OPB-7 OPG-2 OPG-11 OPG-15 OPG-17 OPG-20 OPH-3 OPH-4 OPH-6 OPH-7 OPH-9 OPH-12 OPH-13 OPJ-2 OPJ-3 OPJ-8 OPJ-10 OPJ-12 OPJ-19

Transkript

1 EK-8 T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Proje Başlığı: Nohutla Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. ciceris) ve Ascochyta Yanıklığının (Ascochyta rabiei) Moleküler Yöntemlerle Hızlı Tanısı, Patotiplerinin Ayrımı, Moleküler Karakterizasyonları Proje Yürütücüsünün İsmi: Prof. Dr.Salih MADEN Proje Numarası: Başlama Tarihi: Mart 2004 Bitiş Tarihi: Mayıs-2007 Rapor Tarihi: Aralık-2007 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - "2007"

2 RAPOR FORMATI Bilgisayarda 12 punto büyüklüğünde karakterler ile, tercihan "Times New Roman" stili kullanılarak yazılacak ve aşağıdaki kesimlerden (alt kesimler de dahildir) oluşacaktır. I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Nohutla Fusarium Solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. ciceris) ve Ascochyta Yanıklığının (Ascochyta rabiei) Moleküler Yöntemlerle Hızlı Tanısı, Patotiplerinin Ayrımı, Moleküler Karakterizasyonları Pathotype differentiation of ascochyta blight (Ascochyta rabiei) and fusarium wilt (Fusarium oxysporum f.sp. ciceris) of chickpea by molecular methods Ülkemizdeki nohut ekim alanlarında görülen en önemli fungal hastalıklar Fusarium oxysporum f.sp. ciceris in sebep olduğu Fusarium solgunluğu ve Ascochyta rabiei nin sebep olduğu Ascochyta yanıklığıdır. Bu sebeple farklı bölgelerden elde edilen Ascochyta ve Fusarium izolatları arasındaki genetik ve patojenik faklılıklar bu çalışma ile belirlenmiştir. Yapılan patojesite testleri sonucunda A. rabiei izolatları 3 farklı patotipe ayrılmış ve en yaygın patotipin Patotip 1 (38 izolat) olduğu tespit edilmiştir. Bunu sırasıyla Patotip 3 (23) ve Patotip 2 (3) takip etmiştir. Fusarium oxysporum izolatlarının patojenisite testi sonucunda ise 17 izolat yüksek virulant (YV), 75 izolat orta derecede virulant (OV) ve 12 izolat düşük virulant (DV) veya non patojen olarak değerlendirilmiştir. Bu fungus izolatları arasındaki genetik farklılıklar ise RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) tekniği kullanılarak incelenmiştir. Elde edilen verilerin Dice ın benzerlik katsayısı kullanılarak yapılan UPGMA (Unweighed Pairgroup Method with Arithmetic Average) cluster analizi sonucunda A. rabiei izolatlarının 5 grup ve 34 genotipe ayrıldığı görülmüştür. F. oxysporum izolatları arasında ise 3 ana grubun bulunduğu tespit edilmiştir. Fusarium wilt caused by Fusarium oxysporum f.sp. ciceris and Ascochyta blight by Ascochyta rabiei are the most important fungal diseases on chickpea growing areas in Turkey and all over world. Thus, genetic and pathogenic variability between isolates of Fusarium and Ascochyta obtained from different regions of Turkey were determined in this study. Pathogenicity test grouped A. rabiei isolates into 3 different pathotypes. Pathotypes 1 is the most widespread pathotype (38 isolates), followed by pathotypes 3 (23) and 2 (3) on chickpea growing areas of Turkey. The results of pathogenicity tests of Fusarium oxysporum isolates indicated that seventeen isolates were highly virulent (HV), 75 isolates were moderately virulent (MV) and 12 isolates were low (LV) in virulence. Also, genetic diversity within these fungal pathogens was studied by using RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) technique. UPGMA (Unweighed Pairgroup Method with Arithmetic Average) cluster analysis of the data from DNA amplification of RAPD using Dice s coefficient grouped A. rabiei isolates into 5 major groups and 34 genotypes and also, clustered isolates of F. oxysporum into 3 different groups. II. Amaç ve Kapsam Nohut, ülkemizde baklagiller arasında en fazla üretimi yapılan bir bitkidir ve bitkisel protein kaynağı olarak önemi her gün biraz daha artmaktadır. Nohutun veriminin istenilen düzeyde olmamasının başlıca nedenlerinden birisi hastalıklardan dolayı meydana gelen ürün kayıplarıdır. Bu ürünümüzde verimi büyük oranda etkileyen önemli iki hastalık vardır. Bunlar Fusarium solgunluğu (Fusarium oxysporum f.sp. ciceris, Foc) ve Ascochyta yanıklığı (Ascochyta rabiei, Ar) dır.

3 Bu hastalıklar içerisinde Ascochyta rabiei (Pass.) Labr. ın sebep olduğu yanıklık hastalığı iklim koşullarına bağlı olarak bazı yıllar büyük ürün kayıplarına sebep olabilmektedir. Tüm dünyadaki nohut ekiliş alanlarında önemli bulunan bu hastalık etmeninin Türkiye de yaygınlığı ve verim kayıpları net olmamakla beraber birçok ülkede % 20 den % 100 e kadar varan ürün kayıplarına sebep olduğu bildirilmektedir (Karahan 1968, Singh ve Reddy 1990). Ascochyta rabiei ile kimyasal mücadele tohum ve yaprak ilaçlaması şeklinde yapılmaktadır. Ancak bu uygulamalar epidemik koşullarda hem pratik hem de ekonomik değildir (Kaiser et al. 1973, Maden 1983). Nohut yanıklığına karşı dayanıklı çeşitlerin yetiştirilmesi ise yüksek ve sabit dayanıklılığın olmamasından dolayı istenilen oranda başarılı olmamaktadır. Ayrıca A. rabiei yüksek derecede değişken olup patojenin eşeyli döneminin bulunması patojenin yeni ırklarının veya patotiplerinin oluşumuna yol açtığı sanılmaktadır (Nene ve Reddy 1987). Nohut ekimi yapılan alanlarda son yıllarda dikkati çeken ve üzerinde çalışılmaya başlanan Fusarium oxysporum f.sp. ciceris ise ülkemizde önemli ürün kayıplarına neden olan Ascochyta yanıklığı hastalığından sonra ikinci derecede yaygın ve tahripkar bir patojendir (Dolar, 1996) ve nohut ekim alanlarının yaklaşık olarak % 40 ı bu etmenle bulaşıktır. Solgunluk patojeni olan Fusarium oxysporum f.sp. ciceris e karşı tüm dünyada etkili bir kimyasal mücadele programı henüz geliştirilememiştir. Hastalıkla mücadelede dayanıklı çeşitlerin yetiştirilmesine ağırlık verilmektedir (Haware et.al., 1992; Kaiser et.al, 1994). Ülkemizde mevcut tescilli çeşitlerin bu hastalığa dayanıklılık durumu ile ilgili çalışma sayısı ise yeterli düzeyde değildir (Dolar, 1995; Demirci et.al., 1999). Fusarium oxysporum f.sp. ciceris in 7 ırkı bulunmakta ve bunlar solgunluk veya sararmaya sebep olmalarına göre iki grup içine alınmaktadır. Ayrıca patotiplerin nohuttaki patojenisite derecelerinde de farklılık görülmekte olup solgunluğa sebep olan patotipleri sararmaya sebep olan patotiplerinden çok daha önemli epidemilere sebep olmaktadır. Patojenlerin populasyon biyolojilerinin araştırılmasında moleküler tekniklerin kullanılabilirliğinin tespit edilmesi patojenlerin tanısını pratikleştirdiği gibi bu patojenlerin genetik yapılarındaki varyasyonun belirlenmesi ileride konukçuda bulunan dayanıklılık genlerinin belirlenerek etkili bir ıslah programının hazırlanmasında ve hastalık kayıplarının azaltılmasında önemli rol oynayacağını göstermektedir. Bu çalışmada Türkiye nin önemli nohut ekim alanlarında görülen Ascochyta rabiei ve Fusarium oxysporum etmenlerinin coğrafik dağılımı ve virulenslikleri klasik yöntemler kullanılarak tespit edilmiştir. Ayrıca nohut ekimi yapılan alanlarda yaygın olan ve ekonomik kayıplara neden olan bu fungal etmenlerinin genetik yapısındaki intra ve interspesifik polimorfizimlerin ortaya konulmasında RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) tekniğinin kullanılabilirliği araştırılmıştır. III. Materyal ve Yöntem Hastalıklı Bitki Materyalinin ve Fungus İzolatlarının Temini Çalışmalarda kullanılan A. rabiei izolatları ASCORAB (Eueopean Union ICA-4-CT ) projesi kapsamında elde edilen izolatlar arasından seçilmiştir. Fusarium oxysporum izolatları ise yıllarında Ankara, Eskişehir, Kırşehir, Konya, Kayseri, Burdur, Denizli, Kütahya, Uşak, Antalya, K. Maraş, Adıyaman, Diyarbakır, Amasya ve Tokat olmak üzere 15 ilde yapılan surveyler sonucunda elde edilmiştir. Patojenisite Testleri A. rabiei izolatlarının Patojenisite Testi Denemelerde Ascochyta rabiei nin sporulasyonu için en uygun ortam olduğu Gowen (1986) tarafından bildirilen Nohut -Unu-Dekstroz-Agar (CSMDA: 40 g nohut unu, 20 g dekstroz, 20 g.

4 agar ve 1 l saf su ) kullanılmıştır. CSMDA üzerinde 22±1 o C de 12 saat aydınlık (yakın ultraviole ışık) 12 saat karanlık periyot içeren inkübasyon odasında 15 gün süreyle geliştirilen Ascochyta rabiei kültürlerinden spor süspansiyonu (5x10 5 spor/ml) hazırlanmıştır. Ayırıcı test çeşitleri olarak ise ILC 1929, ILC 482 ve ILC 3279 çeşitleri kullanılmıştır. Basınçlı pülverizatör kullanılarak hassas nohut bitkileri iyice ıslanıncaya kadar inokule edilmiş kontrol olarak kullanılan bitkilere ise sadece saf su püskürtülmüştür. İnokulasyondan sonra yüksek nem sağlamak amacıyla bitkilerin üzerine nemli şeffaf torba geçirilerek 12 saat aydınlık 12 saat karanlık ve 23±2 o C sıcaklık içeren bitki yetiştirme odasına yerleştirilmiştir. İnokulasyondan 3 gün sonra bitkilerin üzerindeki torbalar çıkarılmış ve yüksek nemli bir ortamdan sonra düşük nemli bir ortamda şoka girmemeleri için bitkilerin üzerine 5 gün boyunca günde 3-4 kez su püskürtülmüştür. İnokulasyondan sonra 3 hafta boyunca birer hafta aralıklar ile gözlemler yapılarak bitkiler Singh et al., 1981 skalasına göre değerlendirilmişler ve Udupa ve Weigand (1997) e göre patotip ayrımları yapılmıştır (Tablo 1). Tablo 1. Patotip ayrım tablosu Çeşitler Patotip 1 Patotip 2 Patotip 3 ILC 1929 H H H ILC 482 D H H ILC 3279 D D H H= hassas D= dayanıklı Fusarium oxysporum İzolatlarının Patojenisite Testi Fusarium oxysporum olarak teşhis edilen izolatların patojenisite testlerinde hassas nohut çeşitleri (JG-62, ILC 482) kullanılarak gerçekleştirilmiş ve inokulumlarının hazırlanması için nohut unu - kum ortamı (45 g kum+ 5 g mısır unu+ 10 ila 15 ml destile su) kullanılmıştır (Nene ve Haware 1980). Bu metoda göre PDA (patates dekstroz agar) ortamında geliştirilen F. oxysporum un misel diskleri ile steril koşullarda inokule edilen erlenmayerler 25±1 0 C sıcaklık ve 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık periyot içeren inkubasyon odasında 15 gün süreyle inkübe edilmiştir. Hazırlanan 50 g lık inokulumlar 0.6 kg toprak içeren saksılara karıştırıldıktan sonra yüzeysel dezenfeksiyona tabii tutulan nohut tohumları ekilmiştir. Bitkiler 14 saat aydınlık 10 saat karanlık periyot ve 25±1 0 C sıcaklık içeren bitki yetiştirme odasında yetiştirilmiştir. Hastalık değerlendirmesi inokulasyondan 3 hafta sonra başlanarak 6 hafta süreyle yapılmıştır. Değerlendirme de akropetal sararma ve nekrozun esas alındığı 0-4 skalası kullanılmıştır (Trapera-Casas and Jimenez-Diaz 1985). 0-4 Skalası 0 = % 0 1 = % = % = % = Ölü Bitki Hassas nohut çeşidinde skala değerine neden olan izolatlar yüksek virulant (YV), skala değerine neden olan izolatlar orta derecede virulant (OV) ve 0-1 değerine neden olan izolatlar ise düşük virulant (DV) veya non patojen olarak değerlendirilmiştir.

5 DNA İzolasyonu DNA izolasyonu için fungus izolatları 100 ml PDB (Potato Dextrose Broth, Difco) ortamı içeren 250 ml lik erlenmayerlerde inkübatörlü orbital shaker (150 rpm) üzerinde (25±1 0 C) 7 gün süreyle geliştirilmiştir. PDB ortamında geliştirilen funguslar miracloth bezi kullanılarak süzülmüş ve sıvı nitrojen içeren porselen havanlarda iyice ezilerek 1.5 ml lik eppendorf tüplere aktarılmıştır. Sonra her tüpe 500 µl % 2 lik CTAB ekstraksiyon bufferı (CTAB: 2 g, 200 mm Tris-HCl ph:8.0, 0.7 M NaCl, 25 mm EDTA) konularak süspanse oluncaya kadar karıştırılmıştır. Daha sonra elde edilen ekstrakt nükleik asitleri parçalamak amacıyla 65 C de 1 saat inkübasyona bırakılmıştır. Bu inkübasyon periyodundan sonra eppendorf tüplere eşit hacimde fenol:kloroform (25:24 v/v, AppliChem Darmstadt, Germany) eklenerek g de 1 saat santrifügasyona (Sigma 3K30) bırakılmıştır. Üstte toplanan sıvının 400 µl si yeni eppendorf tüplere aktarılarak üzerine 25 µl RNase A (10 mg/ml, AppliChem Darmstadt, Germany) ilave edilmiştir. 37 C de yarım saat inkübasyondan sonra 250 µl kloroform:isoamilalkol (24:1 v/v, AppliChem Darmstadt, Germany) eklenerek 15 dakika santrifüj edilmiştir. Üstte toplanan sıvı yeniden temiz eppendorf tüplere alınarak üzerine eşit hacim isopropanol eklenmiştir. Bir saat veya tüm gece -20 C de inkübasyondan sonra 5 dakika santrifüj uygulanarak tüpün dip kısmında toplanan DNA pelleti 100 µl % 70 lik ethanol ile yıkanarak ortam koşullarında kurutulmuştur Fungus İzolatlarının Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Yöntemi ile Analizi RAPD analizi modifiye edilerek Williams et al. (1990) yöntemine göre yapılmıştır. PCR reaksiyonları; mm dntps, 0.32 µm primer, 1.5 mm MgCl 2, 10 mm Tris-HCl ph 8.8, 50 mm KCl, 0.8 % Nonident P40, 0.6 U Taq DNA polimeraz (MBI Fermentas GmbH, Germany) içeren 25 µl lik hacimlerde gerçekleştirilmiştir. DNA amplifikasyonu ise 94 C de 20 saniye, 36 C de 1 dakika, 72 C de 1 dakika 40 döngü ve en son döngüden sonra 72 C de 8 dakika olacak şekilde programlanan thermocyclerda (Techne Progene) gerçekleştirilmiştir. A. rabiei izolatları arasındaki genetik farklılıkları araştırmak için 82 fungus izolatı farklı setlerden seçilen 51 RAPD primeri (Operon Technologies, Alameda, CA, USA) kullanılarak incelenmiştir (Tablo.2) Tablo 2. Ascochyta rabiei izolatlarının analizinde kullanılan primerler. OPB-7 OPD-6 OPD-18 OPG-2 OPG-11 OPG-15 OPG-17 OPG-20 OPH-3 OPH-4 OPH-6 OPH-7 OPH-9 OPH-12 OPH-13 OPJ-2 OPJ-3 OPJ-8 OPJ-10 OPJ-12 OPJ-19 OPM-3 OPM-11 OPM-15 OPM-19 OPM-20 OPN-1 OPN-2 OPN-3 OPN-4 OPN-5 OPN-6 OPN-7 OPN-8 OPN-9 OPN-10 OPN-11 OPN-12 OPN-13 OPN-14 OPN-15 OPO-3 OPP-2 OPR-8 OPT-7 OPO-8 OPP-14 OPR-17 OPT-17 OPZ-2 OPZ-3 OPZ-9 OPZ-10 OPZ-20

6 F. oxysporum izolatları arasındaki genetik farklılığı araştırmak için yapılan RAPD analizinde ise OPK ve OPA primer (Operon Technologies, Alameda, CA, USA) setlerinden 30 farklı oligonükleotid primer kullanılmıştır (Tablo 3). Tablo 3. Fusarium oxysporum izolatlarının analizinde kullanılan primerler Primer Kodu Primer sekansı 5 3 Primer Kodu Primer sekansı 5 3 OPA-1 CAGGCCCTTC OPK-2 GTCTCCGCAA OPA-2 TGCCGAGCTG OPK-3 CCAGCTTAGG OPA-3 AGTCAGCCAC OPK-4 CCGCCCAAAC OPA-4 AATCGGGCTG OPK-5 TCTGTCGAGG OPA-5 AGGGGTCTTG OPK-7 AGCGAGCAAG OPA-6 GGTCCCTGAC OPK-8 GAACACTGGG OPA-7 GAAACGGGTG OPK-9 CCCTACCGAC OPA-8 GTGACGTAGG OPK-10 GTGCAACGTG OPA-9 GGGTAACGCC OPK-11 AATGCCCCAG OPA-12 TCGGCGATAG OPK-12 TGGCCCTCAC OPA-16 AGCCAGCGAA OPK-14 CCCGCTACAC OPA-17 GACCGCTTGT OPK-15 CTCCTGCCAA OPA-18 AGGTGACCGT OPK-16 GAGCGTCGAA OPA-19 CAAACGTCGG OPK-17 CCCAGCTGTG OPK-19 CACAGGCGGA OPK-20 GTGTCGCGAG Agaroz Jel Elektroforezi PCR ürünlerinin görsel hale getirilmesi amacıyla, amplifiye edilen DNA ürünleri % 1.4 lük agaroz jelde elektroforetik olarak ayrılmıştır. Agaroz jelin hazırlanmasında ve elektroforez tankında tampon çözeltisi olarak 1XTAE (40 mm Tris-acetate, 1mM EDTA) tampon çözeltisi kullanılmıştır (Sambrook et al. 1989). Ayrıca tüm çalışmalarda elde edilen bantların molekül ağırlıklarının belirlenmesinde marker olarak GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus (MBI Fermentas GmbH, Germany) kullanılmıştır. Elektroforez işlemi 100 V da 2 saat süreyle gerçekleştirilmiştir. İşlem bittikten sonra agaroz jel ethidium bromide (1 mg/ml) ile boyanarak UV ışık altında incelenmiş ve bio-imaj bilgisayar sistemi (Syngene, Cambridge UK) kullanılarak kaydedilmiştir. Verilerin Analizi ve Değerlendirilmesi Tüm PCR analizleri farklı zamanlarda en az iki kez tekrarlamış ve tekrarlanabilen bantlar değerlendirmeye alınmıştır. Daha sonra tüm izolatlar için primerler tarafından oluşturulan bantlar bir araya getirilmiş ve NTSYS ver (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis) software programına aktarılmıştır (Rohlf 1998). Her primer tarafından oluşturulan belirli moleküler ağırlığa sahip bantlar 0 (yok) ve 1 (var) olarak kodlanmış ve rectangular matriks verisi kullanılarak değerlendirilmiştir. Daha sonra SIMQUAL (Similarity for qualitative data) programı

7 kullanılarak Dice ın metoduna (Sij=2a/(2a+b+c)) göre izolatlar arasındaki benzerlik matriksi oluşturulmuştur. Elde edilen benzerlik katsayısı ve UPGMA (Unweighed Pairgroup Method with Arithmetic Average) yardımıyla dendrogram oluşturularak izolatlar arasındaki genetik akrabalık değerlendirilmiştir (Sneath and Sokal 1973). Yapılan cluster analizinin geçerliliği, benzerlik ve kofenetik matriks değerleri karşılaştırılarak test edilmiştir. İki matriks arasındaki ilişkinin derecesi Mantel testi kullanılarak belirlenmiştir. IV. Analiz ve Bulgular Ascochyta rabiei izolatları arasındaki patojenik farklılıklar Nohutlarda yanıklığa neden olan Ascochyta rabiei nin ülkemizdeki mevcut patotiplerinin belirlenmesinin amaçlandığı bu çalışmada 18 farklı ilden toplam 64 Ascochyta rabiei izolatı kullanılmıştır. Bu izolatlar 3 farklı nohut çeşidi (ILC 1929, ILC 482 ve ILC 3279) kullanılarak patojenisite testine tabi tutulmuştur. Patojenisite testinden sonucunda 38 izolat Patotip 1, 3 izolat Patotip 2, 23 izolat ise Patotip 3 olarak sınıflandırılmıştır. Test izolatların illere göre dağılımı ve patotip grupları Tablo 4 ve 5 de verilmiştir. Tablo 4. Ascochyta rabiei patotiplerinin illere göre dağılımı. İller P1 P2 P3 Adıyaman 6 2 Afyon 1 Amasya 2 2 Ankara 5 4 Antalya 3 Çorum 3 1 Denizli Diyarbakır 3 4 Eskişehir 4 Kahramanmaraş 1 Kayseri 1 1 Kırşehir 2 Tokat 1 Uşak 3 2 Urfa 1 Burdur 1 Sivas 1 Yozgat 1 2 Toplam

8 Tablo 5. Ascochyta rabiei izolatlarının toplandığı iller ve dahil oldukları patotip grupları İzolat Adı Alındığı İl Patotip adı-1 Adıyaman 1 adı-2 Adıyaman 1 adı-3 Adıyaman 1 T3(B) Adıyaman 1 Y5 Adıyaman 1 adı-12 Adıyaman 1 af-1 Afyon 1 ama-3 Amasya 1 ama-2 Amasya 1 ank-17 Ankara 1 ank-10 Ankara 1 ank-14 Ankara 1 ank-3 Ankara 1 ank-18 Ankara 1 ant-1 Antalya 1 ant-3 Antalya 1 Korkuteli 3 Antalya 1 çor-4 Çorum 1 Ayaç 5 Çorum 1 çor-1 Çorum 1 dez-9 Denizli 1 Dez 24 Denizli 1 diy-8 Diyarbakır 1 diy-3 Diyarbakır 1 diy-14 Diyarbakır 1 esk-6 Eskişehir 1 esk-1 Eskişehir 1 esk-5 Eskişehir 1 esk-2 Eskişehir 1 km-2 Kahramanmaraş 1 kay-2 Kayseri 1 kır-4 Kırşehir 1 kır-3 Kırşehir 1 tok-1 Tokat 1 usk-4 Uşak 1 usk-5 Uşak 1 usk-1 Uşak 1 yoz-2 Yozgat 1

9 dez-5 Denizli 2 kay-1 Kayseri 2 urf-1 Urfa 2 adı-8 Adıyaman 3 adı-4 Adıyaman 3 Asç 23 Amasya 3 ama-1 Amasya 3 ank-12 Ankara 3 Ank 6 Ankara 3 ank-11 Ankara 3 ank-7 Ankara 3 bur-1 Burdur 3 çor-3 Çorum 3 Adi 3 Denizli 3 dez-2 Denizli 3 Dez 3 Denizli 3 dez-1 Denizli 3 diy-12 Diyarbakır 3 E4 Diyarbakır 3 diy-11 Diyarbakır 3 diy-6 Diyarbakır 3 siv-1 Sivas 3 usk-2 Uşak 3 usk-3 Uşak 3 yoz-1 Yozgat 3 Akyç 22 Yozgat 3 Ascochyta. rabiei izolatları arasındaki genetik farklılığın RAPD ile analizi A. rabiei izolatları arasındaki genetik. polimorfizimin belirlenmesi amacıyla başlangıçta farklı bölgelerden seçilen 16 izolat toplam 51 RAPD primeri kullanılarak incelenmiştir. Test edilen bu primerlerden 44 tanesi test edilen A. rabiei izolatları arasında monomorfik olması veya değerlendirilebilir temiz bantlar oluşturmaması nedeniyle elemine edilmiştir. Diğer 7 primer ise A. rabiei izolatlarının farklı gruplara ayrılmasını sağlayan faydalı polimorfizimler sağlamıştır (Şekil 1). Bu primerler ile farklı büyüklüklerde toplam 27 lokus amplifiye edilmiştir. Bu lokuslardan 16 tanesi A. rabiei izolatları arasında monomorfik olduğu tespit edilmiştir. A. rabiei izolatlarının cluster analizinde F. oxysporum izolatlarının analizine göre farklı bir yol izlenmiş ve değerlendirmede sadece polimorfik bantlar kullanılmıştır. Bu şekilde 11 polimorfik lokusun değerlendirilmesiyle oluşturulan dendrogram A. rabiei populasyonları arasındaki genetik polimorfizimlerin ortaya çıkarılması için oldukça faydalı bilgiler sağlamıştır. Elde edilen dendrogram ile benzerlik matriksi arasındaki kofenetik korelasyon katsayısı r=0.71 olarak bulunmuştur.

10 UPGMA algoritması kullanılarak oluşturulan dendrogramda ise 81 A. rabiei izolatının 5 ana grup ve 34 genotipe ayrıldığı tespit edilmiştir. Farklı genotiplerde yer alan tüm olası çiftler arasındaki benzerlik katsayısının arasında değiştiği görülmüştür. Ayrıca oluşturulan bu dendrogram ile % 73 benzerlik oranında bu ana grupların alt gruplara ayrıldığı ve gerek gruplar arasında gerekse grup içinde yüksek bir polimorfizim olduğu görülmüştür. (Şekil 2). Grup 1, 2 alt gruba ayrılmış alt grup 1A ın % 70 benzerlik ile Ankara ( Ank-5) ve Adıyaman dan (Adı-9) elde edilen 2 izolattan oluştuğu görülmüştür. Alt grup 1B ise farklı bölgelerden elde edilen 13 izolattan oluşmuş ve bu izolatlar kendi arasında 4 genotipe ayrılmıştır. Bu alt grup içerisinde Ank-17 izolatı hariç diğer izolatlar aynı genotipleri paylaşmışlardır. Grup 2 ise test edilen izolatların yaklaşık % 70 ni barındırmakta olup kendi arasında 3 alt gruba ayrılmıştır. Alt grup 2A farklı bölgelerden elde edilen 15 izolattan oluşmuş ve 7 genotipe ayrılmıştır. Alt grup 2B ise en büyük alt grup olup bu çalışmada test edilen izolatların yaklaşık % 50 sini içerisinde barındırdığı görülmüştür. Bu alt grup içerisinde 6 izolat (Tok-1, Ank-1, Ank-9, Ama-3, Diy-14, Dez-9) tek başlarına ayrı genotipler içerisinde yer alır iken diğer 34 izolatın 6 genotipi paylaştıkları tespit edilmiştir. Alt grup 2C ise yaklaşık % 82 benzerlik ile Ankara (Ank- 13), Denizli (Dez-8) ve Diyarbakır dan ( Diy-15) elde edilen 3 izolattan oluşmuştur. Grup 3 e ait izolatlar 2 alt gruba ayrılmış ve alt grup 3A nın aynı genotipi paylaşan 3 izolatdan (Dez-5, Kır-4, Kay-2) oluştuğu görülmüştür. Alt grup 3B de % 86 benzerlik ile Ankara (Ank-6 ve18) ve Urfa (Urf-1) illerinden elde edilen 3 izolattan oluşmuştur. Dez-1 ve Ank-3 izolatlarının ise dendrogramda tek başlarına ayrı RAPD gruplarını (Grup 4 ve 5) oluşturduğu tespit edilmiştir. Test edilen izolatların dendrogramdaki dağılımları ile coğrafik dağılım ve patojenik varyasyonları karşılaştırıldığında ise herhangi bir ilişki tespit edilememiştir. Genelde aynı ilden elde edilen izolatlar farklı genotip gruplarında yer alır iken farklı bölgelerden elde edilen izolatlar arasında yüksek bir benzerlik olduğu ve aynı genotip içerisinde yer aldıkları görülmüştür.

11 Şekil 1. Ascochyta rabiei izolatlarının OPG-2 (a), OPJ-10 (b) ve OPJ-19 (c) primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri.

12 V IV III I II IIIA IIIB IA IB IIA IIB IIC Patotip ank-5 adı-9 çor-1 1 esk-1 1 ama-1 3 diy-3 1 esk-5 1 usk-2 3 diy-1 adı-11 dez-2 3 siv-1 3 ant-1 1 kay-1 2 ank-17 1 diy-7 kır-1 yoz-1 3 çor-3 3 ank-10 1 ank-15 adı-2 1 diy-8 1 usk-7 km-1 ank-4 ank-7 3 esk-6 1 bur-2 dez-6 adı-3 1 af-1 1 usk-5 1 adı-4 3 dez-7 km-2 1 adı-12 1 çor-4 1 adı-10 tok-1 1 diy-2 diy-12 3 yoz-2 1 ank-12 3 adı-1 1 adı-8 diy-6 3 ant-3 1 esk-2 1 ank-11 3 adı-7 1 diy-13 ank-16 ama-5 çor-5 ank-14 1 usk-1 1 bur-1 1 usk-4 1 ank-1 ama-3 1 kır-3 1 diy-10 adı-13 ama-2 1 diy-9 diy-11 3 diy-14 1 ank-9 dez-9 1 ank-13 dez-8 diy-15 dez-5 2 kır-4 1 kay-2 1 ank-18 1 ank-6 3 urf-1 2 dez-1 3 ank Coefficient Şekil 2. Ascochyta rabiei izolatlarından elde edilen RAPD verisinin UPGMA analizi ile oluşturulan dendrogram.

13 Fusarium oxysporum izolatları arasındaki patojenik farklılıklar Nohutlarda kök çürüklüğü ve solgunluğa sebep olan Fusarium oxysporum izolatları arasındaki genetik farklılığı tespit etmek amacıyla yapılan bu çalışmada Türkiye deki toplam nohut ekim alanının yaklaşık % 70 ni temsil eden 15 farklı ilde survey yapılmıştır. Bu survey sonucunda 104 adet Fusarium oxysporum izolatı tek spor izolasyonu yapılarak saflaştırılmıştır. Hastalık etmenlerinin survey yapılan illere göre dağılımı Tablo 6 da verilmiştir. Türkiye deki önemli nohut ekim alanlarından elde edilen ve klasik yöntemlerle teşhisi yapılan 104 F. oxysporum izolatının patojenisite testi Nene and Haware (1980) nin toprak inokulasyon metodu esas alınarak hassas nohut çeşitleriyle yapılmıştır. Patojenisite testleri sonucunda hassas nohut çeşidinin skala değeri almasına neden olan 17 izolat yüksek virulant (YV), skala değerine neden olan 75 izolat orta derecede virulant (OV) ve değerine neden olan 12 izolat düşük virulant (DV) veya non patojen olarak değerlendirilmiştir. Bu izolatların virülenslikleri ve illere göre dağılımı Tablo 7 de verilmiştir. Tablo 6. Nohutlarda kök çürüklüğü ve solgunluğa neden olan Fusarium oxysporum izolatlarının illere göre dağılımı. Survey yapılan iller Adıyaman Amasya Ankara Antalya Burdur Denizli Diyarbakır Eskişehir K. Maraş Kayseri Kırşehir Konya Kütahya Tokat Uşak Diğer Toplam izolat Sayısı İzolat sayısı Tablo 7. F. oxysporum izolatlarının toplandığı iller ve virulenslik dereceleri. İzolat ismi a Alındığı il Tür Virulenslik derecesi Adı-1 Adıyaman-Atatürk barajı F. oxysporum YV Ama-1 Amasya F. oxysporum OV Ama-2 Amasya F. oxysporum OV Ank-1 Ankara-Ayaş F. oxysporum OV Ank-3 Ankara-Akyurt F. oxysporum DV Ank-4 Ankara-Akyurt F. oxysporum YV Ank-5 Ankara-Akyurt F. oxysporum OV Ank-6 Ankara-Bala F. oxysporum DV Ank-7 Ankara-Bölüm F. oxysporum OV Ank-8 Ankara-Çubuk F. oxysporum OV Ank-9 Ankara-Çubuk F. oxysporum YV Ank-10 Ankara-Güdül F. oxysporum OV Ank-11 Ankara-Güdül F. oxysporum OV Ank-12 Ankara-Güdül F. oxysporum OV Ank-13 Ankara-Haymana F. oxysporum YV Ank-14 Ankara-Haymana F. oxysporum DV Ank-15 Ankara-Haymana F. oxysporum OV Ank-16 Ankara-Haymana F. oxysporum OV Ank-17 Ankara-Polatlı F. oxysporum OV

14 Ank-18 Ankara-Sünlü çıkışı F. oxysporum OV Ank-19 Ankara-Şereflikoçhisar F. oxysporum OV Ank-20 Ankara-Şereflikoçhisar F. oxysporum OV Ank-21 Ankara-Şereflikoçhisar F. oxysporum OV Ank-22 Ankara-Merkez F. oxysporum DV Ank-32 Ankara- Merkez F. oxysporum OV Bur-1 Burdur F. oxysporum OV Bur-2 Burdur F. oxysporum OV Bur-3 Burdur F. oxysporum OV Bur-4 Burdur F. oxysporum OV Bur-5 Burdur F. oxysporum OV Bur-6 Burdur F. oxysporum OV Bur-7 Burdur F. oxysporum OV Dez-1 Denizli-Baklan F. oxysporum YV Dez-2 Denizli-Çameli F. oxysporum OV Dez-3 Denizli-Çameli F. oxysporum OV Dez-4 Denizli-Çameli F. oxysporum OV Dez-5 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-6 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-7 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-8 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-9 Denizli-Kale F. oxysporum OV Dez-10 Denizli-Tavas F. oxysporum OV Dez-11 Denizli-Tavas F. oxysporum OV Dez-12 Denizli-Tavas F. oxysporum OV Dez-13 Denizli F. oxysporum OV Dez-14 Denizli F. oxysporum YV Diyar-1 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum DV Diyar-2 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum OV Diyar-3 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum DV Diyar-4 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum OV Diyar-5 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum OV Diyar-6 Diyarbakır-Çınar F. oxysporum OV Diyar-8 Diyarbakır-Ergani F. oxysporum OV Diyar-9 Diyarbakır-Hazro F. oxysporum YV Diyar-10 Diyarbakır-Silvan F. oxysporum OV Diyar-12 Diyarbakır-Siverek F. oxysporum OV Diyar-13 Diyarbakır-Siverek F. oxysporum DV Diyar-15 Diyarbakır-Siverek F. oxysporum OV Diyar-16 Diyarbakır- Merkez F. oxysporum OV Esk-2 Eskişehir-Mihalıççık F. oxysporum OV Esk-3 Eskişehir-Mihalıcçık F. oxysporum YV Esk-4 Eskişehir-Mihalıcçık F. oxysporum OV Esk-5 Eskişehir-Merkez F. oxysporum DV

15 Esk-6 Eskişehir-Seyitgazi F. oxysporum OV Esk-7 Eskişehir-Seyitgazi F. oxysporum OV Esk-8 Eskişehir-Seyitgazi F. oxysporum YV Km-1 K.Maraş-Afşin F. oxysporum DV Km-2 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-3 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-4 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-6 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-7 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-8 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-9 K.Maraş-Afşin F. oxysporum OV Km-10 K.Maraş-Çardak F. oxysporum YV Km-11 K.Maraş-Çardak F. oxysporum DV Km-13 K.Maraş-Pazarçık F. oxysporum OV Km-14 K.Maraş-Pazarçık F. oxysporum OV Km-15 K.Maraş-Pazarçık F. oxysporum OV Km-16 K.Maraş-Pazarçık F. oxysporum YV Km-17 K.Maraş-Pazarçık F. oxysporum OV Km-18 K.Maraş-Pazarçık F. oxysporum OV Km-19 K.Maraş-Pazarçık F. oxysporum YV Kır-1 Kırşehir F. oxysporum DV Kır-2 Kırşehir F. oxysporum OV Kon-1 Konya F. oxysporum OV Kon-3 Konya F. oxysporum YV Küt-1 Kütahya-Gediz F. oxysporum OV Küt-2 Kütahya-Gediz F. oxysporum OV Küt-3 Kütahya-Gediz F. oxysporum OV Küt 4 Kütahya-Gediz F. oxysporum OV Tok-1 Tokat F. oxysporum OV Tok-2 Tokat F. oxysporum OV Tok-3 Tokat F. oxysporum OV Uşk-1 Uşak-Karahallı F. oxysporum YV Uşk-2 Uşak-Sivaslı F. oxysporum OV Uşk-3 Uşak-Merkez F. oxysporum YV Uşk-4 Uşak-Banaz F. oxysporum YV Uşk-5 Uşak-Banaz F. oxysporum OV Uşk-6 Uşak-Sivaslı F. oxysporum OV Ç.I.beyaz Diğer F. oxysporum OV Ç 12 Diğer F. oxysporum DV Ova1 Diğer F. oxysporum YV Gergen 1 Diğer F. oxysporum OV a İzolatlar toplandıkları illerin isimleri kısaltılarak kodlanmıştır; Adıyaman (Adı), Amasya (Ama), Ankara (Ank), Antalya (Ant), Burdur (Bur), Denizli (Dez), Diyarbakır (Diyar), Eskişehir (Esk), Kahraman Maraş (Km), Kayseri (Kay), Kırşehir (Kır), Konya (Kon), Kütahya (Küt), Tokat (Tok), Uşak (Uşk).

16 F. oxysporum izolatları arasındaki genetik farklılığın RAPD ile analizi Fungus izolatlarının ayırımında kullanılacak primerleri seçmek için ise belirli sayıda izolat alınarak tüm primerlerle test edilmiştir. Bu primerlerden PCR amplifikasyonlarında değerlendirilebilir bantlar veren primerler seçilerek diğer örneklerin test edilmesinde kullanılmıştır. Buna karşın amplifikasyon ürünü oluşturmayan veya zayıf amplifikasyon ürünü oluşturan primerler ise elemine edilmiştir. Nohutlarda solgunluk ve sararma simptomlarına sebep olan Fusarium oxysporum izolatları arasındaki genetik farklılığı ortaya koymak için elde edilen 104 izolattan coğrafik bölge ve virulenslikleri dikkate alınarak seçilen 67 izolat ve referans olarak kullanılan 7 izolat (KA1, KC7, A4, A6, HAY5, KC9 1, KC6 2 ) olmak üzere toplam 74 izolat moleküler karakterizasyon için kullanılmıştır. Bu amaçla yapılan RAPD analizlerinde Operon firmasına ait OPK ve OPA kitlerine ait 30 primer kullanılmıştır (Tablo 6). Bu primerlerden OPA-6 primeri bu izolatlar ile herhangi bir polimorfizim oluşturmamıştır. OPA-16, OPA-17, OPK-2, OPK-3 ve OPK-15 primerleri ise değerlendirilebilir bantlar oluşturmadıkları için kullanılmamıştır. Diğer 24 primer ise F. oxysporum izolatları arasında 0.2 (OPK-7) 3.2 kb (OPK-10, OPK-19) arasında değişen büyüklüklerde bantlar oluşturmuştur. RAPD analizi sonucunda F. oxysporum izolatlarından toplam 205 adet (8.54 fragment / primer) fragment amplifiye edilmiştir. Bunlardan 200 tanesinin (8.3 polimorfik marker / primer) F. oxysporum izolatları arasında polimorfik, 5 fragmentin ise monomorfik olduğu tespit edilmiştir. Elde edilen DNA fragmentlerindeki polimorfizim seviyesi ise % 97.5 olarak bulunmuştur (polimorfik band sayısı / toplam band sayısı x 100). Kullanılan primerler ile amplifiye edilen fragment sayısı ise 4 (OPK-4, OPK-9, OPK-10) 13 (OPA-3, OPK-7, OPK-8, OPK-12) arasında değişmiştir. F. oxysporum izolatları arasındaki intraspesifik farklılıkları araştırmak için OPK-12, OPA-9 ve OPA-4 primerlerinin oldukça faydalı olduğu görülmüştür (Şekil 2). Bu primerler sırasıyla izolatlar arasında polimorfik olan 13, 10 ve 8 fragmentin amplifiye olmasını sağlamıştır. UPGMA algoritması kullanılarak oluşturulan dendrogramda ise farklı genotiplerde yer alan tüm olası çiftler arasındaki benzerlik katsayısının arasında değiştiği görülmüştür. En yüksek benzerlik oranı Diyar-3 ile Diyar 4 (0.986), Ank-10 ile Ank 11 (0.985) ve Kon-1 ile Diyar-13 (0.987) izolatları arasında en düşük benzerlik ise Esk-7 ile Dez-8 (0.216) ve Küt-4 ile Km-19 (0.218) izolatları arasında tespit edilmiştir. Dendrogramdan hesaplanan kofenetik matriks değeri ile benzerlik indeksinin karşılaştırılması sonucunda elde edilen matriks korelasyonu ise oldukça yüksek olup r= olarak bulunmuştur. Oluşturulan bu dendrogram ile F. oxysporum izolatları 3 ana gruba ayrılmış ve gerek gruplar arasında gerekse grup içerisinde yüksek bir polimorfizimin olduğu görülmüştür (Şekil 4). Grup 1 Amasya ili hariç diğer bölgelerden elde edilen toplam 41 izolattan (% 55.4) oluşmakta olup bu grup içerisindeki benzerlik indeksinin (Km-7 ile Diyar-15) (Kon-1 ile Diyar-13) arasında değiştiği görülmüştür. Diyar-6, Diyar-15 ve Küt- 4 izolatları ise bu gruba yüksek oranda benzerlik göstermekle beraber bu grup içerisinde ikinci bir alt grubu oluşturmuştur. OPA-4 primeri ile bu grubun tüm üyelerinden yaklaşık 1074 bp büyüklüğünde bir fragment amplifiye edilerek diğer gruplardan ayrılması sağlamıştır.grup 2 Ankara, Amasya, Kütahya, Denizli, K.Maraş ve Diyarbakır illerini temsil eden izolatlardan oluşmaktadır ve bunlar kendi arasında 4 alt gruba ayrılmıştır. Birinci alt grup 15 izolattan oluşmakta olup bu alt grup içerisindeki benzerlik indeksinin 0.65 (A6 ile Ank-5) (Diyar-3 ile Diyar-4) arasında değiştiği görülmüştür. Küt-2, Diyar-8 ve Ama-1 izolatları ise bu grup içerisinde kendi başlarına birer alt grubu oluşturmuşlardır. Bu grupta OPA-9 primeri 700 bp büyüklüğünde bir polimorfik markerı amplifiye etmiştir.grup 3 Ankara, Eskişehir, Tokat, Uşak, Burdur, Denizli, K. Maraş illerinden elde edilen 15 izolattan oluşmakta olup kendi içerisinde 4 alt gruba ayrılmıştır.

17 Bu izolatlardan 10 tanesi birinci grubu oluşturur iken Kc9 izolatı tek başına ikinci grubu oluşturmuştur. Esk-4, Dez-8 ve Km-19 izolatları ise ortalama 0.79 benzerlik indeksi ile üçüncü alt grubu oluşturmuşlardır. Ank-13 izolatı ise tek başına dördüncü alt grubu oluşturmuştur. F. oxysporum içerisinde tespit edilen gruplar içerisinde en fazla benzerlik gösteren grup 3 de ise OPA-9 primeri 1390 bp, OPA-4 primeri ise yaklaşık 1617 bp büyüklüğünde polimorfik markerlar sağlamıştır RAPD analizi ile F. oxysporum izolatları üç gruba ayrılmasına rağmen izolatların bölgelere göre dağılımı ve dendrogramdaki gruplanmaları arasında bir ilişki tespit edilememiştir. Şekil 3 Fusarium oxysporum izolatlarının OPK-12 (a), OPA-9 (b) ve OPA-4 (c) primerleri ile amplifikasyonu sonucu elde edilen RAPD profilleri.

18 Tok-1 Km-6 Dez-5 Esk-8 Diyar-16 Dez-1 Dez-13 Km-9 Küt-1 Dez-6 Esk-6 Ank-9 Kon-1 Diyar-13 Ank-7 Dez-3 Ank-21 a4 Adı-1 Esk-3 Km-2 Uşk-5 Ank-6 Kır-1 Km-4 Ank-16 hay5 Esk-5 kc7 Ank-3 Bur-5 Dez-11 Ank-17 Esk-7 Km-7 Dez-4 Bur-3 Ank-20 Diyar-6 Diyar-15 Küt-4 Ank-12 Ank-11 Ank-10 Dez-12 Km-14 ka1 Diyar-3 Diyar-4 Ank-4 Km-1 Km-13 Ank-5 kc6 a6 Diyar-9 Küt-2 Diyar-8 Ama-1 Uşk-6 ova-1 gergen Bur-6 Uşk-3 Tok-2 Bur-2 Esk-2 Km-16 Dez-14 kc9 Esk-4 Dez-8 Km-19 Ank-13 Grup 1 Grup Coefficient Şekil 4. Fusarium oxysporum izolatlarından elde edilen RAPD verisinin UPGMA analizi ile oluşturulan dendrogram.

19 V. Sonuç ve Öneriler Bitkilerde hastalığa sebep olan funguslar arasındaki genetik ilişkinin incelenmesi ve hastalıktan esas sorumlu olan fungus türlerinin yakın olarak ilişkili fungus türlerinden ve non patojenlerden ayrılmasını sağlayan genetik markerların belirlenmesinin hastalık etmenlerinin teşhisinde büyük öneme sahip olacağı bilinmektedir. Bu nedenle farklı organizmalardaki genetik farklılıkları ortaya koymak amacıyla birçok teknik geliştirilmiştir. Organizmaların genetik yapılarındaki farklılıkları ortaya koyan bu polimorfizimler ise organizmaların biyolojik aktiviteleri ve patojenisitelerindeki farklılıkları ortaya koyabilmektedir (Hernandez et al. 1999). Bu amaçla RAPD tekniği patojen populasyonlarındaki genetik polimorfizimi ortaya koymak, konukçu spesifitesi ve coğrafik dağılımı incelemek için değişik araştırıcılar tarafından farklı organizmalarda başarıyla uygulanmıştır. Bu çalışmada ülkemizdeki önemli nohut ekim alanlarında görülen patojenler arasındaki genetik farklılığın değerlendirilmesi için RAPD tekniğinin kullanıla birliği araştırılmıştır. Asccochyta rabei ülkemizde ve dünyada nohut ekim alanlarında görülen en önemli fungal hastalıklardan biridir. A. rabiei nin yüksek derecede patojenik çeşitlilik göstermesi nedeniyle yeni patotipler ortaya çıkabilmekte ve nohut çeşitlerinin hastalığa dayanıklılık durumu zaman içerisinde değişkenlik gösterebilmektedir. Bu sebeple patojen populasyonundaki patojenik ve genetik farklılıkların ortaya çıkarılması bu hastalık etmenin sebep olduğu kayıpların azaltılması ve tarla koşullarında dayanıklı nohut çeşitlerinin geliştirilmesi için oldukça önemlidir. Bununla birlikte ülkemizde bu konu ile ilgili çok fazla çalışma bulunmamaktır. Daha önce Ege Bölgesinden toplanan 25 A. rabiei izolatının patojenik farklılığını inceleyen Açıkgöz (1983) izolatlar arasında 7 ayrı grubun olduğunu bildirmiş, ancak ırklarla ilgili bir çalışma yapmamıştır. Dolar ve Gürcan (1992) ise 6 ırktan 1, 4 ve 6 no. lu ırkları Türkiye de saptamışlardır. Bu çalışmada da Türkiye deki nohut ekim alanlarında en yaygın patotipin Patotip 1 olduğu ve bunu Patotip 3 ve 2 nin takip ettiği tespit edilmiştir. Bu sebeple bundan sonra yapılacak ıslah çalışmalarında bu patotip dağılımının göz önüne alınması ve farklı illere farklı patotiplerin girmesinin engellenmesi için gerekli tedbirlerin alınması oldukça önem kazanmaktadır. Özelikle en virulent paatotip olan Patotip 3 ün bulunmadığı bölgelere bu patotip girişinin engellenmesinin oldukça önemli olduğu görülmektedir. A. rabiei izolatları arasındaki genetik farklılıklar incelendiğinde ise bu izolatlar arasında 5 farklı RAPD grubunun olduğu ve Grup 2A nın test edilen izolatların yaklaşık % 50 sini kapsadığı tespit edilmiştir. Ayrıca dendrogramda izolat dağılışına bakıldığında birbirine oldukça yakın yerlerden elde edilen izolatların farklı gruplarda yer aldığı buna karşın farklı bölgelerden elde edilen izolatların birbirine çok benzer olduğu hatta aynı genotip içerisinde yer aldığı görülmüştür. Farklı illeri temsil eden izolatlar arasında görülen bu yüksek benzerlik bu patojenin yayılmasında enfekteli tohumların oldukça önemli rol oynadığını göstermektedir. Ayrıca fungusun askosporlarının çok uzak mesafelere taşınabildiği ve bu sexual rekombinasyonun patojendeki genetik farklılıkların ortaya çıkmasında etkin rol oynadığı da bilinmektedir. Bununla birlikte izolatların dendrogramdaki dağılımları ve patojenik farklıkları arasında bir ilişki tespit edilememiştir. Bu sebeple daha fazla sayıda primerle veya daha hassas teknikler kullanılarak bu patojendeki genetik varyasyonun incelenmesinin faydalı olacağı düşünülmüştür. Benzer şekilde A. rabiei nin 30 İtalyan izolatını RAPD tekniği ile incelelyen Fischer et al. (1995) bu izolatların cluster analizi ve patojenisiteleri arasında bir ilişki bulamamıştır. Navas-Cortes et al. (1998) farklı coğrafik bölgelerden elde edilen A. rabiei izolatlarını arasında oldukça düşük bir seviyede genetik faklılığın olduğunu belirtmiş ve bu izolatları % 7 farklılık ile 10 RAPD grubuna ayırabilmiştir. RAPDs ve oligonucleotide fingerprinting tekniklerini kullanan Jamil et al. (2000) ise A. rabiei nin Pakistan izolatlarını 0.3 genetik uzaklık ile 6 farklı gruba ve 46 genotipe ayırmıştır. Santra et al. (2001) ise 37 Hindistan izolatını coğrafik orjinlerine göre farklı gruba

20 ayırmış ancak bu izolatların patojenisiteleri ve cluster analizi arasında herhangi bir ilişki tespit edememiştir. Fusarium cinsi kültür koşullarına bağlı olarak yüksek derece değişken olan ve morfolojik kriterlere dayanılarak bir araya getirilen mitosporik bir fungus topluluğudur (Yoder and Christianson 1998). Bu sebeple morfolojik ve kültürel özelliklere dayanılarak yapılan Fusarium türlerinin teşhisi uzman taksonomistlerce yapılsa bile her zaman güvenilir sonuçlar vermemekte ve genetik olarak farklı olan türler aynı tür olarak sınıflandırılabilmektedir. Bu çalışmada da morfolojik kriterlere dayanılarak bazı fungus izolatlarının teşhisleri mutasyonlar, kültür aktarmaları, ortam koşulları gibi farklı sebeplerden dolayı yapılamamıştır. Ancak morfolojik özelliklere dayanılarak kesin teşhisleri yapılamayan izolatların moleküler yöntemlerle kesin olarak türleri belirlenebilmiş ve bu izolatların oluşturulan dendrogramda ufak farklılıklarla beraber benzer dağılım gösterdikleri tespit edilmiştir. Daha önce F. semitectum olmasından şüphelenilen Kon-3 izolatının Fusarium oxysporum olduğu tespit edilmiştir. Yine teşhisleri tam olarak yapılamayan Km-11 ve Tok-3 izolatları dendrogramda F. oxysporum izolatları ile birlikte dağılım göstermişlerdir. Fusarium oxysporum f.sp. ciceris ülkemizde ve dünyadaki nohut ekim alanlarında görülen önemli bir hastalıktır. Nohutun en önemli kök patojeni olarak kabul edilen F. oxysporum izolatları bu çalışma ile üç farklı gruba ayrılmış ve incelenen primerlerden bazılarının bu izolat populasyonlarındaki genetik varyasyonun ortaya konulması için oldukça faydalı bilgiler sağladığı görülmüştür. RAPD analizi ile gerek gruplar arasında gerekse gruplar içerisinde yüksek bir polimorfizim olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca Fusarium oxysporum izolatları RAPD analizi ile kesin olarak diğer nohut kök patojenlerinden ayrılabilmiştir. Tek bir vejetatif uyum grup içerisinde yüksek bir genetik benzerlik paylaşmalarına rağmen Fusarium oxysporum f.sp. ciceris içerisinde farklı ırkların bulunması bu izolatların birbirinin klonu olabileceğini veya ortak bir soydan gelmiş olabileceklerini göstermektedir (Leslie 1993, Jimenez-Gasco et al. 2001). Fusarium oxysporum f.sp. ciceris in ırklarının serolojik ve elektroforetik değişkenliğini inceleyen Desai et al. (1992) bu ırkların yakın bir antijenik ilişki gösterdiğini ve ortak bir isoenzim içeriğini paylaştıklarını, Perez-Artes et al. (1995) ise mitokondrial DNA in RFLP analizinde ayni restriksiyon profilini gösterdiklerini ifade etmişlerdir. Jimenez-Gasco et al. (2002) Fusarium oxysporum f.sp. ciceris in EF1α (Elongation factor), β-tubulin, histone 3, actin ve calmodulin gen sekanslarının aynı olmasından dolayı bu patojenin monofiletik orijinli olduğunu belirtmişlerdir. Zamani et al. (2004) nohutta vasküler solgunluğa sebep olan F. oxysporum un 15 izolatını vejetatif uyum, patojenisite ve RAPD analizi bakımından karşılaştırdıkları çalışmalarında patojenisite ve vejetatif uyum testi ile bu izolatları üç farklı gruba ayırmışlardır. Oniki primer kullanarak yaptıkları RAPD analizinde ise Fusarium oxysporum izolatları arasında yüksek bir genetik varyasyonun olduğunu tespit etmişlerdir. Ancak RAPD analizi ile elde edilen dağılım ve diğer iki analiz arasında herhangi bir ilişki bulamamışlardır. Fusarium oxysporum izolatlarını koloni büyüklüğü, enzim aktivitesi ve RAPD analizi ile karşılaştıran Motallebi et al. (2002) yüksek virulensliğe sahip izolatların aynı enzim aktivitesine ve daha büyük kolonilere sahip olduğunu bildirmişlerdir. RAPD analizi ile de yüksek virulensliğe sahip izolatlar düşük virulenslikteki izolatlardan ayrı olarak gruplandırılmıştır. Meksika nın farklı bölgelerinden elde edilen 41 Fusarium oxysporum f.sp. ciceris izolatını RAPD analizi ile inceleyen Luna-Paez et al. (2003) Dice ın benzerlik katsayısını kullanarak yaptıkları UPGMA analizi ile bu 41 izolatı 7 farklı gruba ayırmışlardır. Kelly et al. (1994) büyüklükleri bp arasında değişen üç primer ile gerçekleştirdiği RAPD analizi ile 63 Fusarium oxysporum f.sp. ciceris ve 11 farklı fungus izolatını birbirinden ayırmışlardır. Elde edilen RAPD verisi ile yapılan UPGMA analizi ile Fusarium oxysporum f.sp. ciceris izolatlarını sararma ve solgunluk sendromuna sebep olmalarına göre iki farklı gruba ayırmışlardır. Bunun yanı sıra F. oxysporum ve F. solani izolatları arasındaki benzerlik oranının % arasında değiştiğini tespit

21 etmişlerdir. Tüm dünyada nohutlarda hastalığa sebep olan bu patojenlerle mücadele yöntemi olarak dayanıklı nohut çeşitlerinin geliştirilmesi önerilmektedir. Ancak patojenlerin genetik yapısında görülen mutasyon ve rekombinasyonlar dayanıklılıkta kırılmalara sebep olmaktadır. Ayrıca dayanıklılığın bölgesel olarak değişkenlik göstermesi nedeniyle ıslah materyallerinin farklı üretim bölgelerinde test edilmesi gerekmektedir. Bu moleküler tekniklerle patojenlerdeki populasyon genetiğinin incelenerek bölgelere göre intra ve interspesifik varyasyonun tespit edilmesi; farklı genetik yapıya sahip patojenlerin farklı üretim bölgelerine girmesinin engellenmesi ve hassas çeşitlerin ekilerek belirli bir alanda inokulum birikmesinin önüne geçilmesine olanak sağlayacaktır. Yapılan bu çalışma ile elde edilen sonuçların klasik yöntemlerde karşılaşılan problemleri elemine ederek patojenlerin direkt olarak daha hızlı ve doğu bir şekilde tespitini sağlayan metotların geliştirilmesinde, populasyon yapısındaki değişikliklerin incelenerek bölgelere göre dayanıklı çeşitlerin belirlenmesinde ve böylelikle hastalıklara karşı entegre mücadele yöntemlerinin daha etkili olarak uygulanmasında araştırmacılara faydalı olacağı düşünülmektedir. VI. Kaynaklar Açıkgöz, N Nohut Antraknozu Ascochyta rabiei (Pass.) Labr. nin Dayanıklılık Kaynakları ve Dayanıklılığın Kalıtımı Üzerinde Araştırmalar. No:29, Menemen, İzmir. Desai, S., Nene, Y.L., Jambunathan, R., Reddy, R.A.G Races of Fusarium oxysporum causing wilt in chickpea: biochemical variability. Indian Phytopathology, 45 (1), Demirci, E., Eken, C. and Kantar F Pathogenity wilt and root rot pathogens of chickpea cu. Aziziye-94. Journal of Turkish Phytopathology, Vol. 28: Dolar, F.S. and Gürcan, A Pathogenic Variability and Race Apperance of Ascochyta rabiei (Pass.) Labr. in Turkey. J. Turk. Phythopath. 21: Dolar, F.S evaluation of some chickpea cultivars for resistance to Ascochyta rabiei (Pass.) Labr., Fusarium oxysporum and Fusarium solani in Türkiye. Journal of Turkish Phytopathology, 24: Dolar, F.S Determination of chickpea diseases in Ankara Turkey. International Chickpea and Pigeonpea Newsletter No:3, Fischer C., Porta-Puglia A., Barz W., RAPD analysis of pathogenic variability in Ascochyta rabiei. Journal of Phytopathology 143: Gowen, S. R., Investigation into Variability in Ascochyta rabiei and Resistance to the Disease in Chickpea. Report of Project R 3712 Funded by the Overseas Development Administration, Eland House, London and The International Center for Agricultural Research in the Dry Areas., Reading, U. K. 25 pp. Haware, M.P., Nene, Y.L., Piondir, R.P.S. and Narayana Rao J., Screnning of world chickpea germplasm for resistance to Fusarium wilt. Field Crops Research 30: Hernandez, J.F., Posada, M.A. and Arbelaez, G Identification of molecular markers of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi by RAPD. Proc. of the Int. Symp. on cut flowers in the Tropics,

22 Jamil F.F., Sarwar N., Sarwar M., Khan J.A., Geistlinger J., Kahl G., Genetic and pathogenic diversity within Ascochyta rabiei (Pass.) Lab. Populations in Pakistan causing blight of chickpea (Cicer arietinum L.). Physiological and Molecular Plant Pathology 57: Jimenez-Gasco, M., Perez-Artes, E., Jimenez-Diaz, R.M Identification of pathogenic races 0, 1 B/C, 5, and 6 of Fusarium oxysporum f.sp. ciceris with random amplified polymorphic DNA (RAPD). Eur. J. Plant Pathol., 107, Jimenez-Gasco, M., Milgroom, M.G. and Jimenez-Diaz, R.M Gene genealogies support Fusarium oxysporum f.sp. ciceris as a monophyletic group. Plant Pathol., 51, Kaiser, W. J., Factors Affecting Growth, Sporulation, Pathogenicity, and Survival of Ascochyta rabiei. Mycologia. 65: Kaiser, W.J., Alcala-Jimenaz, A.R., Hervas-Vargas, A., Trapero-Casas, J.L. and Jimenaz-Diaz, R.M Screnning of wild Cicer species for resistance to race 0 and 5 of Fusarium oxysporum f.sp. ciceris. Plant Disease, 78: Karahan, O., Nohut Antraknozu nun [Ascochyta rabiei (Pass.) Labr.] Mücadele Metodunun Tesbiti Üzerinde Araştırmalar. Bitki Koruma Bülteni. 8(2): Kelly, A., Alcala-Jimenez, A.R., Bainbridge, B.W., Heale, J.B., Perez-Artes, E. and Jimenez- Diaz, R.M Use of Genetic Fingerprinting and Random Amplified Polymorphic DNA to Characterize Pathotypes of Fusarium oxysporum f.sp. ciceris Infecting Chickpea. Phytopathology, 84, Leslie, J.F Fungal vegetative compatibility. Annual Review of Phytopathology, 31, Luna-Paez, A., Valadez-Moctezuma, E., Silva-Rojas, H.V. and Marban-Mendoza, N Genetic variability of Fusarium oxysporum f.sp. ciceris strains in Mexica using PCR- RAPD. Latin American Association of Plant Pathology, and Mexican Society for Plant Pathology April 6-11, meeting abstracts South Padre Island, Texas. Maden, S., Transmission of seed-borne infections of Ascochyta rabiei (Pass.)Labr. to seedlings and its control. J. Turk. Phytopath., 12 : Motallebi, M., Zamani, M.R., Jazayeri, O., Harighi, M.J Use of RAPD, enzyme activity staining, and colony size to differentiate phytopathogenic Fusarium oxysporum isolates from Iran. Brezilian Journal of Microbiology, 33, Navas-Cortes J.A., Perez-Artes E., Jimenez-Diaz R.M., Llobell A., Bainbridge B.W., Heale, J.B., Mating type, pathotype and RAPDs analysis in Didymella rabiei, the agent of ascochyta blight of chickpea. Phytoparasitica 26: Nene, Y.L. and Haware, M.P Screening chickpea for resistance to wilt. Plant Dis., 66, Nene, Y.L. and Reedy, M.V Chickpea diseases and their control. In: M.C. Saxena and K.B. Singh (eds) The Chickpea. CAB International Oxon, UK. pp Perez-Artes, E., Roncero, M.I.G. and Diaz, R.M.J Restriction fragment length polymorphism analysis of the mitochondrial DNA of Fusarium oxysporum f.sp. ciceris. J. Phytopathol., 143,

23 Rohlf, F.I NTSYS-pc. Numerical taxonomy and multivariate analysis system, Version 2.0. Applied Biostatistics, New York, USA. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T Molecular cloning: A Laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Santra D.K., Singh G., Kaiser W.J., Gupta V.S., Ranjekar P.K., Muehlbauer F.J., Molecular analysis of Ascochyta rabiei (Pass.) Labr., the pathogen of Ascochyta blight in chickpea. Theoretical and Applied Genetics 102: Singh, K.B.; Hawtin, G. C.; Nene Y.L. and Reddy, M.V Resistance in Chickpeas to Ascochyta rabiei. Plant Disease 65: Singh, K.B. and Reddy, M.V Patterns of resistance and susceptibility to races of Ascochyta rabiei among germ plasm accessions and breeding lines of chickpea. Plant Dis., 74; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R Numerical Taxonomy. Freeman. San Francisco. pp. 573 Trapero-Casas, A. and Jimenez-Diaz, R.M Fungal wilt and root rot diseases of chickpea in Southern Spain. Phytopathology, 75, Udupa S.M., Weigand F., Saxena, M.C, and Kahl, G Genotyping with microsatellite and RAPD markers resolves pathotype diversity in the Ascochyta blight pathogen of chickpea. Theor. Appl. Genet., 97: Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. and Tingey, S.V DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acid Res., 18, Yoder, W.T. and Christianson, L.M Species-specific primers resolve members of Fusarium section Fusarium. Fungal Genetics and Biology, 23, Zamani, M.R., Motallebi, M. and Rostamian, A Characterization of Iranian isolates of Fusarium oxysporum on the basis of RAPD analysis, virulence and vegetative compatibility. J. Phytopathol., 152,