HIV/AIDS HASTALARINDA ELISA YÖNTEMİ İLE CRYPTOSPORIDIUM TÜRLERİNİN SIKLIĞININ ARAŞTIRILMASI

Transkript

1 T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI HASEKİ EĞİTİM VE ARAŞTIRMA HASTANESİ ENFEKSİYON HASTALIKLARI VE KLİNİK MİKROBİYOLOJİ KLİNİĞİ ŞEF: Uzm. Dr. Özcan Nazlıcan HIV/AIDS HASTALARINDA ELISA YÖNTEMİ İLE CRYPTOSPORIDIUM TÜRLERİNİN SIKLIĞININ ARAŞTIRILMASI (UZMANLIK TEZİ) Dr. Gülay Ergin Okay İstanbul-2006

2 ÖNSÖZ Huzurlu ve düzenli bir hastane ortamında çalışmamızı sağlayan sayın başhekimimiz Op. Dr. Haldun Ertürk e; Asistanlık eğitimim süresince bilgi ve tecrübelerinden faydlandığım, her zaman yardım ve hoşgörüsü ile bizlere destek olan klinik şefimiz Sayın Dr. Özcan Nazlıcan a; Dahiliye rotasyonum sırasında güler yüzlü ve nazik yaklaşımlarıyla klinik tecrübelerini aktaran, daha geniş bir klinik bakış kazanmamı sağlayan 4. Dahiliye klinik şefi Sayın Dr. Mustafa Yenigün e ve Çocuk Hastalıkları klinik şefi Sayın Dr. Murat Elevli ye; Çalışkanlığı, disiplini ve bilimsel titizliği ile bize örnek olan, asistanlık eğitimim ve tezimin gerçekleşmesinde büyük katkısı olan, her zaman desteği ile yanımızda olan değerli klinik şef yardımcımız Sayın Dr. Gönül Şengöz e; Klinik ve laboratuvarda çalışırken bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım uzmanlarıma, birlikte çalışmaktan mutlu olduğum asistan, hemşire ve teknisyen arkadaşlarıma teşekkür ederim. Dr. Gülay Ergin Okay 2

3 İÇİNDEKİLER Sayfa ÖNSÖZ 2 GİRİŞ VE AMAÇ 4 GENEL BİLGİLER 5 İnsan İmmün yetmezlik Virusu 7 Sınıflama 7 Viral Genom Yapısı 8 HIV Virion Yapısı 8 Virion Proteinleri 9 HIV Replikasyonu 10 HIV İnfeksiyonu İmmünopatogenezi 11 HIV in Bulaşması 12 HIV İnfeksiyonu Klinik Seyri 13 Primer HIV İnfeksiyonu 17 Asemptomatik Dönem 17 Erken Semptomatik Dönem 18 Geç Semptomatik Dönem 18 İleri Evre 19 HIV İnfeksiyonunda Fırsatçı İnfeksiyonlar 19 Cryptosporidium 20 MATERYAL-METOD 28 BULGULAR 30 TARTIŞMA 36 SONUÇ 43 ÖZET 45 KAYNAKLAR 45 3

4 GİRİŞ VE AMAÇ İnfeksiyon hastalıkları, insanlık tarihi boyunca yaşamı tehdit eden en önemli sağlık problemlerinden birini oluşturmuştur. Dünya üzerinde ölümlerin en sık üç nedeninden biri olan infeksiyon hastalıkları, aynı zamanda çok büyük ekonomik kayıplara da neden olmaktadır. İnfeksiyon hastalıkları ile yapılan ciddi mücadelelerle zaman zaman infeksiyonların kontrolü sağlanmış gibi görünse de eski problemlerin yerini yenileri almıştır. Tarih boyunca veba, kolera, tüberküloz gibi infeksiyon hastalıkları ile mücadele edilmiştir. Günümüzde kuş gribi, Severe Acute Respons Sendrom (SARS) ve Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) salgınları önemli hale gelmiş ve mücadele bunlarla devam etmektedir. İlk defa 1981 yılında Amerika Birleşik Devletleri nde (ABD) tanımlanan AIDS olgusunun, o günden bu yana sayısı hızla artarak tüm dünyayı saran bir pandemi halini almıştır yılında tüm dünyada toplam hasta ve taşıyıcı sayısı 39.4 milyona ulaşmıştır. Bulaşma yollarının kolaylığı ve sonunda kesin bir tedavisinin olmayışı hastalığın önemini arttırmaktadır. Hastalıkla mücadelede elimizdeki en önemli silah eğitimdir. Gelişmekte olan ülkelerde hastaların artış hızı gelişmiş ülkelere göre çok fazladır. Bu farklılığın en önemli nedeninin eğitim olduğu düşünülmekte ve gelişmiş ülkelerin yaptığı eğitim programları ile büyük ölçüde başarılı olduğu görülmektedir. AIDS, immun sistemin zayıflaması ile fırsatçı infeksiyonların tabloya eklendiği bir infeksiyon hastalığıdır. Hastalığın prognozunu büyük ölçüde fırsatçı infeksiyonlar belirler. Hastaların büyük çoğunluğunda mortalite, fırsatçı enfeksiyonlara bağlıdır. Hastalar sıklıkla fırsatçı enfeksiyonlar nedeniyle doktora başvurduklarında tanı almaktadır. Birçok bakteri, virus, mantar ve parazit, fırsatçı infeksiyonlara neden olmaktadır. 4

5 Paraziter enfeksiyon etkenlerinden biri de hastalarda kronik ishal ve kilo kaybına neden olan Cryptosporidium türleridir. AIDS e bağlı kronik ishalin en sık nedeni olan Cryptosporidium spp, protozoonların apikomplexa şubesinin coccidia grubunda yer alan bir parazittir. Bağışıklık sistemi sağlam kişilerde, kendi kendini sınırlayan hafif bir klinik tabloya yol açarken, bağışıklık sisteminde yetersizlik olan kişilerde, uzun süreli, ağır ve ölümle sonuçlanabilen bir seyir gösterir. Çalışmamızda, Haseki Eğitim ve Araştırma Hastanesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji kliniğinde takip edilmekte olan HIV/ AIDS vakalarında Cryptosporidium türlerinin sıklığı araştırılarak parazitin ülkemizdeki sıklığının belirlenmesine katkıda bulunulmaya çalışıldı. 5

6 GENEL BİLGİLER AIDS ilk kez 1981'de tanımlanan ve o tarihten itibaren milyonlarca insanın mücadele ettiği, çağımızın salgını olarak kabul edilen kronik bir infeksiyon hastalığıdır. Bu hastalık ilk defa Haiti den ABD'ye gelen göçmenlerde tanımlanmış ve Akkiz İmmün Yetmezlik Sendromu adı verilmiştir (1,2). Hastalardan izole edilen virusun bir retrovirus olduğu tespit edilmiş ve Human T-Lymphotropic Virus (HTLV) olarak adlandırılmış, daha sonraları kullanım kolaylığı nedeniyle İnsan İmmün Yetmezlik Virusu (Human Immunodeficiency Virus, HIV) ismi verilmiştir. 1981'de ilk vakanın bildirilmesinden sonra vaka sayısı giderek artmış ve günümüzde tüm dünyayı etkileyen bir pandemi haline gelmiştir yılında tüm dünyada toplam hasta ve taşıyıcı sayısı 39.4 milyona ulaşmıştır. Bunun 2.2 milyonunu çocuklar oluşturmaktadır (10). Başlangıçta homoseksüel, biseksüel erkekler ve intravenöz ilaç alışkanlığı olanlar vakaların çoğunu teşkil ederken günümüzde heteroseksüel cinsel temasla bulaş oranı giderek artmıştır. Tüm dünyada HIV/AIDS olgularının %94 ü gelişmekte olan ülkelerden, %89 u Sahra-altı Afrika, Güney ve Güneydoğu Asya dan bildirilmektedir (4). Türkiye de ilk AIDS vakası 1985 de tespit edilmiş, 2004 yılında sayı 1922 ye kadar çıkmış, bu hastaların 551 i AIDS basamağında ve 1371 i taşıyıcı olarak bildirilmiştir. Tablo 1 de Türkiye de yıllara göre hasta ve taşıyıcıların dağılımı görülmektedir (12). 6

7 Tablo 1: AIDS vaka ve taşıyıcılarının yıllara göre dağılımı (12). Yıllar AIDS Taşıyıcı Toplam Toplam

8 İNSAN İMMÜN YETMEZLİK VİRUSU Son yıllarda insan ve hayvanlarda yaptıkları hastalıklar ve replikasyon şekilleri nedeniyle araştırıcıların dikkatini çeken Retrovirus grubunda hayvanlarda kesin olarak kanser yaptığı gösterilmiş bazı virusların yanısıra insan retrovirusları da yer almaktadır. Retroviruslar RNA viruslarıdır, yapısında bulunan RNA dan DNA sentezleyen enzim nedeniyle bu adı almıştır. İnsanlarda AIDS etkeni olan HIV virusu, grubun onkojenik olmayan bir üyesidir (1,2). Virus ilk defa 1983 yılında tespit edilmiş ve etkene farklı isimler verilmiştir. Bazı araştırıcılar lenfadenopatili hastadan izole ettikleri etkene lenfadenopati ilişkili virus (lymphadenopaty assaciaeted virus: LAV) adını verdiler. Sonraları bu virusların T lenfositlerine tropizmi gözönüne alınarak İnsan T lenfotrofik virusu (human T lymphotropic virus: HTLV) adı verildi yılında Uluslararası Virus Taksonomi Komitesi bu virusu İnsan İmmün Yetmezlik Virusu (HIV) olarak adlandırdı. İki tip HIV virusundan HIV-1 tüm dünyada yaygın iken, HIV-2 Batı Afrika da yaygın olarak bulundu. Amerika da saptanan HIV-2 ile infekte hastaların Batı Afrika ile ilişkili oldukları görüldü. HIV-1 ve HIV-2 arasında immünolojik olarak çapraz reaksiyon olduğu anlaşıldı (1,2). Sınıflama HIV, retrovirus grubunun lentivirus genusuna mensup, tek sarmallı RNA içeren zarflı bir virusdur. Reverse transkriptaz enzimi aracılığı ile viral RNA yı çift sarmallı DNA ya çevirip konakçı genetik materyaline integre etme özelliği taşır. HIV, hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanıp direkt füzyon ile hücre içine girer. HIV, gp120 yüzey glikoproteini ile T lenfositler, monosit- 8

9 makrofaj serisinde ve diğer bazı hedef hücrelerde bulunan CD 4 reseptörleri ile bağlantıya girer (1). Virusun zarfından kurtulup hücre içine girişini takiben reverse transkriptaz enzimi, viral RNA yı çift sarmallı DNA ya çevirir. Oluşan DNA, sirküler forma geçip hücre içinde serbest durabileceği gibi viral integraz enzimi aracılığı ile hücre DNA sına integre de olabilir (1). Viral Genom Yapısı HIV virion yapısı iki adet pozitif polariteli birbirinin aynı olan tek iplikli RNA içerir. HIV, hücreleri infekte ettikten sonra virion RNA sı revers transkriptaz tarafından lineer çift iplikli DNA haline çevrilir. Bu viral DNA konak hücre yapısına integre olarak provirus yapısını oluşturur. Viral RNA ve m-rna lar proviral DNA dan hücresel polimeraz II enzimi yardımı ile sentez edilir (1,2). HIV de önemli genlerden gag geni kapsid proteinlerini, pol geni virion enzimlerini ve env geni zarf glikoproteinlerini sentezler. Transkripsiyon transaktivatörü (tat) ve viral ekspresyon regülatörü (rev) birbiri ile çalışan ekzonlar tarafından kodlanır. Bunlar dışında HIV replikasyonu için gerekli olmayan, accesory genler olarak bilinen vif, vpr, vpu ve nef genleri mevcuttur (3). HIV Virion Yapısı Sferik yapıda, ortalama 110 nm büyüklüğünde olan HIV virusunun dondurma külahı şeklindeki özyapısını lipid membran veya zarf çevrelemektedir (1,3). Virionda bulunan matrix proteini (MA), major kapsid proteini (NC), gag geninin ürünleridir. 9

10 HIV partikülünün membranında zarf glikoproteini olarak bilinen 72 adet çıkıntı (peplomer) yer alır. Bu yapılar iki kısımdan oluşur; yüzeyde bulunan gp120 ve membran içerisinde bulunan gp41. Bu yapı hücre yüzeyindeki reseptörlerle birleşmedeki tanıma rolünü üstlenmektedir (1,3). Virion Proteinleri Kapsid Proteinleri: Viral kapsidin fonksiyonu RNA yı paketlemek, virus replikasyonu sırasında kapsidin soyulmasında rol almaktır. Gag geni tarafından kodlanan kapsid proteinleri; MA (p17), CA(p24), p2, NC (p7), p1 ve p6 dır. Matrix proteini (MA), virion nükleokapsid ile zarf arasındaki matriksde yer alır. Genetik çalışmalar, özellikle virion ile hedef hücrenin füzyonunda rol oynadığını ortaya koymaktadır. Kapsid proteini (CA), yüksek hidrofob özelliğe sahiptir ve kapsid yapısının temel elemanıdır (1,3). Viral Enzimler: HIV in hücrede olgunlaşması sırasında proteaz (PR), reverse transcriptase (RT), integrase (IN) enzimleri oluşturulur. PR, 99 aminoasit büyüklüğündedir. Genetik çalışmalar proteazın viral replikasyonda önemli olduğunu ortaya koymuştur. RT, RNA ve DNA dan DNA sentezleme fonksiyonu taşır. Reverse transkripsiyon sırasında yanlış nükleotitlerin nükleik asit içerisine birleştirilmesi tek baz mutasyonlarına yol açmaktadır. Bu mutasyonlar antiviral ilaçlara karşı olan rezistansın oluşmasına neden olmaktadır (1,2). 10

11 IN enzimi, viral DNA nın parçalanması ve yeniden birleştirilmesinde aktif olarak görev almaktadır. Böylece proviral DNA nın konak hücre genomuna birleştirilmesi sağlanmaktadır (1,3). Zarf Glikoproteinleri: Zarf glikoproteinleri, T lenfosit, monosit, makrofaj ve dentritik hücrelerde bulunan CD 4 reseptörleri ile bağlanmayı sağlar. Bu bağlanma, viral ve hücresel membranlar arasında füzyona neden olarak virüsün hücre içerisine alınmasını sağlar. env geninin ürünü olan proteinin glikozillenmesi ile en büyük zarf proteini olan gp160 oluşur. Hücre içerisinde gp160 ın parçalanması ile iki önemli zarf proteini olan gp120 ve gp41 oluşur. Olgun HIV partikülünde gp120 ve gp41, non-kovalan bağlarla birarada tutulan bir heterodimerdir (1,3). HIV Replikasyonu HIV in zarf glikoproteini, hücre yüzeyindeki CD 4 reseptörüne bağlandıktan sonra viral ve hücresel membranlar füzyon yolu ile kaynaşırlar. Nükleokapsid hücre stoplazmasına bırakılır. Viral enzimlerden RT ve IN soyulmamış nükleokapsid içerisinde kalır. Revers transkripsiyon sonucunda lineer çift iplikli DNA (provirus) sentez edilerek, IN tarafından kovalan bağlarla hücre DNA sına integre edilir. Viral replikasyonun aşamalarını aşağıdaki şekilde sıralamak mümkündür: 1) Virüsün hücre reseptörüne tutunması ve adsorbsiyonu: HIV in hücreye tutunması ve adsorbsiyonu virusun zarf glikoproteini gp120 ile T yardımcı lenfosit ve makrofajların yüzeyinde bulunan CD 4 reseptörü arasında meydana gelir. 11

12 2) Virüsün hücre içerisine girişi: Yapılan çalışmalar virus ile konak hücre arasında oluşan füzyon mekanizmasının girişte rol oynadığını göstermiştir. Ayrıca virusun hücre içerisine girişinde hücre yüzeyinde bulunan proteazın da rolü vardır. 3) Revers transkripsiyonla oluşan viral DNA sentezi 4) Viral DNA nın integrasyonu: DNA kesilir ve integraz tarafından proviral DNA kovalent bağlarla hücre genomuna bağlanır. 5) Viral m-rna, genomik RNA transkripsiyonu ve protein sentezi: Viral m-rna ve genomik RNA integre olmuş proviral DNA dan sentez edilir. 6) Tam virus partikülü oluşumu, tomurcuklanma ve salınım: Özellikle gp120 ve gp41 hücre membranına monte edildikten sonra tomurcuklanma işlemi başlar (1). HIV İnfeksiyonunun İmmünopatogenezi HIV, önce yüzeyinde bulunan zarf glikoproteinleri yardımı ile yüzeyinde CD 4 taşıyan hücreleri (T-lenfositler, monosit, makrofaj ve dentritik hücreler) infekte eder. Bu, HIV-hücre birleşmesinde CD 4 dışında rolü olan bazı başka moleküller de (füzyon reseptörleri, ko-reseptörler) vardır. İnfeksiyonun başlangıcında virus, yardımcı T (Th) hücrelerine ve makrofajlara kolonize olur ve sonra serbest viral partiküller olarak veya CD 4 T hücreleri içinde, bölgesel lenf nodlarına gider. Burada bir süre kontrolsüz çoğalır ve infekte T hücrelerini patlatarak binlerce yeni virus partikülü hücre dışına çıkar. Bu dönemde sitotoksik T hücreleri birçok virusla infekte hücreyi ve virus partiküllerini parçalayarak viral büyümeyi sınırlar. Bundan sonra virüsün sürekli replike olarak persistan hale geldiği ve immun sistem hücrelerini yıkıma uğrattığı sessiz döneme geçilir. Virus bu dönemde kontrol dışı çoğalmasını kontrol altına almaya çalışan 12

13 immün yanıtla karşılaşır. HIV infeksiyonunun başlangıcında günler içerisinde CD 4 T hücre sayısında akut azalma sonucu lenfopeni gelişir. Birkaç hafta içinde CD 8 T hücre sayısında artışın olmasıyla total lenfosit sayısı artar (3,4). HIV e spesifik nötralizan ve sitotoksik antikor yanıtı, 2 ile 3. haftalarda tespit edilirken, yanıtın gelişmesi için gereken süre 6 aya kadar uzayabilir. Bu antikorların çoğu gp120 ve gp41 zarf glikoproteinlerine karşı oluşmuştur. Nötralizan antikorlar, antijene bağlanarak lenf nodu germinal merkezinde virionun yakalanmasını ve virusun plazmadan temizlenmesini artırır (3,4,5). HIV infeksiyonunda antikora bağlı hücresel sitotoksisite HIV in gp120 ve gp41 proteinine karşı gelişmektedir. Bu yanıtta rol alan hücreler CD 16 pozitif doğal öldürücü (NK) hücreler ve monositlerdir. Akut fazdan sonra kandaki HIV miktarında önemli düşüş olur ve hasta klinik olarak asemptomatik döneme girer. Bu dönem boyunca CD 4 pozitif T hücre sayısında düşme devam eder. Bu düşmeden sorumlu olan mekanizmanın apopitozis olduğu düşünülmektedir. Virüslere karşı immün yanıtta çok önemli olan Sitotoksik T-lenfositler (STL) infekte hücrelerin yüzeyindeki antijeni tanıyarak sitolitik mekanizma ile hücreyi parçalarlar. HIV infeksiyonunun erken döneminde ortaya çıkan virus sayısında azalma ve bazen de vireminin sonlanmasını sağlayan mekanizma STL yanıtıdır. Hastalık ilerleyip vireminin arttığı son dönemlerde STL yanıtının etkinliği azalmaktadır (3,4). HIV in Bulaşması HIV infeksiyonu başlıca cinsel temasla, kontamine kan ve kan ürünleri ile ve perinatal yolla bulaşır. Centers for Disease Control (CDC) merkezine bildirilen olguların %4 ü herhangi bir risk faktörünün 13

14 saptanamadığı undetermined kategorisine girer. İnfeksiyonun progresyon hızını belirleyen parametrelerden biri de bulaş yoludur. İnfeksiyonu kan transfüzyonu yoluyla alanlarda median inkübasyon süresi daha kısadır. HIV İNFEKSİYONUNUN KLİNİK SEYRİ HIV infeksiyonu, ağır immünosupresyona neden olan kronik bir infeksiyon hastalığıdır. HIV infeksiyonunun seyri kişiler arasında önemli farklılıklar gösterir. Serokonversiyon sonrası bazı olgularda 6-7 ay gibi kısa sürede immünsupresyon belirtileri ortaya çıkarken, bir kısmında yıl süreyle herhangi bir immünsupresyon belirtisi olmayabilir. Bu olgularda uzun bir latent dönem sonrası klinik ortaya çıkar. Latent dönem boyunca viral replikasyon belli bir hızda devam eder ve buna CD 4 hücre yıkımı eşlik eder. Plazma HIV RNA düzeyi düşük ve CD 4 lenfosit sayısı normale yakın olanlarda infeksiyon yavaş bir seyir gösterirken, plazma viral yükü fazla olanlarda (HIV RNA nın kopya/ml den fazla) klinik hızlı ilerler. Konakçının bulaş yollarından herhangi biri ile HIV infeksiyonunu alışı ile klasik tablo başlar. Erken dönemde akut semptomatik HIV infeksiyonu gelişebilir. Bundan sonra süresi değişken olan infeksiyonun latent dönemi başlar. Bu dönemin sonunda fırsatçı infeksiyon ve malignitelerle seyreden AIDS dönemi başlar. İnfeksiyonun seyri virusun replikasyon hızıyla ilişkilidir. İnfeksiyonun akut döneminde plazmadaki virus yükü fazla ve virus popülasyonu oldukça homojen iken, infeksiyonun ileri evrelerinde plazma viral yükü giderek artar, ancak primer infeksiyondakinden farklı olarak virus popülasyonu oldukça heterojendir. İnfeksiyonun tüm evreleri 14

15 boyunca lenfoid dokudaki virus replikasyonu devam ederken buna paralel olarak CD 4 lenfosit sayısı progresif olarak azalır (3,4). HIV infeksiyonunun kategorileri CDC tarafından CD 4 lenfosit sayıları, konstitüsyonel semptomlar, fırsatçı infeksiyonlar ve neoplaziler esas alınarak belirlenmiştir (Tablo 2) (8). Tablo 2: Adolesan ve Erişkinler İçin AIDS Olgu Tanımı Klinik kategoriler CD4 hücre kategorisi A Asemptomatik, Akut HIV veya PGL B Semptomatik Non A non C C AIDS göstergeleri >500/mm3 (%29) A1 B1 C /mm3(%14-28) A2 B2 C2 <200/mm3(%14) A3 B3 C3 A Kategorisi -Asemtomatik HIV infeksiyonu -Persistant generalize lenfadenapati (PGL) -Akut retroviral sendrom B Kategorisi -Basiller anjiomatoz -Oral ve rekürren vulvovajınal kandidoz -Servikal displazi -Konstitüsyonel semptomlar (38.5 C ateş, 1 aydan uzun süreli diare) -Oral hairy lökoplaki -Herpes zoster -Idiopatik trombositopenik purpura (ITP) -Listeriyoz -Pelvik inflamatuvar hastalık -Periferal nöropati 15

16 C Kategorisi -CD 4 sayısının 200/mm 3 ün altında olması -Özefajial, bronşial ya da trakeal kandidoz -Ekstrapulmoner koksidioidomikoz -İnvaziv serviks kanseri -Kronik intestinal kriptosporidioz -Citomegalovirus (CMV) retiniti; karaciğer, dalak, lenf düğümleri dışında CMV nin saptanması -HIV e bağlı ensefalopati -Kronik Herpes simpleks virus (HSV) ülserleri, bronşiti, pnomonisi ya da özefajiti -Ekstrapulmoner histoplazmoz -Isosporiaz -Kaposi sarkomu -Lenfoma -Ekstrapulmoner Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC) veya Mycobacterium kansasii infeksiyonu -Mycobacterium tuberculosis infeksiyonu (pulmoner veya ekstrapulmoner) -Pneumcsystis jirovecii pnömonisi -Rekürren pnömoni (12 ayda 2 ya da daha fazla epizod) -Progresif multifokal lökoensefalopati -Serebral toksoplazmoz -HIV e bağlı erime (wasting) sendromu 16

17 World Health Organization (WHO) tarafından oluşturulan klinik evreleme sistemi Evre 1 -Asemtomatik HIV infeksiyonu -Persistant generalize lenfadenapati (PGL) -Performans skala 1: asemtomatik, normal aktivite Evre 2 -Kilo kaybı, vücut ağırlığının %10 undan az -Minör mukokutanöz bulgular -Son 5 yıldır Herpes Zoster -Rekürren üst solunum yolu infeksiyonları -Performans skala 2: Semptomatik normal aktivite Evre 3 -Kilo kaybı, vücut ağırlığının %10 undan fazla -Bir aydan uzun süren nedeni bilinmeyen kronik diare -Bir aydan uzun süren nedeni bilinmeyen ateş -Oral kandidiasis -Oral hairy leukoplaki -Pulmoner tüberküloz -Ciddi bakteriyel infeksiyon -Performans skala 3: Son ay içinde günlerinin yarıdan fazlasını yatarak geçirmesi Evre 4 -HIV e bağlı erime sendromu -Pneumocystis jirovecii pnömonisi -Serebral Toksoplazmosis -Bir aydan uzun süren Cryptosporidiasis (diare) -Ekstrapulmoner Cryptosporidiasis 17

18 -Karaciğer, dalak ve lenf nodu dışı organda CMV hastalığı -Bir aydan uzun süren mukokütanöz Herpes Simplex Virus (HSV) infeksiyonu -Progresif Multifokal Lökoensefalopati (PML) -Herhangibir dissemine endemik mikoz (örnek: histoplasmosis) -Özefagus, trakea, bronş ve akciğerin kandidiasisi -Dissemine atipik mikobakteriosis -Ekstrapulmoner tüberküloz -Lenfoma -Kaposi sarkomu -HIV ensefalopati -Performans skala 4: Son ay içinde günlerinin yarıdan fazlasını yatarak geçirmesi Primer HIV infeksiyonu (Akut Retroviral Sendrom) Tüm hastaların %50-90 ında semptomatik primer HIV infeksiyonu görülür. Virus alındıktan semptomlar başlayana kadar geçen süre genellikle 2-4 haftadır. Bu dönemde hastalarda ateş, adenopati, farenjit, döküntü, miyalji veya atralji, diyare, bulantı, kusma, meningoensefalit tespit edilir. Bu dönemde CD 4 sayısı düştüğü için önce lenfopeni, sonra da CD 8 hücre sayısındaki artışla lenfositoz saptanır. CD 8 pozitif T lenfositlerin ve antikorların ortaya çıkmasıyla beraber viral yük azalır ve bununla birlikte semptomlar gerilemeye başlar. Semptomlar nonspesifik olduğu için bu dönemde tanı koymak çok zordur (4,5). Bu dönemde standart ELISA ve Western blot testleri ile HIV antikorları çoğunlukla saptanamaz. Bu nedenle bu dönemde serum HIV p24 antijeni ölçülebilir. HIV p24 antijeni tespit edilemeyen kişilerde tanı için HIV RNA PCR yapılmalıdır. 18

19 Anti-HIV antikorları virusun vücuda girişinden sonra 6-12 hafta içinde pozitifleşir. Bu dönem serokonversiyon dönemi olarak adlandırılmaktadır (5). Asemptomatik dönem: Bu dönem boyunca hasta klinik olarak asemptomatiktir. Bazı hastalarda persistan generalize lenfadenopati (PGL) (inguinal bölge dışında kalan 2 ya da daha fazla yerde LAP) ve seboreik dermatit görülebilir. Asemptomatik dönem boyunca lenfatik dokularda virus replikasyonu devam eder ve CD 4 sayısı progresif olarak azalır. Bu dönemin süresi 2 yıl kadar kısa veya 15 yıl kadar uzun olabilir (ortalama 7-10 yıl). Bulaş yolu, hastanın yaşı, virusun virulansı gibi faktörler bu süreyi belirler. CD 4 pozitif T hücre sayısı asemptomatik dönem boyunca 500/mm 3 ün üzerindedir. Plazmadaki virusu PCR ile göstermek mümkündür (3,4). Erken semptomatik dönem : Bu dönemde ateş, açıklanamayan kilo kaybı, tekrarlayan diyare, halsizlik, başağrısı gibi B kategorisinde sayılan semptomlar sık görülür. Ayrıca seboreik dermatit, folikülit, rekürren vulvovajinal kandidiyazis, oral kandidiyazis, herpes zoster ve oral hairy lökoplaki gibi cilt bulguları ile sık karşılaşılır. CD 4 sayısı genellikle /mm 3 tür. CD 4 sayısı 200/mm 3 ün altına düşenlerde fırsatçı infeksiyon ve malignansi riski artar. Transaminazlarda yükselme, lökopeni, trombositopeni ve anemi bu dönemin diğer labaratuar bulgularıdır. CD 4 sayımı ile beraber viral yük de bakılması ve tedavi planının buna göre yapılması önerilir (3). Geç semptomatik dönem: AIDS ile ilişkili fırsatçı infeksiyon ve malignansi (PCP, dissemine MAC infeksiyonu, özefageal kandidiyazis, lenfoma vb.) görülme riski CD 4 pozitif T lenfosit sayısı 200/mm 3 ün altına 19

20 inince artar. AIDS ile ilişkili erime sendromu, demans ve periferik nöropati geç semptomatik dönemin özelliklerindendir. Kullanılan ilaçlara, mevcut infeksiyonlara ya da malignansilere bağlı olarak anemi, lökopeni, trombositopeni sık görülür. Laktat dehidrogenaz (LDH), globulin düzeyleri genellikle yüksektir. Bu evrede fırsatçı infeksiyonların profilaksisi, tanısı ve tedavisi önemlidir. Eğer tedavi almıyorsa hemen tedaviye başlanmalı, tedavi alıyorsa daha güçlü bir tedaviye geçilmelidir (3,4). İleri evre: CD4 sayısının 50/mm 3 ün altına düştüğü, hastaların ileri derecede immünsuprese olduğu dönemdir. Bu dönemde dissemine MAC infeksiyonu, CMV retiniti, dissemine histoplazmoz, progresif multifokal lökoensefalopati daha sık görülür. Kalori alımında azalma, katabolizmada hızlanma ve malabsorbsiyon nedeniyle hastaların çoğunda erime sendromu gelişir. Tedavi yaklaşımı, geç semptomatik dönemdeki gibidir. Her fırsatçı infeksiyonun tedavisi ile birlikte yaşam boyu supresyon tedavisi gerekir (3,5). HIV İnfeksiyonunda Fırsatçı İnfeksiyonlar HIV/AIDS olgularında klinik tablonun seyrini ve prognozu, HIV ile birlikte fırsatçı infeksiyonların birlikte oluşturdukları bir süreç belirler. Hastaların yaklaşık %80 inde mortalite fırsatçı infeksiyonlara bağlı olarak gelişir. Ülkemizde hastaların büyük çoğunluğu fırsatçı infeksiyonlar nedeniyle hastaneye başvurduklarında tanı almaktadır. Fırsatçı infeksiyonlar CD 4 pozitif lenfosit sayısı 200/mm 3 ün altına düştüğünde daha sık ortaya çıktığı için HIV/AIDS olguları daha çok hastalığın ileri evrelerinde tanı almaktadır (4). 20

21 HIV olgularında sıklıkla fırsatçı infeksiyonlara neden olan etkenler şunlardır: Bakteriler : Staphylococcus spp, Streptococcus pneumoniae, Heamophilus influenzae, Salmonella spp., Bartonella spp., Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complex (MAC) Viruslar: Herpes simpleks virus (HSV), Herpes zoster virus (HZV), Cytomegalovirus (CMV) Mantarlar: Candida spp., Cryptococcus spp., Aspergillus spp., Histoplasma spp., Coccidioidomyces spp. Parazitler: Pneumocystis jirovecii, Toxoplasma gondii, İsospora belli, Microsporidia spp. CRYPTOSPORİDİUM Cryptosporidium spp, apikomplexa şubesinin coccidia sınfında Eimeria, Sarcocystis, Toxoplasma, Cyclospora ve Isospora ile birlikte yer alır. Yıllarca nadir görülen bir hayvan patojeni olarak düşünülen parazit ilk kez 1973 de ciddi gastroenterit tablosu olan 3 yaşındaki bir hastadan izole edilmiştir. Cryptosporidium türleri konakçı özgüllüğüne, morfolojilerine ve moleküler biyoloji çalışmalarına göre belirlenmiştir. Birçok insan izolatının tek bir türe (C. parvum) ait olduğu düşünülürken yapılan moleküler çalışmalar, C. parvum türünün birçok genotipinin ve gizli türlerinin olduğunu gösterdi. İnsanda infeksiyon yapabilen diğer türler, C. hominis, C. canis, C. meleagridis, C. felis ve C. muris olarak belirlendi. Cryptosporidium türleri birbirini izleyen seksüel ve aseksüel dönemlerden oluşan hayat sikluslarını tek konakta tamamlayabilmektedir (6,7,8). 21

22 C, parvum türünün insan vücüduna ilk girdiğinde yerleşim yeri incebarsak epitelinin mikrovillus bölgesidir. Yerleşim yeri nedeniyle diğer hücre içi parazitlerden ayrılmaktadır (6). Epidemiyoloji: Cryptosporidium spp, konakçı vücudu dışında çoğalamadığı için infeksiyöz dozu düşüktür ve bu da bulaşmayı kolaylaştırmaktadır. Dış ortamda uzun süre yaşayabilmesi ve klorlanmaya dirençli olması, su ile bulaşa neden olmaktadır. Ookistler vücuttan atıldığı anda infeksiyoz olduğu için insanlar birbirine bulaştırabilmektedir. Bazı genotipler önemli hayvan rezervuarlarına sahip olduğu için bu hayvanlarla temas da bulaşmada önemlidir. Cryptosporidium spp, Antarktika dışında dünyanın her bölgesinde bulunabilmektedir. İnfeksiyon, sıcak ve nemli aylarda daha sık görülür. Gelişmiş ülkelerden yapılan birçok çalışmaya göre Cryptosporidium spp sıklığı %5 ile %10 arasında değişmektedir. Tanı testlerinin gelişmesi ile birlikte saptanabilen vaka sayısı artmaktadır (8). Patogenez: Cryptosporidium türleri barsak epitel hücrelerinin mikrovillusları içinde vakuollerde bulunur. Bağışıklığı yeterli kişilerde distal ileum ve proksimal kolonu tutmaktadır. Bağışıklığı yetersiz kişilerde parazit, barsaklardan, safra kanallarından ve solunum yollarından izole edilmiştir. Parazit, ince barsakların proksimali hariç tüm ince barsakları tutar. Persistan enfeksiyonlarda villus atrofisi ve lamina propriadaki lenfositlerde artış görülebilir. Ağır infeksiyonlarda villus atrofisi, kript hiperplazisi ve belirgin lenfosit, plasma hücresi ve hatta nötrofil infiltrasyonu saptanır (8). Kriptosporidyazis, klinik olarak sulu diyare ve malabsorbsiyonla karakterizedir. Diyarenin fizyolojik nedenlerinin, sodyum 22

23 malabsorbsiyonu, elektrolit sekresyonu ve artmış intestinal permeabilite olduğu düşünülmektedir. Klinik: Tüm sindirim sistemini, özellikle de jejunumu etkileyen parazit, bunun dışında, safra ve solunum yollarını da tutabilir. Kuluçka süresi 5-21 gün olan parazit, bağışıklık sistemi normal olanlarda kısa süreli, bol ve sulu diyare, karında kramplar, bulantı, iştahsızlık ve hafif bir ateşle seyreden klinik tabloya neden olur. Bağışıklığı baskılanmış kişilerde özellikle AIDS hastalarında ise klinik ağır seyreder. Çok sulu olan diyarede günlük su kaybı 17 litreyi bulabilir. Günlük dışkılama sayısı elliyi bulan bu diyarede mortalite %50 lere ulaşmaktadır (8). Gelişmiş ülkelerde meydana gelen infeksiyonlar genellikle su kaynaklıdır ya da seyahat edenlerde, hayvanlarla teması olanlarda ve bakım evlerinde kalan çocuklarda görülür. Bağışıklık sistemi sağlam yetişkinlerde hastalık diyare ile kendini gösterir. Diyare genellikle suludur, nadiren mukoid de olabilir. Hastalık ortalama 5-10 gün kadar devam eder. Diyareye diğer hastalıklarda olduğu gibi abdominal kramp, bulantı, kusma ve ateş eşlik edebilir. Hastalık hafif formda görülebileceği gibi asemptomatik de olabilir. Hafif seyirli hastalarda immünfloresan ile tanı koymaya yetecek kadar yumurta olmadığı için tanıda zorlanılır. Gelişmekte olan ülkelerde en sık rastlanılan kriptosporidyaz kliniği, çocukluk çağı ishalleridir. Asya, Afrika ve Latin Amerika da yapılan çalışmalar diyareli çocuklarda kriptosporidyaz sıklığının %5-10 arasında değiştiğini ortaya koymuştur. Akut hastalık, sulu diyare, abdominal ağrı ve kramp ile karakterizedir. Hastaların çoğunluğu hızlı bir şekilde iyileşirken az bir kısmında hastalık 14 güne kadar uzamaktadır. Cryptosporidium spp, gelişmekte olan ülkelerdeki önemli kronik ishal nedenlerindendir (6,8). 23

24 Gelişmekte olan ülkelerdeki çocukluk çağı ishallerinde yapılan çalışmalarda malnütrisyon ile kriptosporidyaz ilişkili bulunmuştur. Kriptosporidyaz malnütrisyonlu hastalarda çok ciddi seyretmektedir. Ölümlerin çoğu malnütrisyonlu çocuklarda görülmektedir. HIV pozitif hastalarda CD 4 sayısı 150 nin üzerinde olanlarda hastalık kendini sınırlar ve normal populasyondaki gibi seyretmektedir. Diğer hastalarda bol hacimli, sıklığı fazla ve kötü kokulu kronik ishal gelişmektedir. Hastaların çoğunda kilo kaybı görülmektedir. Hastalık klinik olarak mikrosporidyaz, dissemine Mycobacterium infeksiyonu ve sitomegaloviral kolit ile karışabilir. Kriptosporidyaz HIV seropozitif kişilerde safra ve solunum yollarını da içeren ekstraintestinal tutulumla karekterize olabilir (6,8). Tanı: Parazitler ilk olarak barsak dokusunun histolojik olarak boyanması ile gösterilmiştir. Parazitler epitel hücrelerinin yüzeyinde veya lümende görülebilir. İntraselüler formlar hemotoxylen ile pembe görülür. Dokular ancak invaziv girişimlerle elde edililebildiği için rutin tanıda kullanılamaz (8). Birçok intestinal parazitte olduğu gibi Cryptosporidium spp. infeksiyonlarının tanısında da gaitanın mikroskobik incelemesi kullanılır. Genellikle gaitalar %10 tamponize edilmiş formalin içinde saklanır. Taze gaita da çalışılabilir fakat laboratuvar personeli için infeksiyöz olabilir. Saklamada polivinyl alkol de kullanılabilir fakat boyama tekniklerini bozduğu için tercih edilmez. Dondurulmuş gaita bazı ELISA testlerinde kullanılabilir (8). Gaitanın konsantrasyon metodlarından formalin eter ve formalin ethyl asetat klinik laboratuvarlarda sıklıkla kullanılmıştır. Yüzdürme metodları parazitin tanısını kolaylaştırmaktadır. Bunların hepsi zahmetli tekniklerdir ve araştırma laboratuvarlarında kullanılmaktadır. 24

25 İmmünomagnetik dalgalar organizmaların izolasyonunda ve organizmaları konsantre etmede kullanılırsa gaita tetkikinin sensivitesi yükselmektedir. Ağır hastalarda sulu gaitalar direk mikroskopi veya faz-kontras mikroskopi ile incelenerek hızlı sonuç alınabilir. Fakat ookistler küçüktür ve normalde gaitada bulunabilen mayalarla benzer şekil ve büyüklükte olduğu için bunlarla karışabilir. Bunlar trikrom boyalarla iyi boyanmazlar ve Giemsa ile boyamada mayalarla ayırt edilmeleri zordur. Ayırtıcı boyalardan biri olan asit-fast boyamada ookistler pembe yada kırmızı boyanırken maya hücreleri ve fekal artıklar yeşil ya da mavi boyanır. En sık kullanılan boyama yöntemi modifiye Ziehl-Neelsen boyamadır. Asit-fast boyama ile yapılan gaita incelemesinin sensivitesi düşüktür, forme gaita da /ml ookist konsantrasyonu gereklidir. Floresan boyamalar ile sonuçlar diğer asit-fast boyamalara göre daha hızlı okunabilir ve duyarlılığı daha yüksektir. Fakat bu testler yanlış pozitif sonuçlar nedeniyle işleri zorlaştırmaktadır. İmmun floresan antikor (İFA) testleri, asit-fast boyamaya göre en az 10 kat daha sensitiftir. Monoklonal antikorlar kullanılarak yapılan direk immün floresan test gaita örnekleri için altın standarttır (8,9). Resim 1 : Modifiye asit-fast boyama yöntemi ile boyanan Cryptosporidium kistleri Gaitada antijen aramaya yönelik testler giderek daha fazla kullanılmaktadır. Kriptosporidyaz tanısında kullanılan ELISA kitlerinin sensitivitesi %66 ile %100 arasında değişirken spesifitesi mükemmeldir. 25

26 İmmünokromatografik testler de tanıda kullanılan hızlı testlerdendir. Sensitivitesi diğer testlerden düşük iken spesifitesi mükemmeldir ve dakikalar içinde sonuç alınır (8,11). Ookistleri saptamada floresan antikor ve flow-sitometri kombinasyonunun duyarlılığı immünfloresan tesstlerinden daha yüksektir. Flow cytometry organizma /ml belirleyebilir (8). PCR, C. parvum DNA sını saptamada kullanılan bir diğer testtir. Mikroskopik testlerle kombine edilirse duyarlılığı artmaktadır. ELISA (Enzyme Linked Immünosorbent Assay) Antikor veya antijen aranmasında kullanılan serolojik testlerden biri olan ELISA yöntemi antijen-antikor bağlanmasını göstermek amacıyla enzimle işaretli konjugant ve enzim substratı kullanılarak renk oluşumu esasına dayanan bir testtir. Elimizde neye özgül olduğunu bildiğimiz antijen ile örneklerdeki antikoru, tipini ve miktarını veya elimizde antikor var ise de buna özgü antijeni ve miktarını saptayabiliriz. Farklı ELISA yöntemleri mevcuttur: -Kompetetif ve nonkompetetif ELISA -İndirek ELISA -Sandwich ELISA -Makro ve mikro-elisa -Avidin ve biyotin ekli ELISA Serumda antikor aramak için yapılan indirek mikro ELISA testinin basamakları: 1-Katı faz olarak kullanılan 96 çukurlu polistren plaklar üzerine bilinen bir antijen bağlanır. 2-Antijen bağlı çukurlara serum örnekleri eklenerek oda ısısında veya 37 C de belirli bir süre inkübe edilir. Bu sürenin sonunda çukurlar 26

27 tamponlanmış sıvı ile yıkanır. Serumda antikor varsa katı fazdaki antijene bağlanarak yıkama işlemi ile ortamdan uzaklaşmaz. Eğer serumda antikor yok ise antijene bağlanmaz ve yıkama işlemi sonunda tamamen temizlenmiş olur. 3-Katı fazdaki antijene bağlanmış olan IgG yapısındaki antikoru saptamak için çukurlara konjugant olarak tanımlanan Fc kısmı enzim ile işaretli anti-igg antikoru eklenir. Konjugant yapısında bulunan enzim genellikle peroksidazdır. Bunun dışında kullanılan enzimler; alkalen fosfataz, glukoz oksidaz, beta D-galaktosidazdır. Çukurlara konjugant eklendikten sonra belirli bir süre inkübe edilir. Bu sürenin sonunda tamponlanmış su ile ikinci bir kez yıkanır. Katı fazdaki antijene bağlanmış olan antikora bağlanan konjugat ikinci yıkama işlemi ile çukurdan uzaklaştırılamaz. 4-Ortamda bağlı kalan konjugatın gösterilmesi için ortama konjuganttaki enzime uygun substrat ve reaksiyonun görünür hale gelmesi için kromojen içeren karışım eklenir. Çukurlara eklenmiş renksiz enzim substratı belli bir sonra enzimin etkisi ile renklenir. Enzim aktivitesini durdurmak için ortama asit (H 2 SO 4 ) eklenir ve oluşan rengin koyuluğu (optik dansite) ELISA okuyucusunda okutulur. Çukurlarda oluşan rengin koyuluğu serumdaki antikorun miktarı ile doğru orantılıdır. Plaktaki bazı çukurlara miktarını bildiğimiz antikor eklenirse, bu çukurlarda oluşan optik dansite eğrisi ile serumdaki antikor miktarı saptanabilir. 27

28 Resim 2 : Pozitif kontrol ve pozitif sonuçların görüldüğü bir ELISA örneği Tedavi: Kriptosporidyaz tedavisinde en önemli komponent destekleyici tedavidir. Oral rehidratasyon tedavisi önerilebilir fakat ciddi hastalıkta parenteral tedaviye ihtiyaç duyulur. Parenteral sıvı sodyum, potasyum, bikarbonat ve glikoz içermelidir. Kriptosporidyaz laktaz enzimi içeren matur epitel hücrelerinin villus kaybı ile karekterizedir. Bu nedenle laktozsuz diyet önerilmelidir. Kriptosporidyaz hızlanmış barsak pasajı ile karekterize olduğu için sıvı elektrolit ve ilaç absorbsiyonu azalır. Bu nedenle antimotilite ajanları anahtar rol oynar. Opiatlar genellikle ilk tercih edilen ilaçlardır. Loperamid ve difenoksilat/atropin kombinasyonu semptomları azaltabilir fakat etkileri sınırlıdır. Cevap alınamayan hastalarda güçlü opiatlar denenebilir. Somatostatinin sentetik peptit analoğu olan octreotidle diareli AIDS hastalarında yapılmış çeşitli çalışmalar etkili olduğunu göstermiş fakat diğer antidiyareiklerden üstünlüğü gösterilememiştir (8). 28

29 Kronik kriptosporidyazlı AIDS hastalarında efektiv antiretroviral tedavi diyarede dramatik bir düzelme sağlayabilir. Antiretroviral tedavi kombinasyonunda reverse transkriptaz inhibitörleri ve bir ya da daha fazla proteaz inhibitörü içermelidir. HIV proteaz inhibitörleri invitro antikriptosporidyal etkinliğe sahiptir ve hayvan modellerinde infeksiyonu %90 azaltmıştır (8). Antiparazitik tedavinin etkinliğini göstermek güçtür. Antikriptosporidyal ajanlarla yapılan invitro ve hayvan modelleri çalışmalarında sınırlı başarı elde edilmiştir. Bağışıklık sistemi yetersiz hastalarda hiçbir ajan küratif olamamıştır. Nitazoxanide, geniş spektrumlu antiparaziter ilaçlardandır. İnvitro çalışmalarda ve hayvan modellerinde kriptosporidyazda etkili bulunmuştur. Hayvan modellerinde parazit sayısını azaltmış ancak kür sağlayamamıştır. HIV ile infekte çocuklarda yapılan çalışmalarda klinik ve parazitolojik olarak belirgin bir değişiklik görülmemiştir. Selüler immünitede ciddi bozukluğu olan hastalar yüksek doz ve uzun süreli kullanımdan fayda görebilir. Paramomisin oral alınan ve absorbe olmayan aminoglikozitlerdendir. C. parvum parazitine karşı zayıf aktivite gösterir. HIV ile infekte hastalarla yapılan klinik çalışmalarda paramomisin küratif olamamıştır (8). Makrolidlerden spiramisin, azitromisin, roksitromisin ve klaritromisin Cryptosporidium türlerine hafif etkilidir. Ancak hiçbiri ile etkili sonuçlar alınamamıştır. İlaçların sınırlı aktivitelerinden dolayı kombinasyon tedavileri araştırılmalıdır. Ancak bu konudaki araştırmalar sınırlıdır. 29

30 MATERYAL-METOD Çalışmamızda, Haseki Eğitim ve Araştırma Hastanesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji kliniğinde takip edilmekte olan HIV/ AIDS olgularının gaita örneklerinde ELISA yöntemi ile Cryptosporidium türlerinin sıklığı araştırıldı. Gaita örneği alınan hastalardan; 1-Yaş 2-Cinsiyet 3-HIV RNA düzeyi 4-CD 4 pozitif lenfosit sayıları 5-Antiretroviral tedavi alıp almadığı 6-Fırsatçı enfeksiyonların varlığı sorgulanarak klinik bilgi alındı. Hastalardan gaita kabı içine alınan örnekler, buzdolabında -2 C ile-8 C arasındaki ısıda en fazla 3 gün bekletilerek çalışmaya alındı. Çalışmada, RIDASCREEN R Cryptosporidium (Biopharm) kiti kullanılarak gaitada antijen arandı. Kit içinde bulunanlar; 1) 12 tane 8 adet kuyucuk içeren mikrostripler 2) Universal gaita diluenti (100 ml, kullanıma hazır) 3)Yıkama solusyonu (100 ml, 10x konsantre, ph 7.2, %0.1 Thimerosal içeriyor) 4) Pozitif kontrol (1.8ml, gaitadan elde edilen Cryptosporidium antijeni, % 0.01 Thimerosal içerir) 5)Konjugant enzimi (10ml, peroxidase ile konjuge edilmiş Cryptosporidium a karşı oluşmuş antikor) 6) Substrat/kromojen (10 ml, peroxide/tmb) 30

31 7) Stop solusyonu (10 ml, 1 N sülfirik asit) Çalışma prosedürü: 1-Her hasta için plastik tüpler numaralanarak her birine sample dilüsyon solüsyonundan dağıtıldı. 2-Solüsyon eklenmiş tüpler içine gaita sıvı ise 100 mikrolitre, katı ise karıştırıcı çubuk yardımı ile nohut tanesi kadar gaita eklenip homojen bir süspansiyon oluşana kadar karıştırıldı. 3-Gaita içindeki partiküllerin çökmesi için 5 dakika beklendi. 4-Tüpün üzerinde oluşan süpernatant kısmından 100 mikrolitre alınarak plaklar üzerindeki hastalara ayrılan kuyucuklara aktarıldı. Beraberinde pozitif ve negatif kontroller de kuyucuklara eklendi. 5-Tüm kuyucuklara konjugantdan 2 damla eklenip yavaşca sallanarak karıştırıldı ve oda ısısında 60 dakika inkübe edildi. 6-1/10 sulandırılmış tamponlanmış yıkama solusyonu ile 5 defa yıkama yapıldı 7-Substratdan 2 damla eklenerek 15 dakika oda ısısında ve karanlıkta ikinci kez inkübe edildi. 8-Bir damla asit solusyonu eklenerek oluşan renk değişimi optik okuyucuda okutuldu. 31

32 BULGULAR Haseki Eğitim ve Araştırma Hastanesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji kliniğinde takip edilmekte olan 29 HIV/AIDS vakasının gaita örneğinde ELISA yöntemi ile Cryptosporidium türlerine ait antijenler araştırılmıştır. Çalışmamıza dahil edilen yaşları arasında değişen 29 hastanın % 79 u (n=23) erkeklerden oluşmakta idi (Grafik 1). Bunlar içinde iki adet karı-koca vardı. Grafik1:Hastaların cinsiyet dağılımı 21% 79% Kadın Erkek Hastaların çoğu yaşları arasındaydı (Tablo 3). Tablo 3: Hastaların yaşlarına göre dağılımı Yaşlar Toplam (n) Yüzde (%) 30 un altı ın üstü Toplam

33 Hastaların büyük çoğunluğu son bir yıl içinde tanı almışlardı (Tablo 4). Tablo 4: Tanı alma sürelerine göre hasta dağılımı Tanı alma süreleri Toplam (n) Yüzde (%) Son 1 yıl yıl yıl yılın üstü Toplam Son beş yıl içinde tanı alan hastaların beşi kadın, 20 si erkeklerden meydana gelmekteydi. Bu hastaların yaşlarına göre dağılımı grafik 2 de görülmektedir. Hastaların yarıdan fazlası yaş diliminde toplanmıştır (grafik 2). Grafik 2: 5 yıllık zaman diliminde tanı alan hastaların yaş gruplarına göre dağılımı 40% 4% 56% 30'un altı 'ın üstü Çalışmamıza alınan 29 hastanın %24 ünün (n=7) CD 4 sayısı 200 ün altında, % 38 nin (n=11) CD 4 sayısı ise 500 ün üzerindeydi (Tablo 5). Tablo 5: Hastaların CD 4 sayı aralıklarına göre dağılımları CD 4 sayıları (/mm 3 ) Toplam (n) Yüzde < > Toplam

34 Grafik 3: Hastaların CD 4 sayılarına göre dağılımları 'ün altı 'ün üstü CD 4 sayıları 200 ün altında olan yedi hastanın hepsi erkeklerden oluşurken, çoğunluğu (n=6) son beş yılda tanı alan hastalardan oluşmaktaydı. Bu hastaların yaşlarına göre dağılımlarına baktığımızda bir tanesi 30 yaşın altında, üç tanesi yaşları arasında ve üç tanesi de 40 yaşın üzerindeydi. Hastaların % 17.2 sinin (n=5) HIV RNA düzeyi kopya/ ml nin üzerindeydi (Tablo 6). Tablo 6: Hastaların HIV RNA sayılarına göre dağılımları HIV RNA sayısı (kopya/ml) Toplam (n) Yüzde (%) < > Toplam Hastalardan altı tanesinin HIV RNA düzeyi in üzerindedir. Bu hastalardan dört tanesinin CD 4 sayısı 200 ün altında iken kalan iki tanesinin CD 4 sayısı ise 300 ün üzerindeydi. Bu hastaların hepsi 34

35 erkeklerden oluşurken, beş tanesinde çeşitli fırsatçı infeksiyonlar görülmüştü. Hastaların 12 si AIDS basamağında idi (Tablo 7). Tablo 7: Hastaların AIDS/taşıyıcı sayılarına göre dağılımları Toplam Yüzde AIDS Taşıyıcı Toplam AIDS basamağındaki 12 hastanın yedi tanesi CD 4 sayısı 200 ün altında olan hastalardan oluşurken, kalan hastaların üç tanesi Mycobacterium tuberculosis infeksiyonu geçirirken iki tanesi de rekürren pnömoni geçirmiştir. Hastalığın bulaşma yollarına baktığımızda heteroseksüel bulaş % 72.5 yüzdesi ile ön sıradaydı (Tablo 8). Tablo 8: Hastaların bulaşma yollarına göre dağılımları Bulaş yolları Toplam Yüzde Homoseksüel/biseksüel Heteroseksüel IV madde bağımlılığı 0 0 Kan transfüzyonu 0 0 Diğer Toplam Hastaların %13.8 i (n=4) trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP- SMX) profilaksisi almaktaydı (Tablo 9). Tablo 9: TMP-SMX alan hastaların sayısı Toplam Yüzde TMP-SMX alanlar TMP-almayanlar Toplam

36 TMP-SMX profilaksisi alan dört hastanın bir tanesinin CD 4 sayısı 50 nin altında iken, iki tanesi pnömoni ve bir tanesi de Zona zoster geçirmişti. Bu hastaların biri kadın üçü erkekti ve kadın hasta hamileliği sırasında tanı almıştı. Hastaların %89.6 sı (n=26) antiretroviral tedavi almaktaydı (Tablo 10). Tablo 10: Antiretroviral tedavi alan hastaların sayısı Tedavi kombinasyonları Toplam (n) Yüzde (%) 2 NRTI*+ 1 proteaz inhibitörü NRTI+ 2 proteaz inhibitörü NRTI Tedavi almayanlar Toplam *NRTI: Nükleozid revers transkriptaz inhibitörleri Antiretroviral tedavi almayan üç hastanın birinde allerji nedeniyle ilaç kesilmiş, diğeri yeni tanı alan hasta idi. Üçüncü hasta ise kendi isteği ile tedavisini kesmişti. Bu hastanın CD 4 sayısı 200 ün altında ve HIV RNA düzeyi de in üzerindeydi. Geçirilen fırsatçı enfeksiyonların dağılımlarına baktığımızda pulmoner/ekstrapulmoner tüberkülozun %30.8 ile ilk sırayı aldığı görülmüştür. Aralıklı seyreden ishal şikayeti olan bir hastada aynı zamanda oral kandidiyaz da tespit edilmiştir (Tablo 11). Tablo 11: Fırsatçı infeksiyon geçiren hastaların sayıları Fırsatçı enfeksiyonlar Olgu sayısı Yüzde Pulmoner/Ekstrapulmoner tüberküloz Oral/genital kandidiyaz Herpes genitalis Zona zoster Molluscum contagiosum Pnömoni 3 23 Toplam

37 Fırsatçı infeksiyon geçiren 13 hastanın %77 sinde CD 4 sayısı 500 ün altındaydı (Tablo 12). HIV RNA sı in üstünde olan üç, in altında olan yedi ve arasında olan üç hasta vardı. Bu hastaların %76.9 u (n=10) erkeklerden oluşmaktaydı (Tablo 13). Tablo 12: Fırsatçı enfeksiyonu olan hastaların CD 4 sayıları CD 4 sayısı Toplam (n) Yüzde (%) 500 ün üzeri ün altında Toplam Tablo 13: Fırsatçı enfeksiyon geçiren hastaların cinsiyet dağılımı Cinsiyet Toplam (n) Yüzde (%) Erkek Kadın Toplam Gaitalarında ELISA yöntemi ile Cryptosporidium antijeni araştırdığımız 29 HIV/AIDS hastasının hiçbirinde Cryptosporidium tespit edilmedi. 37

38 TARTIŞMA Cryptosporidium spp, protozoonların apikomplexa şubesinin coccidia grubunda yer alan son 20 yılda insan patojeni olarak dikkatleri üzerine toplayan bir parazittir. İlk olarak AIDS ve diğer bağışıklık yetersizliği durumlarında meydana getirdiği ciddi ve hayatı tehdit eden ishallerle dikkati çekmiştir. Daha sonraları Cryptosporidium türlerinin aynı zamanda bağışıklığı yeterli kişilerde de kendini sınırlayan, sulu diyarelere neden olduğu görülmüştür (6,7,9). Cryptosporidium spp, gelişmiş ülkelerde görülen akut diyarelerde incelenen gaita örneklerinde %1-7 oranında tespit edilmektedir. Bu parazit çocuklarda özellikle de anne sütü ile beslenmeyenlerde daha sık izlenmektedir. İnsanlara bulaşmada evcil ve besi hayvanları önemli rol oynarken su kaynaklı bulaş da görülmektedir. Parazitin fekal-oral geçişi gösterilmiştir ve ookistler su atıklarında tespit edilebilmektedir. Çocukların evcil hayvanlardan infekte olduğunu gösteren çeşitli çalışmalar mevcuttur (6,7,9). Tüm dünyada yaygın olan Cryptosporidium spp infeksiyonu su kaynaklı epidemilere neden olabilmektedir yılında ABD de kişinin etkilendiği bir epidemi bildirilmiştir (11). Su kaynaklı epidemilere neden olarak; parazitin kaynak sularında yüksek oranda bulunması, klora dirençli olması, içme suyu filtrelerinden geçebilmesi ve çok az sayıda parazitin bile infeksiyona neden olması gösterilmektedir. Cryptosporidium spp infeksiyonunun birlikte en sık görüldüğü hastalık grubunu oluşturan HIV/AIDS, tüm dünyayı saran bir pandemi şeklinde devam etmektedir. HIV ile infekte hastaların büyük bir çoğunluğu gelişmekte olan ülkelerden bildirilmektedir. Dünyada HIV infeksiyonunun en yoğun bulunduğu bölge %7.2 prevelansla Sahra altı Afrika dır (10). Bundan sonra prevelansın yüksek olduğu bölgeler; Doğu ve Güney Asya ve Güney Amerika ülkeleridir. Ülkemiz, dünyanın birçok 38

39 bölgesine göre HIV infeksiyonu prevelansının düşük olduğu ülkelerdendir. Cryptosporidium türleri ile ilgili yapılan çalışmalar kategoriler halinde incelendiğinde birinci grup, bağışıklık sisteminde yetersizlik olmayan hastalarla yapılan çalışmalardır. Ülkemizde farklı yaş gruplarında yapılan tarama çalışmalarında Cryptosporidium spp. sıklığının %4 ile yüzbinde üç arasında değiştiği görülmektedir. Yazar ve arkadaşlarının Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim dalına başvuran hastalarda bağırsak parazitlerini araştıran kişinin dahil edildiği çalışmalarında Cryptosporidium spp yüzbinde üç oranında tespit edilmiştir (13). Orhan ve arkadaşlarının İzmir de bir çocuk yuvasında 148 adet gaita örneğinde modifiye asit-fast ve safranin boyama yöntemleri kullanarak yaptıkları çalışmada Cryptosporidium spp. saptanmamıştır (14). Türk ve arkadaşlarının İzmir de yaptığı çalışmada mikrobiyoloji laboratuvarına gelen 4322 dışkı örneğinde bağırsak parazitleri araştırılmış ve Cryptosporidium spp. sıklığı binde 42 olarak bulunmuştur (15). Doğancı ve arkadaşlarının Ankara da yaptığı çalışmada rastgele seçilen 50 çocukta çeşitli yöntemlerle (direk mikroskopi, modifiye asit-fast boyama, Kinyoun asit-fast boyama ve karbol-fuksin) Cryptosporidium spp. araştırılmış ve 2 adet (%4) gaita örneğinde pozitif sonuç elde edilmiştir (9). Mersin de diyare şikayeti olmayan, 466 normal sağlıklı kişinin katıldığı, Kinyoun un asit-fast boyama yöntemi kullanılan çalışmada ise incelenen örneklerin %3.1 inde Cryptosporidium spp. ookistlerine rastlanmıştır (16). Yukarıdaki çalışmalarda görüldüğü gibi farklı sonuçlar elde edilmesinde çalışılan populasyonun sayılarının değişkenliği ve 39

40 bölgesel farklılıklar etken olabileceği gibi örnekleri çalışan personelin deneyimi de önemli olabilir. Mikroskopik çalışmalar eğitilmiş personele ihtiyaç gösteren, kişisel deneyim gerektiren çalışmalardır. İkinci grup olarak ele alınan, diyareli ve bağışıklık sistemi yeterli olan hastalarda yapılan çalışmalarda, Cryptosporidium spp. sıklığı %13.5 ile binde 4 arasında bulunmuştur. İnceboz ve arkadaşlarının gastrointestinal şikayetleri olan 225 hastanın gaitasında Kinyoun un asitfast boyama yöntemi ile yaptıkları çalışmada Cryptosporidium spp. binde 4 oranında tespit edilmiş ve şiddetli diyare ile başvuran olgularda, immun sistem problemi olmasa da kriptosporidyazisin araştırılması gerektiği kanaatine varılmıştır (17). Malatya da diyareli hastalarda yapılan benzer bir çalışmada 500 dışkı örneği Kinyoun un asit-fast boyama yöntemi ile incelenmiş ve incelenen dışkı örneklerinin % 1.6 sında Cryptosporidium türlerine rastlanmıştır (18). Ankara da 345 adet diyareli hastada çeşitli yöntemler (Modifiye asit-fast, Kinyoun Asit-Fast, Asit-Fast Trichrome) kullanılarak Cryptosporidium spp. ookistinin arandığı çalışmada hiçbir örnekte ilgili etkene rastlanmamıştır. Toplanan dışkı örneklerinden etkeni bulundurma ihtimali yüksek olan 159 adet dışkı örneği seçilip ELISA yöntemi ile Cryptosporidium spp. antijenlerinin varlığı araştırılmış ve altısı (%3.8) pozitif olarak bulunmuştur (19). ELISA özel eğitim görmüş personele ihtiyaç göstermemesi, kolay ve hızlı uygulanabilmesi gibi özellikleri ile mikroskobik yöntemlere üstünlük göstermektedir. Mikroskopik yöntemlerle karşılaştırmalı olarak yapılan çeşitli çalışmalarda ELISA nın en az mikroskobik yöntemler kadar duyarlı olduğu görülmüş ve mikroskobik yöntemlere iyi bir alternatif olduğu düşünülmüştür (20, 21). Koturoğlu ve arkadaşlarının İzmir de 118 akut diyareli çocukta modifiye asit-fast boyama yöntemi kullanarak yaptığı çalışmada Cryptosporidium spp. oranı %13.5 olarak bulunmuştur (22). 40