MİKROORGANİZMALARIN BESLENMELERİ VE GELİŞMELERİ. Doç. Dr. Evrim GÜNEŞ ALTUNTAŞ DIS213

Transkript

1 MİKROORGANİZMALARIN BESLENMELERİ VE GELİŞMELERİ Doç. Dr. Evrim GÜNEŞ ALTUNTAŞ DIS213

2 Mikroorganizmaların beslenmeleri Değişik mikroorganizma gruplarının ortamdan talep ettiği besinler ve koşullar farklıdır. Buna göre izole edilecek bakterinin istekleri doğrultusunda besiyeri çeşiti ve inkübasyon şartlarının uygulanması gerekir.

3 Besin olarak alınan elementler Makro elementler C, O, H, N, S, P, K, Na, Ca, Mg, Fe Mikro elementler Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni C: %50-60 O: %25-30 H: %8-10 N: %3-4 Enzim bileşeni ya da kofaktörüdürler.. Birçok enzimin katalitik etkisi K + iyonlarına bağlıdır.. Ca +2 iyonları spor oluşumu sırasında Ca-dipikolonat oluşumu. Fe +2 ve Fe +3 ETS sisteminde Fe-S proteinlerinin ve sitokrom enzimlerinin bileşiminde. Mg +2 iyonları Cyanobacter lerin ve fototrofik bakterilerin anten pigmentlerinde

4 Bazı mikroelementlerin işlevleri element Cu Co Mo Zn Mn Mg Ni Fe Biyolojik işlevine örnek Mitokondriyal oksidaz bileşeni Kobalaminin (Vit B 12 nin) bileşeni Nitrogenaz bileşeni Dehidrogenaz kofaktörü Fosfat grubu taşıyan enzimlerin kofaktörü Fotosentezde görevli Su Dehidrogenaz kofaktörü Üreaz enzimi kofaktörü Sitokromlarda ve Fe-S proteinlerinde elektron taşıyıcısıdır.

5 Mikroorganizmaların karbon gereksinimi C-ototrof C gereksinimi için yalnızca CO 2 den yararlanan mikroorganizmalar Cyanobacteriler, purpur ve yeşil bakteriler C-heterotrof C ihtiyacını organik bileşiklerden sağlayan mikroorganizmalar Selüloz, nişasta, organik asitler,

6 Oksijen, Azot, Kükürt, Fosfor gereksinimi NH 3 + ve NH 2 + Mikroorganizmalarda Azot; aminoasitlerde, pürin, pirimidin bazlarında, bazı karbonhidratlarda, fosfolipitlerde bulunur. Kükürt; sistein, sistin ve metiyonin gibi aminoasitler ile, biyotin tiyamin gibi vitaminlerde bulunur. Serbest O 2 Sülfidril grubu (-SH) -HPO 4 Organik bileşikler, su ve CO 2 her zaman bünyesinde Oksijen barındırır.

7 Gelişme Faktörleri Mikroorganizma gelişimi için gereken temel bileşenlerin (mineral madde, karbon ve enerji kaynakları) dışında bazı tamamlayıcı bileşenlerin de gelişme sırasında ortamda bulunması gerekir. Gelişmeleri büyüme faktörlerine bağlı mikroorganizmalar OKZOTROF (lösin okzotrof, tiyamin okzotrof, nikotinik asit okzotrof), gelişimleri sırasında büyüme faktörlerine gereksinim duymayan mikroorganizmalar ise PROTOTROF olarak isimlendirilir.

8 Mikroorganizmalarda beslenme tipleri Fototrof Kemotrof Organotrof Litotrof Ototrof Heterotrof Cyanobacter ve fotosentetik bakteriler Enerji kaynağı güneş ışığı Enerjilerini kimyasal maddelerin oksidasyonu ile kazanırlar. Anorganik ya da organik bileşenlerden faydalanırlar. Hidrojen ve elektron vericisi olarak organik bileşikler kullanılır. Hidrojen ve elektron vericisi olarak anorganik bileşikler (S, H 2 S, NO 2-, CO) kullanılır. Anabolizma yolunda karbon kaynağı olarak CO 2 kullanılır. Anabolizma yolunda karbon kaynağı olarak organik bileşikler kullanılır. 1. Fotolitotrof-ototrof 2. Fotoorganotrofheterotrof 3. Kemolitotrof-ototrof 4. Kemoorganotrofheterotrof

9 Beslenme tipi Fotolitotrof-ototrof Fotoorganotrof-heterotrof Kemolitotrof-ototrof Kemoorganotrof-heterotrof Enerji H/elektron kaynağı C kaynağı Işık enerjisi Anorganik H veya e - donör CO 2 Işık enerjisi Organik H veya e- Organik bileşikler Kimyasal enerji (anorganik bileşikler) Anorganik H veya e- donör CO 2 Kimyasal enerji (organik bileşikler) Organik H veya e- donör Organik bileşikler Tipi temsil eden mikroorganizma Algler, Cyanobacterler, purpur sülfür bakterileri, yeşil sülfür bakterileri Purpur non-sülfür bakterileri, yeşil nonsülfür bakterileri Nitrifikantlar, Hidrojen bakterileri, Demir bakterileri Fotosentetik olmayan bakteriler, patojen bakteriler, funguslar, Protozoa

10 SAF KÜLTÜRLER Saf kültür, tek bir hücreden birbirini takip eden bölünmelerle üreyen generasyonları (klonları) içeren popülasyondur. Saf kültürler esas olarak koloniden elde edilirler.

11 Ortalama olarak küfler 4-5 cm çaplı koloniler oluştururken, bakteri ve mayalar cm çaplı koloniler yaparlar. Ancak yayılıcı basiller ve Proteus türleri tüm petri kutusunu kaplayacak koloniler oluşturabilirler.

12 ???

13 Doğrudan katı besiyerine ekim Saf kültür Agar kullanımı

14 Katı besiyerine ekim yöntemleri (yayma, dökme ve sürme yöntemleri) Sürme Yöntemi Yayma ve Dökme Yöntemleri

15 Zenginleştirme teknikleri LAB için; süt, ekşi süt, peyniraltı suyu Hemoglobini kullanan bakteriler için; mezbaha atık suyu Leuconostoc mesenteroides için; sakkarozlu ortam, CO okside edenler için; havagazı fabrikaları Zenginleştirme işlemi; Ön zenginleştirme Selektif zenginleştirme olarak ikiye ayrılır. Penisilin; Gr + lerin, Siklohegzimit; mayaların ve küflerin, Azid, siyanit, H 2 S aerobların inhibisyonu amacıyla kullanılabilir. Mix kültür: Cyanobacter+Azotobacter+Clostridium pasteurianum Sadece birini geliştirmek istediğimizde ne yaparız??? (Işık ve O 2)

16 Seyreltme ve ekim

17 Koloni oluşturan birim sayısı??? kob/ml veya kob/g N= C / [V(n x n 2 ) x d)]? N= C / [V(n1 + 0,1 X n2) X d] N= / [0.1 ( ) x 10-5 N= 6.2 x 10 9 kob/ml

18 Koloni sayısı hesaplama N = Gıda örneğinin 1 g ya da 1 ml'sinde mikroorganizma sayısı C = Sayımı yapılan tüm petri kutularındaki koloni sayısı toplamı V = Sayımı yapılan petri kutularına aktarılan hacım (ml) n1= İlk seyreltiden yapılan sayımlarda sayım yapılan petri kutusu adedi n2= İkinci seyreltiden yapılan sayımlarda sayım yapılan petri kutusu adedi d = Sayımın yapıldığı ardışık 2 seyreltiden daha konsantre olanın seyreltme oranıdır. N= C / [V(n x n 2 ) x d)]

19 Örnek: Örnek: Dökme kültürel sayım yöntemi uygulanmış ve her seyreltiden 2 petri kutusuna ekim yapılmıştır seyreltide 190 ve 163, 10-3 seyreltide 25 ve 16 adet koloni elde edilmiştir. C = = 394 V = 1 (dökme kültürel sayım için petri kutularına 1' er ml pipetlenmiştir) n1= 2 (10-2 seyreltiden ekim yapılan 2 petri değerlendirmeye alınmıştır) n2= 2 (10-3 seyreltiden ekim yapılan 2 petri değerlendirmeye alınmıştır) d = 10-2 (ardışık 2 seyreltinin daha konsantre olanın seyreltme oranıdır) N = C / [V(n1 + 0,1 X n2) X d]= 394 / [(2 + 0,1 X 2) X 10-2 ]= 394 / (2,2 X 0,01)= Bu değer virgülden sonra 1 desimal ile gösterilmeli ve sonuç 1,8 x 10 4 kob/g (sıvı ise ml) olarak verilmelidir.

20 Örnek: Örnek: Bir sıvı gıdada yayma yöntemi kullanılmış ve orijinal örnekten (10 o seyrelti) 280, 310, 10-1 seyreltiden ise 12 ve 16 adet koloni elde edilmiştir. C = = 296 (300' den fazla ve 15' den az koloniler dikkate alınmamaktadır) V = 0,1 n1= 1 (2 petriden 1 adedi sayım için değerlendirilmiştir) n2= 1 (2 petriden 1 adedi sayım için değerlendirilmiştir) d = 10 o = 1 (orijinal örnek kullanılmıştır). N = 296 / [0,1(1 + 0,1 X 1) X 1] = 296/0,11 = 2690 = 2,7 x 10 3 kob/ml

21

22 Besiyeri çeşitleri Süt, ot infüzyonları doğal besiyeri olarak kullanılıyor iken, zamanla mikroorganziamların gereksinim duyduğu minimal besinler ile hazırlanan SENTETİK besiyerleri kullanılmaya başlanmıştır. E.coli, Pseudomonas, Streptococcus bovis için amonyum tuzları + glukoz LAB için pepton, maya ekstraktı vs içeren 40 çeşit bileşenden oluşan KOMPLEKS besiyerleri kullanılır. PEPTON; protein hidrolizi elde edilen parçalanmış protein hidrolizatlarıdır. Papain, pepsin, pankreatin enzimleri genellikle bu amaçla kullanılır. MAYA EKSTRAKTI; Saccharomyces cerevisiae nın otolize olmuş hücrelerinden elde edilir. Bol miktarda B vitamini içerir, aynı zamanda C ve N kaynağıdır. KALP ve BEYİN ekstraktı; zor gelişen bakteriler için besiyerlerine eklenmeleri yaygındır. AGAR; Kırmızı deniz algi olan Agaropytes den elde edilir. D-galaktoz-3,6-anhidro-L-galaktoz ve D-glukuronik asit ten oluşur.

23 Genel amaçlı besiyerleri Plate Count Agar (PCA), Nutrient Agar veya Broth, Tryptic Soy Agar veya Broth (CASO Agar veya Broth) İnhibitör içermezler Genellikle Toplam Aerob Mezofil Bakteri sayımı için ve Toplam Aerob Psikrofil Sayımı için kullanılırlar. Bazı durumlarda kanlı agar ve beyin infüzyonu içeren agar (ÖR; Brain Heart Infusion agar) genel besiyeri olarak değerlendirilebilir. Özellikle hemoliz reaksiyonlarının gözlenmesi gerektiğinde bu besiyeri tercih edilir. Plate Count Agarda gelişmiş koloniler Hemoliz reaksiyonu Brain heart Infusion Agarda gelişmiş koloniler

24 Selektif besiyerleri Safra tuzları, bazik fuksin, kristal viyole, metilen mavisi, malahit yeşili, NaCl VRB agar ile Lauryl Sulphate Tryptose Broth (E.coli ve akrabaları hedeflendiğinde) Bazı durumlarda refakatçi floranın inhibisyonu yerine, hedef mikroorganizmayı teşvik edici ajanlar kullanılır. ÖR 1: GSP agarda bulunan nişasta ve glutamat Pseudomonas gelişimini teşvik eder, ÖR 2: %50 glukoz içeren besiyerinde ozmotolerant/ozmofil maya gelişir, ÖR 3: yüksek tuz içerikli besiyerlerinde halofil/halotolerant bakteriler gelişir.

25 Ayırt edici (diferansiyel) besiyerleri ph indikatörü, çeşitli boya maddeleri, indirgeyici maddeler Kanlı Agar, VRB Agar, Baird Parker Agar hem selektif hem de diferansiyel besiyerleridir. VRB; laktoz içerir FVRB; MUG (4-methiliumbelliferil-β-glukuronid) içerir ve parçalanma ürünü (methiliumbelliferone) 366 nm de UV altında ışıma yapar. Baird Parker Agar; tellürit ve lesitin Laktoz negatif Laktoz pozitif VRB agarda laktoz pozitif ve negatif koloniler içerir, siyah zon ile çevrili koloniler S.aureus. FLST Broth da E.coli görüntüsü

26 MİKROBİYAL GELİŞME Tek bir mikroorganizma gelişmesi kütle artışını ifade ederken mikrobiyal gelişme bir popülasyonun gelişimini ifade eder. Bakteriyel hücreler ikiye bölünmeden önce hücre kütlesi 2 katına çıkar, o halde; kütlece artış=sayıca artış!!! Mikroorganizma sayısı hesaplanırlen, mikrobiyel gelişme kullanılabilir.

27 Gelişme eğrisi Adaptasyon dönemi Eksponensiyel üreme Durma evresi Ölüm evresi

28 Log fazı Bu dönemde bakteri bölünme hızı (V) sabittir. Generasyon süresi (g) ile hücre kütlesinin iki katına çıktığı süre (td) eşittir. V=birim zamanda bölünme olduğuna göre; V=1/g=1/td E.coli için g=20 dakika Rhizobium için g=2-4 saat Mycobacterium için g=12-18 saat

29 Durma ve Ölüm Evresi Durma fazında; hücre ölümü=hücre bölünmesi Maksimum hücre sayısı 10 9 hücre/ml Bu fazda sekonder metabolit üretimi başlar Ölüm fazında; hücre ölümü > hücre bölünmesi

30 Gelişme Kinetiği Log fazın başında N0 sayıda olan hücre zamanla; n N sayısına ulaşan hücreler bu zamana kadar 2 n kadar bölünmüşlerdir. N=N 0 x 2 n g=t/n V=1/g=1/td=t/n t=t-t 0 logn=logn 0 +nlog2 n=logn-logn 0 /log2 V=logN-logN 0 /log2 x t V=logN-logN 0 /0.3 x (t-t 0 )

31 Örnek:Bir statik kültürde başlangıç Staphylococcus aureus sayısı 10 3 ve 13 saatlik inkübasyon sonunda sayı 10 9 a ulaşmışsa bu bakterinin germinasyon süresi nedir? N 0 =10 3 N=10 9 t=13 V= (log10 9 -log10 3 ) / (0.3 x 13) = 1.5 (bu bakteri saatte 1.5 defa bölünür) g=1/v = 1/1.5 = 0.66 (Bu hücre 0.66 saatte (40 dakikada) bir ikiye bölünür)

32 Yarı logaritmik gelişme eğrisi Gelişme kurvesinde hücre sayısının logaritması alınarak elde edilen yarı logaritmik grafikte log fazına ait eğrinin eğimi de bölünme hızını verir!!!