, enterokoklar ve streptokoklar gibi aerob bakteriler anaerobların yanında sayıca az kalır, 1000:1 gibi. Bağırsak lümeni içerisinde dışkının gram başına düşen bakteri sayısı sigmoid kolona yaklaştıkça giderek artar. Sağlıklı bir bireyde kuru dışkı ağırlığının %80 i, yani yaklaşık CFU/gr kadar bakteri içerir (2). İSHAL ETKENİ OLARAK ESCHERİCHİA COLİ Escherichia, Shigella ve Salmonella, Enterobactericeae grubu içerisinde yer alan, MAC da iyi üreyen ve ishale yol açan gram negatif çomaklardır. Bu organizmaların hareketli olmaları peritriş kirpikleri sayesindedir. Ancak Shigella nın tüm türleri ile Escherichia ve Salmonella nın bazı kökenleri hareketsizdir. Hepsi D-glukozu fermente eder; Escherichia ve Salmonella türleri genellikle gaz üretirler. Shigella fenotipik olarak E. coli ile benzerdir ve Shigella boydii serotip 13 dışında DNA-DNA hibridizasyon analizi ile aynı tür oldukları dahi söylenebilir. Escherichia cinsi içerisinde altı tür vardır; Escherichia albertii, E. blattae, E. coli, E. fergusonii, E. hermannii ve E. vulneris. Bu türün tipik özelliklerini E. coli taşır (10). Klinik Önemi Altı Escherichia türü içerisinde genelde insanlardan izole edilen tür E. coli dir. Sağlıklı bireylerin bağırsak florasının daimi bir üyesidir; ancak bazı türleri immün sistemi baskılanmış bireylerde olduğu kadar sağlıklı kişilerde de bağırsak veya bağırsak dışı infeksiyonlara yol açabilir. İdrar yolu infeksiyonları, bakteriyemi, sepsis, pnömoni, menenjit ve sulu ishalden dizanteriye benzer ishale kadar değişen tiplerde ishallere, Hemolitik Üremik Sendrom (HÜS), vb. infeksiyonlara da yol açabilir (10,11). E. coli nin hem normal floranın üyesi olup hem de sıklıkla değişik infeksiyonlara yol açması merak konusu olmuş ve bu bakteri bilim adamları tarafından araştırmalar için model olarak seçilmiştir. Bu araştırmalar sonucunda bakteri genomu tamamen belirlenmiştir (2). PATOGENEZ Gastrointestinal sistemde infeksiyonun gelişmesi idrar yolu infeksiyonlarının patogenezine benzer şekilde cereyan eder. Bağırsak patojeninin ishale neden olup 7

13 olmayacağını konak ve invazyon yapan mikroorganizmanın kendine has özellikleri belirler (2). Konak Faktörleri Konak olarak insanlarda normalde bağırsak patojenlerinin neden olduğu hastalıkların oluşumuna engel olan veya hastalığı kontrol eden çeşitli savunma mekanizmaları vardır. Örneğin mide asiditesi çeşitli tip ve sayıdaki mikroorganizmaların alt gastrointestinal sisteme geçişini etkin bir şekilde sınırlar. Normal peristaltik hareketler mikroorganizmaların rektuma doğru ilerlemesine yardımcı olur ve bunların mukozaya yapışmasını engeller. Müköz tabaka epitelyum hücrelerinin üzerini kaplar ve mikroorganizmaları bu müköz tabaka içerisine hapsederek bağırsağın akış yönüne doğru bunların ilerlemesini sağlar. Normal flora, potansiyel patojen mikroorganizmaların kolonizasyonunu önler (2). Müköz membranlar solunum ve ürogenital sistemde olduğu gibi gastrointestinal sistem boyunca uzanır. Bu membranlar birçok farklı hücre tipini içerir; bu hücrelerden bazıları sekresyon, absorbsiyon görevi görürken bazılarının savunma görevi vardır. Örneğin müköz membranın bir kısmını oluşturan, follikül adı verilen özelleşmiş bazı hücre toplulukları gastrointestinal sistem boyunca uzanır ve savunma fonksiyonları vardır. Bu foliküllerin oluşturduğu topluluğa Peyer plakları denir. Bu folliküller M hücreleri, makrofajlar, B ve T hücrelerini içerirler. Tüm bu hücre topluluklarının ortak işlevi sonuçta bakteri veya karşılaştıkları bir antijene karşı sekretuar IgA salınmasıdır. Fagositik hücreler ve sekretuar IgA bağırsak içinde hastalığa neden olan etkenin ortadan kaldırılmasına yardım eder. Folliküller ve Peyer plakları ince ve kalın bağırsaklarda yer alır (2). Konağa ait kişisel hijyen ve yaş diğer önemli faktörlerdendir. Bağırsak infeksiyonlarının patogenezinde ilk aşama patojenin alımıdır. Gastrointestinal sistem infeksiyonları gıda ürünlerinin veya içme suyunun kontaminasyonu ardından bunların alımı neticesinde yayılır. Hastalığın oluşup oluşmamasında konağın yaşı da çok önemlidir. Örneğin rotavirüs veya enteropatojenik E. coli nin neden olduğu ishal hastalığı erişkinlerde pek yokken genç çocukları daha fazla tutması söz konusudur (2). Potansiyel zararlı mikroorganizmaların girişine karşı konak cevabında normal bağırsak florası önemli bir faktördür. Ne zaman antibiyotik kullanımı veya konağa ait başka faktörler nedeni ile normal bağırsak florasında azalma olsa gastrointestinal infeksiyonlara karşı direnç önemli derecelerde azalır (2). 8

14 Escherichia coli nin birbirinden farklı klinik tablolara yol açan ve bir dizi özgün virulans faktörü taşıyan patojen tipleri bulunur. Her bir patojen tipte yer alan E. coli kökenlerinin serogrupları o tipe özgüldür (10,12,13). İshal yapan E. coli lerin sıklıkla karşılaşılan serotipleri Tablo 2 de gösterilmiştir. Tablo 2. İshal yapan Escherichia coli lerin sıklıkla kaşılaşılan serotipleri * (10) ETEC EPEC EİEC STEC EAEC O6:NM O55:NM O28:NM O22:H5 O118:H16 O3:H2 O6:H16 O55:H6 O29:NM O22:H8 O119:NM O15:H18 O8:H9 O55:H7 O112:NM O26:NM O119:H4 O44:H18 O15:H11 O86:NM O124:NM O26:H :H25 051:H11 020:NM O86:H34 O124:H7 O28:H25 O121:H19 O77:H18 O25:NM O111:NM O124:H30 O45:H2 O128:NM O86:H2 O25:H42 O111:H2 O136:NM O55:H7 O128:H2 O111ab:H21 O27:NM O111:H15 O143:NM O84:NM O128:H45 O126:H27 027:H7 O111:H21 O144:NM O88:H25 O145:NM O141:H49 027:H20 O114:NM O152:NM O91:NM O146:H21 ONT:H21 O49:NM O114:H2 O164:NM O91:H14 O153:H2 ONT:H33 O63:H12 O119:H6 O167:NM O91:H21 O153:H25 O78:H11 O125:H21 ONT:NM O103:H2 O157:NM O78:H12 O126:NM O104:H21 O157:H7 O128:H7 O126:H27 O111:NM O165:NM O148:H28 O127:NM O111:H2 O165:H25 O153:H45 O127:H6 O111:H8 O172:NM O159:NM O127:H9 O113:H21 O174:H21 O159:H4 O127:H21 O118:H2 O174:H28 O159:H20 O128:H2 O118:H12 O167:H5 O128:H7 O169:NM O128:H12 O169:H41 O142:H6 O157:H45 NM: hareketsiz; NT: tiplendirilemeyen. *Salgınla ilişkili serotipler koyu renkle gösterilmiştir. Bugün için ishale yol açan altı farklı E. coli tanımlanmıştır. 1. Shiga toksin üreten E. coli (STEC) [ya da Verotoksijenik E. coli (VTEC)], 2. Enteropatojenik E. coli (EPEC), 3. Enterotoksijenik E. coli (ETEC), 4. Enteroinvazif E. coli (EİEC), 5. Enteroagregatif E. coli (EAEC) ve 6. Diffüz Adherens E. coli (DAEC). Ancak bunlardan DAEC' in klinik önemi çok net bilinmemektedir (9,12,13). İshal yapan farklı patojen tiplerin hücreye tutunma ve virulans 9

15 mekanizmaları birbiriyle örtüşebildiği gibi E. coli kökenlerinde tanımlanan patojenite mekanizmaları diğer bazı bakterilerle ortak da olabilir (13). Shiga Toksin Üreten Escherichia coli İshale neden olan E. coli lerin STEC grubu, bu organizmaların ürettiği toksinlere göre adlandırıldığından ve HÜS veya hemorajik kolit oluşumunu belirleyen asıl genetik özellik tam olarak bilinmediği için EHEC ten ziyade STEC şeklinde adlandırılır. EHEC kökenlerinin patojenitesinde hem Shiga toksinleri hem de yapışma ve bozma mekanizmaları rol oynar. Shiga toksini (verotoksin de denir) salgılayan E. coli nin (STEC), yapışma ve bozma mekanizmasını sağlayan LEE (locus of enterocyte effacement: enterosit bozma lokusu) genleri de varsa bu kökenlere EHEC (örn: O157:H7) denir. Dolayısıyla EHEC olmayan, sadece Shiga toksini salgılayan STEC kökenleri de vardır. EHEC kökenleri aynı zamanda EHEC hemolizini de salgılar (10,12,14). Escherichia coli O157:H7 ve diğer STEC serotipleri insanlara genellikle az pişmiş biftek gibi etlerle bulaşır, çünkü bu bakteri sığırların ve diğer ot obur hayvanların sindirim kanalı normal florasında bulunur. Diğer bilinen bulaş yolları çiğ süt, sosis, klorlanmamış çeşme suyu, elma şarabı, çiğ sebzeler ve lahana gibi yapraklı sebzeler yoluyladır. O157 STEC, kişiden kişiye çok kolay yayılır, çünkü infeksiyon dozu çok düşüktür (<200 CFU); kişiden kişiye yayılma tarzında gözlenen salgınlar okullarda, uzun süreli bakım veren merkezlerde, kalabalık ailelerde ve kreşlerde gözlenir (10,12,14). Hafif kansız ishal, ağır, kanlı ishal (hemorajik kolit) yanında mikroanjiopatik hemolitik anemi, trombositopeni ve akut böbrek yetmezliği ile özellenen HÜS e ve ölüme yol açabilir (10,12,14). Etkisi, hem Shiga toksinleri 1 ve 2, hem de yapışma ve bozma mekanizması ile ortaya çıkar. Bu toksinler patojenite adacıkları tarafından kodlanır. Shiga toksini A-B toksinleri grubundadır, yani bir A alt birimi ve pentamer yapısında B alt birimi vardır. Duyarlı hücre reseptörüne bağlanarak endositozla hücre içine alınır, A alt birimi aktive olarak hücre ribozomunda protein sentezini durdurarak hücre ölümüne yol açar. Sindirim kanalı epitel hücrelerinden geçerek bağırsak, böbrek ve diğer organların kılcal endotellerini tahrip eder ve bunun sonucunda intravasküler koagulasyon ve sonunda da trombositopeni, mikroanjiyopatik hemolitik anemi ve böbrek yetmezliğine, yani HÜS e yol açar (2,12,14,15). 10

16 Enterotoksijenik Escherichia coli Gelişmekte olan ülkelerde ETEC, özellikle küçük çocuklar arasında ishalin önemli nedenlerindendir. Hastalığının en belirgin semptomları; ishal ve abdominal kramplardır, bazen de bulantı, baş ağrısı eşlik edebilir ancak genellikle kusma ve ateşe az rastlanır. ETEC genellikle nispeten hafif sulu ishale neden olurken, bazı yeni ETEC salgınları kendisini uzamış hastalık süresi ile göstermiştir (10). Enterotoksijenik E. coli kökenleri ince bağırsak mukozasına kolonizasyon faktör antijenleri (colonization factor antigens: CFA) denilen adezinler aracılığı ile bağlanır. İnce bağırsak aslında E. coli nin fazla sayıda bulunduğu bir bölge değildir. Tarihsel olarak CFA veya E. coli yüzey antijenleri ismi verilen bu yapılar esas olarak bakteri piluslarından oluşur. E. coli kökenlerinde 20 den fazla farklı pilus vardır ve bunlar konak reseptörlerine özgüldür. Her bir pilusa karşı oluşan antikorlar o serotipe karşı koruyucu ama diğerine karşı koruyucu değildir. Dolayısıyla çocuklar birden fazla ETEC ishali geçirebilir. Erişkin yaşta ise daha önceki karşılaşmalardan dolayı bu bakteriye bağlı ishallerin görülmediği kabul edilmektedir. İnce bağırsak mukoza hücrelerine bu şekilde tutunduktan sonra ETEC kökenleri plazmidlerin kodladığı iki önemli toksini; ısıya duyarlı (heat-labile toxin: LT) ve ısıya dirençli (heat-stable toxin: ST) toksinleri salgılayarak ishale yol açarlar. ETEC kökenleri en çok ST (%35) salgılar, bazıları hem ST hem de LT salgılar, daha az bir kısmı ise sadece LT salgılar (2,9,12,16). Labil toksin biyolojik ve antijenik olarak kolera toksiniyle yakından ilişkilidir. Bu toksinler katalitik özellikte bir A alt birimi ve buna bağlı beşli (pentamer) bir yapıda reseptör bağlayan bir B alt biriminden oluşur (A-B toksinleri). LT konak hücreye B alt birimi ile bağlanır ve A alt birimi enterosit içine girerek adenil siklaz enzimini aktive eder. Hücre içi camp (siklik adenozin monofosfat) nin artışı protein kinaz A nın aktivasyonunu sağlar, bu da kistik fibroz transmembran geçiş regulatörü (CFTR) denilen bir molekülün fosforile ve aktive olmasını sağlar. Böylece oldukça karmaşık bir kaskadın devreye girmesi ile klorun aktif sekresyonu, sodyum ve suyun pasif olarak bağırsak lümenine bol miktarda sekresyonu söz konusudur (2,9,12,14-16). Stabil toksin ise tamamen farklı bir moleküldür, küçük bir peptiddir ve memelilerin guanilin denilen bir hormonuna benzer. ST aynı zamanda guanilin reseptörü olan enterosit apikal membranında bulunan GTP (Guanozin trifosfat) az a bağlanır. Sonuçta hücre içi GMP (Guanozin monofosfat) düzeyi artar ve bu kez protein kinaz G aktive olur, CFTR fosforilasyonu ve bağırsak lümenine elektrolit ve sıvı sekresyonu olur (2,9,12,14-16). 11

17 Enteropatojenik Escherichia coli Geçmiş yıllarda EPEC kökenleri; epidemiyolojik olarak sütçocuğu ishali ile birlikte olan, enterotoksin veya Shiga toksini üretmeyen ve invazif olmayan bazı E. coli serotipleri şeklinde tanımlanmıştı. Klasik EPEC serotipleri tipik olarak HeLa ve Hep-2 hücrelerine özgü bir lokalize aderens paterni göstermektedir (10). Enteropatojenik E. coli infeksiyonunun histopatolojik olarak en önemli özelliği yapışma ve bozma etkisi (attaching and effacing effect) dir. Bu etki in vivo olarak floresan aktin boya testinde aktin agregasyonu şeklinde görülebilmektedir. Bu etkinin oluşması; bakterinin enterosite lokal aderensi, bakterinin enterosit sinyal sistemini uyarması ve enterositle bakteri arasında sıkı bir bağlanmanın gerçekleşmesi basamakları ile olur. Tam olarak bilinmemekle birlikte sonuçta enterositler arası sıkı bağların zayıflaması, mikrovillusların kaybolması ve doğrudan sıvı kaybı ile ishal geliştiği düşünülmektedir (10, 12,14,16,17). Enteropatojenik E. coli virulans faktörleri kromozom ve plazmidler üzerinde bulunan genlerin kontrolündedir. EPEC in patojenitesinin tüm özelliklerini göstermesi için iki genetik elemanın olması gerekir: birincisi EPEC adherence factor (EAF) plazmidi denilen ve tip IV fimbriya veya demet oluşturan piluslar (bundle forming pilus: bfp) denilen pilusları kodlayan plazmidler taşır, ikincisi de yapışma ve bozma etkisidir ki enterosit bozma lokusu (locus of enterocyte effacement: LEE) denilen; bir T3SS (Type 3 secretion system: tip 3 sekresyon sistemini, intimin denilen dış membran adezini, transloke intimin reseptörü (Tir) ve diğer proteinleri kodlayan bir patojenite adası tarafından yönetilir (10,12,16). Tipik EPEC ten kast edilen organizmanın hem EAF plasmidi hem de LEE patojenite adasını birlikte taşımasıdır. Bu kökenler enterositlere lokal aderens göstererek bağlanır. Atipik EPEC kökenleri ise EAF plazmidleri taşımazlar, dolayısıyla bfp leri yoktur ve bunlar daha az patojendir. bfp halat benzeri demet şeklinde agrege olmakta ve bakterinin reversibl otoagregasyonuna yol açmaktadır. Bu özellikleriyle bfp nin infeksiyonun başlangıcındaki aderensi yönlendirdiğine ve daha sonra bakterinin bağırsak yüzeyine dağılmasına yol açtığına inanılmaktadır. EPEC in başlıca adezin faktörleri bfp, intimin ve T3SS inde yer alan EspA proteinidir (10,12,16). Çocuklarda ve küçük bebeklerde sıklıkla şiddetli, uzun süren, kansız diyare, kusma ve ateş şeklindeki bulgular EPEC hastalığının belirgin özellikleri olarak kendisini gösterir. EPEC infeksiyonunun kronik diyare ile ilişkili olduğu gösterilmiştir; malabsorbsiyon, malnutrisyon, kilo kaybı ve büyüme geriliği gibi sekellere neden olabilir (10). 12

18 Enteroinvazif Escherichia coli Enteroinvazif E. coli kökenleri genellikle hareketsizdir ve kolon hücrelerini invaze ederek inflamasyona ve genellikle sulu ishale neden olur. Nadiren Shigella nınkine benzer patojenik mekanizma ile kanlı ishale de neden olabilir. EİEC Shigella ya benzer şekilde T3SS ni kodlayan büyük bir invazyon plazmidi taşır. Epiteli T3SS i kullanarak invaze eder, fagozomdan kaçarak hücre stoplazmasında aktin kamçıları ile hareket ederek komşu hücreye ulaşır ve hücre içine girer. Aynı şekilde taşınarak submukozaya ulaşır ve buradaki makrofajları apopitoza uğratır. İnterlökin 1 in makrofajdan dışarı çıkması inflamatuvar yanıtı başlatır. Lökosit göçü olur, lökositler hücreler arasından geçerek olay yerine gelirler ve bakteri geçişi için de ikinci bir yol açarlar. Bakteriler epiteli her iki yolla aştıktan sonra epitel hücrelerini kolayca infekte ederler (2,10,12,17,18). Enteroagregatif Escherichia coli Tipik olarak Hep-2 hücre kültürlerinde gösterdiği özgül agregatif aderens özelliği ile tanımlanan EAEC, mekanizması tam anlaşılamamış olmakla birlikte insan kolon mukozasına agregasyonla yapışarak mikrovillus kaybına ve hücre ölümüne yol açtığı bilinmektedir. EAEC nin agregatif adherens fimbriaları (AAF/I ve AAF/II) diye bilinen, plazmide bağımlı pilusları vardır. Bazı EAEC kökenlerinin sitotoksin salgıladığı gösterilmiştir. Bu toksine enteroagregatif sitotoksin (EAST) denir. Bu toksin de plazmid tarafından kodlanmaktadır. Bu toksinin hücrelerde yuvarlaklaşmaya, hücre kültürlerinde hücre kopmalarına, insan bağırsak modelinde kriptlerde dilatasyon ve hücre harabiyetine yol açtığı gösterilmiştir (2,10,12,14,15). Enteroagregatif E. coli nin patojenitesi EAEC e bağlı olduğu bildirilmiş ishal salgınları ile doğrulanmıştır. Önceki çalışmalarda pediatrik ishal ile EAEC ilişkisi tam olarak gösterilememişken, agregatif özellik gösteren gerçek patojenin ayrımını sağlayabilen moleküler tekniklerin gelişmesi ile bu ilişki gösterilebilmiştir (10,19). Enteroagregatif E. coli, hem yoksul hem de sanayileşmiş ülkelerdeki çocuklarda endemik, epidemik ishal, gelişmekte olan ülkelerde seyahat ishalleri ve HIV virüsü taşıyan veya AIDS hastaları arasında gözlenen persistan ishal gibi ishal ile ilişkili durumlardan sorumludur. Tipik EAEC terimi organizmanın regülatör EAEC (AggR) kontrolü altındaki virülans genini taşıdığını tarif etmek için kullanılır. Tipik EAEC Amerikalı çocuklardaki ishalin sık nedenidir. Gıda kaynaklı salgınların ve AIDS hastası veya HIV virüs taşıyıcılarındaki ishalin potansiyel nedeni olabileceği de akla gelmelidir. EAEC e bağlı 13

19 ishalde hafif inflamasyon (karın ağrısı ve ateş) belirti ve bulguları olabilir ancak dışkı genellikle kan veya lökosit içermez (10). İshal yapan E. coli kökenlerinin yukarıda anlatılanlar dışında; ishal ile ilişkili hemolitik E. coli, diffüz agregatif E. coli gibi diğer patojen tipleri olduğu da bazı araştırmacılar tarafından ortaya konmuştur. Bu konudaki çalışmalar devam etmektedir. Bu çalışmalar, zaman geçtikçe daha yeni patojen tiplerin gelişeceğinin ipuçlarını vermektedir (20). İshal Oluşturduğu Farzedilen (Putatif) Escherichia coli Birkaç putatif patolojik tip tanımlanmıştır. Yapılan gönüllü çalışmalarında veya salgın araştırmalarında, bu tiplerden hiçbirinin virülan olduğu açıkça ortaya konulmamıştır. Hep-2 hücrelerine karekteristik diffüz aderens özelliği gösteren E. coli (DAEC) kökenleri bazı epidemiyolojik çalışmalarda ishalin sebebi olarak gösterilirken bir başka çalışmada ilişki saptanmamıştır; DAEC nin prototip kökeninin erişkin gönüllülerde ishale neden olmadığı ortaya konulmuştur. Bazı çalışmalarda DAEC infeksiyonunun 1-5 yaş çocuklarda sulu ishal ile ilişkili olabileceği ancak yeni doğanlarda hastalıkla ilişkili olmadığı bildirilmiştir. DAEC sanayileşmiş ülkelerde görülebilir (10). LABORATUVAR TANI Escherichia coli basit besiyerlerinde bile üreyebilen ve kültürden kolaylıkla izole edilen bir bakteridir. Ancak E. coli nin patojen kökenleri ile normalde bağırsakta kommensal yaşayan ve patojen olmayan kökenlerinin birçok özellikleri ortaktır. Bu nedenle dışkı florasında bulunan E. coli kökenleri içinden virulan tipleri ayırt ederek bağırsak infeksiyonlarının tanısını koymak kolay değildir. İshal etkeni E. coli lerin antijenlerini, toksinlerini, virulans genlerini saptamaya yönelik çok sayıda tanı yöntemi tarif edilmiştir. Bu yöntemler genellikle E. coli patojen tiplerini başarıyla saptayabilmekle birlikte bir kısmı henüz rutin kullanıma uygun değildir (21). Shiga Toksin Üreten Escherichia coli nin Laboratuvar Tanısı Shiga toksin oluşturan E. coli (STEC) kökenlerinin bir kısmı EPEC kökenlerinde olduğu gibi A/E etkisi gösterebilen kökenlerdir. Bu tip A/E fenotipindeki STEC kökenleri enterohemorajik E. coli (EHEC) olarak da adlandırılmaktadır (22). Burada bu kökenlerden genel tanımıyla STEC olarak söz edilecektir. STEC infeksiyonlarının tanısı daha çok sık izole 14

20 edilen ve ciddi komplikasyonları nedeniyle öne çıkan bir serotip olan O157:H7 üzerine yoğunlaşmıştır. Gelişen tekniklere rağmen O157 dışındaki STEC infeksiyonlarının tanısı daha zordur (23). Tanıda kullanılan yöntemler: Doğrudan bakteriyi saptayan, dışkıda O157 antijenini tanımlayan ve virülans faktörlerini tespit eden çeşitli yöntemler vardır. 1. Doğrudan bakterinin saptanması: STEC in izolasyonu için doğrudan dışkı örneğinden kültür yapılıp izole edilen kuşkulu kolonilerde Stx varlığı araştırılabilir (7). Kanlı ishal ile başvuran veya bakteriyel bağırsak patojenleriyle sık karşılaşılan endemik bölgelerde yaşayan hastalardan gönderilen tüm dışkı örnekleri O157 STEC açısından incelenmelidir. O157 dışı STEC kültürü HÜS ve/veya kanlı ishali olan hastalar için gereklidir ve ishali olan diğer hastalar için de hastalığın şiddeti, yaş ve epidemiyolojik veriler ışığında veya ilgili patojene maruz kalma öyküsüne göre akla getirilmelidir Ticari ELİSA testlerinin kullanımı Shiga toksininin saptanmasında duyarlı bir yöntemdir (10). a. Besiyerlerine ekim: STEC O157:H7 kültürü; STEC içinde en sık rastlanan serotipler olan O157:H7 ve O157:H - kökenlerinin çoğu, diğer E. coli lerin aksine sorbitolu bir gecelik inkübasyondan sonra bile fermente etmezler. Diğer E. coli kökenlerinin %80 kadarı ise sorbitolu hızlı fermente eder. Bakterinin bu özelliğinden yararlanılarak standart MAC besiyerine %1 laktoz yerine %1 sorbitol ilavesiyle Sorbitollü MacConkey agar (SMAC) geliştirilmiştir. SMAC da O157 kökenlerinin (çoğunun) oluşturdukları şeffaf görünümlü (sorbitol negatif) kolonilerin O157 STEC olabileceği düşünülür. Bu kolonilerden en az 3-10 koloni seçilerek biyokimyasal ve diğer özellikleri açısından incelenir (18). Biyokimyasal ve antibiyotik direnç özelliklerine göre STEC kökenlerinin tespiti için özgül kültür besiyerleri geliştirilmiştir. Hızlı tanıda kullanılması için çeşitli kromojenik agar besiyerleri piyasada vardır. Bu besiyerleri genellikle O157:H7 ve bazı O157 dışı STEC için iyi sonuç verir. Cefixime-tellürit SMAC (CT-SMAC) besiyeri de O157:H7 için yararlı selektif bir besiyeridir (10). b. Biyokimyasal tanımlama: İzole edilen kuşkulu kökenlerin biyokimyasal olarak E. coli olduğu doğrulanmalıdır. Çünkü N grubu Salmonella, Yersinia enterocolitica serotip O9, Citrobacter freundii ve Escherichia hermanii gibi diğer kimi bakteriler O157 antiserumu veya lateks ayıracı ile çapraz reaksiyon verebilirler (18). 15

21 c. Beta-glukuronidaz (MUG) testi: E. coli O157:H7, diğer E. coli kökenlerinden beta- D-glukuronidaz oluşturmaması ile ayrılır. Beta-D-glukuronidaz enzimi florojenik olarak [(4- methyl-umbelliferyl-d-glucuronide (MUG) kullanılarak)] veya kolorimetrik olarak (5-bromo- 6-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronide ilave edilmiş agarda) saptanabilir. Ancak bu özellik O157 dışındaki STEC kökenlerinin veya sorbitol pozitif O157 STEC kökenlerinin saptanması için uygun değildir (24,25). d. Enterohemolysin (Ehly) testi: İnsandan izole edilen Stx oluşturan O157 STEC kökenlerinin %90 kadarı ve O157 dışındaki STEC kökenlerinin %60-80'i enterohemolysin (Ehly) olarak adlandırılan tipik bir E. coli hemolizini oluştururlar; bu hemolizin diğer E. coli kökenlerinin oluşturduğu α hemolizinden farklıdır. Bu özellik seçici olmayan ancak ayırıcı bir besiyeri olan enterohemolysin agarda incelenebilir. Bu yöntemin bir dezavantajı ekim yapıldıktan 3-4 saat sonra hemolitik kolonilerin incelenmesi (α hemolizin belirginleşir) ve tekrar bir gece inkübasyona bırakılmasıdır (hem α hemolizin hem de enterohemolizin belirginleşir) (18). 2. Dışkıda O157 antijeni saptanması: Dışkı örneklerinde E. coli O157 antijenini saptayan serotipe özgül kitler geliştirilmiştir. Poliklonal ve FITC (fluorescein isothiocyanate) ile işaretli anti-o157 antikorlarının kullanıldığı direkt immunfloresan boyama ile 2 saat kadar bir süre içinde E. coli O157 saptanabilmektedir. Dışkıda O157 antijenini saptayan ticari ELISA kitleri ile de 1 saatte sonuç alınabilmektedir. Hem immünfloresan hem de ELISA testleri benzer duyarlılık göstermekle birlikte SMAC kültürüne göre daha duyarlıdırlar. Bu yöntemlerin bir avantajı doğrudan dışkıya uygulanabilmesidir; sadece E. coli O157'yi saptayabilmesi ve pahalı olması dezavantajları arasındadır. O157 antijeni saptandığında yine Stx yönünden doğrulama yapılmalıdır (25). 3. Virulans faktörlerinin saptanması: İshal yapan patojenlerin tespiti sıklıkla seçici veya seçici olmayan besiyerlerinden seçilen E. coli kolonilerinden yapılır. Eğer PZR tekniği kullanılacaksa MAC plağındaki karışık üremeden alınan sürüntü incelenmelidir. Eğer PZR testi pozitif ise izole edilmiş koloniler birbirinden ayrı olarak (tek tek) tekrar PZR ile incelenir (10). 16

22 Enteropatojenik Escherichia coli, Enterotoksijenik Escherichia coli, Enteroinvazif Escherichia coli nin Laboratuvar Tanısı Enterotoksijenik E. coli, EPEC, EİEC, EAEC ve ishal yaptığı tahmin edilen E. coli lerin tanımlanma metotları referans laboratuvarlarda veya genelde araştırma amaçlı yapılmış düzeneklerle yapılır. Bu laboratuvarlar yalnız salgın halinde ve alınan örneklerin rutin bakteriyel patojenler açısından negatif olması halinde bu araştırmalara girişirler. Başka bir patojenin ortaya konamadığı sulu ishal vakalarından EAEC in sorumlu olduğu, turist ishalinden ETEC in, kreşlerde, günlük bakım evlerindeki çocuklarda, ağır kansız ishale EPEC in neden olduğu, EİEC ve EAEC nin ise kanlı veya kansız ishal salgınlarından sorumlu olduğu akla gelmelidir (10,26). Dışkı örneklerinden E. coli yi elde etmek için dışkı örneğinin daha az seçici olan MAC gibi ortamlardan farklı seçici ortamlara alınarak daha ileri testlerin yapılması gereklidir. Çoğunlukla laktoz fermente eden ancak nonfermente koloniler gibi kendisini gösteren örneklerden 5 ile 20 koloni seçilmeli ve seçici olmayan eğik agarlara (L agar veya nutrient agar gibi) inoküle edilmelidir. Daha sonra bu koloniler referans laboratuvarına test için gönderilmeli veya yapılabiliyorsa virülansa ilişkin karekteristik özellikleri açısından taranmalıdır. Elde edilen türler %15-50 gliserol içeren L Broth içinde -80 ⁰C de dondurularak uzun müddet saklanabilir. Salgın sırasında ne yapılacağı, E. coli izolatlarının gönderilmesi ve test edilmesine dair yerel ve ilçe sağlık departmanlarınca organizasyonun nasıl yapılacağına ilişkin prosedürler CDC tarafından çok iyi bir şekilde belirtilmiştir (10). Enteropatojenik Escherichia coli infeksiyonlarının tanısı: EPEC, EAEC ve DAEC; hücre kültürlerinde Hep-2 veya HeLa hücrelerine karekteristik yapışma özelliği göstermesi ile saptanabilmektedir. Bu özellik formalin veya glutaraldehid ile fikse edilmiş hücrelerde de gözlenebilir (10). Enteropatojenik E. coli, epitelyal hücrelerde histopatolojik olarak yapışma ve bozma A/E etkisinin gözlenmesi ve Stx ten yoksun olmasına göre tanınabilmektedir. A/E fenotipi, doku kültürü hücre testi ile intimini kodlayan eae geni ya da LEE patojenite adasına yönelik DNA prob veya PZR testleri ile saptanabilmektedir. Tipik EPEC in EAF plasmidi fragman veya oligonükleotid problar ya da PZR primerleri ile tespit edilebilir. Atipik EPEC yalnız A/E fenotipi/lee patojenite adacığını taşır, fakat EAF plasmidini taşımaz (10). Son yıllarda EPEC'in patogenezi ile ilgili bilgilerimizin artması nedeniyle EPEC'in laboratuvar tanısında önemli değişiklikler olmuştur. Bakterinin patogenezinde lokalize 17

23 aderenste rol oynayan kümeleşen fimbriyaları kodlayan bfp geni, EAF plazmidi, EPEC için tipik olan A/E lezyonunun oluşmasında rol oynayan intimini kodlayan eae geni gibi genetik faktörlerin gösterilmesi bugün tanıda temel yolu oluşturmaktadır (24). 1. Serotiplendirme: EPEC ler yıllarca dışkı örneklerinin ekildiği besiyerlerinden laktozu fermente eden en az 5-10 koloninin seçilip O, H ve K (kapsül) antijenlerine karşı hazırlanmış bağışık serumlarla aglütinasyon deneyi yapılması ile tanımlanmıştır (18). Ancak bu yöntem çeşitli serotiplere karşı bağışık serumların laboratuvarda hazır bulundurulmasını gerektirdiği ve zaman alıcı olduğu gibi, çok duyarlı ve özgül de değildir. Ayrıca ishal olgularında etken olan serotiplere yenilerinin eklenmesi bu yolla yapılan tanıyı giderek zorlaştırmıştır. Bugün, serotip özelliği EPEC kökenlerinin temel karakteristik özelliklerinden sayılmamaktadır yılında 2. Uluslararası EPEC Sempozyumu nda patogenezdeki son gelişmeler göz önüne alınarak EPEC için A/E histopatolojisi olması ve Stx in olmaması en önemli temel özellikler olarak kabul edilmiştir. Az sayıda da olsa kimi salgınlarda etken olarak saptanan EAF plazmiti bulunmayan ancak A/E lezyonu oluşturan kökenlerin plazmidini kaybetmiş olabileceği düşünülmektedir. Yine bu sempozyumda alınan ortak bir kararla EAF plazmidi bulunan, A/E lezyonu oluşturan, Stx oluşturmayan kökenler tipik EPEC kökenleri, aynı özelliklere sahip ancak EAF plazmidi bulunmayanlar ise atipik EPEC kökenleri olarak kabul edilmiştir (18,21,22,24). 2. Hücre kültüründe adherens fenotipinin gösterilmesi: EPEC kökenlerinin oluşturduğu lokalize aderens özelliğinin gösterilmesi amacıyla HEp-2 (insan epiteli) veya HeLa hücre kültürleri kullanılmaktadır. Lokalize aderens tipinde bakteri hücre yüzeyinde bir iki bölgeye mikrokoloniler halinde tutunur (21). Aderens tipi ayrıca formalin veya gluteraldehidle fikse edilmiş hücrelerde de gözlenebilir (24). Hücre kültüründe lokalize aderens saptanması EAF plazmidinin varlığını gösterir. Bunun dışında A/E lezyonunda yüksek konsantrasyonda polimerize filamentöz aktin bulunduğundan bu aktin yapıyı floresan aktin boyama yöntemi (FAS) ile göstermek mümkündür. Bu amaçla doğrudan hücre kültüründe epitel hücrelerine tutunmuş bakterinin altındaki aktin iplikleri ile özgül olarak bağlanabilen FITC( Flurescein isotiyosiyanat) veya rodaminle işaretli falloidin (mantar toksini) kullanılmaktadır. Falloidin çok toksik bir madde olduğundan bunun yerine α aktine karşı hazırlanmış monoklonal antikorlar da kullanılabilmektedir. A/E fenotipi, bağırsak biyopsi örneklerinin veya epitel hücre kültürlerinin elektron mikroskobu ile incelenmesi ile de 18

24 görülebilir. EPEC tanısında çok önemli bir diğer özellik olan Stx negatifliği çeşitli fenotipik testlerle saptanabilir. Bu testler STEC bölümünde anlatıldığı şekilde yapılmaktadır (18). 3. Moleküler yöntemler: EPEC kökenlerinin üç önemli özelliğine (A/E etkisi, EAF plazmidi bulunması ve Stx i olmaması) dayanılarak DNA probları ve PZR primerleri geliştirilmiştir (18,21,24). a- eae geni: İntiminin çok korunmuş N-terminal bölgesini kodlayan sekanslara yönelik fragment bir prob (1 kb) tanımlanmıştır. A/E fenotipi ile kıyaslandığında bu prob %100 duyarlı ve %98 özgül bulunmuştur. O157:H7 kökenleri için eae geninin 3' değişken bölgelerinin kullanıldığı fragment problar da bildirilmiş ancak henüz EPEC ve STEC'e ait eae dizisini ayırt edebilecek bir prob tanımlanmamıştır (18). EPEC tanısında PZR yöntemiyle eae geninin saptanması amacıyla çeşitli primerler bildirilmiştir. eae geninin korunmuş 5' bölgesi için primer çiftlerinin tüm eae pozitif kökenlerden bu fragmentleri amplifiye ettiği ancak 3' ucundan elde edilen primerlerin belli serotiplere özgül olabildiği bildirilmiştir. EPEC ve STEC kökenlerinde eae genini saptayabilen primerler son yıllarda tanıda sıklıkla kullanılmaktadır ( 27,28). b- Enteropatojenik E. coli Adherence Factor plazmidi: EAF plazmidinin fonksiyonu bilinmeyen bir bölgesine ait 1 kb EAF fragment probu tanımlandıktan sonra, 21 bazlık duyarlı ve özgül bir oligonükleotid prob tanımlanmıştır. Daha sonra EAF probunun 397 bp lik bölgesini amplifiye eden bir PZR primer çifti geliştirilmiştir (18). Binding forming pilus geninin klonlanması ile geliştirilen 850 bp' lik bir bfpa fragment probu EAF probundan biraz daha duyarlı bulunmuştur; HEp-2 hücrelere lokalize aderens gösteren EPEC kökenleri arasında bfpa ve EAF probları kullanıldığında sırasıyla %99 ve %96 hibridizasyon elde edilmiştir. Daha sonra bfpa geni için 29 bazlık bir oligonükleotid prob bildirilmiştir. Bu probun duyarlılığı ve özgüllüğü sırasıyla %95.7 ve %100 bulunmuştur. Ayrıca, bfpa genini saptayan %100 duyarlı ve özgül bir PCR yöntemi bildirilmiştir (18). Sonuç olarak A/E lezyonu oluşturan köken, doku kültürü testleri ile veya eae genine (ya da LEE patojenite adasına) yönelik DNA probu veya PCR ile saptanabilmektedir. Genelde, A/E lezyonu oluşturan veya fenotipik olarak lokalize aderans gösteren tipik bir EPEC kökeninin EAF plazmidi de oligonukleotid (veya fragment) problar veya PCR primerleri ile saptanabilmektedir. Bununla birlikte, stx negatif ve eae pozitif 19

25 kökenlerde EAF probu ya da PCR deneyleri negatif sonuç verdiğinde atipik bir EPEC kökeni olduğu düşünülmelidir (18). Enterotoksijenik Escherichia coli infeksiyonlarının tanısı: ETEC kökenlerinin neden olduğu ishallerde plazmidde kodlanan başlıca iki faktör rol oynar; bunlardan biri bakterinin enterotoksinleri; ST ve LT, diğeri kolonizasyon faktörleridir. Bakteri ya sadece ST' yi veya hem ST hem de LT'yi oluşturur. Bu faktörler çeşitli biyolojik, immünolojik ve nükleik asit tabanlı metotlarla saptanabilmektedir. Yalnız ST üreten veya ST ile birlikte LT üreten kökenler ABD deki ETEC salgınlarının en sık nedeni olmuştur (10,18). Enterotoksijenik E. coli kökenlerinin kültür süpernatanlarından ST veya LT nin tespiti için kullanılan en az iki ticari immunoassay kiti vardır. ST EIA yöntemi yalnızca ST i tespit eden yarışmalı enzim immunoassay yöntemidir. Ters pasif lateks aglutinasyon testi antijenik olarak oldukça benzer olan kolera toksini ve LT in her ikisini birden tespit etmektedir (10). Serotiplendirme: Tanı önceleri belli ETEC serogruplarının saptanmasıyla yapılmaktayken çok çeşitli serotipteki ETEC kökenlerinin enterotoksijen özellikte olduğu anlaşıldıktan sonra serotiplendirmenin tanıdaki önemi azalmıştır (29). ETEC antijeni içinde en fazla çeşitlilik O antijenindedir. Bir çalışmada 954 ETEC kökeninde 78 farklı O antijeni, 730 kökende de 34 farklı H antijeni saptanmıştır. Buna ek olarak bir kısım kökenler tiplendirilememektedir (30). Kolonizasyon faktör antijenleri nin saptanması: İshal oluşturan ETEC kökenlerinde CFA olarak adlandırılan çok sayıda adezin tarif edilmiştir. Bu CFA'lar daha çok toksin oluşturan kökenlerde bulunur ve çoğu fimbriyadır. İnsandan izole edilen ETEC kökenlerinde 22 den fazla CFA tanımlanmıştır. Bunlar içinde CFA/1, CS1-CS6 en sık görülen tiplerdir. ETEC kolonizasyon faktörleri için lam aglütinasyonu, immündifüzyon ve ELISA testleri gibi çeşitli yöntemler tanımlanmıştır (31). Toksin araştırılmasında kullanılan yöntemler: Bugün için ETEC infeksiyonunun tanısı daha çok çeşitli biyolojik, immünolojik veya nükleik asit temelli yöntemlerle bakterinin oluşturduğu enterotoksinlerin gösterilmesine dayanmaktadır (24). 1. Labil toksin in gösterilmesi: Hücre kültürü ve immünolojik testlerle labil toksin gösterilebilir. 20

26 a. Hücre kültürü yöntemi: LT' nin saptanması için kullanılan geleneksel yöntem hücre kültürü yöntemidir. Bu amaçla tek tabakalı fare adrenal hücresi (Y1), Çin hamsteri over hücresi (CHO) veya Afrika yeşil maymun böbrek (Vero) hücre kültürleri kullanılır. Toksin hücre morfolojisinde karakteristik değişiklikler oluşturur: LT, Shiga toksinin sitotoksik etkisinden farklı olarak, Y1 hücrelerinin yuvarlaklaşmasına, CHO hücrelerinin ise uzamasına neden olur. Hücre kültürü yöntemi ELISA ve diğer immünolojik yöntemler geliştirilinceye kadar yaygın olarak kullanılmıştır (29). b. İmmünolojik testler: LT kuvvetli antijenik özellikte olduğundan LT' in saptanabilmesi amacıyla klinik laboratuvarlarda uygulanması hücre kültürüne göre daha kolay ELISA, RPLA (ters pasif lateks aglütinasyon) gibi yöntemler geliştirilmiştir. ELISA yönteminde, bakteri kültüründe bulunan toksin, plaklara önceden kaplanmış olan GM1 gangliosidlere bağlanır. Daha sonra bağlı toksin, toksine özgül tavşan antikorlarıyla saptanır. LT ayrıca doğrudan özel bir besiyerinde üreyen bakteri kolonileri üzerine uygulanan presipitasyon testi ile de gösterilebilir. Bu yöntemde, LT ne özgül tavşan antikorları ilave edilerek hazırlanan besiyerinde, toksinin anti-lt antikorlarına bağlanmasıyla bir presipitin halkası oluşur. Stafilokok koaglütinasyonu, lateks aglütinasyonu gibi çeşitli özgül testler yaygın kullanım alanı bulamamıştır. LT'nin antijenik olarak saptanması için RPLA da kullanılabilir; bu yöntemle çalışan kitler ticari olarak (VET-RPLA Oxoid; VTEC-RPLA Denka Seiken) mevcuttur. Bu testler kültürde izole edilen 5-6 E. coli kolonisinin seçilerek sıvı besiyerinde bir gece inkübe edilmesi ve toksin salınımını arttırmak amacıyla polimiksin-b li ortamda tekrar 4 saat inkübasyonunu takiben süpernatanda veya membran filtrasyonu sonucu elde edilen süzüntüde toksin aranması esasına dayanır. Bu yöntemler içinde özellikle GM1- gangliosid ELISA, LT saptanmasında kullanılan en yaygın yöntem olmuştur. Daha sonra özgül monoklonal antikorlar kullanılarak ST ve LT in birarada saptandığı GM1-ELISA testi geliştirilmiş ve epidemiyolojik çalışmalarda sıklıkla kullanılmıştır (29). 2. Stabil toksin in gösterilmesi: ETEC kökenlerinin bir kısmı sadece ST oluşturduğundan bakterinin ST oluşturduğunun gösterilmesi gerekir. ST antijenik özellikte olmayan düşük molekül ağırlıklı bir peptittir. Tavşanın bağırsak lupunda sıvı toplanmasına neden olan ETEC toksinlerinden ST'nin etkisi LT'ye göre ısıya dayanıklı oluşu ve daha hızlı etkili oluşu ile ayrılabilir. İki farklı ST (ST-I ve ST-II) saptanmıştır. İnsandan izole edilen kökenlerde daha çok ST-I bulunur. ST-I'in de iki varyantı (STh ve STp) tanımlanmıştır (18,24,29). 21