1. Ekstraksiyon Tamponu: %2 (w/v) CTAB (Cetyltrimethyl-ammonium bromide) 1.4 M NaCl, % 0.2 (v/v) β-merkaptoetanol, 20 mm EDTA. 100 mm Tris-HCl (ph 8)

Transkript

1 KONU-7. MOLEKÜLER BĠYOLOJĠDE TEMEL TEKNĠKLER BĠTKĠDEN GENOMĠK DNA ĠZOLASYONU Kullanılan Tamponlar: 1. Ekstraksiyon Tamponu: %2 (w/v) CTAB (Cetyltrimethyl-ammonium bromide) 1.4 M NaCl, % 0.2 (v/v) β-merkaptoetanol, 20 mm EDTA 100 mm Tris-HCl (ph 8) CTAB: Nükleaz inhibisyonu ve proteinlerin nükleik asitlerden ayrılmasında kullanılır. Bitki DNA izolasyonunda en çok kullanılan deterjandır. NaCl: Nükleik asit çöktürmesinde kullanılan tek değerli katyondur. β-merkaptoetanol: Nükleik asitleri nükleaz aktivitesinden koruyan ve proteinleri denature eden ajandır. EDTA: DNazların kofaktörü olan Mg +2 a bağlanarak, DNaz enzimini inhibe eder. Tris-HCl: Ortam ph sını tamponlamak amacıyla kullanılır. 2. Kloroform/Ġzoamilalkol (veya Kloroform/Oktanol;24:1) Kloroform lipidlerin uzaklaştırılmasında kullanılmasına ek olarak, proteinleri denature eder. İzoamilalkol faz ayrımına yardımcı olur ve köpüklenmeyi azaltır. 3. TE Tamponu: 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA Ġzolasyon Protokolü (Lodhi et. al., 1994): 1. Derin dondurucuda saklanan 0.5 gr lık yapraklar sıvı azotta ezilir. Sıvı azot hücreleri sertleştirerek, daha kolay kırılmasını sağlar. 2. Ezilen yapraklara 5 ml ekstraksiyon tamponu eklenerek, karıştırılır. 3. Çözelti 15 ml lik steril propilen santrifüj tüpüne konur, havana 1 ml daha ekstraksiyon tamponu eklenerek yıkanır ve tüpe eklenir. 4. Üstüne 50 mg PVP (polyvinlyprolidone) eklenir ve tüp ters çevrilerek, birkaç kez karıştırılır. PVP nükleik asitlerin proteinler, lipitler ve ekstraksiyonda istenmeyen diğer moleküllerden arındırılmasına yardımcı olur. 5. Karışım 60ºC ta 25 dakika bekletilir ve oda sıcaklığında soğutulur.

2 6. Oda sıcaklığında soğutulan karışıma 6 ml kloroform/oktanol eklenir ve emülsiyon oluşması için tüpler defa hızla çalkalanır. 7. Çalkalanan tüpler oda sıcaklığında masaüstü santrifüjde 4000 rpm de 25 dakika santrifüj edilir. 8. Üstteki sıvı faz 15 ml lik yeni bir santrifüj tüpüne aktarılır. Eğer PVP nin varlığından dolayı sıvı faz berrak değilse ikinci bir kloroform/oktanol izolasyonu gerçekleştirilebilir. 9. Elde edilen çözeltiye 0.5 hacim 5 M NaCl eklenerek iyice karıştırılır. Yüksek yoğunluktaki NaCl ile DNA-tuz kompleksi oluşur. 10. Karıştırılan çözeltiye 1 hacim soğuk (-20ºC ta bekletilmiş) %95 lik izopropanol (veya 2 hacim etanol) eklenir ve buzdolabında (4-6ºC ta) DNA iplikçikleri belirene kadar bekletilir. İzopropanol veya etanol ile nükleik asitlerin çökmesi sağlanır. 11. DNA iplikçikleri belirlendikten sonra oda sıcaklığında sırasıyla 3000 rpm de 3 dakika ve 5000 rpm de 3 dakika santrifüj edilir. Değişik rpm deki santrifüjleme DNA nın santrifüj tüpü dibinde yığılmasını sağlar. 12. Supernatant dökülür ve pellet 0-4ºC ta bekletilmiş %76 lık etanol ile yıkanır. Bu basamakta sulu etanol kullanılmasının nedeni DNA etanol ile dibe çöktürülürken su ile önceki basamaklarda oluşturulmuş DNA-tuz kompleksindeki tuzun çözülerek sıvı faza geçmesi sağlanır. 13. Tüpler 37ºC ta dakika ters çevrilerek pellet DNA kurutulmadan etanolun uzaklaştırılması sağlanır. 14. Pellet DNA µl TE de çözülerek, eppendorf tüpe aktarılır.

3 RASTGELE ÇOĞALTILMIġ POLĠMORFĠK DNA (RAPD) ANALĠZLERĠ Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD), polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemine dayanan ve çalışılan genom hakkında özgün nükleotid dizi bilgisi yokluğunda rastgele primerler kullanılarak, genomik DNA nın çoğaltılmasını içeren bir yöntemdir (Williams et. al., 1990). RAPD uygulamasında dizisi rastgele seçilmiş tek bir oligonükleotid ile genomik DNA, ısıya dayanıklı uygun bir DNA polimeraz varlığında karıştırılır ve PZR a benzer olarak döngüsel sıcaklık koşullarında muamele edilir. RAPD yönteminin en büyük üstünlüğü çok sayıda genetik belirteç sağlamasıdır. Yöntem çeşitli bitki ve hayvanlarda polimorfizmin ve genetik belirteçlerin belirlenmesinde hızlı ve etkindir (Ellsworth et. al., 1993). Kekik bitkisinde RAPD uygulaması: RAPD uygulaması 0.5 ml lik mikro tüplerde 25 µl lik toplam reaksiyon hacminde gerçekleştirilecektir. Aşağıdaki çizelge tüpe eklenen bileşenlerin miktarını ve tüpe eklenme sırasını göstermektedir. Tüpe Eklenme Sırası BileĢen Ġçeriği Reaksiyon DeriĢimi 1 Enjeksiyonluk su x PCR tampon Tris-HCl (ph 8.8) KCl Nonidet P mm 50 mm % 0.01 (w/v) 3 MgCl 2-2 mm 4 Genomik DNA ng 5 Primer - 50 ng 6 dntp mix 7 Taq Polimeraz (5u/µl) datp dctp dttp dgtp U

4 AGAROZ JEL ELEKTROFOREZĠ İzole edilen genomik DNA ve RAPD sonucu elde edilen bant profilleri agaroz jel elektroforezi ile incelenmektedir. Agaroz jel elektroforezinin yapılması için kullanılan kimyasal ve tamponlar aşağıda çizelge halinde sunulmuştur. Madde Ġsmi Ġçeriği Miktarı Agaroz - - TBE Tamponu (5x) (500 ml) Trizma base Borik asit EDTA (0.5 M) 1.21 gr 28.6 gr 50 gr Bromofenol mavisi (20 ml) Bromofenol Sukroz dh 2 O 0.05 gr 8 gr ml Etidyum Bromür (10 mg/ml) Etidyum Bromür 1 gr dh 2 O 100 ml Agaroz Jelin Hazırlanması (%1 lik): 1. Kaset hazırlanır ve taraklar yerleştirilir. 2. Erlene 0.40 gr agaroz tartılıp koyulur. 3. Üzerine 40 ml TBE tampon eklenir. 4. Mikrodalga fırında (yaklaşık 160ºC ta) 4-5 dakika ısıtılarak, agarozun homojen bir biçimde eritilmesi sağlanır. 5. Jelin sıcaklığı 40-45ºC ta düştüğünde üzerine 4 µl Et-Br eklenir. 6. Jel elektroforez kasetine dökülür, uygun jel tarakları takılır ve iyice donması için beklenir. 7. Jel donunca taraklar çıkarılıp, elektroforez tankına yerleştirilir ve örnekler yüklenir.

5 DNA Örneklerinin Jele Yüklenmesi: 1. DNA örneklerine 1 µl 6x boya (agaroz için) eklenir, karıştırılır ve birkaç saniye santrifüj edilir. Boya sukroz içeriğinden DNA örneklerinin TBE den ağır olmasını ve kuyularda kalmasını, aynı zamanda içerdiği Bromofenol mavisi boya nedeniyle elektroforezin ve DNA moleküllerinin hareketinin gözlenmesini sağlar. 2. DNA örnekleri bir DNA belirteç ile birlikte pipet yardımıyla jele yüklenir. Örneklerin yandaki kuyulara kaçmamasına özen gösterilmelidir. 3. Elektrotlar güç kaynağına uygun şekilde bağlanır, 80 V a ayarlanır ve güç kaynağı açılır. 4. Bromofenol mavisinin pozisyonuna göre yeterince yürütüldüğüne karar verildiğinde güç kaynağı kapatılarak jel UV transilluminatörde incelenir. Gerekiyorsa bir süre daha yürütülebilir. 5. İstenirse jelin fotoğrafı çekilebilir. Bu amaçla Polaroid Tip 52 (400 ASA) film kullanılabilir. Objektifte kırmızı filtre kullanılmalıdır. KAYNAKLAR: 1. Ellsworth D.L., Rittenhouse K.D., Honeycutt R.L Artifacturing variation randomly amplified polymorphic DNA banding patterns. BioTechniques, 14 (2): Lodhi M.A., Guang-Ning Y., Weeden N.F., Reisch B.I A simple and efficient method for DNA extraction for grapvine cultivars and Vitis species. Molecular Biology Reporter, Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski, J.A., Tingey S.V DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 18: