BD GeneOhm StaphSR testi

Transkript

1 testi REF REF Test 48 Test P0036(02)_TR Tarih:

2 İçindekiler Kullanım amacı Testin özeti ve açıklaması İşlemin prensibi Ayıraçlar Önlemler Sağlanan materyaller Saklama, muamele ve stabilite Toplanan örnekler Ayıraçlar Gereken ama sağlanmayan materyaller Kullanım talimatı Örnek toplama pozitif kan kültürü Örnek toplama nazal eküvyon Örnek toplama yara eküvyonu testi örnek hazırlama Hücre süspansiyonu Lizis test işlemi Örneklerden kültür alma streak-plate yöntemi Örneklerden kültür alma zenginleştirme broth u Kalite kontrolü Pozitif ve negatif kontroller İlave örnek işleme koyma, pozitif ve negatif kontroller Sonuçların yorumlanması Geçersiz test çalışması Çözümlenmemiş örnek I-CORE modülü başarısızlığı nedeniyle örnek belirlenmedi İşlemin sınırlamaları Performans özellikleri Analitik özgüllük Analitik hassasiyet Klinik performans: pozitif kan kültürleri Tekrarlanabilirlik: pozitif kan kültürleri Klinik performans: nazal örnekler Tekrarlanabilirlik: nazal örnekler Klinik performans: yara örnekleri Tekrarlanabilirlik: yara örnekleri Referanslar Semboller indeksi P0036(02)_TR - 2 -

3 Türkçe Kullanım amacı Testi doğrudan pozitif kan kültürü, nazal ve yara örneklerinden hızlı Staphylococcus aureus (SA) ve metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) saptaması için kalitatif bir in vitro diagnostik testtir. Test, spesifik hedeflerin amplifikasyonu için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve MRSA ve SA amplifiye DNA nın gerçek zamanlı saptanması için florojenik, hedefe spesifik hibridizasyon probları kullanır. Pozitif kan kültürü örnekleri: Pozitif kan kültürü örnekleri için test, Gram pozitif kokları değerlendirmek için Gram boyayla birlikte kullanılır. Eşzamanlı kültürler sadece Gram boyada gözlenen diğer organizmaların elde edilmesi ve saptanması amacıyla veya Staphylococcus aureus (SA) veya metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) üzerinde ileri duyarlılık testleri ve/veya epidemiyolojik tipin belirlenmesi amacıyla gereklidir. Nazal örnekler: Nazal örnekler için test, MRSA veya SA MRSA enfeksiyonlarına tanı koyması veya MRSA/SA enfeksiyonları konusunda tedaviye rehberlik yapması veya tedaviyi izlemesi amaçlanmamıştır. Eşzamanlı kültürler sadece epidemiyolojik tipin belirlenmesi amacıyla organizmaların elde edilmesi veya duyarlılık testleri için gereklidir. Yara örnekleri: Yara örnekleri için test, enfeksiyonun klinik işaretliyle ilişkili olarak kullanılır. Eşzamanlı kültürler sadece diğer organizmaların elde edilmesi ve saptanması amacıyla veya Staphylococcus aureus (SA) veya metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) üzerinde ileri duyarlılık testleri ve/veya epidemiyolojik tipin belirlenmesi amacıyla gereklidir. Testin özeti ve açıklaması Testi, bir nazal veya yara eküvyonu veya Gram pozitif koklar içeren bir kan alikotuyla kullanılabilir. Bir nazal veya yara eküvyonu alınır ve laboratuara gönderilir (önerilen eküvyonların bir listesi, Gereken ama sağlanmayan materyaller kısmında verilmektedir). Test yapmak için nazal veya yara örneği örnek tamponuna yerleştirilir ve lizise uğratılır. Pozitif bir kan kültürü test ediliyorsa, kültür ortamının bir alikotu, bir örnek tampon tüpünde aktarılır ve lizise uğratılır. Tüm örnek tipleri için lizise uğratılmış örnekten bir miktar (lizat), mevcutsa genetik hedefi amplifiye etmek için kullanılan MRSA ya spesifik primerleri ve S. aureus içeren PCR ayıraçlarına eklenir. Test ayrıca test ayıraçlarının doğruluğunu kontrol etmek açısından PCR inhibitör maddeleri saptamak için bir dahili kontrol (IC) içerir. Amplifiye hedefler sönmüş floroforlar (moleküler işaret probları) ile etiketlenmiş hibridizasyon probları ile saptanır. Amplifikasyon, saptama ve sonuç yorumlama, Cepheid Smart Cycler yazılımı tarafından otomatik olarak yapılır. İşlem yaklaşık 60 ila 75 dakika sürer. Epidemiyolojik tiplendirme veya daha ileri antibiyotik duyarlılık testi için organizmaların izole edilmesi, örnek hazırlama sırasında uygun kültür ortamı inokülasyonuyla yapılabilir. S. aureus, klinik belirtileri püstüllerden sepsis veya ölüme 1 kadar gidebilen nozokomiyal enfeksiyonların temel bir nedenidir. Sıklıkla sağlıklı bireylerin burnunda veya cildinde bulunur (asemptomatik taşıyıcılar). Laboratuarda S. aureus asıl olarak burun kanadı, cilt, yaralar ve kan kültürlerinden izole olarak bulunur. Hastane ortamlarında S. aureus, genellikle sağlık çalışanlarının kontamine ellerinden hastadan hastaya bulaşır. S. aureus enfeksiyonlarının tedavisi daha önceden etkili olan antimikrobiyel ajanlara dirençli suşların ortaya çıkmasıyla önemli bir konu haline gelmiştir. Metisiline dirençli S. aureus suşları sıklıkla sağlık hizmetleri ortamlarında bulunur ve bazı Kuzey Amerika hastanelerinde hastaneden elde edilen S. aureus izolatlarının %60 ına yakınını temsil eder. 2 Sağlık bakımı ortamında MRSA ile enfeksiyonun risk faktörleri arasında hastanede uzun süre kalma, MRSA ile enfekte hastalara yakın olma, çok sayıda ve uzun süreli geniş spektrumlu antibiyotik tedavisi kullanma ve MRSA taşıma vardır. S. aureus Kan Dolaşım Enfeksiyonları S. aureus kan dolaşım enfeksiyonlarının %25 inden sorumludur, 3,4 bunlar arasında %26 ila %47 sine MRSA 3,5 neden olmuştur. S. aureus nedenli baktereminin %25 ila %35 4,6 mortalite oranlarıyla ilişkili olması, daha iyi hasta yönetimi sağlamak ve hastanede uzun kalışlardan kaynaklanan maliyetleri azaltmak için sonuç alma süresini azaltmanın önemini ortaya çıkarmaktadır. S. aureus Cerrahi Alan Enfeksiyonları S. aureus enfeksiyonları, birçok hastane işlemi için büyük bir kaygı oluşturmaktadır. Cerrahi işlem geçiren hastaların %26 kadarı, cerrahi alan enfeksiyonları (SSI) 2,7 geliştirmektedir. S. aureus en sık CAI nedenleri arasında sürekli olarak bildirilmektedir. Bu nedenle, bu patojen I CAI nın %20 ila %50 sinden sorumludur ve bunlar arasında MRSA, izolatların %57 sini temsil edebilir. Her iki patojenle ilişkili mortalite oranı %5 ila %22 7,8 arasında değişmektedir. Çoğu hastada enfeksiyon alanındaki S. aureus izolatı hastanın burnundan gelen izolatla aynıdır. 7,9 S. aureus Cilt ve Yumuşak Doku Enfeksiyonları S. aureus çoğu zaman deri ve yumuşak doku enfeksiyonlarıyla (DYDE) ilişkili toplumsal bir patojen olarak ortaya çıkmaktadır. Bu enfeksiyonlar, tedavi edilmeden bırakıldıklarında veya tedavi uygun olmayan şekilde yapıldığında ağırlaşmaktadır. Bazı durumlarda bu enfeksiyonlar sepsis ve nekrotizan pnömoniye yol açmışlardır. 10 Son veriler S. aureus un YDE lu hastaların %76 sından izole olduğunu belirlemiştir. Bu SA izolatlarından %78 i MRSA 10 idi. MRSA ile ilgili DYDE bulunan hastaların %80 inden fazlası enfeksiyonları için ampirik antimikrobiyel terapi almalarına rağmen, enfekte edici izolat, bu hastaların %57 sine reçete edilen ajana dirençliydi. 10 Bu nedenle, bu organizmaların erkenden tanımlanması, klinisyenlerin tekrarlayan veya invazif DYDE enfeksiyon riskini azaltmak için uygun antibiyotiği vermelerini sağlayabilir. S. aureus ve MRSA yı saptamak için kullanılan konvansiyonel teknikler, kültür basamaklarını ve saf kolonilerin izolasyonunu gerektirirler ve bunları S. aureus u saptamak için aglütinasyon testi ve ya oksasilin duyarlılık testi, meca geni saptanması ya da MRSA yı saptamak için penisilin bağlayıcı protein (PBP 2a) saptanması yer alır. Bu l konvansiyonel yöntemler kullanıldığında S. aureus ve MRSA durumunu çözümlemek için, 48 saatten fazla ortanca süreyle minimum 16 saat gerekmektedir. S. aureus enfeksiyonlarıyla ilgili morbidite ve mortalite oranlarının artmasıyla birlikte, S. aureus ve MRSA yı günler yerine saatler içerisinde saptamak ve ayrıştırmak, mevcut uygulamalar karşısında kesin bir avantaj getirir ve daha etkin hasta tedavisi ve yönetimine olanak sağlar. P0036(02)_TR - 3 -

4 İşlemin prensibi Örnek lizisinden sonra, birisi veya her ikisi varsa hedeflerin amplifikasyonu olur [MRSA: Stafilokoksis Kaset Kromozomu mec (SCCmec) insersiyon bölgesinin yanındaki dizi; S. aureus (SA): SCCmec kasetine bağlanmamış ayrı bir S. aureus spesifik dizi]. PCR i inhibitör maddeler bulunmuyorsa IC amplifikasyonu da gerçekleşir. Amplifiye DNA hedefleri bir uçta bir söndürücü ve öteki uçta bir floresan raportör boya (florofor) ile etiketlenmiş, saç tokası şekli oluşturan tek iplikli oligonükleotidler olan moleküler işaret probları tarafından saptanır. Hedef yokluğunda floresans söner. Hedef varlığında toka yapısı işaret/hedef hibridizasyonu durumunda açılıp floresans emisyonu yapar. MRSA amplikonunun saptanması için moleküler işaret probu, 5 ucunda FAM floroforunu ve oligonükleotidin 3 karşı ucunda floresan olmayan söndürücü kısım DABCYL içerir. S. aureus amplikonunu saptamak için moleküler işaret probu, 5 ucunda TexasRed floroforu ve 3 ucunda söndürücü DABCYL ile etiketlenir. IC amplikonunu saptamak için moleküler işaret probunda 5 ucunda TET floroforu ve 3 ucunda söndürücü DABCYL bulunur. Her işaret-hedef hibridi belirli moleküler işaret probunda kullanılan floroforun dalga boyu özelliğine göre floresans yayar. Herhangi bir döngüde veya döngü sonrasında floresans miktarı o anda bulunan belirli amplikonun miktarına bağlıdır. SmartCycler yazılımı her moleküler işaret probunda yayılan floresansı aynı anda izler, tüm verileri yorumlar ve döngü programı sonunda son bir sonuç verir ( Sonuçların yorumlanması kısmına bakın). Ayıraçlar testi 48 Test 200 Test Örnek tamponu (Sample Buffer) 60 X 1 ml 240 X 1 ml Tris-EDTA tamponu Lizis tüpü (Lysis tube) 50 tüp 200 tüp Cam boncuklar Ana karışım (her birinde 8 reaksiyon) (Master Mix) 8 tüp 34 tüp < %0,0005 DNA polimeraz kompleksi < %0,001 Dahili kontrol - MRSA-primer bağlayıcı diziler ve prob hibridizasyonu için özgün bir dizi içeren enfeksiyöz olmayan DNA < %0,002 primerler < %0,002 moleküler işaret probları < %0,05 datp, dctp, dgtp, dttp Sığır serum albümini Karbonhidrat MgCl 2 < %0,001 enfeksiyöz olmayan Staphylococcus epidermidis genomik DNA sı (ATCC 14990) Kontrol DNA (Control DNA) 8 tüp 34 tüp Tris-EDTA tamponu Karbonhidrat < %0,001 enfeksiyöz olmayan genomik MRSA DNA sı (ATCC 43300) Seyreltici (Diluent) 8 X 700 µl 34 X 700 µl Tris-HCl tamponu MgCl 2 (NH 4) 2SO 4 KCl Önlemler Dış karton güvenlik mührü bozulmuşsa kiti kullanmayın. Koruyucu poşetler geldiklerinde açık veya yırtıksa ayıraçları kullanmayın. Ana karışım ve kontrol DNA nın koruyucu poşetlerini her kullanımdan sonra fermuar şeklinde kapanan mühürle çabucak kapatın. Ana karışım ve kontrol DNA poşetlerinden kurutucuyu çıkarmayın. Ana karışım ve kontrol DNA poşetlerinin içinde kurutucu yoksa, ayıraçları kullanmayın. Ayıraçlar lotlar arasında değiştirilemez. Farklı tüplerden ayıraçları, aynı lottan olsalar bile, asla bir araya koymayın. Ayıraçları son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. Ayıraçların kapaklarını birbirleriyle değiştirmeyin çünkü kontaminasyon oluşabilir ve test sonuçlarını tehlikeye atabilir. Tüplerden alikotları çıkarırken ayıraçların mikrobiyel ve deoksiribonükleaz (DNAse) kontaminasyonundan kaçının. Steril, DNAse içermeyen tek kullanımlık filtre bloklu veya pozitif displasman pipetör uçlarının kullanılması önerilir. P0036(02)_TR - 4 -

5 Çevrenin S. aureus ve MRSA amplikonlarıyla kontaminasyonunu önlemek için reaksiyon tüplerini amplifikasyon sonrasında açmayın. Her örnek veya ayıraç için yeni bir pipetör ucu kullanın. Testin süresinin önerilen süre aralığının dışına çıkması geçersiz sonuçlara neden olabilir. Belirtilen süreler içinde yapılmayan testler tekrarlanmalıdır. Ek kontroller kılavuz ilkelere veya yerel, bölgesel ve ulusal yönetmelikler veya sertifikasyon sağlayan kurumlara göre test edilebilir. Laboratuar tarafından açık tüplü PCR testlerinin de aynı genel alanda yapıldığı durumlarda örnek hazırlama ve amplifikasyon/saptama aktiviteleri için ayrılmış çalışma alanları kullanılmalıdır. Malzeme ve ekipman her alan için ayrı olmalı ve bir alandan ötekine götürülmemelidir. Daima eldiven kullanılmalı ve bir alandan ötekine giderken değiştirilmelidir. Liyofilize ayıraçlar kullanılmadan önce eldivenler değiştirilmelidir. Örnekleri daima bulaşıcı olabilirlermiş gibi Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 11 ve CLSI Belgesi M29 12 içinde tanımlandığı gibi güvenli laboratuar işlemlerine göre kullanın. Kit ayıraçlarını kullanırken koruyucu giysiler ve tek kullanımlık eldivenler kullanın. Testi yaptıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Ağzınızla pipetlemeyin. Örneklerin veya kit ayıraçlarının kullanıldığı yerlerde sigara içmeyin ve bir şey yemeyin ve içmeyin. Kullanılmamış ayıraçları ve atıkları ülke, bölgesel ve yerel düzenlemelere göre atın. Sağlanan materyaller Örnek tamponu (Sample Buffer) Lizis tüpü (Lysis tube) Ana karışım (Master Mix) Kontrol DNA (Control DNA) Seyreltici (Diluent) SmartCycler reaksiyon tüpleri, 25 µl kapasite Örnek tanımlama etiketleri Saklama, muamele ve stabilite Toplanan örnekler Pozitif kan kültürleri Pozitif kan kültürü örnekleri, test yapılmasından önce oda sıcaklığında (15 ila 25 C) 3 gün saklanabilir. Pozitif kan kültürlerinin, ikinci analiz için sevk edilmesi gerekiyorsa, bunlar taşıma sırasında 2 ila 30 C arasında tutulmalıdır. Donmaya veya aşırı sıcağa maruz kalmaya karşı koruyun. 18 saat içinde test yapılacak pozitif kan kültürü örnekleri 35 C ye kadar oda sıcaklığında 18 saat saklanabilir. Nazal ve yara örnekleri Örnekler taşıma sırasında 2 ile 25 C arasında tutulmalıdır. Donmaya veya aşırı sıcağa maruz kalmaya karşı koruyun. Örnekler 36 saat içinde test edilmelidir. Lizatlar (DNA ekstraktları) Dahili sakama incelemeleri, lizatların -20 C de saklandıklarında iki yıl sonra test için kullanılabildiklerini göstermiştir. Ayıraçlar Not: Saklama koşulları her poşette yazılı spesifikasyonlara uymalıdır. Kit Bileşeni Master Mix ve Control DNA (beyaz ve kırmızı strip etiketler) Lysis tube (sarı kapak) Sample Buffer ve Diluent (sırasıyla mavi kapak ve siyah strip etiket) Mühürlü poşet Açılmış poşet Sıcaklık 2 25 C 2 25 C 2 25 C Stabilite Son kullanma tarihi Son kullanma tarihi Son kullanma tarihi Sıcaklık 2 25 C C 2, C 2,3 Stabilite 1 ay 3 Son kullanma tarihi 3 2 ay 3 1 Poşetteki orijinal mühür bozulduktan sonra poşeti her kullanım sonrasında fermuar şeklinde kapanan bir mühürle dikkatle kapatın ve uygun sıcaklıkta saklayın. 2 Bu ayıraçlar oda sıcaklığında saklanabilse de aynı lottan birlikte gelen ayıraçlarla birlikte 2 8 C de saklanmalıdır. 3 Poşetin her kullanımdan sonra fermuar şeklinde kapanan mühürle uygun şekilde kapatılması şartıyla. P0036(02)_TR - 5 -

6 1 Koruyucu poşetleri dışındaki kit bileşenleri Rekonstitüsyon yapılmamış tüpler Rekonstitüsyon yapılmış tüpler 1 Orijinal kap SmartCycler tüpü Belirtilen stabilite sona erdiğinde kullanılmamış tüpleri atın. Sıcaklık Master Mix ve Control DNA (beyaz ve kırmızı strip etiketler) C Stabilite 2 saat 1 Sıcaklık 2 8 C Stabilite 3 saat 1 Sıcaklık 2 8 C Stabilite 45 dakika 1 Gereken ama sağlanmayan materyaller Kan kültürü şişeleri: BACTEC Sistemi ( Diagnostic Systems) için kan kültürü şişeleri: BACTEC Plus Aerobic/F katalog no BACTEC Plus Anaerobic/F katalog no BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Kültür Şişeleri katalog no BACTEC PEDS PLUS/F Kültür Şişeleri katalog no Veya BacT/Alert Sistemi (biomérieux) için kan kültürü şişeleri: BacT/Alert SA katalog no BacT/Alert SN katalog no BacT/Alert FA katalog no BacT/Alert FN katalog no BacT/Alert PF katalog no Nazal ve yara örnekleri toplama eküvyonları: BBL CultureSwab Sıvı Stuart (Becton Dickinson katalog no ), Copan Transystem Sıvı Stuart (Copan Italia International katalog no. 141C.USE), Copan Venturi Transystem Sıvı Stuart (Copan Diagnostics Inc. katalog no. 141C.US) veya BBL CultureSwab Sıvı Amies (Becton Dickinson katalog no ), Copan Transystem Sıvı Amies (Copan Italia International katalog no. 140C.USE), Copan Venturi Transystem Sıvı Amies (Copan Diagnostics Inc. katalog no. 140C.US) veya BBL CultureSwab Artı Amies Jeli, Kömürsüz (Becton Dickinson katalog no ), Copan Transystem Amies Agar Jel, Kömürsüz (Copan Italia International katalog no. 108C.USE), Copan Venturi Transystem Amies Agar Jel, Kömürsüz (Copan Diagnostics Inc. katalog no. 108C.US) veya BBL CultureSwab Plus Amies Jel, Kömürlü (Becton Dickinson katalog no ), Copan Transystem Amies Agar Jel, Kömürlü (Copan Italia International katalog no. 114C.USE), Copan Venturi Transystem Amies Agar Jel, Kömürlü (Copan Diagnostics Inc. katalog no. 114C.US). Tüm örnek tipleri için: Gram boyama ayıraçları BBL CHROMagar Staph aureus katalog no , Mannitol Tuz Agarı (MSA) katalog no veya veya eşdeğer ortam (isteğe bağlı) %5 koyun kanlı agar plakasında (örn. BBL Triptikaz Soya Agarı (TSA II) %5 Koyun Kanı, katalog no veya ) (isteğe bağlı) %6,5 NaCl eklenmiş TSB (triptik soya broth) (isteğe bağlı) Vortex Genie 2 (Fisher) 1,5 ml mikrotüp tutucu veya eşdeğeri ile; çok sayıda örneğin işleme konması için çok sayıda tüp tutabilen bir adaptör kullanılabilir Mikropipetörler (hassas aralık 1 10 µl, µl ve µl arasında) Steril, DNAse-içermeyen filtre bloklu veya pozitif displasman mikropipetör uçları DNAse içermeyen mikrosantrifüj tüpleri Tek kullanımlık eldivenler, pudrasız Mikrosantrifüj, düşük hızda santrifügasyon için Kuru ısıtma bloğu, 1,5 ml tüpler veya su banyosuna özel Buz veya soğutma bloğu, 1,5 ml tüplere özel Kapak çıkarma aracı (örn. MATRIX katalog no. 4469) (isteğe bağlı) Kronometre veya süre ölçer SmartCycler başlangıç sistemi, Dx Yazılımı ile (işleme koyma bloğu, kullanıcı kılavuzu, aksesuar kiti ve bilgisayar) P0036(02)_TR - 6 -

7 Kullanım talimatı Örnek toplama pozitif kan kültürü Yeterli bir örnek almak için örnek toplama işlemi yakından izlenmelidir. Önerilen bir kan kültürü şişesi kullanarak (bkz. Gereken ama sağlanmayan materyaller ): 1. Kan örneklerini üreticinin talimatlarına ve hastanenin standart çalışma işlemlerine göre toplayın ve işleyin. 2. İnokülasyon yapılmış kan şişelerini üreticinin talimatlarına ve hastanenin standart çalışma işlemlerine göre etiketleyin ve gönderin. 3. Uygun bir otomatik kan kültür sistemi kullanarak kan kültürü şişelerini inkübe edin. 4. Pozitifliğin belirlenmesinden sonra kan kültürü şişelerini inkübasyondan çıkarın ve saklama ve muamele için, bkz. Saklama, muamele ve stabilite Toplanan örnekler. 5. Pozitif kan kültüründen bir Gram boya gerçekleştirin. Gram pozitif koklar gözlenirse, testi örnek hazırlama kısmına ve diğer sonuçlar için Örneklerden kültür alma kısımlarına gidin. Örnek toplama nazal eküvyon Yeterli bir örnek almak için örnek toplama işlemi yakından izlenmelidir. Önerilen bir eküvyon kullanılarak (bkz. Gereken ama sağlanmayan materyaller ), nazal örnekler aşağıdaki işleme göre alınmalıdır: 1. Eküvyonu iki damla (yaklaşık 50 µl) steril serum fizyolojik (salin) ile nemlendirin veya kuru olarak kullanın. 2. Eküvyonu dikkatle hastanın burun deliğine yerleştirin (eküvyon ucu burun kanadının kenarından 2,5 cm (1 inç) mesafeye kadar yerleştirilmelidir). 3. Eküvyonu 5 kez çevirin. 4. Aynı eküvyonu ikinci burun deliğine yerleştirin ve 2. ve 3. adımları tekrarlayın. 5. Eküvyonu taşıma tüpüne yerleştirin. 6. Taşıma tüpünü etiketleyin. 7. Eküvyonu laboratuara hastanenin standart çalışma işlemlerine göre gönderin. 8. Saklama ve muamele için Saklama, muamele ve stabilite Toplanan örnekler kısmına bakın. Örnek toplama yara eküvyonu Yeterli bir örnek almak için örnek toplama işlemi yakından izlenmelidir. Önerilen bir eküvyon kullanılarak (bkz. Gereken ama sağlanmayan materyaller ), yara örnekleri aşağıdaki işleme göre alınmalıdır: 1. Normal salinden küçük bir miktar kullanarak ve yara yüzeyini gereksiz yere bozmamaya dikkat ederek fazlalık kalıntıyı ve tüm bandajları uzaklaştırın. 2. Eküvyonu kullanmadan önce bir-iki dakika bekleyin. Yara çok kuruysa, eküvyonu steril normal salinle nemlendirin. Yara nemliyse, eküvyon kuru olarak kullanılabilir. 3. Yara eküvyonu, enfeksiyonun klinik işaretlerinin bulunduğu bir doku bölgesinden alınmalıdır. Canlılığını kaybetmiş sarı dokuya, soyulmuş dokuya veya yara kabuklarına eküvyon uygulamayın. 4. Etraftaki cilde dokunmaktan kaçının. 5. Yara yüzeyine, aşağıdaki tekniklerden birine göre eküvyon uygulayın: a) 10 nokta diyagonal: Yaranın bir kenarından başlayın ( Nokta 1 ); eküvyonu yara yüzeyinin üzerinden diyagonal olarak karşı kenara yuvarlayın ( Nokta 2 ); tersine yönü izleyin ve eküvyonu yaranın üzerinden diyagonal olarak ilk kenara yuvarlayın ( Nokta 3 ); bu işlemi, yara yüzeyinin üzerinde bir zikzak deseniyle toplam 10 Nokta boyunca tekrarlayın. Eküvyonu, yara yüzeyinin üzerinde olabildiğince çok yuvarlak önemlidir. b) tek noktalı döndürme: Yaranın merkezinde, küçük miktarda akıntı veya kanama oluşturmaya yeterli kuvvette basınç uygulayın. Eküvyonu üç kez saat yönünde yuvarlayın. 6. Varsa taze cerahat veya yara sıvısı toplayın. 7. Eküvyonu taşıma tüpüne yerleştirin. 8. Taşıma tüpünü etiketleyin. 9. Eküvyonu laboratuara hastanenin standart çalışma işlemlerine göre gönderin. 10. Saklama ve muamele için Saklama, muamele ve stabilite Toplanan örnekler kısmına bakın. testi örnek hazırlama Not: Her örneğin işleme göre hazırlanması için bir Lysis tube (lizis tüpü, sarı kapaklı) ve en az bir Sample Buffer (örnek tampon tüpü, mavi kapaklı) gerekir. Gerekli sayıda tüpü koruyucu poşetlerden çıkarın, fazla havayı giderin ve poşeti hemen fermuar şeklinde kapanan mühürle kapatın. testini yapmadan önce örneklerden kültür almanın ayrıntıları için bkz. Klinik örneklerden kültür alma Tek Koloni ekim P0036(02)_TR - 7 -

8 Hücre süspansiyonu Pozitif kan kültürleri için: 1. Gram pozitif koklar içeren 2 µl homojen pozitif kan kültürünü bir örnek tamponu tüpüne (mavi kapaklı) aktarın. Örnek tamponu tüpünün uygun örnek kimliğini kapak ve/veya tüp etiketi üzerine yazın. 2. Yüksek hızda 15 saniye vorteksleyin. Çok sayıda örneği işleme koymak için çok sayıda tüp tutabilen bir adaptör kullanılabilir µl hücre süspansiyonun bir lizis tüpüne (sarı kapaklı) aktarın; sıkıca kapatın. Her örnek için yeni bir pipetör ucu kullanın. 4. Lizis başlıklı bölüme bakın. Nazal eküvyonlar için: 1. Eküvyonu bir örnek tamponu tüpüne (mavi kapaklı) yerleştirin. Örnek tamponu tüpünün uygun örnek kimliğini kapak ve/veya tüp etiketi üzerine yazın. 2. Eküvyon sapını kırın ve tüpü sıkıca kapatın. Eküvyonu tüp kenarına yakın olarak ucundan tutun (kontaminasyon riskini en aza indirmek için gazlı bez kullanın). Eküvyonu en dipten birkaç milimetre kaldırın ve kırmak için tüpün kenarına doğru bükerek kırın. Alternatif yöntem: kök kısmını kesmek için temiz makas kullanın. Kapağın sıkıca kapandığından emin olun. 3. Yüksek hızda bir dakika vorteksleyin. Çok sayıda örneği işleme koymak için çok sayıda tüp tutabilen bir adaptör kullanılabilir. 4. Tüm hücre süspansiyonunu bir lizis tüpüne (sarı kapaklı) aktarın. Steril, ince uçlu bir transfer pipeti veya uzun bir P-1000 mikropipetör kullanın. Kalan eküvyondan örnek kültürleri alınması ayrıntıları için Örneklerden kültür alma Zenginleştirme broth u kısmına bakın. 5. Oda sıcaklığında 5 dakika yüksek hızda ( x g ve x g arasında) santrifüje edin. 6. Süpernatanı alıp atın. Steril, ince uçlu bir transfer pipeti kullanın; pellete dokunmamaya dikkat edin. Her örnek için yeni bir transfer pipeti kullanın. 7. Lizis tüpüne 50 µl örnek tamponu ekleyin; sıkıca kapatın. Her örnek için yeni bir pipetör ucu kullanın. Bir örnek tamponu tüpüyle 20 adete kadar örnek hazırlanabilir. 20 adetten fazla örnek için gerektiği kadar örnek tampon tüpü hazırlayın (kullanılmamış tamponu testi işlemi nin daha sonraki basamakları için saklayın). 8. Lizis başlıklı bölüme bakın. Yara eküvyonları için: 1. Eküvyonu bir örnek tamponu tüpüne (mavi kapaklı) yerleştirin. Örnek tamponu tüpünün uygun örnek kimliğini kapak ve/veya tüp etiketi üzerine yazın. 2. Eküvyon sapını kırın ve tüpü sıkıca kapatın. Eküvyonu tüp kenarına yakın olarak ucundan tutun (kontaminasyon riskini en aza indirmek için gazlı bez kullanın). Eküvyonu en dipten birkaç milimetre kaldırın ve kırmak için tüpün kenarına doğru bükerek kırın. Alternatif yöntem: kök kısmını kesmek için temiz makas kullanın. Kapağın sıkıca kapandığından emin olun. 3. Yüksek hızda 1 dakika vorteksleyin. Çok sayıda örneği işleme koymak için çok sayıda tüp tutabilen bir adaptör kullanılabilir µl hücre süspansiyonun bir lizis tüpüne (sarı kapaklı) aktarın; sıkıca kapatın. Her örnek için yeni bir pipetör ucu kullanın. Kalan eküvyondan örnek kültürleri alınması ayrıntıları için Örneklerden kültür alma Zenginleştirme broth u kısmına bakın. 5. Lizis başlıklı bölüme bakın. Lizis 1. Hücre süspansiyonunu içeren lizis tüpünü yüksek hızda 5 dakika vorteksleyin. Çok sayıda örneği işleme koymak için çok sayıda tüp tutabilen bir adaptör kullanılabilir. 2. Lizis tüpünü kısa süre santrifüje edin (hızlı çevirme). Düşük hızda 2 5 saniye; içeriği tüpün dip kısmına getirmek için. 3. İki (2) dakika boyunca 95 ± 2 C de ısıtın. 1,5 ml tüplere özgü bir kuru ısıtma bloğu veya su banyosu kullanın. 4. Lizis tüpünü buz üzerinde veya bir soğutma bloğunda tutun. Lizatlar hemen test için kullanılamıyorsa, daha sonra kullanılmak üzere -20 ± 5 C de saklayın. P0036(02)_TR - 8 -

9 test işlemi Not: Bir rekonstitüsyon yapılmış Master Mix (ana karışım tüpü, beyaz etiketli) 8 reaksiyon yapmaya yeterli ayıraç sağlar. Test edilecek örnek başına bir SmartCycler tüpü ve pozitif ve negatif kontroller için 2 ek SmartCycler tüpü ayırın. Her test çalışmasına bir (1) pozitif ve bir (1) negatif kontrol dahil edilmelidir. Her test çalışması için bir Control DNA (kontrol DNA, kırmızı strip etiketli) gereklidir. 3 adete kadar Ana karışım tüpünün rekonstitüsyonu için bir seyreltme tüpü (siyah strip etiketli) gereklidir. Gerekli sayıda tüpü koruyucu poşetlerden çıkarın, fazla havayı giderin ve poşeti hemen fermuar şeklinde kapanan mühürle kapatın. Sadece SmartCycle aletindeki mevcut I-CORE modüllerini doldurmaya yetecek kadar SmartCycler tüplerini hazırlayın. 1. Gerekli sayıda ana karışım tüpünü/tüplerini 1,5 ml tüplere özel buza veya soğutma bloğuna koyun. 2. Her ana karışım tüpüne 225 µl seyreltici (siyah strip etiketi) ekleyin. Mikropipetör ucunu kapak septumu içinden ana karışım tüpüne yerleştirin. Ucu kapak içine fazla derin yerleştirmeyin. Seyrelticiyi koyun. Sonra kullanılmamış seyrelticiyi atın. 3. Tüpü/tüpleri 5 10 saniye vorteksleyin. Kullanıma hazır olana kadar tüpü 1,5 ml tüplere özel buza veya soğutma bloğuna koyun (rekonstitüsyon yapılmış ana karışım tüpleri, buzda veya soğutma bloğunda 3 saat stabildir). 4. Bir kontrol DNA tüpünü (kırmızı strip etiketli) 1,5 ml tüplere özel buza veya soğutma bloğuna koyun. 5. Kontrol DNA tüpüne 225 µl örnek tamponu (mavi kapaklı) ekleyin. Mikropipetör ucunu Kontrol DNA tüpünün kapak septumu içinden yerleştirin. Ucu kapak içine fazla derin yerleştirmeyin. Örnek tamponunu verin. 6. Tüpü 5 10 saniye vorteksleyin. Kullanıma hazır olana kadar tüpü 1,5 ml tüplere özel buza veya soğutma bloğuna koyun. 7. SmartCycler soğutma bloğuna gerekli sayıda SmartCycler tüp yerleştirin. Her örnek başına bir SmartCycler tüp ve kontroller için iki adet daha SmartCycler tüp ayırın. Tüpün alt kenarlarındaki optik saptama pencerelerine ve alt elmas şekilli alana dokunmaktan kaçının. Aşağıdaki basamaklar MUTLAKA KIRK BEŞ DAKİKA İÇERİSİNDE yapılmalıdır: 8. SmartCycler tüplerine 25 µl rekonstitüsyon yapılmış ana karışım ekleyin (solüsyonun gerektiği gibi aktarılmasını sağlamak için uygun pipetleme tekniği gerekir). Ayıracın pipetlenmesinden önce kapağı çıkarın. Sıvıyı SmartCycler tüplerinin rezervuarına (üst kısım) koyun. SmartCycler tüplerini kapakta tanımlayın. Örnek tanımlama etiketleri (kitle sağlanır) kullanılabilir. Kullanılmamış ana karışımı atın. 9. Her lizise uğratılmış örnekten 3,0 µl miktarını önceden rekonstitüsyon yapılmış ana karışımla doldurulmuş farklı bir SmartCycler tüpüne koyun; tüpleri kapatın. Lizis tüpünden pipetleme yaparken boncukları aspire etmemeye dikkat edin. Örnek eklendikten sonra tüm hacmin aktarıldığından emin olmak açısından rezervuar içinde 2 3 kez yukarı aşağı pipetleme yapın. Her örnek için yeni bir mikropipetör ucu kullanın. 10. Rekonstitüsyon yapılmış kontrol DNA sından 3,0 µl miktarını en sondan bir önceki SmartCycler tüpüne (Pozitif Kontrol) ekleyin; tüpü kapatın. DNA eklendikten sonra tüm hacmin aktarıldığından emin olmak açısından rezervuar içinde 2 3 kez yukarı aşağı pipetleme yapın. Pozitif kontrol olarak tanımlayın. Kullanılmamış kontrol DNA yı atın. 11. Son SmartCycler tüpüne (Negatif Kontrol) 3,0 µl örnek tamponu (mavi kapaklı) ekleyin; tüpü kapatın. Adım 5 te elde edilen örnek tamponu tüpünü kullanın. Bu işlem örneklerin kullanımı sırasında olabilecek PCR kontaminasyonu izleme açısından kontrol gerçekleştirecektir. Negatif kontrol olarak tanımlayın. Sonra kullanılmamış örnek tamponunu atın. 12. Tüm reaksiyon tüplerini 5-10 saniye santrifüje edin. SmartCycler aleti ile sağlanan özel olarak uyarlanmış mikrosantrifüjü kullanın. 13. Tüpleri alete yüklemeden önce SmartCycler soğutma bloğu üzerinde 2 8 C de tutun. Kalan lizatlar gerekirse daha sonra kullanım için -20 ± 5 C de dondurulmalıdır. 14. test protokolü ile bir çalışma oluşturun. Gerekirse SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzuna bakın. Çalışmayı başlatmadan önce örnekler için tanımlama parametrelerini girin. 15. Her reaksiyon tüpünü SmartCycler I-CORE modülüne yerleştirin ve I-CORE kapağını kapatın. Pozitif ve negatif kontrolleri uygun pozisyona yerleştirin (bakınız Kalite kontrolü kısmı). Tüm tüpleri sıkıca yerlerine aşağıya doğru itin 16. Çalışmayı başlatın. Örneklerden kültür alma streak-plate yöntemi Antimikrobiyel duyarlılık testi veya epidemiyolojik tip belirleme amacıyla aşağıda açıklana Tek Koloni ekimi yöntemini kullanın. Pozitif kan kültürleri için: 1. Pozitif kan kültüründe Gram pozitif koklar gözlendiğinde, pozitif kan kültüründen birkaç damlayı önce plakaların ilk çeyreklik kısmına aktararak bir kanlı agar plağına veya diğer uygun katı ortama inoküle edin. P0036(02)_TR - 9 -

10 2. Steril bir inokülasyon özesi veya iğnesiyle, inokulumu plakların kalan çeyreklerine yayın. 3. Plakaları 35 C de saat inkübe edin. 4. Kolonileri tanımlayın ve antimikrobiyel duyarlılık testini standart yöntemlere göre yapın. Nazal eküvyonlar için: 1. (eküvyonu) kabından çıkarın. 2. Bir mannitol tuzlu agarı (MSA) plağına veya diğer uygun katı ortam plaklarının birinci çeyreğine yayarak inoküle edin. 3. Eküvyonu kabına geri koyun veya örnek tampon tüpünde (mavi kapaklı) kırıp Örnek hazırlama kısmındaki talimata göre devam edin. 4. Steril bir inokülasyon özesi veya iğnesiyle, inokulumu plakların kalan çeyreklerine yayın. 5. Plakaları 35 C de saat inkübe edin. 6. Standart yöntemlere göre S. aureus kolonilerini tanımlayın ve metisilin direnç testi yapın. Yara eküvyonları için: 1. (eküvyonu) kabından çıkarın. 2. Bir kanlı agar plağını veya diğer uygun katı ortam plaklarının birinci çeyreğine yayarak inoküle edin. 3. Eküvyonu kabına geri koyun veya örnek tampon tüpünde (mavi kapak) kırıp Örnek hazırlama kısmındaki talimata göre devam edin. 4. Steril bir inokülasyon özesi veya iğnesiyle, inokulumu plakların kalan çeyreklerine yayın. 5. Plakaları 35 C de saat inkübe edin. 6. Kolonileri tanımlayın ve antimikrobiyel duyarlılık testini standart yöntemlere göre yapın. Örneklerden kültür alma zenginleştirme broth u Bu kültür yöntemi hücre süspansiyonunun lizis tüpüne aktarılmasından sonra örnek tamponu tüpünde kalan eküvyonlarla yapılabilir. Eküvyonlar kapalı örnek tamponu tüplerinde 2 8 C de kültür alınmasından önce 24 saate kadar saklanabilir; az miktarda MRSA veya SA bulunan örneklerle geri kazanım başarılı olmayabilir. Nazal eküvyonlar için: 1. Eküvyonu içeren örnek tampon tüplerine 1,0 ml zenginleştirme broth ekleyin. %6,5 NaCl eklenmiş TSB (triptik soya broth) önerilir saniye vorteksleyin C de 24 saat inkübe edin. Hiç büyüme yoksa, inkübasyonu 48 saate kadar sürdürün. 4. Uygun katı ortamda saat 35 C de alt kültür yapın. %5 koyun kanlı agar plakası veya MSA plakası önerilir. 5. Standart yöntemlere göre S. aureus kolonilerini tanımlayın ve metisilin direnci testi yapın. Yara eküvyonları için: 1. Örnek tamponu tüpünde kalan 300 µl hücre süspansiyonunu 5,0 ml zenginleştirme broth una aktarın. %6,5 NaCl eklenmiş TSB (triptik soya broth) önerilir saniye vorteksleyin C de saat inkübe edin. 4. Uygun katı ortamda saat 35 C de r pasaj yapın. %5 koyun kanlı agar plağı önerilir. 5. Kolonileri tanımlayın ve antimikrobiyel duyarlılık testini standart yöntemlere göre yapın. P0036(02)_TR

11 Kalite kontrolü Pozitif ve negatif kontroller Kalite kontrol işlemleri test performansını izlemek üzere tasarlanmıştır. Pozitif kontrolün önemli ayıraç hatalarını izlemek üzere tasarlanmıştır. Negatif kontrol S. aureus MRSA DNA veya amplikonlarıyla ayıraç veya çevresel kontaminasyonu (veya taşımayı) saptamak üzere tasarlanmıştır. Test kontrolleri (çalışma kontrolleri) pozitif ve negatif kontrollerdir. Geçersiz bir kontrol çalışmayı geçersiz hale getirir. Son olarak her reaksiyon karışımına dahil edilen bir dahili kontrolün her örnekte PCR engellemesini ve ayıraç bütünlüğünü izlemesi amaçlanmıştır. SmartCycler üzerinde çalışılan her test için bir pozitif kontrol ve bir negatif kontrol dahil edilmelidir. Yazılım otomatik olarak alet üzerinde kontrollerin pozisyonunu atar (bakınız SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzu). Tüm örnekler ve kontroller geçerli sonuçlar vermelidir (geçersiz pozitif veya negatif kontrol yok ve hatalı dahili kontrol yok). İlave örnek işleme koyma, pozitif ve negatif kontroller Kontrol suşları yerel, bölgesel ve ulusal yönetmelikler veya sertifikasyon sağlayan kurumların gereklilikleri veya kılavuz ilkelerine göre test edilebilir. Bir referans MRSA suşu (örn. American Type Culture Collection, ATCC 43300), iyi karakterize bir MRSA klinik izolatı, bir referans MSSA suşu (örn. ATCC 25923) veya iyi karakterize bir klinik örnek, bir örnek işleme koyma kontrolü olarak kullanılabilir; testte doğrudan kontrol edilmeyen test problarını ve primerleri izlemek için, varsa MRSA MREJ (Mec Sağ Ekstremite Eklemi) tip iii ve vii suşları ilave pozitif kontroller olarak kullanılabilir; başka herhangi bir Staphylococcus aureus dışı organizma (örn. Staphylococcus epidermidis ATCC 14990) harici bir negatif kontrol olarak kullanılabilir. Pozitif kan kültürleri: İzole edilmiş kolonileri %5 koyun kanlı agar plakasında içinde salinde 0,5 McFarland (~1,5 X 10 8 CFU/mL) türbiditeye kadar saat tekrar süspansiyon haline getirin. Bir örneği işleme koyun ve test edin ( Testi örnek hazırlama ve testi işlemi başlıklı kısımlara bakın). Genel kalite kontrolü rehberliği için, CLSI MM3 13 ve C24 14 kısımlarına bakabilirsiniz. Nazal ve yara örnekleri: İzole edilmiş kolonileri %5 koyun kanlı agar plakasında içinde salinde 0,5 McFarland (~1,5 X 10 8 CFU/mL) türbiditeye kadar saat tekrar süspansiyon haline getirin. ~10 6 CFU/mL süspansiyon elde edecek şekilde salin ile seyreltin. Önerilen eküvyonu ( Gereken ama sağlanmayan materyaller kısmına bakın) bakteriyel süspansiyona batırın, fazla sıvıyı bastırarak giderin, eküvyonu kabına yerleştirin (nakil ortamıyla temas etmesi için) ve oda sıcaklığında 5 dakika bırakın. Bir örneği işleme koyun ve test edin ( Testi örnek hazırlama ve testi işlemi başlıklı kısımlara bakın). Genel kalite kontrolü rehberliği için, CLSI MM3 13 ve C24 14 kısımlarına bakabilirsiniz. Sonuçların yorumlanması testi için karar algoritması SmartCycler yazılımına gömülüdür. Test sonuçlarının yorumlanması aşağıdaki kriterlere göre yapılır: Bildirilen test sonucu Bildirilen IC sonucu Sonucun yorumlanması NEG (NEG) PASS (GEÇTİ) S. aureus DNA saptanmadı POS (POS) NA (Uygulanamaz) MRSA DNA saptandı Reactive (Reaktif) NA (Uygulanamaz) S. aureus DNA saptandı, MRSA DNA saptanmadı Unresolved (Çözümlenmemiş) ND (Belirlenmedi) FAIL (BAŞARISIZ) ND (Belirlenmedi) Çözümlenmemiş engelleyici örnek veya ayıraç başarısızlığı I-CORE Modülü başarısızlığı nedeniyle saptanmadı (Uyarı veya Hata Kodları 1 ile) IC Dahili Kontrol; NA Uygulanamaz; ND belirlenmedi 1 Uyarı ve hata kodlarının yorumlanması için SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzuna bakınız. Geçersiz bir pozitif veya negatif kontrol test çalışmasını geçersiz hale getirir. Bu gibi durumlarda o çalışma için alınan test sonuçları geçersizdir ve bildirilmemelidir. Geçersiz bir test çalışması veya alet hata kodları veya alet uyarıları ekran üzerinde ve raporlarda işaretlenir. Sonuçlarını bildirmeden önce daima test çalışmasının geçerli olduğundan emin olun. Sonuçların yazdırılması için SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzuna bakın. Geçersiz test çalışması Her donmuş örnek lizatını kullanarak o test çalışmasında yeni kontrol tüpleriyle birlikte tüm örnekler için yeni reaksiyon tüpleri hazırlayın. Çözümlenmemiş örnek Testi ilgili örneğin donmuş lizatı ile tekrarlayın. Dondurma-çözme döngüsünün PCR engelleyici maddeleri azalttığı gösterilmiştir. I-CORE modülü başarısızlığı nedeniyle örnek belirlenmedi Testi ilgili örneğin donmuş lizatı ile tekrarlayın. Uyarı veya hata kodu mesajlarının yorumlanması için SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzuna bakınız. P0036(02)_TR

12 İşlemin sınırlamaları Bu testin performans özellikler, SmartCycler aleti dışındaki otomatik, gerçek zamanlı PCR aletleriyle belirlenmemiştir. Gereken ama sağlanmayan materyaller kısmında listelenenler dışındaki kan kültür ortamlarının ve eküvyonların kullanılması önerilmez. Bu test sadece pozitif kan kültürü şişe örnekleri, nazal örnekler ve yara örnekleriyle kullanılmak içindir; diğer klinik örnek tiplerinin performans özellikleri belirlenmemiştir. Negatif test sonuçlarının nedeni uygunsuz örnek toplama, muamele veya saklama, engelleyici varlığı, teknik hata, örnek karışımı veya örnekteki organizma sayısının testin analitik duyarlılığının altında olması olabilir. Bu prospektüste ve SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzunda talimata dikkatle uyulması hatalı sonuçların önlenmesi için gereklidir. Bu testin kullanımı işlem ve SmartCycler kullanımı konusunda eğitim almış personelle sınırlı olmalıdır. Ayıraç hazırlamaya gerek olmamasına ve ana teknik işlemin pipetleme olmasına rağmen bu testin doğru yapılması için iyi laboratuar tekniği şarttır. Testin yüksek analitik hassasiyeti nedeniyle özellikle çok sayıda alikotun tüpten alındığı durumlarda reaktiflerin saflığını korumak için büyük dikkat gösterilmelidir. testi sonuçları bazen çözümlenemeyebilir, belirlenemeyebilir (I-CORE modülü başarısızlığı nedeniyle) veya geçersiz bir kontrolle geçersizleşebilir. Yeniden test etmek gerekir, bu da test sonuçlarını elde etmede gecikmelere neden olabilir. Pozitif bir test sonucu canlı organizmaların mutlaka bulunduğu anlamına gelmez. Ancak Staphylococcus aureus veya MRSA varlığını düşündürür. MRSA saptaması için testi, SCCmec kasetini (meca genini taşır) ve orfx geni içinde yer alan S. aureus a spesifik bir diziyi aynı anda hedefler. testi, meca genini ve bu genin kodladığı penisilin bağlayıcı proteini (PBP 2a) doğrudan saptamaz. S. aureus saptaması için testi, S. aureus a özgü bir diziyi doğrudan hedefler. Primer veya prob bağlayıcı bölgelerdeki mutasyonlar veya polimorfizmler yeni veya bilinmeyen S. aureus varyantlarının saptanmasını etkileyebilir ve testi ile yalancı negatif bir sonuç verebilir. Hem MRSA, hem de MSSA içeren karma bir kültürde, son derece yüksek MSSA konsantrasyonları varsa (örn. MRSA:MSSA oranı 1:500 veya 1:1000 şeklindeyse) MRSA nın LoD u değişken olabilir (30 kopya/reaksiyon düzeyine kadar). Ana karışımın ve pozitif ve negatif kontrollerin hazırlanması, 25 C yi aşmayan bir ortamda yapılmalıdır. Olası enterferans yapan maddeler arasında verilenlerle sınırlı olmamak üzere şunlar vardır: kan, fazla nazal sekresyon/mukus, dekonjestanlar ve zaman zaman burun kuruluğunu ve/veya tahrişini gidermek üzere kullanılan maddeler. Fazla nnazal sekresyon ve kan bulunması PCR yi inhibe edip çözümlenmemiş sonuçlar verebilir. Performans özellikleri Analitik özgüllük 66 Staphylococcal dışı suşun (64 türü temsil eden) genomik DNA sı, 33 koagülaz-negatif Staphylococcus suşun genomik DNA sıyla birlikte (25 türü temsil eden) test edildi. Tüm türler ya S. aureus ile filogenetik olarak ilişkiliydi ya da insan vücudunda yaygın olarak ilişkili bulunuyordu. Bu örneklerin hiçbiri pozitif test edilmedi, bu nedenle analitik özgüllük %100 dü. Analitik hassasiyet Genomik DNA Kullanarak Saptama Sınırı (LoD) Belirleme Genomik DNA testi yapılırken Testi analitik hassasiyeti (saptama sınırları veya LoD'ler) 4 SCCmec tipi (I, II, III, IV) ve 6 MREJ genotipini (i, ii, iii, iv, v ve vii) temsil eden 6 MRSA suşundan azalan miktarlarda kantifiye (kopya/pcr reaksiyonu) genomik DNA ve 1 MSSA suşundan genomik DNA kullanılarak belirlenmiştir. Her suş 2 farklı kullanıcı tarafından 3 farklı Testi Master Mix lotu kullanarak tekrarlı olarak her konsantrasyonda en az 48 adet çalışılmıştır. Tüm replikatların %95'inin pozitif olmasının beklendiği en düşük konsantrasyon olarak tanımlanan analitik hassasiyet (LoD) MRSA için ortalama değer 4 DNA kopyası/pcr reaksiyonu olacak şekilde 2 ile 6 kopya/pcr reaksiyonu arasında ve MSSA için değer 15 DNA kopyası/pcr reaksiyonu olacak şekilde 13 ile 17 kopya/pcr reaksiyonu arasında değişmiştir. MRSA MREJ Genotipi tip i tip ii tip iii tip iv tip v tip vii SCCmec Tipi MSSA NA NA NA: Uygulanamaz *GA: güven aralıkları I II III III IV II LoD Konsantrasyonu (Kopya/PCR Reaksiyonu) (%95 GA ile*) 3 (2-3) 4 (3-5) 5 (4-6) 5 (4-6) 3 (2-3) 3 (3-4) 15 (13-17) P0036(02)_TR

13 Canlı Bakteriler Kullanarak Saptama Sınırı (LoD) Belirleme Canlı MRSA ve MSSA suşları testi yapılırken Testi analitik hassasiyeti (saptama sınırları veya LoD'ler) 4 SCCmec tipi (I, II, III, IV) ve 6 MREJ genotipini (i, ii, iii, iv, v ve vii) temsil eden 6 MRSA suşundan ve 1 MSSA suşundan kültürlerden hazırlanıp kantifiye edilmiş çok çeşitli MRSA ve MSSA bakteriyel suspansiyonlarına eküvyonların batırılmasıyla hazırlanan ve sonra Örnek Tamponu içinde deşarj/elüsyon yapılan simüle edilmiş pozitif sürüntüler kullanılarak belirlenmiştir. Her suş 4 farklı kullanıcı tarafından 3 farklı Test Master Mix lotu kullanarak tekrarlı olarak her konsantrasyonda 24 adet çalışılmıştır. Nazal örneklerde tüm replikatların %95'inin pozitif olmasının bekleneceği en düşük konsantrasyon olarak tanımlanan analitik hassasiyet (LoD) MRSA ortalama değer 109 CFU/eküvyon olacak şekilde 24 ile 319 CFU/eküvyon arasında ve MSSA için değer 641 CFU/eküvyon olacak şekilde 198 ile 1084 CFU/eküvyon arasında değişmiştir. Yara örneklerinde analitik hassasiyet (LoD) MRSA için ortalama değer 314 CFU/eküvyon olacak şekilde 95 ile 770 CFU/eküvyon arasında ve MSSA için değer 642 CFU/eküvyon olacak şekilde 449 ile 834 CFU/eküvyon arasında değişmiştir. Pozitif kan kültürü örneklerinde analitik hassasiyet (LoD) reaksiyon başına 10 CFU şeklindedir; ancak kan kültürlerinde ilgili zenginleştirme süreci nedeniyle tüm kan kültürü örnekleri test lot değerinin çok üzerinde reaksiyon başına DNA kopya numaralarıyla sonuçlanan çok yüksek bakteriyel yük içerirler. Nazal Uygulama MRSA MREJ Genotipi tip i tip ii tip iii tip iv tip v tip vii SCCmec Tipi MSSA NA NA NA: Uygulanamaz *GA: güven aralıkları I II III III IV II LoD Konsantrasyonu (CFU/eküvyon) (%95 GA ile*) 34 (24-44) 104 (74-134) 45 (32-58) 167 ( ) 67 (50-84) 236 ( ) 641 ( ) Yara Uygulaması MRSA MREJ Genotipi tip i tip ii tip iii tip iv tip v tip vii SCCmec Tipi MSSA NA NA NA: Uygulanamaz *GA: güven aralıkları I II III III IV II LoD Konsantrasyonu (CFU/eküvyon) (%95 GA ile*) 340 ( ) 135 (95-175) 448 ( ) 582 ( ) 216 ( ) 165 ( ) 642 ( ) Klinik performans: pozitif kan kültürleri testinin pozitif kan kültürleri için performans özellikleri çok merkezli bir prospektif araştırma çalışmasında belirlenmiştir. Çalışmaya ikisi Kanada, üçü A.B.D. den dört tıp merkezi katılmıştır. Çalışmaya katılabilmek için, BACTEC veya BacT/Alert kan kültür şişelerinden elde edilen pozitif kan kültürlerinin, hastane politikalarına göre test için uygun olmaları ve Gram boyayla değerlendirildiklerinde Gram pozitif koklar göstermeleri gerekiyordu. Alet tarafından pozitif olduklarının bildirilmeleriyle 36 saat içinde Gram pozitif koklar bakterileri büyümesi gösteren pozitif kan şişeleri üzerinde referans kültür yöntemi uygulandı. Referans yöntemi, gece boyunca inkübasyon sonrasında bir kanlı agar plakası üzerinde başlangıç analizinden oluştu. S. aureus olduğu düşünülen koloniler, lateks aglütinasyon testi, bir tüp koagülaz testi veya otomatik bir tanımlama sistemiyle doğrulandı. Doğrulanan koloniler, oksasilin tarama agar, PBP2 lateks aglütinasyon testi veya uygun panellerle otomatik bir antimikrobiyel duyarlılık testi kullanılarak metisilin direnci bakımından test edildi. MRSA ve/veya S. aureus kültürü pozitif bir örnek kültür tekniğinden MRSA ve/veya S. aureus için pozitif bir örnek olarak tanımlandı. MRSA veya S. aureus kültürü negatif bir örnek kültür tekniğinden MRSA ve/veya S. aureus için negatif bir örnek olarak tanımlandı. Toplam olarak, 1183 pozitif kan şişesi S. aureus ve MRSA için yukarıda tanımlanan referans kültür yöntemi ve testiyle test edildiklerinde uyumlu bulundu ve raporlanabilir sonuçlar üretti (Tablo 1). Referans kültür yöntemleriyle karşılaştırıldığında testi, MRSA için pozitif örneklerin %100 ünü ve S. aureus pozitif örneklerin %98,8 ila %100 ünü tanımladı (Tablo 2 ve 3). P0036(02)_TR

14 Tablo 1. MRSA ve S. aureus için testiyle elde edilen sonuçların, pozitif kan kültürleri için referans yöntemiyle elde edilen sonuçlarla karşılaştırılması MRSA S. aureus 1 Kültür/ID-ADT Sistemi 1 Kültür/ID-ADT Sistemi Kültür/ID-ADT Sistemi 2 Kültür/ID-ADT Sistemi Kültür/Oksasilin Tarama Agar Kültür/Oksasilin Tarama Agar Kültür/ID-ADT Sistemi 3 Kültür/ID-ADT Sistemi Kültür/ Oksasilin Tarama Agar ve PBP2 Lateks Kültür/ Oksasilin Tarama Agar ve PBP2 Lateks Tablo 2. MRSA için testiyle elde edilen performansın (çalışma yerine göre), pozitif kan kültürleri için referans yöntemiyle elde edilen sonuçlarla karşılaştırılması MRSA prevalansı MRSA Pozitif MRSA Negatif Genel 1 %13,7 (61/446) %100,0 (61/61) (%94,1 %100,0) %98,7 (380/385) (%97,0 %99,6) %98,9 (441/446) (%97,4 %99,6) 2 % 18,0 (24/133) %100,0 (24/24) (%85,8 %100,0) %98,2 (107/109) (%93,5 %99,8) %98,5 (131/133) (%94,7 %99,8) 3 %9,1 (21/232) %100,0 (21/21) (%83,9 %100,0) %100,0 (211/211) (%98,3 %100,0) %100,0 (232/232) (%98,4 %100,0) 4 %16,8 (48/286) %100,0 (48/48) (%92,6 %100,0) %98,3 (234/238) (%95,8 %99,5) %98,6 (282/286) (%96,5 %99,6) 5 %2,3 (2/86) %100,0 (2/2) (%15,8 %100,0) %100,0 (84/84) (%95,7 %100,0) %100,0 (86/86) (%95,8 %100,0) 1 Binomiyel %95 kesin güven aralıkları. P0036(02)_TR

15 Tablo 3. S. aureus için testiyle elde edilen performansın (çalışma yerine göre), pozitif kan kültürleri için referans yöntemiyle elde edilen sonuçlarla karşılaştırılması S. aureus prevalansı S. aureus Pozitif S. aureus Negatif Genel 1 %22,2 (99/446) %100,0 (99/99) (%96,3 %100,0) %100,0 (347/347) (%98,9 %100,0) %100,0 (446/446) (%99,2 %100,0) 2 %30,1 (40/133) %100,0 (40/40) (%91,2 %100,0) %98,9 (92/93) (%94,2 %100,0) %99,2 (132/133) (%95,9 %100,0) 3 %35,8 (83/232) %100,0 (83/83) (%95,7 %100,0) %100,0 (149/149) (%97,6 %100,0) %100,0 (232/232) (%98,4 %100,0) 4 %29,7 (85/286) %98,8 (84/85) (%93,6 %100,0) %96,5 (194/201) (%93,0 %98,6) %97,2 (278/286) (%94,6 %98,8) 5 %9,3 (8/86) %100,0 (8/8) (%63,1 %100,0) %100,0 (78/78) (%95,4 %100,0) %100,0 (86/86) (%95,8 %100,0) 1 Binomiyel %95 kesin güven aralıkları. Tablo 4. Pozitif kan kültürleri için çözümlenmemiş sonuçlar %95 kesin güven aralıklarıyla Başlangıçta Çözümlenemeyen % %95 kesin güven aralıklarıyla Tekrarlanan Çözümlenemeyen % 1 %0,0 (0/446) (%0,0 %0,8) %0,0 (0/446) (%0,0 %0,8) 2 %0,0 (0/133) (%0,0 %2,7) %0,0 (0/133) (%0,0 %2,7) 3 %0,0 (0/232) (%0,0 %1,6) %0,0 (0/232) (%0,0 %1,6) 4 %0,3 (1/286) (%0,0 %1,9) %0,0 (0/286) (%0,0 %1,3) 5 %0,0 (0/86) (%0,0 %4,2) %0,0 (0/86) (%0,0 %4,2) Genel %0,1 (1/1183) (%0,0 %0,5) %0,0 (0/1183) (%0,0 %0,3) Tablo 5. Pozitif kan kültürleri için geçersiz testler %95 kesin güven aralıklarıyla Başlangıçta geçersiz çalışmalar % %95 kesin güven aralıklarıyla geçersiz tekrar çalışmaları % 1 %1,8 (2/113) (%0,2 %6,2) %0,0 (0/113) (%0,0 %3,2) 2 %8,9 (5/56) (%3,0 %19,6) %0,0 (0/56) (%0,0 %6,4) 3 %2,9 (2/69) (%0,4 %10,1) %0,0 (0/69) (%0,0 %5,2) 4 %2,4 (2/84) (%0,3 %8,3) %0,0 (0/84) (%0,0 %4,3) 5 %7,7 (5/65) (%2,5 %17,0) %0,0 (0/65) (%0,0 %5,5) Genel %4,1 (16/387) (%2,4 %6,6) %0,0 (0/387) (%0,0 %0,9) Tekrarlanabilirlik: pozitif kan kültürleri Tekrarlanabilirlik paneli ya Staphylococcus epidermidis, MRSA ya da S. aureus ile inoküle edilmiş 50 µl pozitif kan kültürü içeren 12 simülasyon örnekten oluşuyordu; ayrıca iki kontrol (pozitif ve negatif) dahil edilmişti. Örnekler, üç çalışma yerinde, üç farklı günde üçlü olarak test edildi (12 örnek artı iki kontrol X 3 X 3 gün X 3 çalışma yeri olarak test edildi). Bu işlem üç ayıraç lotuyla tekrarlandı. Tekrarlanabilirlik panelinin üyeleri, Staphylococcus aureus (MRSA), metisiline duyarlı Staphylococcus aureus (MSSA) veya Staphylococcus epidermidis ile inoküle edilmiş ayrı pozitif kan kültürü şişeleriyle hazırlanmıştı. İnoküle edilmiş şişeler, pozitif olana kadar inkübe edildi, ardından pozitif ortamın alikotları, her örnek için farklı konsantrasyonlarda bakteri elde etmek amacıyla seri dilüsyonlar hazırlamakta kullanıldı (Tablo 6). Tipik olarak, kan kültürü örnekleri, testin LoD una kıyasla çok yüksek bakteriyel yükler içerirle. Bu nedenle panel, LoD a dayanılarak değil, pozitif olduğu bildirilmiş bir şişenin dilüsyonundan oluşturuldu. Dolayısıyla panel, otomatik kan kültürü sistemlerindeki erken pozitiflik (yani beklenen daha düşük bakteriyel yükler) belirlemesine neden olabilecek potansiyel kalibrasyon sorunlarını taklit etmeyi hedefler. P0036(02)_TR

16 Tablo 6. Pozitif kan kültürü tekrarlanabilirlik çalışmasının kümülatif verileri. Örnek Kimliği Dilüsyon Lot 1 Lot 2 Lot 3 Toplam anlaşma Toplam % anlaşma Negatif Geçersiz 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Negatif Geçersiz 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 MRSA 1,0 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 MRSA 1,0 E-01 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 MRSA 5,0 E-02 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 MRSA 1,0 E-02 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 MRSA 1,0 E-03 27/27 27/27 26/26 80/80 %100,0 SA* 1,0 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 SA* 1,0 E-01 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 SA* 5,0 E-02 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 SA* 1,0 E-02 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 SA* 1,0 E-03 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Pozitif kontrol Geçersiz 26/27 27/27 26/27 79/81 %97,5 Negatif kontrol Geçersiz 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Toplam anlaşma 377/ / / /1133 %99,8 % anlaşma %99,7 %100,0 %99,7 %99,8 * Bu panelde SA, metisiline duyarlı bir suşu temsil eder Klinik performans: nazal örnekler testinin nazal eküvyonlar için performans özellikleri çok merkezli bir prospektif araştırma çalışmasında belirlenmiştir. Çalışmaya üçü Kanada, biri A.B.D. den dört tıp merkezi katılmıştır. Çalışmaya katılmak için hastaların hastane politikalarına göre test için uygun olmaları gerekmekteydi. Örnek toplamanın 14 gün öncesine MRSA veya S. aureus un yok edilmesine yönelik tedavi gören hastalar hariç çalışmanın dışında tutuldu. testi prospektif çalışmasını desteklemek üzere, pozitif S. aureus ve MRSA örneği havuzunu artırmak amacıyla saklanmış donmuş nazal örnekler kullanan retrospektif bir çalışma yapıldı. Bu çalışma üç (3) çalışma yerini içerdi; nin koleksiyonundan her biri 50 örneklik üç (3) panel için üye hazırlandı ve seçildi. Her panelin bileşimi çalışma yerlerinde bilinmiyordu. Referans yöntemi, gece boyunca inkübasyon sonrasında bir selektif mannitol tuz agar ortamında başlangıç analizinden oluştu. S. aureus olduğu düşünülen koloniler, S. aureus için bir aglütinasyon testi veya bir tüp koagülaz testiyle doğrulandı. Doğrulanan koloniler, MRSA için oksasilin tarama agar veya PBP2 aglütinasyon testi kullanılarak metisilin direnci bakımından test edildi. MRSA için negatif örnekler %6,5 NaCl içeren triptikaz soya broth (TSB) içinde bir zenginleştirme basamağı ve gerektiğinde sonrasında bir metisilin direnci testinden oluşan ek bir analizden geçti. MRSA ve/veya S. aureus kültürü pozitif bir örnek, her iki kültür tekniğinden MRSA ve/veya S. aureus için pozitif bir örnek olarak tanımlandı. MRSA veya S. aureus kültürü negatif bir örnek, her iki kültür tekniğinden MRSA ve/veya S. aureus için negatif bir örnek olarak tanımlandı. Toplam olarak, 1745 örnek S. aureus ve MRSA için yukarıda tanımlanan referans kültür yöntemi ve testiyle tarandıklarında uyumlu bulundu ve raporlanabilir sonuçlar üretti (Tablo 7 ve 12). Referans kültür yöntemleriyle karşılaştırıldığında testi, MRSA için pozitif örneklerin %73,3 ila %100 ünü ve S. aureus pozitif örneklerin %86,4 ila %94,6 sını tanımladı (Tablo 8, 9, 13 ve 14). P0036(02)_TR

17 Tablo 7. MRSA ve S. aureus için testiyle prospektif çalışmada elde edilen sonuçların, nazal örnekli referans yöntemiyle elde edilen sonuçlarla karşılaştırılması MRSA S. aureus 1 Kültür/Oksasilin Tarama Agar Kültür/Oksasilin Tarama Agar Kültür/PBP2 Lateks Kültür/PBP2 Lateks Kültür/ Oksasilin Tarama Agar ve PBP2 Lateks Kültür/ Oksasilin Tarama Agar ve PBP2 Lateks Kültür/ Oksasilin Tarama Agar ve PBP2 Lateks Kültür/ Oksasilin Tarama Agar ve PBP2 Lateks Tablo 8. MRSA için testiyle prospektif çalışmada elde edilen performansın (çalışma yerine göre), nazal örnekli referans yöntemiyle elde edilen performansla karşılaştırılması. MRSA prevalansı MRSA Pozitif % Anlaşma MRSA Negatif % Anlaşma Genel % Anlaşma 1 %9,0 (60/665) %96,6 (57/59) (%88,3 %99,6) %97,1 (576/593) (%95,4 %98,3) %97,1 (633/652) (%95,5 %98,2) 2 %7,8 (26/333) %84,6 (22/26) (%65,1 %95,6) %98,0 (301/307) (%95,8 %99,3) %97,0 (323/333) (%94,5 %98,6) 3 %1,4 (4/289) %100,0 (4/4) (%39,8 %100,0) %99,6 (279/280) (%98,0 %100,0) %99,6 (283/284) (%98,1 %100,0) 4 %4,5 (15/331) %73,3 (11/15)(%44,9 %92,2) %97,4 (305/313) (%95,0 %98,9) %96,3 (316/328) (%93,7 %98,1) 1 Binomiyel %95 kesin güven aralıkları. P0036(02)_TR

18 Tablo 9. S. aureus için testiyle prospektif çalışmada elde edilen performansın (çalışma yerine göre), nazal örnekli referans yöntemiyle elde edilen performansla karşılaştırılması. S. aureus prevalansı S. aureus Pozitif S. aureus Negatif Genel 1 %30,2 (201/665) %92,9 (183/197) (%88,4 %96,1) %94,7 (431/455) (%92,3 %96,6) %94,2 (614/652) (%92,1 %95,8) 2 %31,2 (104/333) %89,4 (93/104) (%81,9 %94,6) %97,8 (224/229) (%95,0 %99,3) %95,2 (317/333) (%92,3 %97,2) 3 %19,4 (56/289) %94,6 (53/56) (%85,1 %98,9) %97,4 (222/228) (%94,4 %99,0) %96,8 (275/284) (%94,1 %98,5) 4 %26,6 (88/331) %86,4 (76/88) (%77,4 %92,8) %96,3 (231/240) (%93,0 %98,3) %93,6 (307/328) (%90,4 %96,0) 1 Binomiyel %95 kesin güven aralıkları. Tablo 10. Nazal örneklerle çözümlenmemiş sonuçlar 1 %95 kesin güven aralıklarıyla Başlangıçta Çözümlenemeyen % %95 kesin güven aralıklarıyla Tekrarlanan Çözümlenemeyen % 1 %2,3 (15/665) (%1,3 %3,7) %0,2 (1/665) (%0,0 %0,8) 2 %0,3 (1/333) (%0,0 %1,7) %0,0 (0/333) (%0,0 %1,1) 3 %1,0 (3/289) (%0,2 %3,0) %0,0 (0/289) (%0,0 %1,3) 4 %1,5 (5/331) (%0,5 %3,5) %0,3 (1/331) (%0,0 %1,7) Genel çalışma %1,5 (24/1618) (%1,0 %2,2) %0,1 (2/1618) (%0,0 %0,4) 1 Yalnızca taze örnekler hesaplamaya dahil edildi Tablo 11. Nazal örneklerle geçersiz testler %95 kesin güven aralıklarıyla Başlangıçta geçersiz çalışmalar % %95 kesin güven aralıklarıyla geçersiz tekrar çalışmaları % 1 %2,9 (2/69) (%0,4 %10,1) %0,0 (0/69) (%0,0 %5,2) 2 %4,5 (3/67) (%0,9 %12,5) %0,0 (0/67) (%0,0 %5,4) 3 %6,5 (3/46) (%1,4 %17,9) %2,2 (1/46) (%0,1 %11,5) 4 %10,0 (3/30) (%2,1 %26,5) %3,3 (1/30) (%0,1 %17,2) Genel Çalışma %5,2 (11/212) (%2,6 %9,1) %0,9 (2/212) (%0,1 %3,4) P0036(02)_TR

19 Tablo 12. MRSA ve S. aureus için testiyle retrospektif çalışmada elde edilen sonuçların, nazal örnekli referans yöntemiyle elde edilen sonuçlarla karşılaştırılması. MRSA S. aureus 1 Kültür/Oksasilin Tarama Agar Kültür/Oksasilin Tarama Agar Kültür/Oksasilin Tarama Agar Kültür/Oksasilin Tarama Agar Kültür/Oksasilin Tarama Agar Kültür/Oksasilin Tarama Agar Tablo 13. MRSA için testiyle retrospektif çalışmada elde edilen performansın (çalışma yerine göre), nazal örnekli referans yöntemiyle elde edilen performansla karşılaştırılması. MRSA Pozitif MRSA Negatif Genel 1 %100,0 (30/30) (%88,4 %100,0) %100,0 (20/20) (83.2% %100,0) %100,0 (50/50) (%92,9 %100,0) 2 %100,0 (30/30) (%88,4 %100,0) %100,0 (20/20) (83.2% %100,0) %100,0 (50/50) (%92,9 %100,0) 3 %100,0 (29/29) (%88,1 %100,0) %94,7 (18/19) (%74,0 %99,9) %97,9 (47/48) (%88,9 %99,9) 1 Binomiyel %95 kesin güven aralıkları. Tablo 14. S. aureus için testiyle retrospektif çalışmada elde edilen performansın (çalışma yerine göre), nazal örnekli referans yöntemiyle elde edilen performansla karşılaştırılması. S. aureus Pozitif S. aureus Negatif Genel 1 %97,5 (39/40) (%86,8 %99,9) %100,0 (10/10) (%69,2 %100,0) %98,0 (49/50) (%89,4 %99,9) 2 %100,0 (40/40) (%91,2 %100,0) %100,0 (10/10) (%69,2 %100,0) %100,0 (50/50) (%92,9 %100,0) 3 %100,0 (39/39) (%91,0 %100,0) %77,8 (7/9) (%40,0 %97,2) %95,8 (46/48) (%85,7 %99,5) 1 Binomiyel %95 kesin güven aralıkları. P0036(02)_TR

20 Tekrarlanabilirlik: nazal örnekler Tekrarlanabilirlik paneli 100 µl MRSA; S. aureus veya S. epidermidis (negatif örnekler) içeren 14 simülasyon örneğinden oluşuyordu. Ayrıca iki kontrol (pozitif ve negatif) dahil edilmişti. Örnekler, iki çalışma yerinde, üç farklı günde üçlü olarak test edildi (14 örnek artı iki kontrol X 3 X 3 gün X 2 çalışma yeri olarak test edildi). Bu işlem üç ayıraç lotuyla tekrarlandı. İki (2) negatif örnek, Staphylococcus epidermidis ile inoküle edilmişti. MRSA ile inoküle edilmiş iki (2) pozitif örnek ve S. aureus ile inoküle edilmiş iki pozitif örnek, LoD a yakın bir bakteriyel yükle hazırlandı (Tablo 15 te düşük MRSA/S. aureus). MRSA ile inoküle edilmiş dört (4) pozitif örnek ve S. aureus ile inoküle edilmiş dört (4) pozitif örnek, LoD un üzerinde değişken miktarlarda bakteriyle hazırlandı (Tablo 15 te yüksek MRSA/S. aureus). Tablo 15. Nazal örnek tekrarlanabilirlik çalışmasının kümülatif verileri. Örnek Kimliği Lot 1 Lot 2 Lot 3 Toplam Uyum Toplam % Uyum Negatif 18/18 18/18 18/18 54/54 %100,0 Negatif 18/18 18/18 18/18 54/54 %100,0 Düşük pozitif MRSA 18/18 18/18 18/18 54/54 %100,0 Düşük pozitif MRSA 18/18 18/18 18/18 54/54 %100,0 Düşük pozitif SA* 18/18 17/18 16/18 51/54 %94,4 Düşük pozitif SA* 17/18 18/18 15/18 50/54 %92,6 Yüksek pozitif MRSA 18/18 18/18 18/18 54/54 %100,0 Yüksek pozitif MRSA 18/18 18/18 18/18 54/54 %100,0 Yüksek pozitif MRSA 18/18 18/18 18/18 54/54 %100,0 Yüksek pozitif MRSA 18/18 18/18 18/18 54/54 %100,0 Yüksek pozitif SA* 18/18 18/18 18/18 54/54 %100,0 Yüksek pozitif SA* 18/18 18/18 18/18 54/54 %100,0 Yüksek pozitif SA* 18/18 18/18 18/18 54/54 %100,0 Yüksek pozitif SA* 18/18 18/18 18/18 54/54 %100,0 Pozitif kontrol 18/18 17/18 17/18 52/54 %96,3 Negatif kontrol 18/18 17/18 18/18 53/54 %98,1 Toplam anlaşma 287/ / / /864 %98,8 % anlaşma %99,7 %99,0 %97,9 %98,8 * Bu panelde SA, metisiline duyarlı bir S. aureus suşu temsil eder Klinik performans: yara örnekleri testinin yara eküvyonları için performans özellikleri çok merkezli bir prospektif araştırma çalışmasında belirlenmiştir. Çalışmaya ikisi Kanada, ikisi A.B.D. den dört tıp merkezi katılmıştır. Çalışmaya katılmak için hastaların hastane politikalarına göre teste uygun olmaları için enfekte yara taşımaları gerekmekteydi. Örnek toplamanın 14 gün öncesine MRSA veya S. aureus un yok edilmesine yönelik tedavi gören,örnek toplanmasından önce antiseptik kullanan veya örnek toplanmasından önce lokal anestezik kullanan hastalar çalışmanın dışında tutuldu. Referans yöntemi, gece boyunca inkübasyon sonrasında bir kanlı agar plağına üzerinde başlangıç analizinden oluştu. S. aureus olduğu düşünülen koloniler, S. aureus için bir aglütinasyon testi veya bir tüp koagülaz testiyle doğrulandı. Doğrulanan koloniler, oksasilin tarama agar, MRSA için PBP2 aglütinasyon testi veya bir otomatik sistem kullanılarak metisilin direnci bakımından test edildi. MRSA için negatif örnekler %6,5 NaCl içeren triptikaz soya broth (TSB) içinde bir zenginleştirme basamağı ve gerektiğinde sonrasında bir metisilin direnci testinden oluşan ek bir analizden geçti. MRSA ve/veya S. aureus kültürü pozitif bir örnek, her iki kültür tekniğinden MRSA ve/veya S. aureus için pozitif bir örnek olarak tanımlandı. MRSA veya S. aureus kültürü negatif bir örnek, her iki kültür tekniğinden MRSA ve/veya S. aureus için negatif bir örnek olarak tanımlandı. Toplam olarak, 748 örnek S. aureus ve MRSA için yukarıda tanımlanan referans kültür yöntemi ve testiyle test edildiklerinde uyumlu bulundu ve raporlanabilir sonuçlar üretti (Tablo 16). Referans kültür yöntemleriyle karşılaştırıldığında testi, MRSA için pozitif örneklerin %96,0 ila %100 ünü ve S. aureus pozitif örneklerin %83,3 ila %100 ünü tanımladı (Tablo 17 ve 18). P0036(02)_TR

21 Tablo 16. MRSA ve S. aureus için testiyle elde edilen sonuçların, yara örnekleri için referans yöntemiyle elde edilen sonuçlarla karşılaştırılması. MRSA S. aureus 1 Kültür/Oksasilin Tarama Agar Kültür/Oksasilin Tarama Agar Kültür/PBP2 Lateks Kültür/PBP2 Lateks Kültür/ Oksasilin Tarama Agar ve PBP2 Lateks Kültür/ Oksasilin Tarama Agar ve PBP2 Lateks Kültür/ID-ADST Sistemi Kültür/ID-ADST Sistemi Tablo 17. MRSA için testiyle elde edilen performansın (çalışma yerine göre), yara örnekleri için referans yöntemiyle elde edilen sonuçlarla karşılaştırılması. MRSA prevalansı MRSA Pozitif MRSA Negatif Genel 1 %11,3 (50/443) %96,0 (48/50) (%86,3 %99,5) %95,7 (375/392) (%93,1 %97,5) %95,7 (423/442) (%93,4 %97,4) 2 %25,0 (3/12) %100,0 (3/3) (%29,2 %100,0) %100,0 (8/8) (%63,1 %100,0) %100,0 (11/11) (%71,5 %100,0) 3 %13,3 (2/15) %100,0 (2/2) (%15,8 %100,0) %100,0 (13/13) (%75,3 %100,0) %100,0 (15/15) (%78,2 %100,0) 4 %49,3 (139/282) %98,6 (137/139) (%94,9 %99,8) %98,6 (139/141) (%95,0 %99,8) %98,6 (276/280) (%96,4 %99,6) 1 Binomiyel %95 kesin güven aralıkları. P0036(02)_TR

22 Tablo 18. S. aureus için testiyle elde edilen performansın (çalışma yerine göre), yara örnekleri için referans yöntemiyle elde edilen sonuçlarla karşılaştırılması. S. aureus prevalansı S. aureus Pozitif S. aureus Negatif Genel 1 %30,2 (134/443) %92,5 (124/134) (%86,7 %96,4) %93,5 (288/308) (%90,1 %96,0) %93,2 (412/442) (%90,5 %95,4) 2 %50,0 (6/12) %83,3 (5/6) (%35,9 %99,6) %100,0 (5/5) (%47,8 %100,0) %90,9 (10/11) (%58,7 %99,8) 3 %46,7 (7/15) %100,0 (7/7) (%59,0 %100,0) %100,0 (8/8) (%63,1 %100,0) %100,0 (15/15) (%78,2 %100,0) 4 %66,3 (187/282) %97,9 (183/187) (%94,6 %99,4) %97,8 (91/93) (%92,4 %99,7) %97,9 (274/280) (%95,4 %99,2) 1 Binomiyel %95 kesin güven aralıkları. Tablo 19. Yara örnekleriyle çözümlenmemiş sonuçlar %95 kesin güven aralıklarıyla Başlangıçta Çözümlenemeyen % %95 kesin güven aralıklarıyla Tekrarlanan Çözümlenemeyen % 1 %2,7 (12/443) (%1,4 %4,7) %0,2 (1/443) (%0,0 %1,3) 2 %8,3 (1/12) (%0,2 %38,5) %8,3 (1/12) (%0,2 %38,5) 3 %6,7 (1/15) (%0,2 %31,9) %0,0 (0/15) (%0,0 %21,8) 4 %2,5 (7/282) (%1,0 %5,0) %0,7 (2/282) (%0,1 %2,5) Genel çalışma %2,8 (21/752) (%1,7 %4,2) %0,5 (4/752) (%0,1 %1,4) Tablo 20. Yara örnekleriyle geçersiz testler %95 kesin güven aralıklarıyla Başlangıçta geçersiz çalışmalar % %95 kesin güven aralıklarıyla geçersiz tekrar çalışmaları % 1 %3,3 (2/61) (%0,4 %11,3) %0,0 (0/61) (%0,0 %5,9) 2 %0,0 (0/11) (%0,0 %28,5) %0,0 (0/11) (%0,0 %28,5) 3 %23,1 (3/13) (%5,0 %53,8) %0,0 (0/13) (%0,0 %24,7) 4 %6,3 (4/63) (%1,8 %15,5) %0,0 (0/63) (%0,0 %5,7) Genel çalışma %6,1 (9/148) (%2,8 %11,2) %0,0 (0/148) (%0,0 %2,5) Tekrarlanabilirlik: yara örnekleri Tekrarlanabilirlik paneli 100 µl MRSA; S. aureus veya S. epidermidis (negatif örnekler) içeren 14 simülasyon örneğinden oluşuyordu. Ayrıca iki kontrol (pozitif ve negatif) dahil edilmişti. Örnekler, üç çalışma yerinde, üç farklı günde üçlü olarak test edildi (14 örnek artı iki kontrol X 3 X 3 gün X 3 çalışma yeri olarak test edildi). Bu işlem üç ayıraç lotuyla tekrarlandı. İki (2) negatif örnek, Staphylococcus epidermidis ile inoküle edilmişti. MRSA ile inoküle edilmiş üç pozitif örnek ve S. aureus ile inoküle edilmiş dört pozitif örnek, LoD a yakın bir bakteriyel yükle hazırlandı (Tablo 21 de düşük MRSA/SA). MRSA ile inoküle edilmiş üç pozitif örnek ve S. aureus ile inoküle edilmiş iki pozitif örnek, LoD un üzerinde değişken bakteri miktarlarıyla hazırlandı (Tablo 21 de yüksek MRSA/SA). P0036(02)_TR

23 Tablo 21. Yara örneği tekrarlanabilirlik çalışmasının kümülatif verileri. Örnek Kimliği Lot 1 Lot 2 Lot 3 Toplam Uyum Toplam % Uyum Negatif 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Negatif 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Düşük pozitif MRSA 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Düşük pozitif MRSA 27/27 27/27 25/27 79/81 %98,8 Düşük pozitif SA* 27/27 27/27 26/27 80/81 %98,8 Düşük pozitif SA* 26/26 27/27 27/27 80/80 %100,0 Düşük pozitif MRSA 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Yüksek pozitif MRSA 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Yüksek pozitif MRSA 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Yüksek pozitif MRSA 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Düşük pozitif SA* 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Düşük pozitif SA* 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Yüksek pozitif SA* 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Yüksek pozitif SA* 27/27 27/27 27/27 81/81 %100,0 Pozitif kontrol 27/27 27/27 26/27 80/81 %98,8 Negatif kontrol 26/27 27/27 27/27 80/81 %98,8 Toplam anlaşma 430/ / / /1295 %99,6 % anlaşma %99,8 %100,0 %99,1 %99,6 * Bu panelde SA, metisiline duyarlı bir S. aureus suşunu temsil eder P0036(02)_TR

24 GeneOhm TM Referanslar 1 2 Centers for Disease Control and Prevention. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin or soft tissue infection in a state prison. Mississippi, MMWR 2001; 50: National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 to June 2004, issued October Am J Infect Control. 2004; 32: Collignon, P. et al., Staphylococcus aureus bacteremia, Australia. Emerg. Infect. Dis., 2005; 11 (4): Wyllie, D., et al., Mortality after Staphylococcus aureus bacteraemia in two hospitals in Oxfordshire, : cohort study. BMJ, 2006; doi: /bmj f. 5 Staphylococcus aureus bacteremia: England, Wales and Northern Ireland: January to December CDR Weekly, 2004; 14 (16): Cosgrove, S., et al., Comparison of mortality associated with methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus bacteremia: a meta-analysis. Clin Infect Dis., 2003; 36 (1): Jernigan, J., Is the burden of Staphylococcus aureus among patients with surgical-site infections growing? Infect. Control Hosp. Epidemiol., 2004; 25 (6): Mc Garry, S. et al., Surgical-site infection due to Staphylococcus aureus among elderly patients: mortality, duration of hospitalization, and cost. Infect. Control Hosp. Epidemiol., 2004; 25 (6): Kluytmans, J. and Wertheilm H., Nasal carriage of Staphylococcus aureus and prevention of nosocomial infections. Infection, 2005; 33 (1): Moran, G.J., et al., Methicillin-resistant S. aureus Infections among patients in the emergency department. New Engl J Med, 2006; 355 (7): Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. Richmond JY and McKinney RW (eds) (1999). HHS Publication number (CDC) Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved Guideline. Document M29 (current edition/édition en vigueur). 13 Clinical and Laboratory Standards Institute. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline,(current edition/édition en vigueur). CLSI document MM3-A2. Clinical Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical and Laboratory Standards Institute. Statistical Quality Control for Quantitative Measurements: Principles and Definitions; Approved Guideline, (current edition/édition en vigueur). CLSI document C24. Clinical Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, 2006 Bu kit New York Eyaleti Public Health Research Institute (Kamu Sağlığı Araştırmaları Enstitüsü) lisansı ile satılmaktadır ve sadece insan in vitro klinik diagnostikleri için PHRI patent haklarına göre kullanılabilir. Bu ürünün satın alınması satın alan kişiye insan in vitro diagnostik bilgi sağlamak amacıyla nükleik asit dizilerinin amplifikasyonu ve saptanması için kullanılmasına izin verir. Bu satın almayla bu spesifik kullanım hakkı dışında herhangi bir genel patent veya başka herhangi bir türde lisans verilmez. Bu ürün, Molecular Probes, Inc. ve Geneohm Sciences, Inc. arasındaki bir anlaşmaya tabidir ve bu ürünün üretimi, kullanımı, satışı veya ithalatı (bütünüyle Invitrogen Corporation şirketinin bir yan kuruluşu olan) Molecular Probes, Inc. şirketinin sahibi olduğu bir veya daha çok A.B.D. patentine, bekleyen uygulamaya ve ilgili yabancı eşdeğerlerine tabi olabilir. Bu ürünün satın alınması satın alan kişiye, ürünün ve ürünün bileşenlerinin satın alınan miktarını, insan diagnostiğinde mikroorganizmaları tanımlamak amacıyla nükleik asit saptamasına yönelik testlerde kullanmak için devredilemez bir hak verir. Satın alan kişi, bu ürünü veya bileşenlerini imalat amacıyla veya terapötik veya profilaktik amaçla kullanamaz veya bu ürünü veya bileşenlerini satamaz veya üçüncü bir tarafa başka şekillerde devredemez veya insan diagnostiği dışındaki amaçlarla kullanamaz. Bu ürün için, insan diagnostiği dışındaki kullanım amaçları için bir lisans satın alınması hakkında bilgi için, Molecular Probes, Inc., Business Development, Willow Creek Road, Eugene, OR 97402, A.B.D. adresinden veya aşağıdaki numaralardan bağlantı kurun: Tel: (541) ; Faks: (541) P0036(02)_TR

25 GeneOhm TM Semboller ındeksi SEMBOL ANLAMI SEMBOL ANLAMI Üretici Parti kodu Katalog numarası Sıcaklık sınırlaması In Vitro Diagnostik Kullanım Işık ve nemden koruyun Yetkili Avrupa Temsilcisi Kullandıktan sonra poşetleri tekrar mühürleyin Son kullanma tarihi Kullanım talimatına bakınız İçindekiler «n» test için yeterlidir Nadražuje oči i kožu Müşteri Servisi: Benex Limited Pottery Road Dun Laoghaire, Co. Dublin, Ireland GeneOhm Sciences Canada, Inc boul. du Parc-Technologique Québec, QC, Canada, G1P 4S5, Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company P0036(02)_TR