BD GeneOhm MRSA ACP Testi Amplifikasyon Kiti

Transkript

1 Testi Amplifikasyon Kiti REF REF Test 200 Test P0057(02)_TR Tarih :

2 P0057(02)_TR - 2 -

3 İÇİNDEKİLER TÜRKÇE... 4 KULLANIM AMACI... 4 ÖZET VE AÇIKLAMA... 4 İŞLEMİN PRENSİBİ... 4 AYIRAÇLAR... 5 ÖNLEMLER... 6 SAĞLANAN MATERYALLER... 6 SAKLAMA, MUAMELE VE STABİLİTE... 7 GEREKEN AMA SAĞLANMAYAN MATERYALLER... 7 KULLANIM TALİMATI... 8 Hazırlama...8 Testi... 8 PCR Kontrol Başarısızlığı ve Numune İşleme Kontrol (SPC) Başarısızlığı için (SPC'ler Yapıldığında) Test İşlemini tekrarlayın... 9 Çözümlenmemiş veya Belirlenmemiş Sonuçlar için Test İşlemini Tekrarlayın KALİTE KONTROLÜ Pozitif ve Negatif PCR Kontrolleri Numune İşleme Kontrolleri (SPC'ler) SONUÇLARIN YORUMLANMASI Geçersiz Çalışma Çözümlenmemiş Örnek I-CORE Modülü Başarısızlığı Nedeniyle Numune Belirlenmedi İŞLEMİN SINIRLAMALARI BEKLENEN DEĞERLER PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Klinik Performans Analitik Hassasiyet Analitik Özgüllük Enterferans Yapan Maddeler Tekrarlanabilirlik Kesinlik...17 Ulaşan Kontaminasyon REFERANSLAR SEMBOLLER İNDEKSİ P0057(02)_TR - 3 -

4 Kullanım Amacı TÜRKÇE Testi nazal kolonizasyon riski olan hastalarda nazal sürüntülerden metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) DNA'sının doğrudan saptanması için bir kalitatif in vitro diagnostik testtir. Test, MRSA DNA'sının amplifikasyonu amacıyla polimeraz zincir reaksiyonunu (PCR) ve amplifiye DNA'nın saptanması için florojenik, hedefe spesifik hibridizasyon problarını kullanır. Testinin sağlık bakımı ortamlarında MRSA enfeksiyonlarının önlenmesi ve kontrolüne yardımcı olması amaçlanmıştır. MRSA enfeksiyonlarına tanı koyması veya MRSA enfeksiyonları konusunda tedaviye rehberlik yapması veya tedaviyi izlemesi amaçlanmamıştır. Eş zamanlı kültürler sadece epidemiyolojik tipin belirlenmesi amacıyla organizmaların elde edilmesi veya daha ileri duyarlılık testleri için gereklidir. Özet ve Açıklama MRSA nozokomiyal enfeksiyonların temel bir nedenidir. Çoğu bulaşma, MRSA taşıyan bir kişinin kontamine elleri yoluyla olur. MRSA püstüllerden sepsis veya ölüme kadar gidebilen klinik bulguları olan enfeksiyonlara yol açar. 1 Ancak sağlıklı kişilerin de (asemptomatik taşıyıcılar) burnunda veya cildinde bulunabilir. Antimikrobiyal ajanlara geniş direnci nedeniyle MRSA enfeksiyonlarının tedavisi önemli bir problem haline gelmiştir. Metisiline dirençli S. aureus suşları sıklıkla sağlık bakımı ortamlarında bulunur ve bazı Kuzey Amerika hastanelerinde hastaneden elde edilen S. aureus izolatlarının %50'sinden fazlasını temsil eder. 2 MRSA prevalansı A.B.D.'de hastaneler ve toplumda artmaya devam etmektedir. 2,3 Sağlık bakımı ortamlarında MRSA gelişmesi için risk faktörleri arasında hastanede uzun süreli kalma, MRSA enfeksiyon veya kolonizasyonu olan hastalara yakınlık, vankomisine dirençli enterokoklar (VRE) ve C. difficile gibi diğer dirençli organizmalarla kolonizasyon, çok sayıda ve/veya uzun süreli antibiyotik tedavisine maruz kalma, sağlık bakımı tesisi içinde yüksek MRSA prevalansı bölgelerine maruz kalma ve daha önce MRSA enfeksiyonu veya taşıma vardır. MRSA taşıyan hastaların erken tanımlanması MRSA için etkili bir enfeksiyon önleme programının önemli bir kısmıdır. MRSA'nın kültür temelli saptanması saf kolonilerin izolasyonu ve sonrasında oksasilin veya sefoksitin duyarlılık testi, meca geninin saptanması veya meca geninin kodladığı penisilin bağlayıcı proteinin (PBP 2a) saptanmasını içerir. Kültür temelli işlem minimum 24 saat sürerken MRSA tanımlamak için sonuca kadar ortanca süre 48 saate daha yakındır. MRSA enfeksiyonlarının özellikle taşıyıcıların sık görüldüğü sağlık bakımı ortamlarında hızla yayılabilmesi nedeniyle nazal MRSA taşımanın belirlenmesinin hastaneye yatış gününde yapılabilmesi enfeksiyon önleme programları için kesin bir avantaj sağlamaktadır. İşlemin Prensibi Bir nazal örnek önerilen eküvyon kullanılarak alınıp laboratuvara gönderilir ( Gereken Ama Sağlanmayan Materyaller kısmına bakın). Nazal sürüntü numunelerinde bakteriyel hücrelerin lizisi BD GeneOhm TM MRSA ACP Lizis kiti kullanılarak yapılır. Lizis alikotu, genetik hedefi mevcutsa amplifiye etmek için MRSA'ya spesifik primerleri içeren hazırlanmış PCR ayıraçlarına eklenir. Test ayrıca test ayıraçlarının doğruluğunu kontrol etmek açısından PCR inhibitörü maddeleri saptamak için bir Dahili Kontrol (IC) içerir. Kontroller ve numune lizatları tek kullanımlık reaksiyon tüplerine eklenip SmartCycler II cihazına yerleştirilir. Amplifikasyon, saptama ve sonuçları yorumlama, SmartCycler II yazılımı tarafından otomatik olarak yapılır. BD GeneOhm TM MRSA ACP Testi işlemi, işleme konan numunelerin sayısına bağlı olarak 2 saat içinde yapılabilir. Epidemiyolojik tür belirleme veya daha ileri antibiyotik duyarlılık testi için MRSA elde edilmesi amacıyla, örnek hazırlama sırasında veya hazırlamadan sonraki 24 saat içinde kültür ortamına inokülasyon yapılabilir. Testindeki primerler ve problar MRSA DNA varlığına işaret edecek şekilde S. aureus kromozomundaki özel bir diziyi saptar. IC ve MRSA DNA amplifikasyonu, amplifiye edilen hedefin spesifik bir dizisine bağlanan spesifik hibridizasyon probları kullanılarak saptanır. MRSA DNA ve IC ayırt edilmesi farklı fluorometrik özelliklere sahip moleküler işaretler kullanılarak yapılır. İşaret-hedef hibridi, MRSA ve IC için farklı dalga boylarında floresans gösterir ve bu reaksiyondan çıkan ışık SmartCycler II cihazıyla ölçülür. MRSA veya IC'ye spesifik amplikonlar SmartCycler üzerinde iki farklı floresans kanalında aynı anda saptanır ve böylece ayırt edilebilir. SmartCycler II cihazının çalışması şirkete özel mikroişlemci kontrollü I-CORE (Akıllı Soğutma/Isıtma Optik Reaksiyonu) modülünü temel alır. 4 P0057(02)_TR - 4 -

5 Ayıraçlar Testi 48 Test 200 Test Master Mix 8 tüp 30 tüp < %0,0005 DNA polimeraz kompleksi < %0,001 Internal Control (Dahili Kontrol): Bulaşıcı olmayan DNA içeren MRSA-primer bağlanma dizileri ve prob hibridizasyonu için özgül diziler < %0,06 primerler < %0,02 Moleküler problar < %1 Nucleotide mix (Nükleotid karışımı) (datp, dctp, dgtp, dttp) Sığır serum albumini Karbonhidrat MgCl 2 < %0,001 Bulaşıcı olmayan Staphylococcus epidermidis genomik DNA (ATCC 14990) Kontrol DNA 8 tüp 30 tüp Tris-EDTA tamponu Karbonhidrat < % 0,001Bulaşıcı olmayan genomik MRSA DNA (ATCC 43300) Diluent 8 X 700 µl 30 X 700 µl Tris-HCl buffer MgCl 2 (NH 4 ) 2 SO 4 KCl Tween-20 P0057(02)_TR - 5 -

6 Önlemler Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir. Dış karton güvenlik mührü bozulmuşsa kiti kullanmayın. Koruyucu poşetler geldiklerinde açık veya yırtıksa ayıraçları kullanmayın. Master Mix ve Kontrol DNA'nın koruyucu poşetlerini her kullanımdan sonra fermuar şeklinde kapanan mühürle kısa süre içinde kapatın. Mühürlemeden önce varsa poşetlerdeki fazla havayı giderin. Master Mix ve Kontrol DNA poşetlerinden kurutucuyu çıkarmayın. Master Mix ve Kontrol DNA poşetlerinin içinde kurutucu yoksa veya açılmışsa ayıraçları kullanmayın. Ayıraçlar lotlar arasında değiştirilemez. Farklı tüplerden ayıraçları, aynı lottan olsalar bile, asla bir araya koymayın. Ayıraçları son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. Ayıraçların kapaklarını birbirleriyle değiştirmeyin çünkü kontaminasyon oluşabilir ve test sonuçlarını tehlikeye atabilir. Tüplerden alikotları çıkarırken ayıraçların mikrobiyal ve deoksiribonükleaz (DNAse) kontaminasyonundan kaçının. Steril, DNAse içermeyen tek kullanımlık filtre bloklu veya pozitif displasman pipetör uçlarının kullanılması önerilir. Ortamın MRSA amplikonlarıyla kontaminasyonunu önlemek açısından reaksiyon tüplerini amplifikasyon sonrasında açmayın. Numune veya ayıraç tüpünün alt kısmındaki sıvıya ulaşmaya yetecek kadar küçük çapa sahip bir pipetör ucu kullanın. Testi yapma süresinin önerilen süre aralığının dışına çıkması geçersiz sonuçlara neden olabilir. Belirtilen süreler içinde yapılmayan testler tekrarlanmalıdır. Yerel, bölgesel ve/veya ulusal yönetmelikler veya sertifikasyon sağlayan kurumların gereklilikleri veya kılavuz ilkelere göre ek kontroller test edilebilir. Laboratuvar tarafından diğer açık tüplü PCR testleri yapılıyorsa, örnek hazırlama ve amplifikasyon/saptama aktiviteleri için ayrılmış ve izole edilmiş çalışma alanları kullanılmalıdır. Malzeme ve ekipman her alan için ayrı olmalı ve bir alandan ötekine götürülmemelidir. Daima eldiven kullanılmalı ve bir alandan ötekine giderken değiştirilmelidir. Liyofilize ayıraçlar kullanılmadan önce eldivenler değiştirilmelidir. Örnekleri daima bulaşıcı olabilirlermiş gibi ve Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 5 ve CLSI Belgesi M29 6 içinde tanımlandığı şekilde güvenli laboratuar işlemlerine göre kullanın. Kit ayıraçlarını kullanırken koruyucu giysiler ve tek kullanımlık eldivenler kullanın. Testi yaptıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Ağzınızla pipetlemeyin. Örneklerin veya kit ayıraçlarının kullanıldığı yerlerde sigara içmeyin ve bir şey yemeyin ve içmeyin. Kullanılmamış ayıraçları ve atıkları ulusal, bölgesel ve yerel yönetmeliklere göre atın. Sağlanan Materyaller Master Mix Kontrol DNA Dilüent SmartCycler reaksiyon tüpleri, 25 µl kapasite P0057(02)_TR - 6 -

7 Saklama, Muamele ve Stabilite Not: Saklama koşulları her poşette yazılı spesifikasyonlara uymalıdır. Master Mix ve Pozitif ve Negatif Kontrollerin hazırlanması, 25 C sıcaklığı aşmayan bir ortamda yapılmalıdır. Master Mix (beyaz şerit etiketi), Kontrol DNA (kırmızı Kit Bileşenleri şerit etiketi) ve Seyreltici (siyah şerit etiketi) Saklama Koşulları Mühürlü poşet Sıcaklık 2-25 C Stabilite Son kullanma tarihi Açılmış poşet Sıcaklık C Stabilite 2 1 ay 1 Poşetteki orijinal mühür bozulduktan sonra fazla havayı giderin ve poşeti her kullanım sonrasında fermuar şeklinde kapanan bir mühürle dikkatle kapatıp uygun sıcaklıkta saklayın. 2 Sağlanan torba her kullanımdan sonra fermuar şeklinde kapanan mühürle uygun şekilde kapatılmış. Master Mix (beyaz şerit etiketi) ve Koruyucu poşeti dışındaki Kit Bileşenleri Kontrol DNA (kırmızı şerit etiketleri) Sulandırılmamış ayıraçlar Sıcaklık C içeren tüpler Stabilite 2 saat Yeni, sulandırılmış Sıcaklık 2-8 C 2 Master Mix, orijinal kabında (Yeni tam Stabilite tüp, 8 tam 3 saat reaksiyon ile) Sulandırılma Sulandırılmış Sıcaklık 2-8 C 4 mış ayıraçlar Master Mix, orijinal içeren kabında (Kısmen tüpler 1 Stabilite kullanılmış tüp, 3 26 saat reaksiyon kalmış) 3 Sıcaklık 2-8 C 2 SmartCycler tüp İşlem adımları 5-10: 30 dakika Stabilite İşlem adımları 11-15: 30 dakika Belirtilen stabilite süresi geçtiğinde kullanılmamış tüpleri atın. Buz üzerinde veya bir soğutma bloğunda 25 C'yi geçmeyen bir ortamda saklanmalıdır. Kısmen kullanılmış Master Mix tüpleri ile çalışmaları kurmanın kılavuz ilkeleri için Kullanım Talimatı Kısmına bakınız. 2-8 C sıcaklığın devam ettirilmesi için buzdolabında saklanmalıdır. Gereken Ama Sağlanmayan Materyaller Lizis Kiti (BD katalog no ) Vorteks Genie 2 (VWR katalog no ) 1,5 ml mikrotüp tutucu veya eşdeğeri ile; çok sayıda örneğin işleme konması amacıyla çok sayıda tüp için tasarlanmış bir adaptör kullanılabilir (VWR katalog no ) Kalibre edilmiş Mikropipetörler (hassas aralık 1-10 µl, µl ve µl arasında) Steril DNase içermeyen filtre ile bloke edilmiş veya pozitif displasman mikropipetör uçları [1-10 µl (46 mm), µl ve µl] Buz veya soğutma bloğu 1,5 ml ve SmartCycler tüpleri için Mikrosantrifüj, SmartCycler tüpleri için SmartCycler II başlangıç sistemi, Dx Yazılımı ile (işleme koyma/soğutma bloğu, kullanıcı kılavuzu, aksesuar kiti ve bilgisayar) Kapak çıkarma aracı (örn. MATRIX katalog no. 4469) (isteğe bağlı) Tek kullanımlık eldivenler, pudrasız Kronometre veya süre ölçer Testi Tanımlama CD'si (kurulum desteği için BD Müşteri Hizmetleri ile irtibat kurun) P0057(02)_TR - 7 -

8 Kullanım Talimatı Hazırlama Toplu Lizis Ayıracı Hazırlama, Numune Toplama, Numune Hazırlama, Numune Lizisi ve Klinik Numunelerin Kültürünün yapılması için Lizis Kiti prospektüsüne başvurun. İki (2) PCR Kontrolü (bir (1) Pozitif ve bir (1) Negatif) Test çalışmasına dahil edilmelidir. PCR kontrolleri hazırlama talimatı için BD GeneOhm MRSA ACP Lizis Kiti prospektüsüne başvurun. Testi Not: Bir (1) rekonstitüsyon yapılmış Master Mix tüpü (beyaz etiket) sekiz (8) reaksiyon sağlar. Her numune için (1) SmartCycler tüpü gereklidir. PCR kontrolleri için ilave olarak iki (2) SmartCycler tüpü gereklidir. Gerekli sayıda tüpü koruyucu poşetler'nden çıkarın, fazla havayı giderin ve poşeti fermuar şeklinde kapanan mühürle kısa süre içinde kapatın. Koruyucu poşet kapatıldıktan sonra uygun şekilde mühürlenmesini sağlayın. Çalışma başına maksimum SmartCycler tüpü sayısı SmartCycler II cihazındaki/cihazlarındaki mevcut I-CORE modüllerinin sayısına bağlıdır. 1. Gerekli sayıda Master Mix tüpünü/tüplerini 1,5 ml tüplere özel soğutma bloğuna veya buza koyun. 2. Her Master Mix tüpüne 225 µl seyreltici (siyah şerit etiketi) ekleyin. Mikropipetör ucunu Master Mix tüpünün kapak septumu içinden yerleştirin. Ucu kapak içine fazla derin yerleştirmeyin. Seyrelticiyi tüpe verin. Kalan kullanılmamış seyrelticiyi atın. 3. Tüpü/tüpleri 5-10 saniye vorteksleyin. İşleme koymaya hazır olana kadar rekonstitüsyon yapılmış Master Mix tüpünü 1,5 ml tüplere göre tasarlanmış soğutma bloğuna veya buza koyun. NOTLAR: Sulandırılmamış Master Mix (orijinal kabında), Master Mix tüpü dolu olduğunda (8 tam reaksiyon içeriyor) bir soğutma bloğunda veya buz üzerinde 3 saate kadar saklanabilir. Tam sulandırılmış Master Mix tüpü saklama koşulları için Saklama, Muamele ve Stabilite Kısmına bakınız. Sulandırılmış Master Mix (orijinal kabında), Master Mix tüpünde 3 reaksiyon kaldığında 26 saate kadar 2-8 C'de buzdolabında saklanabilir. Kısmen sulandırılmış Master Mix tüpü saklama koşulları için Saklama, Muamele ve Stabilite Kısmına bakınız. 4. SmartCycler soğutma bloğuna gerekli sayıda SmartCycler tüpü yerleştirin. Her SmartCycler tüpünü uygun tanımlama ile etiketleyin. Tüpün alt kenarlarındaki optik saptama pencerelerine ve alt elmas şekilli alana dokunmaktan kaçının. Aşağıdaki Adımlar (5-10) MUTLAKA 30 DAKİKA İÇİNDE yapılmalıdırs NOT: Adım 5-10'un zamanında tamamlanmasını sağlamak üzere örnekler hazırlandıktan sonra SmartCycler tüplerini 8'li setlerde santrifüje etmek önerilir. Kısmen kullanılmış bir Master Mix tüpünden bir Master Mix kullanılarak bir çalışma kurulurken aşağıdaki kılavuz ilkelere mutlaka uyulmalıdır. 1. Bir kısmen kullanılmış Master Mix tüpünde tam bir çalışma [kontroller ve örnek(ler) ile] için yeterli reaksiyon içeriyorsa. - Kısmen kullanılmış Master Mix tüpünden kalan reaksiyonları hem kontroller hem örnek(ler) için kullanın 2. Kısmen kullanılmış Master Mix tüpü tam bir çalışma [kontroller ve örnek(ler) ile] için yeterli reaksiyon içermiyorsa. - Pozitif ve Negatif Kontroller için yeni (tam) sulandırılmış Master Mix tüpünden reaksiyonlar kullanın; kalan reaksiyonları yeni tüpten ve ayrıca numuneler için önceden kısmen kullanılmış Master Mix tüpünden kalan reaksiyonlarla birlikte kullanın. P0057(02)_TR - 8 -

9 5. Her SmartCycler tüpüne 25 µl sulandırılmış Master Mix ekleyin. Ayıracın pipetlenmesinden önce septum kapağını dikkatle çıkarın. Sulandırılmış Master Mix ayıracını her SmartCycler tüpünde rezervuar (üst kısım) içine koyun. Master Mix tüpünde en az 3 reaksiyon kaldıysa Master Mix tüpünü daha sonraki çalışmalarda kullanmak için saklayın. Pipetlemeden sonra Master Mix tüpünü orijinal Master Mix septum kapağı ile tekrar mühürleyin. Kalan sulandırılmış Master Mix kullanılırsa septum kapağını çıkarmadan önce tüpü kısa süre santrifüje edin (hızlı çevirme). NOT: Lizis tüplerini mühürlemek için septum kapağı kullanılmışsa Adım 6-8 için 45 mm pipet uçları gerekir. 6. Master Mix ayıracı içeren her karşılık gelen etiketlenmiş SmartCycler tüpü için 3 µl lizise uğratılmış numune ekleyin. SmartCycler tüpünü her numune lizatı eklendikten sonra sıkıca kapatın. Numune eklendikten sonra tam numune hacminin verilmesini sağlamak üzere SmartCycler tüpü rezervuarında pipet ucundan 2-3 kez sıvı geçirin. Her örnek için yeni bir mikropipetör ucu kullanın. 7. Uygun şekilde etiketlenmiş SmartCycler tüpüne 3 ul Pozitif kontrol ekleyin. SmartCycler tüpünü sıkıca kapatın. 8. Uygun şekilde etiketlenmiş SmartCycler tüpüne 3 ul Negatif kontrol ekleyin. SmartCycler tüpünü sıkıca kapatın. 9. Lizatların kullanılmamış kısmını içeren lizis tüplerini ek testler için -20 C'ye koyun (gerekirse). 10. Tüm reaksiyon tüplerini 5-10 saniye santrifüje edin. SmartCycler tüpleri ile uyumlu bir mikrosantrifüj kullanın. Aşağıdaki Adımlar (11-15) MUTLAKA 30 DAKİKA İÇİNDE yapılmalıdır: 11. Tüpleri alete yüklemeden önce SmartCycler soğutma bloğu üzerinde 2-8 C'de tutun. 12. BD GeneOhm MRSA ACP protokolü ile bir çalışma oluşturun. Çalışılacak örnek sayısını girin. Gerekirse SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzuna bakın. 13. Her reaksiyon tüpünü SmartCycler I-CORE modülüne yerleştirin ve I-CORE kapağını kapatın. Test Pozitif ve Negatif Kontrollerini Smartcycler Dx yazılımı tarafından belirlendiği şekilde uygun konumlarına koyun. 14. Tüplerin sıkıca yerinde olmasını sağlamak üzere her tüpün üstüne bastırın. 15. Çalışmayı başlatın. Her numune tanımlamayı manuel olarak veya bir barkod okuyucu kullanarak girin. PCR Kontrol Başarısızlığı ve Numune İşleme Kontrol (SPC) Başarısızlığı için (SPC'ler Yapıldığında) Test İşlemini tekrarlayın Not: Orijinal Örnek Tampon tüpleri (elüe numuneler ve kontroller içeren), 72 saate kadar 2-8 C'de saklanmış olarak tekrar testler için kullanılabilir (bakınız Lizis Kiti prospektüsünde Saklama, Muamele ve Stabilite kısmı). 1. Tekrar çalışma için kullanılan tüm tüpleri (numune ve kontroller) 2-8 C'de bir soğutma bloğuna yerleştirin. Numunelerle birlikte hazırlanan SPC'ler için tekrar test gerekiyorsa 2-8 C'de soğutma bloğuna SPC Örnek Tamponu tüplerini de ekleyin. 2. Lizis Kiti prospektüsünde "Numune Lizisi" kısmında adım 4-10'u izleyin. 3. Yukarıda Testi kısmında adım 1-15'i izleyin. P0057(02)_TR - 9 -

10 Çözümlenmemiş veya Belirlenmemiş Sonuçlar için Test İşlemini Tekrarlayın Not: Numuneler ve kontroller -20 C'de en fazla 8 gün saklanmış dondurulmuş numune/kontrol lizat tüplerinden tekrarlanmalıdır. Yeni örnekler içeren bir çalışma içinde: 1. Yeni numuneler ve kontrolleri BD GeneOhm MRSA ACP Lizis Kiti prospektüsünde sağlanan talimata göre hazırlayın. 2. Tekrar test yapılacak donmuş numune lizatlarını çözün. 3. Lizatları 2-8 C'de bir soğutma bloğuna yerleştirin. Lizatları 5-10 saniye vorteksleyin ve sıvının tüplerin alt kısmında yer almasını sağlamak üzere 5-10 saniyesantrifüj edin (hızlı çevirme). 4. Yukarıda Testi kısmında adım 1-15'i kontroller, çözülmüş numuneler ve yeni numuneler için tekrarlayın. Sadece tekrar örnekleri içeren bir çalışmada (bir veya bir kaç çalışma listesinden): 1. Tekrar test yapılacak donmuş numune ve kontrol lizatlarını çözün. 2. Lizatları 2-8 C'de bir soğutma bloğuna yerleştirin. Lizatları 5-10 saniye vorteksleyin ve sıvının tüplerin altında yer almasını sağlamak üzere 5-10 saniye santrifüj edin (hızlı çevirme). 3. Yukarıda Testi kısmında adım 1-15'i tekrarlayın. Kalite Kontrolü Pozitif ve Negatif PCR Kontrolleri Kalite kontrol işlemleri test performansını izlemek üzere tasarlanmıştır. Pozitif Kontrol, önemli ayıraç hatalarını izlemek üzere tasarlanmıştır. Negatif Kontrol, MRSA DNA veya MRSA amplikonlarıyla ayıraç veya çevresel kontaminasyonu (veya taşımayı) saptamak üzere tasarlanmıştır. Pozitif ve Negatif Kontroller test kontrolleridir (çalışma kontrolleri). Son olarak her reaksiyon karışımına dahil edilen bir Dahili Kontrolün (IC) her örnekte PCR inhibisyonunu ve ayıraç bütünlüğünü izlemesi amaçlanmıştır. Her Test çalışmasına bir (1) Pozitif Kontrol ve bir (1) Negatif Kontrol dahil edilmelidir. Bu kontroller Lizis Kiti prospektüsünde tanımlandığı şekilde lizis ayıracı ile inkübe ve inaktive edilmelidir. PCR yazılımı otomatik olarak cihaz üzerinde kontrollerin pozisyonunu atar (SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzuna bakınız). Tüm Pozitif ve Negatif Kontroller geçerli sonuçlar vermelidir. MRSA DNA'sı negatif numuneler için Dahili Kontroller geçerli sonuçlar vermelidir ( Sonuçların Yorumlanması kısmına bakınız). Numune İşleme Kontrolleri (SPC'ler) Numune İşleme Kontrolleri (SPC'ler) test süreci sırasında önemli çapraz kontaminasyon oluşmadığı konusunda güvence vermek ve önemli ayıraç veya metodoloji başarısızlığını izlemek açısından önerilir. SPC'ler olarak yerel, bölgesel ve/veya ulusal yönetmelikler veya sertifikasyon sağlayan kurumların gereklilikleri veya kılavuz ilkelerine göre ek kontrol suşları test edilmelidir. Pozitif SPC olarak bir referans MRSA suşu (örneğin ATCC 43300) veya iyi karakterize edilmiş bir MRSA klinik izolatı kullanılabilir; mevcutsa MRSA MREJ tip iii ve vii suşları testte doğrudan kontrol edilmeyen test problarını ve primerleri izlemek için ek pozitif SPC olarak kullanılabilir. Negatif SPC olarak bir metisiline duyarlı Staphylococcus aureus suşu (örneğin ATCC 25923) veya başka herhangi bir non-aureus Stafilokok (örneğin Staphylococcus epidermidis ATCC 14990) kullanılabilir. SPC'ler kullanıldığında geçerli sonuçlar vermelidir. Hatalı bir SPC sonucu durumunda SPC'ler ile aynı örnek işleme çalışmasında çalışılmış numunelerin, sonuçlar bildirilmeden önce PCR Kontrol Başarısızlığı ve Numune İşleme Kontrol (SPC) Başarısızlığı için (SPC'ler Yapıldığında) Test İşlemini tekrarlayın kısmı içinde ana hatları verilen işlemle uyumlu olarak tekrar test edilmesi kuvvetle önerilir. Genel kalite kontrolü rehberliği için CLSI C24 3 ve MM3 4 kısımlarına bakabilirsiniz. P0057(02)_TR

11 Sonuçların Yorumlanması Testi için karar algoritması SmartCycler Test sonuçlarının yorumlanması aşağıdaki kriterlere göre yapılır: Bildirilen IC (Dahili Bildirilen test sonucu Sonucun yorumlanması 1 Kontrol) sonucu NEG (NEGATİF) PASS (GEÇTİ) MRSA DNA saptanmadı yazılımına gömülüdür. POS (POZİTİF) NA (GEÇERSİZ) MRSA DNA saptandı Unresolved Çözümlenmemiş inhibitör örnek veya ayıraç FAIL (BAŞARISIZ) (Çözümlenmemiş) başarısızlığı I-CORE Modülü başarısızlığı nedeniyle belirlenmedi BELİRLENMEDİ BELİRLENMEDİ (Uyarı veya Hata Kodları ile 2 ) IC Dahili Kontrol; NA geçersiz; ND belirlenmedi 1 Testi sonuçları kurumsal programlar ve uygulamalarla birlikte izolasyon ve önlem düzeyi için bir kılavuz olarak kullanılabilir. 2 Uyarı ve hata kodlarının yorumlanması için SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzuna bakınız. Sonuçların yazdırılması için SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzuna bakınız. Geçersiz Çalışma Geçersiz bir Pozitif veya Negatif PCR Kontrolü, Test Çalışmasını Geçersiz hale getirir. Bu gibi durumlarda o çalışma için alınan test sonuçları geçersizdir ve bildirilmemelidir. Geçersiz bir test çalışması veya cihaz hata kodları veya uyarıları raporlarda işaretlenir. MRSA sonuçlarını bildirmeden önce daima test çalışmasının geçerli olduğundan emin olun. Lütfen PCR Kontrol Başarısızlığı ve Numune İşleme Kontrol (SPC) Başarısızlığı için (SPC'ler Yapıldığında) Test İşlemini tekrarlayın kısmına bakınız. Çözümlenmemiş Örnek Testi ilgili numune/numunelerve kontroller için donmuş lizat(lar) ile tekrarlayın. Örnek lizatında dondurmaçözme döngüsünün PCR engelleyici maddeleri azalttığı gösterilmiştir. Lütfen Çözümlenmemiş veya Belirlenmemiş Sonuçlar için Test İşlemini Tekrarlayın kısmına başvurun. I-CORE Modülü Başarısızlığı Nedeniyle Numune Belirlenmedi Testi ilgili numune/numuneler ve kontroller için donmuş lizat(lar) ile tekrarlayın. Lütfen Çözümlenmemiş veya Belirlenmemiş Sonuçlar için Test İşlemini Tekrarlayın kısmına başvurun. Uyarı veya hata kodu mesajlarının yorumlanması için SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzuna bakınız. İşlemin Sınırlamaları Bu ürün sadece Lizis Kiti kullanılarak lizise uğratılmış nazal sürüntü numuneleriyle kullanılmalıdır. Bu ürün sadece SmartCycler II aletiyle kullanılmalıdır. Negatif test sonuçlarının nedeni ayrıca uygunsuz örnek toplama, muamele veya saklama, teknik hata, örnek karışması veya örnekteki organizma sayısının testin analitik duyarlılığının altında olması olabilir. Hatalı sonuçları önlemek için prospektüs talimatı ve Kullanım Kılavuzuna/Kılavuzlarına dikkatle uymak gereklidir. Bu testin düzgün yapılması için uygun laboratuar tekniği şarttır. Bu testin yüksek analitik hassasiyeti nedeniyle özellikle çok sayıda alikotun tüpten alındığı durumlarda tüm ayıraçların saflığını korumak için büyük dikkat gösterilmelidir. Tarama belirli bir zamanda kolonizasyon durumunu gösterir, ve bu durum hastanın aldığı tedavi (örneğin dekolonizasyon rejimi), hastanın durumu (örn. aktif olarak MRSA saçmıyor) veya yüksek riskli ortamlara maruz kalma (örn. MRSA taşıyıcısıyla temas, uzun süreli hastanede yatma) gibi faktörlerle değişebilir. Kolonizasyon durumu kurumsal politikalara göre izlenmelidir. Testinin sonuçları artmış önlemler gerektiren hastaları tanımlamak için nozokomiyal enfeksiyon kontrolü çabalarına yardımcı olarak kullanılmalıdır. Testin stafilokoksik P0057(02)_TR

12 enfeksiyon bulunan hastaları tanımlaması amaçlanmamıştır. Sonuçlar MRSA enfeksiyonları için tedaviye kılavuzluk yapma veya bunu izleme için kullanılmamalıdır. pozitif bir sonuç DNA varlığında devam edebileceğinden tedavi eradikasyonunun başarısızlığını kesin olarak göstermez. Daha önceki bir pozitif test sonucundan sonraki negatif bir sonuç tedavi eradikasyonunun başarısını gösterebilir veya aralıklı yayma nedeniyle olabilir. Pozitif bir test sonucu canlı organizmaların mutlaka bulunduğu anlamına gelmez. Ancak pozitif bir sonuç MRSA DNA'sı varlığına işaret eder çünkü Testi aynı anda SCCmec kaseti (meca genini taşıyan) ve orfx geni içinde bulunan bir S. aureus spesifik dizisini saptar. Literatürde farklı MRSA klinik izolatlarının SCCmec/orfX bileşkesinin dizi analizleri temelinde yirmi (20) MREJ genotipi (MREJ genotipi i - xx) tanımlanmıştır. MREJ genotipi SCCmec tipiyle korelasyon göstermez yani bilinen sekiz (8) SCCmec tipinin her biriyle farklı MREJ genotipleri ilişkili olabilir. BD GeneOhm TM MRSA ACP Testi sadece MREJ genotipi i, ii, iii, iv, v ve vii saptamak üzere tasarlanmıştır; bu altı (6) MREJ genotipi bugüne kadar BD Diagnostics tarafından test edilen dünya çapındaki suşların %98'den fazlasını oluşturur. BD GeneOhm TM MRSA ACP Testi diğer MREJ genotiplerini saptamayabilir ve yalancı negatif sonuçlara yol açabilir. Testi meca genini ve bu genin kodladığı penisilin bağlayıcı proteini (PBP 2a) saptamaz. Bir boş kaset S. aureus varyantı mevcutsa yalancı pozitif bir MRSA sonucu oluşabilir. Testi çok yüksek konsantrasyonlarda bulunduklarında bazı metisiline duyarlı Staphylococcus aureus (MSSA) suşlarıyla çapraz reaksiyon gösterebilir. Testi yaklaşık 3 x 10 5 genom kopyası/pcr reaksiyonu (yaklaşık 7 x 10 7 CFU/sürüntü) şeklinde toplam 111 iyi karakterize MSSA suşu test edildiğinde bir analitik özgüllük çalışmasında 5 yalancı pozitif sonuç oluşturmuştur. Bir numunede fazla miktarda kan Testini inhibe edebilir. Yüksek konsantrasyonlarda Rhinaris ve Secaris, Testinde hafif inhibisyon yapabilir (Daha fazla ayrıntı için Enterferans Yapan Maddeler kısmına bakınız). Tüm PCR tabanlı in vitro diagnostik testlerde olduğu gibi testin saptama limitinin altında çok düşük hedef düzeyleri saptanabilir ama sonuçlar tekrar edilemeyebilir (Daha fazla ayrıntı için Tekrarlanabilirlik kısmına bakınız). Yalancı negatif sonuçlar numunelerin yetersiz toplanması, taşınması veya saklanması sonucunda nükleik asit kaybı veya yetersiz bakteriyel hücre lizisi nedeniyle oluşabilir. PCR amplifikasyonu inhibitörleri içeren örneklerin tanımlanmasına yardımcı olmak üzere teste Dahili Kontrol eklenmiştir. Dahili Kontrol nükleik asidin numunelerin yetersiz toplanması, taşınması veya saklanması nedeniyle kaybedilip kaybedilmediğini veya bakteriyel hücrelerin yeterli lizise uğrayıp uğramadığını belirtmez. Testi sonuçları bazen geçersiz bir kontrol nedeniyle çözümlenmemiş veya geçersiz olabilir ve sonuçların elde edilmesinde gecikmeye neden olabilecek şekilde tekrar test yapılmasını gerektirebilir. Primer veya prob bağlayıcı bölgelerdeki mutasyonlar veya polimorfizmler yeni veya bilinmeyen MRSA varyantlarının saptanmasını etkileyebilir ve Testi ile yalancı negatif bir sonuç verebilir. Master Mix ve Pozitif ve Negatif Kontrollerin hazırlanması, 25 C yi aşmayan bir ortamda yapılmalıdır. Tüm in vitro diagnostik testlerle olduğu gibi pozitif ve negatif prediktif değerler prevalansa yüksek ölçüde bağlıdır. Testi performansı prevalansa ve test edilen popülasyona göre değişebilir. P0057(02)_TR

13 Beklenen Değerler Testi klinik çalışmasında coğrafi olarak ayrı üç A.B.D. klinik çalışma yerinde toplam 1228 numune test edilmiştir. Çalışma popülasyonu Yoğun Bakım, Uzun Dönemli Bakım Tesisi ve Tıbbi Hizmetlerdeki hastalar şeklinde gruplandırılmıştır. Karşılaştırmalı kültür referans yöntemiyle belirlendiği şekilde pozitif ve negatif vakaların sayısı ve yüzdesi hesaplanıp aşağıdaki tabloda sunulmuştur. Grup Kültüre Göre MRSA Toplam Sayı Pozitif Sayı Negatif Sayı Gözlenen Prevalans Yoğun Bakım %7,3 Uzun Dönemli Bakım Tesisi %22,1 Tıbbi Hizmetler %14,6 Toplam %15,4 1 Tıbbi Hizmetler kategorisi Tıbbi, Kadın Doğum, Pediatrik, Cerrahi ve Diğer şeklinde tanımlanan numuneler içerir. Performans Özellikleri Klinik Performans Testinin klinik performans özellikleri çok merkezli bir prospektif araştırma çalışmasında belirlenmiştir. Çalışmaya üç (3) araştırma merkezi katılmıştır. Çalışmaya katılmak için hastaların kurumsal politikalarına göre MRSA testi yapılması için uygun olmaları gerekmekteydi. Klinik çalışma yeri politikalarına göre hedeflenmiş tarama için uygunluk gereklilikleri arasında verilenlerle sınırlı olmamak üzere şunlar vardı: belirli sağlık bakımı sistemine kabul edilen tüm hastalar; Yoğun Bakım Ünitesine kabul edilen tüm hastalar; Yoğun Bakım Ünitesine aktarılan hastalar; elektif cerrahi öncesi hastalar ve uzun dönemli bakım tesislerinden kabul edilen hastalar. Çalışmaya daha önce kaydedilen hastaların tekrar girmesine izin verilmedi. Karşılaştırmalı Referans Yöntemi selektif kromojenik vasatta başlangıç analizi ve sonrasında S. aureus olduğu düşünülen kolonilerin Kanlı Agar (KA) ile alt kültüründen oluştu. Tanımlama bir aglütasyon testi ile yapılırken metisilin direnci sefoksitin diski difüzyon duyarlılık testiyle doğrulandı. Metisiline dirençli S. aureus başlangıç yöntemiyle doğrulanmadığında Triptik Soy Buyyon (TSB) içinde geliştirme uygulandı. TSB, ek kromojenik vasat ve Kanlı Agar plaklarını inoküle etmek için kullanıldı ve MRSA doğrulaması yukarıda tanımlandığı şekilde yapıldı. Toplam 1228 nazal sürüntü numunesi hem Karşılaştırmalı Referans Yöntemi hem BD GeneOhm MRSA ACP Testi ile test edildi bildirilebilir sonuç vardı (Tablo 1); on iki (12) nazal sürüntü numunesi klinik çalışma protokol kontrolü stratejisiyle uyumlu olmadığı için performans analizinden hariç tutuldu. Karşılaştırmalı Referans Yöntemiyle karşılaştırıldığında Testi MRSA pozitif örneklerin %92,0'ını ve negatif örneklerin %94,6'sını tanımladı (Tablo 2). Test edilen popülasyon için bu durum %98,5 Negatif Prediktif Değer (NPV) ve %75,4 pozitif prediktif değere karşılık gelmektedir. Testi ile test edilen 1216 nazal sürüntü numunesi içinde 12'si (%1,0) başlangıçta çözümlenmemiş olarak bildirildi (Tablo 3). Dondurulmuş lizatlardan tekrarlanan testlerde 12'sinin de bildirilebilir sonuçları vardı. Üç (3) çalışma Çalışma Kontrolü başarısızlığı nedeniyle geçersiz olarak rapor edildi (%4,4) (Tablo 4). Çalışmalar numune lizatlarından tekrarlanan test sonrası geçerli rapor edildi. Tablo 1: Testiyle Elde Edilen Sonuçların Referans Yöntemiyle Karşılaştırılması Karşılaştırmalı Referans Yöntemi + - BD GeneOhm MRSA ACP Testi P0057(02)_TR

14 Tablo 2: Testiyle Elde Edilen Performansın Referans Yöntemiyle Karşılaştırılması Klinik Çalışma Yerleri Prevalans %95 GA ile hassasiyet* %95 GA ile özgüllük* Çalışma yeri 1 %11,6 (67/579) %94,0 (%85,4, %98,3) %96,7 (%94,7, %98,1) Çalışma yeri 2 %17,5 (56/320) %88,9 (%77,4, %95,8) %89,8 (%85,4, %93,2) Çalışma yeri 3 %20,1 (66/329) %92,.4 (%83,2, %97,5) %95,1 (%91,7, %97,3) Genel %15,4 (189/1228) %92,0 (%87,1, %95,4) %94,6 (%93, %95,9) * GA: Güven Aralıkları Tablo 3: Çözümlenmemiş Oranlar Klinik Çalışma Yerleri %95 GA ile başlangıçta çözümlenemeyen oran* %95 GA ile tekrar sonrasında çözümlenmemiş oranı* Çalışma yeri 1 %1,0 (6/579) (%0,4 - %2,2) %0,0 (0/579) (%0,0 - %0,6) Çalışma yeri 2 %0,3 (1/308) (%0,0 - %1,8) %0,0 (0/308) (%0,0 - %1,2) Çalışma yeri 3 %1,5 (5/329) (%0,5 - %3,5) %0,0 (0/329) (%0,0 - %1,1) Genel %1,0 (12/1216) (%0,5 - %1,7) %0,0 (0/1216) (%0,0 - %0,3) * GA: Güven Aralıkları Tablo 4: Genel Geçersiz Çalışma Oranları Çalışma yeri %95 GA ile geçersiz çalışma oranları* Çalışma yeri 1 %0,0 (0/25) (%0,0 - %13,7) Çalışma yeri 2 %4,5 (1/22) (%0,1 - %22,8) Çalışma yeri 3 %9,5 (2/21) (%1,2 - %30,4) Genel %4,4 (3/68) (%0,9 - %12,4) * GA: Güven Aralıkları Analitik Hassasiyet Genomik DNA Kullanarak Saptama Sınırı (LoD) Belirleme Genomik DNA testi yapılırken Testi analitik hassasiyeti (saptama sınırları veya LoD'ler) 4 SCCmec tipi (I, II, III, IV) ve 6 MREJ genotipini (i, ii, iii, iv, v ve vii) temsil eden 6 MRSA suşundan azalan miktarlarda kantifiye (kopya/pcr reaksiyonu) genomik DNA kullanılarak belirlenmiştir. Her MRSA suşu 2 farklı kullanıcı tarafından 3 farklı liyofilize Test Master Mix lotu kullanılarak tekrarlı olarak her konsantrasyonda 48 adet çalışılmıştır. Replikatların %95'inin pozitif test edildiği en düşük konsantrasyon olarak tanımlanan analitik hassasiyet (LoD), ortalama değer 5 DNA kopyası/pcr reaksiyonu olacak şekilde 2,5-5 kopya/pcr reaksiyonu arasında değişmiştir. MRSA Suşu MREJ SCCmec Genotipi Tipi LoD Konsantrasyonu 1 tip i I 5 kopya/pcr reaksiyonu 2 tip ii II 5 kopya/pcr reaksiyonu 3 tip iii III 5 kopya/pcr reaksiyonu 4 tip iv III 5 kopya/pcr reaksiyonu 5 tip v IV 2,5 kopya/pcr reaksiyonu 6 tip vii II 5 kopya/pcr reaksiyonu Klinik Nazal Matriks ile Canlı Bakteriler Kullanarak Saptama Sınırı (LoD) Belirleme Klinik nazal matriks ile canlı MRSA suşları testi yapılırken Testi analitik hassasiyeti (saptama sınırları veya LoD'ler) 4 SCCmec tipi (I, II, III, IV) ve 6 MREJ genotipini (i, ii, iii, iv, v ve vii) temsil eden 6 MRSA suşundan kültürlerden hazırlanıp kantifiye edilmiş çok çeşitli MRSA bakteriyel suspansiyonlarına eküvyonların batırılmasıyla hazırlanan ve sonra birleştirilmiş negatif klinik nazal matriks içinde deşarj/elüsyon yapılan simüle edilmiş pozitif sürüntüler kullanılarak belirlenmiştir. Her MRSA suşu 2 farklı kullanıcı tarafından 3 farklı liyofilize Testi Master Mix lotu kullanılarak P0057(02)_TR

15 tekrarlı olarak her konsantrasyonda 24 adet çalışılmıştır. Replikatların %95'inin pozitif test edildiği en düşük konsantrasyon olarak tanımlanan analitik hassasiyet (LoD), ortalama değer 300 CFU/sürüntü olacak şekilde CFU/sürüntü arasında değişmiştir. Analitik Dahil Olma MRSA Suşu MREJ SCCmec LoD Genotipi Tipi Konsantrasyonu 1 tip i I 207 CFU/sürüntü 2 tip ii II 576 CFU/sürüntü 3 tip iii III 256 CFU/sürüntü 4 tip iv III 245 CFU/sürüntü 5 tip v IV 130 CFU/sürüntü 6 tip vii II 386 CFU/sürüntü BD GeneOhm TM MRSA ACP Testinin analitik olarak aynı zamanda her yerde bulunması analitik dahil edilme çalışmasında değerlendirilmiştir Çeşitli Staphylococcus aureus suşları coğrafi köken, MREJ genotipi, SCCmec tipi, puls alan jel elektroforezi (PFGE) tipi, temporal çeşitlilik ve duyarlılık paterni dikkate alınarak çalışmaya dahil edilmiştir. Bu analitik dahil etme çalışmasında kamu koleksiyonlarından 52 ve iyi karakterize edilmiş klinik izolatlardan 88 örnek Vankomisine dirençli Staphylococcus aureus (VRSA) ve Vankomisin ara Staphylococcus aureus (VISA) suşları dahil olmak üzere 31 ülkeden yüz kırk (140) suş dahil edilmiştir. İlgili klinik yükte (100 genom kopyası/µl) test edildiğinde suşların %99'u saptanmıştır. Testi, test edilen tüm MREJ vahşi tipleri i, ii, iii, iv, v ve vii ve ayrıca MREJ mutant tipleri ii mut16, ii mut25 ve iii mut25 saptamıştır. Testi MRSA SCCmec tipleri I, II, III, IV, V ve VI ve MRSA PFGE tipleri USA , 1000 ve 1100 saptamıştır. Vankomisine ek direnç gösteren tüm Staphylococcus aureus suşları (VRSA ve VISA) da saptanmıştır. Aynı suçlar < 3X LoD konsantrasyonlarında üçlü olarak test edildiğinde %83'ü üç replikatın tümünde ve %99'u üç replikatın en az birinde bulunmuştur. İyi Karakterize Edilmiş bir Karşılaştırma Suşu Panelinin Değerlendirilmesi Testi analitik performansını değerlendirmek için, PFGE tipleri USA 100, 300 ve 400 (USA 300'e ağırlık verilerek), BORSA (sınırda oksasiline dirençli S. aureus suçları meca negatiftir ama tam anlaşılmayan bir mekanizmayla oksasilin direnci gösterirler), methisiline duyarlı S. aureus (MSSA), ve metisiline dirençli Staphylococcus epidermidis (MRSE) suşları dahil olmak üzere yüksek ve düşük oksasilin minimum inhibe edici konsantrasyonlara (MIC değerleri) sahip MRSA suşlarını içeren iyi karakterize edilmiş bir karşılaştırma suşu paneli test edilerek ek bir analitik çalışma yapılmıştır. Bu çalışmada kullanılan karşılaştırma suşu paneli 15 MRSA, 4 BORSA, 1 MRSE ve 5 MSSA suşundan oluşmaktadır. Tüm MRSA suşları MREJ tip iii olan tek MRSA suşu dışında MREJ tip ii şeklindedir. Bu suşların daha önce geniş bir oksasilin ve sefoksitin MIC aralığı gösterdiği bildirilmiştir. Bu suşların tümü MIC değerlerinin saptanması için FDA onaylı broth seyreltme duyarlılık testleriyle test edilmiştir. Test edilen tüm MRSA suşları (PFGE tipleri USA 100, 300 ve 400 dahil) 2-3X LoD konsantrasyonunda test edildiğinde pozitif sonuçlar göstermiştir. Tüm BORSA, MSSA ve MRSE suşları yüksek konsantrasyonlarda test edildiğinde negatif sonuçlar vermiştir. Analitik Özgüllük Çeşitli non-stafilokoksik türlerin 42 suşunun kırk biri (41) yaklaşık 3 x 10 5 kopya/pcr reaksiyonu (yaklaşık 7 x 10 7 CFU/sürüntü) değerine karşılık gelen bir konsantrasyonda test edildiğinde BD GeneOhm TM MRSA ACP Testiyle negatif sonuçlar vermiştir. Bir (1) suş BD GeneOhm TM MRSA ACP Testi tarafından pozitif olarak bildirilmiştir. Araştırma elde edilen pozitif sonucun MRSA kontaminasyonu nedeniyle olduğunu göstermiştir. BD GeneOhm TM MRSA ACP Testiyle test edilen on dokuz (19) Metisiline duyarlı Koagülaz Negatif Staphylococci (MSCNS) suşu, 15 Metisiline dirençli Koagülaz Negatif Staphylococci (MRCNS) suşu ve 2 Koagülaz Negatif Staphylococci (CNS) suşu negatif sonuç vermiştir. Koagülaz Negatif Staphylococci ile özgüllük %100 bulunmuştur. Çok yüksek konsantrasyonlarda yani yaklaşık 3 x 10 5 kopya/pcr reaksiyonu (yaklaşık 7 x 10 7 CFU/sürüntü) test edilen 111 MSSA suşunun 106'sı BD GeneOhm TM MRSA ACP Testiyle negatif sonuçlar vermiştir; kalan 5 MSSA suşu yaklaşık 3 x 10 4 kopya/pcr reaksiyonu (yaklaşık 7 x 10 6 CFU/sürüntü) ile negatif sonuçlar vermiştir. Bu nedenle BD GeneOhm TM MRSA ACP Testinin P0057(02)_TR

16 MSSA ile yaklaşık 3 x 10 4 kopya/pcr reaksiyonu (yaklaşık 7 x 10 6 CFU/sürüntü) değerinde özgüllüğü %100 (111/111) ve yaklaşık 3 x 10 5 kopya/pcr reaksiyonu (yaklaşık 7 x 10 7 CFU/sürüntü) ile %95,5 (106/111) şeklindedir. Enterferans Yapan Maddeler Bakteriyel kültür, taşıma ortamlarında bulunan ve ayrıca burun deliğinde veya nazal sürüntü numunelerinde bazen bulunan biyolojik ve kimyasal maddeler şeklindeki on sekiz (18) madde Testi ile olası enterferans açısından değerlendirilmiştir. MRSA pozitif numuneler 3x Saptama Limitinde (LoD) ve tipik klinik konsantrasyonda (FAM kaanalında Ct değerleri 30,0 ile 35,0 arasında) her bileşenin örnek alma bölgesi veya nazal sürüntü numunelerinde bulunması olası en yüksek miktarıyla test edilmiştir. Sonuçlar fazla miktarda bulunan kan dışında herhangi bir maddeyle bildirilebilir enterferans göstermemiştir. Yüksek konsantrasyonlarda Rhinaris ve Secaris Testinde hafif inhibisyon göstermiş ancak beklenen test sonuçları yine de elde edilmiştir. Testi ile Test Edilen Endojen ve Ticari Olarak Eksojen Maddeler Madde Sonuç Madde Sonuç Dristan NI Mannitol Tuz Agarı plakası NI Drixoral NI CHROMagar NI Flonase NI Sıvı Amies NI Nasonex NI Sıvı Stuart NI Otrivin NI Jel Amies NI Petroleum jelly NI Kan I Rhinaris NI* Nazal Sekresyon NI Secaris NI* Cromolyn göz damlası NI Triptik Soya Broth NI Salin NI NI: Testiyle bildirilebilir enterferans yoktur. I: Testiyle ancak madde aşırı miktarda varsa saptanabilir enterferans. * Yüksek konsantrasyonlarda Rhinaris ve Secaris Testinde hafif inhibisyon göstermiş ancak beklenen test sonuçları yine de elde edilmiştir. Tekrarlanabilirlik Tekrar üretilebilirlik paneli LoD yakınında 4 numune kategorisinden oluşmuştur. Her tüp simüle edilmiş nazal flora içermekteydi (Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990)). İki MRSA suşu aşağıdaki şekilde 4 kategorinin her birinde test edilmiştir: Orta Pozitif (MP): 2-5X LoD Düşük Pozitif (LP): 1-2X LoD Yüksek Negatif 1:10 (HN1:10): 1 X LoD'nin 10 kat dilüsyonu Yüksek Negatif 1:100 (HN1:100): 1 X LoD'nin 100 kat dilüsyonu Beşinci bir kategori negatif (Neg) numunelerden oluşmuştur (simüle edilmiş nazal flora, MRSA yok). Her kategorideki örnekler 5 ayrı günde üçlü olarak test edilirken her gün 2 panel 2 teknisyen tarafından 3 klinik çalışma yerinde 1 ayıraç lotu kullanılarak test edilmiştir (Çalışma Yerinden Çalışma Yerine). Bu klinik çalışma yerlerinden biri (1) 2 ek ayıraç lotunun test edildiği bir genişletilmiş çalışmaya katılmıştır (Lottan-Lota). Sonuçlar her numune kategorisi için, her MRSA suşundan veriler birleştirilmiş olarak gösterilmektedir. Çalışma Yerinden Çalışma Yerine Tekrarlanabilirlik için genel anlaşma yüzdesi MP ve Neg kategorileri için %100, LP için %95,0 ve HN1:100 ve HN1:10 kategorileri için sırasıyla %88,3 ve %47,2 negatif anlaşma olmuştur (Tablo 5). Lottan Lota Tekrarlanabilirlik için genel anlaşma yüzdesi MP ve Neg kategorileri için %100, LP için %98,3 ve HN1:100 ve HN1:10 kategorileri için sırasıyla %91,7 ve %41,7 negatif anlaşma olmuştur (Tablo 6). Son test sonucunu belirlemek üzere kullanılan bir dahili kriter olan Döngü eşiği (Ct), test tekrarlanabilirliğini değerlendirmenin ek bir yolu olarak seçilmiştir. Tablo 5 ve 6 varyans bileşenleri ile (SD ve %CV) genel ortalama Ct değerlerini göstermektedir. P0057(02)_TR

17 Tablo 5: Bir Lot kullanarak Çalışma Yerinden Çalışma Yerine Tekrarlanabilirlik Çalışması Sonuçları ÇALIŞMA YERİ Çalışma yeri Çalışma yeri Ct Değerleri 1 Çalışma yeri 3 Genel Yüzde Kategori 1 2 Anlaşma Yüzde Anlaşma Yüzde Anlaşma Yüzde Anlaşma Genel Ortalama SD %CV Neg 30/30 %100 30/30 %100 30/30 %100 90/90 %100 34,9 0,3 0,9 HN1: /60 %81,7 58/60 %96,7 52/60 %86,7 159/180 %88,3 40,8 1,6 3,8 HN1: /60 %43,3 27/60 %45,0 32/60 %53,3 85/180 %47,2 39,8 1,5 3,8 LP 59/60 %98,3 60/60 %100 52/60 3 %86,7 171/180 %95,0 38,5 1,1 2,8 MP 60/60 %100 60/60 %100 60/60 % /180 %100 36,8 1,0 2,6 1 Neg kategorisi için bildirilen CT değerleri dahili kontrol içindir. Diğer kategoriler için bildirilen CT değerleri MRSA hedefi içindir. 2 Yüksek Negatif kategoriler için beklenen test sonucunun negatif olduğu kabul edilmiştir. Bu nedenle yüzde anlaşma negatif sonuçlar için hesaplanmıştır. 3 Sekiz (8) LP numunesi başlangıçta negatif olarak bildirilip donmuş lizatlarla tekrar test yapıldığında pozitif olmuştur. Tablo 6: Üç Lot kullanarak Lottan Lota Tekrarlanabilirlik Çalışması Sonuçları LOT Kategori Lot 1 Lot 2 Lot 3 Yüzde Anlaşma Yüzde Anlaşma Yüzde Anlaşma Genel Yüzde Anlaşma Genel Ortalama Ct Değerleri 1 Neg 30/30 %100 30/30 %100 30/30 %100 90/90 %100 34,8 0,4 1,2 HN1: /60 %96,7 54/60 %90,0 53/60 %88,3 165/180 %91,7 39,9 1,1 2,7 HN1: /60 %45,0 28/60 %46,7 20/60 %33,3 75/180 %41,7 39,6 1,0 2,5 LP 60/60 %100 58/60 %96,7 59/60 %98,3 177/180 %98,3 38,2 0,9 2,4 MP 60/60 %100 60/60 %100 60/60 % /180 %100 36,5 09 2,5 1 Neg kategorisi için bildirilen CT değerleri dahili kontrol içindir. Diğer kategoriler için bildirilen CT değerleri MRSA hedefi içindir. 2 Yüksek Negatif kategoriler için beklenen test sonucunun negatif olduğu kabul edilmiştir. Bu nedenle yüzde anlaşma negatif sonuçlar için hesaplanmıştır. Kesinlik Laboratuar içi kesinlik 1 çalışma yerinde Testi için değerlendirilmiştir. Çalışma yukarıdakilerle aynı numune kategorileri ve hesaplamaları kullanılarak yapılmıştır. Testler ikili olarak 12 gün boyunca günde 2 çalışmayla 2 teknisyen tarafından yapılmıştır. Tüm numuneler ve kontroller çözümlenmemiş sonuçlar veren 1 HN1:100 örneği ve 2 HN1:10 örneği dışında bildirilebilir sonuçlar oluşturmuştur. Donmuş lizatlarla tekrarlanan testler bildirilebilir sonuçlar vermiştir. Neg, LP ve MP örnekleri için kesinlik çalışması sonuçları %100 anlaşma göstermiştir. HN1:100 ve HN1:10 için kesinlik çalışması sonuçları sırasıyla %95,8 ve %41,7 anlaşma göstermiştir. Ulaşan Kontaminasyon SD %CV Testinde yüksek MRSA bakteriyal yükü ile numuneleri işleme koyarken bulaşma riskini değerlendirmek için örnek hazırlamadan (septum kullanımı ve lizis tüplerine kapakların çevrilerek takılması dahil) PCR sonucuna kadar tüm işlemi değerlendirmek üzere analitik bir çalışma yapılmıştır. İki (2) MRSA suşu (MREJ tipi ii ve vii) yüksek pozitif MRSA paneli üyeleri olarak kullanılmıştır (sırasıyla 1,4 X 10 4 kopya/pcr reaksiyonu ve 5,1 X 10 4 kopya/pcr reaksiyonu). Negatif üyeler Num une Tamponu ile hazırlanmıştır. Her yüksek pozitif panel üyesinden üç (3) kopya (toplam 6 yüksek pozitif) ve negatif panel üyesinden 6 kopya negatif ve pozitif örneklerin alternasyonuyla test edilmiştir. Her çalışma prospektüse göre hazırlanmış pozitif ve negatif kontroller içermiştir. Tüm panel üyeleri ve kontroller B D GeneOhm MRSA ACP Lizis Kiti prospektüsü ve BD GeneOhm MRSA ACP prospektüsü izlenerek işlenmiştir. Aynı deney 4 kişi tarafından iki lizis tüpü kapağı tipinin her biriyle yapılmıştır (septum ve vidalı kapaklar). Deney 72 saat sonra ilk deneyden orijinal çalışma kontrolleri kullanılarak ikinci bir kez, saklama sırasında olası kontaminasyonu değerlendirmek için yapılmıştır. Toplam 16 çalışmada (4 kişi tarafından 8'i septum kapaklı tüplerle ve 8'i vidalı kapaklı tüplerle) bulaşma yoluyla kontaminasyon nedeniyle herhangi bir yalancı pozitif sonuç gözlenmemiştir. PC ve NC tüplerinin 72 saat boyunca 4 C'de saklanması ve sonra tekrar test için kullanılması geçersiz çalışmalara veya bulaşma yoluyla kontaminasyona neden olmamıştır. P0057(02)_TR

18 Referanslar 1. MMWR. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin or Soft Tissue Infection in a State Prison- Mississippi, 2000, Editorial note. October MMWR 50: Styers D et al., Laboratory-Based Surveillance of Current Antimicrobial Resistance Patterns and Trends among Staphylococcus aureus: 2005 Status in the United States. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2006;5:2. 3. Cosgrove SE et al. Comparison of Mortality Associated with Methicillin-resistant and Methicillinsusceptible Staphylococcus aureus Bacteremia: a Meta-analysis. Clin Infect Dis 2003;36: SmartCycler II DX Software, Operator Manual, D4198 Rev. D, Cepheid, Sunnyvale, CA, USA. 5. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Richmond JY and McKinney RW (eds) (1993). HHS Publication number (CDC) Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue; Approved Guideline, Document M29 (Son edisyona başvurun 7. Clinical and Laboratory Standards Institute. Statistical Quality Control for Quantitative Measurements: Principles and Definitions; Approved Guideline, Document C24 (Son edisyona başvurun) 8. Clinical and Laboratory Standards Institute. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline, Document MM3 (Son edisyona başvurun) Bu kit New York Eyaleti Public Health Research Institute Inc. (Kamu Sağlığı Araştırmaları Enstitüsü, PHRI) lisansı ile satılmaktadır ve sadece insan in vitro klinik diagnostikleri için PHRI patent haklarına göre kullanılabilir. Bu ürünün satın alınması satın alan kişiye insan in vitro diagnostik bilgisi sağlamak amacıyla nükleik asit dizilerinin amplifikasyonu ve saptanması için kullanılmasına izin verir. Bu satın almayla bu spesifik kullanım hakkı dışında herhangi bir genel patent veya başka herhangi bir türde lisans verilmez. P0057(02)_TR

19 Semboller İndeksi Sembol Anlamı Sembol Anlamı Üretici Parti kodu Katalog numarası Sıcaklık sınırlaması In Vitro Diagnostik Kullanım Işık ve nemden koruyun Yetkili Avrupa Temsilcisi Kullandıktan sonra poşeti tekrar mühürleyin Son kullanma tarihi Kullanım talimatına bakınız İçindekiler "n" test için yeterlidir R36/38 Gözler ve cildi tahriş eder Kutu 1 / 3 GeneOhm Sciences Canada, Inc boul. du Parc-Technologique Québec, QC, Canada, G1P 4S5 Müşteri Servisi: Benex Limited Pottery Road Dun Laoghaire, Co. Dublin, Ireland Avustralya Temsilcisi: Becton Dickinson Pty Ltd. 4 Research Park Drive, Macquarie University Research Park, North Ryde, NSW 2113 Avustralya BD, BD Logosu ve tüm diğer ticari markalar Becton, Dickinson and Company'nin malıdır BD. P0057(02)_TR Canada'da basılmıştır