BİR SÜT SIĞIRCILIĞI İŞLETMESİNDE BoHV-1 IgG ANTİKOR AVİDİTESİNİN ARAŞTIRILMASI

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİR SÜT SIĞIRCILIĞI İŞLETMESİNDE BoHV-1 IgG ANTİKOR AVİDİTESİNİN ARAŞTIRILMASI Ayşe Başak DEMİR VİROLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Yılmaz AKÇA 2006-ANKARA

2

3 İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler Resimler ii iii vi vii viii ix xii 1. GİRİŞ BoHV-1 Enfeksiyonu Etiyoloji Epidemiyoloji Patogenez ve Patoloji Klinik Bulgular İmmunoloji Teşhis Klinik Teşhis Laboratuvar Teşhisi Virus İzolasyonu ve Viral Antijen Tespiti Viral Nükleik Asit Tespiti Serolojik Testler Kontrol ve Eradikasyon Eradikasyon Aşılar Antikor Aviditesi Araştırmanın Amacı 25 iii

4 2. GEREÇ VE YÖNTEM Gereç Hücre Kültürü Viruslar Kontrol Serumlar Araştırmada Kullanılan Hayvanlar Yöntem Antijen Hazırlanması Virusların Üretilmesi Virusların Saflaştırılması ELISA Bileşenleri ve Prosedürün Optimizasyonu Antijen ve Serum Sulandırmalarının Optimizasyonu Konjugat ve Boş Kontrollerin Test Edilmesi Diğer Parametrelerin Kontrolü Pozitif ve Negatif Kontrol Serumlar ile Antijen Sulandırmalarının Son Nokta Titrasyon Değerlerinin Tespit Edilmesi Pozitif ve Negatif Kontrol Serumların Test Edilmesi Avidite Testi İstatistiksel Analizler BULGULAR ELISA Antijeni Hazırlanması ELISA Bileşenleri ve Prosedürün Optimizasyonu Antijen ve Serum Sulandırmalarının Optimizasyonu Konjugat ve Boş Kontrollerin Değerlendirilmesi Diğer Parametrelerin Kontrolü Pozitif ve Negatif Kontrol Serumlar ile Antijen Sulandırmalarının Son Nokta Titrasyon Değerlerinin Tespit Edilmesi Pozitif ve Negatif Kontrol Serumların Sulandırma Oranlarının Test Edilmesi Avidite Testi Örneklemelerin Tümünde Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi 48 iv

5 İlk 6 Örneklemede Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi Son 6 Örneklemede Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi İlk 4 Örneklemede Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi Örneklemelere Ait Bireysel Avidite Değerleri ile Nötralizasyon SN 50 Değerlerinin Karşılaştırılması TARTIŞMA SONUÇ ve ÖNERİLER 81 ÖZET 83 SUMMARY 84 KAYNAKLAR 85 ÖZGEÇMİŞ 94 v

6 ÖNSÖZ BoHV-1 enfeksiyonu, sığırlarda dünya çapında oldukça yaygın olarak görülmekte ve ciddi ekonomik kayıplara yol açması nedeni ile yetiştiricilik yönünden büyük önem taşımaktadır. Çoğunlukla subklinik olarak seyreden hastalığın dünya çapındaki yayılımı, sığır popülasyonlarındaki prevalansı ve sığır endüstrisi üzerindeki önemli etkileri nedeni ile birçok ülke hastalığın kontrol ve eradikasyonu çalışmalarını yoğun bir şekilde sürdürmektedir. Araştırmada, BoHV-1 enfeksiyonunun varlığının ve olası rekürrensilerin önceki bir çalışmada tesbit edildiği bir süt sığırcılığı işletmesindeki hayvanlara ait serum örneklerinde, IgG antikor aviditesinin araştırılması ve böylelikle mevcut antikorların kaynağının primer enfeksiyon mu yoksa bir reenfeksiyon veya reaktivasyon mu olduğunun belirlenmesi amaçlanmıştır. Bunun yanısıra BoHV-1 enfeksiyonlarında antikor aviditesinin ölçülmesinin pratikte getirebileceği diyagnostik avantajların araştırılması hedeflenmiştir. BoHV-1 enfeksiyonun başlangıç döneminde ve ilerleyen dönemlerindeki antikor düzeyleri ile aviditelerini ayrıca primer ve sekonder enfeksiyonlar ile reaktivasyonların antikor aviditesinde oluşturduğu değişimleri belirlemek için BoHV-1 IgG avidite ELISA tekniğinin kullanılabileceği ayrıca, indirekt ELISA testi kullanılarak geliştirilen IgG avidite testinin longitudinal çalışmalar veya taramalarda, primer ve tekrarlayan virus enfeksiyonlarının veya viruslara karşı yapılan aşılamalardan sonra bağışık yanıtın sorgulanması amacıyla kullanılabilecek uygun bir araç olduğu sonucuna varılmıştır. Doktora eğitimim ve tez çalışmam süresince yardım ve desteklerini esirgemeyen, bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım danışman hocam Sayın Prof. Dr. Yılmaz AKÇA ya, eğitimim süresince bilgi ve önerilerinden yararlandığım Ankara Üniversitesi Viroloji Anabilim Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. İbrahim BURGU ya, eğitimim ve tez çalışmam süresince her konuda bana destek ve yardımcı olan Sayın Prof. Dr. Feray ALKAN a, çalışmalarımın tüm aşamalarında beni destekleyen, değerli önerileri ile bana yön veren Sayın Prof. Dr. Aykut ÖZKUL a, bana her konuda sonsuz destek ve yardımcı olan Sayın Doç. Dr. Seval BİLGE DAĞALP e, tez izleme komitesindeki olumlu katkılarıyla Sayın Prof. Dr. Jale PARACIKOĞLU na ve Sayın Doç. Dr. Mehmet ÇABALAR a, eğitimim sırasında birlikte çalıştığım tüm Araştırma Görevlisi ve Doktor arkadaşlarıma, bu çalışma için materyal sağlamakta yardımcı olan Saray Halı Tarım İşletmesi Veteriner Hekimi Vet. Hek. İsmail KOCAER e, çalışmamda yardımlarını esirgemeyen Şap Enstitüsü Teşhis Bölüm Başkanı Uzm. Vet. Hek. Naci BULUT a ve Şap Enstitüsü çalışanlarına ve tüm eğitim hayatım boyunca verdikleri sonsuz maddi ve manevi destekten dolayı sevgili aileme teşekkürü bir borç bilirim. vi

7 SİMGELER VE KISALTMALAR A.I. : Avidite İndeksi BoHV-1 : Bovine Herpesvirus Tip-1 BVDV : Bovine Viral Diarrhoea Virus CPE : Sitopatolojik Etki DNA : Deoksiribonükleik asit DMEM : Dulbecco s Modified Eagle Medium ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FDS : Fötal Dana Serumu H 2 O 2 : Hidrojen Peroksit H 2 SO 4 : Sülfirik Asit IBR : Infectious Bovine Rhinotracheitis IPB : Infectious Pustular Balanopostitis IPV : Infectious Pustular Vulvovaginitis Ig : İmmunglobulin IFT : İmmun Florasan Tekniği M : Molar MDBK : Madin Darby Bovine Kidney mg : Miligram ml : Mililitre µg : Mikrogram µl : Mikrolitre moi : Multiplicity of Infection nm : Nanometre NK : Natural Killer Hücreleri O.D. : Optik Dansite O.F.D. : Ortofenilen Diamin PBS : Phosphate Buffered Saline PDFA : Primer Dana Fötal Akciğer PK-15 : Pig Kidney-15 PMN : Polymorfonükleer Nötrofiller PZR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu rpm : Roll per minute (Devir/Dakika) SD : Standart Sapma SNT : Serum Nötralizasyon Testi SN 50 : Serum Nötralizasyon 50 vii

8 ŞEKİLLER Şekil 2.1. : ELISA testinin uygulanma aşamaları 30 Şekil 3.1. : Şekil 3.1 1/600 antijen sulandırması sabit tutularak pozitif ve negatif serumların sulandırmaları 46 Şekil 3.2. Şekil 3.3. : 1/50 pozitif ve negatif serum sulandırmaları sabit tutularak antijenin bir seri sulandırılması sonucu elde edilen O.D. ortalamaları 47 : 1/200, 1/400, 1/600 ve 1/800 oranında antijen sulandırmalarına karşılık pozitif kontrol serumun 1/50, 1/75 ve 1/100 oranında sulandırılması 51 Şekil 3.4. : 1/200, 1/400, 1/600 ve 1/800 oranında antijen sulandırmalarına karşılık negatif kontrol serumun 1/50, 1/75 ve 1/100 oranında sulandırılması 51 Şekil 3.5. : Örneklemelere göre ortalama A.I.(%) ve O.D. değerleri 54 Şekil 3.6. : Bazı bireylere (3015, 3083, 3040, 3012 ve 3021 kulak no lu hayvanlar) ait SN 50 ve A.I. (%) değerleri 70 viii

9 ÇİZELGELER Çizelge 2.1.: Yapılan örneklemelerde hayvanlardan alınan ve mevcut olan serum numunelerinin tarihleri ve örneklemelere göre sayısal dağılımları 27 Çizelge 2.2.: Tüm örneklemeler, ilk 6 örnekleme, son 6 örnekleme ve ilk 4 örneklemede bulunan hayvanların kulak numaraları 28 Çizelge 2.3.: ELISA optimizasyonunda kullanılan 11 basamak antijen sulandırmaları 32 Çizelge 2.4.: ELISA optimizasyonunda kullanılan 8 basamak serum sulandırmaları 32 Çizelge 2.5.: ELISA optimizasyonu için 1/600 antijen sulandırma oranı sabit tutularak pozitif ve negatif serumların sulandırılması 35 Çizelge 2.6.: ELISA optimizasyonu için 1/50 serum sulandırma oranı sabit tutularak antijenin sulandırılması 35 Çizelge 2.7.: Antijenin 1/200, 1/400, 1/600 ve 1/800 oranında sulandırmalarına karşılık pozitif ve negatif kontrol serumun 1/50, 1/75 ve 1/100 oranında sulandırmaları 38 Çizelge 3.1.: Antijen ve pozitif kontrol serum checker-board titrasyonlarına ait O.D. değerleri 42 Çizelge 3.2.: Konjugat ilave edilmeden (1-3) ve ilave edilerek (4-6) elde edilen O.D. değerleri 43 Çizelge 3.3.: Tablet 1, 1/600 antijen sulandırması sabit tutularak pozitif ve negatif serumların sulandırılması sonucu elde edilen O.D. değerleri 45 Çizelge 3.4.: Tablet 2, 1/50 pozitif ve negatif serum sulandırmaları sabit tutularak antijenin sulandırılması sonucu elde edilen O.D. değerleri 45 Çizelge 3.5.: 1/200, 400, 600 ve 800 antijen sulandırmalarına karşılık pozitif ve negatif kontrol serumların 1/50, 1/75 ve 1/100 oranında sulandırılmasıyla elde edilen O.D. değerleri 49 Çizelge 3.6.: Farklı antijen konsantrasyonlarında kontrol serumların 1/50, 1/75 ve 1/100 oranında sulandırılmaları ile elde edilen O.D. Değerleri 50 ix

10 Çizelge 3.7.: Tüm örneklemelerde bulunan serum örneklerinin avidite ELISA testi ile saptanan O.D. ve % A.I. değerleri 52 Çizelge 3.8.: Bütün örneklemelerde bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 48 Çizelge 3.9.: Tüm örneklemelerde bulunan serumların % A.I. değerlerinin ortanca, minimum ve maksimum değerleri 53 Çizelge 3.10.: Tüm örneklemelerde bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 55 Çizelge 3.11.: İlk 6 örneklemede bulunan serum örneklerinin avidite ELISA testi ile saptanan O.D. ve % A.I. değerleri 56 Çizelge 3.12.: İlk 6 örneklemede bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 57 Çizelge 3.13.: İlk 6 örneklemede bulunan serumların % A.I. değerlerinin ortanca, minimum ve maksimum değerleri 58 Çizelge 3.14.: İlk 6 örneklemede bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 58 Çizelge 3.15: Son 6 örneklemede bulunan serum örneklerinin avidite ELISA testi ile saptanan O.D. ve A. I. Değerleri 60 Çizelge 3.16.: Son 6 örneklemede bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 59 Çizelge 3.17.: Son 6 örneklemede bulunan serumların %A.I. değerlerinin ortanca, minimum ve maksimum değerleri 61 Çizelge 3.18.: Son 6 örneklemede bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 61 Çizelge 3.19.: İlk 4 örneklemede bulunan serum örneklerinin avidite ELISA testi ile saptanan O.D. ve A.I. değerleri 63 Çizelge 3.20.: İlk 4 örneklemede bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalamaları ve standart sapmaları 62 Çizelge 3.21.: İlk 4 örneklemede bulunan serumların % A.I. değerlerinin ortanca, minimum ve maksimum değerleri 64 Çizelge 3.22.: İlk 4 örneklemede bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 64 x

11 Çizelge 3.23.: Tüm örneklemelerde mevcut olan 21 hayvana ait serum örneklerinin %A.I. değerlerinin sayısal ve % dağılımları 65 Çizelge 3.24.: İlk 6 örneklemede mevcut olan 16 hayvana ait serum örneklerinin %A.I. değerlerinin sayısal ve % dağılımları 66 Çizelge 3.25.: Son 6 örneklemede mevcut olan 21 hayvana ait serum örneklerinin %A.I. değerlerinin sayısal ve % dağılımları 66 Çizelge 3.26.: İlk 4 örneklemede mevcut olan 13 hayvana ait serum örneklerinin %A.I. değerlerinin sayısal ve % dağılımları 67 Çizelge 3.27.: Bazı bireylere ait SN 50 ve A. I. (%) değerleri 68 xi

12 RESİMLER Resim 3.1.: 1/600 antijen sulandırması sabit tutularak pozitif ve negatif serumların sulandırılması ile yapılan ELISA sonucunda oluşan renk dağılımı 46 Resim 3.2.: 1/50 pozitif ve negatif serum sulandırmaları sabit tutulup antijenin sulandırılması ile yapılan ELISA testi sonucunda oluşan renk dağılımı 47 xii

13 1. GİRİŞ Bovine Herpesvirus Tip-1 (BoHV-1), sığırlarda Infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR) ve Infectious Pustular Vulvovaginitis/Balanopostitis (IPV/IPB) olarak bilinen ve dünya çapında oldukça yaygın olarak görülen hastalıkların etiyolojik ajanıdır (Wyler ve ark., 1989). Etkenin meydana getirdiği akut enfeksiyonda genellikle konjuktivitis, tracheitis ve üst solunum yolları enfeksiyonu görülmekte, sekonder bakteriyel enfeksiyonların komplikasyonunda ise bronkopnöymoniler gelişebilmektedir. Genital sistem etkilendiğinde ise abortlar, repeat breeding (döl tutmama), embriyonal ölümler gibi fertilite problemleri ve mastitis şekillenebilmektedir (Straub, 1991). Virus, aynı zamanda, özellikle genç danalarda, Bovine viral diarrhoea virus (BVD), Parainfluenza-3 virus (PI-3) veya Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) ve Mannheimia haemolytica veya Pasteurella multocida gibi bakterilerle beraber Sığır Solunum Hastalıkları Kompleksi ne neden olmaktadır (Yates 1982). Çoğunlukla subklinik olarak seyreden hastalık, dünyada oldukça yaygın düzeyde bulunmaktadır. BoHV-1 in dünya çapındaki yayılımı, sığır popülasyonlarındaki prevalansı ve sığır endüstrisi üzerindeki önemli etkileri, etkeni, sığır yetiştiricilerinin üzerinde durması gereken en önemli enfeksiyöz ajanlardan biri konumuna getirmiştir. Enfeksiyona bağlı olarak oluşan ekonomik kayıplar da dikkate alınarak birçok ülke hastalığın kontrol ve eradikasyonu çalışmalarını yoğun bir şekilde sürdürmektedir (Straub, 1990). 1

14 1.1. BoHV-1 Enfeksiyonu Etiyoloji Etken, Herpesviridae familyası içinde yer alan Alfaherpesvirinae altfamilyasına bağlı varicellovirus genusu içerisinde Bovine Herpesvirus-1 (BoHV-1) olarak sınıflandırılmıştır (Fenner ve ark. 1987). BoHV-1 suşları, viral DNA daki farklılıkların restriksiyon endonükleaz enzim kesimleri veya polimeraz zincir reaksiyonu ile analizine dayanarak, BoHV-1.1, BoHV-1.2a ve BoHV-1.2b olmak üzere üç alt tipe ayrılmaktadır (Metzler ve ark., 1985; Engels ve ark., 1986; Rijsewijk ve ark., 1999). BoHV-1, genetik materyal olarak yaklaşık 136 kilobaz (kb) büyüklüğünde, çift iplikçikli ve linear yapıda DNA genomu içermektedir (Fenner ve ark., 1987). Genom, yaklaşık 100 nm çapında ve 162 kapsomerden oluşan ikozahedral bir kapsid ile çevrilmiştir. Nükleokapsid, tegümen adı verilen elektrondens bir materyal ile sarılmıştır. En dışta ise viral glikoproteinleri içeren tek katmanlı bir zar bulunmaktadır (Wyler ve ark., 1989). Yapılan çalışmalar neticesinde, BoHV-1 virionunun, 10 tanesi zarda bulunan glikoproteinler olmak üzere kapsid ve tegümende bulunan yapısal ve yapısal olmayan yaklaşık 69 adet protein içerdiği tespit edilmiştir. Bunlardan özellikle zarda bulunan glikoproteinler (gb, gc, gd, ge, gg, gh, gi, gk, gl, gm), immun sistemin aktivasyonu, konak hücreye adsorbsiyon ve penetrasyon, hücreden hücreye yayılma gibi fonksiyonlara sahiptirler. Bunların dışında, bazı enzimler (ribonükleotid redüktaz, DNA polimeraz gibi) ve bir grup düzenleyici protein (BICP0, 4, 22, 27 ve αtif) bulunmaktadır (Schwyzer ve Ackermann, 1996). BoHV-1 virusu, 63 C nin üzerindeki ısılarda hızla inaktive olurken, 4 C de çok yavaş inaktive olmaktadır. 37 C de yaklaşık 10 gün canlı kalabilmekte, -20 C de en az bir yıl enfektivitesini korumakta, -65 C nin altında ise stabil kalmaktadır (Straub, 1990). Fenner ve ark (1987), virusun dondurulmuş spermada bulunma 2

15 olasılığını ve bu durumun hastalıkla mücadelede dikkat edilmesi gereken önemli bir konu olduğunu belirtmişlerdir. Çapraz nötralizasyon testleri, BoHV-1 izolatlarının serolojik olarak tek tip olduğunu göstermiştir. Aynı zamanda CapHV-1 ile BoHV-1 arasında yakın antijenik ilişki gözlenmiştir (Wyler ve ark., 1989). Bunun dışında Equine Herpes Virus-1 (EHV-1) ile BoHV-1 in antijenik olarak yakın ilişkili olduğu da bildirilmiştir (McKercker, 1973). Etkenin referens suşu IBR/Colorado BoHV-1/Cooper varyantıdır (Fenner ve ark., 1987). Diğer herpesviruslarda olduğu gibi, BoHV-1 de konakçı hücreye füzyon yolu ile penatre olur. Replikasyon nükleus içerisinde meydana gelir ve yeni oluşan nükleokapsitler zarlarını nüklear membranın iç lamelinden, sitoplazmik membranlardan veya plazma membranından alırlar. BoHV-1 e, doğal konakçısı olan sığırların dışında, gelincik, vizon ve tavşanlar da duyarlı olup deneysel çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadırlar (Wyler ve ark., 1989). Virusun fare, sıçan, kobay ve tavuk embryolarını enfekte etmediği tespit edilmiştir (Gibbs ve Rweyemamu, 1977). Bununla birlikte, interferon reseptörleri olmayan farenin periton boşluğuna virusun enjekte edilmesiyle enfeksiyon şekillenmiştir (Abril ve ark., 2004). Virusun üretilmesinde; sığır orijinli primer hücre kültürleri (böbrek, testis, akciğer), Madin Darby Bovine Kidney (MDBK), Bovine Turbinata (BT), RK-13 ve Mink Lung (ML) hücre kültürleri kullanılmaktadır. Virus, bu hücre kültürlerinde yuvarlaklaşma ve lizis odakları ile karakterize sitopatik effekt (cpe) oluşturarak üremektedir (Wyler ve ark., 1989) Epidemiyoloji BoHV-1 enfeksiyonlarının tüm dünyada yaygın olarak bulunduğu, antikor prevalans çalışmaları ile gösterilmiştir (McKercker, 1973). Diğer alfaherpesviruslarda olduğu gibi, BoHV-1 de sınırlı konakçı spektrumuna sahiptir ve tür bariyerlerini genellikle geçememektedir (Brake ve Studdert, 1985). 3

16 BoHV-1 in bulaşması, enfekte hayvanla direkt temas veya indirekt olarak çeşitli mekanik vektörlerle olmaktadır. Direkt bulaşmada enfekte hayvana ait burun, göz ve boğaz akıntıları (Fenner ve ark., 1987; Miller, 1991), gaita (Miller, 1991), vajinal salgı ve sperma (Deas ve Johnston, 1973), süt (Probst ve ark., 1983) gibi sekret ve ekskretler önemli rol oynamaktadır. Gibbs ve Rweyemamu (1977), enfeksiyöz virusun, akut solunum enfeksiyonu sırasında gün boyunca saçıldığını bildirmişlerdir. Kontamine materyaller ve sperma ile virusun bulaştığı tespit edilmiştir (Mars ve ark., 2000a,b). Enfeksiyonun bulaşmasında önemli rol oynayan bir diğer faktör latent enfekte hayvanlardır. Latent enfekte hayvanlarda virus stres, doğum, nakil, aşlama ve kortikosteroidlerin uygulanması sonucunda yeniden aktive olarak saçılmaya başlar. Sonuçta, virusun duyarlı hayvanlara geçişine neden olurlar. Akut, subklinik veya latent enfekte boğalara ait sperma, sıvı azot ortamında saklandığında virus sperma içerisinde muhafaza olduğundan suni tohumlama yoluyla enfeksiyonun yayılmasına neden olmaktadır (Wyler ve ark., 1989; Engels ve Ackerman, 1996). Sığırlar BoHV-1 in doğal konakçısı durumundadırlar (Gibbs ve Rweyemamu, 1977). Bununla birlikte yapılan araştırmalarda vahşi hayvanlarda da hastalığa karşı antikor oluştuğu tespit edilmiş, ancak belirgin klinik semptomların sadece sığırlarda geliştiği gözlenmiştir (Straub, 1990). Metzler ve ark. (1990) asya fillerinde BoHV- 1 e karşı antikor tespit etmiş, ancak hastalık ile sonuçlanan BoHV-1 enfeksiyonu saptayamamıştır. BoHV-1, hastalık belirtileri olmadan antilop, gelincik ve vizonlardan izole edilmiştir (Porter ve ark., 1975). Kuzey Amerika, Avustralya ve Avrupa da yapılan serolojik araştırmalar diğer bazı vahşi ruminantlarda da BoHV-1 spesifik antikor varlığını ortaya koymuştur (Ackerman ve ark., 1986). Diğer yandan, BoHV-1 in koyun ve keçileri enfekte ederek hastalığa sebep olduğu bildirilmiştir (Whetstone ve Evermann, 1988). Ackermann ve ark. (1986) BoHV-1 enfeksiyonunun keçilerde nadir olarak görüldüğünü ve bu enfeksiyonun reaktivasyonunun kolay şekillenmediğini göstermişlerdir. 4

17 Taylor ve ark. (1982), yumuşak kabuklu keneden (Ornithodoros coriaceus) BoHV-1 izole etmiştir. Ancak, kenelerin virus bulaşmasındaki rolü henüz netlik kazanmamıştır. Yüz sineklerinin (Musca autumnalis), enfekte hayvanlardan beslendikten sonra virusu taşıdıkları fakat bulaşmada rol oynamadıkları bildirilmiştir (Johnson ve ark., 1991) Patogenez ve Patoloji BoHV-1 in organizmaya ilk giriş yerleri nazal kavite, oropharynx, göz, genital kanaldır. Primer enfeksiyon sonrasında ilk çoğalma, giriş noktasındaki epitel hücrelerde meydana gelmektedir. Bu noktadan itibaren gelişen enfeksiyonun 3 muhtemel seyri bildirilmektedir; lokal olarak sınırlanma, viremi ile sistemik yayılım ve nöronal yayılım. Lokal alanlardaki sınırlı enfeksiyon çoğunlukla üst solunum yolu, göz (IBR) ve genital (IPV/IPB) dokulardaki viral invazyondan sonra meydana gelmektedir. Hastalık semptomları temelde virus replikasyonuna bağlı olarak enfekte hücrelerin hasarı ile ilişkili olmaktadır. İmmun yanıt neticesinde bu tip enfeksiyonlar sınırlı kalmakta ve çoğunlukla bir iki hafta içerisinde iyileşme meydana gelmektedir. Viremi aracılığıyla sistemik yayılım, BoHV-1 enfeksiyonlarında karşılaşılan abort veya enteritis olaylarına neden olmaktadır (Engels ve Ackerman, 1996). BoHV-1 enfeksiyonunda viremiyi inceleyerek, Nyaga ve McKercher (1980) BoHV-1 in kan monositlerini enfekte ettiğini, sınırlı virus replikasyonu ve saçılımın mümkün olduğunu göstermişlerdir. Araştırıcılar aynı zamanda, nötralizan antikorların bulunmadığı dönemde BoHV-1 in lenfositlere adsorbe olabildiğini ve bu şekilde yayıldığını göstermişlerdir. Genel bir kural olarak, lenfosit bağımlı viremiyi takiben virusun sistemik yayılımı, lenf nodüllerine yerleşmesi ile sonuçlanmaktadır. BoHV-1 replikasyonu enfeksiyonun ilk iki saati içerisinde başlar (Meurens ve ark., 2004). Hücre yüzeyinde antijen ekspresyonu enfeksiyondan 3-4 saat sonra şekillenir ve virusun hücre dışına çıkması ve yayılma enfeksiyondan 8 saat sonra gerçekleşir (Babiuk ve ark., 1996). 5

18 Virus, vücuda giriş yerindeki primer replikasyon sırasında lokal sinir hücrelerinin aksonlarına invaze olabilmekte, daha sonra intra-aksonal yayılım ile bölgesel gangliyonlardaki nöronlara ulaşmakta ve latentlik şekillenmektedir (Engels ve Ackerman, 1996). BoHV-1 ile merkezi sinir sisteminin enfeksiyonunun aksonal yayılım yoluyla mı, yoksa viremi ile mi gerçekleştiği henüz kesin olarak bilinmemektedir. Viremi ile yayılımda virus kan-beyin bariyerine geçer ve bu durum BoHV-1 nedeniyle oluşan ensefalitlerin neden sadece sporadik olarak oluştuğunu ve deneysel olarak oluşturmanın güç olduğunu açıklayabilmektedir. (McKercher ve ark., 1970). Zar glikoproteinleri viral tutunma, penetrasyon ve hücreden hücreye yayılımda görev almaktadırlar. Glikoprotein C (gc) hücre yüzeyindeki heparan sülfat proteoglikanlarına bağlanmak suretiyle hücreye tutunmakta, ikinci bir hücresel reseptöre glikoprotein D nin (gd) bağlanması ile viral giriş şekillenmektedir (Karger ve ark., 1995; Thaker ve ark., 1994). Virusun hücreye girişi ve viral zarın hücre membranı ile füzyonu gb, gh, gl nin etkileşimleri sonucu gerçekleşmektedir. Glikoproteinler, virusun virulensinde rol oynarken in vitro ve in vivo koşullarda virus replikasyonu için esansiyel değildirler (Schwyzer ve Ackerman, 1996). BoHV-1 in ge gen bölgesi çıkartıldığında, vahşi tip virus ile aynı bölgedeki dokular enfekte olmaktadır ancak enfeksiyon daha kısa sürmektedir (Van Engelenburg ve ark., 1994). Bu durum, ge nin hücreden hücreye yayılımındaki fonksiyonunu yansıtmaktadır. Bütün herpesviruslar gibi BoHV-1 de latent enfeksiyon oluşturabilmektedir. Latentlik, enfeksiyöz virusun izole edilememesi ve latent enfekte hücrelerde viral antijenin tespit edilememesi ile karakterizedir. BoHV-1 ile meydana gelen primer enfeksiyon sonrasında, etkenin organizmada oluşan kendisine ilgili immun yanıttan kaçabilmek için öncelikle merkezi sinir sistemi ve buna ilgili gangliyonlar (Engels ve 6

19 Ackerman, 1996) ve daha nadiren lenfoid doku, makrofajlar, epitel hücreleri ve olfaktör bulbus da (Wyler ve ark., 1989) saklanmasıdır. Ackermann ve ark. (1982) viral DNA yı, in situ hibridizasyon ile lokal sensör ganglionlarda tespit etmişlerdir. Latentliğin diğer bölgeleri olan lenf nodülleri ve nazal mukozada BoHV-1 genomu, PCR ile tespit edilmiştir (Van Engelenburg ve ark., 1994). Attenüe canlı aşılar ve mutant suşları (ısıya duyarlı ve timidin kinaz negatif mutantlar) da dahil olmak üzere tüm BoHV-1 suşlarının latentlik oluşturabildiği bildirilmiştir (Wyler ve ark., 1989; Engels ve Ackerman, 1996). Latentliğin oluşumu için en az iki koşulun yerine getirilmesi gerekmektedir; birincisi, nöronlar veya lenfoid hücreler gibi uzun yaşam süreli, replike olmayan ve yüksek derecede farklılaşmış hücreler, latentlik sırasında virusun yerleşmesi için idealdir. İkincisi, üretken enfeksiyon ve perifer dokularda replikasyonda görülenin aksine latent enfekte hücreler yıkımlanmamalıdır. Bu sebeple, apoptozun indüklenmesi ve immun mekanizmalar tarafından yıkımlama önlenmelidir. Ayrıca, latentlik sırasında viral protein sentezi olmamalı veya protein immun sistem tarafından tolare edilebilmelidir. Prodüktif viral replikasyon erken dönemde kesilmelidir. Latent enfekte hücrelerde sınırlı bir viral transkripsiyon tespit edilmiş ve latentlik bağımlı transkriptlerin (LAT) oluştuğu bildirilmiştir (Engels ve Ackerman, 1996). Latent virus immun bireyde uzun süre bulunmakta ve reaktivasyon ile tekrar etkin duruma geçmektedir. Stres faktörleri veya deneysel kortikosteroid uygulaması gibi çeşitli uyarılar latentlikten reaktivasyona sebep olmaktadır. Latentlik bölgelerinde yeni virus sentezlenmekte ve tekrar saçılım gerçekleşmektedir. BoHV-1 enfeksiyonunda, reaktive olan virus intra-aksonal olarak organizmaya ilk giriş yerine geri gelerek sekonder lezyonları oluşturmasıyla rekürrent (tekrarlayan) enfeksiyonlar meydana gelmekte ve virus diğer duyarlı konaklara saçılmaktadır (Engels ve Ackerman, 1996). Thiry ve ark (1987) transport stresinin viral reaktivasyona neden olduğunu ve transport sonrası 1-4 gün virus saçılımı olduğunu bildirmişlerdir. 7

20 Reaktivasyonun etkinliğinde sadece virus değil aynı zamanda konakçı da önemli rol oynamaktadır. Örneğin, kortikosteroid uygulamaları ile BoHV-1 ile latent enfekte sığırlardan virusu reaktive etmek oldukça kolay olmaktadır ancak, yüksek dozlarda kortikosteroid uygulansa bile, aynı virus keçilerden reaktive edilememiştir (Ackermann ve ark., 1986). Kaashoek ve ark. (1996) primer BoHV-1 enfeksiyonunu takiben oluşan immun yanıtın takibi ve olası reaktivasyonları deneysel şartlarda araştırmışlardır. Araştırıcılar 3 yıl boyunca takip ettikleri hayvanlarda BoHV-1 e karşı yüksek düzeyde antikorun tespit edilebildiğini ve olası bir reaktivasyondan sonra nötralizan antikor yanıtının 4 kat artabileceğini bildirmişlerdir. Antikor yanıtı olmaksızın da reaktivasyon görülebileceği bildirilmesine rağmen elde edilen bulgular, reaktivasyona uğrayan virusun izole edilebileceği ya da trigeminal gangliyonda DNA sının tespit edilebileceği yönündedir. Hage ve ark. (1996) bir süt sığırcılığı işletmesinde BoHV-1 enfeksiyonunun popülasyon dinamiğinin tespiti için yaptıkları çalışmada, sadece 3 seropozitif hayvanın dekzametazon ile immunsupresyonu neticesinde sürü içindeki tüm seronegatif hayvanların seropozitif duruma geçtiğini ve antikor yanıtına sahip hayvanlarda önemli titre artışlarının olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca bu araştırmada incelenen sürünün BoHV-1 yönünden popülasyon dinamiği çıkartılmıştır. Bu sonuca göre BoHV-1 in sürü içindeki dolaşımı immunsupresyonu izleyen 5. günde başlayıp yaklaşık 49. gün civarında tamamlanmıştır. Aynı dönem süresince seronegatif ve seropozitif hayvan sayıları 3-4. haftadan itibaren değişerek 7. hafta sonunda tüm hayvanların seropozitifliğe ulaşmasıyla tamamlanmıştır. Bu veriler ışığında BoHV-1 enfeksiyonunun seyir süresi en az 7 hafta olarak bildirilmiştir. Genç sığırlar, maternal antikorların varlığında latent enfekte olabilmekte ve enfeksiyona bağlı antikor yanıtı göstermektedirler (Scahw, 2000). BoHV-1 in canlı aşı suşlarının inokülasyonu latent enfeksiyona neden olabilmektedir (Kit ve ark., 1985). 8

21 Klinik Bulgular BoHV-1 in sığırlarda oluşturduğu hastalığın şiddeti, virusun suşuna ve alt tipine bağlı olmaktadır. Akut hastalıktaki klinik belirtilere, BoHV-1 ile enfekte hücrelerin yıkımı sebep olmaktadır (Engels ve Ackermann, 1996). Virusun konak hücreye bağlanması, programlanmış konak hücre ölümünü (apoptosis) tetiklemektedir (Lovato ve ark., 2003). BoHV-1 enfeksiyonu sığırlarda, reprodüktif problemlere, solunum sistemi, santral sinir sistemi ve deri hastalıklarına, enterik ve neonatal hastalıklara neden olabilmektedir (Gibbs ve Rweyemamu, 1977; Biuk-Rudan ve ark., 1999; Kahrs, 2001). Ayrıca Wellenberg ve ark. (2001), virusun deneysel şartlarda mastitise neden olabildiğini bildirmişlerdir. IBR, beden ısısı artışı (40,5-42 C), solunum sayısında artış, kuru öksürük, anoreksi, depresyon ve sütçü ineklerde süt üretiminde ciddi bir düşüş ve zayıflama ile karakterizedir. Bir veya iki gün içerisinde bilateral, berrak bir nazal akıntı gelişir ve nazal mukozada hiperemik bir görüntü (kırmızı burun) şekillenir (Kahrs, 1977). Bazı hayvanlarda IBR enfeksiyonu sırasında uni veya bilateral bir konjuktivitis ve hastalığın ilerleyişine bağlı olarak berraktan mukopurulente kadar değişebilen bir okuler sekresyon bildirilmiştir (Rebhun ve ark., 1978). Hastalığın akut fazı genellikle 5-10 gün sürmekte ve hayvanlar bu sürenin sonunda genellikle iyileşmektedirler. Hastalıktan etkilenen hayvanların yaklaşık %10 unda sekonder enfeksiyonlar ile komplikasyon olabilmekte ve sonuçta ölüm şekillenebilmektedir (Wyler ve ark., 1989). BoHV-1, stres, bazı viral (BVD, PI-3, BRSV) ve bakteriyel (Mannheimia haemolytica veya Pasteurella multocida) ajanlarla birlikte Sığır Solunum Hastalıkları Kompleksini (BRD) oluşturmaktadır (Yates, 1982). BoHV-1, immunsupresyona sebep olmak suretiyle hastalığı başlatabilmekte (Winkler ve ark., 1999; Lovato ve 9

22 ark., 2003) ve sekonder enfeksiyonlara predispozisyon yaratarak şiddetli pnömoni ve ölüme neden olmaktadır (Hanon ve ark., 1998; Lovato ve ark., 2003). Infectious Pustular Vulvovaginitis (IPV) ve Balanopostitis (IPB) dişi ve erkek hayvanlarda çiftleşmeden yaklaşık 1-3 gün sonra gözlenmekte ve genellikle ağrılı bir yangıya yol açmaktadır. Vulva ödematöz ve hiperemiktir, mukozal yüzeye yayılmış küçük püstüller görülmektedir. Hastalığın akut fazı 2-4 gün içerisinde sona ermekte ve lezyonlar hastalığın başlamasından yaklaşık gün içerisinde iyileşmektedir (Gibbs ve Rweyemamu, 1977). BoHV-1 ile enfeksiyon, tek başına sağlıklı erişkin sığırlarda ölüme neden olmamaktadır (Kahrs, 2001). Ancak, virus gebe ineklerin genital enfeksiyonunu takiben fötal enfeksiyon, viremi, ölüm ve abortlara neden olabilmektedir (Gibbs ve Rweyemamu, 1977; Kahrs, 2001). Enfeksiyonun gebe ineklerin bulunduğu bir sürüde geliştiği durumlarda, 3-6 haftalık inkübasyon süresini takiben özellikle gebeliğin 5-8. aylarındaki hayvanlarda abortlar meydana gelebilmekte ve bu durum gebe ineklerin yaklaşık %25 inde gözlenebilmektedir (Wyler ve ark., 1989). Yeni doğanların maternal antikor alamadığı durumlarda, ölümle sonuçlanan şiddetli enfeksiyon tablosu oluşabilmektedir (Mechor ve ark., 1987) İmmunoloji Birçok viral enfeksiyonda olduğu gibi, BoHV-1 e karşı oluşan immun yanıt, enfeksiyonun oluşmasını önleyen (humoral) ve iyileşmeye yardımcı olan (selüler ve humoral) immun yanıt olarak ikiye ayrılır. Bağışıklık düzeyi hastalık tablosunun seyrine, hastalığın genel veya lokal oluşmasına göre değişmektedir. Genel enfeksiyonlardan sonra kazanılan bağışıklığın süresi uzun olmasına rağmen, lokal enfeksiyonlarda bu sürenin çok daha kısa olduğu ortaya konulmuştur (Babiuk ve ark., 1996). Aynı zamanda, B- ve T-hücreleri tarafından kontrol edilen spesifik yanıtlar ve polimorfnükleer nötrofiller (PMN), makrofajlar ve NK (natural killer) hücreleri, interferon, komplement ve diğer faktörler tarafından kontrol edilen spesifik 10

23 olmayan immun yanıt solunum epiteline virusun tutunmasını sınırlamaktadır (Denis ve ark., 1994). Bu mekanizmaların herbirinin önemi, enfeksiyonun primer enfeksiyon veya antikor ve bellek hücrelerinin önceden varolduğu sekonder enfeksiyon oluşuna bağlı olarak değişmektedir (Babiuk ve ark., 1996). İlk enfeksiyonun ardından viral protein sentezi, konağın nonspesifik immun yanıtını uyaran bir seri olayı başlatır. Primer enfeksiyonu takiben, virus intraselüler olarak hücreden dışarı çıkmadan yayılır ve antikorlar tarafından nötralize edilemez. Antikor varlığında virus intraselüler olarak yayılabildiği için, antikor varlığı hücreden hücreye yayılımı önlemekte yetersiz kalır. Ancak sekonder enfeksiyonlarda veya reaktivasyonun ardından viral tutunmanın antikorlar tarafından inhibisyonu virus enfektivitesi ve yayılımı üzerinde önemli etkiye sahiptir (Babiuk ve ark., 1996). Sonuçta, primer enfeksiyon için antikorlar hücresel immuniteye göre daha az öneme sahiptir. Bunun aksine sekonder enfeksiyonlarda antikorlar enfeksiyonu önlemede ve virusun temizlenmesinde hücresel immuniteye göre daha önemlidir (Babiuk ve ark., 1996). BoHV-1 ile primer enfeksiyonda güçlü humoral ve hücresel immun yanıt oluşur. Hücresel immun yanıt enfeksiyon sonrası yaklaşık 5. günde ilk kez tespit edilir ve yaklaşık 8-10 günde en yüksek seviyeye ulaşır. Nötralizan antikorlar, IgM ve bunu takiben IgG sınıfı, genellikle enfeksiyon sonrası 10.gün civarında tespit edilir. BoHV-1 enfeksiyonunu takiben nazal ve genital salgılarda nötralizan IgA da bulunabilir. Nötralizan antikorların hücre dışı virusu elimine edebilmelerine rağmen, hücresel immun yanıtın hastalığın iyileşmesinde etkili olduğu belirtilmiştir (Wyler ve ark., 1989; Scott, 1989; Straub, 1990; Babiuk ve ark., 1996). Sistemik humoral immun yanıtta öncelikle IgG ve IgM türünden antikorlar görev alır. BoHV-1 e karşı gelişen antikorların üretiminin enfeksiyondan sonraki yaklaşık günlerde başladığı ve 5,5 yıl kadar vücutta kaldığı bildirilmiştir (Chow, 1972; Gibbs ve Rweyemamu, 1977). Bu antikorların 5,5 yıl kadar vücutta kalabilmesinin arasıra tekrar uyarımların meydana gelmesine bağlı olduğu da 11

24 bildirilmiştir (Kahrs, 1977). Aşılama sonrasında ise, antikorların 3 yıl süreyle tespit edilebilir seviyelerde kaldığı gösterilmiştir (Hage ve ark., 1998). BoHV-1 enfeksiyonunda, gb, gc, gd ve ge glikoproteinlerine karşı üretilen antikorlar (Tikoo ve ark., 1995), viremi ve buna bağlı gelişen hastalığı önlemektedir (Mechor ve ark., 1987). BoHV-1 enfeksiyonlarında oluşan immunitede, lokal olarak nazal ve genital sekresyonlarda tespit edilebilen IgA sınıfı antikorların da rolü bulunmaktadır (Ludwig, 1983). Doğal kazanılmış herpesvirus bağışıklığı hastalığın şiddetini azaltmaktadır. Fakat bu, latentliğin oluşmasını, tekrarlayan hastalığın veya reenfeksiyonun gelişmesini engellememektedir (Aynı virus suşu ile otoinokulasyon yapılsa bile). Bu, virusa tekrar maruz kalmada herpesvirus spesifik T hücresi cevabının geçici tersdüzenlenmesine bağlıdır (Lemaire ve ark, 2000). BoHV-1 gc bölgesi üçüncü komplement bileşenine (C3) bağlanabilmektedir. Bu bağlanma C3 dönüşümünü engellemekte ve bu durum komplement sisteminin alternatif yolunu bloke etmektedir (Huemer ve ark., 1993). BoHV-1 enfeksiyonunu takiben MHC sınıf 1 ekspresyonu azalmaktadır (Hariharan ve ark., 1993). Bu durum viral patogenezde önemli olmaktadır; çünkü antijen varlığının gösterilememesi virusun sitotoksik lenfositler tarafından tespit edilememesine neden olmaktadır (Engels ve Ackerman, 1996). BoHV-1 enfeksiyonunun indüklediği immun yanıt, bir erken spesifikolmayan faz ve bir geç herpesvirus spesifik efektör fazı içermektedir. Enfeksiyonun spesifik-olmayan fazında görev alan ana faktörler NK hücreleri ve/veya interferondur. Bunlar erken enfeksiyonda görev almakta ve böylelikle enfeksiyonun büyümesini kısıtlamakta ve virus miktarını azaltmaktadırlar. Humoral ve hücre aracılı cevaplar spesifik efektör fazda görev alırlar. Herpesvirus spesifik antikorları enfeksiyondan sonraki 5-10 uncu günde ilk kez gözlenirler ve bunlar uzun süreli persiste kalırlar. Bir rekürrent (tekrarlayan) hastalık durumunda antikor titreleri, 12

25 rekürrensi göstermeyenlere oranla daha yüksektir. Bu durum latent virusun reaktive olma eğilimini açıklamaktadır (Lemaire ve ark. 2000). BoHV-1 e karşı oluşan humoral immun yanıt, virusun latentliğini önleyememekte ancak tekrarlayan (rekürrent) enfeksiyonların sıklığını ve saçılan virus miktarını etkileyebilmektedir (Gregersen ve Wagner, 1985). Guy ve Potgieter (1985) BoHV-1 in primer ve sekonder inokulasyonu ve indüklenmiş abort olaylarından sonra antikor oluşum kinetiğini incelemişlerdir. Bu araştırıcılar IgM ve IgG antikorlarının primer enfeksiyondan 7 gün sonra ortaya çıktığını bildirmişlerdir. Araştırıcılar ayrıca, gebe olmayan ineklerde maksimum IgG düzeyine enfeksiyondan 35 gün sonra, gebe olanlarda ise 14 gün sonra ulaşıldığını belirtmişler ve IgM aktivitesinin ise her iki grupta da enfeksiyondan 14 gün sonra oluştuğunu ortaya koymuşlardır. Maternal antikorların, hayvanların 2 aylıkken sütten kesilmesinden sonra 123 gün kadar bulunabildiği bildirilmiştir (Fulton ve ark., 2004). Yeni doğanlar, BoHV-1 enfeksiyonundan, aşılı annelerin kolostrumunu alarak korunabilmekte (Mechor ve ark., 1987), ancak maternal antikorlar BoHV-1 ile latent enfeksiyonu önleyememektedirler (Scahw, 2000). Bununla birlikte, IBR-IPV enfeksiyonlarının, maternal antikor almamış ya da yetersiz almış hayvanlarda çok daha şiddetli seyrettiği, bunun yanısıra kolostrum alan hayvanların 1-6 ay kadar pasif olarak korunabildiği tespit edilmiştir (Menanteau-Horta ve ark., 1985). 13

26 Teşhis Klinik Teşhis BoHV-1 enfeksiyonlarında belirgin klinik bulgular ve histopatolojik lezyonlar gözlenebilmekle birlikte, herhangi bir patognomonik bulgu bulunmamaktadır. Ayrıca, BoHV-1 in sebep olduğu atipik hastalık olguları da tanımlanmıştır (Gibbs ve Rweyemamu, 1977). Bu nedenle tam bir teşhis, virusun ve spesifik antikorların tespitine dayanan laboratuvar metotları ile yapılabilmektedir (Wyler ve ark., 1989) Laboratuvar Teşhisi Virus İzolasyonu ve Viral Antijen Tespiti Virus izolasyonu için primer ve sekonder dana böbrek, akciğer ve testis hücreleri, fötal dana trachea veya turbinata hücreleri ile MDBK gibi devamlı hücre kültürleri kullanılabilmektedir (Wyler ve ark., 1989). Virusun üremesini takiben monospesifik BoHV-1 antiserumu kullanılarak yapılan nötralizasyon ile virusun identifikasyonu mümkün olabilmektedir (Straub, 1987). Semende BoHV-1 in tespit edilmesi, seminal plazmanın hücre kültürlerine toksik etkisi ve virus nötralizasyon aktivitesine sahip olması nedeniyle oldukça güç olmaktadır (Drew ve ark., 1987; Goffaux ve ark., 1976). Semenin hazırlanmasındaki bazı uyarlamaları içeren birkaç hücre kültürü tekniği bildirilmiştir. Bunlar, toksisitenin giderilmesi için semenin sulandırılması, adsorbsiyondan sonra fazla miktarda yıkama ve santrifuj basamaklarını içermektedir (Goffaux ve ark., 1976). Teşhis için, hücre kültürü uygulamalarına gerek duyulmayan, antijen tespitine dayalı metotlar geliştirilmiştir. Bunlardan biri, nazal, okuler ve genital swablardan immunfluoresan teknikleri (IFT) ile direkt antijen tespiti olarak gösterilmiştir (Reed ve ark., 1971; Terpstra 1979; Slim ve Elazhary, 1983). Bu tekniğin, hızlı bir teşhise 14

27 olanak vermesi avantajının yanısıra, virus izolasyonuna göre daha az duyarlı olduğu bildirilmiştir (Edwards ve ark., 1983). Ayrıca, IFT ile test edilecek nazal sürüntülerin taze olması (Slim ve Elazhary, 1983), mukopurulent veya hemorajik değil de seröz olması durumunda daha iyi sonuç alındığı bildirilmiştir (Terpstra, 1979). BoHV-1 teşhisinde kullanılan antijen tespitine dayalı yöntemlerden bir diğeri de fikse edilmiş akciğer dokularının immunperoksidaz tekniği ile boyanması olarak bildirilmiştir (Wyler ve ark., 1989). Viral antijenin direkt ve hızlı tespitinde diğer bir yöntem, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tekniğinin kullanımıdır. Antijen, mikrotabletin gözlerine kaplanmış monoklonal veya poliklonal antikorlar ile tutulabilmekte, bu şekilde nazal sürüntülerde BoHV-1 antijeninin tespiti mümkün olabilmektedir (Collins ve ark., 1988) Viral Nükleik Asit Tespiti Son yıllarda, şüpheli materyallerde BoHV-1 DNA sının tespiti için DNA-DNA hibridizasyon ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi birçok yöntem bildirilmiştir. Rutin teşhiste PCR yöntemi, giderek artan bir kullanım alanı bulmaktadır (Moore ve ark., 2000). PCR, virus izolasyon yöntemlerine göre daha duyarlı ve hızlı olmasının yanısıra, latent enfekte gangliyonda viral DNA nın tespitine olanak sağlamaktadır (Van Engelenburg ve ark., 1993). Xia ve ark. (1995) deneysel olarak enfekte edilmiş, Van Engelenburg ve ark. (1993) ise doğal enfekte semen örneklerinde BoHV-1 DNA sının tespiti için PCR yöntemini kullanılmışlardır. Araştırıcılar, örnek hazırlanması, primer ve enzimlerin konsantrasyonları gibi PCR şartlarının iyi bir şekilde optimize edilmesinin önemli olduğunu bildirmişlerdir. 15

28 BoHV-1 e ait tymidinkinaz (TK), gb, gc, gd ve ge genleri PCR amplifikasyonu için hedef olarak kullanılmaktadır. ge dizinlerinin tespitine dayalı PCR yöntemleri, vahşi tip virus ile ge gen bölgesi çıkarılmış marker aşı suşlarının ayrımında kullanılabilmektedir (Fuchs ve ark., 1999; Schynts ve ark., 1999). Aynı zamanda, BoHV-1 ile BHV-5 viruslarının birbirinden ayrımında kullanılan PCR teknikleri de geliştirilmiştir (Ashbaugh ve ark., 1997; Ros ve ark., 1999) Serolojik Testler Virus nötralizasyon (VN) testleri ve çeşitli ELISA sistemleri BoHV-1 e karşı serumda oluşan antikorların tespitinde kullanılmaktadır (Kramps ve ark., 1993). İndirekt fluoresan antikor tekniği, alternatif bir serolojik test olarak uygulanabilmektedir (Miller ve Wilkie, 1979). VN testleri çeşitli modifikasyonlarla uygulanabilmektedir. Testler, kullanılan virus suşuna, serumun başlangıç sulandırmasına, inkubasyon periyoduna, kullanılan hücre tipine ve testin okunma zamanına bağlı olarak farklılıklar göstermektedir (Perrin ve ark., 1993). VN testi, BoHV-1 spesifik antikorları tespit etmede oldukça duyarlı ve spesifik olup, eradikasyon programlarında referans test olarak kullanılmaktadır (Wyler ve ark., 1989). Son yıllarda, BoHV-1 e karşı oluşan antikorların tespitinde VN testlerinin yerini ELISA teknikleri almaktadır. ELISA için standart bir prosedür henüz oluşturulmamıştır. İndirekt ve blocking ELISA ları içeren bir çok ELISA tipi mevcuttur. Serum ve sütte antikorların tespitine olanak sağlayan birçok ELISA kiti ticari olarak bulunmaktadır. Ülke bazında standardizasyon için kitlerin niteliği ve kalitesi karşılaştırılmalı ve her grup örnek, ulusal referens laboratuvarı tarafından önceden tanımlanan kriterler ile test edilmeli, daha sonra ülkedeki diğer laboratuvarlarda kullanılmalıdır. 16

29 ELISA prosedürlerinin birçok varyasyonu bulunmaktadır. En çok kullanılan; antijen hazırlanması ve kaplama, test örneklerinin sulandırılması, antijen ve test örneklerinin inkubasyon periyodu, konjugat eklenmesi ve substrat/kromojen solüsyonunun eklenmesidir. Rutin kullanıma başlamadan önce, ELISA sisteminin geçerliliği, sensitivite ve spesifitesinin tespitiyle sağlanmalıdır. Bunun için bir grup iyi tanımlanmış (örn. VN testi ile) güçlü pozitif, zayıf pozitif ve negatif serum test edilmelidir. BoHV-1 testlerinin standardizasyonu için OIE nin öngördüğü uluslararası standartlara göre hazırlanmış güçlü pozitif, zayıf pozitif ve negatif serumlar, OIE IBR/IPV referens laboratuvarlarında bulunmaktadır (Perrin ve ark., 1994). Blocking veya competitive ELISA tekniklerinin prensibi, antijenin enzimle işaretli BoHV-1 antiserumu veya anti-bohv-1 monoklonal antikoruna bağlanmasının test örneğindeki antikorlar tarafından bloke edilmesi temeline dayanmaktadır. İndirekt ELISA sistemleri ile blocking ELISA lar karşılaştırıldığında, blocking ELISA ların genellikle daha duyarlı olduğu tespit edilmiştir (Perrin ve ark., 1993). Son zamanlarda, marker aşılarla birlikte kullanım alanı bulan ve aşılı popülasyonlardaki enfekte sığırları tespit etmede kullanılan ge ELISA sistemleri geliştirilmiştir (Van Oirschot ve ark., 1997; Wellenberg ve ark., 1998) Kontrol ve Eradikasyon BoHV-1 enfeksiyonunun kontrolünde temel strateji, ekonomik kayıpların ve salgınların önlenmesi ile sığır populasyonlarında saha virusu sirkülasyonunun azaltılması olarak bildirilmiştir (Kaashoek ve ark., 1994). Enfeksiyonun, kombine bir kontrol programı ile önlenebileceği (Ackermann ve ark., 1990), sığır popülasyonlarında oldukça yaygın olarak görüldüğü ve bu nedenle düzenli bir aşılama programının gerekliliği belirtilmiştir (Straub, 1990; Van Donkersgoed ve Babiuk, 1991). 17

30 Eradikasyon Hayvan Hastalıkları Dünya Örgütü (OIE), IBR/IPV enfeksiyonunu B grubu ihbari mecburi hastalık olarak bildirmiştir (OIE, 2004). OIE B grubu hastalıkları, sosyoekonomik ve/veya halk sağlığında önemi olan ve uluslararası ticarette dikkate alınması gereken bulaşıcı hastalıklardır. BoHV-1 tüm dünyada sığırcılık işletmelerinde yaygın olarak görülmektedir. Enfeksiyon prevalansının yüksek olduğu ülkelerde, enfekte sığırların oranını azaltmak için, marker aşılara dayalı aşılama programı uygulanmasının, BoHV-1 eradikasyonunda ilk aşama olabileceği bildirilmiştir (Van Oirschot, 1999). Birçok Avrupa ülkesinde, aşılama, sürü izolasyonu, sınır kontrolü ve kesim uygulamalarını içeren eradikasyon programları uygulanmaktadır (Kahrs, 2001). Amerika Birleşik Devletleri nde solunum sistemi enfeksiyonları büyük ekonomik kayıplara yol açtığından söz konusu hastalığın kontrolü, aşılama stratejisine dayanmaktadır (Wyler ve ark., 1989). Kontrol programlarının amacı, klinik hastalığı kontrol etme ve enfeksiyonu elimine etme temeline dayanmaktadır. Aşılamalar bireyleri hastalığa karşı korurken, enfeksiyona karşı koruma oranları düşük olabilmektedir (Rouse ve Babiuk, 1978). Aşılama temeline dayanan bir eradikasyon programı planlanırken, kullanılacak aşı türünün seçimi oldukça önemlidir. İnaktive ve atenüye marker aşılar birçok ülkede bulunmaktadır (Kaashoek et al., 1994, 1995). Aşılar oldukça güvenli olmakla birlikte, canlı marker aşılar bazen latentlik oluşturabilmektedir (Scahaw, 2000). 18

31 Aşılar BoHV-1 enfeksiyonunun kontrolünde, inaktif virus aşıları ve modifiye canlı virus aşılarını içeren konvansiyonel aşılar ile marker aşılar kullanılmaktadır (Frerichs ve ark., 1982; Kaashoek ve ark., 1994). Aşıların, hastalığın şiddetini azalttığı fakat genellikle enfeksiyonun oluşmasını önleyemediği bildirilmiştir (Fenner ve ark., 1993). Çok çeşitli konvansiyonel ve marker aşılar bulunmakta, genellikle multivalan aşı olarak diğer patojenlere (solunum hastalıkları kompleksinin kontrolü) karşı olan aşılarla kombine olarak kullanılabilmektedir (Fulton ve ark., 2003). Konvansiyonel aşılar kullanılarak uygulanan aşılama programlarının, latentlik, abortlar, immunsupresyon, virulens kazanma ve enfeksiyondan korumada başarısızlık gibi problemleri beraberinde getirdiği bildirilmiştir (Van Drunen Littelvan den Hurk ve ark., 1993). Diğer taraftan, konvansiyonel aşıların kullanımı, aşılama sonrası oluşan antikor yanıtı ile enfeksiyondan sonra meydana gelen antikor yanıtının ayırt edilmesini engellemektedir. Etkin bir kontrol programı uygulayabilmek için aşılı ve enfekte hayvanların birbirinden ayrılması gerekliliği nedeniyle son yıllarda, glikoprotein E taşımayan aşı virusları ile hazırlanan marker aşılar geliştirilmiştir. Böylelikle spesifik serolojik testler kullanılmak suretiyle, marker aşılar, aşılama ile enfeksiyonu ayırt etmeye olanak sağlamaktadırlar (Kaashoek ve ark., 1994; Van Oirschot ve ark., 1996; Lemaire ve ark., 1999). Marker aşıların aynı zamanda BoHV- 1 in bulaşma oranını azaltmakta etkili olduğu, güvenilir ve etkin bir aşı olarak kontrol veya eradikasyon programlarında kullanılabildiği bildirilmiştir (Kaashoek ve ark., 1994, 1995). 19

32 1.2. Antikor Aviditesi Avidite, antijenlerle antikorlar arasında oluşan kompleksin genel stabilitesinin bir ölçümüdür. Bir antijen antikor etkileşiminin toplam gücü, 3 büyük faktör tarafından düzenlenir; antikorun epitopa göre intrinsik affinitesi, antikor ve antijenin etkinliği ve etkileşime giren komponentlerin geometrik düzeni. Avidite tam bir reaksiyonu tanımladığından, bu değer sonuçta tüm immunokimyasal tekniklerin başarısını tespit etmektedir (Harlow ve Lane, 1988). Antikor aviditesi, serum antikorlarının antijenlere bağlanmak için olan fonksiyonel affinitelerinin bir ölçümüdür. Mikroorganizmaların yüzeyinde bulunan çok sayıda antijenik determinant ile poliklonal antikorlar arasında bir multivalan bağlanma söz konusudur. Bu bağlanmanın gücü de tüm itici ve çekici güçlerin toplamıdır ve antikor aviditesi (fonksiyonel affinite) olarak tanımlanır. Monovalan bir antijen ile monoklonal bir antikor arasındaki bağlanmanın gücü ise antikor afinitesi (intrinsik afinite) olarak tanımlanır (Harlow ve Lane, 1988). Antikorların multivalan antijenlere bağlanma gücü olarak adlandırılan avidite genellikle primer akut enfeksiyonlarda düşüktür ve immun sistemin matürasyonu ile yükselir. Avidite, katı faz elüsyon yönteminin kullanıldığı ve spesifik IgG antikorlarının tespit edildiği ELISA metotlarıyla hızlı bir şekilde saptanabilir. Primer immun yanıtın erken dönemlerinde düşük aviditeli, geç dönemlerinde ise yüksek aviditeli spesifik IgG antikorları mevcuttur. Reaktivasyon/reenfeksiyon gibi sekonder immun yanıt durumlarında da yine yüksek aviditeli antikorlar tespit edilmektedir. Serum örneklerinde spesifik IgG aviditesinin hesaplanması viral enfeksiyonların tanısına yardımcı olmanın yanında, özellikle primer ve sekonder enfeksiyonların ve reaktivasyonun ayırdedilmesinde oldukça güvenilir bulgular sağlamaktadır (Yan ve Fedorko, 2002). Antikorların aviditelerinin artması, antijen-antikor komplekslerinin ortamda bulunan protein denatüre edici maddelere karşı daha stabil olmalarına neden 20

33 olmaktadır ve buna bağlı olarak da, bu maddelerle düşük aviditeli antikorlar ortamdan uzaklaştırılabilirken, yüksek aviditeli antikorlar stabil kalabilmektedir. Buna dayanarak immunolojik testlerde üre, dietilamin, guanidin hidroklorid gibi protein denatüre edici maddelerin kullanılması ile antikorların aviditeleri hesaplanabilmektedir (Blackburn ve ark., 1991). Antikor aviditesinin hesaplanmasında 2 yöntem kullanılmaktadır; Dilüsyon yönteminde, protein denatüre edici madde serum dilüentine eklenerek düşük aviditeli antikorların solid fazdaki antijene bağlanmaları engellenmekte, yüksek aviditeli antikorlar ise bağlanabilmektedir. Elüsyon yönteminde ise protein denatüre edici madde antijen-antikor kompleksi oluştuktan sonra ortama eklenmekte böylece düşük aviditeli antikorlarla oluşmuş antijen-antikor kompleksi arasındaki bağların ayrışmasına neden olmakta, ancak yüksek aviditeli antikorlarla meydana gelen antijen-antikor komplekslerine etki etmemektedir. Her iki yöntemde de serumların protein denatüre edici madde içeren ve içermeyen solüsyonlarla paralel olarak çalışılması öngörülmekte ve test sonucunda her bir serum örneği için elde edilen iki absorbans (optik dansite:od) karşılaştırılarak antikor aviditesi hesaplanmaktadır. Ticari olarak kullanıma sunulmuş olan enzim immün assay prensibi ile çalışan kitlerde elüsyon yöntemi kullanılmakta ve sonuçta Avidite İndeksi (AI) şu formül ile hesaplanmaktadır; AI = OD (protein denatüre edici madde içeren test) / OD (protein denatüre edici madde içermeyen test) x 100 (Tuokko, 1995). Antikorun affinitesi veya aviditesi hayvanların immunizasyonundan sonra zaman içerisinde progresif olarak artar; bu durum, immün yanıtın matürasyonu adını alır. Bu fenomen, virus enfeksiyonlarından sonraki konakçı immun yanıtında da görülmektedir ve tek bir serum örneğinde IgG antikorunun aviditesinin ölçümü ile bir virus enfeksiyonunun teşhisine olanak sağlamaktadır. Genellikle, virusa karşı serumda oluşan IgG antikorunun tespiti diyagnostik bir değer taşımamaktadır. Çünkü IgG antikoru virus enfeksiyonlarından sonra uzun süre varlığını devam ettirir. Bu nedenle çift serum örneği arasındaki antikor titrelerindeki artışın tespiti gereklidir. Bunun için ilk serum örneği, enfeksiyondan sonra mümkün olabilen en erken 21

34 zamanda alınmalıdır. Ancak, çift serumun iyi zamanlamalı toplanması genellikle zor olmaktadır. Serumda IgG antikorunun yüksek veya düşük seviyeli olarak tespit edilmesiyle, serumun enfeksiyondan kısa veya uzun bir süre sonra alındığı saptanabilir. Bununla birlikte viruslara karşı antikor aviditesinin ölçümü kolay değildir. Viral antijenler büyük ölçüde tekrarlayan antijenik determinantlar içerdiğinden, hapten-antikor interaksiyonları için equilibrium diyaliz tekniği veya %50 lik ammonyumsülfat ile çökmeyen çözünebilir proteinlere karşı antikor düzeyinin tespiti gibi yöntemler kullanılamamaktadır (Inouye ve ark, 1984). Inouye ve ark. nın (1984) bildirdiğine göre, Webster, influenza virusları ile tavşanların immunizasyonundan sonra avidite değişimini equilibrium filtrasyon tekniği ile çalışmıştır. Fakat bu teknik zaman alıcı ve zahmetli olduğundan rutin diyagnostik olgular için uygun bulunmamıştır. Sonraki zamanlarda, Lehtonen ve Meurmann rubella enfeksiyonundan sonra, avidite değişimini ELISA yöntemini kullanarak çalışmıştır. Bu ELISA sisteminde, enfeksiyondan sonraki kısa ve uzun dönemde alınan serumlar arasındaki antikor titrasyon eğrilerinin farklılıkları tespit edilmiştir. Inouye ve ark. (1984) relatif antikor aviditesini değerlendirmek için, viral enfeksiyonların diyagnozunda tek serum örneğinin kullanılabildiği basit bir ELISA prosedürü geliştirmişlerdir. Bu teknikte, solid-faz antijenlere düşük aviditeli antikorların bağlanmasını önlemek için serum sulandırmalarına düşük konsantrasyonda protein denatürantı eklenmiştir ve denatüranın olduğu ve olmadığı gözlerden elde edilen antikor titrasyon eğrileri karşılaştırılmıştır. HSV, CMV, EBV ve HHV6 enfeksiyonlarında, IgM antikorunun varlığı primer enfeksiyonun, reenfeksiyon veya reaktivasyonun teşhisi için yeterli değildir. Bu antikorlar, küçük miktarlarda üretildiklerinden veya hiç üretilmediklerinden tespit edilmeleri zor olmakta ve bu nedenle yanlış negatif sonuç verebilmektedirler. Yanlış pozitif sonuçlar ise IgM antikorlarının uzun süreli persistensinden ve söz konusu enfeksiyonla ilgisiz olarak bulunabilmelerinden kaynaklanmakta, pozitif bulgularda reaktivasyon veya reenfeksiyondan da kaynaklanabilmektedir (Gutierrez ve ark., 1997). 22

35 Ayrıca HSV enfeksiyonunda IgM yanıtı primer faza özgü değildir, IgM persistensi veya tekrar oluşumu, tekrarlar sırasında çoğunlukla gözlenmektedir. Bu zorlukları gidermek ve primer HSV enfeksiyonlarının ayrımını yapmak için polimerik formda spesifik IgA antikorlarını varlığına yönelik bir serodiyagnostik yaklaşım geliştirilmiştir. Ancak bu teknik birçok karmaşık prosedürü gerektirdiğinden fazla pratik bir metot olarak görülmemektedir (Hashido ve ark., 1997). IgA antikorları ve düşük aviditeli IgG antikorları, yeni oluşmuş primer enfeksiyonun belirleyicisidir. IgA antikorları primer enfeksiyonda, IgM antikorlarından daha sonra oluşur ve reaktivasyonda da bulunur. Spesifik IgG antikor aviditesinin tespiti, serolojik diyagnozda oldukça duyarlı ve spesifik bir metottur. Bu metot aynı zamanda primer enfeksiyonun yaklaşık noktasını ve reaktivasyondan ayrımını tespit etmek için de kullanılabilir. Genellikle, ilk antijen etkisinden sonra, IgG aviditesi düşüktür ve takip eden haftalarda ve aylarda B-lenfositlerin matürasyonu ve antijen uyarımının azalmasından dolayı yükselir (Gutierrez ve ark., 1997). Primer herpesvirus enfeksiyonlarının %70-80 i asemptomatik seyrettiğinden primer enfeksiyonlar ile primer olmayan enfeksiyonların ayrımı klinik olarak yapılamaz. Bu nedenle serolojik testler sadece epidemiyolojik ve etiyolojik çalışmaları değil, aynı zamanda herpesvirus enfeksiyonlarındaki klinik çalışmaları da aydınlatmaktadır. Viral enfeksiyonların teşhisinde primer enfeksiyonların tespiti IgM veya IgG saptanması ve titrelerinin akut ve konvalasen-faz serum örneklerinde karşılaştırılmasına dayanmaktadır. Bununla birlikte çift serum örneğinin doğru zamanda toplanması çok mümkün olmamaktadır. Son zamanlarda yapılan çalışmalarla, primer enfeksiyonlardan sonra düşük aviditeli antikorları kapsayan erken spesifik IgG yanıtı ve birkaç ay içerisinde aviditenin matürasyonu gözlenmiştir. Düşük aviditeli antikor denatürasyon teknikleri rubella, varicellazostervirus, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 ve toxoplasma gibi birçok enfeksiyöz ajanın neden olduğu hastalıkların teşhisinde 23

36 başarıyla kullanılmaktadır (Kangro ve ark., 1991; Ward ve ark., 1993; Gray, 1995; Hashido ve ark., 1997; Akingbade ve ark., 2003). Protein denatüre edici ajanlar ve bir ELISA testinin modifikasyonu kullanılarak, primer genital herpes simplexvirus (HSV) enfeksiyonları ile primer olmayan enfeksiyonların ayrımında bir IgG antikor avidite testi uygulanmıştır. Primer, rekürrent ve primer olmayan ilk dönem genital herpes enfeksiyonu bulunan 49 serum örneği çalışılmıştır. Denatüre edici ajanlar olarak 6 M üre, 8 M üre ve 35 mm diethylamin (DEA) kullanılmıştır. En iyi ayrım 6 M üre muamelesi ile elde edilmiştir ve avidite indeksleri enfeksiyon sonrası 100. güne kadar olan serumlarda ve enfeksiyon sonrası 100. günden sonraki serumlarda olarak belirlenmiştir. Rekürrent ve primer olmayan ilk dönem enfeksiyonları arasında belirgin bir avidite indeksi farkı gözlenmemiştir. Primer ve rekürrent veya primer olmayan ilk dönem genital herpes enfeksiyonlarının ayrımında IgG aviditesinin serolojik bir belirleyici olduğu gösterilmiştir ve bu prosedürün, IgM veya IgG antikor titrelerindeki artışın tespitinin fazla önem taşımadığı kronik enfeksiyöz hastalıkların teşhisinde özellikle faydalı olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada aynı zamanda, rekürrent enfeksiyon gösteren hastalardan alınan serumlar, primer olmayan ilk dönem enfeksiyonu gösteren hastalardan alınan serumlara göre daha geniş çapta ve daha düşük değerlerde avidite indeksi göstermiştir fakat belirgin bir farklılık tespit edilmemiştir (Hashido ve ark., 1997). Inouye ve ark. (1984) tarafından yapılan bir çalışmada, viruslara karşı ELISA yöntemi ile serum IgG aviditesini saptamak için, serumun bir seri iki katlı sulandırmaları için çift sıra göz kullanılmış; bir sıraya düşük konsantrasyonda protein denatüranı eklenmiş ve düşük aviditeli antikorların solid fazdaki viral antijenlere bağlanması engellenmiştir. Daha sonra, her iki gözden elde edilen antikor titrasyon eğrileri karşılaştırılmıştır. Denatüranın eklenmesi, eğrilerin paralel olarak sola kaymasına neden olmuş ve kaymanın derecesi, çalışılan üç enfeksiyonda da (Japanese Encephalitis Virus, Rotavirus, Rubella Virus Enfeksiyonları) erken serum örneklerinde geç serum örneklerinden fazla bulunmuştur. Bu prosedür serumda 24

37 antikor aviditesinin tespitinde ve viral enfeksiyonların tek serum örneği ile teşhisinde yararlı bulunmuştur (Akingbade ve ark., 2003). IgG antikor aviditesinin tespiti, tek serum ile teşhiste IgM antikor tespitine alternatif bir metot olarak gösterilebilmektedir. Bu metodun yanlış negatif ve yanlış pozitif sonuçlarının minimum düzeyde olduğu tespit edilmiştir. IgG antikoru avidite prosedürünün, sadece yeni geçirilmiş ve eski viral enfeksiyonların ayrımında değil, aynı zamanda reenfeksiyon (yüksek antikor titresi, yüksek avidite) ile primer enfeksiyonun (yüksek antikor titresi, düşük avidite) ayırt edilmesinde de yol gösterici olduğu tespit edilmiştir (Inouye ve ark., 1984; Bodeus ve ark., 1998; Yan ve Fedorko, 2002) Araştırmanın Amacı Anabilim dalımızda BoHV-1 sürü dinamiğinin izlenmesi amacıyla yapılan bir çalışmada, tespit edilen nötralizan antikor düzeylerinin çok kısa süreli stabilitesi, bu antikorların aviditesi ile ilgili soruları gündeme getirmiştir (Güngör, 2003). Araştırmada, yukarıda bahsedilen çalışma ile BoHV-1 enfeksiyonunun varlığının ve olası rekürrenslerin tespit edildiği serum örneklerinde IgG antikor aviditesinin hesaplanması ve böylelikle mevcut antikorların kaynağının primer enfeksiyon mu, yoksa bir reenfeksiyon veya reaktivasyon mu olduğunun belirlenmesi ve BoHV-1 enfeksiyonlarında antikor aviditesinin ölçülmesinin pratikte getirebileceği diyagnostik avantajların araştırılması amaçlanmıştır. 25

38 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Gereç Hücre Kültürü ELISA antijeni hazırlamak için kullanılacak virusların üretilmesi amacıyla Primer Dana Fötal Akciğer (PDFA) hücre kültürü kullanıldı. Hücrelerin üretilmesi amacıyla ise % 10 Fötal Dana serumu (FDS) içeren, Streptomisin ve Penisilin ile desteklenmiş Dulbecco s Modified Essential Medium (DMEM; Biochrom) dan yararlanıldı Viruslar Antijen hazırlamak amacıyla, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı virus koleksiyonunda yer alan BoHV-1 referenz suşu (Cooper) ile 5 adet BoHV-1 izolatı (ANK 1, ANK 2, ANK 3, ANK 4 ve ANK 5) kullanıldı Kontrol Serumlar Pozitif kontrol serum olarak, BoHV-1 nötralizasyon pozitif olup SN 50 değeri 1/64 değerinden büyük olan bir sığır serumu, negatif kontrol serum olarak ise fötal dana serumu kullanıldı Araştırmada Kullanılan Hayvanlar Daha önce Anabilim Dalımızda yapılan bir çalışmada (Güngör, 2003), tüzel nitelikli bir süt sığırcılığı işletmesindeki hayvanlardan 2 yıl boyunca 3 er ay aralıklarla yapılan toplam 6 örneklemede alınan kan serumu örnekleri ile bu çalışmadaki son 26

39 örneklemeden 1,5 yıl sonra ve bunu takiben 1. yıl sonunda alınan kan örnekleri kullanıldı. Söz konusu çalışmada, ilk örnekleme döneminde hayvanların 6-8 aylık, aşısız ve seronegatif olmalarına özen gösterilmiştir. Bu hayvanların ikinci örnekleme sırasında serokonverte oldukları, bunu takip eden örneklemelerde serokonversiyonun artarak devam ettiği tespit edilmiştir. Zaman içerisinde değişik nedenlerle meydana gelen kayıplar sebebiyle hayvan sayılarında azalmalar meydana geldi. Bu hayvanların örneklemeler bazında sayısal dağılımları Çizelge 2.1. de gösterildi. Çizelge 2.1. Yapılan örneklemelerde hayvanlardan alınan ve mevcut olan serum numunelerinin tarihleri ve örneklemelere göre sayısal dağılımları ÖRNEKLEME TARİH HAYVAN SAYISI I 23 Kasım * II 23 Şubat * III 21 Mayıs * IV 25 Eylül * V 11 Şubat * VI 5 Kasım * VII 30 Haziran VIII 12 Mayıs TOPLAM 687 * Güngör, 2003 de kullanılan materyallerdir. Yapılacak çalışmada, hayvanların birbirini takip eden örneklemeleri sonucunda tespit edilen avidite indekslerindeki değişimlerin değerlendirilmesi planlandığından, ard arda örneklemelere ait kan serumları var olan hayvanlar belirlendi. Bu doğrultuda, birbiri ardına 8 kez örneklemenin her birinde bulunan hayvanlar ile ilk 6, son 6 ve ilk 4 örneklemede materyal sağlanan hayvanların kulak numaraları çizelge 2.2. de gösterildi. 27

40 Çizelge 2.2. Tüm örneklemeler, ilk 6 örnekleme, son 6 örnekleme ve ilk 4 örneklemede bulunan hayvanların kulak numaraları Tüm örneklemeler İlk 6 örnekleme Son 6 örnekleme İlk 4 örnekleme ADET 16 ADET 21 ADET 13 ADET 28

41 2.2. Yöntem Antijen Hazırlanması Virusların Üretilmesi ELISA antijeni hazırlanması amacıyla üretilecek virusların inokule edileceği hücre kültürünün herhangi bir intrinsik kontaminant içermemesi gerekliliği göz önünde bulundurularak, PFDA hücre kültürü, BVDV kontaminasyonu yönünden Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) tekniği ile kontrol edildi. Hücre, BVDV yönünden negatif bulunduktan sonra 25 cm 2 lik hücre kültürü şişelerinde üretildi. BoHV-1 referenz suşu (Cooper) ve izolatların (ANK1, ANK2, ANK3, ANK4, ANK5), hücre kültürlerine ayrı ayrı inokule edilmek suretiyle adaptasyonları sağlandı. Bunu takiben 150 cm 2 lik hücre kültürü şişelerinde üretilen PFA hücre kültürlerinin her birine, adapte edilmiş olan izolatlardan 0,01 moi oranında inokule edildi saat içerisinde %80 in üzerinde CPE oluşumu gözlendi ve viruslar saflaştırma işleminde kullanılmak üzere -80 C de muhafaza edildi Virusların Saflaştırılması Bu amaç için Bolton ve ark. (1981) ile Collins ve ark. (1984) tarafından bildirilen teknikler kullanıldı. BoHV-1 izolatları ayrı ayrı 4 C de 3500 rpm devirde 30 dakika süreyle santrifüj edildi ve süpernatantlar ayrıldı. 35 ml sıvı kapasitesine sahip ultrasantrifüj tüplerine %30 luk sükroz çözeltisinden 10 ml koyuldu. Viruslara ait süpernatantlar %30 luk sükroz çözeltisi üzerinde 2. fazı oluşturacak şekilde 20 ml hacimde yerleştirildi ve rpm de 4 saat süreyle santrifüj edildi. Santrifüj sonunda elde edilen pelletler yaklaşık 200 mikrolitre (μl) Phosphate Buffered Saline (PBS) ile sulandırıldı ve tüm tüpler birleştirildi. Karışımdan 20 μl alınarak 1/100 oranında sulandırıldı ve spektrofotometrede 290 nm de okutularak protein konsantrasyonu 0,075 olarak tespit edildi. Antijenin, 1mL hacimde içerdiği protein miktarı önceden bildirilen formüle göre; 0,075 x 100 / 1,35 = 5,6 mg/ml 29

42 olarak hesaplandı. Daha sonra ELISA antijeni, kullanılacağı zamana kadar -80 C de saklandı ELISA Bileşenleri ve Prosedürün Optimizasyonu ELISA antijeninin hazırlanışı, bileşenlerinin standardizasyonu ve prosedürün uygulanışı ile ilgili şema, şekil 2.1 de gösterildi. Şekil 2.1 ELISA testinin uygulanma aşamaları Virusların Üretilmesi Virusların Saflaştırılması ELISA Prosedürü ve Bileşenlerin Standardizasyonu Konjugat ve Blank kontrollerin Optimizasyonu Antijen ve Serum Sulandırmalarının Optimizasyonu Diğer Parametrelerin Kontrolü Bloklama Parametrelerinin Belirlenmesi Kontrol Serumlar ile Antijen Sulandırmalarının Son Nokta Titrasyon Değerlerinin Belirlenmesi Pozitif ve Negatif Serumun Belirlenmesi Kontrol Serumların Belirlenen Konsantrasyonlarda Test Edilmesi Avidite ELISA Testi 30

43 Antijen ve Serum Sulandırmalarının Optimizasyonu Purifiye antijenin ELISA tabletlerinde (Maxisorb; Nunc) 1/100 oranından başlayarak iki katlı artan sulandırmaları hazırlandı. Bu amaçla, purifiye antijen, karbonatbikarbonat çözeltisi (ph:9,6) içerisinde 1/100 oranında sulandırıldı ve ELISA tableti nin ilk sırasına (A-H) 100 er μl koyuldu. Diğer gözlere 50 μl karbonatbikarbonat çözeltisi koyuldu. Çok kanallı mikropipet yardımıyla ilk sıradan başlayarak 11. sıraya kadar 50 μl hacminde antijen sulandırması aktarılarak antijenin 1/ e kadar (1/100, 1/200,...1/102400) sulandırması hazırlandı. 12. sıra boş bırakıldı (Çizelge 2.3). Daha sonra tablet, 4 C de bir gece boyunca inkübe edildi. İnkübasyon sonrası tablet içerikleri döküldü ve tüm gözler 0,01 M PBS çözeltisi (ph:7,4) ile 4 kez yıkama işlemi yapıldı. Bloklama çözeltisi olarak PBS içerisinde %0.05 Tween-20 (Tw-20), %3 süt tozu, %3 at serumu hazırlanarak tabletin tüm gözlerine 100 er μl ilave edildi ve 37 C de 1 saat süreyle inkübasyona bırakıldı. Sürenin sonunda tablet içerikleri döküldü ve PBS çözeltisi ile yukarıda belirtilen şekilde yıkama işlemi yapıldı. Serum sulandırma çözeltisi olarak PBS içerisinde %0,05 Tw-20, %3 süt tozu hazırlandı. BoHV-1 Nötralizasyon SN 50 değeri 64 olan bir serum örneği pozitif serum olarak kullanılmak üzere seçildi. Başka bir tablet içerisinde, pozitif serumun 1/10 dan başlayarak iki katlı artan sulandırmaları hazırlandı (1/10, 1/20,...1/1280). ELISA tabletinin A(1-12) sırasından başlayarak H(1-12) sırasına kadar hazırlanmış olan sulandırmalar aktarıldı (Çizelge 2.4). 1 saat 37 C de inkübasyona bırakıldıktan sonra tablet içerikleri dökülerek PBS çözeltisi ile daha önce belirtilen şekilde yıkama işlemi yapıldı. Konjugat sulandırma çözeltisi olarak PBS içerisinde %0,05 Tw-20 hazırlandı. Konjugat (Tavşan (Rabbit) Anti-bovine IgG peroksidaz konjugat; Sigma) önerilen konsantrasyonda (1/20.000) PBS-Tw-20 içerisinde hazırlandı. Tüm gözlere 100 er μl ilave edildi. 1 saat 37 C de inkübasyon sonrası tablet içerikleri dökülerek PBS çözeltisi ile yıkama yapıldı. 31

44

45 Substrat çözeltisi olarak, fosfat-sitrat tampon çözeltisi içerisinde Ortophenilen Diamin (OPD) hazırlandı. Bu amaçla, 50 ml fosfat-sitrat çözeltisi içerisinde 1 adet (30mg) OPD tablet çözüldü. Bu çözeltiye 1/2000 oranında hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) eklenerek hazırlanan substrat çözeltisinden tüm gözlere 100 er μl ilave edildi. Oda sıcaklığında ve karanlık ortamda 20 dakika süreyle inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda, distile su içerisinde % 6,8 konsantrasyonunda hazırlanan sülfirik asit çözeltisinden tabletin tüm gözlerine 100 er μl eklenmek suretiyle reaksiyon durduruldu. Tablet, ELISA okuyucusunda 492 nm de okutularak optik dansite (OD) değerleri tespit edildi Konjugat ve Boş (Blank) Kontrollerin Test Edilmesi ELISA tableti nin ilk 6 sırası (A-H) ayrılarak 1/600 oranında antijen ile kaplandı. 4 C de bir gece bekletildikten sonra 4 kez PBS ile yıkama işlemi yapıldı. Bloklama solüsyonundan (PBS, %0.05 Tw-20, %3 süt tozu, %3 at serumu) ayrılan gözlere 100 er μl ilave edildi ve 37 C de 1 saat süreyle inkubasyona bırakıldı. Tablet içeriği dökülüp PBS ile 4 kez yıkandı. Konjugat 1/20000 konsantrasyonunda olacak şekilde PBS-%0.05 Tw-20 içerisinde hazırlandı. 1, 2 ve 3. sıralar (A-H) blank olarak ayrıldı ve bu gözlere 100 er μl PBS-Tw-20 ilave edildi. 4., 5. ve 6. sıralar (A-H) konjugat kontrol olarak ayrıldı ve bu gözlere hazırlanmış olan konjugat dilüsyonundan 100 er μl eklendi. 37 C de 1 saat süreyle inkubasyona bırakıldı. Tablet içeriği dökülüp yıkama işlemi yapıldı. Substrat çözeltisi hazırlandı (sitrat buffer-opd çözeltisi içerisinde 1/2000 oranında H 2 O 2 ). Kullanılan tablet gözlerine 100 er μl substrat ilave edildi ve 20 dakika oda sıcaklığında bırakıldı. %6,8 lik H 2 SO 4 ile reaksiyon durduruldu ve 492 nm de optik dansite değerleri saptandı. 33

46 Diğer Parametrelerin Kontrolü Testin uygulanması esnasında oluşan yüksek background değerlerinin giderilmesi için bloklama çözeltilerinin içeriği iki ayrı şekilde hazırlanarak test edildi. Bloklama solüsyonlarından biri PBS içerisinde %0,05 Tween-20, %3 süt tozu ve %3 at serumu olacak şekilde, diğeri ise aynı şekilde ancak at serumu ilave edilmeden hazırlandı ve ayrı ayrı test edildi. Ayrıca, bloklama işlemi 100 μl ve 300 μl miktarında çözelti ile, 1 saat ve 2 saat inkubasyon süresi ile uygulanarak test edildi. Test sisteminde kullanılacak pozitif ve negatif kontrol serumun belirlenmesi için farklı serum örnekleri, belirtilen prosedür dahilinde test edildi ve elde edilen O.D. değerleri karşılaştırıldı Pozitif ve Negatif Kontrol Serumlar ile Antijen Sulandırmalarının Son Nokta Titrasyon Değerlerinin Tespit Edilmesi Purifiye antijen, karbonat-bikarbonat çözeltisi (ph:9,6) içerisinde 1/100 oranında sulandırıldı. ELISA tabletinin (Tablet-2) ilk sırasına (A-H) 100 er μl antijen sulandırması ilave edildi. Diğer gözlere 50 μl karbonat-bikarbonat çözeltisi eklendi. Ilk sıradan başlayarak son sıraya kadar antijenin 1/600 hariç iki katlı artan (1/100, 1/200, 1/400, 1/600,...1/102400) sulandırmaları yapıldı (Çizelge 2.6). Başka bir tabletin (Tablet-1) tüm gözlerine karbonat-bikarbonat içerisinde 1/600 oranında sulandırılmış antijen ilave edildi (Çizelge 2.5). Tabletler 4 C de bir gece süreyle inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda, tablet içerikleri dökülüp 0,01 M PBS çözeltisi (ph:7,4) ile 4 kez yıkama işlemi yapıldı. Daha sonra, bloklama çözeltisi olarak PBS içerisinde %0,05 Tw-20 ve %3 süt tozu hazırlandı ve tabletin tüm gözlerine 300 er μl hacminde çözelti ilave edildi. 37 C de 2 saat süreyle inkübasyon sonrası tablet içerikleri döküldü ve PBS çözeltisi ile az önceki basamakta belirtilen şekilde yıkama işlemi yapıldı. 34

47

48 Tabletler pozitif ve negatif serum örnekleri için 4 er sıra (A-D, E-H) kullanılacak şekilde düzenlendi. Bir numaralı tablet, serumların bir seri sulandırmaları yapılarak (1/10, 1/20, 1/40, 1/50, 1/60...1/200), iki numaralı tablet ise her iki serumunda 1/50 oranında sulandırmaları yapılarak çalışıldı (Çizelge 2.5, 2.6). Bu amaçla, serum sulandırma çözeltisi, PBS içerisinde %0,05 Tw-20 ve %3 süt tozu olacak şekilde hazırlandı ve başka iki tablet içerisinde serumlar belirtilen şekilde sulandırıldı. Daha sonra hazırlanan bu sulandırmalar, ELISA tabletine çok kanallı mikropipet yardımıyla ve her bir serum sulandırması için 100 μl hacimde olacak şekilde aktarıldı. 37 C de 1 saat süreyle inkübasyona bırakıldıktan sonra tablet içerikleri dökülüp, PBS ile bir önceki basamakta belirtilen şekilde yıkandı. Konjugat 1/20000 konsantrasyonunda olacak şekilde PBS-%0,05 Tw-20 içerisinde hazırlanarak tabletin tüm gözlerine 100 er μl hacimde ilave edildi ve 1 saat süreyle 37 C de inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda yıkama işlemini takiben substrat solüsyonu (fosfat-sitrat çözeltisi içerisinde OPD + 1/2000 hidrojen peroksit) tabletin tüm gözlerine 100 er μl hacminde ilave edildi ve 20 dakika süreyle oda ısısında, karanlık ortamda inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda, distile su içerisinde %6,8 konsantrasyonunda hazırlanan H 2 SO 4 çözeltisinden tabletin tüm gözlerine 100 er μl eklenmek suretiyle reaksiyon durduruldu. Tablet, ELISA okuyucusunda 492 nm de okutularak optik dansite (OD) değerleri tespit edildi Pozitif ve Negatif Kontrol Serumların Test Edilmesi Purifiye antijen karbonat-bikarbonat çözeltisi (ph:9,6) içerisinde 1/200, 1/400, 1/600 ve 1/800 oranlarında sulandırıldı. ELISA tabletinin her 1/3 lük kısmına bu sulandırmalar yerleştirildi, 4 C de bir gece bekletildi. Tablet içerikleri dökülüp 0,01 M PBS çözeltisi (ph:7,4) ile 4 kez yıkama işlemi yapıldı. Bloklama çözeltisi, PBS içerisinde %0,05 Tw-20 ve %3 süt tozu olacak şekilde hazırlandı. Tablet in tüm gözlerine 300 er μl çözelti ilave edildi ve 37 C de 2 saat süreyle inkubasyona bırakıldı. İnkubasyon sonrası tablet içerikleri dökülüp, PBS çözeltisi ile az önceki basamakta belirtilen şekilde yıkama işlemi yapıldı. Tablet, pozitif ve negatif kontrol örnekleri için 4 er sıra (A-D, E-H) kullanılacak şekilde düzenlendi. Pozitif kontrol 36

49 olarak, BoHV-1 nötralizasyon pozitif serum, negatif kontrol olarak da fötal dana serumu kullanıldı. Kontrol serumlar 1/50, 1/75 ve 1/100 oranında PBS-Tw-20, %3 süt tozu içerisinde sulandırılarak sırasıyla tabletin her 1/3 lük bölümüne yerleştirildi (Çizelge 2.7). 37 C de 1 saat süreyle inkubasyona bırakıldıktan sonra tablet içeriği dökülüp PBS ile yıkandı. Konjugat 1/20000 konsantrasyonunda olacak şekilde PBS- %0,05 Tw-20 içerisinde hazırlandı. Tüm gözlere 100 er μl ilave edildi ve 1 saat 37 C de inkubasyona bırakıldı. Yıkama işlemini takiben substrat çözeltisi (fosfatsitrat solüsyonu içerisinde OPD + 1/2000 H 2 O 2 ) tüm gözlere 100 er μl ilave edildi ve 20 dakika oda ısısında bekletildikten sonra H 2 SO 4 ile reaksiyon durduruldu. 492 nm de O.D. değerleri tespit edildi. 37

50

51 Avidite Testi Purifiye antijen, karbonat-bikarbonat çözeltisi (ph:9,6) içerisinde 1/600 oranında sulandırılarak ELISA tabletlerinin tüm gözlerine 50 μl hacimde ilave edildi. Tabletler 4 C de bir gece süreyle inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda, tablet içerikleri dökülüp 0,01 M PBS çözeltisi (ph:7,4) ile 4 kez yıkama işlemi yapıldı. Daha sonra, bloklama çözeltisi olarak PBS içerisinde %0,05 Tw-20 ve %3 süt tozu hazırlandı ve tabletin tüm gözlerine 300 er μl hacminde çözelti ilave edildi. 37 C de 2 saat süreyle yapılan inkübasyon sonrası tablet içerikleri döküldü ve PBS çözeltisi ile az önceki basamakta belirtilen şekilde yıkama işlemi yapıldı. Çizelge 2.1 ve 2.2 de gösterilen hayvanlara ait serum örnekleri, serum sulandırma çözeltisi (PBS içerisinde %0,05 Tw-20 ve %3 süt tozu) içerisinde 1/50 oranında sulandırılarak ELISA tabletinin çift gözüne 100 er μl ilave edildi. Tabletin 4 gözü pozitif kontrol (A1, A2, B1, B2); 4 gözü negatif kontrol (C1, C2, D1, D2) ve 4 gözü blank (serum içermeyen) kontrol (E1, E2, F1, F2) olarak ayrıldı. Pozitif ve negatif kontrol gözlerine, serum sulandırmaları ile aynı oranda sulandırılan pozitif ve negatif serumlar ilave edildi. Blank için ayrılan gözlere sadece serum sulandırma çözeltisi koyuldu. 1 saat süreyle 37 C de inkübasyon sonrası tablet içerikleri döküldü. Tabletin ilk sıralarına (1,3,5,7 ) 150 μl hacimde PBS, ikinci sıralarına (2,4,6,8...) PBS içerisinde hazırlanmış 8 M Üre solüsyonundan 150 μl hacimde ilave edildi. 6-8 dakika süreyle 37 C de inkübe edildikten sonra dökülüp PBS ile 3 kez yıkama işlemi yapıldı. Konjugat 1/20000 konsantrasyonunda olacak şekilde PBS- %0,05 Tw-20 içerisinde hazırlanarak tabletlerin tüm gözlerine 100 er μl hacimde ilave edildi ve 1 saat süreyle 37 C de inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda PBS ile yıkama işlemini takiben substrat solüsyonu (fosfat-sitrat solüsyonu içerisinde OPD + 1/2000 H 2 O 2 ) tabletlerin tüm gözlerine 100 er μl hacminde ilave edildi ve 20 dakika süreyle oda ısısında, karanlık ortamda inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda, distile su içerisinde %6,8 konsantrasyonunda hazırlanan H 2 SO 4 çözeltisinden tüm gözlere 100 er μl eklenmek suretiyle reaksiyon durduruldu. Tabletler, ELISA okuyucusunda 492 nm de okutularak O.D. değerleri tespit edildi ve avidite indeksleri (A.I.) hesaplandı. 39

52 Gerek ELISA ve gerekse bunun temelinde yapılan Avidite testlerinin değerlendirilmesinde daha önce bildirilen yöntemler kullanıldı. Buna göre ELISA testinin cut-off değeri aşağıdaki formül ile hesaplandı: ELISA cut-off = %50 Ort. Pozitif O.D. * ± S.D. * %50 Ort. Pozitif O.D. * : Pozitif kontrollerin optik dansite ortalamalarının %50 si. S.D. * : Standart sapma değerleri. Avidite İndeksi (%A.I.) ise, BoHV-1 antikor pozitif olduğu tespit edilen serum örnekleri için aşağıdaki formüle göre hesaplandı: % A.I. = O.D. * ÜRE / O.D. * PBS x 100 * O.D. ÜRE : Ayrıştırıcı çözelti (8M ÜRE) ile yıkanan gözlerde tespit edilen optik dansite değeri. O.D. * PBS : Yıkama solüsyonu (PBS) ile yıkanan gözlerde tespit edilen optik dansite değeri İstatistiksel Analizler Verilerin analizi SPSS 11.5 paket programında yapıldı. Tanımlayıcı istatistikler ortalama ± std.sapma şeklinde gösterildi. Örneklemeler arasında O.D. ve A.I. değerlerine yönelik farklılıkların istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığı Tekrarlı Ölçümlü Varyans Analizi yle değerlendirildi. Farkın görüldüğü yerlerde Bonferroni Çoklu Karşılaştırma testi kullanılarak farka neden olan ölçüm zamanları tespit edildi. Avidite indeksine ilişkin karşılaştırmalarda Avidite indeksinin logaritmik dönüşüm değerleri kullanıldı. 40

53 3. BULGULAR 3.1. ELISA Antijeni Hazırlanması Bölüm de belirtilen şekilde hesaplanarak 1 ml hacimdeki protein konsantrasyonu 5,6 mg olarak tespit edilen saflaştırılmış virusun, ELISA antijeni olarak kullanılması için protein konsantrasyonunun 50 μl hacimde 1-10 μg/ml olması gerekliliği (Crowther, 1995) göz önünde bulundurularak, saflaştırılmış virusun 1/500 oranında sulandırılabileceği tespit edildi ELISA Bileşenleri ve Prosedürün Optimizasyonu Antijen ve Serum Sulandırmalarının Optimizasyonu Aynı tablet içerisinde, yukarıdan aşağıya ve soldan sağa doğru bir seri sulandırmaları yapılarak (checker-board) ELISA testi uygulanan antijen ve pozitif serumun çeşitli konsantrasyonlarında elde edilen O.D. değerleri Çizelge 3.1. de sunuldu. Checker-board sistemine göre, O.D. değerlerinin linearite gösterdiği konsantrasyonlar (C3-D3 ile C4-D4), optimum sulandırmalar olarak değerlendirildi. Antijenin 1/100 den başlayarak 2 katlı artan sulandırmaları yapılmak suretiyle 3 tablet kaplanarak, herhangi bir BoHV-1 nötralizasyon pozitif ve negatif serum ile fötal dana serumu aynı şekilde test edildi ve sonuçlar değerlendirildi. Bu uygulamalar neticesinde antijenin 1/400-1/800, serumların ise 1/40-1/80 oranında sulandırıldığı gözlerin en optimal O.D. değerlerini verdiği gözlendi. 41

54

55 Konjugat ve Boş (Blank) Kontrollerin Değerlendirilmesi ELISA tabletine konjugat ilave edilerek ve edilmeksizin uygulanan ELISA testi sonucunda elde edilen O.D. değerleri Çizelge 3.2. de sunuldu. Çizelge 3.2. Konjugat ilave edilmeden (1-3) ve ilave edilerek (4-6) elde edilen O.D. değerleri A B C D E F G H Blank ve konjugat kontrol olarak ayrılan gözlerin ortalama ± standart sapma (SD) değerleri tespit edildi. Buna göre; blank için ortalama 0,04 ve SD ± 0,002, konjugat için ortalama 0,06 ve SD ± 0,009 olarak hesaplandı. Elde edilen veriler ışığında, konjugatın antijenle herhangi bir spesifik olmayan (yalancı pozitif) reaksiyon vermediği tespit edildi Diğer Parametrelerin Kontrolü Test sistemindeki bloklama işleminin değişik parametreler yönünden kontrol edilmesi sonucunda, PBS içerisinde %0,05 Tw-20, %3 süt tozu olacak şekilde hazırlanan ve at serumu içermeyen bloklama çözeltisi ile daha düşük background değerleri elde edildi. Ayrıca, bloklama işleminin 100 μl yerine 300 μl çözelti ile ve 1 saat yerine 2 saat inkubasyon süresi ile uygulanmasının daha iyi sonuçlar verdiği (düşük background) gözlendi. Bu veriler ışığında, test sisteminde bloklama işleminin PBS-%0,05 Tw-20 ve %3 süt tozu olacak şekilde hazırlanan çözelti ile 300 μl miktarında ve 2 saat inkubasyon süresi ile yapılması uygun görüldü. 43

56 Pozitif kontrol serumun tespiti için 4 ayrı serum örneği test edildi. Bunlar arasında, son nokta sulandırma oranı düşük olup, başlangıç titresi (O.D.) yüksek olan ve SN 50 >1/64 olan serum pozitif kontrol olarak seçildi. Negatif kontrol serum olarak kullanılmak üzere ise fötal dana serumu belirlendi Pozitif ve Negatif Kontrol Serumlar ile Antijen Sulandırmalarının Son Nokta Titrasyon Değerlerinin Tespit Edilmesi 1/600 antijen sulandırması sabit tutularak, pozitif ve negatif kontrol serumların 1/10-1/200 oranında sulandırılmaları ile uygulanan ELISA testi sonucunda elde edilen O.D. değerleri Çizelge 3.3 de sunuldu. 1/600 oranında sabit antijen sulandırmasında, pozitif ve negatif kontrol serumların her sulandırma basamağı için elde edilen O.D. değerlerinin ortalamaları alınarak değerlendirildiğinde, serum sulandırmalarının son nokta titrasyon değerleri 1/160, en uygun sulandırma oranları ise 1/50 olarak belirlendi (Şekil 3.1). Pozitif ve negatif kontrol serumların 1/10-1/200 oranında sulandırılmaları ile uygulanan ELISA testi sonucunda oluşan renk dağılımı, Resim 3.1 de gösterildi. 1/50 oranında pozitif ve negatif serum sulandırmaları sabit tutularak, antijenin 1/100 den başlayıp, 1/ e kadar sulandırması yapılarak uygulanan ELISA testi sonucunda elde edilen O.D. değerleri Çizelge 3.4 de sunuldu. Pozitif ve negatif kontrol serumların 1/50 oranında sulandırıldığı durumda, antijene ait her sulandırma basamağında elde edilen O.D. değerlerinin ortalamaları alınarak değerlendirildiğinde, en uygun antijen sulandırma oranı 1/600 olarak belirlendi (Şekil 3.2). Antijenin 1/100-1/ oranında sulandırılması ile uygulanan ELISA testi sonucunda oluşan renk dağılımı, Resim 3.2 de gösterildi. 44

57

58

59

60 Pozitif ve Negatif Kontrol Serumların Sulandırma Oranlarının Test Edilmesi Antijeni 1/200, 1/400, 1/600 ve 1/800, pozitif ve negatif serumları 1/50, 1/75 ve 1/100 oranlarında sulandırmak suretiyle uygulanan ELISA testi sonucunda elde edilen O.D. değerleri ile ortalama O.D. değerleri Çizelge 3.5. ve 3.6. da sunuldu. Her bir sulandırmadaki O.D. değerlerinin ortalamaları karşılaştırıldığında, kontrol serumların 1/50, antijenin 1/600 oranında sulandırılmasının uygun olduğu tespit edildi (Şekil 3.3, 3.4) Avidite Testi Örneklemelerin Tümünde Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi Ard arda yapılan 8 örneklemenin tümünde bulunan serum örneklerinin avidite ELISA tekniği ile test edilmesi sonucunda, PBS ve üre uygulanan gözlerden elde edilen O.D. ve A.I. değerleri Çizelge 3.7. de sunuldu. Her bir örnekleme dönemi için O.D. değerlerinin ortalamaları ve standart sapmaları Çizelge 3.8 de sunuldu. 1. örneklemeye ait serumların BoHV-1 antikor negatif olarak tespit edilmesinden dolayı söz konusu örneklemeye ait veriler gösterilmedi. Çizelge 3.8. Bütün örneklemelerde bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalama ve standart sapmaları Örnekleme Serum O.D. Dönemi Standart Sapma Sayısı Ortalamaları ,23 0, ,65 0, ,38 0, ,93 0, ,96 0, ,07 0, ,93 0,125 48

61

62

63

64

65 Örneklemelere ilişkin O.D. değerleri, ortalama O.D. ± SD olarak değerlendirildi. Buna göre 2,3,4,5,6,7 ve 8. örneklemeler için ortalama O.D. değerleri sırasıyla; 1,23 ± 0,305, 1,65 ± 0,370, 1,38 ± 0,431, 1,93 ± 0,236, 1,96 ± 0,205, 2,07 ± 0,152 ve 1,93 ± 0,125 olarak tespit edildi. Bu veriler değerlendirildiğinde, örneklemeler arasında O.D. değerleri bakımından anlamlı bir fark olduğu sonucuna varıldı (p<0,001). Örneklemelerin tümünde bulunan serum örneklerinin O.D. değerleri arasındaki farklılık incelendiğinde, 2. örneklemeye göre 4. örnekleme hariç diğer tüm örneklemelerden elde edilen ölçümler daha yüksek bulundu (p<0,001). 3. örneklemeye göre ise, 6. ve 7. örneklemelerin O.D. değerleri daha yüksek olup, p değerleri sırasıyla 0,027 ve 0,006 olarak belirlendi. 4. örnekleme dönemi ele alındığında; 5,6,7 ve 8. örneklemelere ait değerlerin tümünün 4 e göre daha yüksek olduğu tespit edildi (p<0,001; p=0,003). 5. örneklemeden itibaren ilerleyen örneklemelerde O.D. değerleri bakımından anlamlı bir farklılık olmadığı belirlendi. Avidite ELISA testi sonucunda elde edilen A.I değerlerinin ortanca, minimum ve maksimum değerleri ile A.I. değerlerinin logaritması alındığında elde edilen ortalama ve standart sapmaları Çizelge 3.9 ve 3.10 da sunuldu. Çizelge 3.9. Tüm örneklemelerde bulunan serumların % A.I. değerlerinin ortanca, minimum ve maksimum değerleri Örnekleme Serum Ortanca Minimum Dönemi Maksimum (%) Sayısı (%) (%) ,0 44,0 79, ,0 65,0 89, ,0 70,0 98, ,0 75,0 98, ,0 79,0 96, ,0 82,0 99, ,0 74,0 96,0 2, 3, 4, 5, 6, 7 ve 8. örneklemelere ilişkin ortanca A.I. değerleri sırasıyla %64 [44-79], %74 [65-89], %86 [70-98], %86 [75-98], %90 [79-96], %93 [82-99] ve %88 [74-96] olarak tespit edildi (Şekil 3.5). 53

66

67 Çizelge Tüm örneklemelerde bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama ve standart sapmaları Örnekleme Serum Logaritmik A.I. Dönemi Standart Sapma Sayısı Ortalamaları ,79 0, ,88 0, ,93 0, ,93 0, ,94 0, ,96 0, ,94 0,030 Örneklemelere ait AI değerleri, logaritmik A.I. ortalamaları ± SD olarak değerlendirildi. Buna göre 2,3,4,5,6,7 ve 8. örneklemeler için logaritmik A.I. ortalama değerleri sırasıyla; 1,79 ± 0,063, 1,88 ± 0,041, 1,93 ± 0,042, 1,93 ± 0,039, 1,94 ± 0,025, 1,96 ± 0,022 ve 1,94 ± 0,030 olarak tespit edildi. Bu verilerin analizi sonucunda, örneklemeler arasında A.I. değerleri bakımından istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu sonucuna varıldı (p<0,001). Örneklemeler arasında A.I. değerlerindeki farklılıklar incelendiğinde, 2. örneklemeye göre diğer tüm örnekleme dönemlerinde tespit edilen logaritmik A.I. değerleri daha yüksek bulundu (p<0,001). 3. örnekleme dönemi incelendiğinde 4, 5, 6, 7 ve 8. örneklemelere ait avidite değerlerinin 3. örneklemeye göre arttığı ve p değerlerinin 4. ve 5. örneklemeler için sırasıyla p=0,007, p=0,003; 6,7 ve 8. örneklemeler için p<0,001 olduğu tespit edildi. 4. örneklemeden itibaren yapılan örneklemelere ait A.I. ölçümlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark görülmemesine karşın, 5. ile 7. örnekleme arasında istatistiksel olarak anlamlı bir artış tespit edildi (p=0,043). 6,7 ve 8. örneklemeler arasında avidite değerlerinde anlamlı bir farklılık görülmedi İlk 6 Örneklemede Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi İlk 6 örnekleme döneminde mevcut olan 16 serum örneğinin avidite ELISA tekniği ile test edilmesi sonucunda, PBS ve Üre uygulanan gözlerden elde edilen O.D. ve A.I. değerleri Çizelge 3.11 de sunuldu. 55

68

69 Her bir örnekleme için O.D. değerlerinin ortalama ve SD değerleri çizelge 3.12 de gösterildi. 1. örneklemeye ait serumların BoHV-1 antikor negatif olarak tespit edilmesinden dolayı söz konusu örneklemeye ait veriler gösterilmedi. Çizelge İlk 6 örneklemede bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalama ve standart sapmaları Örnekleme Serum O.D. Dönemi Standart Sapma Sayısı Ortalamaları ,42 0, ,68 0, ,23 0, ,94 0, ,99 0,177 Örneklemelere ilişkin değerler, ortalama O.D. ± SD olarak değerlendirilerek analiz edildiğinde, 2,3,4,5 ve 6. örneklemeler için ortalama O.D. değerleri sırasıyla; 1,42 ± 0,238, 1,68 ± 0,326, 1,23 ± 0,296, 1,94 ± 0,266, 1,99 ± 0,177 olarak tespit edildi. Bu veriler değerlendirildiğinde, örneklemeler bazında O.D. değerleri arasında anlamlı bir fark olduğu sonucuna varıldı (p<0,001). İlk 6 örneklemede bulunan serumların, örneklemeler arası O.D. değerlerinin farklılıkları incelendiğinde, 2. örneklemeye göre 5. ve 6. örnekleme arasındaki artış istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). 3. örneklemeye göre ise, 5. ve 6. örneklemelerin O.D. değerleri daha yüksek olup, p değerleri sırasıyla 0,009 ve 0,039 olarak tespit edildi. 4. örnekleme dönemi ele alındığında; 5. ve 6. örneklemelere ait değerlerin 4 örneklemeye göre daha yüksek olduğu tespit edildi (p<0,001). 5 ve 6. örneklemeler arasında O.D. değerleri bakımından anlamlı bir farklılık olmadığı belirlendi. Avidite ELISA testi sonucunda elde edilen A.I ve logaritmik A.I. değerlerinin ortalama ve standart sapmaları ile ortanca, minimum ve maksimum değerleri Çizelge 3.13 ve 3.14 de sunuldu. 57

70 Çizelge İlk 6 örneklemede bulunan serumların % A.I. değerlerinin ortanca, minimum ve maksimum değerleri. Serum Ortanca Minimum Örnekleme Dönemi Maksimum (%) Sayısı (%) (%) ,50 52,00 88, ,00 65,00 98, ,00 70,00 97, ,50 71,00 99, ,00 79,00 99,00 2, 3, 4, 5 ve 6. örneklemelere ilişkin ortanca A.I. değerleri sırasıyla %67,5 [52-88], %77 [65-98], %87 [70-97], %86,5 [71-99] ve %94 [79-99] olarak tespit edildi (Şekil 3.5). Çizelge İlk 6 örneklemede bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama ve standart sapmaları. Örnekleme Dönemi Serum Sayısı Logaritmik A.I. Ortalamaları Standart Sapma ,82 0, ,90 0, ,92 0, ,93 0, ,96 0,028 Örneklemelere ait AI değerleri, logaritmik A.I. ortalamaları ± standart sapmaları olarak analiz edildiğinde, 2,3,4,5 ve 6. örneklemeler için logaritmik A.I. ortalama değerleri sırasıyla; 1,82 ± 0,055, 1,90 ± 0,051, 1,92 ± 0,041, 1,93 ± 0,040 ve 1,96 ± 0,028 olarak tespit edildi. Bu verilerin analizi sonucunda, örneklemeler arası A.I. değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu belirlendi (p<0,001). 2. örneklemeden sonra yapılan tüm örneklemelerde avidite değerlerinde anlamlı bir artış tespit edildi (3. örnekleme için p=0,006; 4,5,6. örneklemeler için p<0,001). 3. ile 6. örnekleme ve 4. ile 6. örnekleme arasında A.I. değerlerinde anlamlı bir fark olduğu (p=0,003 ve p=0,021), 3. ve 4. örneklemelere göre 6. 58

71 örneklemede elde edilen A.I. değerlerinin daha yüksek olduğu belirlendi. 3. ve 4., 3. ve 5. örneklemeler ile 5. ve 6. örneklemeler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark tespit edilmedi Son 6 Örneklemede Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi Son 6 örnekleme döneminde mevcut olan 21 serum örneğinin avidite ELISA tekniği ile test edilmesi sonucunda, PBS ve Üre uygulanan gözlerden elde edilen O.D. ve A.I. değerleri Çizelge 3.15 de sunuldu. Her bir örnekleme için O.D. değerlerinin ortalama ve SD değerleri çizelge 3.16 da sunuldu. Çizelge Son 6 örneklemede bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalama ve standart sapmaları Örnekleme Serum O.D. Dönemi Standart Sapma Sayısı Ortalamaları ,57 0, ,23 0, ,82 0, ,89 0, ,02 0, ,05 0,197 3,4,5,6,7 ve 8. örneklemeler için ortalama O.D. değerleri sırasıyla; 1,57 ± 0,335, 1,23 ± 0,342, 1,82 ± 0,384, 1,89 ± 0,290, 2,02 ± 0,147 ve 2,05 ± 0,197 olarak belirlendi. Verilerin analizi sonucunda, örneklemeler arasında O.D. değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu tespit edildi (p<0,001). Son 6 örneklemede bulunan serumlarda, 3. örneklemeye göre 6,7 ve 8. örneklemelere ait O.D. değerlerindeki artış istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,033, p<0,001). Diğer taraftan, 4. örneklemeye göre 5,6,7 ve 8. örneklemelerdeki O.D. değerlerinde anlamlı bir artış tespit edildi (p<0,001). 59

72