Protein analizleri. Gıda Analizleri-6. Protein analizleri. Proteinler. Proteinler 3/17/2013. Bazı gıdaların yaklaşık protein içerikleri

Transkript

1 Protein analizleri Gıda Analizleri-6 Bitkisel ve hayvansal tüm gıdalar, az veya çok miktarda protein içerdiği için gıda analizlerinde protein analizleri önemli bir yer tutar. Gıda içerisinde N içeren bileşikler, genellikle protein olarak bilinir ve geleneksel olarak tayin işlemleri de gıda içerisindeki mevcut N miktarının tayinine dayanır. Genellikle N miktarı ile belirlenen protein oranı, ham protein olarak adlandırılır. Protein analizleri Protein analizleri kalitatif veya kantitatif amaçlarla yapılabilir. Ayrıca proteinlerin izolasyonu, ekstraksiyonu ve çeşitli özelliklerinin (çözünürlük, su bağlama, emülsiyon vb) belirlenmesi amacıyla yapılan analizler de vardır. Bazı gıdaların yaklaşık protein içerikleri Hayvansal gıdalar % protein Bitkisel gıdalar % protein Jelatin 84 Soya fasulyesi 40 Pastırma 40 Mercimek 25 Peynir 30 Fındık 15 Balık 20 Un 12 Et Lahana 4.5 Yumurta 12 Patates 3 Süt 3.4 Domates 1.1 Proteinler Proteinler amino asitlerin birbiriyle yaptığı peptit bağlarıyla oluşturdukları polimerlerden meydana gelen azotlu organik bileşiklerdir. Proteinlerin temel yapıtaşı amino asitlerdir ve 2 amino asidin birleşimi ile di, 3 tanesinin birleşimi ile tri, 5-11 tanesinin birleşimi ile oligo ve 11 den daha fazlasının birleşimi ile de polipeptitler meydana gelir. Proteinler genellikle birden fazla polipeptit zincirinin bir araya gelmesiyle meydana gelir. Canlı organizmanın temeli protein olduğu için beslenmenin temelinde de yine protein vardır. Dolayısıyla gıdalarda az veya çok mutlaka bir miktar protein vardır. Proteinler Yapısal olarak proteinler 4 temel elementten meydana gelmiştir, bunlar; C, O, H, ve N dur. Bunların haricinde yapılarında S, P ve Fe gibi elementleri de içerirler. Yine Mg ve Co ihtiva edenleri de vardır. Birçok proteinin izolasyon ve identifikasyonu içerdikleri elementlerden faydalanılarak yapılmaktadır. Örn, toplam N, ham protein miktarının bir ölçüsüyken, Fe bazı et proteinlerinin (myoglobin, hemoglobin vb) tanımlanmasında kullanılmaktadır. 1

2 Gıdalarda Protein Analizi Yapılmasının Nedenleri 1. Gıda maddesinin mevcut kalite standartlarına uygunluğunun belirlenmesi 2. Gıda maddesinin beslenme değerini belirlemek 3. Proteinlerin bazı fonksiyonel özelliklerini belirlemek 4. Proteinlerin bazı teknolojik özelliklerinin belirlenmesi 5. Bir gıda maddesinin genel bileşiminin tespit edilmesi 6. Satışa sunulacak gıda maddesinin fiyatını ayarlamak 7. Herhangi bir işleme tekniğinin proteinler üzerindeki etkisini belirlemek 8. Gıda içerisindeki protein çeşitleri veya bunların yapısal özelliklerinin belirlenmesi Gıdalarda Toplam Protein Tayin Metotları Günümüzde çok sayıda değişik protein tayin yöntemi bulunmaktadır. Bunlar genelde, protein içersindeki N u esas alarak veya proteinlerin herhangi bir maddeyle verdiği reaksiyonları dikkate alarak yapılan analiz metotlarıdır. Toplam protein analizlerinde 3 temel metot kullanılır. Bunlar; 1. Proteinlerin bazı bileşiklerle verdiği reaksiyonların dikkate alındığı metotlar 2. Proteinlerin fiziksel ve kimyasal özelliklerini değerlendiren metotlar 3. Proteinlerde bulunan toplam N un dikkate alındığı metotlar 1.Proteinlerin bazı bileşiklerle verdiği reaksiyonların dikkate alındığı metotlar Bunlara kolorimetrik yöntemler de denir. a. Biüret metodu b. Lowry metodu c. Millon reaksiyonu metodu d. Boya bağlama metotları 2. Proteinlerin fiziksel ve kimyasal özelliklerini değerlendiren metotlar a. Direkt spektrofotometrik (UV) absorbans metodu b. Türbidimetrik metotlar c. IR (infrared) analizleri d. NMR (nükleer manyetik rezonans) e. Floresansa dayalı metotlar f. Özgül ağırlık metodu g. Elektriksel iletkenlik metodu 3. Proteinlerde bulunan toplam N un dikkate alındığı metotlar a. Kjeldahl metodu b. Dumas metodu c. Meulen metodu 1. Proteinlerin bazı bileşiklerle verdiği reaksiyonların dikkate alındığı metotlar (kolorometrik metotlar) o Proteinlerin renk veren bir kimyasal madde ile reaksiyona sokularak elde edilen rengin yoğunluğunun, bir kolorimetre veya spektrofotometre de belirlenmesi ve bu rengin, miktarı bilinen standart protein çözeltileri ile kıyaslanarak sonucun belirlenmesidir. o Konsantrasyona karşılık absorbans değerleri grafiğe geçirilerek bir kalibrasyon eğrisi hazırlanır. o Bu eğrinin denkleminden yararlanılarak bilinmeyen örnekteki protein miktarı hesaplanır. a)biüret metodu Bu metodun dayandığı temel prensip, protein ve polipeptitlerde bulunan aminoasitlerin oluşturduğu peptit bağlarının, alkali bir ortamda CuSO 4 ile reaksiyona sokulduğu zaman verdiği mavi-menekşe rengin şiddetinin bir spektrofotometrede ölçülmesidir. Bu renk peptit bağlarında bulunan N atomunun Cu ++ ile yaptığı bir kompleks sonucu oluşur. Daha önce hazırlanan protein çözeltisi ile biüret çözeltisi karıştırılarak oda sıcaklığında 10 dakika bekletilir ve oluşan rengin absorbansı 540 nm de ölçülür. Biüret metodunun hassasiyet sınırı, 1-20 mg protein arasındadır. o Bu yöntemler protein miktarı az olan gıdalar için kullanılır. Protein oranı yüksek gıdalarda da çalışmak gerekiyorsa, gıdanın uygun dilüsyonları hazırlanmalıdır. 2

3 b) Lowry Metodu Bu yöntem, biüret metodunun modifikasyonu sonucu hazırlanmıştır ve biüret reaksiyonuna göre çok daha hassas sonuçlar verir. 2 temel reaksiyon söz konusudur. 1. Alkali ortamda bakırın peptitlerle verdiği reaksiyon sonucu renkli bir kompleksin oluşumu 2. Oluşan bu kompleksin folin çözeltisi ile ikinci bir reaksiyon vererek koyu mavi-yeşil renk vermesidir. Bu metotta tayini yapılacak protein çözeltisi folin çözeltisi ile muamele edildikten sonra 30 dakika beklenir ve oluşan renk 600 nm de ölçülür. Bu yöntemle ortamda bulunan mikrogram (µg) seviyesindeki protein oranları bile tespit edilebilmektedir. c) Boya Bağlama Metotları Çok sayıda farklı boya bağlama yöntemi ile protein tayin yöntemi bulunmaktadır. Genel olarak protein oranı belirlenecek çözelti, bazı boyalar ile muamele edilir, filtrasyon veya santrifüj ile proteinler ayrılır ve elde edilen renkli çözeltinin absorbansı bir kolorimetre veya spektrofotometre ile ölçülür. Bu amaçla kullanılan en yaygın yöntemde (Bradford metodu) yapısında (-) yükler ihtiva eden bir boya maddesinin proteinlerin (+) yüklerine bağlanması sonucu ortaya çıkan rengin ölçülmesi prensibinden yararlanılmaktadır. sodyum 1,2-naftakinon-4-sulfonat 2. Proteinlerin fiziksel ve kimyasal özelliklerini değerlendiren metotlar 1. Direkt UV-Absorbans Metodu: Proteinlerin yapılarında bulunan tirozin ve triptofan amino asitleri nedeniyle 280 nm de absorbans vermelerine dayanan bir protein tayin metodudur. Bu metodun dezavantajı ise 280 nm de absorbans veren diğer bazı organik bileşenlerin (nükleik asit gibi) varlığında hassasiyetin düşmesidir. 2. Florometrik analizler: Triptofan aminoasitinin verdiği UV floresans ile çok az da olsa triozin ve alaninden kaynaklanan floresans özelliğin değerlendirilmesidir. Bu yöntemde 280 nm de uyarma işlemi yapılır ve 348 nm de yayılan ışınların şiddeti ölçülür. 3. Infrared spektroskopisi: Gıda içindeki farklı fonksiyonel gruplar IR ışının farklı frekanslarını absorbe ederler. Protein ve peptidler için yakın ve orta IR bantları gıdaların protein içeriklerini belirlemek için kullanılmaktadır. 4. Türbidimetrik metot: Bir çözelti içindeki proteinler trikloroasetik asit gibi maddelerin ilavesi ile çökelir ve bulanıklığa neden olurlar. Bu bulanıklığın derecesi ölçülerek protein konsantrasyonu belirlenebilir. 5. Yoğunluk ve kırılma indisi: Proteinlerin yoğunluğu pek çok gıda bileşeninden yüksektir. Protein içeriği arttıkça yoğunluğu da artmaktadır. Kırılma indisi de protein içeriği arttıkça artar. Bu nedenle yoğunluk ve kırılma indisi ölçümleri protein içeriğini belirlemede kullanılır. Kolorometrik ve spektroskobik metotların bazı ortak özellikleri ve bunların kullanımında dikkate alınması gereken noktalar: a) Ortamda saf proteinler bulunduğunda iyi sonuç vermektedirler. b) Örnek veya protein miktarının çok az olduğu durumlarda bu metotlar tercih edilir c) Örnek içersindeki protein oranını belirleyebilmek için önce standart saf proteinlerle absorbans belirlenerek bunlardan kalibrasyon eğrilerinin hazırlanması gerekir. d) Bazen bu metotların protein oranı yüksek gıdalarda uygulanabilmesi için numuneden uygun dilüsyonların hazırlanması gerekebilir. e) Elde edilen renk şiddeti genellikle bir spektrofotometre veya bir kolorimetre ile belirlenir. Kolorimetre yada spektroskopik metotların bazı avantaj ve dezavantajları vardır. Avantajları; - Çok hızlı sonuç verirler. - Kullanılan örnek miktarı azdır. Yani çok az miktardaki proteinler bile tayin edilebilir. - Basittir ve fazla alet ekipmana ihtiyaç duyulmaz. - Tehlikesiz ve çevreyi kirletmezler. - Diğer azotlu bileşiklerin renk oluşumuna katkısının hemen hiç olmaması nedeniyle diğer metotlara tercih edilirler. Dezavantajları; - Gıdadaki diğer bazı bileşenler reaksiyonları engelleyebilir. - Gıdadaki bulanıklık yapan maddeler absorbansı etkileyebilir. - Genellikle saf proteinler için daha uygundurlar, kompleks protein varlığında hata verebilir. - Bazı durumlarda ph, sıcaklık, dilüsyon gibi koşulların standardizasyonu gerekir. 3

4 3. Proteinlerde Bulunan Toplam N un Dikkate Alındığı Metotlar Bu metotların esası gıda maddesindeki N in büyük bir çoğunluğunun proteinlerde bulunduğu noktasından hareket ederek bu azotun miktarının belirlenmesine dayanır. Yapılan çalışmalar, gıda içerisinde bulunan N un % 99 nun proteinlerden kaynaklandığını ortaya koymuştur. Protein yapısında olmayan diğer bazı gıda bileşenlerinin de azot içerdiği bilinmektedir. Bunlar, azotlu karbonhidratlar ve fosfolipitler, nükleik asitler, pürin bileşikleri, çeşitli pigmentler, üre, amonyum tuzları, amin ve amid bileşikleri ve çeşitli alkoloidler gibi bileşiklerdir. İşte toplam azotun esas alındığı protein tayinlerinde, protein yapısında olmayan azot da belirlendiği için bu metoda genellikle ham protein tayini adı verilir. Ham protein oranı çoğu zaman gerçek protein oranı gibi değerlendirilmektedir. Yapılan araştırmalar proteinlerin yaklaşık % 16 sının N, geri kalan bölümünün ise C, H ve O den oluştuğunu ortaya koymuştur. Sonuç olarak protein tayininde, önce gıda içerisindeki N miktarı bulunur ve bu değer bir faktör (100/16=6.25) ile çarpılarak protein miktarı hesaplanır. Her bir gıda maddesi için belirli katsayılar belirlenmiştir. Bu faktörler: Et,yumurta,fasulye,balık vb gıdalar için 6.25 Süt ve mamulleri için 6.38 Buğday,un vb tahıllar için 5.70 Jelatin 5.55 Kabuklu yemişler için 5.30 Bazı gıdalar için belirlenen bu oranların farklı olmasının en önemli nedenleri; 1. Gıda içindeki N nin tamamının protein kaynaklı olmaması 2. Her proteinin aminoasit oranlarının, dolayısıyla N miktarlarının farklı olması a) Dumas Yöntemi Temel prensibi gıda maddesinin bir fırın içersinde yakılarak tüm N formlarının azot dioksit gazlarına (NO2) dönüştürülmesi ve daha sonra bu gazların, elemental azota indirgenmesi (N 2 ) ve bu azotun termal iletkenlik yöntemleri ile miktarının belirlenmesidir. Dumas metodunun Kejldahl yöntemine kıyasla pek çok avantajı vardır, 1. Derişik asit ve baz kullanılmaması nedeniyle çalışanlar için emniyetli olması 2. Sıvı, katı ve yarı katı haldeki her türlü gıda maddesinde kolaylıkla uygulanabilmesi 3. Çok kısa süre içersinde sonuç alınabilmesi 4. Doğruluk ve tekrarlanabilirlik oranının oldukça yüksek olması 5. Çevre kirliliği açısından daha emniyetli olması Ancak, bu metodun da Kjeldahl yöntemine kıyasla bazı dezavantajları vardır. 1. Dumas metodunda kullanılan örnek miktarının az olması (yaklaşık mg) 2. Fazla yağlı gıdalarda yakma güçlüklerinin olması b) Kjeldahl Yöntemi Bu yöntem ilk defa Danimarka lı araştırıcı Kjeldahl tarafından tanımlandığı için aynı ad ile anılmaktadır. Kjedahl yönteminde esas olarak organik kökenli azot miktarı saptanmaktadır. Bu nedenle metot çoğu kaynakta protein tayini olarak değil, azot tayini olarak sunulmaktadır. Ancak saptanan azot miktarı 6.25 faktörü ile çarpılınca protein miktarı dolaylı şekilde bulunabilmektedir. Proteinlerin içindeki azotu esas alarak tayin işlemi gerçekleştirilen en önemli toplam N veya ham protein tayin metodu Kjeldahl metodudur. Bu yöntemin 2 ana formu mevcuttur; a. Makro Kjeldahl b. Mikro Kjeldahl Her iki yönteminde temel prensibi arasında bir fark yoktur. Tek farkı, mikro Kjeldahl metodunda örnek miktarı ve kullanılan kimyasal madde miktarının az olmasıdır. 4

5 Kjeldahl yönteminin prensibi Proteinlerde bulunan azotu, amonyak (NH3) haline getirmek, amonyaktan azotu ve dolayısıyla proteini hesaplamaktır. Mikro Kjeldahl ünitesi Makro Kjeldahl ünitesi Yöntem 3 safhadan oluşur: 1) Yakma 2) Distilasyon 3) titrasyon 1. YAKMA: Bu aşamada proteinin yapısında bulunan azot, H 2 S0 4 ve uygun katalizör maddelerle Amonyum sülfat - (NH 4 ) 2 SO 4 - haline getirilir Isı Organik madde (N 2 ) + H 2 SO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 + H 2 O + CO 2 + SO 2 Katalizör Reaksiyon sonucu SO 2, CO 2 ve H 2 O oluşur. SO 2 ve diğer gazların zararlı etkileri nedeniyle işlemin mutlaka bir çeker ocak sisteminde yapılması gerekir. Kullanılan katalizörler Parçalanmayı hızlandırmak için katalizör olarak genellikle Cu, Hg, Fe, Se veya K tuzları kullanılır. Katalizör olarak bu bileşikler 1-2 g civarında ortama ilave edilir. En çok kullanılan katalizör bakır sülfat ile potasyum sülfat karışımından oluşur. Katalizörlerin genel fonksiyonları: Yanma sırasında arzu edilen kimyasal reaksiyonları hızlandırırlar. H 2 SO 4 in kaynama noktasını yükseltirler (özellikle K 2 SO 4 ve Na 2 SO 4 ) dolayısıyla yüksek sıcaklıklara ulaşılır ve kısa sürede reaksiyon gerçekleştirilir. Organik bileşiklerin oksidasyonunu hızlandırırlar. 2. DİSTİLASYON: Amonyum sülfatın (NH 4 ) 2 SO 4 ın, su ve NaOH ile ayrıştırılarak önce NH 4 OH ve daha sonra NH 3 haline dönüştürülerek zayıf bir asitle tutulması Isı (NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH Isı NH 4 OH H 2 O+NH 3 Na 2 SO 4 + 2NH 4 OH Burada amonyak gazı distilasyon düzeneğinde yoğunlaşarak zayıf bir asit (% 4 lük borik asit) içinde tutulur. NH 3 +H 3 BO 4 NH + 4+BO 3 +H 2 O 5

6 Borik asit çok zayıf bir asit olması nedeniyle, destilatın standart asit çözeltisi ile titrasyonunda doğrudan doğruya amonyak ile titre edilmektedir. Borik asitin görevi destilasyon aşamasında oluşan amonyağın tutulmasıdır. NH + 4+BO 3 +HCl NH 4 Cl + HBO 3 3. TİTRASYON: Bu aşamada amonyak standart asit çözeltisi ile titre edilir. Eğer destilat % 4 lük borik asit içinde toplanmış ise titrasyonda standart 0.1 N HCl çözeltisi kullanılır. 2NH 3 + H 2 SO 4 ( veya HCl) (NH4) 2 SO 4 + H2O Hesaplama Eğer destilat % 4 lük borik asit içinde toplanmış ise titrasyonda standart 0.1 N HCl çözeltisi kullanılmış ise, Örnekteki azot miktarı, V HCl (ml) x N HCl x % N = x 100 m (g) % protein miktarı = (% azot) x (6.25) m: örnek miktarı, g V HCl : sarfedilen HCl miktarı N HCl : HCl in normalitesi (14/1000) : 1 ml 0.1 N HCl in eşdeğeri olan amonyak azotu Genel olarak Kjeldahl yönteminin Avantajları; Güvenilir bir metottur ve daha doğru ve hassas sonuçlar verir. Çok fazla protein içeren gıdalarda kolorometrik metotlarla protein tayini çok zordur veya yapılamaz, bu durumlarda kjeldahl metodu kullanılır. Dezavantajları ise; Numunedeki protein oranı az ise hassasiyet düşer. Pahalı ve tehlikeli bir metottur. Çevre kirliliği oluşturma problemi vardır. İşlemleri sıkıcı ve uzun zaman alır. Sonuç olarak yukarıda sıralanan tüm bu olumsuzluklara rağmen gıdalarda en güvenilir protein tayin yöntemi yine kjeldahl tekniklerine göre çalışan protein tayin metotlarıdır. Proteinlerin saflaştırılması Proteinlerin saflaştırılmasında çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Bunlar; Diyaliz Ultrafiltrasyon Jel filtrasyon Elektroforez İzoelektrik odaklama İyon değişimi kromatografisi Afinite kromatografisi 6

7 Diyaliz Diyaliz belirli bir boyuttan küçük molekülleri geçiren fakat daha büyük moleküllerin geçişini önleyen yarı geçirgen bir membran kullanılarak bir çözeltideki molekülleri ayırma işlemidir. Ultra filtrasyon Bir protein çözeltisi yarı geçirgen bir membran içeren bir hücreye konur ve basınç uygulanır. Uygulanan basıncın etkisiyle büyük moleküller çözelti içinde kalırken küçük moleküller membrandan geçer. Proteinleri daha küçük molekül ağırlığına sahip diğer moleküllerden ayırmak için kullanılır. Bu teknik prensip olarak diyalize benzer. Ancak basınç uygulandığı için işlem hızlıdır. Jel filtrasyon Bu yöntemde protein karışımını içeren çözelti çok küçük porlu taneciklerle doldurulmuş bir kolondan geçirilir. Bu tanecikler dekstran veya agaroz olabilir. Protein karışımı porlu tanecikler arasından geçerken küçük moleküllü proteinler taneciklerin deliklerine girer ve bu proteinlerin kolondan çıkışı gecikir. Büyük proteinler ise taneciklerin delikleri arasına giremez ve kolondan hızla geçer. Böylece kolondan önce büyük moleküllü, sonra orta büyüklükteki en sonda ise küçük moleküllü proteinler çıkar. Bu şekilde proteinler molekül ağırlıklarına göre ayrılmış olurlar. Elektroforez Elektroforez, bir çözeltideki yüklü moleküllerin elektriksel bir alan uygulandığında farklı hızlarda göç etmesi prensibine dayanır. Bu yöntemde yüklü bileşenler birbirinden elektriksel alan etkisiyle ayrılabilir. Eğer bir protein karışımını bir elektrik alana koyarsak proteinler yüklerine ve molekül ağırlıklarına göre elektriksel alanda göç ederler. Elektroforez (+) yüklü proteinler (-) yüklü elektrota doğru, (-) yüklü proteinler ise (+) yüklü elektrota doğru göç ederler. Ayrıca bu proteinlerden yüksek yoğunlukta yüklü olanlar düşük yoğunlukta yüklü olanlara göre elektrota doğru daha hızlı hareket ederler. En çok kullanılan poliakril amid jel elektroforezidir. Bu yöntemde proteinler molekül ağırlıklarına ve taşıdıkları elektrik yüküne göre bu elektrik alanda hareket ederler ve protein molekülleri birbirinden ayrılır. İzoelektrik odaklama Aminoasitler gibi proteinlerde belirli bir izoelektrik noktaya sahiptir. Bu metodun prensibi proteinlerin izoelektrik noktalarının farklı olmasına dayanmaktadır. Bir molekül kendi izoelektrik noktasına ulaştığı anda hareketi durur. Böylece hareket eden diğer moleküllerden ayrılmış olur. 7

8 Afinite kromatografisi Afinite kromatografisinde katı bir desteğe kovalent olarak bağlanan bir ligandı içeren sabit faz kullanılır. Ligand belirli bir protein için yüksek afiniteye (ilgiye) sahiptir. Örnek kolondan geçirilirken ayrılması istenen protein liganda bağlanırken diğer proteinler direkt olarak geçer. Kolonda adsorbe olan protein kolonun uygun bir tampon ile yıkanması sayesinde kolondan ayrılır. Bu teknik karışım halindeki proteinlerden belirli bir proteini ayırmanın en etkili yoludur. 8