SPEED-OLIGO GROUP B STREPTOCOCCUS

Transkript

1 1 TR SPEED-OLIGO GROUP B STREPTOCOCCUS artan kısmın membran tarafından absorbe edilmesinden dolayı ürün kontrol çizgisi ortaya çıkar. Altın reaksiyonunun olduğu konumda kırmızı çizgiler görünür hale gelir. Bu teknik geleneksel PCR dan daha duyarlı ve daha spesifiktir. Çift hibridizasyon spesifik ve spesifik olmayan amplifikasyon fragmanları arasındaki ayırımı sağlar. SP004: Klinik örneklerde Streptococcus group B nin kalitatif belirlenmesi için oligokromatografik test. 40 test. GİRİŞ: Group B streptococcus (GBS; Streptococcus agalactiae) enfeksiyonu rutin prenatal taramadan dolayı oluş sıklığında azalmaya rağmen neonatal hastalığa ve ölüme neden olacak şekilde devam eder. Bebeklerde GBS enfeksiyonları çocukluğun çok erken dönemleriyle kısıtlanmıştır. Bebek enfeksiyonlarının yaklaşık olarak %80'i hayatın ilk günlerinde ortaya çıkar, sözde erken başlangıç tanısı sepsis ve pnömoni ile karakterize edilmiştir. Menenjit ve sepsis ile geç başlayan enfeksiyonlar bebeklerde 1 hafta ila 3 ay arasında ortaya çıkar. Erken başlamış GBS hastalığı olan yeni doğanlar, genital sisteminde kolonize GBS olan annelerden, doğum sırasında organizmayı alırlar. Önlenmesi doğum sırasında antibiyotik profilaksi ilaç verilmesiyle sağlanabilir. GBS, hamile ve doğum sonrası kadın arasında, hafif idrar yolları enfeksiyonundan hayatı tehdit edici sepsis ve menenjite, klinik hastalığın değişimine neden olur. Yetişkin enfeksiyonları taşıyıcı (immunocompromised) hastalarda gözlenebilir. Önlem olarak hamile kadınların kolonizasyon için tarama stratejisinde, GBS'nin optimum belirlenmesi çok önemlidir. Prenatal taramaya dayalı GBS ile kolonize olmuş kadınlar doğum sırasında antibiyotik profilaksi için adaylardır. Ancak doğum sırasında bilinmeyen GBS kolonizasyon durumu olan kadınlardan doğmuş yeni doğanlar bir meydan okuma göstermiştir. GBS kolonizasyonu belirlenmesinin hızlı metodu, yayılan hastalık riski olan kolonize bebeklerin ek değerlendirme ve izlenmesi için tanımlanmasına yardım edebilir. Kültür metodu sınırlamalara sahiptir: en az 36 saat gerektirir ve doğum sırasında GBS kolonizasyonu için %69 ve %87 arasında bir tahmin değerine sahiptir. Antijen belirleme metodları genellikle düşük doğruluk değerleri gösterir. In-house GBS spesifik PCR tabanlı testler daha iyi duyarlılık göstermiştir fakat klinik laboratuvarlara uyarlanması kolay olmayan karmaşık prosedürler gerektirmektedir. Çoğu PCR testi yoğun çalışma veya duyarsız belirleme sistemlerinin ikisinden birinin kullanımına sahiptir. SPEED-OLIGO GROUP B STREPTOCOCCUS belirleme kitinde PCR-tabanlı metot ile daldırma şeriti birleştirilmiştir, klinik örneklerde S. agalactiae nın hızlı, yüksek duyarlılıkta ve spesifik olarak belirlenmesine olanak sağlar. Temin edilen PCR karışımı cfb geni fragman amplifikasyonları için spesifik oligo çifti içerir. Kit kolaylıkla kullanılacak şekilde tasarlanmıştır. PCR thermocycler kullanımına bağlı olarak amplifikasyon adımı 15 ila 75 dakika kadar bir zaman alır, oysa daldırma şeriti ile belirlemek için sadece 7-10 dakika gereklidir. PCR karışımının liyofilize sunumu kontaminasyonu önlemek için kullanım ve pipetleme prosedürlerini minimize eder. TESTİN PRENSİBİ: Testin prensibi spesifik Streptococcus group B gen fragmanlarının amplifikasyonuna dayanır ve Streptococcus group B enfeksiyonlarının hızlı tanısına olanak sağlar. Test, örnekte amplifikasyon inhibitörlerinin taşınmadığı durumların kontrolü için iç amplifikasyon kontrolü içermektedir ve doğru amplifikasyon oluşmaktadır. Kontrol, DNA fragmanı ve onun amplifikasyonu için spesifik oligo çiftinden oluşmaktadır. Teknik üç ana adıma bölünmüştür: DNA ekstraksiyonu, spesifik oligo çiftiyle amplifikasyonu ve çoğaltılmış ürünlerin belirlenmesi. Belirleme daldırma şeriti ile gerçekleştirilir. İki defa amplifikasyon yapıldığında, amplifikasyon kontrol ve spesifik test amplicon denatüre olur ve stripte ilerlemesine olanak sağlar. PCR fragmanları, altın partiküllerinin kolloidal süspansiyonu ile birleştirilmiş spesifik oligonükleotidler ile reaksiyon verir. Sonra PCR ürünleri ve kolloidal altın kompleksi spesifik problara (test çizgisi ve PCR amplifikasyon kontrol çizgisi) ulaşana kadar membrandan yukarı doğru ilerler, ikinci hibridizasyonun meydana geldiği yer. Altın probun tamamlayıcı oligonükleotidler ile hibridizasyonundan KİT ÖZELLİKLERİ: Kit DNA amplifikasyonu ve hibridizasyon prensiplerine dayanmaktadır. Kontaminasyon riskinden dolayı Tavsiyeler ve önlemler bölümünün dikkatle okunması önemlidir. PCR karışımı ve pozitif kontrol reaktifleri liyofilizedir. Kullanımdan önce kullanıma hazır forma getirilmeleri gerekmektedir (Reaktiflerin ön hazırlığına bakın). Geri kalan reaktifler kullanıma hazırdır. KİT İÇERİĞİ: 1 VIRCELL SGB PCR MIX: Liyofilize PCR tamponu, Cl 2 Mg, Streptococcus group B için spesifik primerler, dntp ler, Taq polimeraz ve amplifikasyonu için spesifik primerler ile birlikte PCR amplifikasyon kontrolü için DNA fragmanları içeren 5 şişe. 2 VIRCELL SGB POSITIVE CONTROL: Pozitif kontrol olarak kullanılan enfekte olmamış liyofilize DNA içeren 1 şişe. 3 VIRCELL NEGATIVE CONTROL: Negatif kontrol olarak kullanılan 200 µl deiyonize su içeren 1 şişe. 4 VIRCELL SGB STRIPS: Spesifik DNA belirlenmesi için 40 strip. 5 VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION: Triton X-100 içeren, PCR karışımını kullanıma hazırlamak için 1 ml sulu çözelti 1 şişe. 6 VIRCELL POSITIVE CONTROL RECONSTITUTION SOLUTION: Triton X-100 içeren, pozitif kontrolü kullanıma hazırlamak için 500 µl sulu çözelti 1 şişe. 7 VIRCELL SGB RUNNING SOLUTION: Proklin içeren hibridizasyon çözeltisinin 1 ml'sini içeren 2 şişe. 8 VIRCELL SAMPLE SOLUTION: 25 ml tamponlanmış çözelti. 2-8ºC de saklayın ve son kullanma tarihini kontrol edin. Gerekli materyal, temin edilmemiştir: Çubuklar ve uygun taşıma ortamı (Numune Toplama ve Kullanma'ya bakın) Thermocycler Mineral yağ (ısıtılmış kapağı olmayan thermocycler için) Hassas mikropipet ( µl) Aerosol bariyerli steril uçlar Tek kullanımlık eldivenler 55ºC±2ºC ısıtıcı blok 1.5 ml lik mikrosantrifüj tüpleri Mikrosantrifüj PCR odası (tavsiye edilen) Vorteks

2 2 SAKLAMA KOŞULLARI: 2-8ºC de saklayın. Kit reaktiflerini son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. Bu reaktifler kapalı ve 2-8ºC de saklandığında geçerlidir. VIRCELL PCR MIX ve VIRCELL POSITIVE CONTROL kullanıma hazırlandığında, -20ºC nin altında saklanmalıdır ve tekrarlayan dondurup çözme işleminden kaçınılmalıdır. AÇILDIĞI ZAMAN REAKTİFLERİN KARARLILIĞI: REAGENTREAKTİF VIRCELL PCR MIX ve VIRCELL POSITIVE CONTROL kullanıma hazırlandığında Diğer bileşenler KARARLILIK -20ºC nin altında saklayın ve son kullanma tarihine kadar kullanın 2-8ºC de saklayın ve son kullanma tarihine kadar kullanın. KARARLILIK VE REAKTİFLERİN KULLANIMI: Kit 2-8ºC de son kullanma tarihine kadar kararlılığını korur. VIRCELL PCR MIX ve VIRCELL POSITIVE CONTROL kullanıma hazırlandıktan sonra, -20ºC'nin altındaki sıcaklıkta son kullanma tarihine kadar kararlılığını korur. Mikrobiyal kontaminasyondan kaçınmak için reaktifleri aseptik koşullarda kullanın. Reaktifleri sadece test için gereken miktarda kullanın. Artan çözeltiyi şişeye geri koymayın. VIRCELL, S.L. kit içeriğindeki reaktiflerin hatalı kullanımına dair sorumluluk kabul etmemektedir. TAVSİYELER VE ÖNLEMLER: 1. Sadece laboratuvar içi tanıda kullanım içindir. Sadece profesyonel kullanım içindir. 2. Sadece kit bileşenlerini kullanın. VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION, VIRCELL POSITIVE CONTROL RECONSTITUTION SOLUTION ve VIRCELL NEGATIVE CONTROL farklı VIRCELL SPEED-OLIGO kitleri ile kullanılabilir. VIRCELL PCR MIX, VIRCELL POSITIVE CONTROL, VIRCELL STRIP ve VIRCELL RUNNING SOLUTION lotlar ve kitler arasında değişim yapmayın. 3. Aerosol bariyerli steril uçlar DNA ekstraksiyonu esnasında kontaminasyonu engellemek ve PCR performansı için zorunludur. 4. Numuneler bulaşıcı örneklerdeki gibi laboratuvar güvenlik prosedürleri uygulanarak kullanılmalıdır. Tüm çalışma alanlarını taze olarak hazırlanmış deiyonize veya distile suda %0.5 lik sodyum hipoklorit çözeltisi ile tamamen temizleyin ve dezenfekte edin. 5. Tüm örneklerin alındıktan sonraki en kısa aralıkta test edilmesi en doğru test sonuçlarının elde edilmesine yardımcı olacaktır. Numunenin yollanması sırasında saklama süresindeki değişimler değerlendirilmemiştir. 6. Numuneleri kullanırken koruyucu tek kullanımlık eldivenler, laboratuvar kıyafetleri ve göz koruyucu kullanın. Örnekler ile çalıştıktan sonra ellerinizi tamamen yıkayın. 7. Reaktif tüplerinden numune alırken reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçının. 8. Testi gerçekleştirirken üç farklı alan olması zorunludur: Amplifikasyon öncesi, Amplifikasyon ve Amplifikasyon sonrası veya Belirleme alanı. Laboratuvardaki iş akışı Amplifikasyon öncesi başlangıcından ve Amplifikasyon sonrası alana doğru hareket ederek tek yönlü biçimde ilerlemelidir. Herbir alanda eldiven giyilmeli ve herbir alandan ayrılırken eldiven atılmalıdır. A) Amplifikasyon öncesi alan: Sadece örneğin toplanması ve DNA ekstraksiyonu içindir. Yalnızca amplifikasyon öncesi faaliyetler için spesifik ekipmanlar belirlenmelidir (eldivenler, steril tüpler, bariyer uçlar, mikropipetler, mikrosantrifüj veya diğer gerekli ekipman) ve diğer prosedürler için kullanılmamalıdır veya diğer alanlara taşınmamalıdır. B) Amplifikasyon alanı: Bu alanda PCR gerçekleştirilir ve sadece PCR reaktifleri kullanılmalıdır. Amplifikasyon faaliyetleri için spesifik ekipmanlar belirlenmelidir (eldivenler, steril tüpler, bariyer uçlar, mikropipetler, mikrosantrifüj, thermocycler, katmanlı hava akış dolabı veya diğer gerekli ekipman) ve diğer prosedürler için kullanılmamalıdır veya diğer alanlara taşınmamalıdır. Amplifikasyon tamamlandıktan sonra, PCR tüpleri asla bu alanda açılmamalıdır. C) Amplifikasyon sonrası veya belirleme alanı: Belirleme bu alanda gerçekleştirilir. Isıtma bloğu, 1.5 ml lik mikrosantrifüj tüpleri mikropipet gereklidir. Amplifikasyon sonrası materyeller ve teçhizat her zaman amplifikasyon sonrası alanda durmalıdır. 9. Testin yüksek analitik duyarlılığından dolayı, kit reaktifleri veya amplifikasyon karışımlarının saflığını korumak için aşırı özen gösterilmelidir. Tüm reaktiflerin saflığı yakından takip edilmelidir. Şüpheli reaktifleri atın. 10. Bu ürün PCR testlerinin tekniklerinde eğitilmiş personel ile sınırlandırılmalıdır. 11. Kiti son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. 12. Kullanılmamış reaktifleri ve atığı uygulanabilir yönetmeliklere göre atın. 13. Bu kitin reaktifleri genetik materyal veya hayvan ve/veya insan orjinli maddeler içerebilir. Her ne kadar bu materyal bulaşıcı olmasa da potansiyel olarak bulaşıcı gibi kullanılmalıdır. Tüm materyal potansiyel olarak bulaşıcı gibi kullanılmalı ve atılmalıdır. Klinik atıkların yok edilmesi için yerel yönetmeliklere uyun. 14. Edinilen stripler PCR kontaminasyon riskinden kaçınmak için amplifikasyon öncesi alandan uzak bir yerde saklanmalıdır. Daha iyi bir koruma için edinilen striplerin kenarlarının kesilmesi tavsiye edilir. ÖRNEK TOPLAMA VE KULLANMA: Doğum öncesi tanı için, çubuklar alt vajina ve anorektal bölgeden alınmalı ve uygun taşıma ortamına yerleştirilmelidir. Amies veya Stuart ortamı kullanılabilir ama PCR inhibitörlerinin olmaması için dikkatle test edilmelidirler. Anal numuneler için, çubuk dikkatle anal sfinkterden yaklaşık olarak 2.5 cm içeri yerleştirilmeli ve sonra anal boşluğa temas için yavaşça döndürülür. Vajinal numuneler için, aşırı salgı veya akıntı silenerek yok edilir, çubuk ile vajinanın üçüncü derinliğindeki mukoza salgıları elde edilir. Vajinal ve anal numunelerin birleştirilmesi için, yukarıda tanımlandığı gibi çubuk önce vajinaya yerleştirilir ve sonra anüse yerleştirilir. Potansiyel olarak girişim yapan maddelerin veya zar kopması ile ilgili maddelerin (örneğin, mekonyum, amniyotik sıvı veya kan) bulunması durumunda gerekli bilgi laboratuvara verilmelidir. Yeni doğan kolonizasyon testi için numuneler ilk banyodan önce yüzeydeki bölgelerden elde edilir. Gırtlak, burun delikleri, dış işitme kanalları, anüs veya göbekten alınan örnekler çubuk ve taşıma sistemi kullanılarak toplanır. Kan ve serebrospinal sıvı örnekleri aseptik olarak ve dilüe edilmeden taşınır. Örnekler çevre sıcaklığında taşınır. Eğer test hemen gerçekleştirilmeyecekse 2-8ºC de saklayın. Eğer örnek 72 saatten fazla tutulacaksa -20 ila -80ºC arasında dondurun. REAKTİFLERİN İLK HAZIRLIĞI VIRCELL PCR MIX ve VIRCELL POSITIVE CONTROL dışındaki tüm reaktifler kullanıma hazır olarak temin edilmiştir. 1 VIRCELL PCR MIX. Herbir PCR mix 8 PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için yeterli reaktifi içerir. Kullanıma hazırlamak için sonraki adımları takip edin: - Herbir tübe 150 µl VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION ekleyin saniye vorteksleyerek karıştırın. PCR karışımının tamamen homojenize olduğundan emin olmalısınız. - Kullanıma hazırlamanın tamamlanması için oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. 2 VIRCELL POSITIVE CONTROL. Kullanıma hazırlamak için sonraki adımları takip edin:

3 3 - İlgili tüpü 5000 g de 5 saniye santrifüjleyin. - Herbir tübe 200 µl VIRCELL POSITIVE CONTROL RECONSTITUTION SOLUTION ekleyin saniye vorteksleyerek karıştırın. - Tüpü 5000 g de 5 saniye santrifüjleyin. - Kullanıma hazırlamanın tamamlanması için oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. Kullanıma hazırladıktan sonra VIRCELL PCR MIX 1 ve VIRCELL POSITIVE CONTROL 2 daha sonraki reaksiyonlarda kullanmak için - 20ºC nin altındaki sıcaklıkta saklanabilir. ANALİZ PROSEDÜRÜ: Her kitte işleme tabi tutulan örnek sayısı çalışılan strateji büyüklüğüne bağlı olarak değişkenlik gösterecektir. 40 STRİP ÇALIŞMA TEST PROSEDÜRÜ: POZİTİF KONTROL NEGATİF KONTROL ÖRNEK TOPLAM DNA ekstraksiyonu: (Amplifikasyon öncesi alanda gerçekleştirilir). DNA ekstraksiyonu için, çubuğu içeriğini elüe etmek için SAMPLE SOLUTION içine yerleştirin. Ondan sonra Streptococcus group B nin lizizi için örnek ısıtılır ve direkt olarak PCR karışımına eklenir. Bunun için aşağıdaki adımlar takip edilmelidir: ml SAMPLE SOLUTION ı 1.5 ml lik tüp içine pipetleyin. Örnek sayısı kadar tüp kullanın. nº örneği tüp kapağında tanımlayın. 2-Çubuğu sapından tutun, tübün kenarına yaklaştırın. Çubuğu parmaklarınızla 10 döndürün. Çubuğu çıkarın ve tüpü kapatın. Bu adımda kontaminasyonu önlemek için dikkatli olun dakika 95ºC de ısıtın. 1.5 ml lik tüpler veya su banyosu için kuru ısıtıcı blok kullanın dakika g de santrifüjleyin. Bu adım olası PCR inhibitör bileşenlerinin tekrar süspanse hale gelmesini engellemek için çok önemlidir. Bunun için santrifüjleme PCR reaksiyonunu hazırlamadan önce yapılmalıdır. Örneğin pipetlenmesi ile santrifüjleme arasındaki süre 2-3 dakikadan az olmalıdır. Ekstraksiyondan sonra PCR gerçekleştirilemeyeceği durumda, 100 µl süpernatant başka bir tübe aktarılmalıdır ve PCR gerçekleştirilene kadar -20ºC nin altındaki sıcaklıkta dondurulmalıdır. Bu prosedürü uygulayarak PCR inhibitör bileşenlerinin tekrar süspanse olmasını engelleyebiliriz. 5.-Herbir PCR tübüne derhal 10 µl süpernatant pipetleyin. 2.-PCR (Amplifikasyonun gerçekleştirildiği alan): PCR karışımı 1 liyofilizedir. Herbir şişe 8 reaksiyon için gerekli bileşenleri içerir. Analizlenecek örnek sayısı ve çalışılacak kontrol sayısına bağlı olarak bir veya daha fazla PCR karışımı tüpleri kullanıma hazırlanmalıdır ( reaktiflerin ön hazırlığı"na bakın). rack ta gerekli tüp sayısını ayırın: her örnek için bir tüp artı pozitif kontrol için bir tüp ve negatif kontrol için bir tüp. Artan PCR karışımı daha sonraki reaksiyonlarda kullanmak için - 20ºC nin altındaki sıcaklıkta dondurulabilir. Negatif kontrol verilen test için hazırlanan son örnek olmalıdır. - Her tübe kullanıma hazırlanan PCR karışımının 15 µl sini pipetleyin. - Herbir tübe örnek veya kontrolün 10 µl sini ekleyin. Kitte temin edilen negatif kontrol sudur. - Thermocycler a PCR tüplerini yerleştirin ve aşağıdaki programı uygulayın*. 1 döngü 92ºC 1 dakika 30 saniye 92ºC 20 saniye 35 döngü 55ºC 20 saniye 72ºC 20 saniye 1 döngü 72ºC 2 dakika 1 döngü 95ºC 1 dakika *(thermocycler üreticisi tarafından verilen talimatları izleyin). Pozitif kontrol 2 liyofilizedir. Gerekliyse kullanmadan önce kullanıma hazırlayın ( reaktiflerin ön hazırlığı"na bakın). Kullanıma hazırladıktan sonra, pozitif kontrol daha sonraki reaksiyonlarda kullanmak için -20ºC nin altındaki sıcaklıkta dondurulabilir ("reaktiflerin ön hazırlığı"na bakın). Tekniğin yüksek duyarlılığından dolayı ve kontaminasyondan kaçınmak için pozitif kontrol, PCR karışımı ve örnekler dağıtıldığında, PCR hazırlamanın sonunda kullanılmalıdır. PCR a başlamadan önce Pozitif kontrol ve PCR karışım tüplerinin ayrılmış alanda, pozitif kontrolün pipetlendiği amplifikasyon sonrası alandan ayrı saklanması tavsiye edilir. PCR ürünlerinin belirlenmesi daldırma çubuğuyla yapılır. Eğer hibridizasyon hemen gerçekleştirilmezse PCR tüpleri -20ºC nin altındaki sıcaklıkta dondurulabilir. Daha sonra hibridizasyonu oluşturmak için PCR son denatürasyon adımının bir daha gerçekleştirilmesi gereklidir. Adım 1 95ºC 1 dakika 3.-Strip belirlemesi: (Amplifikasyon sonrası alanda gerçekleştirilir). Strip hibridizasyonu gerçekleştirmeden önce ısıtıcı bloğun 55ºC de ön ısıtması gereklidir ml lik tübe* 35 µl VIRCELL RUNNING SOLUTION ekleyin ve 55ºC de 2 dakika inkübe edin. - Örneği 95ºC de 1 dakika denatüre edin ve hemen buza veya 4ºC ye soğutulmuş rack'a koyun. 95ºC lik denatürasyon adımından sonra örnekleri oda sıcaklığındaki rack ta bırakmayın. Soğutulmuş rack veya buzunuzun olmaması durumunda, 95 ºC de denatürasyon adımından sonra örneği soğutmadan pipetleyebilir ve hemen stribi yerleştirebilirsiniz. - 4ºC ye soğutulmuş denatüre PCR ürününün 5 μl sini ekleyin. Örnekler 1.5 ml lik tübe eklenmeden, 4ºC de 1 dakikadan fazla kalamaz. Eğer PCR programının son denatürasyon adımından sonra PCR ürünü 1.5 ml lik tübe hemen eklenmezse, 4ºC de buza veya eş soğuklukta rack a koymak için bu adımın (95ºC de 1 dakika) bir daha tekrarlanması gerekecektir. Eş zamanlı olarak birçok örneğin analizi durumunda, denatürasyon adımı ile strip belirlemesi arasında 1 dakikadan fazla zaman geçmemesine dikkat edin, 3 ila 5 örneklik gruplar için tavsiye edilir. Bu şekilde yanlış negatifin ortaya çıkmasından kaçınıyoruz. - - Hemen stribi doğru yönelimde (oklar örneğe doğru göstermektedir: plana bakın) yerleştirin ve 55ºC de 5 dakika inkübe edin.

4 4 - PCR amplifikasyon kontrol çizgisi: Kırmızı şeritin olmaması durumu örnekte amplifikasyon reaksiyonu ile girişim yapabilecek inhibitörlerin bulunduğunu gösterir. O takdirde numuneden alınan ikinci bir örnek veya yeni numune tekrar test edilmelidir. Şiddetli pozitif örneklerde örnekteki spesifik hedefin yüksek içeriğinden dolayı çizgi zayıf veya negatif olabilir ama son sonucu geçersiz kılmaz. - Test çizgisi: Bu pozisyondaki kırmızı şerit örnekte Streptococcus group B genetik materyali bulunduğunu gösterir. - Stribi çıkarın ve sonucu okuyun. *1.5 ml lik tüp ısıtıcı bloğu dolduracak şekilde uymalıdır. Sonuçların yorumu strip çıkarıldıktan sonra gerçekleştirilmelidir. Kurutma işaret yoğunluğundaki değişimlere neden olabilir ve negatif örneklerde bazı zeminler görülebilir. Edinilen stripler PCR kontaminasyon riskinden kaçınmak için amplifikasyon öncesi alandan uzak bir yerde saklanmalıdır. İÇ KALİTE KONTROL: İç kalite kontrol testine tabi olan herbir parti piyasaya çıkmadan önce, yüksek derecede kesin tanımlamalara uymaktadır. Herbir özel lot için son kalite kontrol sonuçları mevcuttur. KÜLTÜR NAKİL ORTAMININ VE NUMUNE TOPLAMA ÇUBUKLARININ GEÇERLİLİĞİ Çubuk numunelerinin test için laboratuvara nakilinde kullanılan Kültür Nakil Ortamının tüm yeni lotları testte kullanılabilecek nitelikte (ortam PCR'a karışan maddeleri içermemelidir) olduğunu garanti etmelidir (nitelik için protokol mevcuttur). NUMUNE İŞLEME KONTROLÜ Örnek işlemenin geçerlilik testi için, bir miktar mikroorganizma veya Vircell in (ref. MBC071) S. agalactiae saflaştırılmış DNA kontrolü onaylanmış Nakil Ortamı tübüne eklenmelidir ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edilmelidir. Ani olarak artan numune işlenmeli ve test edilmelidir. PCR ürün kontaminasyonunun kontrolü için Nükleik Asit İzolasyonu adımından başlayarak kitin herbir çalışmasında negatif kontrol kullanın. KULLANICILAR İÇİN SONUÇLARIN YORUMU VE GEÇERLİLİK PROTOKOLÜ: Gerçekleştirilen herbir test çalışmasına bir negatif kontrol her zaman dahil edilmelidir. Gerçekleştirilen herbir test çalışmasına bir pozitif kontrol dahil edilmelidir. Yeni bir kit açıldığında en az bir kez pozitif kontrol çalışılmalıdır. Pozitif kontrol reaktif hataları ve zorunlu prosedürün doğru çalışılmasının izlenmesi içindir. Negatif kontrol reaktiflerin veya çevresel kontaminasyonun izlenmesi içindir. Sonucu okumak için okuma kartında S ile gösterilen pozisyona stribi yerleştirin. Test 3 okuma alanı içerir: - Ürün kontrol çizgisi: Eğer test doğru olarak gerçekleştirildiyse her zaman pozitif ve okunaklı olmalıdır. Bu çizgi kolloidal altının doğru olarak çalıştığını gösterir, prob uygulanabilirliği yeterli ve çalışma tamponu uygun bir şekilde akmıştır. SINIRLAMALAR: 1.-Kit insan klinik örnekleriyle kullanım için tasarlanmıştır. 2.-Kit kullanıcısına paket insert ünü dikkatle okuması ve anlaması tavsiye edilmiştir. Güvenilir test sonuçları elde etmek için protokole katı bir şekilde bağlı kalınması gereklidir. Özellikle doğru örnek ve reaktif pipetleme, dikkatli kullanımla birlikte inkübasyon adımlarının zamanlama ve sıcaklıkları doğru sonuçlar için zorunludur. Bu özellikle test protokolünde tanımlanan atanmış alanlarda herbir test adımını gerçekleştirmek için önemlidir. 3.-Bu test enfeksiyonun yerini göstermez. Bu izolasyon yenilemesini kastetmemektedir. 4.- Mikroorganizmanın belirlenmesi numunede bulunan organizma sayısına bağlıdır ve numune toplama metodlarından, hasta faktörlerinden, enfeksiyon aşaması ve/veya türünden etkilenebilir. 5.-Herhangi bir tanı testinde, sonuçlar tüm klinik ve laboratuvar bulgular göz önüne alınarak yorumlanmalıdır. Kit sonuçları klinik değerlendirme ve diğer tanı prosedürleri ile birlikte kullanılabilir. 6.-Bu ürünün kullanımı sadece PCR tekniklerinde eğitilmiş personel ile sınırlandırılmalıdır. 7.-Test kalitatif sonuçlar sağlar. Pozitif sonuç büyüklüğü ve örnekteki mikroorganizma sayısı arasında bir korelasyon oluşturulamaz. 8.-Bu test insan klinik örnekleriyle kullanım için doğrulanmıştır. Bu test diğer örnek tipleriyle doğrulanmamıştır. 9.-Güvenilir sonuçlar yeterli numune toplanması, nakil, saklama ve prosedürlerin uygulanmasına bağlıdır. 10.-Performans özellikleri tüm genotipler için belirlenmemiştir. 11.-Test sadece seçilen probun genomik bölgelerinin limitleri içerisinde çalışır. Bakteriyel genomların yüksek değişkenliğinden dolayı bazı alt tiplerin belirlenememesi olasıdır. PCR oligolarında veya mikroorganizma DNA dizi problarındaki değişiklikler yanlış negatif sonuçlara neden olabilir. 12.-Negatif test sonucu hedef organizma düzeyinin testin belirleme limitinin altında olduğu durumda dışlanamaz. 13.-Pozitif test diğer patojenlerin bulunma olasılığını bertaraf etmez. 14.-Testin içerdiği iç kontrol tüm yanlış negatif test sonuçlarını ortadan kaldırmayacaktır.

5 5 Pozitif sonuç muhakkak yaşayan organizma bulunduğunu göstermez. Ancak GBS kolonizasyonu için muhtemeldir. Test tüm streptokoksik enfeksiyonlardan GBS taşıyıcılarını ayırmak için tasarlanmamıştır. Parti kodu PERFORMANS DUYARLILIK VE SPESİFİKLİK: Analitik Duyarlılık: Streptococcus group B saflaştırılmış DNA (gerçek zamanlı PCR ile miktarı belirlenmiştir) seri dilüsyonları negatif örneklerde yapılmıştır. İşleme tabi olmuş ve analizlenmişlerdir. Kit her reaksiyonda DNA nın 8 kopyasına kadar belirleyebilmiştir. Farklı miktarlarda S. agalactiae ile ıslatılan çubukların 15 kopyası işleme tabi tutulmuş ve analizlenmiştir. Ortalama 5 koloni ekilip büyütüldükten sonra, 250 veya daha fazla mikroorganizma içeren örneklerde kit %100 tekrarlanabilirlik ile belirleme yapabilmiştir. Kültürden 184 örnek analizlenmiş ve işleme tabi tutulmuştur. Sonuçlar aşağıdaki gibidir: Kültür Negatif Pozitif Toplam Negatif 120 3* 123 PCR Pozitif 11** Toplam * 3 koloni/palet ten az PCR pozitif koloni ** PCR ürünü dizi analizi yapılmış ve S. agalactiae olarak tanımlanmıştır Spesifiklik: Sağlıklı donörlerden alınan 50 örnek işleme tabi tutulmuş ve test edilmiştir. Pozitif reaksiyon belirlenmemiştir. TEST İÇİ KESİNLİK: 2 örnek (belirleme limitine yakın bir pozitif ve bir negatif) aynı operatör ile değiştirilmemiş koşullarda tekli testte 5 kez çoğaltılması gerçekleştirilmiştir. Tüm testlerde aynı sonuçlar gözlenmiştir. TESTLER ARASI KESİNLİK: İki örnek (belirleme limitine yakın bir pozitif ve bir negatif) 2 farklı operatör tarafından ardışık 3 günde ayrı ayrı çoğaltılmıştır. Tüm testlerde aynı sonuçlar gözlenmiştir. ÇAPRAZ REAKTİVİTE VE GİRİŞİMLER: Aşağıdaki mikroorganizmaların ani artışı olan örnekler ile test kontrol edilmiştir (Aspergillus fumigatus, Brucella abortus, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Steptococcus pyogenes group A, Streptococcus group F, Streptococcus dysagalactiae group C, Streptococcus constellatus). Yanlış pozitif sonuç gözlenmemiştir. ETİKETLERDE KULLANILAN SEMBOLLER: 8ºC 2ºC Laboratuvar içi tanı medikal aygıt Son kullanım tarihi 2-8ºC de saklayın. KAYNAKÇA: Katalog numarası Kullanım talimatlarına başvurun <X> µl de kullanıma hazırlayın Monoline test için okuma kartı Yorumlama kartı Ürün Kontrol Çizgisi PCR Amplifikasyon Kontrol Çizgisi Test Çizgisi Örnek Pozitif Örnek Negatif Örnek Geçersiz Test 1. Bergeron, M. G., D. Ke, C. Menard, F. J. Picard, M. Gagnon, M. Bernier, M. Ouellette, P. H. Roy, S. Marcoux, and W. D. Fraser Rapid detection of group B streptococci in pregnant women at delivery. N Engl J Med 343: Davies, H. D., M. A. Miller, S. Faro, D. Gregson, S. C. Kehl, and J. A. Jordan Multicenter study of a rapid molecular-based assay for the diagnosis of group B Streptococcus colonization in pregnant women. Clin Infect Dis 39: Honest, H., S. Sharma, and K. S. Khan Rapid tests for group B Streptococcus colonization in laboring women: a systematic review. Pediatrics 117: Ke, D., C. Menard, F. J. Picard, M. Boissinot, M. Ouellette, P. H. Roy, and M. G. Bergeron Development of conventional and real-time PCR assays for the rapid detection of group B streptococci. Clin Chem 46: Natarajan, G., Y. R. Johnson, F. Zhang, K. M. Chen, and M. J. Worsham Real-time polymerase chain reaction for the rapid detection of group B streptococcal colonization in neonates. Pediatrics 118: Rallu, F., P. Barriga, C. Scrivo, V. Martel-Laferriere, and C. Laferriere Sensitivities of antigen detection and PCR assays greatly increased compared to that of the standard culture method for screening for group B streptococcus carriage in pregnant women. J Clin Microbiol 44: Schuchat, A Epidemiology of group B streptococcal disease in the United States: shifting paradigms. Clin Microbiol Rev 11: Sorularınız için lütfen temasa geçin: customerservice@vircell.com x <X> teste yeterli içerik REVİZYON TARİHİ: Ocak-09