PROTEİN PROSESİ Proteinlerde Blot Digestion

Transkript

1 PROTEİN PROSESİ 1D ve 2D jel elektroforezinden elde edilen bilgi proteinleri tanımlamada yeterli değildir. Birkaç bin daltonda moleküler ağırlık kolaylıkla gözlenmeyebilir. Bunun dışında, proteinlerdeki posttranslasyonal modifikasyonlar ve kesikler moleküler ağırlık ve izoelektrik nokta gözlemlerini etkileyebilir. Ayrıca jelin içerdiği bilgi proteinleri tanımlamada son nokta değildir. Belirgin bir tanımlama için daha fazla bilgiye ihtiyaç vardır. Proteinlerde Blot Digestion Probleme karşı ilk yaklaşım proteini jelden elde etmek olacaktır. Elektrotransfer ya da elektroblotting adlı teknikler bu amaca uygun olarak düzenlenmiştir. 1 ya da 2D jel elektroforezle ayrılan proteinler nitroselüloz gibi bir bağlanma membranına aktarılır, Jel üzerinde bir elektriksel alan oluşturulur. Proteinler jel içinde anota doğru göç eder, bağlanacağı membranla karşılaşır. Coomassie ya da gümüş boyama teknikleri kullanılarak blottaki protein paternleri görünür hale getirilir. Bu yolla jeldeki ayrım profili doğru şekilde blot membrana aktarılabilir. Ayrıca bu metod kimyasal/enzimatik müdahaleleri mümkün kılar. Başlangıçta elektroblotting, Edman degradasyonu kullanılarak protein tanımlanmasında kullanıldı. Aebersold un (1986, 1987) çalışmaları bu yaklaşıma öncü oldu. Temel olarak elektroblotting; Edman degradasyonu ile jel elektroforezi arasındaki boşlukları birleştirir ların ortalarında kütle spektrometresi (MS), proteinlerden elde edilen peptidleri kullanarak proteinlerin tanımlanmasında ilgi çekici bir yöntem oldu. Elektroblotting MS analizi için gerekli protein prosesinin seçimini sağlayan bir metod oldu. Metod, blotta bulunan proteinin enzimatik parçalanmasına izin verecek şekilde modifiye edildi. Blottaki noktalar kesilip alındıktan sonra Polyvinglpyrrolidone-40 (PVP-40) adlı bir ajanla muamele edilir. PVP-40 membrana bağlanmadan membranı kaplar, enzim solusyonunun blotlanmış proteine doğru akışına izin verir. Enzim mekanizması iki reaksiyonun kombinasyonuyla etkin olur. Birincisi katı faz reaksiyonudur; enzim tutunmuş proteini parçalar. İkincisi solüsyon reaksiyonudur; fragmentlerin ileri düzey parçalanmasıdır. Blotlanmış proteinden peptid solusyonu oluşur. Bu peptid solusyonu MS analizi için uygundur. Protein tanımlanmasında blot kullanımı 1990 ların ortalarında tercih edilen bir teknikti. Bununla beraber sınırları vardı. En önemli 1

2 sınırlayıcısı sıkıcı, yorucu olmasıydı. Zaman isteyen bir teknikti. İlk olarak 2D jel oluşturulmalı, nitroseluloza elektrotransfer yapılmalı, boyanmalıydı. Daha sonra boyalı noktalar kesilip çıkarılmalı, noktalar PVP-40 kullanarak bloke edilmesi gerekiyordu ki bu son basamak çok sayıda tekrarlayan yıkamalar içeriyordu. Son olarak blotlanmış proteinler tripsinle parçalanırdı. Bu aşamaların hepsi nokta sayısına bağlı olmak koşuluyla 3 ile 4 gün arasında süre alabiliyordu. İkinci sınırlayıcı faktör; jelden blota aktarılan proteinlerin nicel uyuşmazlığıydı. Bu durum benzer boyanmış 2D jel blotların karşılaştırılması esnasında görülebiliyordu. Bazı proteinlerin aktarılma oranı yüksek iken bazıları nerdeyse hiç aktarılamıyordu. Son sınırlayıcı faktör; membran bloklanmasından sonra yetersiz yıkama nedeniyle PVP-40 ın taşınamamasıydı. Jelde Protein Parçalanması Edman sekansıyla proteinlerin jelde parçalanması 1990 ların başlarında geliştirildi. Kütle spektrometresiyle protein analizi ilk olarak 1996 yılında Wilm ve arkadaşları tarafından ortaya kondu. Metod hızlı bir şekilde elektroblotting yaklaşımının yerini aldı. Bu yöntemin esas avantajı jel elektroforezinden sonra analiz için uygun ürünü miktar açısından önemli derecede azaltmasıydı. Jel fikse edilir, proteinler boyanır, fark edilen noktalar jelden kesilerek alınır. Enzimle jeli buluşturmak için jel parçaları küçültülür ve enzim solusyonuyla şişmeleri sağlanır. Enzimatik parçalanma sonucunda peptidleri elde etmek için sadece birkaç basamağa daha ihtiyaç vardır. İş gücündeki azalma, prosesteki azalma bu yöntemi jel elektroforezinden peptid eldesinde kullanılan bir metod haline getirdi. PROTEİN TANIMLANMASI Edman Degradasyonu 1967 yılında Edman ve Begg adlı araştırmacılar tarafından proteinlerin N-terminal sekansı için protein sequenator adında bir teknik ortaya atıldı. Bu kimyasal degradasyon tekniği, proteinlerin N-terminal ucunu kullanarak aminoasitlerin tek tek eldesine olanak sağlıyordu. Zaman içinde aminoasitlerin tek tek sekansında High performance liquid chromotography (HPLC) kullanıldı. Tekrarlayan kimyasal degradasyon döngüsüyle N-terminali kullanarak 20 aminoasite kadar sekans yapmak mümkün oldu. Bu yöntemle zahmetli bir biçimde bir proteinin novo sekansını yapmak ya da gende 2

3 klonlamak için yeterli uzunluktaki bir protein sekansını yapmak mümkündür. Proteinlein eldesi ve DNA sekans veritabanları işi kolaylaştırmıştır ve sınırlı N- terminal aminoasit sekansıyla protein tanımlanmasına olanak sağlamaktadır. Kütle Spektrometresiyle Protein Tanımlanması Kütle spektrometresinin farklı şekilleri Edman degradasyon tekniği kadar uzun süreli protein analizinde kullanıldı. Bugünün koşullarına göre kütle spektrometresi sıkıcı, yavaş ve çok fazla örneğe ihtiyaç duyan bir yöntemdi. Yıllar sonra cihazlardaki gelişmeler ve genomik veritabanlarındaki değişiklikler protein tanımlanmasında kütle spektrometresinin kullanım fikrinin gelişmesine yol açtı. Etkili Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) ve Time-of-flight (TOF) kütle spektrometresi ile electrospray ionization(esi) kütle spektrometresiyle tanışma bu alanda bir devrim yarattı. Bu cihazların üretilmesi proteomik çalışmaları için daha fazla sayıda cihazın üretilme çabalarını kuvvetlendirdi. Bu yüzden önceki çalışmalara bakıldığında geçen yıllar içinde çok büyük değişiklikler gerçekleşti (Tablo 1). MS/MS deki Kararlılık Maliyet MS de M/MS de duyarlılık tanımlanma tanımlanma MALDI-TOF Düşük Orta Bazen (PSD ile) MALDI-Pulsar Yüksek Orta ESI-Triple Düşük 1000 Orta değil Quadrupole ESI-Ion trap Orta Düşük değil ESI-FTMS Yüksek >50000 Yüksek (yavaş) ESI-Pulsar Yüksek Orta değil and Qtof Tablo.1. Farklı Kütle Spektrometrelerinin Protein Tanımlanmasındaki Performansları MALDI-TOF Kütle Spektrometresi Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) ve Time-of-flight (TOF) adlı kütle spektrometresi yöntemiyle kütle spektrometresinde kendiliğinden oluşan gelişmeler, analitlerin kütle ölçümlerinin hızlı ve kesin olarak yapılmasına olanak sağladı. Bu teknikte peptidler katı fazdan gaz fazına geçerken, TOF kütle spektrometresiyle hızlı bir biçimde m/z oranlarına göre ayrılır (Şekil 1) 3

4 Şekil 1. MALDI-TOF kütle spektrometresinin şematik çizimi 2D jel elektroforezinden izole edilen proteinler enzimlerle parçalanır, tuzlardan arındırılır, ko-kristalizasyon için doymuş matriks solüsyonu içeren MALDI plağına aktarılır. Alternatif yol olarak protein parçalanma ürünleri HPLC tekniğiyle ayrılıp daha sonra MALDI plağına aktarılır. Hedef plağın kütle spektrometresinin vakum bölümüyle karşılaşması sağlanır. Bir otomatik translasyon evresinde her bir noktanın yeri lazerin merkezi noktasında olacak şekilde kütle spektrometresi ekseninde belirlenir, matriksin emdiği dalga boyu lazer ışını spottaki kısıtlı bir alan üzerine yoğunlaşır. Plaka yüzeyinden hızlı enerji transferiyle peptidler gaz fazına dönüşür. MALDI plağına +20 ile +30 kv larda voltaj verilir. Bu durum pozitif yüklü peptidlerin flight tüpünün ağzına doğru hızlanmalarına neden olur. Tüpün ağız kısmına (z/m) 1/2 orantılı bir hızla ulaşırlar. Peptidler ağız kısmını geçtikleri anda hepsi aynı kinetik enerjiye sahiptir ancak farklı kütleden dolayı aynı hıza sahip değildir. Böylece moleküller hemen hemen aynı yüke sahip olduklarından kütlelerine orantılı bir hıza sahip olacaktır. Genel olarak MALDI de peptid iyonları tek yüklüdür. Flight tüpün elektriksel alanda olmadığı anda peptidler ilk hızlarına göre tüp boyunca hareket ederler. Kütlelerine göre tüpün içinden geçerler ve farklı zaman aralıklarında detektöre çarparlar. Kütle analizi lazer atışıyla tetiklenir, zamanla ortaya çıkan sinyalleri kaydeder, eğer kütle spektrometresi uygun bir biçimde kalibre edilirse bu verileri kolayca m/z oranına dönüştürür. Prensip olarak, uzun tüpler farklı kütleleri ayırmada daha iyi netice verir. Gaz moleküllerinin analit yolunda çarpışmaları 4

5 ayrışmaya zarar verir. Bu nedenle uzun yollar büyük vakum ihtiyacı doğurur. Bu sayede çarpışmaların azaltıldığı bir yol sağlanır. Bu nedenledir ki kütle spektrometreleri 10-9 ile torr pompalamayı sağlayacak donanıma sahiptir. Ayrım karalılığını etkileyen ikinci faktör; MALDI plağındaki analitlerin patlamasıyla ilk kinetik enerjinin yayılması, dağılmasıdır. İyonların kararlılığını artırmak için MALDI- TOF sistemine Delay extraction tekniği ve reflektron eklenmiştir. Delay extraction ayrımdan önce kinetik enerjiyi harekete geçirir, reflektron ise hareket süresince kinetik enerjinin yayılımında etkilidir. Delay extraction MALDI plağına yüksek voltaj uygulanmasından önce bir bekleme aralığı sunar. Plaktan dışarı fırlatılan iyonların kinetik olarak soğumasına izin vererek gelişmiş bir kararlılık sağlar. Reflektron iyonların kinetik odaklanmasına olanak sağlarken daha iyi bir kararlılık kazandırır. 10 ile 50 ppm deki peptid kütlesinin kesinliğini sağlamak ve 5000 ile kararlılığı elde etmek onun için normal bir durumdur. Reflektron iyon yolunda yer alan bir parça bilgisayar donanımı gibidir. Reflektronla donatılmış MALDI-TOF sistemleri geleneksel MALDI-TOF sistemlerinden çok farklıdır. Prensipte aynı olmakla beraber farklı tasarımlar üretilmiştir. Reflektron bir grup halkasal lensten oluşur ve bunlar birlikte bir yığın halindedir. Sürekli artan yüksek potansiyeller halkalara uygulanır. Hareket anında her peptid bir paket iyonla temsil edilir. Bu iyonlar dar bir aralıktaki kinetik enerjiye yani hıza sahip olarak hareket ederler. Paketin ön kısmında bulunanlar daha az kinetik enerjiye sahiptir. Hızlı hareket eden iyonlar reflektrona ilk ulaşanlardır. Reflektron tarafından verilen itici elektriksel alanı hissetmeye başlarlar. Sahip oldukları yüksek kinetik enerjiden dolayı reflektronda daha fazla ilerlerler. Kinetik enerjileri sıfır oluncaya kadar bu hareket devam eder. İtici elektriksel alan bunları reflektronun girişine doğru tekrar hızlandırır. Bu arada diğer iyonlar da kinetik enerjilerini düşürmek için reflektrona giriş yaparlar. Bu iyonlar yönleri değiştirilmeden önce reflektron içinde daha az mesafe katederler. Bunun sonucunda yavaş hareket eden iyonlar iyon paketinin önündeyken hızlı hareket edenler arkasında kalır. Bütün iyonlar daha sonra TOF tüpünün field free bölgesine döner. Bu seyahat esnasında iyon paketlerinde hızlı hareket edip geride kalan iyonlar yavaş hareket edip önde olan iyonları yakalamaya odaklanır. Açıkça görülüyor ki başarı; reflektronun ana noktasında detektörün pozisyonuna bağlıdır. Eğer detektör reflektrona çok yakın pozisyondaysa iyon paketlerinin odaklanmaya zamanı olmayacaktır. Bunun tersi şekilde detektör reflektrondan çok uzak bir pozisyondaysa iyon paketleri yine odaklanamayacaktır. 5

6 MALDI İçin Örnek Hazırlanmasında Farklı Yaklaşımlar MALDI için örnek hazırlamak bir sanattır. Örneklerin yerleştirilmesinde pek çok protokol bildirilmiştir. Burada, en fazla kullanılan yaklaşımlar sunulmuştur. Cleanup prior to spotting: Reverse faz materyallerin ister kolon formatında isterse bir pipet ucunun içinde gevşek şekilde paket edilerek kullanılmasının yararlı bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Bu yaklaşım örneklerin tuzlardan arındırılmasında ve MALDI-TOF analizinden önce polimerlerden ayrılmasında yararlı olmuştur. Fakat reverse faz materyalin ve paketlenmenin özelliklerinin dikkatli bir biçimde ölçülmesine ihtiyaç vardır. Örneğin pipet uçlarından Ziptips; en uç kısmında bir tampon ekstraksiyon materyali vardır. Bu tampon bir polimerik destek içinde reverse faz materyalin gömülmesiyle elde edilir. Sıvının uç içinde kolayca akmasını sağlamak için gömüldükleri polimer içerisinde reverse faz taneleri iyice yayılır. Bu durum düşük geri basınca neden olur. Uçların orta ve yüksek seviyedeki peptid karışımlarının temizlenmesinde yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Ancak reverse tanelerinin yayılımları ekstraksiyon verimliliğinin difüzyonunu sınırlar. Yani peptidlerin paketlenmiş materyale ulaşması için yayılmak zorunda olduğu mesafeyle karşılatırınca bu doğrusal akış çok yüksektir. Bunun sonucunda ekstraksiyon verimliliği düşük konsantrasyondaki peptid karışımları için önemli miktarda düşer. Yani bu yöntemle düşük miktardaki peptid karışımlarını (100 fmol den az) analiz etmek oldukça zordur. Spotting yaklaşımları: Küçük miktarlardaki peptidlerin analizi için yıllar boyunca farklı örnek hazırlama yöntemleri geliştirildi. En popüleri Dried Droplet metodu oldu. Bu yöntemde peptid karışımının suyu çekilir ve α-cyano-4-hydroxycinnamic asitle doyurulmuş asitli su içinde asılı bırakılır. Bu organik karışımdan 1 mikrolitre MALDI plağının içine konulur ve kurumaya bırakılır. Bu yöntem örnek hazırlanması için hızlı bir yoldur ancak en duyarlı yol değildir İkinci bir yaklaşım da Two-layer yöntemi olarak adlandırıldı. İlk önce α-cyano-4- hydroxycinnamic asit solüsyunu MALDI plağının üzerine konulur ve bir mikrokristal tabakası oluşturması için kurumaya bırakılır. Daha sonra matriks ve analit solüsyonu ilk tabakanın üzerine konulur ve kurumaya bırakılır. Bu yöntem oldukça sıkıcı olmasına rağmen analizde daha temiz bir spektra verir. Ayrıca bu metod otomatikleştirilebilir. 6

7 Cleanup post spotting: İster Dried droplet ister two-layer metodu olsun her iki yöntemde de bir cleanup yöntemi MALDI plağı üzerine direkt olarak uygulanabilir. Bu yöntem bir spotting yönteminin hemen ardından uygulanır. Bir su damlası MALDI plağının üzerindeki her bir spota eklenir ve su damlası uçurulur ve spotlar MALDI-TOF kütle spektrometresine yerleştirilmeden önce kurumaya bırakılır. Bu basamak tuzlar ve kurutulmuş kristaldeki hidrofilik moleküllerin eldesini sağlar. Bu sinyal gürültü oranında bir yükselmeye neden olur. Yıkamanın zamanlaması hidrofilik peptidlerin gereksiz kaybının önlenmesinde önemlidir. On plate concentration: Daha önce de değinildiği gibi kütle spektrometreler yoğunluğa bağımlı aletlerdir. MALDI daha komplekstir. Çünkü iyonizasyon süreci ve matrikslerin katılımı tam olarak anlaşılamamaktadır. MALDI yüzeyindeki analit konsantrasyon artışı gözlemlenen sinyali artırabilir ancak bu durum örnek yeteri kadar temiz olduğunda iyi çalışır. Örnek miktarı kısıtlı olduğunda yoğunluğu artırmanın tek yolu spotun büyüklüğünü azaltmaktır. MALDI plakları küçük ve hidrofilik spotting bölümleriyle hazırlanır fakat plağın diğer kısmı hidrofobiktir. Bir damla peptid solusyonu spot üzerine konulduğunda hidrofobik çevre ve yüzey gerilimi damlanın yüzeyle temasını kısıtlayacak bir şekil almasına zorlar. Damla kururken küçük hidrofilik page üzerinde yoğunlaşır. Sonuç; MALDI plağı üzerinde küçük bir alanda yüksek bir konsantrasyondur. Kendi içinde bu yöntem önemli bir gelişme sağlayacak yeterlilikte değildir. Çünkü kontaminantlar özellikle tuzlar benzer şekilde konsantre olurlar. Tuzları uzaklaştırmak için Drop of water gibi bir cleanup yönteminin beraberde uygulanması gerekir. MALDI-TOF Yöntemiyle Proteinlerin Tanımlanması Doğru Protein Kütle Ölçümünün Kullanılması Proteinlerin tanımlanmasının moleküler ağırlıklarının doğru ölçümlerinin yapılmasına bağlı olarak gerçekleştirilebilineceğine inanılmıştı. Fakat daha sonra anlaşıldı ki gittikçe gelişen veritabanları ve kütle ölçümünün doğruluğu moleküler ağırlığa bağlı protein tanımlanmasını sınırlar. Protein moleküler ağırlığının taşıdığı bilgi protein tanımlanmasında yetersizdi. Kesin protein tanımlanması proteinin proteltik sindiriminin ihtiva eteği peptid kütlelerinin doğru bir şekilde ölçülmesiyle gerçekleştirilebilir. Açıkça, bir proteinden alınmış sadece bir peptid kütlesi proteinin 7

8 tanımlanmasında yeterli değildir. Aynı proteinden alınmış geniş peptid kütleleri tanımlamada yeterli olur. MALDI-TOF kütle spektrometresi peptid kütlelerinin ölçülmesinde bir yöntem seçeneğidir. MALDI-TOF da iyonlar kısa bir mesafe için hızlandırılır ve sonra iyonlar TOF tüpünün içerisine uçar. Bu uçuş bazen 5 metreyi bulur. Genel olarak hızlandırılmış yerin sabit olduğu düşünülür. Fakat hızlandırılma alanındaki herhangi bir hata uçma zamanına yayılır ve böylelikle ölçülen kütlenin doğruluğunu etkiler. Plak doğruluğu, pozisyonu, plak tutacağının yatıklığı hızlandırma alanını değiştirebilir. Bu olayı azaltmak için bazı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Örneğe bir içsel standartın eklenmesiyle ya da MALDI plağının üstündeki örnek spotunun yakınına kütle ölçümlerini tarayarak düzelten bir dış kalibrantın eklenmesiyle başarılmıştır. MALDI-TOF ve Doğru Peptid Kütleleriyle Protein Tanımlanması MALDI-TOF kütle spektrometresiyle proteinlerin tanımlanması +1 yüklü peptidlerin m/z oranının ölçülmesiyle başarıldı. Doğru peptid kütle ölçümü ile protein dizilimi veritabanlarının kombinasyonu MALDI-TOF yöntemiyle protein tanımlanmasının ana yapısını oluşturur. Şekil 2. MALDI-TOF yöntemiyle protein tanımlanmasının arkasındaki prensibi tarif eder. Peptid kütlelerinin doğru ölçümüne dayanan protein tanımlanması için geliştirilmiş farklı software paketleri vardır. Skorlama için en basit yöntem peptid kütlelerinin sayılarını toplamaktır. Peptid kütlelerinin sayıları protein veritabanındaki her giriş için tahmin edilen kütleyle eşleştirecektir. Veri girişleri daha sonra vuruşların sayısına göre sıralanır. Bu PepSea ve MS-Fit programlarının temel dayanağıdır ( Bu software paketleri kaliteli deney verileri için iyi çalışır. Mascot MOWSE adlı softwareden köken alan bir programdır. MOWSE, protein büyüklüğünü ve veritabanındaki peptidlerin göreceli çokluğunu hesaba katarak skoru belirlerken daha fazla bilgi kullanır. Mascot, veri ile veritabanındaki eşleştirme olasılığını skordaki ihtimalle birleştirir. Bu skor veritabanına her girişte hesaplanır. Tesadüfi eş olma olasığı düşen proteinler dizilerek tanımlama gerçekleştirilir. Mascot programına internetten adresinden ücretsiz ulaşılabilir. Ticari amaçlar için Matrix Science dan elde edilebilir. 8

9 2-D Jel Elektroforezi MW x pi 1547 Kesip çıkarılan protein noktaları Jelde trypsinle müdahale MALDI-TOF veya LC-ESI-MS. Peptid kütle fingerprint MS/MS ile ek sekans bilgileri elde edilebilir m/z Yeniden tryptic peptidler elde edilir Proteomik veya genomik veritabanları kullanılarak protein tanımlanması Şekil 2. MALDI-TOF kütle spektrometresiyle protein tanımlanmasının şematik düzeni Profound proteinlerin oluşum olasılığına göre veritabanındaki dizilimini sıralarken bayesian teorisine dayalı farklı bir yaklaşım kullanır. Bu bir uzman sistemidir. Yani bu konuda gerçekte bir uzmanın yapabileceği işi etkin kılar. Profound, her protein dizilimi hakkındaki detaylı bilgiyi ve skoring şemadaki proteolitik peptidlerin dağılımı hakkındaki deneysel bilgiyi kullanır. Bu programa internet üzerinden ( ulaşılabilir. Genel olarak tüm bu software paketleri iyi kalitedeki spektranın olduğu durumlarda iyi sonuçlar verir. Daha gelişmiş skoring şemaları sağlayanlar daha az bilgi ve MS spektrasının kalitesi azaldığı zaman daha iyi performans sergiler. Hangi program olursa olsun proteinlerin tanımlanması gözlemlenen proteinlerin sayısına, ölçümlerin doğruluğuna ve özel türlerin genomunu büyüklüğüne bağlıdır. Daha küçük genomlar için mesela maya ve E. coli MALDI-TOF kütle spektrometresi protein tanımlanmasında başarılıdır. Daha büyük genomlar için başarı oranı önemli ölçüde düşer. 9

10 Post-Source Decay (PSD) MALDI-TOF kütle spektrometresi aynı zamanda bir peptidden alınan parça örneklerinin kaydedilme olasılığını sunar. İşte bu Post source decay yöntemi kullanılarak başarılır. Fazla enerji peptidlerde(iyonlarda) kırıklara yol açar. Bu iyonlar düşük kinetik enerjilerinden dolayı genellikle MALDI-TOF analizlerinde görülmez. Ancak reflektron üzerindeki ayarlar değiştirilerek düşük enerjili peptid kırıkları tespit edilebilir. PSD, iyonları üretmek için gerekli olan değerin üzerinde lazer gücünün artırılmasıyla başarılır. PSD, reflektron üzerindeki farklı ayarlı özel kütle dağılımı için spektra alınmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra bütün spektra birleştirilir. PSD, peptidlerin kırık patternlerinin eldesinde hızlı bir yol gibi görünse de ciddi olarak duyarlılıktan uzaktır. Ayrıca kırık patternleri ayırt etmek sıklıkla zordur. Bu nedenle tercih edilen bir yöntem değildir CANAN ÇOBANOĞLU A