BD GeneOhm Cdiff Testi

Transkript

1 BD GeneOhm Cdiff Testi REF REF Test 200 Test P0047(02)_TR Tarih:

2 İÇİNDEKİLER KULLAM AMACI... 3 TESTİN ÖZETİ VE AÇIKLAMASI... 3 İŞLEMİN PRENSİBİ... 3 AYIRAÇLAR... 4 ÖNLEMLER... 5 SAĞLANAN MATERYALLER... 5 SAKLAMA, MUAMELE VE STABİLİTE... 6 TOPLANAN ÖRNEKLER... 6 AYIRAÇLAR... 6 GEREKEN AMA SAĞLANMAYAN MATERYALLER... 6 KULLAM TALİMATI... 7 ÖRNEK TOPLAMA... 7 ÖRNEK HAZIRLAMA... 7 BD GENEOHM CDİFF TEST İŞLEMİ... 8 KALİTE KONTROLÜ... 9 POZİTİF VE NEGATİF KONTROLLER... 9 ÖRNEK İŞLEME KOYMA KONTROLLERİ... 9 KLİNİK ÖRNEKLERDEN KÜLTÜR ALINMASI... 9 SONUÇLARIN YORUMLANMASI... 9 GEÇERSİZ TEST ÇALIŞMASI ÇÖZÜMLENMEMİŞ ÖRNEK I-CORE MODÜLÜ BAŞARISIZLIĞI NEDENİYLE ÖRNEK BELİRLENMEDİ İŞLEMİN SIRLAMALARI ENTERFERANS YAPAN MADDELER PERFORMANS ÖZELLİKLERİ ANALİTİK ÖZGÜULLÜUK ANALİTİK HASSASİYET TEKRARLANABİLİRLİK HASSASİYET REFERANSLAR...15 SEMBOLLER İNDEKSİ P0047(02)_TR -2 -

3 Türkçe Kullanım Amacı BD GeneOhm Cdiff Testi Clostridium difficile ilişkili hastalık (CDAD) bulunduğundan şüphelenilen hastalarda sıvı veya yumuşak gaita örneklerinde doğrudan ve kalitatif bir şekilde C. difficile toksini B geni (tcdb) saptanması için hızlı bir in vitro diagnostik testtir. Gerçek zamanlı PCR ı temel alan bu testin CDAD tanısına yardımcı olarak kullanılması amaçlanmıştır. Test, spesifik hedeflerin amplifikasyonu için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve amplifiye DNA nın saptanması için florojenik, hedefe spesifik hibridizasyon probları kullanılarak doğrudan örnek üzerinde yapılır. Testin Özeti ve Açıklaması Sıvı veya yumuşak bir gaita örneği alınıp laboratuara gönderilir. Steril ve kuru bir eküvyon, sıvı veya yumuşak gaita materyaline batırılır ve işleme konur. Test için eküvyon örnek tamponuna yerleştirilir ve örnek lizise uğratılır. Lizis alikotu, mevcutsa Clostridium difficile genetik hedefini amplifiye etmek için kullanılan tcdb ye spesifik primerleri içeren PCR ayıraçlarına eklenir. Test ayrıca PCR tarafından engellenen örnekleri saptamak ve test ayıraçlarının doğruluğunu kontrol etmek açısından bir dahili kontrol (IC) içerir. Amplifiye hedefler, sönmüş floroforlar (moleküler işaretler) ile etiketlenmiş hibridizasyon probları ile saptanır. Sinyallerin amplifikasyonu, saptanması ve yorumlanması Cepheid SmartCycler yazılımı tarafından otomatik olarak yapılır. Tüm işlem, işleme konan örnek sayısına bağlı olarak yaklaşık dakika sürer. C. difficile çeşitli hastalıkların etiyolojik ajanıdır. Epidemiyoloji çalışmaları dünya çapında artan sayıda C. difficile ilişkili salgın olduğunu göstermiştir 1 ve bunların bazıları artmış mortalite ve morbiditeye neden olmuştur. 2 Hastalık semptomları hafif ve rahatsız edici diyareden şiddetli kolite ve hatta bağırsak perforasyonu ve dehidratasyonu nedeniyle ölüme kadar gidebilir. Bu patojen, antibiyotik ilişkili diyare (AAD) ve psödomembranöz kolitin önde gelen nedenidir. 3 Yatkınlık oluşturan risk faktörleri çok sayıdadır ve bunlara yaş, hastanede yatmanın uzunluğu ve sayısı, invaziv tıbbi işlemler, immünsüpresif tedaviler ve kronik patolojiler (diyabet, kardiyovasküler sendromlar veya AIDS) vardır. 4 Bu faktörler hastane ve kurumlarda bazı servislerin (yoğun bakım, cerrahi, uzun dönemli bakım) neden diğerlerinden daha fazla etkilendiğini açıklar. C. difficile bakterisi ve diğer intestinal flora bakterileri antimikrobiyel tedaviyle ölür ama antimikrobiyel ajanların çoğuna duyarlı olmayan C. difficile sporları ölmez. Antimikrobiyel konsantrasyon minimum inhibe edici konsantrasyondan düşük olduğunda sporlar germinasyon yoluyla toksinler oluşturan canlı bakterilere dönüşür. 5 Toksijenik C. difficile tanısı genellikle doku kültürü sitotoksisite testi ve/veya C. difficile nin kültürle tanımlanması ve/veya enzim immünoassay (EIA) testiyle yapılır. Doku kültürü sitotoksisite testi ve C. difficile kültürle tanımlanması çok emek ve zaman ister ve sonuçlar saatte alınır. Toksin EIA testleri düşük hassasiyet ve glutamat dehidrogenaz antijeni enzim immunoassay testleri (GDH EIA) düşük özgüllük gösterirler. Hassas ve özgül moleküler amplifikasyon tekniklerinin geliştirilmesi artık klinik örneklerde birkaç kopya bakteriyel DNA nın saptanmasını ve spesifik türlerin ayırt edilmesini mümkün kılmıştır. 6 Ayrıca hızlı PCR teknolojisi bu işlemi 1 saat içinde yapabilir. Bu özelliklerin kombinasyonu CDAD hastalarının hızlı ve hedeflenmiş bir şekilde tedavisini mümkün kılabilir ve böylece hastanın sonucunu daha iyi hale getirebilir ve iyileşme süresini kısaltabilir. İşlemin Prensibi Örnek lizisinden sonra varsa tcdb hedefinin amplifikasyonu gerçekleşir. C. difficile de bulunmayan 277 bp dizisi dahil 333 baz çifti (bp) DNA fragmanı olan dahili kontrolün (IC) amplifikasyonu da PCR engelleyici maddeler mevcut değilse gerçekleşir. Amplifiye DNA hedefleri bir uçta bir söndürücü ve öteki uçta bir floresan raportör boya (florofor) ile işaretlenmiş, saç tokası şekli oluşturan tek iplikli oligonükleotidler olan moleküler işaretler tarafından saptanır. Hedef yokluğunda floresans söner. Hedef varlığında, saç toka yapısı işaret/hedef hibridizasyonu sonrasında açılıp floresans emisyonu yapar. tcdb amplikonlarının saptanması için moleküler işaret 5' ucunda FAM floroforunu ve oligonükleotidin karşı 3' ucunda floresan olmayan DABCYL söndürücü kısmı içerir. IC amplikonlarını saptamak için moleküler işarette 5' ucunda TET floroforu ve 3' ucunda söndürücü DABCYL kısmı bulunur. Her işaret-hedef hibridi belirli moleküler işarette kullanılan floroforun dalga boyu özelliğine göre floresans yayar. Herhangi bir döngüde veya siklus sonrasında floresans miktarı o anda bulunan belirli amplikonların miktarına bağlıdır. SmartCycler yazılımı her moleküler işarette yayılan floresansı aynı anda izler, tüm verileri yorumlar ve siklus programı sonunda son bir sonuç verir («Sonuçların Yorumlanması» kısmına bakınız). P0047(02)_TR -3-

4 Ayıraçlar Testi 48 Test 200 Test Örnek tamponu (Sample Buffer) 60 X 1 ml 240 X 1 ml Tris-EDTA tamponu Lizis tüpü (Lysis tube) 50 tüp 200 tüp Cam boncuklar Ana Karışım (Master Mix) 8 tüp 34 tüp < %0,0005 DNA polimeraz kompleksi < %0,001 Dahili Kontrol (tcdb primeri bağlanma dizileri ve prob hibridizasyonu için özgün bir dizi içeren enfeksiyöz olmayan DNA) < %0,002 Primerler < %0,002 Moleküler problar < %0,05 Nükleotid karışımı (datp, dctp, dgtp, dttp) Sığır serum albümini Karbonhidrat MgCl 2 < %0,001 Enfeksiyöz olmayan Escherichia coli genomik DNA sı (ATCC 25922) Kontrol DNA (Control DNA) 8 tüp 34 tüp Tris-EDTA tamponu Karbonhidrat < %0,001 Enfeksiyöz olmayan ve tcdb geni taşıyan C. difficile genomik DNA sı (ATCC 43255) Seyreltici (Diluent) 8 X 700 µl 34 X 700 µl Tris-HCl tamponu MgCl 2 (NH 4) 2SO 4 KCl P0047(02)_TR -4-

5 Önlemler Bu test sadece in vitro diagnostik kullanım içindir. Dış karton güvenlik mührü bozulmuşsa kiti kullanmayın. Koruyucu poşetler geldiklerinde açık veya yırtıksa ayıraçları kullanmayın. Ana Karışım ve Kontrol DNA nın koruyucu poşetlerini her kullanımdan sonra fermuar şeklinde kapanan mühürle çabucak kapatın. Ana Karışım ve Kontrol DNA poşetlerinden kurutucuyu çıkarmayın. Ana Karışım ve Kontrol DNA poşetlerinin içinde kurutucu yoksa, ayıraçları kullanmayın. Ayıraçlar partiler arasında değiştirilemez. Farklı tüplerden ayıraçları, aynı partiden olsalar bile, asla bir araya koymayın. Ayıraçları son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. Ayıraçların kapaklarını birbirleriyle değiştirmeyin çünkü kontaminasyon oluşabilir ve test sonuçlarını tehlikeye atabilir. Tüplerden alikotları çıkarırken ayıraçların mikrobiyel ve deoksiribonükleaz (DNAse) kontaminasyonundan kaçının. Steril, DNAse içermeyen, tek kullanımlık, filtre bloklu veya pozitif displasman pipetör uçlarının kullanılması önerilir. Ortamın tcdb geni amplikonlarıyla kontaminasyonunu önlemek için reaksiyon tüplerini amplifikasyon sonrasında açmayın. Her örnek veya ayıraç için yeni bir pipetör ucu kullanın. Testin süresinin önerilen süre aralığının dışına çıkması geçersiz sonuçlara neden olabilir. Belirtilen süreler içinde yapılmayan testler tekrarlanmalıdır. Yerel, bölgesel ve/veya ulusal yönetmelikler veya sertifikasyon sağlayan kurumların gereklilikleri veya kılavuz ilkelere göre ek kontroller test edilebilir. Laboratuar tarafından açık tüplü PCR testlerinin de aynı genel alanda yapıldığı durumlarda, örnek hazırlama ve amplifikasyon/saptama aktiviteleri için bölünmüş ve ayrılmış çalışma alanları kullanılmalıdır. Malzeme ve ekipman her alan için ayrı olmalı ve bir alandan ötekine götürülmemelidir. Daima eldiven kullanılmalı ve bir alandan ötekine giderken değiştirilmelidir. Liyofilize ayıraçlar kullanılmadan önce eldivenler değiştirilmelidir. Örnekleri daima bulaşıcı olabilirlermiş gibi, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 7 ve CLSI Belgesi M29 8 içinde tanımlandığı şekilde güvenli laboratuar işlemlerine göre kullanın. Kit ayıraçlarını kullanırken koruyucu giysiler ve tek kullanımlık eldivenler kullanın. Testi yaptıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Ağzınızla pipetlemeyin. Örneklerin veya kit ayıraçlarının kullanıldığı yerlerde sigara içmeyin ve bir şey yemeyin ve içmeyin. Kullanılmamış ayıraçları ve atıkları yerel, bölgesel ve/veya ulusal yönetmeliklere göre atın. Kullanıcılar BD GeneOhm Cdiff Testini yapmadan önce yerel, bölgesel ve/veya ulusal yönetmelikler veya sertifikasyon sağlayan kurumlara göre yetkinlik testleri ve eğitimden geçmelidir. Sağlanan Materyaller Örnek tamponu (Sample Buffer) Lizis tüpü (Lysis tube) Ana Karışım (Master Mix) Kontrol DNA (Control DNA) Seyreltici (Diluent) SmartCycler reaksiyon tüpleri, 25 µl Örnek tanımlama etiketleri P0047(02)_TR -5-

6 Saklama, Muamele ve Stabilite Toplanan Örnekler Örnekler taşıma sırasında 2 ile 25 C arasında tutulmalıdır. Donmaya veya aşırı sıcağa maruz kalmaya karşı koruyun. Örnekler test edilmeden önce 2 8 C de 5 gün saklanabilir. Örnekler test edilmeden önce 48 saate kadar oda sıcaklığında (15 25 C) tutulabilir. Örnekler bir dondurma ve çözme döngüsü sonrasında test edilebilir. Ayıraçlar Not: Saklama koşulları her poşette yazılı spesifikasyonlara uymalıdır. Master Mix, Diluent ve Control DNA Kit Bileşeni (sırasıyla beyaz, siyah strip ve kırmızı strip etiketleri) Mühürlü poşet Lysis tube (sarı kapaklı) Sample Buffer (mavi kapaklı) Sıcaklık 2 8 C 2 25 C 2 25 C Stabilite Son kullanma tarihi Son kullanma tarihi Son kullanma tarihi Açılmış poşet A Sıcaklık 2 8 C 2 25 C 2 25 C B Stabilite 1 ay C Son kullanma tarihi 2 ay C A Poşetteki orijinal mühür bozulduktan sonra poşeti her kullanım sonrasında fermuar şeklinde kapanan mühürle dikkatle kapatın ve uygun sıcaklıkta saklayın. B Bu ayıraçlar oda sıcaklığında saklanabilse de aynı partiden birlikte gelen ayıraçlarla birlikte 2 8 C de saklanmaları gerekir. C Torbanın her kullanımdan sonra fermuar şeklinde kapanan mühürle uygun şekilde kapatılması şartıyla. Koruyucu poşeti dışındaki Kit Bileşenleri Rekonstitüsyon yapılmamış ayıraçlar içeren tüpler Rekonstitüsyon yapılmış ayıraçlar içeren tüpler A Orijinal kap SmartCycler tüpü A Belirtilen stabilite sona erdiğinde kullanılmamış tüpleri atın. Master Mix ve Control DNA (beyaz ve kırmızı strip etiketler) Sıcaklık C Stabilite 2 saat Sıcaklık 2 8 C Stabilite 3 saat Sıcaklık 2 8 C Stabilite 1 saat Gereken Ama Sağlanmayan Materyaller Kuru steril eküvyon Sıvı veya yumuşak gaita örneklerinin alınması için kuru steril kap Vortex Genie 2 (Scientific Industries Inc.) 1,5 ml mikrotüp tutucu veya eşdeğeri ile; çok sayıda örneğin işleme konması için çok sayıda tutma bölgesi olan adaptör kullanılabilir Mikropipetörler (hassas aralık 1 10 µl, µl ve µl arasında) Steril, DNAse içermeyen filtre bloklu veya pozitif displasman mikropipetör uçları DNAse içermeyen mikrosantrifüj tüpleri Makas (isteğe bağlı) Gazlı bez Tek kullanımlık eldivenler, pudrasız Mikrosantrifüj, düşük hızda santrifügasyon için 1,5 ml tüpler için kuru ısıtma bloğu veya su banyosu 1,5 ml tüpler için soğutma bloğu veya buz Kronometre veya süre ölçer SmartCycler başlangıç sistemi, Dx Yazılımı ile (işleme koyma bloğu, kullanıcı kılavuzu, 9 aksesuar kiti ve masaüstü bilgisayarı) (Cepheid, Sunnyvale, CA, A.B.D.) P0047(02)_TR -6-

7 Kullanım Talimatı Örnek Toplama Yeterli bir örnek almak için örnek toplama işlemi yakından izlenmelidir. Sıvı gaita veya yumuşak gaita örneği Kuru ve steril bir kap kullanılarak sıvı gaita veya yumuşak gaita örnekleri şu işleme göre toplanır: 1. Sıvı veya yumuşak gaitayı (idrarı değil) kaba aktarın. Örneğe tuvalet kağıdı, su veya sabun karışmasını önleyin. 2. Kabı etiketleyin. 3. Kabı laboratuara hastanenin standart çalışma işlemlerine göre gönderin. 4. Saklama ve muamele için Saklama, Muamele ve Stabilite Toplanan Örnekler kısmına bakın. Örnek Hazırlama NOT: Her örneğin işleme göre hazırlanması için bir (1) Lysis tube (lizis tüpü, sarı kapak) ve en az bir (1) Sample Buffer tüpü (örnek tamponu, mavi kapak) gerekir. Ayrıca örnekleri seyreltmek için ek bir Sample Buffer tüpü (örnek tampon, mavi kapak) gereklidir. Bu örnek tampon tüpü BD GeneOhm Cdiff Test işlemi için kullanılacaktır. Gerekli sayıda tüpü koruyucu poşetlerden çıkarın, fazla havayı giderin ve poşeti hemen fermuar şeklinde kapanan mühürle kapatın. 1. BD GeneOhm Cdiff Testi için örnek hazırlamaya başlamadan önce örneği 15 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin ve test için gaita materyaline steril kuru bir eküvyon batırın. Fazla gaitayı giderin. 2. Eküvyonu bir örnek tamponu tüpüne (mavi kapak) yerleştirin. Örnek tamponu tüpünün tanımını kapak ve/veya tüp etiketi üzerinde yapın. 3. Eküvyon sapını kırın ve örnek tampon tüpünü sıkıca kapatın. Eküvyonu tüp kenarına yakın olarak ucundan tutun (kontaminasyon riskini en aza indirmek için gazlı bez kullanın). Eküvyonu en dipten birkaç milimetre kaldırın ve kırmak için sapı tüpün kenarına doğru bükün. Alternatif yöntem: sapı kesmek için temiz makas kullanın. Kapağın sıkıca kapanacağından emin olun. 4. Örnek tampon tüpünü (eküvyonu içeren) yüksek hızda bir (1) dakika vorteksleyin. Çok sayıda örneği işleme koymak için çok sayıda tutma bölgesi olan adaptörler kullanılabilir. 5. Örneği seyreltmek için ek örnek tampon tüpünden (mavi kapak) lizis tüpüne (sarı kapak) 40 µl ekleyin µl örnek tamponu (mavi kapak) içeren lizis tüpüne (sarı kapak) (Basamak 5 ten) 10 µl hücre süspansiyonu (Basamak 4 ten) aktarın. 7. Lizis tüpünü yüksek hızda beş (5) dakika vorteksleyin. Çok sayıda örneği işleme koymak için çok sayıda tutma bölgesi olan adaptörler kullanılabilir. 8. Lizis tüpünü kısa süre santrifüje edin (hızlı çevirme). Katı içeriği tüpün alt kısmına getirmek için düşük hızda iki (2) beş (5) saniye santrifüjleyin. 9. Lizis tüpünü beş (5) ile yedi (7) dakika arasında 95 ± 2 C de ısıtın. 1,5 ml tüpler için bir kuru ısıtma bloğu veya su banyosu kullanın. 10. Lizis tüpünü buz üzerine veya bir soğutma bloğuna yerleştirin. Lizatlar 2 8 C de dört (4) saate kadar stabildir. P0047(02)_TR -7-

8 BD GeneOhm Cdiff Test İşlemi NOT: Bir (1) rekonstitüsyon yapılmış Master Mıx tüpü (Ana Karışım, beyaz etiket) sekiz (8) reaksiyon yapmaya yeterli ayıraç sağlar. Test edilecek örnek başına bir SmartCycler tüpü ve pozitif ve negatif kontroller için iki (2) ek SmartCycler tüpü ayırın. Her BD GeneOhm Cdiff Testi çalışmasına bir (1) pozitif ve bir (1) negatif kontrol dahil edilmelidir. Her test çalışması için bir (1) Control DNA (Kontrol DNA, kırmızı strip etiket) gereklidir. Üç (3) adede kadar Ana Karışım tüpünün rekonstitüsyonu için bir (1) Diluent (seyreltme tüpü, siyah strip etiket) gereklidir. Gerekli sayıda tüpü koruyucu poşetlerinden çıkarın, fazla havayı giderin ve poşetleri hemen fermuar şeklinde kapanan mühürle kapatın. Sadece SmartCycler aletindeki mevcut I-CORE modüllerini doldurmaya yetecek kadar SmartCycler tüpü hazırlayın. 1. Gerekli sayıda Ana Karışım tüpünü buza veya 1,5 ml tüpler için soğutma bloğuna koyun. 2. Her Ana Karışım tüpüne 225 µl seyreltici (siyah strip etiket) ekleyin. Mikropipetör ucunu kapak septumu içinden Ana Karışım tüpüne yerleştirin. Ucu kapak içine fazla derin yerleştirmeyin. Seyrelticiyi koyun. Sonra kullanılmamış seyrelticiyi atın. 3. Tüpü/tüpleri 5 10 saniye vorteksleyin. 4. Kullanıma hazır olana kadar tüpü/tüpleri 1,5 ml tüpler için soğutma bloğuna veya buza koyun. Bir Kontrol DNA tüpünü (kırmızı strip etiket) 1,5 ml tüpler için soğutma bloğuna veya buza koyun. 5. Kontrol DNA tüpüne 225 µl örnek tamponu (mavi kapak) ekleyin. Örnek hazırlama kısmından ek örnek tampon tüpünü (mavi kapak) kullanın (Basamak 5). Mikropipetör ucunu kapak septumu içinden Kontrol DNA tüpüne yerleştirin. Ucu kapak içine fazla derin yerleştirmeyin. Örnek tamponunu koyun. 6. Tüpü 5 10 saniye vorteksleyin. Kullanıma hazır olana kadar tüpü 1,5 ml tüpler için soğutma bloğuna veya buza koyun. 7. SmartCycler soğutma bloğuna gerekli sayıda SmartCycler tüp yerleştirin. Her örnek başına bir (1) SmartCycler tüpü ve kontroller için iki (2) adet daha SmartCycler tüp ayırın. Tüpün alt kenarlarındaki optik saptama pencerelerine ve alt elmas şekilli alana dokunmaktan kaçının. AŞAĞIDAKİ BASAMAKLAR MUTLAKA BİR (1) SAATLİK ZAMAN ÇERÇEVESİ İÇİNDE YAPILMALIDIR: 8. SmartCycler tüplerine 25 µl rekonstitüsyon yapılmış Ana Karışım ekleyin (solüsyonun gerektiği gibi aktarılmasını sağlamak için uygun pipetleme tekniği gerekir). Ayıracın pipetlenmesinden önce kapağı çıkarın. Sıvıyı SmartCycler tüplerinin rezervuarına (üst kısım) koyun. SmartCycler tüplerini kapakta tanımlayın. Örnek tanımlama etiketleri (kitle sağlanır) kullanılabilir. Kullanılmamış Ana Karışımı atın. 9. Her lizise uğratılmış örnekten 3,0 µl miktarını farklı bir SmartCycler tüpüne (rekonstitüsyon yapılmış Ana Karışım ile önceden doldurulmuş) koyun; tüpleri kapatın. Lizis tüpü içinden pipetleme yaparken boncukları aspire etmemeye dikkat edin. Örnek eklendikten sonra tüm hacmin aktarıldığından emin olmak açısından rezervuar içinde 2 3 kez yukarı aşağı pipetleme yapın. Her örnek için yeni bir mikropipetör ucu kullanın. 10. Rekonstitüsyon yapılmış Kontrol DNA sından 3,0 µl miktarını en sondan bir önceki SmartCycler tüpüne ekleyin (Pozitif Kontrol); tüpü kapatın. DNA eklendikten sonra tüm hacmin aktarıldığından emin olmak açısından rezervuar içinde 2 3 kez yukarı aşağı pipetleme yapın. Pozitif kontrol olarak tanımlayın. Kullanılmamış kontrol DNA yı atın. 11. Son SmartCycler tüpüne 3,0 µl örnek tamponu (mavi kapak) ekleyin (Negatif Kontrol); tüpü kapatın. Basamak 5 te elde edilen örnek tampon tüpünü kullanın. Bu işlem örneklerin kullanımı sırasında olabilecek PCR kontaminasyonunu izleme açısından kontrol gerçekleştirecektir. Negatif kontrol olarak tanımlayın. Kullanılmamış örnek tamponunu atın. 12. Tüm reaksiyon tüplerini 5 10 saniye santrifüje edin. SmartCycler aleti ile sağlanan özel olarak uyarlanmış mikrosantrifüjü kullanın. 13. Tüpleri alete yüklemeden önce SmartCycler soğutma bloğu üzerinde 2 8 C de tutun. Kalan lizatlar gerekirse daha sonra kullanım için -20 ± 5 C de dondurulmalıdır. 14. BD GeneOhm Cdiff Test protokolü ile bir çalışma hazırlayın. Gerekirse SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzuna 9 bakın. Önerilen çalışmayı başlatmadan önce örnekler için tanımlama parametrelerini girmeniz önerilir. 15. Her reaksiyon tüpünü SmartCycler I-CORE modülüne yerleştirin ve I-CORE kapağını kapatın. Pozitif ve negatif kontrolleri uygun pozisyona yerleştirin («Kalite Kontrolü» kısmına bakınız). Tüm tüpleri sıkıca yerlerine aşağıya doğru itin. 16. Çalışmayı başlatın. P0047(02)_TR -8-

9 Kalite Kontrolü Pozitif ve Negatif Kontroller Kalite kontrol işlemleri test performansını izlemek üzere tasarlanmıştır. Pozitif kontrolün önemli ayıraç hatalarını izlemek üzere tasarlanmıştır. Negatif kontrol, DNA içeren tcdb genleri veya tcdb amplikonları tarafından ayıraç veya çevresel kontaminasyonu (veya taşımayı) saptamak üzere tasarlanmıştır. Pozitif ve negatif kontroller test kontrolleridir (çalışma kontrolleri). Geçersiz bir kontrol çalışmayı geçersiz hale getirir. Son olarak her reaksiyon karışımına dahil edilen bir dahili kontrolün her örnekte PCR engellemesini izlemesi amaçlanmıştır. SmartCycler üzerinde çalışılan her test için bir pozitif kontrol ve bir negatif kontrol dahil edilmelidir. Yazılım otomatik olarak alet üzerinde kontrollerin pozisyonunu atar (bakınız SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzu 9 ). Örnek İşleme Koyma Kontrolleri Yerel, bölgesel ve/veya ulusal yönetmelikler veya sertifikasyon sağlayan kurumların gereklilikleri veya kılavuz ilkelerine göre ek kontrol suşları test edilebilir. tcdb genini içeren referans bir toksijenik C. difficile suşunun (örn. American Type Culture Collection, ATCC veya tcdb genini içerdiği tanımlanmış ve iyi karakterize edilmiş bir C. difficile klinik izolatı) pozitif örnek işleme koyma kontrolü olarak kullanılabilirken toksijenik olmayan bir C. difficile suşu (örn. ATCC ) kültürü negatif örnek işleme koyma kontrolü olarak kullanılabilir. Koloniler %5 koyun kanlı plağında saat anaerobik inkübasyondan sonra izole edilir. Kolonilerle 0,5 McFarland (~1,5 X 10 7 CFU/mL) türbidite oluşturacak şekilde tekrar süspansiyon yapın. ~10 6 CFU/mL süspansiyon elde edecek şekilde salin ile seyreltin. Bakteriyel süspansiyona kuru bir eküvyon batırın, fazla sıvıyı bastırarak giderin. Klinik örneği işleme koyun ve kontroller dahil olmak üzere test edin (bakınız «Örnek Hazırlama» ve «BD GeneOhm Cdiff Test İşlemi» kısımları). Tüm örnekler ve kontroller geçerli sonuçlar vermelidir (geçersiz pozitif veya negatif kontrol yok, hatalı dahili kontrol yok ve örnek işleme koyma kontrolleri yapıldığında hatalı örnek işleme koyma kontrolü sonucu yok). Hatalı örnek işleme koyma kontrolü sonucu durumunda orijinal gaita örneğinden yeni bir kısım alınması ve sonuçların bildirilmesinden önce bu testin yeni kontroller birlikte tekrar test edilmesi önerilir. Genel kalite kontrolü rehberliği için, CLSI MM3 10 ve C24 11 belgelerine bakabilirsiniz. Klinik Örneklerden Kültür Alınması Doğrudan gaitadan tür tanımlamak için hastane işlemleri kullanılarak klinik örneklerden kültür hazırlanabilir. Sonuçların Yorumlanması BD GeneOhm Cdiff Testi için karar algoritması SmartCycler DX yazılımına gömülüdür. Test sonuçlarının yorumlanması aşağıdaki kriterlere göre yapılır: Örnek Tipi Aletin Bildirdiği Test Sonucu 9 Aletin Bildirdiği IC Sonucu 9 Sonuçların Kullanıcı Tarafından Yorumlanması Klinik Örnek Pozitif Kontrol Negatif Kontrol NEG (NEG) PASS (GEÇTİ) tcdb geni DNA sı saptanmadı POS (POZ) NA (Uygulanamaz)- tcdb geni DNA sı saptandı Unresolved (Çözümlenmemiş) ND (Belirlenmedi) Valid (Geçerli) Invalid (Geçersiz) Valid (Geçerli) FAIL (BAŞARISIZ) ND (Belirlenmedi) NA (Uygulanamaz)- NA (Uygulanamaz)- PASS (GEÇTİ) Çözümlenmemiş engelleyici örnek veya ayıraç başarısızlığı I-CORE Modülü başarısızlığı nedeniyle saptanmadı (Uyarı veya Hata Kodları 9 ile) Geçerli Pozitif Kontrol; Negatif Kontrol de geçerliyse geçerli çalışma. Geçersiz Pozitif Kontrol; geçersiz çalışma. A Test sonuçları geçersizdir ve bildirilmemelidir. Geçerli Negatif Kontrol; Pozitif Kontrol de geçerliyse geçerli çalışma. Geçersiz Negatif Kontrol; geçersiz çalışma. A Invalid (Geçersiz) FAIL (BAŞARISIZ) Test sonuçları geçersizdir ve bildirilmemelidir. IC Dahili Kontrol A Geçersiz bir test çalışması veya alet hata kodları veya uyarıları ekran üzerinde ve raporlarda işaretlenir. C. difficile sonuçlarını bildirmeden önce daima test çalışmasının geçerli olduğundan emin olun. P0047(02)_TR -9-

10 Geçersiz Test Çalışması Donmuş lizat(lar) kullanılarak o test çalışmasında yeni kontrol tüpleriyle birlikte tüm klinik örnekler için yeni reaksiyon tüpleri hazırlayın. Çözümlenmemiş Örnek Testi ilgili örneğin donmuş lizatı ile tekrarlayın. Dondurma-çözme döngüsünün PCR engelleyici maddelerin etkisini azalttığı gösterilmiştir. I-CORE Modülü Başarısızlığı Nedeniyle Örnek Belirlenmedi Testi ilgili örneğin donmuş lizatı ile tekrarlayın. Uyarı veya hata kodu mesajlarının yorumlanması için SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzuna 9 bakınız. İşlemin Sınırlamaları Bu testin performans özellikler, SmartCycler aleti dışındaki otomatik, gerçek zamanlı PCR aletleriyle belirlenmemiştir. Bu test sadece sıvı veya yumuşak gaita ile kullanılmak içindir; diğer klinik örnek tiplerinin performans özellikleri belirlenmemiştir. Negatif test sonuçlarının nedeni uygunsuz örnek toplama, muamele veya saklama, engelleyici varlığı, teknik hata, örnek karışımı veya örnekteki organizma sayısının testin analitik duyarlılığının altında olması olabilir. Bu prospektüste ve SmartCycler Dx Yazılımı Kullanım Kılavuzundaki 9 talimata dikkatle uyulması hatalı sonuçların önlenmesi için gereklidir. Bu testin kullanımı işlem ve SmartCycler kullanımı konusunda eğitim almış personelle sınırlı olmalıdır. BD GeneOhm Cdiff Testi geçersiz bir kontrol nedeniyle çözümlenmemiş veya geçersiz sonuçlar verebilir; bu nedenle -20 ± 5 C sıcaklıkta tutulan lizatın tekrar test edilmesi gerekir ve sonuçların elde edilmesini geciktirecektir. Pozitif bir test sonucu canlı organizmaların mutlaka bulunduğu anlamına gelmez. Ancak tcdb geninin bulunduğu anlamına gelir ve C. difficile toksijenik organizmasının tanısının varsayılmasını sağlar. BD GeneOhm Cdiff Testi C. difficile için spesifik primerler ve problar içermediğinden tür tanımlama için kullanılamaz. Primer veya prob bağlayıcı bölgelerdeki mutasyonlar veya polimorfizmler C. difficile tcdb geni varyantlarının saptanmasını etkileyebilir ve BD GeneOhm Cdiff Testi ile yalancı negatif bir sonuç verebilir. Ayıraç hazırlamaya gerek olmamasına ve ana teknik işlemin pipetleme olmasına rağmen bu testin doğru yapılması için iyi laboratuar tekniği şarttır. Testin yüksek analitik hassasiyeti nedeniyle özellikle çok sayıda alikotun tüpten alındığı durumlarda tüm reaktiflerin saflığını korumak için büyük dikkat gösterilmelidir. tcdb geni bulunmayan veya işlevsel Toksin B proteini olmayan varyant toksijenik C. difficile ile çok nadirdir BD GeneOhm Cdiff Testi tcdb genini hedefler ve Toksin A+/Toksin B- varyant suşları saptayıp saptamayacağı bilinmemektedir. BD GeneOhm Cdiff Testi gaita örneklerinde mevcut olabilecek şu virüslerle değerlendirilmemiştir: RNA virüsleri Enterovirüs, Astrovirüs, Norovirüs, Rotavirüs ve Hepatit A virüsü; DNA virüsü Adenovirüs. Ancak BD GeneOhm Cdiff Test primerleri ile bu virüslerle ilişkili hedef prob sekans homolojisi çok düşüktür. BD GeneOhm Cdiff Testi primerleri ve hedef prob C. difficile Toksini B genini C. sordellii ölümcül toksin geninden ayırmak üzere tasarlanmıştır. Ancak C. difficile Toksin B ve C. sordellii ölümcül toksini arasında yüksek sekans homolojisi nedeniyle çapraz reaksiyon oluşabilir. C. sordellii nin,nadir görülmesi ve sınırlı elde edilebilirliği nedeniyle test ile çapraz reaksiyon testi yapmak üzere sadece bir suş mevcuttu. Herhangi bir çapraz reaksiyon gözlenmedi. P0047(02)_TR -10-

11 Enterferans Yapan Maddeler Arada kullanılan veya perianal, rektal ve/veya gaita örneklerinde bulunan yirmi altı (26) biyolojik ve kimyasal madde BD GeneOhm Cdiff Testi ile enterferans açısından değerlendirildi. Olası enterferans yapan maddeler arasında verilenlerle sınırlı olmamak kan ve mukus vardır. Fazla kan bulunması PCR yi inhibe edip çözümlenmemiş sonuçlar verebilir. Aşağıdaki tabloda verilen kalan yirmi dört (24) madde BD GeneOhm Cdiff Testinde saptanabilir enterferans göstermedi. BD GeneOhm Cdiff Testi ile Test Edilen Endojen ve Ticari Eksojen Maddeler Madde Sonuç Madde Sonuç Anusol MC Plus* ** Monistat Derm Mikonazol nitrat krem USP %2 (McNeil) Atlas Ihle Macunu* Çinko oksit %25 w/w macun (Laboratoire Atlas Inc.) Palmitik asit* Tozdan taze solüsyon (LabMat) Baryum sülfat Toz formundan taze solüsyon (LabMat) Preparation H with Bio-Dyne * Krem (Wyeth) Exact Hidrokortizon asetat* Krem USP %0,5 (Taro Pharmaceuticals Inc.) Preparation H with Bio-Dyne * Melhem (Wyeth) Exact mide ilacı Bismut subsalisilat sıvısı (Perrigo ) Rougier Neo-Laryngobis* Suposituvarlar (Rougier Pharma) Fekal yağ SAB-Dimenhydrinate * Suposituvarlar (SABEX ) Fresh control ıslak mendiller ph 5,5 (Blue Skin) Sterik asit* Tozdan taze solüsyon (LabMat) Gyne Moistrin Vaginal nemlendirici jel (Schering) Trojan lateks prezervatifler (nonoksinol-9 lu) Spermisit lubrikan (Church & Dwight Co., Inc.) Imodium AD * Loperamid hidroklorür oral solüsyon (McNeil) Kaopectate Oral attapulgit süspansiyonu (Pharmacia & Upjohn) K-Y Jelly (Johnson & Johnson Inc.) Tucks MC kişisel temizlik pedleri Nemli, yumuşak bez pedler (Pfizer) Vagisil Kaşıntı önleyici krem (Combe Incorporated) Vankomisin Sıvı (MP Biomedicals, LLC) Metronidazol Toz formundan taze solüsyon (Acros Organics) * Madde iki C. difficile ile suşuyla test edildi (Toks 0 ve Toks VIII) ** : BD GeneOhm Cdiff Testinde saptanabilen enterferans yok Vaseline TM* Beyaz vazelin U.S.P. (Lever Pond s) Performans Özellikleri BD GeneOhm Cdiff Testinin performans özellikleri çok merkezli bir prospektif araştırma çalışmasında belirlenmiştir. Çalışmaya ikisi (2) Kanada, ikisi (2) Amerika Birleşik Devletleri olmak üzere dört (4) tıp merkezi katılmıştır. Çalışmaya alınmaları için örneklerin Clostridium difficile ile test yapılmasının kurumsal politikalara göre endike ve/veya istenmiş olduğu bireylerden olması gerekiyordu. Sıvı veya yumuşak gaita örnekleri alındıktan sonra 48 saat içinde bir doku kültürü Sitotoksisite testi kullanılarak bir Referans Sitotoksisite Testi yapıldı. Bu işlem Üreticinin Kullanma Talimatına göre yapıldı. Toplam olarak 1108 örnek uyumlu bulundu ve hem yukarıda test edilen Referans Testi hem de BD GeneOhm Cdiff Testi ile test edildi ve 1090 bildirilebilir sonuç ortaya çıkardı. Birinci veri setinde dört (4) klinik çalışma yerinden üçünde (3) test edilen 835 taze örnek vardır (Tablo 1). Referans Test ile karşılaştırıldığında, BD GeneOhm Cdiff Testi C. difficile pozitif örneklerin %93,8 ini ve negatif örneklerin %95,5 ini tanımladı (Tablo 2). Test edilen popülasyon için bu durum %99,1 Negatif Prediktif Değer (NPD) ve %67,3 Pozitif Prediktif Değere (PPD) karşılık gelmektedir. Dördüncü klinik çalışma yerinde yapılan testler Referans Sitotoksisite Testinin doğru sonuçlar vermediğini ortaya koydu. Yüksek sayıda doğru olmayan referans test sonuçları nedeniyle testler ilk test yapılmasından sonra dondurulmuş orijinal gaita örneklerinin alikotlarından tekrar test edildi. Üç dondurulmuş alikot hem Referans Testi hem BD GeneOhm Cdiff Testi ile test edildi. Verilen ikinci veri setinde analiz için kullanılabilen 255 donmuş gaita örneğinden sonuçlar vardır (Tablo 3). Referans Testi ile karşılaştırıldığında BD GeneOhm Cdiff Testi dondurulmuş veri setinde C. difficile pozitif örneklerin %100 ünü ve negatif örneklerin %97,7 sini tanımladı ve böylece NPD %99,2 ve PPD %81,5 oldu (Tablo 4). BD GeneOhm Cdiff Testi ile test edilen 852 taze örnekten 39 u başlangıçta çözümlenmemiş olarak bildirildi (%4,6). Donmuş lizatlar tekrar test edildiğinde 22 si çözümlendi ve 17 si çözümlenmemiş kaldı (%2,0) (Tablo 5). BD GeneOhm Cdiff Testi ile test edilen 256 donmuş örnekten sadece bir (1) örnek (%0,4) başlangıçta çözümlenmemiş olarak bildirildi. Donmuş lizattan çalışıldığında örnek çözümlenmemiş kaldı (%0,4) (Tablo 6). Bir (1) çalışma, Çalışma Kontrolü başarısızlığı nedeniyle geçersiz olarak bildirildi (%0,6). Bu çalışma örnek lizatları tekrar test edildiğinde geçerli olarak bildirildi (Tablo 7). P0047(02)_TR -11-

12 Tablo 1: BD GeneOhm Cdiff Testi ile Elde Edilen Taze Gaita Sonuçlarının Referans Testiyle Karşılaştırılması Referans Sitotoksisite Testi + - BD GeneOhm Cdiff Testi İzole edilmiş suşlarda Sitotoksite Testi 34 örnekten 21 inde pozitifti ve C. difficile varlığını doğruladı. Kalan 13 örnekte alternatif primerlerle standart PCR ve sonrasında iki yönlü sekanslama 13 örneğin 11 inde beklenen tcdb geninin bulunduğunu gösterdi. Beş (5) yalancı negatif örnekten iki (2) adetinde C. difficile kültür ile elde edildi ve bu iki (2) örnekten sadece biri (1) toksijenik olarak bildirildi. Kalan üç (3) yalancı negatif PCR örneğinde kültürle C. difficile bulunmadı. Tablo 2: BD GeneOhm Cdiff Testiyle Elde Edilen Taze Gaita Sonuçlarının Referans Yöntemiyle Karşılaştırılması Çalışma Yerleri Prevalans %95 GA* ile Hassasiyeti* %95 GA* ile Özgüllük* Çalışma Yeri 1 %11,0 (40/365) %90,5 (38/42) (%77,4 %97,3) %95,7 (309/323) (%92,8 %97,6) Çalışma Yeri 2 %6,7 (16/240) %94,4 (17/18) (%72,7 %99,9) %96,4 (240/249) (%93,2 %98,3) Çalışma Yeri 3 %11,1 (18/162) %100 (21/21) (%83,9 %100) %94,0 (171/182) (%89,4 %96,9) Genel %9,6 (74/767) %93,8 (76/81) (%86,2 %98,0) %95,5 (720/754) (%93,8 %96,9) * GA: Güven Aralıkları Tablo 3: BD GeneOhm Cdiff Testi ile Elde Edilen Donmuş Gaita Sonuçlarının Referans Testi ile Karşılaştırılması Referans Sitotoksisite Testi + - BD GeneOhm Cdiff Testi Tablo 4: BD GeneOhm Cdiff Testi ile Elde Edilen Donmuş Gaita Sonuçlarının Referans Yöntemiyle Karşılaştırılması Klinik Çalışma Yeri Prevalans %95 GA* ile Hassasiyet %95 GA* ile Özgüllük Çalışma Yeri 4 %12,7 (34/267) %100,0 (34/34) (%89,7 %100) %97,7 (216/221) (%94,8 %99,3) * GA: Güven Aralıkları Tablo 5: Taze Gaita Çözümlenmemiş Oranları Klinik Çalışma %95 GA* ile başlangıçta Yerleri çözümlenemeyen oran %95 GA* ile tekrar sonrasında çözümlenmemiş oranı Çalışma Yeri 1 %0,8 (3/367) (%0,2 %2,4) %0,5 (2/367) (%0,1 %2,0) Çalışma Yeri 2 %6,6 (18/273) (%4,0 %10,2) %2,2 (6/273) (%0,8 %4,7) Çalışma Yeri 3 %8,5 (18/212) (%5,1 %13,1) %4,2 (9/212) (%2,0 %7,9) Genel %4,6 (39/852) (%3,3 %6,2) %2,0 (17/852) (%1,2 %3,2) * GA: Güven Aralıkları Tablo 6: Donmuş Gaita Çözümlenmemiş Oranları %95 GA* ile başlangıçta Klinik Çalışma Yeri çözümlenemeyen oran %95 GA* ile tekrar sonrasında çözümlenmemiş oranı Çalışma Yeri 4 %0,4 (1/256) (%0,0 - %2,2) %0,4 (1/256) (%0,0 - %2,2) * GA: Güven Aralıkları P0047(02)_TR -12-

13 Tablo 7: Genel Geçersiz Çalışma Oranları Çalışma Yeri %95 GA* ile Geçersiz Çalışma oranları Çalışma Yeri 1 %2,6 (1/38) (%0,1 %13,8) Çalışma Yeri 2 %0,0 (0/41) (%0,0 %8,6) Çalışma Yeri 3 %0,0 (0/58) (%0,0 %6,2) Çalışma Yeri 4 %0,0 (0/23) (%0,0 %14,8) Genel %0,6 (1/160) (%0,0 %3,4) * GA: Güven Aralıkları Analitik Özgüllük Toksijenik olmayan bir C. difficile, tcdb geni bulunmayan iki Toksinotip XI geni 17 ve 29 başka-clostridium suşu (bir C. sordellii suşu dahil) ile bağırsak ve gaitada bulunan yakından ilişkili 99 organizma ve diğer patojenik ve komensal flora (96 türü temsil edecek şekilde) genomik DNA sı test edildi. Tüm suşlar yaklaşık 1 X 10 8 CFU/mL veya 1 X 10 8 hedef kopya/ml konsantrasyonunda test edildi. Bu türlerin hiçbiri BD GeneOhm Cdiff Testi ile pozitif test edilmedi. Analitik Hassasiyet Kantifiye edilmiş kültür ve purifiye genomik DNA sı BD GeneOhm Cdiff Testi örnek tamponunda seyreltilip beş (5) replikatta test edildi. LOD, beş replikat arasında beşinin pozitif bulunduğu, reaksiyon başına DNA kopya numarası ve reaksiyon başına CFU açısından en düşük konsantrasyon olarak tanımlanır. BD GeneOhm Cdiff Testi analitik hassasiyeti (saptama limiti veya LOD) tcdb genini içeren bir Toksinotip 0 Clostridium difficile suşu (ATCC 43255) ile belirlendi. BD GeneOhm Cdiff Testi LOD değeri reaksiyon başına 10 DNA kopyasıdır. Koloni Oluşturan Üniteler (CFU) cinsinden LOD reaksiyon başına 4 CFU olarak belirlendi. Reaksiyon başına CFU olarak analitik hassasiyet ikinci bir Toksinotip 0 (ATCC 9689) ve Toksinotip IIIa (SE ), V (SE ), VII ( ) ve VIII ( ) Clostridium difficile toksijenik suşlarıyla doğrulandı. LOD belirleme için kullanılan suşlar dışında 21 ülkeyi temsil eden ve iyi karakterize edilmiş klinik izolatlar veya halka açık koleksiyonlardan elde edilen yüz (100) başka toksijenik C. difficile suşu (17 başka Toksinotip dahil) BD GeneOhm Cdiff Testi ile değerlendirildi. C. difficile suşları yaklaşık 6,7 DNA kopyası/µl veya 1 CFU/µL konsantrasyonunda test edildi. Test, tcdb geni taşıyan 100 C. difficile suşunu da doğru tanımladı. Tekrarlanabilirlik Tekrarlanabilirlik paneli her tüpte 100 µl simüle edilmiş bağırsak florasının bulunduğu üç (3) simüle edilmiş örnek kategorisinden oluşuyordu; iki pozitif panel üyesi C. difficile (ATCC 43255) ile de inoküle edilmişti. Ayrıca iki (2) Örnek İşleme Koyma Kontrolü (ATCC 9689 ve ATCC 25922) ve iki (2) Çalışma Kontrolü (Pozitif ve Negatif) dahil edildi. Örnekler her panel çalışmasında üçlü olarak beş (5) ayrı günde (peş peşe veya değil) test edildi bu sırada her gün üç (3) klinik çalışma yerinde bir (1) ayıraç partisi ile her biri iki (2) teknisyenin biri tarafından olmak üzere iki (2) panel test edildi. Bu klinik çalışma yerlerinin biri (1) ayrıca iki (2) ek ayıraç partisinin test edildiği genişletilmiş çalışmaya katıldı. Çalışma Yerleri Arası Tekrarlanabilirlik açısından genel yüzde uyum düşük pozitif C. difficile örneği kategorisi için %96,7; orta pozitif C. difficile örneği kategorisi için %100 ve negatif örnek kategorisi için %100 bulundu (Tablo 8). Partiler Arası Tekrarlanabilirlik açısından genel yüzde uyum oranı düşük pozitif C. difficile örneği kategorisi için %100; orta pozitif C. difficile örneği kategorisi için %97,8 ve negatif örnek kategorisi için %100 bulundu (Tablo 9). Döngü eşiği (Ct) son test sonucunu belirlemek için kullanılan dahili bir kriterdir ve test tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için ek bir yol olarak seçilmiştir. Varyans bileşenleri (SD ve %CV) ile genel ortalama Ct değerleri Tablo 8 ve 9 da gösterilmiştir. Orijinal tekrarlanabilirlik çalışma protokolü ile uyumlu olarak BD GeneOhm Cdiff Testi saptama limiti (LOD) altındaki yüksek negatif örnekleri değerlendirmek için ek bir tekrarlanabilirlik çalışması yapıldı. Simüle edilmiş bağırsak florası içeren bir örnek C. difficile (ATCC 43255) ile test LOD değerine eşdeğer bir konsantrasyonda inoküle edildi. Bu örnekten sırasıyla 100 kat ve 10 kat seyreltmeler iki (2) negatif panel üyesi elde etmek üzere hazırlandı. Tablo 10 varyans bileşenleri (SD ve %CV) ile genel ortalama Ct değerleri ve negatif test sonuçlarının genel yüzde uyumu verilmektedir. Beklendiği gibi daha seyreltilmiş panel üyesi (LOD nin 100 kat altında) daha düşük düzeyde hedef içeriyordu ve daha az seyreltilmiş panel üyesi (LOD nin 10 kat altında) yani daha yüksek düzeyde hedef içerene göre negatif test sonuçları için daha yüksek yüzde uyum gösterdi. Yüksek negatif panel üyeleri testin analitik LOD değeri altında olsa da bu örneklerde hedef bulunması nedeniyle yine de pozitif test sonuçları gözlenebilir. P0047(02)_TR -13-

14 Tablo 8. Bir Parti kullanılarak Çalışma Yerleri Arası Tekrarlanabilirlik Sonuçları Kategori ÇALIŞMA YERİ Çalışma Yeri 1 Çalışma Yeri 2 Çalışma Yeri 3 Yüzde Uyum Yüzde Uyum Yüzde Uyum Genel Yüzde Uyum Genel Ortalama Ct Değerleri NEG 30/30 %100,0 30/30 %100,0 30/30 %100,0 90/90 %100,0 36,2 0,3 %0,8 DÜŞÜK POZ 28/30 %93,3 29/30 %96,7 30/30 %100,0 87/90 %96,7 38,8 0,9 %2,3 ORTA POZ 30/30 %100,0 30/30 %100,0 30/30 %100,0 90/90 %100,0 38,3 1,0 %2,7 Veriler dahili kontrol değerlerini temsil etmektedir. SD %CV Tablo 9. Üç Parti kullanılarak Partiler Arası Tekrarlanabilirlik Sonuçları Kategori PARTİ KODU Parti Kodu 1 Parti Kodu 2 Parti Kodu 3 Yüzde Uyum Yüzde Uyum Yüzde Uyum Genel Yüzde Uyum Genel Ortalama Ct Değerleri NEG 30/30 %100,0 30/30 %100,0 30/30 %100,0 90/90 %100,0 36,1 0,3 %0,8 DÜŞÜK POZ 30/30 %100,0 30/30 %100,0 30/30 %100,0 90/90 %100,0 38,6 1,0 %2,5 ORTA POZ 29/30 %96,7 29/30 %96,7 30/30 %100,0 88/90 %97,8 37,8 1,1 %2,8 Veriler dahili kontrol değerlerini temsil etmektedir. SD %CV Tablo 10: Yüksek Negatif Örnek Paneli Kullanılarak Ek Tekrarlanabilirlik Çalışması Yüksek Negatif Panel Üyesi Çalışma yeri 1 Çalışma yeri 2 Çalışma yeri 3 Yüzde Uyum* Yüzde Uyum* Yüzde Uyum* Genel Yüzde Uyum* Genel Ortalama Ct Değerleri SD %CV 1:100 dilution 25/30 %83,3 21/30 %70,0 26/30 %86,7 72/90 %80,0 41,3 0,9 %2,1 1:10 dilution 11/30 %36,7 5/30 %16,7 5/30 %16,7 21/90 %23,3 40,2 1,4 %3,4 *Negatif sonuç için yüzde uyum. Hassasiyet BD GeneOhm Cdiff Testi için Laboratuvar içi hassasiyet bir (1) çalışma yerinde test edildi. Çalışma 12 gün boyunca, her gün iki (2) çalışma ve her çalışmada iki (2) örnek replikatı olacak şekilde yapıldı. Örnekler arasında düşük ve orta pozitif C. difficile ve ayrıca negatif C. difficile yi temsil eden simüle edilmiş örnekler vardı. Yapılan 24 çalışmadan biri (1) pozitif control (PC) hatası nedeniyle çalışma dışı bırakıldı. Bir (1) orta pozitif örnek çözümlenmemiş bir sonuç verdi. Tüm diğer örnekler ve kontroller toplam 46 replikat için bildirilebilir sonuçlar oluşturdu. Düşük ve orta pozitif örnekler için kesinlik çalışması sonuçları sırasıyla (46/46) ve (45/46) replikat için uyum gösterirken negatif örnek sonuçları (46/46) replikat için uyum gösterdi. P0047(02)_TR -14-

15 Referanslar 1. Cloud J and Kelly CP., Update on Clostridium difficile associated disease. Curr Opin Gastroenterol 2007 Jan; 23 (1): Warny M, et al. Toxin production by an emerging strain of Clostridium difficile associated with outbreaks of severe disease in North America and Europe. Lancet Sep 24-30; 366(9491): Bartlett, John G. MD, Clostridium difficile: Old and New Observations. J of Clin Gastroent 41 Supplement 1:S24-S29, May/June Hurley BW and Nguyen CC. The spectrum of pseudomembranous enterocolitis and antibiotic-associated diarrhea. Arch Intern Med Oct 28; 162 (19): Polgreen PM, et al. An outbreak of severe Clostridium difficile-associated disease possibly related to inappropriate antimicrobial therapy for community-acquired pneumonia. Infect Control Hosp Epidemiol Feb; 28 (2): Nagy E, et al. The place of molecular genetic methods in the diagnostics of human pathogenic anaerobic bacteria. A minireview. Acta Microbiol Immunol Hung Jun; 53 (2): Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. Richmond JY and McKinney RW (eds) (1993). HHS Publication number (CDC) Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved Guideline. Document M29 (Refer to the latest edition). Clinical Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, SmartCycler Dx Software Operator Manual D4198 Rev. C, Cepheid, Sunnyvale, CA, USA. 10. Clinical and Laboratory Standards Institute. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline, document MM3-A2 (Refer to the latest edition). Clinical Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical and Laboratory Standards Institute Statistical Quality Control for Quantitative Measurements: Principles and Definitions; Approved Guideline. Document C24 (Refer to the latest edition). Clinical Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Cohen SH et al. (1998) Isolation of a Toxin B-deficient mutant strain of Clostridium difficile in a case of recurrent C. difficile Associated Diarrhea, Clin. Infect. Dis. 26: Cohen SH et al. (2000) Analysis of the pathogenicity locus in Clostridium difficile strains, J. Infect. Dis. 181: Maccannell D. et al. (2006) Characterization of a novel, TcdB-deficient, NPA1 variant strain of Clostridium difficile, 46th Annual ICAAC, San Francisco, Sept McFarland, L.V., et al., Implications of the changing face of Clostridium difficile disease for health care practitioners. Am J Infect Control, (4): p Rupnik M. et al. A novel toxinotyping scheme and correlation of toxinotypes with serogroups of Clostridium difficile isolates, J Clin Microbiol, 1998, vol 36 no 8 : Rupnik M. et al. Comparison of toxinotyping and PCR ribotyping of Clostridium difficile strains and description of novel toxinotypes, Microbiology 2001, 147, Bu kit New York Eyaleti Public Health Research Institute Inc. (Kamu Sağlığı Araştırmaları Enstitüsü) lisansı ile satılmaktadır ve sadece insan in vitro klinik diagnostikleri için PHRI patent haklarına göre kullanılabilir. Bu ürünün satın alınması satın alan kişiye insan in vitro diagnostik bilgi sağlamak amacıyla nükleik asit dizilerinin amplifikasyonu ve saptanması için kullanılmasına izin verir. Bu satın almayla bu spesifik kullanım hakkı dışında herhangi bir genel patent veya başka herhangi bir türde lisans verilmez. Bu ürün, Molecular Probes, Inc. ve Geneohm Sciences, Inc. arasındaki bir anlaşmaya tabidir ve bu ürünün üretimi, kullanımı, satışı veya ithalatı Molecular Probes, Inc. şirketinin (bütünüyle Invitrogen Corporation şirketinin bir yan kuruluşu olan) sahibi olduğu bir veya birçok A.B.D. patentine, patent bekleyen uygulamaya ve ilgili yabancı eşdeğerlerine tabi olabilir. Bu ürünün satın alınması satın alan kişiye, ürünün ve ürünün bileşenlerinin satın alınan miktarını, insan diagnostiğinde mikroorganizmaları tanımlamak amacıyla nükleik asit saptamasına yönelik testlerde kullanmak için devredilemez bir hak verir. Satın alan kişi, bu ürünü veya bileşenlerini üretim amacıyla veya terapötik veya profilaktik amaçla kullanamaz veya bu ürünü veya bileşenlerini satamaz veya üçüncü bir tarafa başka şekillerde devredemez veya insan diagnostiği dışındaki amaçlarla kullanamaz. Bu ürün için insan diagnostiği dışındaki kullanım amaçları için bir lisans satın alınması hakkında bilgi için, Molecular Probes, Inc., Business Development, Willow Creek Road, Eugene, OR 97402, A.B.D. adresinden veya aşağıdaki numaralardan bağlantı kurun: Tel: (541) Faks: (541) P0047(02)_TR -15-

16 Semboller İndeksi SEMBOL ANLAMI SEMBOL ANLAMI Üretici Parti kodu Katalog numarası Sıcaklık sınırlaması In Vitro Diagnostik Kullanım Işık ve nemden koruyun Yetkili Avrupa Temsilcisi Kullandıktan sonra poşetleri tekrar mühürleyin Son kullanma tarihi Kullanım talimatına bakınız İçindekiler «n» test için yeterlidir R36/38 Gözler ve cilt için tahriş edici Nadražuje oči i kožu Müşteri Servisi: Benex Limited Pottery Road Dun Laoghaire, Co. Dublin, Ireland GeneOhm Sciences Canada, Inc boul. du Parc-Technologique Québec, QC, Canada, G1P 4S5 BD, BD Logosu ve tüm diğer ticari markalar Becton, Dickinson and Company'nin mülkiyetindedir BD. P0047(02)_TR -16-