ÖNSÖZ Biyojen aminler, gıdalarda bazı spesifik amino asitlerin dekarboksilasyonu sonucu (glutamik asit ve argininden putresin, histidinden histamin, t

Transkript

1 T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Proje Başlığı Sofralık Zeytinlerde Biyojen Amin Miktarlarının Belirlenmesi Proje Yürütücüsünün İsmi Prof. Dr. Kamuran AYHAN Yardımcı Araştırıcı K.Özgür ERGEN Proje Numarası HPD Başlama Tarihi Bitiş Tarihi Rapor Tarihi Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara-2006

2 ÖNSÖZ Biyojen aminler, gıdalarda bazı spesifik amino asitlerin dekarboksilasyonu sonucu (glutamik asit ve argininden putresin, histidinden histamin, tirozinden tiramin, fenilalaninden feniletilamin, lisinden kadaverin) veya aldehit ve ketonların transaminasyonuna bağlı olarak meydana gelen temel azotlu bileşikler olarak tanımlanmaktadır. Gıdalarda biyojen amin oluşumu ham maddede varolan amino asitlerin dekarboksilasyonu veya enzimatik aktivite için uygun koşulların oluşmasıyla dekarboksilaz enzim aktivitesine sahip mikroorganizmaların faaliyeti sonucu meydana gelmektedir. Düşük moleküler ağırlığa sahip olan biyojen aminler, doğal biyolojik aktiviteleri nedeniyle pek çok gıdada bulunmaktadırlar. Bu gıdalar arasında balık ve balık ürünleri, et ve et ürünleri, yumurta, peynir gibi proteince zengin gıdalar, fermente sebzeler ve soyalı ürünler, bira ve şarap gibi alkollü içkiler meyveler, fındık, çikolata gibi ürünler yeralmaktadır. Biyojen aminlerin, intoksikasyonlara neden olmaları yanında bazı gıdalarda (örneğin, balık ve ürünlerinde yüksek histamin ve tiramin miktarı) bozulma indikatörü olarak kullanılmaları nedeniyle gıdalardaki varlıklarının belirlenmesi önem taşımaktadır. Yürütücüsü olduğum 16/05/2005 tarihinde Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Fonunca desteklenme kararı alınan HPD numaralı ve Sofralık Zeytinlerde Biyojen Amin Miktarlarının Belirlenmesi isimli proje çalışmaları tamamlanmıştır. Yapılan bu araştırmada Ankara piyasasında satılan çeşitli tipteki siyah ve yeşil sofralık zeytinler ile zeytin ezmelerinde biyojen amin miktarlarının belirlenmesi hedeflenmiştir. Araştırma kapsamında yeralan biyojen amin analizleri BİTAUM Kromotografi Ünitesi laboratuvarlarında yürütülmüştür. 1

3 Projenin gerçekleştirilmesinde verilen destek ve katkılarından dolayı Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Müdürlüğüne, BİTAUM Müdürü Sayın Prof. Dr. Tamer BAYKARA ya ve analizler süresince yardımcı olan Uzman Nilüfer VURAL a ve diğer çalışanlarına sonsuz teşekkür ederim. Prof. Dr. Kamuran AYHAN Proje yürütücüsü 2

4 1. ÖZET Bu çalışmada Yüksek Performanslı Sıvı Kromotografisi (HPLC) yöntemi kullanılarak piyasadan temin edilen 40 adet çeşitli tipteki sofralık yeşil ve siyah zeytin örneklerindeki biyojen amin miktarları belirlenmiştir. Ayrıca örneklerde toplam mezofilik aerobik bakteriler (TMAB), enterobakteri ve maya-küf sayımları da yapılmıştır. Zeytin örneklerinde belirlenen TMAB sayım sonuçları; açık tipteki siyah zeytin örneklerinde 3,52-6,83 log kob/g, vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde 4,00 log kob/g, açık tipteki yeşil zeytin örneklerinde < 2-5,88 log kob/g olarak bulunurken, sterilize ve pastörize siyah zeytin örneklerinde ve pastörize yeşil zeytin örneklerinde < 2 log kob/g olarak saptanmıştır. Tüm örneklerde enterobakteri sayım sonuçları 2 log kob/g dan düşük olarak belirlenmiştir. Maya sayım sonuçlarının açık tipteki siyah zeytin örneklerinde 3,30-6,65 log kob/g, vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde 3,39 log kob/g ve açık tipteki yeşil zeytin örneklerinde < 2-5,82 log kob/g aralığında değişim gösterdiği, pastörize ve sterilize siyah zeytin örnekleri ile pastörize yeşil zeytin örneklerinde ise 2 log kob/g dan daha az olduğu anlaşılmıştır. Araştırmada yalnızca 3 adet açık tipteki siyah zeytin örneğinde 3,11-3,85 log kob/g aralığında küf bulunurken, diğer örneklerde küf bulgusuna rastlanmamıştır. Zeytinlerde en yüksek konsantrasyona sahip biyojen aminler, sırasıyla, triptamin (6,705 mg/kg 9 nolu örnek), tiramin (6,230 mg/kg 2 nolu örnek) ve feniletilamin (2,295 mg/kg 2 nolu örnek) olarak belirlenmiştir. Belirlenen değerler içerisinde en düşük konsantrasyon aralığına sahip biyojen aminin histamin, rastlanma sıklığı en düşük biyojen aminin ise spermin olduğu görülmüştür. Analiz edilen tüm örneklerin biyojen amin değerleri ile mikrobiyolojik bulguları arasında düzenli bir artış veya azalma olmadığı, zeytin örneklerinin siyah, yeşil, açık, pastörize, sterilize veya vakum paketli olmalarının biyojen amin oluşumunda büyük değişikliklere yol açmadığı, ve zeytin örneklerinde belirlenen feniletilamin, putresin, histamin, tiramin ve toplam biyojen amin miktarlarının toksik limitlerin altında olduğu anlaşılmıştır. 3

5 2. AMAÇ VE KAPSAM Ülkemizde hemen her evde tüketilen gıda maddeleri arasında sofralık siyah zeytinin özel bir yeri bulunmaktadır (Kılıç vd. 1986). Sofralık zeytin, bileşiminde yüksek oranda yağ, miktarı az fakat yüksek kaliteli protein, kalsiyum, magnezyum, potasyum, sodyum, demir, bakır gibi mineral maddeler, provitamin A, vitamin C, tiyamin ve iştah açıcı oleuropein maddesi bulunan bir gıda maddesidir (Başer ve Kılıç 1987). Zeytin, içerdiği % 33 oranlarına kadar varabilen yenebilir yağı ile insan beslenmesinde temel besin maddeleri arasında yer almaktadır. Karbonhidratlı besinlerle diyete girerek bunların yağca zenginleşmelerini sağlamaktadır. Ayrıca, öğünün kalori değerini artırmakla birlikte içerdiği vitaminler, proteinler ve aroma maddeleriyle tek başına ekmekle birlikte dengeli beslenme olanağı yaratır. Özellikle, yağda eriyen ve sadece yağlardan doğal olarak alınabilen A ve E gibi vitaminleri içermesi sağlıklı beslenme yönünden de değerini artırmaktadır (Aktan ve Kalkan 1999). Türkiye dünya zeytin üretiminin % 10 unu karşılarken siyah zeytin üretiminde birinci, sofralık zeytin üretiminde ikinci ve zeytinyağı üretiminde dördüncü sırada yer alan önemli bir ülke konumunda bulunmaktadır (Anonim 2006). Türkiye de üretilen zeytinin yaklaşık % 30 u sofralık olarak işlenmektedir (Tunalıoğlu 2003). Zeytin ağacı Ege, Akdeniz, Marmara sahil şeridinde ve Güneydoğu Anadolu Bölgesi nde yaygın olarak bulunmaktadır. Bölgelerin yamaç ve dağlarının tamamına yakın bir kısmı zeytin ağaçları ile kaplıdır (Aktan ve Kalkan 1999). Gıdalarda biyojen amin oluşumu hammaddede varolan amino asitlerin dekarboksilasyonu veya enzimatik aktivite için uygun koşulların oluşmasıyla dekarboksilaz enzim aktivitesine sahip mikroorganizmaların faaliyeti sonucu meydana gelmektedir. Gelişmekte olan zeytin meyvesinde putresin, spermin ve spermidinin çok düşük miktarda bulunduğu ve tuz varlığında meyveden salamuraya geçtiği (Garcia- Garcia et al. 2000), diğer yandan, olgunlaşmış, fermente olmuş veya bozulmuş 4

6 ürünlerde ise yüksek miktarda biyojen amin varlığına rastlandığı ileri sürülmektedir (Garcia-Garcia et al. 2001). Ticari olarak farklı şekillerde işlenen sofralık zeytinlerin mikrobiyolojik, fiziksel, kimyasal ve duyusal özelliklerini belirlemeye yönelik araştırmalar (Akbulut 1977, Kılıç vd 1986, Nas ve Gökalp 1990, Arıcı ve Aktan 1997) bulunmakla birlikte, biyojen amin oluşumu ve miktarlarının araştırılması konusunda Türkiye de yapılmış herhangi bir çalışmaya rastlanmamış olup biyojen amin indeksi (BAI) dikkate alındığında zeytinde biyojen amin miktarlarının belirlenmesi üzerine bu araştırmanın yapılması gerekli görülmüştür. Bu çalışmada, piyasada satışa sunulan çeşitli tipteki yeşil ve siyah sofralık zeytin ile zeytin ezmesi ürünlerinde biyojen amin miktarlarının HPLC tekniği ile belirlenmesi amaçlanmıştır. Zeytinin ülkemizde yaygın olarak tüketildiği göz önüne alındığında elde edilen sonuçların hem halk sağlığı hem de ticari olarak üretim yapan firmalara yönelik bilgiler açısından faydalı olacağı düşünülmektedir. 5

7 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1 Materyal Araştırmada piyasadan temin edilen farklı tipte 40 adet zeytin örneği kullanılmıştır. Mikrobiyolojik sayımlarda enterobakteri grubu bakterilerin sayımı için Violet Red Bile Glucose Agar (VRBG, Merck) besiyeri ve Toplam Mezofilik Aerobik Bakteri (TMAB) sayımı için Plate Count Agar (PCA, Merck) besiyeri kullanılmıştır. Maya-küf sayımı ise Oxytetracycline Glucose Yeast Agar (OGYE Agar, Oxoid) besiyerinde gerçekleştirilmiştir. Biyojen amin analizleri için gerekli olan tiramin (TRA), putresin (PUT), kadaverin (KAD), triptamin (TRP), feniletilamin (FEA), histamin (HIS), spermin (SPM) ve spermidin (SPD) biyojen aminleri Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) den sağlanmıştır. 3.2 Yöntem Zeytin örneklerinin toplanması ve analiz planı Ticari olarak satışa sunulan 17 çeşit siyah zeytin, 17 çeşit yeşil zeytin, 4 adet zeytin ezmesi ve 2 adet dilimlenmiş zeytin örneği piyasadan temin edilmiştir (Çizelge 3.1). Zeytin örneklerinde biyojen amin analizleriyle birlikte mikrobiyolojik analizlerde yürütülmüştür. 6

8 Çizelge 3.1 Zeytin çeşitleri SİYAH YEŞİL Açık Pastörize Sterilize V. p a k e Açık Pastörize t Örnek No 1 Sele 2 Sele 3 Sele 4 Gemlik 5 Gemlik 6 Gemlik 7 Kalamata 8 Kalamata 9 Kalamata 10 Edremit 11 Akhisar 12 Ezme 13 Ezme 14 Sele 15 Kalamata 16 Dilimlenmiş 17 Konserve 18 Konserve 19 Konserve 20 Gemlik 21 Çizik 22 Çizik 23 Çizik 24 Çizik 25 Biberli 26 Biberli 27 Biberli 28 Biberli 29 Kokteyl 30 Kokteyl 31 Kokteyl 32 Kokteyl 33 Kırma 34 Kırma 35 Kırma 36 Domat 37 Ezme 38 Ezme 39 Kırma 40 Dilimlenmiş 7

9 3.2.2 Mikrobiyolojik analizler Steril koşullarda alınan 10 g zeytin örneği, 90 ml % 0,85 lik steril fizyolojik tuzlu suda 1 : 9 oranında seyreltilmiş ve elde edilen seyreltiler, toplam mezofilik aerobik bakteri, Enterobakteri ve maya-küf sayımları için kullanılmıştır Toplam mezofilik aerobik bakteri sayımı Toplam mezofilik aerobik bakteri sayımı için Plate Count Agar (PCA, Merck) besiyerine yayma kültürel sayım yöntemine göre ekim yapılmış ve o C da 48 saat süre ile inkübasyon sonucunda gelişen koloniler sayılmıştır. Sonuçlar logaritmik değerlere çevrilmiş ve log kob (koloni oluşturan birim) / g olarak ifade edilmiştir (Anonymous 1996) Enterobakteri sayımı Enterobakteri sayımı için yayma kültürel sayım yöntemi kullanılarak Violet Red Bile Glucose Agar (VRBG, Merck) besiyerinde 37 o C da 24 saat inkübasyon sonunda, gelişme olmayan petrilerde ise 48 saat sonunda gelişen pembe-kırmızı renkteki koloniler sayılmıştır. Sonuçlar log kob/g olarak verilmiştir (Anonymous 1996) Maya ve küf sayımı Toplam maya-küf sayımı yayma kültürel sayım yöntemi kullanılarak Oxytetracycline Glucose Yeast Agar (OGYE, Oxoid) besiyerinde yapılmıştır. Petriler, mayalar için o C da 72 saat, küfler için ise o C da 120 saat süreyle inkübasyona bırakılmış ve inkübasyon sonunda gelişen koloniler sayılmıştır. Sonuçlar log kob/g olarak verilmiştir (Anonymous 1990). 8

10 3.2.3 HPLC analizi HPLC cihazı Araştırmada kullanılan HPLC cihazının özellikleri ve kromatografi koşulları çizelge 3.2 de verilmiştir. Çizelge 3.2 HPLC cihazının özellikleri ve biyojen amin analizi için kromatografi koşulları HPLC Thermo Finnigan, Surveyor (Waltham, USA) Kolon fırını Thermo Finnigan, Surveyor, Sıcaklık 5 ºC Kolon C-18 (250x4.6 mm, ID) Phenomenex Luna Pompa Surveyor dörtlü düşük basınç gradient pompa Degasser Otomatik vakum degasser Dedektör 254 nm, PDA (Photo Diode Array), pik saflığının kontrolü için nm arasında spektrum taramalı, bant genişliği: 2 nm Yazılım programı Chrom Quest Chromatography Software Mobil faz Solvent A: 30 ml buffer / 550 ml asetonitril / 420 ml destile su Solvent B: 2 ml buffer / 900 ml asetonitril / 100 ml destile su Akış hızı 1,3 ml/dak. Enjeksiyon 25 µl Şekil 3.1 Çalışmada kullanılan HPLC sistemi (Ankara Üniversitesi BİTAUM) 9

11 Biyojen amin standart çözeltilerinin hazırlanması Tiramin (TRA), putresin (PUT), kadaverin (KAD), triptamin (TRP), feniletilamin (FEA), histamin (HIS), spermin (SPM) ve spermidin (SPD) standart biyojen aminlerinden her biri 50 ml lik balon jojeler içinde 0,4 M perklorik asit ile çözündürülmüş ve her bir biyojen aminin son konsantrasyonu 10 mg/50 ml olacak şekilde biyojen amin standart çözeltileri hazırlanmıştır. Miks standart çözeltisi hazırlamak için ise her bir biyojen aminin 5 ml stok çözeltisi 50 ml lik balon jojeye aktarılmış ve hacim 0,4 M perklorik asit ile 50 ml ye tamamlanmıştır. Dansil klorür çözeltisi için 10 mg dansil klorür 1 ml aseton içinde çözündürülmüştür. Tüm çözeltiler günlük olarak hazırlanmıştır (Bütikofer et al. 1990) Mobil faz 0,1 M tris, 0,1 M asetik asit ve destile su, sırasıyla, 2 / 1 / 2 oranında kullanılarak buffer (ph 8) hazırlanmıştır. Solvent A için 30 ml buffer / 550 ml asetonitril / 420 ml destile su ve Solvent B için de 2 ml buffer / 900 ml asetonitril / 100 ml destile su kullanılmıştır Örneklerin hazırlanması ve ekstraksiyonu Zeytin örnekleri çekirdekleri çıkarılıp, bıçak yardımıyla küçük parçalara ayrılmış ve havanda dövüldükten sonra elde edilen meyve kısımlarından 10 ar gram alınmıştır. Alınan örnekler 250 ml lik Erlenmayer e konularak üzerlerine 25 ml perklorik asit, 200 µl 1,7-diaminoheptan (iç standart, Sigma) ilave edilmiş ve 20 dakika süreyle çalkalayıcı kullanılarak (Griffin, UK) çalkalanmıştır. Bu şekilde hazırlanan karışım kaba filtre kağıdından geçirilerek 50 ml lik balon jojelere süzülmüştür. Elde edilen süzüntünün üzeri % 5 lik triklor asetik asit (TCA) ile 50 ml ye tamamlanmıştır. 10

12 Ekstraktların türevlendirilmesi te açıklandığı şekilde hazırlanan örnek ekstraktlarından 400 µl alınarak alüminyum folyo ile sarılmış olan 10 ml lik kapaklı santrifüj tüplerine aktarılmış ve üzerlerine 400 µl sodyum karbonat çözeltisi ilave edildikten sonra tüp karıştırıcıda karıştırılmıştır. Karışımların üzerine 400 µl dansil klorür ilave edilip tekrar karıştırıldıktan sonra 30 dakika süreyle 40 o C lık su banyosunda bekletilmiştir. Kalan dansil klorürü uzaklaştırmak için 200 µl sodyum glutamat eklenmiş, karıştırıldıktan sonra tekrar 60 dakika süreyle 40 o C lık su banyosunda bekletilmiştir. Su banyosunda bekletme sürecinde tüpler 15 dakika aralıkla tüp karıştırıcıda karıştırılmıştır. Bu sürenin bitiminde 1 ml asetonitril ilave edilerek örnekler 3500 devirde 20 dakika süreyle santrifüj edilmişler, santrifüj sonunda elde edilen süpernatantlar ependorf tüplerine alınarak HPLC analizi için 20 o C da muhafaza edilmişlerdir (Eerola et al. 1993). 11

13 4. ANALİZ VE BULGULAR 4.1 Mikrobiyolojik Sayım Sonuçları Toplam mezofilik aerobik bakteri sayımı Zeytin örneklerinde belirlenen toplam mezofilik aerobik bakteri sayım sonuçları çizelge 4.1 de verilmiştir. Çizelge 4.1 Zeytin örneklerinde belirlenen TMAB sayım sonuçları (log kob/g) TOPLAM MEZOFİLİK AEROBİK BAKTERİ SİYAH YEŞİL Zeytin Tipi Örnek No. Zeytin Tipi Örnek No. AÇIK PASTÖRİZE STERİLİZE VAKUM PAKET 1 (Sele) 5,82 21 (Çizik) <2,00 2 (Sele) 4,64 22 (Çizik) 5,88 3 (Sele) 3,52 23 (Çizik) 5,12 4 (Gemlik) 5,02 24 (Çizik) 4,64 5 (Gemlik) 5,08 25 (Biberli) <2,00 6 (Gemlik) 4,94 26 (Biberli) <2,00 7 (Kalamata) 5,25 27 (Biberli) 5,00 8 (Kalamata) 6,83 28 (Biberli) <2,00 AÇIK 9 (Kalamata) 4,11 29 (Kokteyl) 3,56 10 (Edremit) 6,03 30 (Kokteyl) 5,96 11 (Akhisar) 4,66 31 (Kokteyl) <2,00 12 (Ezme) <2,00 32 (Kokteyl) 4,47 13 (Ezme) <2,00 33 (Kırma) 4,83 14 (Sele) <2,00 34 (Kırma) 4,01 15 (Kalamata) <2,00 35 (Kırma) 5,03 16 (Dilimlenmiş) <2,00 36 (Domat) 5,37 17 (Konserve) <2,00 37 (Ezme) <2,00 18 (Konserve) <2,00 38 (Ezme) <2,00 19 (Konserve) <2,00 PASTÖRİZE 39 (Kırma) <2,00 20 (Gemlik) 4,00 40 (Dilimlenmiş) <2,00 12

14 Açık tipteki siyah zeytin örneklerinde toplam mezofilik aerobik bakteri sayısı (TMAB) 3,52-6,83 log kob/g arasında, vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde ise 4,00 log kob/g olarak belirlenmiştir. Açık tipteki yeşil zeytin örneklerinde TMAB sayısı < 2-5,88 log kob/g olarak saptanmıştır (Çizelge 4.1). Sterilize ve pastörize siyah zeytin örneklerinde ve pastörize yeşil zeytin örneklerinde TMAB sayısı < 2 log kob/g olarak bulunmuştur (Çizelge 4.1). Türk Gıda Kodeksi Mikrobiyolojik Kriterler Tebliği (Anonim 2001) ne göre turşu ve salamura ürünlerde TMAB sayısı için limit değer 1,0 x 10 5 /g olarak verilmiştir. Buna göre analiz edilen 40 adet zeytin örneğinin 11 adedinde TMAB sayısının limit değerin üzerinde olduğu anlaşılmıştır Enterobakteri sayımı Ticari olarak satışa sunulan zeytin örneklerinde yapılan enterobakteri sayım sonuçlarına göre, tüm örneklerde belirlenen enterobakteri sayısı 2 log kob/g dan düşük bulunmuştur Maya ve küf sayımı Zeytin örneklerinde belirlenen maya sayım sonuçları çizelge 4.2 de verilmiştir 13

15 Çizelge 4.2 Zeytin örneklerinde belirlenen maya sayım sonuçları (log kob/g) MAYA* SİYAH YEŞİL Zeytin Tipi Örnek No. Zeytin Tipi Örnek No. 1 (Sele) 5,32 21 (Çizik) <2,00 2 (Sele)** 4,32 22 (Çizik) 5,82 3 (Sele) 3,30 23 (Çizik) 5,00 4 (Gemlik) 4,97 24 (Çizik) 4,60 5 (Gemlik) 5,03 25 (Biberli) <2,00 AÇIK 6 (Gemlik)** 3,96 26 (Biberli) <2,00 7 (Kalamata) 5,20 27 (Biberli) 4,87 8 (Kalamata) 6,65 28 (Biberli) <2,00 AÇIK 9 (Kalamata) 4,11 29 (Kokteyl) <2,00 10 (Edremit)** 5,88 30 (Kokteyl) 5,28 11 (Akhisar) 4,07 31 (Kokteyl) <2,00 12 (Ezme) <2,00 32 (Kokteyl) 4,00 13 (Ezme) <2,00 33 (Kırma) 4,81 PASTÖRİZE 14 (Sele) <2,00 34 (Kırma) 3,88 15 (Kalamata) <2,00 35 (Kırma) 4,68 16 (Dilimlenmiş) <2,00 36 (Domat) 4,47 17 (Konserve) <2,00 37 (Ezme) <2,00 STERİLİZE 18 (Konserve) <2,00 38 (Ezme) <2,00 19 (Konserve) <2,00 PASTÖRİZE 39 (Kırma) <2,00 VAKUM 20 (Gemlik) 40 (Dilimlenmiş) <2,00 3,99 PAKET * Bu sonuçlar maya değerlerine ait olup örneklerde küf bulgusuna rastlanmamıştır. **Bu 3 örnekte küf belirlenmiştir. Açık tipteki siyah zeytin örneklerinde maya sayım sonuçları 3,30-6,65 log kob/g aralığında belirlenirken, vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde 3,39 log kob/g olarak saptanmıştır. Pastörize ve sterilize siyah zeytin örneklerinde ise maya bulgusuna rastlanmamıştır (Çizelge 4.2). Açık tipteki yeşil zeytin örneklerinde maya sayısı < 2-5,82 log kob/g aralığında değişim gösterirken, pastörize yeşil zeytin örneklerinde 2 log kob/g dan daha az olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2). 14

16 Küf sayım sonuçları yalnızca 2 (sele), 6 (gemlik) ve 10 (edremit) nolu açık tipteki siyah zeytin örneklerinde, sırasıyla 3,62, 3,85, 3,11 log kob/g olarak saptanmıştır. Diğer zeytin örneklerinde ise küf bulgusuna rastlanmamıştır. 4.2 Biyojen Amin Analiz Sonuçları HPLC yöntemi kullanılarak, piyasada ticari olarak satışa sunulan çeşitli tipteki zeytin örneklerinde triptamin (TRP), feniletilamin (FEA), putresin (PUT), kadaverin (KAD), histamin (HIS), tiramin (TRA), spermidin (SPD) ve spermin (SPM) biyojen aminlerinin düzeyleri belirlenmiştir. Denemede tüm biyojen aminler çok iyi bir şekilde ayrılmış olup şekil 4.1 de biyojen aminlerin geliş zamanları ve sıraları, şekil 4.2 de ise bir zeytin örneğindeki biyojen amin içeriklerini gösteren kromotogramlar verilmiştir. Şekil 4.1 Standart biyojen aminlerin geliş sırası ve sürelerini gösteren kromatogram 15

17 Şekil 4.2 Zeytin örneğindeki biyojen aminleri gösteren kromatogram Tekrarlanabilirlik değeri standart çözeltilerin dört kez enjeksiyonu ile elde edilmiştir. Normalde bu değer her zaman % 1 den düşük olmaktadır ve bizim sonuçlarımızda da bu değerin altında saptanmıştır. Araştırmada kullanılan yöntemin doğruluğunun göstergesi olan ekstraksiyon yönteminin geri kazanım oranı % 91 olarak bulunmuştur. Çizelge 4.3 te eğim (slope), kesim (intercept), korelasyon katsayılarıyla (r) verilerin doğrusallığı gösterilmektedir. 16

18 Çizelge 4.3 Verilerin doğrusallığı Biyojen amin Eğim (Slope) Kesim (İntercept) Korelasyon katsayısı (r) Triptamin ,9996 Feniletilamin ,9932 Putresin ,9973 Kadaverin ,9960 Histamin ,3 0,9976 Tiramin ,9985 Spermidin ,9969 Spermin ,9970 Yapılan analizler sonucu biyojen aminlerin teşhis limitleri 0,045 mg/kg TRP; 0,050 mg/kg FEA; 0,015 mg/kg PUT; 0,010 mg/kg KAD; 0,015 mg/kg HIS; 0,020 mg/kg TRA; 0,050 mg/kg SPD ve 0,050 mg/kg SPM olarak saptanmıştır Triptamin miktarı Zeytin örneklerinde belirlenen triptamin miktarları çizelge 4.4 te verilmiştir. 17

19 Çizelge 4.4 Zeytin örneklerinde triptamin miktarları (mg/kg) TRİPTAMİN SİYAH YEŞİL Zeytin Tipi Örnek No. Zeytin Tipi Örnek No. 1 (Sele) ND 21 (Çizik) 3,571 2 (Sele) 0, (Çizik) 2,674 3 (Sele) ND 23 (Çizik) 0,362 4 (Gemlik) 1, (Çizik) ND 5 (Gemlik) ND 25 (Biberli) 2,618 AÇIK 6 (Gemlik) 0, (Biberli) 1,450 7 (Kalamata) 4, (Biberli) 2,638 8 (Kalamata) ND 28 (Biberli) 4,373 AÇIK 9 (Kalamata) 6, (Kokteyl) 2, (Edremit) ND 30 (Kokteyl) 3, (Akhisar) 4, (Kokteyl) 4, (Ezme) 4, (Kokteyl) 3, (Ezme) 0, (Kırma) 0,455 PASTÖRİZE 14 (Sele) ND 34 (Kırma) 3, (Kalamata) 3, (Kırma) 1, (Dilimlenmiş) 1, (Domat) 4, (Konserve) 3, (Ezme) ND STERİLİZE 18 (Konserve) 1, (Ezme) ND 19 (Konserve) 4,162 PASTÖRİZE 39 (Kırma) 0,736 VAKUM 20 (Gemlik) 40 (Dilimlenmiş) PAKET 0,246 3,046 ND: Belirlenemedi En yüksek triptamin miktarı açık tipteki siyah zeytinlerde 9 nolu örnekte 6,705 mg/kg, pastörize siyah zeytinlerde 12 nolu örnekte 4,835 mg/kg, sterilize siyah zeytinlerde 19 nolu örnekte 4,162 mg/kg ve vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde (20 nolu örnek) 0,246 mg/kg olarak belirlenmiştir. En düşük triptamin miktarı ise 0,079 mg/kg olarak 6 nolu örnekte bulunmuştur. 1, 3, 5, 8, 10 ve 14 nolu örneklerde ise triptamine rastlanmamıştır (Çizelge 4.4). Açık tipteki yeşil zeytin örneklerindeki triptamin miktarı 31 nolu örnekte 4,492 mg/kg, pastörize yeşil zeytinlerde ise 40 nolu örnekte 3,046 mg/kg olarak belirlenmiştir. Yeşil zeytin örneklerinde bulunan en düşük triptamin miktarı ise 0,362 mg/kg olarak 23 nolu 18

20 (çizik) örnekte tespit edilirken; 24, 37 ve 38 nolu örneklerde triptamin belirlenememiştir (Çizelge 4.4). Yapılan bu çalışmada zeytin örneklerinde belirlenen biyojen amin miktarları dikkate alındığında; belirlenen triptamin aralığının yeşil ve siyah zeytin örneklerinde 0-6,705 mg/kg arasında değişim gösterdiği görülmüştür (Çizelge 4.4) Feniletilamin miktarı Zeytin örneklerinde belirlenen feniletilamin miktarları çizelge 4.5 te verilmiştir. 19

21 Çizelge 4.5 Zeytin örneklerinde feniletilamin miktarları (mg/kg) FENİLETİLAMİN SİYAH YEŞİL Zeytin Tipi Örnek No. Zeytin Tipi Örnek No. 1 (Sele) 0, (Çizik) 0,541 2 (Sele) 2, (Çizik) 1,358 3 (Sele) 0, (Çizik) 0,473 4 (Gemlik) 0, (Çizik) ND 5 (Gemlik) ND 25 (Biberli) 1,189 AÇIK 6 (Gemlik) 0, (Biberli) 0,696 7 (Kalamata) 0, (Biberli) 0,960 8 (Kalamata) 1, (Biberli) 1,866 AÇIK 9 (Kalamata) 0, (Kokteyl) 0, (Edremit) 0, (Kokteyl) ND 11 (Akhisar) 1, (Kokteyl) 0, (Ezme) 0, (Kokteyl) 1, (Ezme) 0, (Kırma) 0,418 PASTÖRİZE 14 (Sele) ND 34 (Kırma) 0, (Kalamata) 0, (Kırma) 1, (Dilimlenmiş) 0, (Domat) 1, (Konserve) 0, (Ezme) 0,853 STERİLİZE 18 (Konserve) 0, (Ezme) ND 19 (Konserve) 0,936 PASTÖRİZE 39 (Kırma) 0,931 VAKUM 20 (Gemlik) 40 (Dilimlenmiş) PAKET 0,630 0,911 ND: Belirlenemedi En yüksek feniletilamin miktarı açık tipteki siyah zeytinlerde 2 nolu örnekte 2,295 mg/kg, pastörize siyah zeytinlerde 13 nolu örnekte 0,958 mg/kg, sterilize siyah zeytinlerde 19 nolu örnekte 0,936 mg/kg ve vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde (20 nolu örnek) 0,630 mg/kg olarak belirlenmiştir. En düşük feniletilamin miktarı 0,438 mg/kg olarak 18 nolu konserve siyah zeytin örneğinde bulunmuş, 5 nolu (gemlik) ve 14 nolu (sele) örneklerde ise feniletilamine rastlanmamıştır (Çizelge 4.5). Pastörize yeşil zeytin örneklerinde en yüksek feniletilamin miktarı 39 nolu (kırma) örnekte 0,931 mg/kg, açık tipteki yeşil zeytin örneklerinde 28 nolu (biberli) örnekte 1,866 mg/kg olarak bulunmuştur. Yeşil zeytin örneklerinde en düşük feniletilamin 20

22 miktarı ise 29 nolu (kokteyl) örnekte 0,352 mg/kg olarak belirlenirken; 24, 30 ve 38 nolu örneklerde ise feniletilamin tespit edilememiştir (Çizelge 4.5). Denemede feniletilamin miktarının zeytin örneklerinde 0-2,295 mg/kg aralığında olduğu belirlenmiştir (Çizelge 4.5). Hornero-Mendez ve Garrido-Fernández (1997) zeytin salamurasında feniletilamin miktarını 1,78 µg/ml olarak saptamışlardır. Elde ettiğimiz değerlerin Hornero-Mendez ve Garrido-Fernández (1997) tarafından belirlenen feniletilamin değeri ile benzerlik gösterdiği, ayrıca literatürde belirtilen ve toksik limit olan 30 mg/kg feniletilamin (Nout 1994) miktarından düşük olduğu anlaşılmıştır Putresin miktarı Zeytin örneklerinde belirlenen putresin miktarları çizelge 4.6 da verilmiştir. 21

23 Çizelge 4.6 Zeytin örneklerinde putresin miktarları (mg/kg) PUTRESİN SİYAH YEŞİL Zeytin Tipi Örnek No. Zeytin Tipi Örnek No. 1 (Sele) 0, (Çizik) ND 2 (Sele) 0, (Çizik) ND 3 (Sele) 0, (Çizik) 0,200 4 (Gemlik) ND 24 (Çizik) 0,149 5 (Gemlik) 0, (Biberli) 0,169 AÇIK 6 (Gemlik) 0, (Biberli) 0,315 7 (Kalamata) 1, (Biberli) 0,181 8 (Kalamata) 0, (Biberli) 0,343 AÇIK 9 (Kalamata) 0, (Kokteyl) 0, (Edremit) 0, (Kokteyl) 0, (Akhisar) 0, (Kokteyl) 0, (Ezme) 0, (Kokteyl) 0, (Ezme) 0, (Kırma) ND PASTÖRİZE 14 (Sele) 0, (Kırma) ND 15 (Kalamata) 0, (Kırma) ND 16 (Dilimlenmiş) 0, (Domat) 0, (Konserve) 0, (Ezme) 0,315 STERİLİZE 18 (Konserve) ND 38 (Ezme) ND 19 (Konserve) ND PASTÖRİZE 39 (Kırma) 0,179 VAKUM 20 (Gemlik) 40 (Dilimlenmiş) PAKET 0,198 ND ND: Belirlenemedi Putresin miktarının en yüksek değerleri açık tipteki siyah zeytinlerde 7 nolu örnekte 1,605 mg/kg, pastörize siyah zeytinlerde 12 nolu örnekte 0,425 mg/kg, sterilize siyah zeytinlerde 17 nolu örnekte 0,189 mg/kg ve vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde (20 nolu örnek) 0,198 mg/kg olarak belirlenmiştir. En düşük putresin miktarı 13 nolu ezme örneğinde 0,153 mg/kg olarak tespit edilmiştir. 4, 18 ve 19 nolu örneklerde ise putresin varlığına rastlanmamıştır (Çizelge 4.6). Açık tipteki yeşil zeytin örneklerindeki en yüksek putresin miktarı 28 nolu örnekte 0,343 mg/kg, pastörize yeşil zeytinlerde ise 37 nolu örnekte 0,315 mg/kg olarak saptanmıştır. Yeşil zeytin örneklerinde en düşük putresin miktarı 0,149 mg/kg ile 24 22

24 nolu (çizik) örnekte belirlenirken; 21, 22, 33, 34, 35, 38 ve 40 nolu örneklerde ise putresin tespit edilememiştir (Çizelge 4.6). Araştırmamızda yeşil ve siyah zeytin örneklerinde belirlenen putresin miktarı 0-1,605 mg/kg aralığında değişim göstermektedir (Çizelge 4.6). Hornero-Mendez ve Garrido-Fernández (1997), HPLC tekniği ile yürüttükleri çalışmalarında zeytin salamurasında putresin miktarını 42,94 µg/ml olarak tespit etmişlerdir. García-García et al. (2000), HPLC yöntemi ile sofralık zeytinlerin meyve ve salamuralarındaki biyojen amin miktarlarını belirlemişlerdir. İncelenen tüm örneklerde putresin içeriğinin çeşitlilik gösterdiğini tespit etmişlerdir. Bu durumun farklı tip zeytinlerin üretiminde farklı işlem koşulları arasındaki ve kendiliğinden meydana gelen laktik asit fermentasyonu sırasında populasyonlar ve mikroorganizmalar arasındaki farklılığa bağlı olabileceğini ileri sürmüşlerdir. Fermantasyon süresince en yüksek miktara sahip biyojen aminin meyvede 46,3 mg/kg, salamurada ise 64,4 mg/l olarak belirlenen putresin olduğunu bildirmişlerdir. García-García et al. (2001) tarafından yapılan bir çalışmada, işlenmemiş siyah zeytinlerde 50 mg/kg olarak belirlenen putresinin diğer biyojen aminlerden daha yüksek konsantrasyona sahip olduğunu ve ayrıca yeşil zeytin örneklerinde de putresin düzeyinin 18 mg/kg dan daha düşük olduğunu saptamışlardır. García-García et al. (2004), fermente yeşil sofralık zeytinlerin depolama süresince Zapatera tipi bozulma ile ilişkili biyojen amin oluşumunu araştırmışlar, depolama başlangıcında putresin konsantrasyonunu 38 mg/l olarak belirlemişler ve bu miktarın depolama süresince değişmediğini gözlemlemişlerdir. Araştırmadan elde edilen sonuçlar diğer çalışmalarla karşılaştırıldığında putresin için saptanan değerlerin diğer çalışmalarda bulunan değerlerden daha düşük olduğu 23

25 anlaşılmıştır. Ayrıca putresin için belirlenen ve 396 mg/kg (Stratton et al. 1991) olan toksik limitin de altında olduğu görülmüştür Kadaverin miktarı Zeytin örneklerinde belirlenen kadaverin miktarları çizelge 4.7 de verilmiştir. Çizelge 4.7 Zeytin örneklerinde kadaverin miktarları (mg/kg) KADAVERİN SİYAH YEŞİL Zeytin Tipi Örnek No. Zeytin Tipi Örnek No. 1 (Sele) 0, (Çizik) ND 2 (Sele) 0, (Çizik) ND 3 (Sele) ND 23 (Çizik) 0,039 4 (Gemlik) ND 24 (Çizik) 0,032 5 (Gemlik) 0, (Biberli) 0,043 AÇIK 6 (Gemlik) 0, (Biberli) 0,031 7 (Kalamata) 0, (Biberli) 0,040 8 (Kalamata) 0, (Biberli) 0,097 AÇIK 9 (Kalamata) 0, (Kokteyl) 0, (Edremit) ND 30 (Kokteyl) 0, (Akhisar) 0, (Kokteyl) 0, (Ezme) 0, (Kokteyl) 0, (Ezme) ND 33 (Kırma) ND PASTÖRİZE 14 (Sele) 0, (Kırma) 0, (Kalamata) 0, (Kırma) ND 16 (Dilimlenmiş) 0, (Domat) 0, (Konserve) 0, (Ezme) 0,195 STERİLİZE 18 (Konserve) ND 38 (Ezme) ND 19 (Konserve) ND PASTÖRİZE 39 (Kırma) 0,043 VAKUM 20 (Gemlik) 40 (Dilimlenmiş) PAKET 0,030 0,111 ND: Belirlenemedi En yüksek kadaverin miktarı açık tipteki siyah zeytinlerde 2 nolu örnekte 0,903 mg/kg, pastörize siyah zeytinlerde 14 nolu örnekte 0,150 mg/kg, sterilize siyah zeytinlerde 17 24

26 nolu örnekte 0,050 mg/kg ve vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde (20 nolu örnek) 0,030 mg/kg olarak belirlenmiştir. Siyah zeytin örneklerinde tespit edilen en düşük kadaverin miktarı 5 nolu (gemlik) zeytin örneğinde 0,029 mg/kg olarak bulunmuş ve 3, 4, 10, 13, 18 ve 19 nolu örneklerde ise kadaverine rastlanmamıştır (Çizelge 4.7). Açık tipteki yeşil zeytin örneklerindeki kadaverin miktarı 31 nolu (kokteyl) örnekte 0,097 mg/kg, pastörize yeşil zeytinlerde ise 37 nolu (ezme) örnekte 0,195 mg/kg olarak bulunmuştur. En düşük kadaverin miktarı 26 nolu (biberli) ve 29 nolu (kokteyl) örneklerde 0,031 mg/kg olarak saptanırken; 21, 22, 33, 35 ve 38 nolu örneklerde kadaverin belirlenememiştir (Çizelge 4.7). Zeytin örneklerinde belirlenen kadaverin miktarları, 0-0,903 mg/kg aralığında bulunmuştur (Çizelge 4.7). Hornero-Mendez ve Garrido-Fernández (1994), Zapatera tipi bozulma görülen yeşil zeytinlerle yaptıkları çalışmalarında kadaverin miktarını 8,29 µg/ml olarak tespit etmişlerdir. Hornero-Mendez ve Garrido-Fernández (1997) tarafından yapılan başka bir çalışmada ise zeytin salamurasındaki kadaverin miktarı 15,62 µg/ml olarak saptanmıştır. García-García et al. (2000), yürüttükleri diğer bir çalışmada sofralık zeytinlerde 12 aylık fermantasyonun sonunda kadaverin miktarının 10 mg/l nin altında olduğunu belirlemişlerdir. Denemede zeytin örneklerinden elde edilen sonuçların, yapılan araştırmalarda belirlenen kadaverin miktarlarından daha düşük olduğu anlaşılmıştır (Çizelge 4.7) Histamin miktarı Zeytin örneklerinde belirlenen histamin miktarları çizelge 4.8 de verilmiştir. 25

27 Çizelge 4.8 Zeytin örneklerinde histamin miktarları (mg/kg) HİSTAMİN SİYAH YEŞİL Zeytin Tipi Örnek No. Zeytin Tipi Örnek No. 1 (Sele) 0, (Çizik) ND 2 (Sele) ND 22 (Çizik) ND 3 (Sele) 0, (Çizik) 0,018 4 (Gemlik) 0, (Çizik) ND 5 (Gemlik) 0, (Biberli) ND AÇIK 6 (Gemlik) 0, (Biberli) ND 7 (Kalamata) ND 27 (Biberli) ND 8 (Kalamata) 0, (Biberli) ND AÇIK 9 (Kalamata) 0, (Kokteyl) 0, (Edremit) ND 30 (Kokteyl) ND 11 (Akhisar) 0, (Kokteyl) 0, (Ezme) 0, (Kokteyl) 0, (Ezme) 0, (Kırma) ND PASTÖRİZE 14 (Sele) ND 34 (Kırma) ND 15 (Kalamata) ND 35 (Kırma) ND 16 (Dilimlenmiş) 0, (Domat) 0, (Konserve) 0, (Ezme) 0,108 STERİLİZE 18 (Konserve) ND 38 (Ezme) 0, (Konserve) 0,021 PASTÖRİZE 39 (Kırma) ND VAKUM 20 (Gemlik) 40 (Dilimlenmiş) PAKET 0,166 0,016 ND: Belirlenemedi Histamin miktarının en yüksek değerleri açık tipteki siyah zeytinlerde 4 nolu örnekte 0,241 mg/kg, pastörize siyah zeytinlerde 13 nolu örnekte 0,075 mg/kg, sterilize siyah zeytinlerde 17 nolu örnekte 0,037 mg/kg ve vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde (20 nolu örnek) 0,166 mg/kg olarak belirlenmiştir. En düşük histamin miktarı 0,011 mg/kg ile 12 nolu ezme örneğinde bulunurken; 2, 7, 10, 14, 15 ve 18 nolu örneklerde ise histamin varlığına rastlanmamıştır (Çizelge 4.8). Açık tipteki yeşil zeytin örneklerindeki en yüksek histamin miktarı 29 nolu örnekte 0,039 mg/kg, pastörize yeşil zeytinlerde ise 38 nolu örnekte 0,182 mg/kg olarak saptanmıştır. Yeşil zeytin örneklerinde belirlenen en düşük histamin değeri 31 nolu 26

28 (kokteyl) ve 40 nolu (dilimlenmiş) örneklerde 0,016 mg/kg olarak tespit edilmiştir. 21, 22, 24, 25, 26, 28, 30, 33, 34, 35 ve 39 nolu örneklerde ise histamin belirlenememiştir (Çizelge 4.8). Bu çalışmada zeytin örneklerinde histamin miktarı 0-0,241 mg/kg aralığında bulunmuştur (Çizelge 4.8). Inigo ve Bravo-Abad (1983), histamin konsantrasyonunun fermente yeşil sofralık zeytinlerde 0,5-2,0 ppm olarak saptamışlar, bozulmuş zeytinlerde ise 5,0 ppm in üzerine çıktığını belirlemişlerdir. Hornero-Mendez ve Garrido- Fernández (1994) ise Zapatera tipi bozulma görülen yeşil zeytinlerde yaptıkları çalışmalarında histamini tespit edememişlerdir. Araştırmamızda elde edilen histamin miktarlarının yapılan diğer çalışmalarda belirlenen histamin miktarlarından daha düşük değerlerde olduğu ve aynı zamanda toksik limit olan 100 mg/kg histamin (ten Brink et al. 1990) düzeyinin de altında bulunduğu anlaşılmıştır Tiramin miktarı Zeytin örneklerinde belirlenen tiramin miktarları çizelge 4.9 da verilmiştir. 27

29 Çizelge 4.9 Zeytin örneklerinde tiramin miktarları (mg/kg) TİRAMİN SİYAH YEŞİL Zeytin Tipi Örnek No. Zeytin Tipi Örnek No. 1 (Sele) ND 21 (Çizik) 0,116 2 (Sele) 6, (Çizik) ND 3 (Sele) 0, (Çizik) 0,184 4 (Gemlik) 0, (Çizik) ND 5 (Gemlik) ND 25 (Biberli) 0,260 AÇIK 6 (Gemlik) ND 26 (Biberli) 0,724 7 (Kalamata) 0, (Biberli) 0,310 8 (Kalamata) 0, (Biberli) 0,679 AÇIK 9 (Kalamata) 2, (Kokteyl) 0, (Edremit) ND 30 (Kokteyl) 0, (Akhisar) 0, (Kokteyl) 0, (Ezme) 0, (Kokteyl) 0, (Ezme) 0, (Kırma) ND PASTÖRİZE 14 (Sele) ND 34 (Kırma) 0, (Kalamata) 0, (Kırma) 0, (Dilimlenmiş) 0, (Domat) 0, (Konserve) 0, (Ezme) ND STERİLİZE 18 (Konserve) ND 38 (Ezme) ND 19 (Konserve) ND PASTÖRİZE 39 (Kırma) 0,038 VAKUM 20 (Gemlik) 40 (Dilimlenmiş) PAKET ND 0,103 ND: Belirlenemedi En yüksek tiramin miktarı açık tipteki siyah zeytinlerde 2 nolu örnekte 6,230 mg/kg, pastörize siyah zeytinlerde 13 nolu örnekte 0,763 mg/kg, sterilize siyah zeytinlerde 17 nolu örnekte 0,422 mg/kg olarak bulunurken, vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde (20 nolu örnek) ve 1, 5, 6, 10, 14, 18 ve 19 nolu örneklerde belirlenememiştir. En düşük tiramin miktarı ise 3 nolu (sele) örnekte 0,129 mg/kg olarak tespit edilmiştir (Çizelge 4.9). Açık tipteki yeşil zeytin örneklerindeki tiramin miktarı 29 nolu (kokteyl) örnekte 0,849 mg/kg, pastörize yeşil zeytinlerde ise 40 nolu (dilimlenmiş) örnekte 0,103 mg/kg olarak bulunmuştur. Yeşil zeytin örneklerinde en düşük tiramin miktarı 39 nolu (kırma) zeytin 28

30 örneğinde 0,038 mg/kg olarak belirlenmiş ve 22, 24, 33, 37 ve 38 nolu örneklerde ise tiramine rastlanmamıştır (Çizelge 4.9). Zeytin örneklerinde belirlenen tiramin miktarı 0-6,230 mg/kg aralığındadır (Çizelge 4.9). García-García et al. (2000), 12 aylık fermantasyonun sonunda zeytin salamurasında tiramin düzeyinin 3 mg/l nin atında olduğunu tespit etmişlerdir. García-García et al. (2004), fermente yeşil sofralık zeytinlerin depolama süresince Zapatera tipi bozulma ile ilişkili biyojen amin oluşumunu araştırdıkları çalışmalarında ise depolamanın başlangıcında tiramin konsantrasyonunu 1,70 mg/l olarak belirlemişlerdir. Araştırmada 2 nolu (sele) örnekte belirlenen 6,230 mg/kg tiramin miktarı (Çizelge 4.9) Hornero-Mendez ve Garrido-Fernández (1997) in çalışmaları ile benzerlik gösterirken, genelde zeytin örneklerinde belirlenen tiramin miktarları düşük düzeylerde bulunmuştur. Ayrıca mg/kg tiramin (Maijala and Eorola 1993) olan toksik limitin de altında olduğu görülmektedir Spermidin miktarı Zeytin örneklerinde belirlenen spermidin miktarları çizelge 4.10 da verilmiştir. 29

31 Çizelge 4.10 Zeytin örneklerinde spermidin miktarları (mg/kg) SPERMİDİN SİYAH YEŞİL Zeytin Tipi Örnek No. Zeytin Tipi Örnek No. 1 (Sele) 0, (Çizik) ND 2 (Sele) 0, (Çizik) 0,459 3 (Sele) 0, (Çizik) 0,459 4 (Gemlik) 0, (Çizik) 0,456 5 (Gemlik) 0, (Biberli) ND AÇIK 6 (Gemlik) ND 26 (Biberli) 0,471 7 (Kalamata) ND 27 (Biberli) 0,459 8 (Kalamata) ND 28 (Biberli) 0,469 AÇIK 9 (Kalamata) ND 29 (Kokteyl) ND 10 (Edremit) ND 30 (Kokteyl) 0, (Akhisar) 0, (Kokteyl) ND 12 (Ezme) ND 32 (Kokteyl) 0, (Ezme) ND 33 (Kırma) ND PASTÖRİZE 14 (Sele) ND 34 (Kırma) ND 15 (Kalamata) ND 35 (Kırma) ND 16 (Dilimlenmiş) 0, (Domat) 0, (Konserve) ND 37 (Ezme) 0,547 STERİLİZE 18 (Konserve) ND 38 (Ezme) ND 19 (Konserve) 0,459 PASTÖRİZE 39 (Kırma) ND VAKUM 20 (Gemlik) 40 (Dilimlenmiş) PAKET 0,461 ND ND: Belirlenemedi Spermidin miktarının en yüksek değerleri açık tipteki siyah zeytinlerde 3 nolu örnekte 0,773 mg/kg, pastörize siyah zeytinlerde 16 nolu örnekte 0,561 mg/kg, sterilize siyah zeytinlerde 19 nolu örnekte 0,459 mg/kg ve vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde (20 nolu örnek) 0,461 mg/kg olarak belirlenmiştir. En düşük spermidin değeri 19 nolu örnekte 0,459 mg/kg olarak tespit edilmiştir. 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14,15, 17 ve 18 nolu örneklerde ise spermidine rastlanmamıştır (Çizelge 4.10). Denemede spermidin miktarı yeşil ve siyah zeytin örneklerinde 0-0,773 mg/kg aralığında saptanırken (Çizelge 4.10); Hornero-Mendez ve Garrido-Fernández (1997), zeytin salamurasında spermidini belirleyemediklerini ifade etmişlerdir. Araştırmamızda 30

32 elde edilen spermidin miktarlarının genel olarak çok düşük düzeylerde olduğu gözlenmiş ve Hornero-Mendez ve Garrido-Fernández (1997) in çalışmasıyla da benzer bulunmuştur. Literatür verilerine göre spermidin miktarı ile ilgili herhangi bir toksik limit bulunmamaktadır Spermin miktarı Zeytin örneklerinde belirlenen spermin miktarları çizelge 4.11 de verilmiştir. Çizelge 4.11 Zeytin örneklerinde spermin miktarları (mg/kg) SPERMİN SİYAH YEŞİL Zeytin Tipi Örnek No. Zeytin Tipi Örnek No. 1 (Sele) ND 21 (Çizik) ND 2 (Sele) ND 22 (Çizik) ND 3 (Sele) ND 23 (Çizik) ND 4 (Gemlik) ND 24 (Çizik) ND 5 (Gemlik) ND 25 (Biberli) ND AÇIK 6 (Gemlik) ND 26 (Biberli) 0,434 7 (Kalamata) ND 27 (Biberli) 0,437 8 (Kalamata) ND 28 (Biberli) 0,437 AÇIK 9 (Kalamata) ND 29 (Kokteyl) ND 10 (Edremit) ND 30 (Kokteyl) 0, (Akhisar) ND 31 (Kokteyl) ND 12 (Ezme) ND 32 (Kokteyl) ND 13 (Ezme) ND 33 (Kırma) ND PASTÖRİZE 14 (Sele) ND 34 (Kırma) ND 15 (Kalamata) ND 35 (Kırma) 0, (Dilimlenmiş) 0, (Domat) ND 17 (Konserve) 0, (Ezme) ND STERİLİZE 18 (Konserve) ND 38 (Ezme) ND 19 (Konserve) ND PASTÖRİZE 39 (Kırma) ND VAKUM 20 (Gemlik) 40 (Dilimlenmiş) PAKET ND 0,526 ND: Belirlenemedi Pastörize siyah zeytinlerde sadece 16 nolu örnekte 0,444 mg/kg, sterilize siyah zeytinlerde ise 17 nolu örnekte 0,431 mg/kg spermin tespit edilirken; açık tipteki siyah 31

33 zeytin örneklerinde ve vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde spermin belirlenememiştir (Çizelge 4.11). Açık tipteki yeşil zeytin örneklerindeki spermin miktarı 35 nolu (kırma) örnekte 0,455 mg/kg, pastörize yeşil zeytinlerde ise sadece 40 nolu (dilimlenmiş) örnekte 0,526 mg/kg olarak bulunmuştur. En düşük spermin değeri 26 nolu (biberli) örnekte 0,434 mg/kg olarak belirlenirken; 21, 22, 23, 24, 25, 29, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38 ve 39 nolu örneklerde ise spermin varlığına rastlanmamıştır (Çizelge 4.11). Bu çalışmada zeytin örneklerinde spermin aralığı 0-0,526 mg/kg olarak tespit edilmiştir (Çizelge 4.11). Hornero-Mendez ve Garrido-Fernández (1997) ise zeytin salamurasında spermin varlığına rastlamadıklarını belirtmişlerdir. Araştırmadan elde edilen sonuçlar Hornero-Mendez ve Garrido-Fernández (1997) in çalışmasıyla benzerlik gösterirken, belirlenen spermin miktarlarının da çok düşük düzeylerde olduğu anlaşılmıştır Toplam biyojen amin miktarı Zeytin örneklerinde belirlenen toplam biyojen amin miktarları çizelge 4.12 de verilmiştir. Piyasadan satın alınan çeşitli tipteki zeytin örneklerinde yapılan analizler sonucu en yüksek toplam biyojen amin miktarı 2 nolu örnekte 10,425 mg/kg, en düşük toplam biyojen amin miktarı ise 38 nolu örnekte 0,182 mg/kg olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.12). 32

34 Çizelge 4.12 Zeytin örneklerinde toplam biyojen amin miktarları (mg/kg) TOPLAM BİYOJEN AMİN SİYAH YEŞİL Zeytin Tipi Örnek No. Zeytin Tipi Örnek No. AÇIK PASTÖRİZE STERİLİZE VAKUM PAKET 1 (Sele) 1, (Çizik) 4,228 2 (Sele) 10, (Çizik) 4,491 3 (Sele) 1, (Çizik) 1,735 4 (Gemlik) 2, (Çizik) 0,637 5 (Gemlik) 0, (Biberli) 4,279 6 (Gemlik) 0, (Biberli) 4,121 7 (Kalamata) 7, (Biberli) 5,025 8 (Kalamata) 1, (Biberli) 8,264 AÇIK 9 (Kalamata) 10, (Kokteyl) 3, (Edremit) 0, (Kokteyl) 4, (Akhisar) 6, (Kokteyl) 5, (Ezme) 6, (Kokteyl) 5, (Ezme) 2, (Kırma) 0, (Sele) 0, (Kırma) 4, (Kalamata) 4, (Kırma) 3, (Dilimlenmiş) 3, (Domat) 6, (Konserve) 5, (Ezme) 2, (Konserve) 1, (Ezme) 0, (Konserve) 5,578 PASTÖRİZE 39 (Kırma) 1, (Gemlik) 1, (Dilimlenmiş) 4,713 Araştırmada çeşitli tipteki zeytin örneklerinin hemen hemen tümünde, farklı düzey ve çeşitlilikte triptamin, feniletilamin, putresin, kadaverin, histamin, tiramin, spermidin ve spermin biyojen aminleri saptanmıştır. Bu biyojen aminler içerisinde en yüksek konsantrasyona sahip olanlar, sırasıyla, triptamin (6,705 mg/kg 9 nolu (kalamata) örnek), tiramin (6,230 mg/kg 2 nolu (sele) örnek) ve feniletilamin (2,295 mg/kg 2 nolu (sele) örnek) olarak belirlenmiştir. García-García et al. (2001) ticari olarak satışa sunulan zeytinlerin biyojen amin içeriklerinin dağılımını, ortalama olarak, putresin için 18,6 ppm, kadaverin için 1,1 ppm ve tiramin için 0,5 ppm olarak belirlemişlerdir. Doğal siyah zeytinlerdeki toplam 33

35 biyojen amin miktarlarının her zaman toksik limit olan 100 mg/kg değerinin altında olduğunu ifade etmişlerdir. Araştırmada kullanılan zeytin örneklerinin üretim şekillerindeki farklılıklara rağmen elde edilen biyojen amin sonuçları arasında büyük farklılıklar olmadığı ve genel olarak yapılan çalışmalara göre belirlediğimiz biyojen amin sonuçlarının düşük düzeylerde olduğu görülmüştür. Bunun nedeninin García-García et al. (2001) un da belirttiği gibi fermantasyondan sonra salamuranın değiştirilmesi, zeytinlerin yıkanması ve salamurasız olarak tüketime sunulması sonucu biyojen amin içeriklerinde meydana gelen seyrelmelerden kaynaklanmış olabileceği düşünülmektedir. Araştırmamızda 3 adet konserve zeytin örneğinde (17, 18 ve 19 nolu örnekler) García- García et al. (2001) un belirledikleri sonuçların aksine toplam biyojen amin değerleri sırasıyla 5,024, 1,697 ve 5,578 mg/kg olarak saptanmıştır (Çizelge 4.12). Biyojen amin değerleri mikrobiyolojik analiz sonuçlarıyla karşılaştırıldığında aralarında mikrobiyolojik bulgulara bağlı düzenli bir artış veya azalma olmadığı belirlenmiştir. Zeytin tiplerindeki farklılıklar ele alındığında ise zeytin örneklerinin siyah yada yeşil olmasının biyojen amin oluşumunda büyük değişikliklere yol açmadığı sonucuna varılmıştır. Araştırmada incelenen örneklerde genel olarak biyojen amin içerikleri çok düşük düzeylerde bulunmuştur. Bunun nedeni olarak belirlenen biyojen aminlerin mikrobiyolojik bozulmayla değil, daha çok fermentasyon aşamasındaki işlemlerden yada zeytin meyvesinde doğal olarak bulunmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Pastörize ve sterilize örneklerde TMAB ve maya-küf sayısı < 2 log kob/mg olmasına rağmen bu örneklerde tespit edilen biyojen amin miktarlarıyla açık tip örneklerde belirlenen biyojen amin miktarları arasında büyük farklılıkların bulunmadığı söylenebilir. 34

36 Sonuç olarak genel bir değerlendirme yaptığımızda; 1 Açık tipteki siyah zeytin örneklerinde toplam mezofilik aerobik bakteri sayısı (TMAB) 3,52-6,83 log kob/g arasında, vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde ise 4,00 log kob/g olarak belirlenmiştir. Açık tipteki yeşil zeytin örneklerinde TMAB sayısı < 2-5,88 log kob/g olarak saptanmıştır. Sterilize ve pastörize siyah zeytin örneklerinde ve pastörize yeşil zeytin örneklerinde TMAB sayısı < 2 log kob/g olarak bulunmuştur (Çizelge 4.1). 2 Açık tipteki siyah zeytin örneklerinde maya sayım sonuçları 3,30-6,65 log kob/g aralığında belirlenirken, vakum paketlenmiş siyah zeytin örneğinde 3,39 log kob/g olarak saptanmıştır. Pastörize ve sterilize siyah zeytin örneklerinde ise maya bulgusuna rastlanmamıştır. Açık tipteki yeşil zeytin örneklerinde maya sayısı < 2-5,82 log kob/g aralığında değişim gösterirken, pastörize yeşil zeytin örneklerinde 2 log kob/g dan daha düşük olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2). 3 Küf sayım sonuçları yalnızca 2 (sele), 6 (gemlik) ve 10 (edremit) nolu açık tipteki siyah zeytin örneklerinde, sırasıyla 3,62, 3,85, 3,11 log kob/g olarak saptanmıştır. Diğer zeytin örneklerinde ise küf bulgusuna rastlanmamıştır. 4 Ticari olarak satışa sunulan zeytin örneklerinde yapılan enterobakteri sayım sonuçlarına göre, tüm örneklerde belirlenen enterobakteri sayısı 2 log kob/g dan düşük bulunmuştur. 5 Araştırmada, zeytin örneklerinde en yüksek konsantrasyona sahip olan biyojen aminler, sırasıyla, triptamin, tiramin ve feniletilamin olarak belirlenmiştir. Belirlenen değerler içerisinde en düşük konsantrasyon aralığına sahip biyojen aminin ise histamin (0-0,241 mg/kg 4 nolu (gemlik) örnek) olduğu anlaşılmıştır. Rastlanma sıklığı en düşük biyojen aminin de spermin olduğu görülmüştür. 35

37 6 Biyojen amin değerleri mikrobiyolojik analiz sonuçlarıyla karşılaştırıldığında aralarında mikrobiyolojik bulgulara bağlı düzenli bir artış veya azalma olmadığı, zeytin tiplerindeki farklılıklar ele alındığında ise zeytin örneklerinin siyah veya yeşil olmasının biyojen amin oluşumunda büyük değişikliklere yol açmadığı sonucuna varılmıştır. 7 Pastörize ve sterilize örneklerde TMAB ve maya-küf sayısı < 2 log kob/g olmasına rağmen bu örneklerde tespit edilen biyojen amin miktarlarıyla açık tip örneklerde belirlenen biyojen amin miktarları arasında çok büyük farklılık bulunmamıştır. 8 Toksik limitler açısından bir kıyaslama yapıldığında; zeytin örneklerinde belirlenen feniletilamin, putresin, histamin, tiramin ve toplam biyojen amin miktarlarının BAI düzeyinin (396 mg/kg PUT, mg/kg HIS, mg/kg TRA, 30 mg/kg FEA ve mg/kg toplam biyojen amin) altında olduğu anlaşılmıştır. 9 Zeytin örneklerindeki biyojen amin oluşumunun fermantasyon süresince salamuradaki laktik asit bakterilerinin gelişiminden ve amino asit yapılarındaki farklılıklardan meydana gelebileceği, ayrıca örneklerin biyojen amin içeriklerinin çok düşük düzeylerde bulunmasının mikrobiyolojik bozulma sonucu değil, daha çok biyojen aminlerin zeytin meyvesinde doğal olarak bulunmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. 10 Fermantasyondan sonra zeytin salamurasının değiştirilmesi, zeytinlerin yıkanması ve salamurasız olarak tüketime sunulması sonucu biyojen amin içeriklerinde meydana gelen seyrelmeler nedeniyle analiz edilen zeytin örneklerinde genel olarak biyojen amin sonuçlarının düşük düzeylerde olduğu anlaşılmıştır. 36

38 KAYNAKLAR Akbulut, N Zeytin mikroflorası. Gıda, 6; Aktan, N. ve Kalkan, H Sofralık zeytin teknolojisi. Ege Üniversitesi Basımevi, 122 s., İzmir. Anonim Türk Gıda Kodeksi Mikrobiyolojik Kriterler Tebliği. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı. Tebliğ no: 2001/ s. Anonim Zeytincilik Araştırma Enstitüsü. Erişim Tarihi: Anonymous Oxoid Manual, Unipath LTD., Basingstonc, Hampshire, England. Anonymous Merck Manual, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland. Arıcı, Ö. ve Aktan, N Memecik ve Uslu siyah zeytin çeşitlerine uygulanan farklı salamura yöntemlerinin duyusal ve kimyasal bileşimi üzerine etkileri. Gıda, 22 (2); Başer, D. ve Kılıç, O Gemlik çeşidi zeytinlerden kaliteli ve az tuzlu siyah sofralık zeytin üretimi üzerine bir araştırma. Gıda, 12 (2); Bütikofer, U., Funchs, D., Hurni, D. und Bosset, J.O Bestimmung biogener amine in kase. Mitteilungen dee gebiete der lebensmittelhygine, 81; Eerola, S., Hinkkanen, R., Lindfors, E. and Hirvi, T Liquid chromatographic determination of biogenic amines in dry sausages. J. AOAC Int., 76 (3); García-García, P., Brenes-Balbuena, M., Hornero-Mendez, D., Garcia-Borrego, A. and Garrido-Fernández, A Content of biogenic amines in table olives. J. Food Protect., 63 (1); García-García, P., Brenes-Balbuena, M., Romero-Brink, C. and Garrido-Fernández, A Biogenic amines in packed table olives and pickles. J. Food Protect., 64 (3); García-García, P., Romero-Barranco, C., Durán-Quintana, M.C. and Garrido- Fernández, A Biogenic amine formation and Zapatera spoliage of fermented green olives: Effect of storage temperature and debittering process. J. Food Protect., 67 (1); Hornero-Mendez, D. and Garrido-Fernández, A Biogenic amines in table olives. Analysis by high-performance liquid chromatography. Analyst, 119; In Halász, A., Baráth, A. and Holzapfel, W.H The influence of starter culture selection on sauerkraut fermentation. Z Lebensm Unters Forsch A, 208; Hornero-Mendez, D. and Garrido-Fernández, A Rapid high-performance liquid chromatography analyses of biogenic amines in fermented vegetable brines. J. Food Protect., 60 (4); Inigo, R. M. and Bravo-Abad, F Fermentacion y nivel de histamina en aceitunas verdes. Alimentaria, 141; In García-García, P., Brenes-Balbuena, M., Hornero-Mendez, D., Garcia-Borrego, A. and Garrido-Fernandez, A Content of biogenic amines in table olives. J. Food Protect., 63 (1); Izquierdo-Pulido, M., Font-Frabegas, J., Carceller-Rosa, J.M., Mariné-Font, A. and Vidal Carou, C Biogenic amine changes related to lactic acid bacteria during brewing. J. Food Protect., 59; In García-García, P., Brenes- Balbuena, M., Hornero-Mendez, D., Garcia-Borrego, A. and Garrido-Fernández, 37