Polimerik partiküllerin Biyomedikal Uygulamaları

Transkript

1 Polimerik partiküllerin Biyomedikal Uygulamaları Doç. Dr. Nurettin ŞAHİNER ÇANAKKALE NSEKİZ MART UNİVERSİTESİ Fen-Ed. Fak., Kimya Böl. & Nanobilim ve Teknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi 22 cak, 2012 CANAKKALE

2 Kapsam -Bazi temel kavramlar, tanımlar ve boyut -Nano yapıların tasarımı ve özellikleri -Nano partiküllerin bazı biomedikal uygulamaları

3 What is hydrogels? swollen -T -ph -Ionic Strength -light -pressure. shrunk 1 μm 3-D hydrophilic networks

4 Nanomateryaller için Boyutlar C-H (single): nm C-C (single): nm C=C (double): nm C C (triple): nm C- (single): nm C= (double): nm C (triple): nm C-N (single): nm C=N (double): nm C N (triple): mm 1 nm = 0- Dimensional structures: from a few nm to hundred nm, Q-dots, Fullerenes (C 60, C 70, C 76 ) carbon nanotubes etc, 1- D Dimensional structures: from several nm to several hundered μm, nanorod, nano tubes, nanowires etc 2-D Dimensional structures: from several μm to higher dimensions, thin films etc 10 H atoms or 5 silicone aligned in a line Aspect ratio=length/diameter AR<10 nm Nanorods, AR>10 nanotubes hollow inside Jingyi Chen, Benjamin J. Wiley, and Younan Xia Langmuir 2007, 23,

5 For any materials that needs to be used in biomedical fields have certain characteristics: -biocompatiblebiodegradable -tunable physical and chemical characteristics -have enough payload(s) (cargo) and delivery this to the target sites -to be targetable for the specific tissues/cells -durable against enzymatic degradation and aggregations -able to penetrate to target cells and release the active agents in therapeutic ratio and in a controllable fashion (preferably via a signal)

6 -understand the change in environments and act accordingly -It should not effect the immune system and be nontoxic - can be removable readily from the medium upon completion the task Therefore hydrogels are the most appropriate materials for application in biomedical fields (1) Synthesis and modification various hydrogel particles 2) applications -Biomedical field as drug delivery devices -Antimicrobial agents

7 Self Assembly systems for nanoparticle preparation il-in-water Su Microemulsiyon systems water-in-oil yağ yağ su micelle Reverse micelle

8 Hidrogels are versatile and can be prepared at different dimension, shapes and morphology 8 mm 100 μm 5 μm 2.00 μm 2 cm

9 Fonksiyonlu Nanojellerin değişik ilaç, sensör ve saflaştırma uygulamaları Charged nanogels r Polyions 20 nm

10 Gel Electrophoresis of 1:100 charge ratio (DNA:+ gel) Free DNA 2 Days TAE 1 Day TAE 0 Days TAE Sahiner N. et al., Colloid And Polymer Science, 284, 10 (2006)

11 SEM images of Cationic micro hydrogels w/t phospholipids (a) (b) 100 m 100 m (d) (c) 500 nm 100 nm Sahiner N, Singh M, PLYMER, 48 (10), 2007,

12 The modification of p(an-c-nipam) Nanohydrogels R CH ) R CH ) CN C N H NH 2 -C N -C=N -N- 20 nm Partially amidoximated particles The FT-IR spectrum of p(an-c-nipam) p (AN-c-NIPAM)

13 p(an-c-nipam) nanopartiküllerinin DLS ve TEM analizleri (a) (b) Particle size:104 nm in water (c) (d) 20 nm Core-shell p(an-c-nipam) 100 nm Amidoximated core-shell particles After complete amidoximation Particle size: 390 nm

14 Change in Hydrodynamic Radius with Temperature (1) p(an-co-nipam)core-shell (2) p(nipam) 100 nm 20 nm (3) Amidoximated p(an-co-nipam) 100 nm Sahiner N, Euro Polym J. 43 (2007)

15 A model Drug release from p(an-c-nipam) hydrogels Loading: 10 0 C Release : 37 0 C Propranolol (PPL): non Selective beta blocker, hypertenion drug H CH 2 CHCH 2 NHCH(CH 3 ) 2.HCl (1) p(an-co-nipam (2) Amidoximated p(an-co-nipam) Absorption wavelengths 290 and 305 nm

16 Hydrodynamicdiameter (nm) TG % % Weight loss TGA of p(an-c-nipam) based particles Zeta potantial measurements of amidoximated p(an-co-nipam) Magnetic p(an-co-nipam) 14.8 % ph=2 ; mv ph=6 ; mv ph=10 ; mv 20.0 p(an-co-nipam) Temp Cel ph dependence of hydrodynamic diameters of ph N. Sahiner, P. Ilgin, Current Nanoscience, (2010) 6(5), amidoximated p(an-c-nipam) p(an-co-nipam)

17 Released amount of drug mg/g The drug release profile at 25 0 C (a) N Verapamil N A calcium channel blocker: Used in the treatment of Hypertension, angina pectoris, Cardiac arrhythmia, and cluster headaches (b) amidoximated Magnetic p(an-c-nipam) Magnetic p(an-co-nipam) Time(h) 30 40

18 TG % TG % Magnetic p(an) based ionic composite particles p(an-co-aptmaci) p(an-co-amps) (a) (b) (c) mag-p(an-c-amps) p(an-c-amps) (1) (2) %13 M-p(AN-co-APTMACI) (d) M-p(AN-co-AMPS) (e) Temp Cel mag-p(an-co-aptmaci) p(an-co-aptmaci) (1) (2) % Temp Cel Sahiner, N., Ilgin, P. J. Polym Sci. Part A: Polym Chem. (2010) 48, 22,

19 Intensity Intensity The zeta potential of the (1) p(an-c-amps) and (2) p(an-c-aptmaci), and SEM images of p(an-c-aptmaci) (1) (2) (b) p(an-c-amps: p(an-c-aptmaci): -35 mv mv 1 µm (a) 361 nm 739 nm 460 nm 875 nm 105 amd-p(an-c-amps) p(an-c-amps) Diameter (nm) (b) 95 amid-p(an-c-aptmaci) p(an-c-aptmaci) Diameter (nm)

20 Hydrodynamic diameter Hydrodynamic diameter ph responsiveness of polyelectrolyte hydrogel particles p(an-c-amps) p(an-c-aptmaci) ph amd-p(an-c-aptmaci) p(an-c-aptmaci) ph

21 Release amount of NP mg/g Released amount of TMP mg/g Drug Release Profile of release profile of p(an-c-amps) based and p(an-c-aptmacl based particles N NH p(an-c-amps) mag-p(an-c-amps) amd-p(an-c-amps) mag-amd-p(an-c-amps) NH 2 N Trimethoprim (TMP) : A n bacteriostatic antibiotic Time (h) H 120 p(an-c-aptmaci) amd-p(an-c-aptmaci) mag-p(an-c-aptmaci) mag-amd-p(an-c-aptmaci) Naproxene (NP ) :Non steroidal Anti-inflammatory drug Time (h)

22 Zeta potantial measurements p(an-c-1-vi) (1) (2) (3) p(an-c-4-vp) (1) (2) (3) (1) p(an-c-1-vi)= -0.25mV, (2) (2) p(an-c-1-vi)-hcl = mV, (3) p(an-c-1-vi)-bea-hcl = mV (1) p(an-c-4-vp) = mv (2)p(AN-c-4-VP)-BEA= +26 mv (3) p(an-c-4-vp)-bea-hcl = +40 mv

23 Released amount of naproxen mg/g Released amount of diclofenac (mg/g) Released amount of naproxen mg/g Sodium Diclafenac Non steroidal Antiinflammatory drug 15 amd-p(an-c-1-vi) mag-amd-p(an-c-1-vi) p(an-c-1-vi) Drug Release Profile 10 p(an-c-4-vp) H Naproxene (NP ) :Non steroidal Anti-inflammatory drug mag-p(an-c-4-vp) time (h) Time (h) amd-p(an-c-4-vp) mag-amd-(p(an-c-4-vp) -p(an-c-4-vp) Time (h)

24 p0-p(an-co-nipam,amidoximated) p1- P(AN-co-NIPAM) p2- P(AN-co-APTMACl) Antimicrobial Studies p3- P(AN-co-4VP) p4- P(AN-co-4VP+) p5- P(AN-co-4VP++) Table 1.Determined MIC values of polymers against tested bacteria. Polymer MIC values ( g/ml) S.aureus P. ATCC6538 aeruginosa B. subtilis ATCC 6633 E.coli ATCC 8739 ATCC 9027 P0* > > > > P1* > > > > P > > P > > P P Table 2. Determined MBC values of polymers against tested bacteria. Polym er MBC values ( g/ml) S.aureus P. ATCC6538 aeruginosa B. subtilis ATCC 6633 E.coli ATCC 8739 ATCC 9027 P none none P none 500 none P P none

25 Hiyaluronik Asit Mikro ve Nano Hidrojel Partiküllerinin Sentezi, Karakterizasyonu ve Biyolojik Alanlarındaki Uygulamaları

26 Motivasyon: - Doğal polimerler arasında çok özel bir yere sahip olan Hiyaluronik asit (HA) insan vücudunda bol miktarda bulunur -HA disakkaritten oluşan doğal bir polielektrolittir ve canlı organizmanın en önemli bileşenidir. ECM deki tek sulfatlanmamış glikozaminoglikandır. (β1-4 D-glucuronic acid and β1-3 D-Nacetylglucosamine) H H HC H -Birçok biyolojik fonksiyonları var: ECM organizasyonu regüle etmenin yanında hücre sinyalizasyonu, eklemlerde kayganlaştırıcı ve hücre yüzeyinin korunması ve iyileştirilmesi gibi pek çok hücre ve doku işlevlerinin gerçekleştirilmesinde önemli rol oynar. H H H H H H NH H

27 -İnsan vücudundaki ekstrasellüler matriksin (ECM) ana bileşeni olan HA; ECM in ve hücre proliferasyonunun, hareketliliğinin ve farklılaşmasının düzenlenmesi, yaraların iyileştirilmesi gibi pek çok önemli biyolojik işlevlerin yanında kendisininde terapik etkisi vardır. Embriyonik gelişme ve morfogenez için vazgeçilmez bir materyaldir -Doğal olarak HA biyouyumlu ve biyobozunabilir. Ayrıca çok yönlü fizikokimyasal özellikler ve biyolojik fonksiyonlar gösterir. Bütün bu özelliklerine rağmen: -HA in in vivo yaşam süresi kısadır (dk-haftalara) -Hidrofilik özelliği hücre adhezyonunun sağlanmasını önler. Buda bir implant bileşeni için istenmeyen bir durumdur. Bu sorun ise hücre adhezyonunu sağlayacak modifikasyon ile mümkündür. -Lineer HA in biyomekanik özelliklerinin zayıf olması nedeniyle HA içeren biyomateryallerin hazırlanması ve kullanılmasında birtakım zorluklarla karşılaşılmaktadır.

28 Kapsam -Kimyasal ve fiziksel olarak çapraz bağlanmış mikro ve nano boyutundaki HA hidrojel partiküllerinin hazırlanması, ve bunların kimyasal modifikasyonlarının yapılması. -Hazırlanan HA partiküllerine Magnetik özellik kazandırmak için 2-20 nm boyutundaki magnetit (Fe 3 4 ) partikülleri HA ile kapsüllenerek bu tip ilaç taşıyıcıların hedeflenebilme özelliğinin araştırılması. Ayrıca, nano ve mikro partiküller mekanik ve reolojik özelliklerinin iyileştirilmesi amacıyla iç içe geçmiş ağ yapılı polimerler hazırlanılması ve biyomedikal alanda kullanılması.

29 Basit süzme ile HA partikülleri değişik boyutlara ayrılabilir süzme 10 µm Süzgec kağıdı gözenek boyutu >2.5 μm DLS ile partikül boyut dağılımı

30 Morfolojik olarak oldukça düzgün HA partikülleri yüzeyleri negatif olarak yüklenmişlerdir (a) (b) Filtre edilmiş HA partikülleri H HC H H H H H Zeta potential measurements yüzey yükü -40 mv H H H NH H

31 Normalized Absorbance Biomedikal uygulamalar için sitotoksisite testi Cell cytotoxicity of HA particles mg/ml 0.2 mg/ml 0.02mg/ml 0.002mg/ml HA particle concentration Değişik miktardaki HA partikülleri NIH 3T3 Fibroblast hücreleri ile 3 gün inkübe edilmiştir. HA miktar artışı cell viabilitysinde çok az bir düşme olmasına rağmen hepsinde %80 hücre viabilitisi sağlanmiştır. Ayrıca 24 gün süreyle 100 U/ml hyaluronisade varlığında Hiç bozunma gözlemlenmemiştir.

32 Release amount (mg) MMC Release from HA particles in PBS at 37 o C MMC Release Mitomycin C: MMC Toksik ve birçok Kanser tedavisinde Kullanılan bir ilaç Time (min) HA Control NH 2 NH 2 CH 3 H λ=360 nm in PBS H 3 C N NH H

33 Cumulative Release (mg R6G) Cumulative Release (mg TMP) HA partiküllerinden R 6G salım grafiği (a) ve TMP salım grafiği 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, ,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, t(min) t(min) NH 2 HN N Cl H N H 2 N N C 2 CH 2 CH 3 Rhodamine 6G (R6G) Flouresans özelliği olan bir boya λ= 525 nm (Abs.) Trimethoprim (TMP) Antibakteriyel etkili bir ilaç olup kronik bronşit, sinüzit, sistit, koli enfeksiyonları gibi solunum yolları ve gastrointestinal sistem enfeksiyonlarının tedavisinde kullanılır. λ= 280 nm (Abs.)

34 HA-HA interpenetrating polimer ağ yapıları (IPN) + Modifiye edilmiş HA partikülleri Modifiye edilmiş Lineer HA (Matrix bileşeni) 1 µm 1 µm Jia et al., Macromolecules 2009,

35 Multi Foton Konfocal Mikroskopi resimleri (a) HA particles Kontrol (b) Modified HA particles After Cascade blue dye absorption

36 HA partikülleri SEM Mikrografları Modifiye edilmiş HA partikülleri 1 µm 10 µm Modifiye edilmiş HA partikülleri Modifiye edilmiş HA partikülleri

37 Biyouyumluluk testleri (a) MTT viability test assay sonuçları (3 gün 37 0 C) Lineer HA pozitif kontrol ve Triton X negatif kontrol olarak kullanılmıştır. (b) MTT viability test assay sonuçları (1 gün 37 0 C).

38 Absorbance HA-AAm Interpenetrating Polymeric Networks (IPN) + H 2 C= CHCNH 2 + H 2 C=CHCNHCH 2 NHCCH =CH 2 (Matrix components) R6G R6G in PBS Rhodamine 6G y = x R 2 = H 3 C CH 3 CH 2 NH C CH 2 CH 3 CH 3 Cl NHCH 2 CH 3 % X AAm Dye concentration (mg) λ= 527nm in PBS 5wt%HA

39 HA ve oxha partiküllerinden In vitro R6G salımı Rhodamin 6G (0.10 mg) salım ortamı PBS. Kontrol için dogrudan diyaliz membranına yükleme ile yapıldı. Uygun santrifüjleme ile partiküller istenilen boyutta ayrılabilirler. Boyut:262 nm Sahiner et al., J. Biomater. Sci. Polym. Edn, 19(2), , 2008

40 Ses telleri için Doku mühendisiliği uygulamaları Hz aralığında iki yapıda zaman ve frekansdan bağımsız =Kovalent karakterli yapı DXN IPN ler bulk HA hidrojeller ile karsılaştıtılınca saha sert ve Enerji absorplayıcı özelliğe sahip HA-bulk (üste) ve IPN yapısındaki (aşagıda) düşük Frekanslı viskoelastik davranışları. (Constant strain 0.2% T=37 CG =elastik, G : loss modilus) Ölçülen Hidrojel vizkoelastisileri (G and G ) bu materyallerin insan ses telleri ile karşılaştırılabilir boyuttatır. (The measured elastic moduli for human vocal fold LP ( Pa) )

41 Normalized Absorbance Normalized Absorbance Normalized Absorbance MTT Assay on NIH/3T3 Fibroblast Cell Cell cytotoxicity of HA particles mg/ml 0.2 mg/ml 0.02mg/ml 0.002mg/ml HA particle concentration Fe(III)-HA cytotoxicity Cell Cytotoxicity HA-Gd Con. (mg) mg/ml 0.2 mg/ml 0.02mg/ml 0.002mg/ml HA-Gd+3 particles

42 TG % Particle Diameter (nm) (a) 2500 HA HA-CYs-AMPS HA-CYs-APTMACl (b) ph (c) HA HA-CYs-AMPS HA-CYs-APTMACl 10% 12% SEM images of (a) HA, (b) HA-CYs-AMPS and HA-CYs-APTMACl polymeric particles. Temperature ( 0 C) The comparison of thermograms of HA and HAbased ionic particles.

43 Released amount of drug (mg drug/g dryparticle) Released amount of drug Mg drug/g dry particle Drugs and their release profiles from HA and Modified HA particles NH 2 CH 3 HA ph 7.4 (36%) HA-CYs-AMPS ph 7.4 (92%) H 2 N 8 4 N N CH 3 Trimethoprim (TMP): A n bacteriostatic antibiotic) HA ph 1.1 (25%) HA-CYs-AMPS ph 1.1 (100%) Time(min) CH 3 CH H 3 C HA ph 7.4 (7%) HA ph 1.1 (7%) H Naproxen (NN) :Non steroidal Anti-inflammatory drug HA-CYs-APTMACl ph 1.1 (78%) HA-CYs-APTMACl ph 7.4 (100%) Time(min) Chemical structure of the model drug trimethoprim (TMP). And TMP release profile from HA and HA-Cys-AMPS particles at different phs. [TMP loading: 45 mg HA and 100 mg HA-CYs-AMPS particles placed in 50 ml 250 ppm TMP aqueous solution for 24 h at 25 o C. Release medium: 50 ml PBS, ph 7.4 and ph 1.1 with 30 mg HA and 80 mg HA-CYs-AMPS drug loaded particle].

44 Particle size (nm) Cumulative released amount of drug/ g dry particles The zeta potential of HA based particles; and their thermal behaviors and drug release studis HA- HA-CYs HA-CYs-NIPAm HA-Fe-CYs (a) H 2 N S N H N Zeta Potential/ mv HA-= -30 mv, HA-CYs= mv, HA-CYs-NIPAm = mv and HA-Fe-CYs = mv ( Bare HA=-35 mv) Sulfamethozale (SMZ), a sufonamide bacteriostatic antibiotic (b) HA-Fe-CYs HA-CYs-NIPAm HA Temperature ( o C) Temperature dependence of hydrodynamic diameters of HA-Cys-NIPAM particles Time/hour SMZ release profile from HA), HA-CYs-NIPAm, and HA-CYs-Fe in PBS at 37 o C and ph 7.4.

45 P(4-VP) modifiye edilebilen nanoyapilar 4-vinyl pyridine (4-VP) nin Poly- or kopolimerleri çok ilginç özelliklere sahiptir ve sensör ve actuators, metal içeren host/ligand kromoforlarında, antimicrobial materyal vb alanlarda uygulamalara sahiptir. N N N N N N P(4-VP) değişik asitlik ve bazlık (amphoteric) and hidrofilik-hydrofobik özellikler (amphiphilic) özellikleri vardır H N H 2 N H K b =1.5X10-9

46 4-VP den hazılanan Poli ve kopolimerik hidrojel ve nanopartiküllerden hazırlanan sistemlerin yapı ve nanomimarisinin kontrol edilmesi çok özel ve üstün özellikler oluşturabilir. Bu amaçla: 1) p(4-vp) esaslı hidrojel, partikülleri ve kompozitleri hazırlanarak fonksiyonel materyal olarak kullanılmışlardır. 2) Bunların kullanım alanları -İlaç salım sistemleri -Antimikrobial materyal -Çevreden toksik türlerin uzakaştırılması

47 P(4-VP) based particle synthesis in oil-in water microemulsion 4-VP 4-VP 4-VP 4-VP 4-VP il-in-water Microemulsiom system : SDS 4-VP 4-VP 4-VP 4-VP 4-VP I Polymerization & Crosslinkling 4-VP N Crosslinker DVB or EGDMA Sub(micron) p(4-vp) particles

48 TEM images of p(4-vp) particles (a) (b) 500 nm 500 nm (c) (d) 100 nm 100 nm TEM images of 5 % DVB) crosslinked (X-ed) (a) and (b), and 7.5% EGDM X-ed p(4-vp) (c) and (d).

49 Intensity Diameter (nm) The schematic representation of the p(4-vp) nanoparticles synthesis N + N N 0.1 M SDS APS, 75 C N ph<4 H N + N H + 4-VP EGDMA N mmol 2.68 mmol 3.12 mmol Diameter (nm) SDS concentration (x10-2 M)

50 Cu ve Ag partikülleri içeren p(4-vp) komopozitlerin SEM görüntüleri Cu Ag

51 p(4-vp) esaslı partiküllerin antibakterial özelliklerinin belirlenmesi MIC (Minimum Inhibitory Concentration) and MBC (Minimum Bactericidal Concentration) were evaluated against: -S. aureus (ATCC 6538), -P. aeruginosa (ATCC 9027), -B. subtilis (ATCC 6633), -E. coli (8739). MIC tests were studied for 50, 100, 250, 500, 1000, microgram / ml polymers, using 10^5 CFU/ml bacterial suspension in LB broth. After h, 35 C in shaking waterbath incubation LB broth were visually inspected and turbidity noted. Tubes were vortexed and 1/ diluted sample prepared, from these 10 microliter sample were plated on %1 LB agar and incubated 18-24h, 35 C. Colonies were counted and MIC and MBC values of the polymer were determined. -Positively charged P(4-VP) particles -metal particle containing P(4-VP) particles -doubly charged P(4-VP) particles Increased antibacterial property

52 Sonuçlar Nanoteknoloji istenilen boyutta, özellikte, Morfoljide, fonksiyonalitede yapılar hazırlammıza olanak sağlayarak onların biyomedikal alanlrada kullanılmasına olanak sağlamaktadır. Fundings -Turkish Academy of Science (TUBA), -Canakkale nsekiz Mart University TESEKKURLER

53 Acknowledgements -Prof. Dr. Vijay T. John (TU, Chemical Eng.) -zgur zay (PhD student) -Sultan Butun (PhD student) -Pinar Ilgin (PhD student) -Selin Basaran (PhD student) -Dr. Alper Akcali (CMU Medical School) Fundings -Turkish Academy of Science (TUBA), -Canakkale nsekiz Mart University