Staphylococcus aureus Suşlarında Panton-Valentine Lökosidin (PVL) Genlerinin Araştırılması I. Özet Staphylococcus aureus, taşıdığı virülans faktörleri

Transkript

1 T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Staphylococcus aureus Suşlarında Panton-Valentine Lökosidin (PVL) Genlerinin Araştırılması Yürütücü: Uzm. Dr. Zeynep Ceren Karahan Proje No: HPD Başlama Tarihi: Bitiş Tarihi: Rapor Tarihi: Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara-2007

2 Staphylococcus aureus Suşlarında Panton-Valentine Lökosidin (PVL) Genlerinin Araştırılması I. Özet Staphylococcus aureus, taşıdığı virülans faktörleri ve kendisine karşı kullanılan antibiyotiklere hızlı direnç geliştirme potansiyeli nedeniyle günümüzün en önemli enfeksiyon etkenlerinden biridir. Panton-Valentine lökosidini (PVL), özellikle toplum kökenli cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları ile akut nekrotizan pnömonilerden izole edilen S. aureus suşları tarafından salgılanan önemli bir virülans faktörüdür. PVL, birbiri ile sinerjik etki gösteren iki komponentli bir toksin olup, konak lökositlerinin membranlarında porlar oluşturarak bu hücrelerin erimesine neden olmaktadır. PVL sentezleyen suşlar tarafından oluşturulan enfeksiyonlar daha şiddetli seyretmekte, hatta akut nekrotizan pnömonilerde olduğu gibi ölümle sonuçlanabilmektedir. Özellikle toplum kökenli suşlar tarafından sentezlenmekle birlikte, yapılan çalışmalar PVL-pozitif S. aureus suşlarının hastanelerde yayılabildiğini, hatta hastane kaynaklı salgınlara neden olabildiğini göstermektedir. Bu projede, ülkemizde hastane ve toplum kökenli S. aureus suşlarında PVL varlığı ve sıklığının araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, hastane kökenli 293, toplum kökenli 74 adet olmak üzere toplam 367 Staphylococcus aureus suşu dahil edilmiştir. Hastane kökenli suşlar, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İbn-i Sina Hastanesi (İSH), İstanbul Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi (HNH) ve Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi (HTH) nin çeşitli kliniklerinde yatarak tedavi gören hastalardan; toplum kökenli suşlar ise, HNH nin 1

3 çeşitli polikliniklerine ayaktan tedavi için başvuran ve son 1 ay içerisinde hastaneye yatmamış veya antibiyotik tedavisi görmemiş olan hastalardan enfeksiyon etkeni olarak izole edilmişlerdir. Suşların identifikasyonu standart mikrobiyolojik yöntemler (Koloni morfolojisi, Gram boyama, katalaz ve koagülaz testleri) kullanılarak gerçekleştirilmiş; metisilin direnci, Klinik ve Laboratuar Standartları Enstitüsü (CLSI) önerileri doğrultusunda Oksasilin disk difüzyon yöntemi ile belirlenmiştir. Bütün suşlardan klasik fenol-kloroform yöntemi kullanılarak DNA ekstrakte edilmiş ve DNA örnekleri -20 C de muhafaza edilmiştir. Bütün örneklerde metisilin direncinden sorumlu meca geni ve PVL sentezinin kodlandığı luks-pv ve lukf-pv genleri ile metisilin dirençli bulunan suşlarda stafilokokkal kromozom kaset (SCCmec) tipleri, literatürde belirtilen yöntemler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile araştırılmıştır. PVL genlerinin araştırılmasında iki ayrı primer çifti (luk-pv1+luk-pv2 ve PVLup+PVLdn) ve her bir primer çifti için iki ayrı yapışma sıcaklığı kullanılmıştır. Farklı primer çiftleriyle alınan farklı sonuçların doğrulanması amacıyla, elde edilen amplikonlar DNA dizi analizi ve enzimle kesim (BspH1) yöntemlerine tabi tutulmuşlardır. PVL-pozitif suşların birbirlerinden ayrımı için, kromozomal DNA ekstraksiyonunu takiben SmaI enzimi ile kesim sonrasında pulsed field gel electrophoresis (PFGE) uygulanmıştır. Değerlendirilen 367 S. aureus suşunun 32 tanesi (%8.7) meca negatif (MSSA), 335 tanesi (%91.3) meca pozitif (MRSA) bulunmuştur. Luk-PV1 ve luk-pv2 primerleri kullanılarak 52 C de gerçekleştirilen PCR analizi sonucunda, 32 MSSA izolatının 5 i (%15.6) PVL-pozitif, 27 si (%84.4) PVL-negatif bulunurken; 335 MRSA izolatının 203 ü (%60.6) PVL-pozitif, 132 si (%39.4) PVL-negatif bulunmuştur. Luk-PV1 ve luk-pv2 primerleri ile yüksek oranda PVL pozitifliği tespit edilmesi üzerine, sonuçları doğrulamak amacıyla, elde edilen amplikonlardan ikisine aynı primerlerle iki yönlü DNA dizi analizi 2

4 yapılmıştır. Elde edilen DNA dizisinin PVL dizisinden farklı olduğu, buna karşılık Staphylococcus aureus cell wall associated fibronectin-binding protein (= conserved hypothetical protein = cell surface protein ) DNA dizisi ile %99 oranında identik olduğu görülmüştür. Bu nedenle, MRSA izolatları arasında %60 lara varan PVL pozitifliğinin primerlere ait hatalı bağlanmadan kaynaklandığı sonucuna varılarak çalışılan tüm suşlar, PVLup ve PVLdn primerleri kullanılarak yeniden değerlendirilmiştir. Bu primerlerle uygulanan PCR reaksiyonu sonucunda, değerlendirilen 367 suşun hiçbirinin PVL genlerini taşımadığı görülmüştür. İki sonuç arasındaki bu büyük fark nedeniyle, sonuçların doğrulanması için ilk primerlerle (luk-pv1 ve luk-pv2) pozitif bulunan tüm amplikonlar yapışma sıcaklığı arttırılarak yeniden değerlendirilmiş, 161 suş (%48) PVLpozitif bulunmuştur. Bu 161 suştaki PVL pozitifliğini, hatalı bağlanma sonucu amplifiye olan amplikonlardan ayırt edebilmek için BspH1 (T/CATGA, New England Biolabs, İngiltere) enzimi ile kesim yapılmış, biri hastane kökenli olmak üzere toplam 12 örneğin (7 yara, 4 idrar, bir eklem mayi) PVL-pozitif olduğu tespit edilmiştir. PVL-pozitif izolatlar, ikinci primer çifti (PVLup ve PVLdn) ile 48 C yapışma sıcaklığında tekrar çalışılmış, 12 örneğin 5 i bu yapışma sıcaklığında pozitif reaksiyon vermiştir. SCCmec tipleri değerlendirildiğinde, klinik izolatlarının çoğunluğunda (%78,7-100) SCCmec-tip III, poliklinik izolatlarında ise SCcmec tip-iiib nin hakim olduğu (%41.7) tespit edilmiştir. PFGE analizi sonucunda, PVL-pozitif suşların birbirlerinden tamamen farklı oldukları tespit edilmiştir. Sonuçlarımız, ülkemizde toplum kökenli S. aureus izolatlarının yaklaşık %15 inin, hastane kökenli izolatların ise %0.34 ünün PVL genlerini taşıdığını göstermektedir. İlk kez bu çalışmada idrardan izole edilne S. aureus suşlarında PVL genleri varlığı gösterilmiştir. Toplum kökenli izolatlarda, ülkemizde, SCCmec tip-iiib nin hakim olduğu, bununla 3

5 birlikte tiplendirilemeyen izolatların çokluğu dikkat çekmiştir. PVL-pozitif bulunan suşların ayrı klonlardan köken aldığı anlaşılmıştır. PVL pozitifliği, S. aureus suşlarının virülansını önemli ölçüde arttırmakta ve neden olduğu hastalıkların klinik seyrini ağırlaştırarak komplikasyon gelişme riskini yükseltmektedir. PVL-pozitif suşların hastane ortamında yayılması, bu suşların antibiyotik direnç determinantlarını da üzerinde toplaması ile daha dirençli ve virülan S. aureus suşlarının ortaya çıkma riskini arttırmaktadır. PVL genlerinin stafilokok türleri arasında yayılması, stafilokoklara bağlı enfeksiyonların yol açtığı morbidite ve mortalite oranlarının arttıracağından, stafilokokların yayılmasını önleyecek sıkı tedbirlerin bir an önce alınması gerekmektedir. 4

6 Investigation of Panton-Valentine Leukocidine (PVL) Genes in Staphylococcus aureus Isolates I. Summary Staphylococcus aureus is one of the most important infectious agents owing to its virulence factors and ability to develop resistance against the antimicrobial agents used to eradicate it. Panton-Valentine leucocidin (PVL), is an important virulence factor of S. aureus which is most frequently isolated from strains obtained from community acquired skin and soft tissue infections and acute necrotising pneumonia. PVL is a bi-component cytotoxin acting synergistically on the leucocytes of the host. It leads to pore formation on the membranes of the leucocytes and cell lyses. Infections due to PVL-producing strains of S. aureus are shown to be more aggressive and even fatal. Although PVL is more frequently synthesized from community-acquired S. aureus strains, studies show that they can spread in the hospital environment. In this study, we aimed at investigating the presence and frequency of S. aureus strains producing PVL among hospital and community acquired infections. A total of 367 (293 hospital acquired and 74 community-acquired) Staphylococcus aureus strains were investigated. Hospital-acquired strains were obtained from patients hospitalized in different clinics of Ankara University Medical Faculty İbn-i Sina Hospital (İSH), Istanbul Haydarpaşa Numune education and Investigation Hospital (HNH) and Hacettepe University Medical Faculty Hospital (HTH). Community acquired strains were obtained from out-patients who had attended to various policlinics of HNH without a 5

7 history of hospitalization or antibiotic usage in the previous month. Identification of the strains was based on standart microbiological procedures (colony morphology, Gram stain, catalase and coagulase reactions) and methicillin resistance was determined by oxacillin disk diffusion method according to the suggestions of Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Genomic DNA was extracted by the classical phenol-chlorophorm extraction method from all S. aureus strains. The presence of meca (responsible for methicillin resistance), luks-pv and lukf-pv genes (encoding the PVL) and determination of staphylococcal chromosome cassette (SCCmec) types were done by polymerase chain reaction (PCR) according to the previously published methods. Two different primer pairs (luk-pv1+luk-pv2 and PVLup+PVLdn) with two different annealing temperatures were used in the PVL-PCR. In order to confirm the different results obtained by different primers, the amplicons were subjected to DNA sequence and restriction endonuclease (BspH1) analyses. The clonality of the PVL-positive strains were investigated by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Of the 367 S. aureus strains, 32 (%8.7) were meca negative (MSSA), and 335 (%91.3) were meca positive (MRSA). PCR amplification with luk-pv1 and luk-pv2 primers at 52 C yielded 5 (%15.6) PVL-positive MSSA isolates and 203 (%60.6) PVLpositive MRSA Due to the high frequency of PVL-positivity, bi-directional DNA sequence analysis was performed with the same primers to two of the amplicons in order to confirm the accuracy of the amplification. The sequence of these amplicons were different from the sequence of PVL gene, and it showed a 99% identity with the sequence of Staphylococcus aureus cell wall associated fibronectin-binding protein (= conserved hypothetical protein = cell surface protein ). The results showed that the high positivity was due to cross binding of the primers. The PVL gene of all the strains were amplified with another 6

8 set of primers (PVLup and PVLdn) and none of the strains was found to be positive. When the annealing temperature of the first pair of primers was increased, again 161 strains (48%) were found to give positive results. In order to find true PVL-positive strains, restriction endonuclease analysis with BspH1 was performed and 12 strains (one hospital, 11 community acquired; 7 wound, 4 urine and 1 synovial fluid specimens) were found to be true PVL-positives. PVL-positive isolates were amplified with the second set of primers at a lower annealing temperature, and 5 of them were found to give positive results. Most of the SCCmec types of the hospital isolates (%78,7-100) was found to type- III, while in community-acquired isolates SCCmec type-iiib (%41.7) was found to be more prevalent. PFGE analysis revealed that all the PVL-positive strains were different from each other. Our results shoe that, nearly 15% of community-acquired and 0.43% of hospitalacquired S. aureus strains carry the PVL gene. This is the first study showing the presence of PVL-positive S. aureus strains among urinary isolates. In community acquired S. aureus strains, the meca determinant was most frequently carried on type-iiib SCCmec element. one striking result of the study was the high incidence of the untypeable patterns in SCCmec multiplex PCR. All the PVL-positive strains were found to be of different clonal origins, as shown by PFGE. PVL-positivity increases the virulence of S. aureus strains and the frequency of complications of infections due to these strains increases. The dissemination of PVL-positive strains in hospital environments increases the risk of occurance of more virulent and resistant S. aureus strains under strong antibiotic pressure. The dissemination of PVl determinant among staphlococci would lead to an increase in the morbidity and mortality of these infections, thus strong prevention and control measures should be undertaken. 7

9 II. Amaç ve Kapsam Staphlococcus aureus, günümüzün en önemli enfeksiyon etkenlerindendir. Özellikle son yıllarda ortaya çıkan direnç problemi nedeniyle, gerek hastanede yatan, gerek poliklinikte tedavi gören hastalarda ciddi problem oluşturmaktadır. Ortaya çıkarttığı enfeksiyonların spektrumu hafif yüzeysel cilt enfeksiyonlarından hayatı tehdit eden bakteriyemi ve endokardite kadar değişiklik göstermektedir. Toksik şok sendromu gibi toksinleri aracılığı ile ortaya çıkan enfeksiyonlar da yüksek mortalite ile seyretmektedir. Özellikle yumuşak doku ve cilt enfeksiyonları ile toplumdan kazanılmış pnömonilerden izole edilen S. aureus suşlarında, patojeniteden sorumlu olan bir lökosidin tespit edilmiştir. Panton-Valentine lökosidini (PVL) olarak adlandırılan bu lökosidin, özellikle toplum kökenli metisilin dirençli S. aureus (MRSA) suşlarında sık görülmekte ve bu suşların hastane ortamlarında da yayılmaya başladığı bilinmektedir. Ülkemizde, özellikle hastane enfeksiyonu etkeni olarak MRSA izolasyon sıklığı gün geçtikçe artmaktadır. Toplumdan edinilmiş enfeksiyonlarda da S. aureus izole edilmekle beraber, bu suşların karakterizasyonuna dair bir çalışma bulunmamaktadır. Panton-Valentine Lökosidinleri (PVL), toplumdan edinilmiş S. aureus suşlarında, özellikle MRSA suşlarında tespit edilmiştir. Bu suşların varlığı ve sıklığı üzerine son yıllarda yapılan çalışmalar, özellikle Avrupa ve Amerika da PVL (+) S. aureus izolatlarının artmakta olduğunu göstermektedir. Bu konuda ülkemizde yapılmış bir çalışma bulunmamaktadır. PVL salgılayan suşların toplumdaki sıklığının ve bu suşların direnç ve virülans karakteristiklerinin belirlenmesi, uygun enfeksiyon kontrol önlemlerinin alınması açısından önemlidir. Bu projenin amacı, ülkemizde hastane ve toplum kökenli S. aureus suşlarında PVL varlığı ve sıklığının araştırılmasıdır. 8

10 III. Materyal ve Yöntem Staphylococcus aureus Suşları: Bu çalışmaya, hastane kökenli 293, toplum kökenli 74 adet olmak üzere toplam 367 Staphylococcus aureus suşu dahil edilmiştir. Hastane kökenli suşların 139 u Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İbn-i Sina Hastanesi (İSH) nin Cerrahi (Genel Cerrahi, Beyin Cerrahisi, Göğüs Cerrahisi, Ortopedi, KBB, Üroloji) ve Dahiliye (Endokrinoloji, Hematoloji, İntaniye, Nefroloji, Nöroloji, Onkoloji) kliniklerinde tarihleri arasında yatan 137 hastadan; 108 i İstanbul Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi (HNH) nin Cerrahi (Genel Cerrahi, beyin Cerrahisi, Ortopedi, Plastik cerrahi ve Reanimasyon) ve Dahiliye (Dahiliye, Diyaliz, Nöroloji, İntaniye) kliniklerinde tarihleri arasında yatarak tedavi gören 95 hastadan ve 46 sı da Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi (HTH) nin çeşitli kliniklerinde (Anestezi, Beyin Cerrahi, Beyin Cerrahi Devamlı Bakım, Büyük Acil, Dahiliye, Dahiliye Devamlı Bakım, Genel Cerrahi, Genel Cerrahi Devamlı Bakım, Göğüs Devamlı Bakım, Nöroloji, Plastik Cerrahi, Üroloji, Yanık) tarihleri arasında yatarak tedavi gören farklı hastalardan enfeksiyon etkeni olarak izole edilmiştir. Toplum kökenli S. aureus suşları, HNH nin çeşitli polikliniklerine tarihleri arasında ayaktan tedavi için başvuran ve son 1 ay içerisinde hastaneye yatmamış veya antibiyotik tedavisi görmemiş olan farklı hastalardan enfeksiyon etkeni olarak izole edilmişlerdir. Aynı hastanın farklı enfeksiyon bölgelerinden S. aureus izole edildiğinde bu suşlar çalışmaya dahil edilmiş, ancak aynı enfeksiyon bölgesine ait birden fazla suş çalışılmamıştır. 9

11 Suşların identifikasyonu standart mikrobiyolojik yöntemler (Koloni morfolojisi, Gram boyama, katalaz ve koagülaz testleri) kullanılarak gerçekleştirilmiş; metisilin direnci, Klinik ve Laboratuar Standartları Enstitüsü (CLSI) (1) önerileri doğrultusunda Oksasilin disk difüzyon yöntemi ile belirlenmiştir. DNA Ekstraksiyonu: Suşlardan genomik DNA ekstraksiyonunda, literatürde belirtilen Fenol-Kloroform ekstraksiyon yöntemi kullanılmıştır (2). Kısaca, her bir suşun kanlı agar besiyerinde 37 C o de bir gecelik kültürünü takiben alınan 1 öze dolusu koloni, 100 µl erime tamponu (20 mm Tris HCl, 140 mm NaCl, 5 mm EDTA [ph 8.0]) içerisine toplanmış, üzerine 3 U lizostafin (Sigma, Almanya) eklenerek 37 o C de 3 saat bekletilmiştir. Bu süre sonunda 200 µl steril distile su ilave edilerek, 95 C de 5 dakika tutulmuştur. Üzerlerine 300 µl fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1) eklenerek DNA ekstrakte edilmiş, kloroform ile yıkamayı takiben saf etanolde DNA çöktürülmüş ve %70 lik alkolle yıkanmıştır. Elde edilen DNA, 100 µl steril distile su içerisinde çözdürüldükten sonra PCR de şablon olarak kullanılmıştır. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) İçin DNA Ekstraksiyonu: 3 ml Brain-heart broth içerisinde 37 C de 1 gece inkübe edilen bakteri süspansiyonu, xg de çöktürülmüş, üzerine hücre süspansiyon tamponu (10 mm Tris- HCl, 50 mm EDTA, 20 mm NaCl) eklenerek tekrar süspanse edilmiştir.. Süspansiyon 10

12 McFarland 5 çizelgesine karşılık gelecek şekilde yoğunluğu ayarlandıktan sonra, 150 µl si alınmış ve 150 µl % 1.5 lik düşük erime ısılı agaroz (Agaroz-Low melt, AppliChem, Almanya) ile karıştırılmıştır. Karışımdan 100 er µl alınarak kalıp (plug) içerisine pipetlenmiş, kalıplar katılaştıktan sonra 2 µl lizostafin (1 mg/ml) eklenen 500 µl erime tamponu (10 mm Tris-HCl (ph 7.2), 50 mm NaCl, 50 mm EDTA, % 0.2 deoxycholate, % 0.5 Sarcosyl) içerisinde 2 saat süreyle 37 Cº de çalkalamalı su banyosunda inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrasında erime tamponu uzaklaştırılıp kalıp üzerine 3 µl proteinaz K (50µg / ml) ve 500 µl PKtamponu (250 mm EDTA, % 1 Sarcosyl) eklenerek 50 Cº de 2 saat bekletilmiştir. Daha sonra kalıplar, dört defa 1000 µl TE tamponu (10 mm Tris-HCl, 50 mm EDTA) içerisinde yirmişer dakika çalkalanarak yıkanmış ve son yıkama işleminden sonra TE tamponu içerisinde +4 Cº de saklanmıştır (3). meca Geni Amplifikasyonu: Metisilin direncinin tanımlanmasında altın standart olarak kabul edilen meca geninin poimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile amplifikasyonunda daha önce tanımlanan (4) ve Johnsson ve ark. (5) tarafından modifiye edilen yöntem kullanılmıştır. Bu amaçla, MecA1 (5 GTA GAA ATG ACT GAA CGT CCG ATA A3 ) ve MecA2 (5 CCA ATT CCA CAT TGT TTC GGT CTA A3 ) oligonükleotid primerleri kullanılarak, 310 bç lik meca geni bölgesi PCR yöntemi ile amplifiye edilmiş, elde edilen ürünler %2 lik agaroz jel elektroforezine tabi tutulduktan sonra ethidium bromid ile boyanarak UV altında görüntülenmiştir (Resim 1). 11

13 M bç 300 bç Resim 1: Metisilin dirençli S. aureus suşlarının meca geni amplikonları. M: Moleküler büyüklük belirteci (O Range Ruler 100 bp DNA ladder, Fermentas, Litvanya), 1-3,5-8: meca pozitif amplikonlar, 4: meca negatif amplikon. PVL Geni Amplifikasyonu: PVL genlerinin amplifikasyonunda iki ayrı primer çifti kullanılarak literatürde tanımlanan şekilde PCR yöntemi literatürde önerilen 52 C ve daha sonra 55 C yapışma sıcaklıkları kullanılarak uygulanmıştır (6). PCR amplifikasyonunda kullanılan luk-pv1 (5 GTA AAA TGT CTG GAC ATG ATC CA3 ) ve luk-pv2 (5 CAA (C/G)TG TAT TGG ATA GCA AAA GC3 ) oligonükleotid primerleri ile amplifiye edilen 433 bç lik bölge, luks-pv geninin son bölgesini ve lukf-pv geninin başlangıcını içerdiğinden iki genin de varlığını göstermektedir (Resim 2). Hisata ve ark. (7) tarafından kullanılan PCR yöntemi ile PVL genlerinin amplifikasyonunda ise PVLup (5 AAG ACT ATT AGC TGC AAC ATT GTC3 ) ve PVLdn (5 AAT CTA TCT GTT TAG CTC ATA GGA3 ) primerleri kullanılarak luks-pv ve lukf-pv 12

14 genlerini içine alan 1918 bç lik bir bölge 50 ve 48 C yapışma sıcaklıklarında amplifiye edilmiştir (Resim 3). Reaksiyonlarda pozitif kontrol olarak GRE14 suşu kullanılmıştır. Her iki amplifikasyon sonucunda elde edilen PCR ürünleri %2 lik agaroz jel elektroforezine tabi tutulduktan sonra etidyum bromid ile boyanarak UV altında görüntülenmiştir M 433 bç Resim 2: luk-pv1 ve luk-pv2 primerleri ile 52 C de uygulanan PVL-PCR amplikonları. M: Moleküler büyüklük belirteci (O Range Ruler 50 bp ladder, Fermentas, Litvanya); 1: Pozitif kontrol (GRE14); 4, 6, 7, 9-13, 15-17, 19-21: PVL-pozitif PCR amplikonları; 2, 3, 5, 8, 14, 18: PVL-negatif PCR amplikonları bç Resim 1 3: 2 PVLup 3 4 ve PVLdn 5 6 primerleri 7 8 ile 9 uygulanan PVL-PCR amplikonları M: Moleküler büyüklük 20 M belirteci (O Range Ruler 50 bp ladder, Fermentas, Litvanya); 1: Pozitif kontrol (GRE14); 2-20: Resim 2 deki aynı numaralara karşılık gelen örneklerin amplikonları. 13

15 DNA dizi analizi: Luk-PV1 ve luk-pv2 primerleri ile pozitif sonuç alınan amplikonlardan rastgele seçilen iki tanesi DNA dizi analizine tabi tutulmuştur. Elde edilen PCR ürünleri, PCR pürifikasyon kiti (MoBio, ABD) kullanılarak temizlenmiş ve daha sonra her bir primerle ayrı ayrı tek yönlü amplifikasyonu takiben, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İbn-i Sina Hastanesi İmmünoloji Laboratuarı nda bulunan API Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, ABD) cihazında DNA dizi analizi gerçekleştirilmiştir (Resim 4). Elde edilen DNA dizisi, BLAST programı kullanılarak ( Gen Bankasında kayıtlı dizilerle karşılaştırılmıştır. Resim 4: luk-pv1 primeri ile uygulanan DNA dizi analizi görüntüsü. 14

16 Enzimle Kesim Luk-PV1 ve luk-pv2 primerleri ile amplifiye edilen ürünün PVL geni olmadığının anlaşılması üzerine, amplfifye edilen dizi ile PVL amplikonunun birbirinden ayrılmasını sağlamak için her iki dizi üzerinde bulunan enzimle kesim bölgeleri, Internet üzerinde WebCutter ( programı kullanılarak araştırılmış ve BspH1 enziminin (T/CATGA, New England Biolabs, İngiltere) sadece PVL amplikonlarını iki ayrı kesim bölgesinden (151 ve 331. nükleotidler) kestiği, ancak diğer amplifikasyon ürünü üzerinde kesim noktasının bulunmadığı anlaşılmıştır. PVL amplikonları (433 bç) BspH1 enzimi ile kesimi sonucunda, ve 102 bç lik üç amplikona ayrılmaktadır. Gerçek PVL amplikonları ile hatalı bağlanma sonucu elde edilen amplikonların birbirinden ayrılması için, luk-pv1 ve luk-pv2 primerleri ile elde edilen tüm amplikonlar 10U BspH1 enzimi ile 37 C de bir gece inkübe edilerek kesilmiş, kesim ürünleri %2 lik agaroz jel elektroforezine tabi tutulduktan sonra etidyum bromid ile boyanarak UV altında görüntülenmiştir (Resim 5) M 433 bç 180 bç 151 bç 102 bç Resim 5: Luk-PV1 ve luk-pv2 primerleri ile elde edilen amplikonların BspH1 enzimi ile kesim sonuçları. M, Moleküler büyüklük belirteci (50 bp O Range Ruler, Fermentas, Litvanya). 1, kesilmemiş amplikon. 2-4, hatalı amplifikasyon ürünleri (kesilmemiş ürün). 5-16, PVL-pozitif amplikonlar (180, 151, 102 bç ürünler). 15

17 SCCmec tip tayini: Oliveira ve delancestre nin (8) geliştirdiği multipleks PCR yöntemi kullanılarak SCCmec tip-i, -IA, -II, -III, -IIIA, -IIIB ve -IV tespiti yapılmıştır. Bu amaçla kullanılan primerler ve elde edilen amplikon büyüklükleri tablo 1 de görülmektedir. Buna göre, 342 ve 495 bç bant oluşturan amplikonlar tip-i, 342, 382 ve 495 bç bant oluşturan amplikonlar M tip-ia, 209, 284, 342 ve 381 bç bant oluşturan amplikonlar tip-ii, 209, 243, 303 ve 414 bç bant oluşturan amplikonlar tip-iii, 209, 243 ve 414 bç bant oluşturan amplikonlar tip-iiia, 209 bç tek bant oluşturan amplikonlar tip-iiib ve 342 bç tek bant oluşturan amplikonlar tip IV olarak tanımlanmıştır. Bant paternleri herhangi bir tiple uyum göstermeyen veya meca geni pozitif bulunduğu halde multipleks PCR yöntemi ile hiç bant gözlenmeyen suşlar tiplendirilemeyen olarak belirtilmiştir. SCCmec tayininde kontrol suşları olarak GRE14 (tip-iv), HPV107 (tip-ia), BK2464 (tip-ii), HUSA304 (tip-iii), HDE288 (tip-iv) ve HSJ216 (tipiiia) kullanılmıştır (Resim 6). Kontrol suşları, Sn. Herminia de Lancestre (Rockefeller Üniversitesi Mikrobiyoloji Laboratuarı, New York, ABD) ve Sn. Teruyo Ito (Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi Bakteriyoloji Departmanı, Tokyo, Japonya) ile görüşülerek kendilerinden alınmıştır. Elde edilen PCR ürünleri, %2 lik agaroz jel elektroforezine tabi tutulduktan sonra etidyum bromid ile boyanarak UV altında görüntülenmiştir. 16

18 Tablo 1: SCCmec tayininde kullanılan multipleks PCR primerleri, elde edilen amplikon büyüklükleri ve karşılık gelen SCCmec tipleri Primer Dizi (5-3 ) Amplikon büyüküğü SCCmec tipi CIF2 F2 CIF2 R2 KDP F1 KDP R1 MECI P2 MECI P3 DCS F2 DCS R1 RIF4 F3 RIF4 R9 RIF5 F10 RIF5 R13 IS431 P4 pub110 R1 IS431 P4 pt181 R1 TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG ATTTACCACAAGGACTA CCAGC AATCATCTGCCATTGGTGATGC CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG ATCAAGACTTGCATTCAGGC GCGGTTTCAATTCACTTGTC CATCCTATGATAGCTTGGTC CTAAATCATAGCCATGACCG GTGATTGTTCGAGATATGTGG CGCTTTATCTGTATCTATCGC TTCTTAAGTACACGCTGAATCG GTCACAGTAATTCCATCAATGC CAGGTCTCTTCAGATCTACG GAGCCATAAACACCAATAGCC CAGGTCTCTTCAGATCTACG GAAGAATGGGGAAAGCTACAC 495 I 284 II 209 II, III 342 I, II, IV 243 III 414 III 381 IA 303 IIIA M 1 M Resim 6: M1: Pozitif kontrollerden oluşturulan moleküler büyüklük belirteci ( bç), M2: Moleküler büyüklük belirteci (O Range Ruler 50 bp ladder, Fermentas, Litvanya), 1,5,12,18,19: SCCmec M1 M2 tip-iv 1 (342 2 bç); 3 2: SCCmec 4 5 tip-ii 6 ( bç); 11 3,9-11,17: SCCmec tip-iii 16 ( bç); 4,13,14: SCCmec tip-iiia ( bç); 6,7: Belirlenemeyenler; 8: SCCmec tip-i ( bç); 15,16: SCCmec tip-iiib (209 bç); 20: Negatif kontrol. 17

19 Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) : Kromozomal DNA içeren kalıp örneklerinin üçte biri, uygun tampon içerisinde 3 saat süreyle, 30 U SmaI restriksiyon endonükleazı ile 37 C de kesilmiştir. Kesim örnekleri %1.5 lik jele yüklenerek 6V da (başlangıç süresi 5.3, bitiş süresi 34.9) 20 saat süreyle CHEF DRII (BioRad, Amerika) PFGE cihazında yürütülmüştür (Resim 7). B A A A A A1 M A2 C D Resim 7: S. aureus izolatlarına ait PFGE paternleri 18

20 IV. Analiz ve Bulgular Değerlendirilen 367 S. aureus suşunun 32 tanesi (%8.7) meca negatif, 335 tanesi (%91.3) meca pozitif bulunmuştur. Bu nedenle, 32 S. aureus izolatı metisilin duyarlı (MSSA), diğerleri metisilin dirençli (MRSA) olarak değerlendirilmiştir. Luk-PV1 ve luk-pv2 primerleri kullanılarak 52 C de gerçekleştirilen PCR analizi sonucunda, 32 MSSA izolatının 5 i (%15.6) PVL-pozitif, 27 si (%84.4) PVL-negatif bulunurken; 335 MRSA izolatının 203 ü (%60.6) PVL-pozitif, 132 si (%39.4) PVL-negatif bulunmuştur. Literatürde S. aureus izolatları arasında ortalama olarak %2-10 arasında PVL pozitifliği bildirilmesine karşın (6, 9), değerlendirdiğimiz MRSA izolatlarında luk-pv1 ve luk-pv2 primerleri ile %60 gibi yüksek oranda PVL pozitifliği tespit edilmesi nedeniyle, elde edilen sonuçların doğruluğunu ortaya koymak üzere, luk-pv1 ve luk-pv2 primerleri ile elde edilen iki PVL-pozitif amplikonunun aynı primerler kullanılarak iki yönlü DNA dizi analizi yapılmıştır. Elde edilen DNA dizisi Gen bankasında ( mevcut olan PVL dizisi (Ulaşım numarası AB256039) ile karşılaştırıldığında, elde edilen amplikonların DNA dizisinin, 28 bç lik luk-pv1 primerinin son 18 bazı ile başlayıp, 29 bç lik luk-pv2 primerinin ilk 16 bazı ile bittiği, ancak arada kalan 313 bç lik bölümün PVL dizisinden tamamen farklı olduğu anlaşılmıştır (Tablo 2). Amplifiye edilen toplam 347 bç lik bölgenin DNA dizisinin karşılık geldiği dizi, BLAST programı ( kullanılarak araştırıldığında, amplifiye edilen bölgenin, Staphylococcus aureus cell wall associated fibronectin-binding protein (= conserved hypothetical protein = cell surface protein ) DNA dizisi ile %99 oranında 19

21 identik olduğu görülmüştür. Bu nedenle, MRSA izolatları arasında %60 lara varan PVL pozitifliğinin primerlere ait hatalı bağlanmadan kaynaklandığı sonucuna varılarak çalışılan tüm suşlar, yine luks-pv ve lukf-pv genlerini içine alan 1918 bç lik bölgeyi amplifiye eden PVLup ve PVLdn primerleri kullanılarak yeniden değerlendirilmiştir (7). Tablo 2: Genbankasında kayıtlı (Ulaşım numarası: AB256039) PVL dizisi ile luk-pv2 ve luk-pv2 primerleri ile amplifiye edilen gen bölgesine ait DNA dizisinin karşılaştırılması (boş kutular bir anlam taşımamaktadır). PVL dizi a tca tta ggt aaa atg tct gga cat gat cca aat tta ttt gtt gga Amp. dizi a atg tct gga cat gat cca cat caa aat atg atc PVL dizi tat aaa cca tat agt caa aat ccg aga gac tat ttt gtg cca gac aat Amp. dizi ttt tgg ttt gca tta cca gca gac caa gtg cca gta gga aga act gac PVL dizi gaa tta ccc cca tta gta cac agt ggt ttc aat cct tca ttt att gca Amp. dizi ttt gta aca gtt aat tca gat gga aca aat gta caa tgg agt cat gga PVL dizi act gtt tct cat gaa aaa ggc tca gga gat aca agt gaa ttt gaa ata Amp. dizi gca gga gca ggt gca aat aaa cca ctt caa caa atg tgg gaa tat gga PVL dizi acg tat ggc aga aat atg gat gtt act cat gct act aga aga aca aca Amp. dizi gta aat gat cct cat cgt tca cat gac ttt aaa ata aga aat aga agt PVL dizi cac tat ggc aat agt tat tta gaa gga tct aga ata cac aac gca ttt Amp. dizi ggc caa gta ata tat gac tgg cca act gtc cat att tat tct tta gaa PVL dizi gta aac aga aat tac aca gtt aaa tat gaa gtg aac tgg aaa act cat Amp. dizi gat tta tct aga gcg agt gat tat ttt agt gaa gct gga gcg aca cct PVL dizi gaa att aaa gtg aaa gga cat aat tga t atg aaa aaa ata gtc aaa Amp. dizi gct act aaa PVL dizi tca tca gtt gtt aca tca att gca ttg ctt ttg cta tcc aat aca gtt Amp. dizi g ctt ttg cta tcc aat PVL dizi gat gc Amp. dizi 20

22 PVLup ve PVLdn primerleri kullanılarak 50 C de uygulanan PCR reaksiyonu sonucunda, değerlendirilen 367 suşun hiçbirinin PVL genlerini taşımadığı görülmüştür. Ancak iki sonuç arasındaki bu büyük fark nedeniyle, sonuçların doğrulanması için ilk primerlerle (luk-pv1 ve luk-pv2) pozitif bulunan tüm amplikonların yeniden değerlendirilmesine karar verilmiştir. PCR reaksiyonunun yapışma sıcaklığı 3 C arttırıldığında (55 C ), daha önce pozitif reaksiyon veren bazı amplikonların negatifleştiği görülmüş, ancak yine de pozitiflik oranı %48 (161/335) olarak bulunmuştur. Gerçek PVL-pozitif amplikonları, hatalı bağlanma sonucu amplifiye olan amplikonlardan ayırt edebilmek için her iki dizi üzerinde bulunan enzimle kesim noktaları, Internet üzerinde bulunan WebCutter ( programı kullanılarak araştırılmıştır. PVL dizisi üzerinde iki adet (151 ve 331. nükleotidler) kesim noktası olan, ancak diğer amplikonlarda kesim noktası bulunmayan BspH1 (T/CATGA, New England Biolabs, İngiltere) enzimi seçilerek, luk-pv1 ve luk-pv2 primerleri ile 55 C de pozitif sonuç veren tüm amplikonlar enzimle kesilmiştir. Kesim sonucunda 12 örneğin [AÜTF İbn-i Sina hastanesinde yatan hastalardan izole edilen 139 S. aureus suşunun biri (%0.7), toplum kökenli olarak değerlendirilen 74 poliklinik suşunun 11 i (%14.86)] PVL-pozitif olduğu tespit edilmiştir. Gerçek PVL-pozitif olduğu anlaşılan 12 izolat, ikinci primer çifti (PVLup ve PVLdn) ile 48 C yapışma sıcaklığında PCR yöntemi ile tekrar çalışılmış, bu 12 örneğin 5 inden pozitif sonuç alınmıştır (Resim 8). 21

23 M M 1918 bç Resim 8: PVLup ve PVLdn primerleri ile 48 C yapışma sıcaklığında değerlendirilen PVL-pozitif örnekler. M, moleküler büyüklük belirteci (Mass Ruler, Fermentas, Litvanya), 1,5-8: Pozitif örnekler. 2-4, 9-12: Negatif örnekler. PK: Pozitif kontrol, NK: Negatif kontrol PVL-pozitif bulunan klinik izolat, AÜTF İbn-i Sina Hastanesi Acil Servisi ne trafik kazası sonucu getirilen ve Genel Cerrahi Kliniği ne yatırılan 43 yaşında bir erkek hastanın abse kültüründen izole edilmiştir. Poliklinik izolatlarının altısı yara kültüründen, dördü idrardan, biri ise eklem mayiinden izole edilmiştir. PVL pozitifliği tespit edilen suşların hepsi metisilin dirençli (MRSA) olup, hasta ve suşlara ait özellikler Tablo 3 de verilmiştir. Tablo 3: PVL-pozitif MRSA suşlarının izole edildiği hastaların ve suşların özellikleri Hasta No Klinik/poliklinik Örnek Cinsiyet Yaş SCCmec tipi 1 Dermatoloji polikliniği Yara E 46 IIIB 2 Ortopedi polikliniği Yara E 14 IIIB 3 Ortopedi polikliniği Yara E 55 T* 4 Dermatoloji polikliniği Yara E 33 IIIB 5 Ortopedi polikliniği Yara E 30 T* 6 Dahiliye polikliniği Yara K 27 IIIA 7 Ortopedi polikliniği Eklem mayii E? IIIB 8 Pediatri polikliniği İdrar K 8 IIIB 9 Üroloji polikliniği İdrar E 70 T* 10 Üroloji polikliniği İdrar K 9 T* 11 Üroloji polikliniği İdrar E? T* 12 Genel cerrahi kliniği Abse E 43 III E: Erkek, K: Kadın. *T: Tiplendirilemeyen 22

24 meca geni pozitif bulunan 335 S. aureus suşunun SCCmec tiplerinin dağılımı tablo 4 de, enfeksiyon yerine göre kromozomal kaset tiplerinin dağılımı ise tablo 5 de görülmektedir. görülmektedir. Klinik izolatlarının çoğunluğunda (%78,7-100) meca geni SCCmec-tip III kaset elemanı üzerinde taşınmaktadır. Poliklinik izolatlarında ise SCcmec tip-iiib nin hakim olduğu (%41.7), bunu tiplendirilemeyen izolatların (%40.3) izlediği tespit edilmiştir. PFGE analizi, hastane kökenli suşların büyük ölçüde klonal olduğunu ortaya koymuştur. Elde edilen bant paternlerinin değerlendirilmesinde Tenover kriterleri (10) kullanılmıştır. Buna göre, aynı bant paternini veren izolatlar bir tipi oluşturmuşlar, bu bant paterninden 3 bant farklılığı olan izolatlar bu tipin alt tipleri olarak kabul edilmişlerdir. Aralarında dört veya daha fazla bandın yerleşiminde farklılıklar bulunan izolatlar ise birbirlerinden farklı olarak değerlendirilmişlerdir (Üç bant kuralı). İSH de yatan hastalardan izole edilerek çalışmaya alınan 123 örneğin 97 sinin (%78.8) aynı klonal tipe ait olduğu anlaşılmıştır. Bu bant paternini veren izolatlardan birine multilokus sekans tiplemesi yapılmış (ek veri) ve klonal kompleks 8 (CC8) içerisinde tanımlanan ST-MRSA- III (Macar klonu) olduğu anlaşılmıştır. Toplum kökenli izolatların PFGE paternlerinin birbirlerinden farklı olduğu tespit edilmiştir. PVL-pozitif bulunan izolatların tümünün birbirinden ve PVL-pozitif bulunan hastane izolatının aynı hastaneden izole edilen diğer S. aureus örneklerinden farklı PFGE paternlerine sahip olduğu, dolayısıyla bu suşların ayrı klonal kökenlerden geldiği belirlenmiştir. 23

25 Tablo 4: Çalışılan MRSA suşlarının SCCmec tiplerinin dağılımı. Multipleks PCR yöntemi ile elde edilen bant paterninin herhangi bir tiple uyum sağlamayan veya meca geni taşıdığı halde bu yöntemle hiç bant vermeyen suşlar Tanımlanamayan grubuna dahil edilmiştir. SCCmec tipi AÜTF-Klinik n (%) Hacettepeklinik n (%) İstanbul-klinik n (%) İstanbulpoliklinik n (%) Toplam n (%) I (1,4) 1 (0,3) IA (1,1) 2 (2.8) 3 (0.9) II 1 (0,8) (0,3) III 99 (80,5) 46 (100) 74 (78,7) 4 (5,55) 223 (66,6) IIIA 2 (1,6) - 1 (1,1) 2 (2.8) 5 (1,5) IIIB (3,2) 30 (41.7) 33 (9,9) IV 1 (0,8) - 1 (1,1) 4 (5,55) 6 (1,8) Tiplendirilemeyen 20 (16,3) - 14 (14.9) 29 (40.3) 63 (18.5) Toplam Tablo 5: Değerlendirilen MRSA suşlarının izole edildikleri yere göre kromozomal kaset tiplerinin dağılımı Örnek I IA II III IIIA IIIB IV Tiplendirilemeyen Toplam Abse Balgam BAL Boğaz Burun BOS Dren Eklem mayii İdrar Kan Kateter Perikard mayii Periton mayii Plevra mayii Trakeal aspirat Üretral akıntı Vajen Yara Toplam

26 V. Sonuç ve Öneriler Çalışmamızın sonuçları şu şekilde sıralanabilir: 1- Değerlendirilen 367 S. aureus suşu içerisinde 12 si (%3.27) PVL-pozitif olarak bulunmuştur. MRSA izolatları açısından değerlendirilecek olursa bu oran %3.6 (12/335) olarak bulunmaktadır. Klinik izolatlar arasında tek PVL-pozitif örnek, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İbn-i Sina Hastanesi Genel Cerrahi Kliniğinde yatan 43 yaşında bir erkek hastanın cerrahi yerinde gelişen abseden izole edilmiştir. Hastane izolatları arasında PVL pozitifliği %0.34 (1/ 293) olarak hesaplanmıştır. Toplum kökenli S. aureus suşlarımızın %14.9 u (11/74) (toplum kökenli MRSA izolatları açısından bakılacak olursa %15.3 ü [11/72]) PVL-pozitif bulunmuştur. PVL-pozitif suşların %91.7 si (11/12) toplum kökenli, %8.3 ü (1/12) ise hastane kökenli olarak bulunmuştur. S. aureus izolatlarında PVL pozitifliği çeşitli çalışmalarda %0,44 (11) ile %72 (12) arasında değişmekle birlikte, PVL pozitifliği genel olarak %2-10 arasında bildirilmektedir (6, 9, 13, 14). Toplum kökenli izolatlarda PVL pozitifliği, hastane kökenli izolatlara kıyasla genellikle daha yüksek bulunmuştur (12, 15). Çalışmalar, aynı ülkede şehirler (16), hatta aynı şehrin hastaneleri (17) arasında bile PVL pozitifliğinin değişebildiğini göstermektedir. Bu çalışmalarda PVL pozitifliği sıklıkla cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları ve akut nekrotizan pnömonilerle ilişkilendirilmektedir (6, 12, 15, 16). Çalışmamızda değerlendirdiğimiz hastane kaynaklı PVL-pozitif MRSA izolatı abseden, toplum kökenli 11 izolatın altısı yara enfeksiyonlarından, dördü idrardan ve biri de eklem mayiinden izole edilmiştir. Bu çalışma, idrarda PVL-pozitif MRSA tespit edilen ilk çalışmadır. Sonuçlarımız, PVL-pozitif izolatların hemen her sistemde enfeksiyon oluşturabildiğini göstermektedir. 25

27 2- PVL pozitifliğinin değerlendirilmesinde en sık kullanılan yöntem Lina ve ark. larının (6) tanımladığı yöntemdir (9, 13-15, 17). Ancak çalışmamızın sonuçları, bu primerlerle belirtilen şartlarda uygulanan amplifikasyon reaksiyonunun hatalı bağlanmaya bağlı olarak stafilokoklarda korunmuş bir proteini kodlayan gen bölgesini amplifiye ettiğini göstermiştir. Böyle bir hatalı bağlanma, önceki çalışmalarda belirtilmemiş olmakla birlikte aynı yöntemi kullanan bazı çalışmalarda %86 ya varan pozitiflik bildirilmiştir (12). Sonuçların doğrulanması için, bu primer çiftinin kullanıldığı çalışmalarda, enzimle kesim veya DNA dizi analizi gibi yöntemlerle amplikonların PVL genine ait olduğunun gösterilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır. Çalışmamızda kullandığımız ikinci primer çifti olan PVLup ve PVLdn ile 50 C de uygulanan amplifikasyon reaksiyonunda pozitif kontrol haricinde hiçbir örnekten pozitif sonuç alınmaması, yapışma sıcaklığının azaltılması halinde bile 12 PVL-pozitif örneğin sadece 5 inin pozitif sonuç vermesi, bu primer çifti ile alınan sonuçların da doğruluğu konusunda şüphe uyandırmaktadır. Aynı primerle yapılan çalışmada da değerlendirilen 231 örneğin hiçbirinde PVL pozitifliğine rastlanmamıştır (7). Bu nedenle literatür sonuçları yorumlanırken, primer seçimine bağlı olarak gözlenebilecek yalancı pozitif ve yalanı negatif sonuçların akılda bulundurulması faydalı olacaktır. 3- Kromozomal kaset mec (SCCmec) tipleri değerlendirildiğinde, 335 S. aureus suşunun 223 ü (%66.6) tip-iii bulunmuştur. Tip-III, özellikle hastane izolatları arasında en sık karşılaşılan tipi oluşturmuştur. SCCmec-tip III, meca genine ek olarak pt181 laazmidi (tetrasiklin ve cıva direncinden sorumlu), Tn554 (makrolidlinkozamid-streptogramin direncinden sorumlu erma geni taşır) ve ΨTn554 (kadmiyum direncinden sorumlu) transpozonlarını taşır (18). Bu nedenle tip-iii 26

28 SCCmec elemanı taşıyan MRSA suşları sıklıkla antibiyotiklere çoklu direnç gösterme özelliğindedir ve SCCmec tip-i ve -II ile birlikte hastane kaynaklı MRSA izolatlarından en sık tespit edilen kromozomal kaset tipidir (11). 4- Toplum kökenli MRSA izolatlarında, SCCmec tip-iv ve V daha sık tespit edilmekte, hatta bu kromozomal kaset tiplerinin varlığı ve beraberinde PVL determinantının bulunması, bir MRSA suşunun toplum kökenli olduğunun kanıtı olarak ileri sürülmektedir (13). Bununla birlikte, herhangi bir kromozomal kaset tipinin herhangi bir enfeksiyon bölgesinden veya toplum kesiminden izole edilmeyeceğini gösteren bir veri bulunmamaktadır. Bizim değerlendirdiğimiz poliklinik izolatlarında, suşların çoğunun SCCmec-tipIIIB yi taşıdığı tespit edilmiştir. Tip-IIIB, Tn554 transpozonu ile pt181 plazmidini taşımaz (19, 20). Bu nedenle antibiyotik duyarlığı, tip-iii e kıyasla daha fazladır. Toplum izolatlarının daha az antibiyotik baskısı altında olması nedeniyle, tip III izolatlar hastane dışına çıktıklarında bazı direnç determinantlarını kaybediyor olabileceği gibi, toplumda sık bulunan tip-iiib kasetini taşıyan MRSA izolatlarının hastane ortamının yoğun antibiyotik baskısı altında yeni direnç genleri kazanması da sözkonusu olabilir. İlginç olarak, toplum kökenli MRSA izolatlarının göstergesi kabul edilen ve üzerinde meca geni haricinde direnç determinantı taşımayan tip IV SCCmec elemanı taşıdığı tespit edilen suşlar, değerlendirilen tüm toplum kökenli MRSA izolatlarının %5,6 sını, hastane kökenli izolatların ise yaklaşık %1 ini oluşturmuştur. Tip-IV SCCmec elemanı taşıyan bu MRSA izolatlarının hiçbirinde PVL genleri bulunmamıştır. Bizim tplumumuzda PVL genlerinin yayılmasında tipiiib (PVL-pozitif suşların %41,6 sında) rezervuar görevi görüyor olabilir. Hastane kökenli tek PVL-pozitif suşun da tip III olarak bulunması, bu görüşü 27

29 destekler niteliktedir. Başka çalışmalarda da, SCCmec tip-i, -II ve III taşıyan toplum kökenli MRSA suşları tespit edilmiştir (15, 21, 22). Bu ve benzeri sonuçlar toplum ve hastane kökenli izolatların ayrımında SCCmec tiplerinin dikkate alınmasının ne kadar doğru olduğunun sorgulanması gerektiğini ortaya koymaktadır. 5- Oliviera ve delancestre nin (8) geliştirdiği multipleks PCR yöntemi ile SCCmec tiplendirmesinde, tüm MRSA izolatlarının %18 i (toplum kökenli olanların %40 ı, hastane kökenli olanların yaklaşık %15 i) beklenen bant paternleinin dışında bantlar oluşturması veya hiç bant oluşturmaması nedeniyle tiplendirilememiştir. Bu suşlar, bu yöntemle tiplendirilemeyen ve yeni tanımlanan tip-v ve -VI SCCmec tipleri ile tip-iv varyantlarını taşıyor olabilir (23). SCCmec tip IVa, IVb, IVc ve IVd üzerinde, ccr kompleksinden sonrki L-C bölgesinin dizileri birbirlerinden farklıdır (20). SCCmec tip-v, tip-iii gibi tip5 ccr gen kompleksi ile tip1 restriksiyon-modifikasyon sistemi genleri taşır (24). Tip-V SCCmec elemanının bazı gen bölgelerinin delesyona uğraması sonucunda tip-iii ü oluşturabileceği ileri sürülmüştür (19). Bizim çalışmamızda tipiii sıklığının yüksekliği, multipleks PCR yöntemi ile tiplendirilemeyen izolatların tip-v SCCmec elemanı taşıyor olma ihtimalini güçlendirmektedir. Bununla birlikte, tanımlanamayan örneklerin kromozomal kaset tiplerinin kesin olarak belirlenmesine yönelik yeni bir proje planlanmasına karar verilmiştir. 6- PFGE analizi, hastane kökenli suşların büyük ölçüde klonal olduğunu, ancak PVLpozitif bulunan suşun klonal kökeninin diğerlerinden farklı olduğunu ortaya koymuştur. İSH de yatan hastalardan izole edilerek çalışmaya alınan 123 örneğin 28

30 97 sinin (%78.8) aynı klonal tipe ait olduğu (ST8-MRSA-III, Macar klonu) anlaşılmıştır. Toplum kökenli izolatlar birbirlerinden farklı bulunmuştur. Toplum kökenli izolatların farklı genetik kökenlere sahip olması, bunun aksine hastane izolatlarının büyük ölçüde klonal olması, beklenen sonuçları ortaya koymuştur. Sonuç olarak, ülkemizde toplum kökenli S. aureus izolatlarının yaklaşık %15 inin PVL genlerini taşıdığı tespit edilmiştir. Bu oran, daha önce farklı ülkelerden yapılan çalışmalarla karşılaştırıldığında ortalama bir değer olarak karşımıza çıkmaktadır. PVL pozitifliği, suşun toplum hayatına adaptasyonun sağlamada önemli olmasa da (25), S. aureus suşlarının virülansını önemli ölçüde arttırmakta ve neden olduğu hastalıkların klinik seyrini ağırlaştırarak komplikasyon gelişme riskini yükseltmektedir (26, 27). PVL-pozitif suşların hastane ortamında yayılması, hatta salgınlar oluşturması (28-30), bu suşların antibiyotik direnç determinantlarını da üzerinde toplaması ile daha dirençli ve daha virülan S. aureus suşlarının ortaya çıkma riskini arttırmaktadır. Stafilokok türleri arası gen alışverişi (30) olduğu bilinen bir gerçektir. PVL genleri, MRSA izolatları arasında, özellikle toplum kökenli izolatlarda daha sık olsa da (29), MSSA izolatları arasında da yayılmaktadır (31). Koagülaz negatif stafilokoklara da PVL genlerinin geçmesi, stafilokoklara bağlı enfeksiyonların yol açtığı morbidite ve mortalite oranlarının artmasına yol açabileceğinden toplumda ve hastane ortamında stafilokokların yayılmasını önleyecek tedbirlerin bir an önce alınması ve yayılımın önlenmesine yönelik uygulamaların sıkı kontrolünün yapılması gerekmektedir. 29

31 VI. Kaynaklar 1. Clinical and Laboratory Standards Institute/NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility fifteenth informational supplement. CLSI/NCCLS document M100-S15. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA, Ida T, Okamoto R, Shimauchi C, Okubo T, Kuga A, Inoue M. Identification of aminoglycoside-modifying enzymes by susceptibility testing: Epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Japan. J. Clin. Microbiol. 2001, 39: Mulvey MR, Chui L, Ismail J, Louie L, Murphy C, Chang N, Alfa M; Canadian Committee for the Standardization of Molecular Methods. Development of a Canadian standardized protocol for subtyping methicillin-resistant Staphylococcus aureus using pulsed-field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 2001; 39: Araj GF, Talhouk RS, Simaan CJ, Maasad MJ. Discrepancies between meca PCR and conventional tests used for detection of methicillin resistant Staphylococcus aureus. Int. J. Antimicrob. Agent. 1999; 11: Johnsson D, Mölling P, Strålin K, Söderquist B. Detection of Panton-Valentine leukocidin gene in Staphylococcus aureus by LightCycler PCR: Clinical and epidemiological aspects. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10: Lina G, Piémont Y, Godail-Gamot F, Bes M, Peter MO, Gaudochon V, Vandenesh F, Etienne J. Involvement of Panton-Valentine Leukocidin- Producing Staphylococcus aureus in primary skin infections and pneumonia. Clin. Infect. Dis. 1999; 29:

32 7. Hisata K, Kuwahara-Arai K, Yamanoto M, Ito T, Nakatomi Y, Cui L, Baba T, Terasawa M, Sotozono C, Kinoshita S, Yamashiro Y, Hiramatsu K. Dissemination of methicillin-resistant staphylococci among healthy Japanese children. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: Oliveira DC, de Lencastre H. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 2002; 46: Prevost G, Couppie P, Prevost P, Gayet S, Petiau P, Cribier B, Monteil H, Piemont Y. Epidemiological data on Staphylococcus aureus strains producing synergohymenotropic toxins. J. Med. Microbiol. 1995; 42: Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE, Persing DH, Swaminathan B. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: Criteria for bacterial strain typing. J. Clin. Microbiol. 1995; 33: Witte W, Braulke C, Cuny C, Strommenger B, Werner G, Heuck D, Jappe U, Wendt C, Linde H-J, Harmsen D. Emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with Panton-Valentine leukocidin genes in central Europe. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2005; 24: Ramdani-Bouguessa N, Bes M, Meugnier H, Forey F, Reverdy M-E, Lina G, Vandenesch F, Tazir M, Etienne J. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains resistant to multiple antibiotics and carrying the Panton-Valentine leukocidin genes in an Algeries hospital. Antimicrob. Agents Chemother. 2006; 50: Kuehnert MJ, Kruszon-Moran D, Hill HA, McQuillan G, McAllister S, Fosheim G, McDougal LK, Chaitram J, Jensen B, Fridkin SK, Killgore G, 31

33 Tenover FC. Prevalence of Staphylococcus aureus nasal colonization in the United States, J. Infect. Dis. 2006; 193: Ellington MJ, Hope R, Ganner M, Ganner M, East C, Brick G, Kearns AM. Is Panton-Valentine leucocidin associated with the pathogenesis of Staphylococcus aureus bacteraemia in the UK? Antimicrob. Chemother. 2007; 60: Wannet WJB, Spalburg E, Heck MEOC, Pluister GN, Tiemersma E, Willems RJL, Huijsdens XW, de Neeling AJ, Etienne J. Emergence of virulent methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains carrying Panton-Valentine leucocidin genes in the Netherlands. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: Nimmo GR, Coombs GW, Pearson JC, O Brien FG, Christiansen KJ, Turnidge JD, Gosbell IB, Collignon P, McLaws M-L. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the Australian community: an evolving epidemic. M.J.A. 2006; 184: Robert J, Etienne J, Bertrand X. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus producing Panton-Valentine leukocidin in a retrospective case series from 12 French hospital laboratories, Clin. Microbiol. Infect. 2005; 11: Ito T, Okuma K, Ma XX, Yuzawa H, Hiramatsu K. Insights on antibiotic resistance of Staphylococcus aureus from its whole genome; genomic island SCC. Drug Res. Updates 2003; 6: Hanssen A-M, Sollid JUE. SCCmec in staphylococci: genes on the move. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2006; 46: Shore A, Rossney AS, Keane CT, Enright MC, Coleman DC. Seven novel variants of the staphylococcal chromosome cassette mec in methicillin-resistant 32

34 Staphylococcus aureus isolates from Ireland. Antimicrob. Agents. Chemother. 2005; 49: Chung M, Dickinson G, de Lancestre H, Tomasz A. International clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in two hospitals in Miami, Florida. J. Clin. Microbiol. 2004; 42: Taneike I, Otsuka T, Dohmae S, Saito K, Ozaki K, Takano M, Higuchi W, Takano T, Yamamoto T. Molecular nature of methicillin-resistant Staphylococcus aureus derived from explosive nosocomial outbreaks of the 1980s in Japan. FEBS Letters 2006; 580: Milheiriço C, Oliviera DC, de Lancestre H. Update to the multiplex PCR strategy for the assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 2007; Jun (epub ahead of print). 24. Ito T, Ma XX, Takeuchi F, Okuma K, Yuzawa H, Hiramatsu K. Novel type V staphylococcal casette chromosome mec driven by a novel casette chromosome recombinase ccrc. Antimicrob. Agents Chemother. 2004; 48: Diep BA, Carleton HA, Chang RF, Sensabaugh GF, Perdreau-Remington F. Roles of 34 virulence genes in the evolution of hospital- and communityassociated strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Infect. Dis. 2006; 193: Gonzalez BE, Hulten KG, Dishop MK, Lamberth LB, Hammerman WA, Mason EO Jr, Kaplan SL. Pulmonary manifestations in children with invasive community-acquired Staphylococcus aureus infection. Clin. Infect. Dis. 2005; 41: