NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI"

Umut Sezen
8 yıl önce
İzleme sayısı:

1 NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI Dr. Zafer KÜÇÜKODACI GATA HEH Patoloji Servisi 22. ULUSAL PATOLOJİ KONGRESİ 7 Kasım 2012 Manavgat

2 DNA ve RNA NIN KANTİTASYONU Spektrofotometrik ölçüm Floresans teknik

3 Spektrofotometre Spektrofotometre bir solüsyon tarafından absorbe edilen ışığın miktarını ölçen cihazdır.

4 Spektrofotometre Hazırlanan çözeltiden belirli spektrumlarda ışık geçirilmesi ve bu ışının ne kadarının çözelti tarafından absorblandığının bulunması esasına dayanır. Çözeltinin içerdiği madde miktarı ne kadar fazla ise daha fazla ışın, çözelti tarafından soğurulur. Spektrofotometre, çözeltinin içinden geçebilen - çözelti tarafından absorblanmayan- ışığın yoğunluğu tespit ederek çözelti içeriğindeki aranan maddenin miktarı hakkında kantitatif bilgi verir.

Çözeltinin içerdiği madde miktarı ne kadar fazla ise daha fazla ışın, çözelti tarafından soğurulur.

5 IŞIK KAYNAĞI DALGABOYU SEÇİCİ ÖRNEK KABI DEDEKTÖR KAYDEDİCİ Ulraviyole bölgede en çok kullanılan lambalar, hidrojen ve döteryum elektriksel boşalım lambalarıdır. Bu lambalar nm arasında ışık yayar. Dalga boyu seçicileri (monokromatörler), ışık kaynağından gelen polikromatik ışıktan tek bir dalga boyunda monokromatik ışık elde edilmesini gerçekleştiren düzeneklerdir. Spektrofotometrelerde dedektör, maddenin ışığı absorplayıp absorplamadığını anlamak için ışık kaynağından gelen ışığın şiddetinin ölçülmesi amacıyla kullanılan düzenektir. Spektrofotometrelerde örneğin konulduğu örnek kapları(küvet),yuvarlak bir tüp veya dört köşe olabilir. Küvetler, soft veya borosilikat camdan, kuartz veya plastikten yapılır.

Dalga boyu seçicileri (monokromatörler), ışık kaynağından gelen polikromatik ışıktan tek bir dalga boyunda monokromatik ışık elde edilmesini gerçekleştiren düzeneklerdir.

6 Spektrofotometre UV spektrofotometre Elektromanyetik ışınlar dalga boylarına göre adlandırılır. Dalga boylarına göre; nm : Ultraviyole nm : Görünür nm: İnfrared OD 260 OD 280

7 Dalga boyu uzunluk birimleri cinsinden ifade edilir. Angstrom Spektrofotometrik ölçümlerde nanometre, mikrometre, veya milimikron 10AO = 1nm = 1milimikron Absorbansın birimi yoktur. Spektrofotometreden okunan bir sayıdır. Okunan dalgaboyu absorbans ile birlikte A 260 = 0.34 DNA konsantrasyonu ( g/ml) = OD260 x 100 (dilüsyon faktörü) x 50 g/ml

1nm = 1milimikron Absorbansın birimi yoktur. Spektrofotometreden okunan bir sayıdır.

8 Nükleotid içerisindeki bazlar 260 nm de maksimum absorbansı sağlar Deoksiribonükleotid Ribonükleotid DNA konsantrasyonu ( g/ml) = OD260 x 100 (dilüsyon faktörü) x 50 g/ml

9 1 A 260nm ünite dsdna = 50 g/ml DNA konsantrasyonu ( g/ml) = OD260 x 100 (dilüsyon faktörü) x 50 g/ml

10 Örneğimiz saf mı? Nükleik asit maksimum absorbansı 260 nm dalga boyu OD260/OD280 oranı? Oran DNA saf Oran 1.8 den düşük ise protein varlığı ve/veya diğer UV absorbers Oran 2.0 den büyük ise örnek kloroform veya fenol ile kontamine DNA konsantrasyonu ( g/ml) = OD260 x 100 (dilüsyon faktörü) x 50 g/ml DF=100 1:99 (Örnek:dsu) [dsdna] A260 x (50 µg/ml) [ssdna] A260 x (33 µg/ml) [ssrna] A260 x (40 µg/ml)

0 den büyük ise örnek kloroform veya fenol ile kontamine DNA konsantrasyonu ( g/ml) = OD260 x 100

11 OD 260 =0,065 OD 280 =0,040 DF=100 1:99 (Örnek:dsu) DNA miktarı =? 0,065x 100x 50 = 325 g/ml = 325 ng/ L DNA nın saflığı? OD 260/280 = 0,065/ 0,040 = 1,625

12 NUMUNE KÖR STANDART

13 Nano Drop

14 NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI

15 DNA RNA Phosphate HO OH P HO O CH 2 O Sugar Base N H N NH 2 N N OH H Azotlu heterosiklik bir baz, beş karbonlu bir seker ve bir fosfat grubundan meydana gelir

17 DNA KARARLI Çift sarmal yapıda Şeker fosfat omurga Hidrojen bağlarıyla birbirine bağlanan baz yapıları Kümeleşme etkisi (hidrofobik) FOSİL ÇALIŞMALARI

18 DNA DNA kararlılığını etkileyen başlıca faktörler DNA nın baz içeriği Tek iplikli DNA oranı Ortamın ısısı Ortamın ph değeri Ortamın tuz içeriği Fenol-kloroform

19 DNA BAZ İÇERİĞİ A = T zengin DNA moleküllerine göre, G C den zengin DNA molekülleri daha kararlıdır.

20 DNA TEK İPLİKLİ DNA ORANI Hücrede tek iplik DNA yıkıma açık ssdna bağlayan proteinler Kümeleşme etkisi daha az

21 DNA ph Asit ve alkaliye genelde dirençli güçlü alkaliye dayanıklı asidik ph ya hassas Kuvvetli asitlerde ve yüksek ısıda nükleik asitler kendilerini oluşturan baz, şeker ve fosfat gruplarına hidrolize olur Seyreltik asitlerde (ph 3-4) beta-glikozid pürin bağlarında hidroliz apürinik DNA hidroksil iyonlarıyla yıkım Alkali ortam bazların tautomerik durumunu değiştirir

22 DNA ISI sıcaklık artışı ile denaturasyon ssdna-dsdna absorbans HELIX-COIL TRANSITION

23 DNA FENOL-KLOROFORM Fenol ve kloroform organik solventler Her ikisi de güçlü denaturasyon ajanları proteinleri denatüre ederler Fenolden etkilenmez Kontaminasyon Kloroform genellikle suya karışmaz

24 DNA ribonükleazlar deoksiribonükleazlar ekzonükleazlar (5' -> 3 : Ekzonükleaz VII, Bal31 nükleaz 3' -> 5 : DNA polymerase I, Ekzonükleaz I, Ekzonükleaz VII, Bal31 nükleaz) endonükleazlar (Non-spesifik: DNaz I, Mikrokokkal nükleaz, Mung bean nükleaz; spesifik: restriksiyon endonükleazlar) Fenol-kloroform-izoamilalkol

25 DNA Ultraviyole gibi iyonizan radyasyon Serbest radikaller Uygunsuz tüpler Polypropylene plastik: 5ng/mm 2 Uygunsuz solüsyonlar Agresif pipetleme ve vorteksleme

26 RNA

27 RNA

28 RNA RNaz

29 RNA RNaz Taze doku-dondurulmuş doku Neredeyse tüm hücreler ve salgılarda. Neden? Laboratuvarda bulaş çok olası. Nereden?

30 RNA RNaz Saç, tüy, tükrük ve ter gibi vücut salgılarında Bakteri ve küf mantarı içeren toz partiküllerinde Pipet uçlarında, laboratuvar tüplerinde, cam veya plastik laboratuvar malzemelerinde Suda, çözeltiler ve solüsyonlarda Laboratuvar yüzeylerinde Dokunun kendisinde

31 RNaz İÇERMEYEN ORTAM RNaz YALNIZCA RNA İÇİN KULLANILAN MALZEME

32 RNaz Kabin Eldiven, eldiven, eldiven.. Pipet seti Rnaz sız pipet uçları, vs. Steril, RNaz içermeyen polipropilenli tüpler

33 Hazır kimyasallar RNaz içermeyen su NaOH-EDTA Çamaşır suyu DEPC Otoklav RNaz

34 RNA Çalışma öncesi ve sonrası temizlik Tezgahlar, cihazlar vb. hazır kimyasallar NaOH çamaşır suyu deterjan güzelce yayar!

35 RNA Otoklav yeterli değil Cam malzemeler 230 o C 2-4 saat Plastik laboratuvar ürünleri önce 0.1 M NaOH, sonra 1 mm EDTA ve RNaz içermeyen su ile durulanmalıdır Plastik malzemeler DEPC RNA izolasyonundaki kimyasallar - DEPC

36 RNA DEPC (dietilpropilkarbonat) Buffer ve cam malzemelerdeki RNazın inaktivasyonu için kullanılan alkilleyici bir ajandır %0.05-%0.1 Karsinojen Tris, HEPES için uygun değil Otoklavlanamayacak çözeltiler Diğer hazır kimyasallar

37 RNA Pürifiye edilmis RNA, -20 C veya - 80 C de Solüsyonlar (1) 1 mm sodyum sitrat, ph: 6.4 (2) 0.1 mm EDTA (DEPC ile muamele edilmiş) (3) 10 mm Tris-HCL, 1mM EDTA, ph: 7.0 Uzun dönem saklama etanolde -20 C de ve tercihen etanol ve sodyum asetat ile çöktürme işlemi sonrasında -80 C de

39 Eksizyonu takiben doku hızla en az 10 kat hacminde reaktif içine konulmalı (1 mg doku başına yaklaşık 10 μl reaktif) 150 mg a kadar ağırlıktaki dokularda RNA 1.5ml lik (RNAlater TissueProtect) tüplerde mg arası doku parçaları, 5 ml lik (RNAlater TissueProtect) tüplerde stabilize edilir.

40 RNaz RNazsız ortamda, düşük ph, düşük sıcaklık ve yoğun alkol içinde RNA nın saklanması önerilir

Benzer belgeler

RNA DNA. Nükleosit Baz + Şeker Riboz (RNA) Deoksiriboz (DNA) Ribonükleozitler : Adenozin, Pürinler: Pirimidinler: AveGdışında

RNA DNA. Nükleosit Baz + Şeker Riboz (RNA) Deoksiriboz (DNA) Ribonükleozitler : Adenozin, Pürinler: Pirimidinler: AveGdışında Bazlar : Nükleik Asitlerin karakteristik Özellikleri DNA RNA Yasin EREN Recep LiMAN Muhsin KONUK Nükleik Asitlerin Yapısı Pürinler: Pirimidinler: AveGdışında TU T,U ve Sdışında d bazı theobromin, kafein,