HEPATİT B VİRÜS ENFEKSİYONLARINDA ANTİ-VİRAL İLAÇ DİRENCİ-MİKROBİYOLOJİK YAKLAŞIM

Transkript

1 HEPATİT B VİRÜS ENFEKSİYONLARINDA ANTİ-VİRAL İLAÇ DİRENCİ-MİKROBİYOLOJİK YAKLAŞIM Prof. Dr. A. Mithat Bozdayı, Uz. Dr. Ersin Karataylı GİRİŞ Etkili bir aşılama yolunun olmasına rağmen, yaklaşık 400 milyon insanın kronik olarak Hepatit B virüsü (HBV) ile enfekte olması kronik HBV enfeksiyonunun dünyanın en yaygın infeksiyöz hastalığı olmasına neden olmaktadır (1). Kronik hepatit B hastalarının yaklaşık %15-40'ının, karaciğer yetmezliği, siroz ve özellikle hepatosellüler karsinoma (HCC) gibi ilerleyici karaciğer hatalıklarından yaşamlarını kaybettiği düşünülmektedir (2). Dünya Sağlık Örgütü (WHO) her yıl yaklaşık 1 milyon insanın bu nedenlerle öldüğünü tahmin etmektedir (3). Yapılan araştırmalar, kronik HBV hastalarının, HBV taşıyıcısı olmayanlara göre HCC geliştirme olasılıklarının yaklaşık 100 kat arttığını göstermiştir (4-6). Bu nedenlerle, hastalarda HBV nin erken tanısı ve tedavisi çok önemlidir. Kullanılan tedavi yöntemlerinin hiçbiri HBV yi tamamen eradike edememektedir. Bu tedavilerin hepsinin temeli HBV viral baskılanmasının ömür boyu sürmesini sağlamaktır. HBV antiviral tedavisinde kullanılan ilaçlar, immüno-modülatör ajanlar (interferon ve peginterferon) ve oral antiviral ajanlardan (nükleotid ve nükleozid analogları) oluşmaktadır. Şekil 1. Nükleoz(t)id analog yapıları. 55

2 Şekil 2. HBV viral genom yapısı. Yeni nükleozid analoglarının geliştirilmesi ile ilaç direncinin kontrolü ve önlenmesi HBV enfeksiyonlarının antiviral tedavisinde en önemli sorunsallardan biri olarak ortaya çıkmıştır. Nükleozid analoglarının potansiyel bir tedavi stratejisi olarak kronik B hepatiti tedavisinde kullanımı yaklaşık 15 yıl önce başlamıştır. Bununla birlikte, yaklaşık 10 yıl interferon tek kullanım seçeneği olan bir antiviral olarak kullanılagelmiştir. Son yıllarda, bir deoksisitidin analogu olan ve doğal olamayan L-konfigurasyon yapısı ile lamivudin, hepatit B virüs enfeksiyonlarında onaylanarak kullanıma sunulmuştur. Daha sonra adefovir, entekavir, telbivudin, tenofovir gibi nükleozid ya da nükleotid analogu ilaçlar da klinikteki yerlerini almaya başlamışlardır. Bu ilaçlar, HBV ye karşı secici ve potansiyel etkisi ile kronik HBV enfeksiyonu tedavisinde çok önemli bir kilometre taşı oluşturmuşlardır (Şekil 1). Antiviral nükleoz(t)idler, virüs replikayonunun baskılanmasında interferon tabanlı tedavilere göre daha etkili yöntemler olmasına rağmen tedavinin kaldırılmasından sonra viral baskılanmanın genellikle sona ermesi ve uzun süreli antiviral ilaç kullanımından dolayı antiviral direncin ortaya çıkması kronik HBV tedavisindeki başarısızlığın en önemli nedenidir. HBV VİROLOJİSİ HBV, insanlarda enfeksiyona neden olan en küçük DNA virüsüdür. HBV genomu kısmi olarak çift sarmallıdır ve yaklaşık 3200 baz uzunluğundadır. HBV kendidinin sınırlı kodlama kapasitesini çok ekonomik olarak kullanır. Genomunun küçüklüğüne rağmen 4 protein kodlar. Bunlar; yüzey, kor, polimeraz ve X proteinleridir (Şekil 2). HBV, pregenomik RNA aracılığı ile replike olur. 56

3 Şekil 3. HBV replikasyonu. HBV nin yaşam siklüsü antiviral startejilerin geliştirilmesinde kritik öneme sahiptir. Viral partiküllerin konak hücre duvarına adsorpsiyonu ve penetrasyonunu takiben kılfından kurtulan genom, kısmi çift sarmalın tamamlanacağı hücre nükleusuna taşınır. Bu yapı cccdna yı oluşturur. Viral cccdna, hücre nükleusu içinde yer alacak ve HBV RNA üretimi için kalıp fonksiyonu görecek şekilde mini kromozomlar oluşturur. Viral mini kromozomların transkripsiyonu ve oluşumu tamamen konak hücre enzimlerine bağımlıdır. Viral mrna lar, translasyonun, replikasyonun ve nükleokapsid oluşumunun gerçekleştiği sitoplazmaya taşınırlar. Olgunlaşmış nükleokapsidler 2 yol izler; 1-Ya nükleus içine tekrar girerler, 2- Ya da endoplazmik retikulum içinde kılıf sahibi olarak hücre dışına sekrete edilirler (Şekil 3). HBV, bir pregenomik RNA aracılığı ile replike olur ve lamivudin, replikasyonu çeşitli basamaklarda zincir sonlanması prensibi ile baskılar. Bununla beraber cccdna üzerine bir etkisi yoktur. HBV replikasyonun hepatosit içinde primer olarak cccdna dan başlaması nedeni ile HBV DNA, tedavinin kesilmesini izleyen süre içerisinde tekrar serumda saptanabilir düzeye erişir. Bu nedenle, lamivudin ile uzun süreli tedavi düşük viral yük düzeyini sağlanması ve enfekte olmuş hepatositlerin konağa ait immün yanıt ile eradikasyonu gereklidir. Fakat uzun süreli bu tedavi stratejisi sıklıkla direnç gelişimi sorununu da beraberinde getirmektedir. Nükleozid ve nükleotid analogları aktif viral replikasyonunu baskılamakla beraber hiçbiri cccdna üzerine etkili değildir. Fakat, enfekte olmuş hücre nükleusuna tekrar girerek cccdna birikmesine neden olacak yeni viral genomların oluşumunu bloke ederler. Hepadnavirus enfeksiyonunun ortadan kaldırılmasında ve cccdna nın yok edilmesinde rol 57

4 oynaması olası 2 ileri sürülmüş yol vardır; 1- Hücre içindeki virüsün sitokin aracılı hücre yıkımına neden olmaksızın temizlenmesi, 2- İnfekte hücrelerin T hücre aracılı yıkımı. Ters transkriptaz inhibitörleri cccdna rezervuarına etki etmediklerine göre, nükleozid ve nükleotid analogları viral yükü düşük bir düzeye indirebildiğinde konak immün sistemine ait mekanizmalar geride kalmış enfeksiyonu temizleyebilirler. ANTİ-VİRAL DİRENÇLİ MUTASYONLARIN OLUŞUM MEKANİZMASI İlaca dirençli HBV dizilerinin biyolojisi ve bu virüslerle persistant enfeksiyon sonuçları hakkındaki bilgilerimiz gittikçe artmaktadır. Bazı çalışmalar ilaca dirençli HBV dizinlerinin in-vitro ortamda replikasyonlarının azalmış olduğunu gösterseler de bu HBV dizinlerinin daha az patolojik olduğu sonucuna ulaşmak oldukça zordur. Hem viral hem de konağa ait faktörler, kronik enfeksiyon sürecinde HBV viral genetik heterojenite oluşumuna etki eden faktörlerdir. Antiviral ilaç direnci, viral mutasyon frekansına, antiviral için seçilmiş hedef bölgenin içsel mutasyona uğrama özelliğine, anti-viral ilaç tarafından oluşturulan seçici baskıya ve virüs replikasyon oranı tarafından belirlenir. Replikasyon uyumu ve replikasyon aralığı da direnç gelişimini belirleyen ana etkenlerdendir. Hepatitis B virüsünün sahip olduğu polimerazın doğrulayıcı aktivitesi, yani 3 5 ekzonükleaz aktivitesi yoktur. Bir başka deyişle HBV polimeraz yanlış sokulmuş dntp leri uzaklaştıramaz. HBV de viryon üretimi, HIV ve HCV viryon üretimi ile karşılaştırıldığında daha yüksektir. Yüksek viryon üretimi ve HBV polimeraz hata oranı birlikte bir viral genetik heterojenite yaratmak için yeterlidir. İlaca dirençli HBV dizinlerinin ortaya çıkması ve çoğalması immün sisitemin ve anti-viral ilaçların seçicici baskısı altında gelişir. Viryon üretimi HBV pol hata oranı Günlük baz çifleşme hatası viryon/gün, 10-7 değişim/ nükleotid/gün 10 7 nükleotid/gün HBV nin yaşam siklüsü ve kinetiği ile ilgili bilgiler HBV enfeksiyonunun doğal seyri ve klirensi ile ilgili modellerin oluşturulmasında kullanılır. Lamivudin tedavisi altında HBV viral yükü monitorize edildiğinde, viral yükteki düşüşte 2 faz saptanmaktadır. Birinci faz virüsün Şekil 4. HBV polimeraz enziminin fonksiyonel bölgeleri 58

5 plazmadan temizlenmesine işaret ederken, 2.faz enfekte hücrelerin kaybına işaret eder. Anti-viral direnç gösteren HBV dizinlerinin replikasyonlarında hasar olduğu ve daha az uyum gösteren dizinler olduğu bir süre genel olarak kabul görmüş ise de, gerçek tam olarak böyle değildir. Bu dizinlerle devam eden enfeksiyonlarda histopataolojik bozulmanın devam etmekde olduğu ve HIV enfeksiyonlarındaki benzer durumlarda hastalığın ilerlediği gösterilmiştir. İlaca dirençli HBV populasyonları herhangi bir anti-viral tedavi almamış kişilerde de görülebilmektedir. Ve anti-virallerin seçici baskıları altında bazı dizinler seçilebilmektedir. Dirençli dizinlerin replikayon hasarlı olduğu varsayılırsa, ikincil bazı mutasyonların replikasyon restorasyonuna telafi edici bir şeklide katkıda bulunduğu ileri sürülmüştür. Viral replikasyonu tamamen veya kısmen düzelten olası mutasyon patternleri aşağıda verilmiştir. - G145R (Yüzey geni) - D144E/D145R (Yüzey geni) - rtl80i/v - rtv173l - Pre-S1 genindeki delesyonlar, - Pre-kor stop kodon mutasyonları, HBV polimeraz hem RNA hem DNA bağımlı polimeraz olarak fonksiyon görür. Dört farklı fonksiyonel bölgesi vardır (Şekil 4). 1- Priming bölgesi, 2- Herhangi bir enzimatik fonksiyonu bilinmeyen Spacer bölgesi, 3- DNA ve RNA bağımlı DNA polimeraz aktivitesi olan ters transkriptaz enzimi, 4- RnaseH aktivitesinden sorumlu bölge, Ters transkriptaz bölgesi diğer poimerazlarda da iyi korunmuş 5 bölge içerir. Son zamanlarda 2 bölge daha tanımlanmıştır. A, C ve D dntp bağlanması ve katalizi ile ilgili iken, B ve E bölgeleri kalıp primer pozisyonlanması ile ilgili olduğu sanılmaktadır. HBV polimeraz, HBsAg bölgesi ile tam olarak, X ve kor bölgesi ile ise kısmi olarak çakışmaktadır. Pol geni ters transkriptazının yüzey geni ile tam olarak çakışması, pol genindeki değişikliklerin yüzey geninde de değişikliğe yol açmasına neden olur. Yüzey genindeki bu değişikliklerin virüsün yaşam döngüsünü etkileyebilecek değişiklikler olması olasıdır (Şekil 5). RT bölgesinin C subdomaini polimeraz aktivitesi için gerekli olan ortak bir YMDD (tiro- Şekil 5. HBV yüzey geni yapısı. 59

6 Tablo 1. Farklı virüslerdeki korunmuş YMDD motifi. Virüs Amino asit Amino asit Gen Bank posizyon dizisi no DHBV TFTYMDDFLL K01834 HHBV TFSYMDDFLL M22056 HBV AFSYMDDVVL X51970 WHV VFAYMDDLVL M11082 GSHV BA AFAYMDDLVL K ASHV AFAYMDDLVL U29144 HIV IYQYMDDLVY K02013 zin-metyonin-aspartat-aspartat) motifine sahiptir. Bu motif tüm hepadnavirus polimerazlarında ve HIV ters transkriptazlaronda çok iyi korunmuş durumdadır. Korunmuş YMDD bölgesi polimerazın katalitik domaini içerisinde yer alır ve nükleotid bağlanmasından sorumludur. İlk 2 amino asit YM kalıp primer etkileşiminde rol oynarken 2 amino asit M dntp bağlanmasında kritik bir rol oynar (Tablo 1). Şimdiye kadar lamivudine direnci belirleyen 6 ana mutasyon patterni tanımlanmıştır. Hemen çoğu YMMD motifinde ve B domainin 180. kodonunda yer alan çiftli mutasyonlardır. Moleküler modelleme çalışmaları daha önce de belirtildiği gibi rtm204 amino asidinin zincir uzamasına sokulacak dntp ve kalıp bağlanması ile düzgün geometrik konumlanmada rol oynadığını göstermiştir. RT enziminin nükleotid bağlama kapasitesi rtm204v/i varyantları oluştuğunda bozulur. Valin veya izolösinin metil grupları ile lamivudinin yapısındaki sülfür atomları arasında steric hindrance (üç boyutlu saklanma) meydana gelir. Steric hindrance ile ilgili Virüs - Yüksek replikasyon düzeyi - Viral polimerazınyüksek hata yapma frekansı cccdna uzun yarı ömrü Hepatositler Genetik Heterojenite ( Quasispecies ) Viral Persistans Konak Dirençli Mutantların Seçilimi ve Tedavide Başarısızlık - Seçici baskı - İmmün yanıt - Antiviraller Şekil 6. Viral persistans ve direnç mutasyonlarının seçilimi. 60

7 Tablo 2. Antiviral direnç terminolojisi. Terim Primer yanıtsızlık Biyokimyasal breakthrough Genotipik direnç Fenotipik direnç Çapraz-direnç Tanım Nükleos(t)id analoğu tedavisinde tedavinin ilk 6 ayından sonra serum HBV DNA düzeyinin > 1 log 10 IU/ml kadar düşürülememesi Serum alanin aminotransferaz (ALT) düzeyinin tedavi sırasında normalizyonun sağlanmasından sonra tekrar yükselmesi HBV nin viral transkriptaz bölgesinde bulunan, fenotipleme deneyleriyle daha önce antiviral ilaçlara karşı dirençleri tanımlanmış amino asit değişikliklerini taşıyan viral popülasyonların tespiti Bir HBV polimerazın in vitro da antiviral bir tedaviye karşı duyarlılığının azalması Aynı amino-asit değişimiyle veya değişik amino asit değişikliklerinin kombinasyonuyla birden fazla antiviral ilaca karşı duyarlılığın azalması olan direnç, L-nükleozidlerin genel bir problemi gibi gözükmektedir. KRONİK HEPATİT B (KHB) TEDAVİSİ VE ANTİVİRAL DİRENÇ Hepatoselüler Karsinoma (HCC) geliştirme riskinin ve siroza ilerleyişin azaltılması ve antiviral ilaç direnci geliştirmeden maksimum viral baskılamanın gerçekleştirilmesi kronik HBV tedavisinin en temel hedeflerindendir. Bu amaçla günümüzde global olarak, çoğu anti-hbv nükleoz(t)id analoğu olmak üzere çok sayıda ilaç HBV tedavisinde onaylanmıştır. Nükleotid analoğu olan Adefovir dipivoksil (ADV), tenefovir (TNF) ve nükleozid analogları olan lamuvidin (LAM), entekavir (ETV) ve telbivudin (LdT) gibi antiviral ilaçlar HBV viral polimerazı hedef almaktadır. İnterferon (IFN α) ve pegile-ifn α (PEG) ise kronik HBV tedavisinde kullanılan diğer ilaçlardır. İnterferon tabanlı tedaviler zayıf tolerabilite ve yan etkiler sergilerken nükleoz(t)id analog tedavisinin en büyük sorunu ortaya çıkan direnç mutasyonlarıdır. Yüksek HBV replikasyon düzeyi, viral polimeraz yüksek hata yapma frekansı, Hepatit B virüsünün cccdna formunda kendisini hücre çekirdeğinde depolaması ve kullanılan antivirallerin hiçbirinin cccdna üzerinde etkili olmamasından dolayı, tedavi amaçlı uzun süreli antiviral kullanımı antiviral direnç mutasyonlarının ortaya çıkmasının temel nedenlerindendir (Şekil 6). Kullanılan antiviral moleküllere karşı gelişen direnç mutasyonlarının doğru saptanması ve tedavinin bu sürece göre düzenlenmemesi sonucunda tedavide başarısızlığı beraberinde getirmektedir. Bu sebeple antiviral direnç konusunda elde edilen bilgiler ve bu bilgilerin doğru kullanımı HBV ile girişilen mücadelede başarı oranını artıracaktır. Literatürde ise antiviral direnç konusunda kullanılan terminoloji, farklı yayınlarda değişiklilik göstermekteydi. Bu yüzden HBV antiviral direncinin isimlendirilmesi ile ilgili standart tanımlara ve fenotipik, genotipik ve klinik rezistans terimlerinin tanımlanmasına ihtiyaç duyulmuştur. Ulusal Sağlık Enstitüsünün (National Institute of Health, NIH) 2006 daki HBV ile ilgili olan çalışma kurultayında bu terimler üzerinde standartlaştırılmış tanımlamalar tablo 2 deki gibi önerilmiştir (7,8). 61

8 Tablo 3. Lamivudin, Adefovir, Entekavir, Embtricitabin ve Telbuvidin için yıllık direnç gelişimi. İlaç Tedavide yıllara göre direnç gelişimi (% olarak) 1. yıl 2. yıl 3. yıl 4. yıl 5. yıl Lamivudin Adefovir (naiv HBeAg-negatif) Adefovir (LAM rezistans) Entekavir (naiv) Entekavir (LAM rezistans) Embtricitabin Telbuvidin Tablo. Locarnini et.al 2008 den uyarlanmıştır (18). Nükleot(z)id analogları viral polimeraz aktivitesini engelleyerek etkili olmaktadır. Hepatit B virüsü yaşam döngüsünde sentezin başlatılması ( priming ) ve hem pozitif zincirden (DNA bağımlı DNA polimeraz aktivitesi) hem de negatif zincirden (RNA bağımlı DNA polimeraz aktivitesi veya ters transkripsiyon) DNA sentezi basamakları gerçekleşmektedir (Şekil 3). Kullanılan antiviraller bu 3 basamağı hedef almaktadır. Lamivudine ters transkripsiyonu hedef alırken (9) Clevudine ve Entekavir hem negatif hem de pozitif zincir sentezini hedef almaktadır (10,11). Adefovir ve tenofovir ise hem ters transkripsiyonun başlatılması (priming) hem de uzaması sırasında inhibitör olarak etki ederler (12,13). Lamivudin Lamivudine 1998 yılında FDA tarafından onay verilen ilk oral antiviral ilaçtır. Hem HBeAg-pozitif hem de HBeAg-negatif hastalarda interferona göre daha hızlı bir etki göstermektedir (14,15). HBeAg pozitif hastalarda, tedavi HBeAg serokonversiyonu gerçekleşene kadar devam ettirilmektedir ve antiviral terapi süresinin uzatılması diğer bütün ajanlarda olduğu gibi antiviral direnç mutasyonları geliştirme riskini artırmaktadır. Lamivudine kullanımında 1 yıl içinde mutasyon gelişimi yaklaşık %20 dir ve bu oran 4-5 yılın sonunda %70-80lere kadar çıkmaktadır (Tablo 3) (16,17). Adefovir Dipivoksil Adefovir 2002 yılında FDA tarafından onay alınan ikinci antiviral ajandır. Hem in vitro hücre kültürü modellerinde hem de in vivo da yabanıl tip ve lamivudin resistant HBV genomlarında etkili olduğu gösterilmiştir (19-23). Adefovir dipivoksilin direnç geliştirme sıklığı lamivudine kıyasla daha az olmasına rağmen 5. yıl sonundaki direnç gelişimi %30 lara kadar çıkmaktadır (Tablo 3). Adefovir için tanımlanmış direnç mutasyonları viral polimerazın 181. ve 236. aminoasitlerinde meydana gelen değişikliklerdir. HBV genomunda meydana gelen değişikliklerin birden fazla antivirale direnç göstermesiyle ortaya çıkan çapraz direnç kronik HBV tedavisinin diğer bir zorluğudur, bu yüzden tedavinin başarılı olması için meydana gelen değişikliklerin analizinin çok iyi yapılması gerekmektedir. HBV genomunda günümüze kadar antivirallere karşı geliştirilen direnç mutasyonları Tablo 4. de gösterilmiştir. Tablodaki mutasyonların varlığına göre tedavi süreci belirlenebilir. Entekavir Entekavir lamivudine göre daha yüksek bir potansiyel sergileyen nükleosit analoğudur. 62

9 Tablo 4. Hepatit B Virüsü Direnç mutasyonlarıa. Lamivudin Adefovir Embtrici- Telbivudin Entekavir Tenofovir tabine Yabanıl Tip D D D D D D M204I/V/S R D R R R D L180M/C+ R D R R A D M204V/I A181T/V A R D D D D N236T D R D D D A I169T+V173L+ R D R R R D M250V* T184G+ R D R R R D S202I/G* D, duyarlı; R; rezistant, A, Azalmış Duyarlılık * Bu mutasyonlarla beraber lamivudine direnç mutasyonu olan rtm204 mutasyonu da bulunmaktadır. a Tablo 45 nolu referanstan, tablodaki mutasyonlar 12, 27, 28, 35, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 55, 58 nolu referanslardan derlenmiştir. HBeAg pozitif hastalarda yürütülen 0.5 mg/gün dozluk Entekavir çalışmasında HBV DNA düzeylerinde 6.98 log10 kopya/ml lik bir düşüş gösterilmiştir (24). Buna ek olarak entekavir HBeAg negatif hastalarda da lamivudine göre daha iyi histolojik gelişme (entekavir için %70, lamivudine için %60) ve daha iyi viral baskılanma (<400 kopya/ml ye kadar entekavir için %91, lamivudine için %73) göstermiştir (25). Bu yüksek antiviral potansiyeline rağmen entekavir kullanımında HBeAg serokonversiyonu diğer antivirallere göre daha azdır. İlginç olarak naiv HBV hastalarında entekavire direnç gelişimi 5. yılın sonunda oldukça düşük olmasına rağmen (%1.2), lamivudine dirençli hastalarda entekavir direnç gelişimi 5. yılın sonunda %50 lere kadar çıkmaktadır (26) (Tablo 3). Bu farkın nedeni, entekavir direnci gelişiminin, öncelikle lamivudin direnç mutasyonlarının (180. ve 204. amino asitlerde) oluşması ve ardından ikincil mutasyonların ortaya çıkmasıyla 2 basamaklı bir seçilim modeli izlemesidir (27,28). Yapılan çeşitli çalışmalarda, viral genomun rti169, rtt184, rts202, ve rtm250 pozisyonlarında meydana gelen entekavir ilaç direnç mutasyonlarının, lamivudine direnç mutasyonları yokluğunda, entekavir ilaç duyarlılığında çok az miktarda azalmaya neden olduğu gösterilmiştir (27,28,56,57). Aynı mutasyonlar, lamivudine direnç mutasyonlarıyla beraberken entekavire karşı yüksek direncin geliştiği yine aynı çalışmalarda in vitro ve in vivo olarak belirlenmiştir. Bu yüzden, entekavirle başlayan tedaviler, entekavir dirençli viral suşların ortaya çıkması olasılığının daha az olmasına neden olabilir, fakat bu hipotezin yeni çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir. Tüm bu bilgiler ışığında, lamivudin dirençli hastaların tedavisinde ise entekavir ideal bir tedavi yöntemi değildir. Telbivudin HBV DNA polimerazın diğer bir potent inhibitörü olan telbivudin in etkinliği, direnç gelişimi ve lamivudine ile karşılaştırılması randomize bir faz III çalışmasında (The Globe Trial) HBeAg pozitif ve HBeAg negatif hastlarda 1 ve 2. yılın sonunda gösterilmiştir (29,30). Bu çalışmalarda Telbivudine in, entekavir gibi Lamivudine e göre daha etkin bir antiviral ilaç olduğu gösterilmiştir. Telbivudin de ente- 63

10 Tablo5. Yaygın HBV direnç mutasyonlarının in vitro fenotipleme sonuçları a Direnç Artışı HBV Lamivudine Clevudine Telbivudine Entekavir Adefovir Tenofovir Yabanıl Tip L80I+M204I >1000 >120 >1000 NA >10 NA L180M 1.7 > NA M204I >1000 >120 > NA L180M+M204V >1000 > A181T/V 2-6 NA NA NA 1-5 NA A181S+M204I > NA NA N236T NA V214A/Q215S NA NA NA 7-10 NA rtl180m+ >1000 NA >100 > NA M204V + I169T/M250V rtl180m+ >1000 NA >1000 > NA M204V+ T184G/S202I A194T NA NA NA NA NA 1.5 A194T+L180M NA NA NA NA NA 2.4 +M204V a Tablo 46 nolu referanstan adapte edilmiş ve güncellenmiştir. Tablodaki sonuçlar 12, 21, 47, 48, 49, 50, 51 ve 52 nolu referanslardan derlenmiştir. NA, çalışılmamış. kavir ve lamivudine gibi 204. amino asitteki direnç mutasyonlarını seçer ve 2. yılın sonunda %8.6 direnç gelişimi gösterilmiştir (Tablo 3). Herhangi bir adefovir direnç mutasyonu ile ilişkilendirilmediği için telbivudin adefovir dirençli suşların tedavisinde kullanılabilir. İlginç olarak telbivudin rtm204i mutantına ve rtl180m+m204v mutantlarına karşı etkisiz kalırken rtm204v mutantına karşı etkilidir. Bu durumda telbivudin in faz III denemelerinde neden sadece rtm204i mutasyonunun tespit edildiğini açıklamaktadır. Tenofovir Tenofovir yapısal olarak adefovire benzemektedir ve hem HBeAg pozitif hem de HBeAg negatif hastalarda viral baskılanma ve histolojik gelişme açısından adefovire göre daha etkin olduğu faz III çalışmalarıyla gösterilmiştir (31,32). Tenofovir hem yabanıl tip hem de entekavir ve lamivudine dirençli suşlara karşı antiviral aktivite gösterebilmektedir (33). Yapısal açıdan adefovire çok benzemesine rağmen adefovir için tanımlanan rta181t/v mutantlarınının tenofovir e duyarlı olduğu ve rtn236t mutantının ise tenofovire duyarlı olduğu fakat bunun azalmış bir duyarlılık olduğu gösterilmiştir (34,35). Bunun yanı sıra 2005 yılında yapılan bir çalışmada HBV/HIV koenfekte hastalarda ortaya çıkan rta194t mutasyonunun in vitro da tenofovir duyarlılığında yaklaşık 7.6 kat düşme meydana getirdiğini göstermiş (36) fakat takip eden başka bir çalışmada HIV olmaksızın sadece HBV ile enfekte olan HepG hücrelerinde yapay ola- 64

11 rak yaratılan rta194t mutasyonunun tenofovire karşı direnç göstermediği gösterilmiştir (37). Benzer bir çelişki tenofovirin yakın akrabası olan adefovir dipivoksil için de farklı bir mutasyon için ortaya çıkmıştır. rti233v mutasyonu bir çalışmada adefovire karşı dirençli olarak gösterilmiş, diğer bir çalışmada ise duyarlı olarak gösterilmiştir (38,39). Çapraz direnç ve Fenotipleme Deneyleri Hepatit B virüsü varyantlarının HepG2, Hep ve Huh7 gibi hücre kültürü sistemlerinde direnç profillerinin ortaya çıkarılması in vitro fenotipleme deneyleriyle yapılmaktadır. Tedavinin seyrinin belirlenmesinde bu deneyler oldukça bilgilendirici olmaktadır. Günümüze kadar literatürde in vitro fenotipleme yöntemiyle direnç profilleri ortaya çıkarılan mutasyonlar Tablo 5 te derlenmiştir. ANTİ-VİRAL DİRENÇLİ HBV DİZİNLERİNİN SAPTANMASI 1- Genotipik deneyler, - DNA dizi analizi, - PCR ürünlerinini DNA dizi analizi, - Klonlanmış dizinlerin DNA dizi analizi, - Line probe assay, - PCR-RFLP - Real-Time PCR 2- Fenotipik yöntemler. İlaca dirençli HBV dizinlerinin biyolojik özelliklerini çalışmak için kullanılan teknikler: - Hayvan hepadnavirus modelleri - Woodchuck hepatitis virus, - Duck hepatitis B virus, - Transfeksiyon temelindeki modeller, - Geçici transfeksiyon, - HBV ekspresse eden stabil hücre dizinleri, - HBV-baculovirus rekombinantları, - Hücreden yoksun enzim deneyleri, SONUÇ VE TARTIŞMA Aşılama ile HBV enfeksiyonunun engellenebilir olmasına rağmen kronik HBV enfeksiyonu oldukça yaygındır. Kronik HBV enfeksiyonunu tedavi etmek için kullanılan antivirallere karşı gelişen direnç mutasyonları tedavinin en temel sorunudur. Ortaya çıkan çapraz direnç mutasyonları ise bu sorunu daha da karmaşık hale getirmektedir. HBV tedavisinde kullanılan ilaçların sayısının sınırlı olmasından dolayı, tedavi sürecinde verilen kararlardan en önemlilerinden birisi, naiv hastalarda kullanılacak ilk antiviral ilacın seçimidir. Tüm antiviral monoterapiler direnç mutasyonu taşıyan mutantların ortaya çıkmasıyla ilişkilendirilebilir ve bu, kronik HBV tedavisinin uzun süreli tedavisinde başa çıkılması gereken ana sorundur. Günümüzde Kronik HBV enfeksiyonunun temel tedavi yöntemi, en düşük oranda genotipik dirence sahip, en etkin antiviral kullanarak tedaviye monoterapi ile başlamaktır. 53,54 Her koşulda antiviral cevap zaman içerisinde takip edilmelidir. Tedavinin başarısız olduğu durumlarda direnç profilinin bilinmesi antiviral tedavinin başarılı bir şekilde devam ettirilebilmesi için çok önemlidir. Antiviral direnç profilinin bilinmesiyle beraber başka bir antiviral ilaca geçilerek monoterapiye devam edilebilir (kombinasyon tedavisi) ya da kullanılan antivirale ek olarak başka bir antiviral tedaviye eklenebilir ( add-on terapi). Başarısızlık durumunda hangi tedavinin daha iyi bir strateji olduğunu belirlemek için daha fazla klinik denemelere ihtiyaç vardır. Hepatit B virüsünün yüksek replikasyon düzeyi ve kendisine özgü replikasyon döngüsü göz önüne alındığında herhangi bir ajana karşı direnç geliştirmesi kaçınılmaz gibi görünmektedir. Çözülmesi gereken sorun, ilaç direnç mekanizması hakkındaki günümüz bilgilerini kullanarak daha yüksek antiviral potansiyele ve daha iyi direnç profiline sahip ilaçlar üretmektir. KAYNAKLAR 1. de Franchis R, Hadengue A, Lau G et al. EASL Jury. EASL International Consensus Conference on Hepatitis B September, 2002 Geneva, Switzerland. Consensus statement.j Hepatol 2003; 39 (Suppl. 1): S3 S Lok ASF, McMahon BJ. AASLD practice guidelines: chronichepatitis B. Hepatology 2007; 45: World Health Organization: [26 February 2007]. 4. Beasley RP. Hepatitis B virus: the major etiology of hepatocellular carcinoma. Cancer 1988; 61:

12 5. Chiaramonte M, Stroffolini T, Vian A, et al. Rate of incidence of hepatocellular carcinoma in patients with compensated viral cirrhosis. Cancer 1999; 85: Fattovich G, Pantalena M, Zagni I, Realdi G, Schalm SW, Christensen E. Effect of hepatitis Band C virus infections on the natural history of compensated cirrhosis: a cohort study of 297 patients. Am J Gastroenterol 2002; 97: Hoofnagle JH, Doo E, Liang TJ, Fleischer R, Lok ASF. Management of Hepatitis B: Summary of a Clinical Research Workshop. Hepatology 2007;45: Lok AS, Zoulin F, Locarnini S, et al. Antiviral drug-resistant HBV: standardization of nomenclature and assays and recommendations for management. Hepatology 2007; Seigneres B, Pichoud C, Martin P, Furman P, Trepo C, Zoulim F. Inhibitory activity of dioxolane purine analogs on wild-type and lamivudine-resistant mutants of hepadnaviruses. Hepatology 2002;36: Zoulim F, Dannaoui E, Borel C, Hantz O, Lin TS, Liu SH, et al. 20,30-Dideoxy-beta L-5-fluorocytidine inhibits duck hepatitis B virus reverse transcription and suppresses viral DNA synthesis in hepatocytes, both in vitro and in vivo. Antimicrob Agents Chemother 1996;40: Seifer M, Hamatake RK, Colonno RJ, Standring DN. In vitro inhibition of hepadnavirus polymerases by the triphosphates of BMS and lobucavir. Antimicrob Agents Chemother 1998;42: Delaney WEt, Ray AS, Yang H, Qi X, Xiong S, Zhu Y, et al. Intracellular metabolism and in vitro activity of tenofovir against hepatitis B virus. Antimicrob Agents Chemother 2006;50: Seigneres B, Aguesse-Germon S, Pichoud C, Vuillermoz I, Jamard C, Trepo C, et al. Duck hepatitis B virus polymerase gene mutants associated with resistance to lamivudine have a decreased replication capacity in vitro and in vivo. J Hepatol 2001;34: Lok AS. The maze of treatments for hepatitis B. N Engl J Med 2005; 352: Keeffe EB, Dieterich DT, Han SH, et al. A treatment algorithm for the management of chronic hepatitis B virus infection in the United States: an update. Clin Gastroenterol Hepatol 2006; 4: Lai CL, Dienstag J, Schiff E, Leung NW, Atkins M, Hunt C, et al. Prevalence and clinical correlates of YMDD variants during lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B. Clin Infect Dis 2003;36: Lok AS, Lai CL, Leung N, Yao GB, Cui ZY, Schiff ER, et al. Long-term safety of lamivudine treatment in patients with chronic hepatitis B. Gastroenterology 2003; Locanini S. Primary resistance, multidrug resistance, and cross-resistance pathways in HBV as a consequence of treatment failure Hepatol Int : Lok AS, McMahon BJ. Chronic hepatitis B. Hepatology 2007; 45: Schiff ER, Lai CL, Hadziyannis S, et al. Adefovir dipivoxil therapy for lamivudine resistant hepatitis B in preand post-liver transplantation patients. Hepatology 2003; 38: Angus P, Vaughan R, Xiong S, et al. Resistance to adefovir dipivoxil therapy associated with the selection of a novel mutation in the HBV polymerase. Gastroenterology 2003; 125: Perrillo R, Hann HW, Mutimer D, Willems B, Leung N, Lee WM, et al. Adefovir dipivoxil added to ongoing lamivudine in chronic hepatitis B with YMDD mutant hepatitis B virus. Gastroenterology 2004;126: Peters MG, Hann Hw H, Martin P, Heathcote EJ, Buggisch P, Rubin R, et al. Adefovir dipivoxil alone or in combination with lamivudine in patients with lamivudine-resistant chronic hepatitis B. Gastroenterology 2004;126: Chang TT, Gish RG, de Man R, et al. A comparison of entecavir and lamivudine for HBeAg-positive chronic hepatitis B. N Engl J Med 2006; 354: Lai CL, Shouval D, Lok AS, et al. Entecavirversus lamivudine for patients with HBeAg-negative chronic hepatitis 26. Tenny DJ, Pokornowsky KA, Rose RE, et al. Entecavir at five years shows long-term maintenance of high genetic barrier to hepatitis B virus resistance [abstract]. Hepatol Int 2008; 2: A Tenney DJ, Levine SM, Rose RE, Walsh AW, Weinheimer SP, Discotto L, et al. Clinical emergence of entecavir-resistanthepatitis B virus requires additional substitutions in virus already resistant to lamivudine. Antimicrob Agents Chemother 2004;48: Villet S, Ollivet A, Pichoud C, Barraud L, Villeneuve JP, Trepo C, et al. Stepwise process for the development of entecavir resistance in a chronic hepatitis B virus infected patient. J Hepatol 2007;46: Lai CL, Gane E, Liaw YF, et al. Telbivudine versus lamivudine in patients with chronic hepatitis B. N Engl J Med 2007; 357: Lai CL, Gane E, Hsu C, et al. Two-year results from GLO- BE trial in patients with hepatitis B: greater clinical and antiviral efficacy for telbivudine (LdT) vs lamivudine [abstract]. Hepatology 2006; 44: 222A. 31. Heathcote EJ, Ed Gane E, DeMan R, et al. A randomized, double-blind, comparision of tenofovir df (TDF) versus Adefovi dipivoxil (ADV) for the treatment of HBeAg positive chronic hepatitis B (CHB): Study GS-US [abstract]. Hepatology 2007; 46: 861A. 32. Marcellin P, Buti M, Krastev Z, et al. A randomized, double-blind, comparision of tenofovir DF (TDF) versus adefovir dipivoxil (ADV) for the treatment of HBeAg-negative chronic hepatitis B (CHB): study GS-US [abstract]. Hepatology 2007; 46: 80A. 33. van Bommel F, Zollner B, Sarrazin C, Spengler U, Huppe D, Moller B, et al. Tenofovir for patients with lamivudine-resistant hepatitis B virus (HBV) infection and high HBV DNA level during adefovir therapy. Hepatology 2006;44: Ratziu V, Thibault V, Benhamou Y, Poynard T.Successful rescue therapy with tenofovir in a patient with hepatic decompensation and adefovir resistant HBV mutant. Comp Hepatol. 2006: 11;5: Qi X, Xiong S, Yang H, Miller M, Delaney WE 4th. In vitro susceptibility of adefovir-associated hepatitis B virus polymerase mutations to other antiviral agents. Antivir Ther. 2007;12: Sheldon J, Camino N, Rodés B, Bartholomeusz A, Kuiper M, Tacke F, Núñez M, Mauss S, Lutz T, Klausen G, Locarnini S, Soriano V. Selection of hepatitis B virus polymerase mutations in HIV-coinfected patients treated with tenofovir. Antivir Ther. 2005;10: Curtis M, Zhu Y, Borroto-Esoda K. Hepatitis B virus containing the I233V mutation in the polymerase reversetranscriptase domain remains sensitive to inhibition by adefovir. J Infect Dis 2007;196: Sheldon J, Camino N, Rodes B, Bartholomeusz A, Kuiper M, Tacke F, et al. Selection of hepatitis B virus polymerase mutations in HIV-coinfected patients treated with tenofovir. Antivir Ther 2005;10: Tenney DJ, Rose RE, Baldick CJ, Levine SM, Pokornowski KA, Walsh AW, et al. Two year assessment of entecavir resistance in lamivudine-refractory hepatitis B virus patients reveals different clinical outcomes depending on the 66

13 resistance substitutions present. Antimicrob Agents Chemother 2007;51: Yang H, Qi X, Sabogal A, Miller M, Xiong S, Delaney W. Cross-resistance testing of next-generation nucleoside and nucleotide analogues against lamivudine-resistant HBV. Antivir Ther 2005;10: Villet S, Pichoud C, Villeneuve JP, Trepo C, Zoulim F. Selection of a multiple drug resistant hepatitis B virus strain in a livertransplanted patient. Gastroenterology 2006;131: Brunelle MN, Jacquard AC, Pichoud C, Durantel D, Carrouee- Durantel S, Villeneuve JP, et al. Susceptibility to antivirals of a human HBV strain with mutations conferring resistance to both lamivudine and adefovir. Hepatology 2005;41: Brunelle MN, Lucifora J, Neyts J, Villet S, Holy A, Trepo C, et al. In vitro activity of 2,4 diamino-6-[2-(phosphonomethoxy) ethoxy]-pyrimidine against multidrug-resistant hepatitis B virus mutants. Antimicrob Agents Chemother 2007;51: Pai SB, Bozdayı AM, Pai RB, Beker T, Sarioglu M, et al. Emergence of a novel mutation in the FLLA Region of Hepatitis B virus during Lamivudine therapy. Antimicrob Agents Chemother Jul;49(7): Zoulim F, Perrillo R Hepatitis B: Reflections on the current approach to antiviral therapy. Journal of Hepatology 48 (2008) S2 S Locarnini S, Mason WS. Cellular and virological mechanisms of HBV drug resistance. J Hepatol Feb; 44(2): Epub 2005 Dec Chin R, Shaw T, Torresi J, Sozzi V, Trautwein C, Bock T, Manns M, Isom H, Furman P, Locarnini S. In vitro susceptibilities of wild-type or drug-resistant hepatitis B virus to (-)-beta D-2,6-diaminopurine dioxolane and 2'- fluoro-5-methyl-beta-l-arabinofuranosyluracil. Antimicrob Agents Chemother Sep;45(9): Ono-Nita SK, Kato N, Shiratori Y, Carrilho FJ, Omata M. Novel nucleoside analogue MCC-478 (LY582563) is effective against wild-type or lamivudine-resistant hepatitis B virus. Antimicrob Agents Chemother Aug; 46(8): Levine S, Hernandez D, Yamanaka G, Zhang S, Rose R, Weinheimer S, Colonno RJ. Efficacies of entecavir against lamivudine-resistant hepatitis B virus replication and recombinant polymerases in vitro. Antimicrob Agents Chemother Aug;46(8): Karatayli E, Karayalçin S, Karaaslan H, Kayhan H, Türkyilmaz AR, Sahin F, Yurdaydin C, Bozdayi AM. A novel mutation pattern emerging during lamivudine treatment shows cross-resistance to adefovir dipivoxil treatment. Antivir Ther. 2007;12(5): Delaney WE 4th, Locarnini S, Shaw T. Resistance of hepatitis B virus to antiviral drugs: current aspects and directions for future investigation. Antivir Chem Chemother. 2001;12: Angus P, Locarnini S. Lamivudine-resistant hepatitis B virus and ongoing lamivudine therapy: stop the merrygo-round, it's time to get off! Antivir Ther ;9: Lok ASF, Zoulim F, Locarnini S, et al. Antiviral drug-resistant HBV: standardization of nomenclature and assays and recommendations for management. Hepatology 2007;46: Keeffe EB, Zeuzem S, Koff RS, et al. Report of an international workshop: roadmap for management of patients receiving oral therapy for chronic hepatitis B. Clin Gastroenterol Hepatol 2007;5: Bozdayi AM, Eyigun CP, Turkyilmaz AR, et. al. A novel pattern (sw195a) in surface gene of HBV DNA due to YSDD (L180M plus M204S) mutation selected during lamivudine therapy and successful treatment with adefovir dipivoxil. J Clin Virol ;31: Yim HJ, Hussain M, Liu Y, Wong SN, Fung SK, Lok AS. Evolution of multi-drug resistant hepatitis B virus during sequential therapy. Hepatology 2006;44: Hiroshi H, Kazuhiko K. Drug resistance in antiviral treatment for infections with hepatitis B and C viruses. J Gastroenterol 2007; 42: Bozdayi AM, Uzunalimoglu O, Turkyilmaz AR, Aslan N, Sezgin O, Sahin T, Bozdayi G, Cinar K, Pai SB, Pai R, Bozkaya H, Karayalcin S, Yurdaydin C, Schinazi RF. (2003). YSDD: a novel mutation in HBV DNA polymerase confers clinical resistance to lamivudine. J. Viral Hepat., 10: