Moleküler Yöntemlerin Mikrobiyolojide Uygulanması (Dr. Neval Yurttutan Uyar)

Transkript

1 Moleküler Yöntemlerin Mikrobiyolojide Uygulanması (Dr. Neval Yurttutan Uyar) Biyoteknolojide 1990 ların ikinci yarısının sonları ve 2000 lerin başlarındaki büyük gelişmeler, şimdi enfeksiyöz hastalıkların tanısında uygulanan modern tekniklerin gelişmesi ve belirgin ölçüde hassaslaştırılması ile sonuçlanmıştır. Bu teknikler moleküler biyolojinin önemli malzemeleridir ve dünya genelinde hastalıkların tanısının konulması, antimikrobiyal tedavinin yönlendirilmesi ve hastane epidemiyolojisi ve enfeksiyon kontrolü için klinik laboratuarlarda düzenli olarak kullanılırlar (Pfaller, 2001; Wolk, Raoult, 2004). Moleküler tanısal yöntemler, geleneksel yöntemler kullanarak bulunması ve belirlenmesi zor veya imkansız olan enfeksiyöz ajanların tanımlanmasında halen en değerlisidir. Benzer şekilde modern seroloji, akım sitometrisi ve elektron mikroskobi ve kütle spektrometri gibi güçlü araçlar ile birleştirildiğinde moleküler teknikler medikal uygulamada sık karşılaşılan patojenlerle birlikte, birçok yeni ortaya çıkan veya tekrar ortaya çıkan patojenlerin de hızlı (aynı gün) ve doğru olarak belirlenmesinin sağlanması becerimizi belirgin olarak artırmıştır (Alvarez-Barrientos, 2000; Houpikian, 2002; Mezzasoma, 2002; Hazelton, 2003; Cockerill, 2004; Raoult, 2004). Enfeksiyöz hastalıkların moleküler tanısı çoğunlukla nükleik asit odaklıdır ve mikroorganizma ve klinik materyalden nükleik asitin izole edilmesi gerekir ve sınırlayıcı endonükleaz enziminin, jel elektroforez ve nükleik asit hibridizasyon tekniklerinin kullanımına dayanır. Giderek artan sayıda yeni nükleik asit amplifikasyon tekniği klinik materyallere uygulanmaktadır (Wolk, 2001). Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RCR) ile birlikte nükleik asit amplifikasyonu ve amplifiye edilmiş ürünün floresan saptanması şeklinde kapalı sistemli yeni platformlar giderek artan spektrumlu enfeksiyöz hastalıkların esnek, hızlı ve doğru şekilde tanımlanmasını sağlıyorlar (Cockerill, 2004). DNA sekans analizi yüksek oranda otomatize olmuştur ve kültürde üretilebilen ve üretilemeyen çok sayıda mikroorganizmanın tanımlanması için referans ve tanı laboratuarlarında kullanılabilir (Aman, 1994; Wilson, 1994; Clarridge, 2004). Moleküler dizi teknolojisinin geliştirilmesi ile mikroorganizmaların tanımlanmasındaki anlamlı potansiyeli ortaya çıkmaktadır (Boriskin, 2004; Stöver, 2004; Zhou, 2004). Moleküler tekniklerin daha geniş bir alanda kullanılmasında ki konulardan biri maliyettir (Pfaller, 2001). Enfeksiyöz hastalıkların tanısı alanında, hasta sonuçlarının iyileşmesi ve antimikrobiyallerin maliyetinin ve hastanede kalış süresinin azalması laboratuar maliyetlerinin artmasına ağır basabilir. Rakamlarla belirtmek zor olsa da, moleküler yöntemlerin tanısal uygulamalarının etkilerinin pozitif ve etkin maliyetli olduğunu gösteren örnekler mevcuttur (Shrestha, 2003a; Clarridge, 2004; Diekema, 2004; Scheuerman, 2004). Bulaşıcı hastalık durumunda, hasta ve sağlık çalışanlarının korunmasında enfeksiyon kontrol ölçümlerinin geliştirilmesi maliyetleri kabul edilebilir hale getirebilir (Cockerill, 2004). Moleküler epidemiyoloji enfeksiyonun nazokomial yayılımının kontrolü ve belirlenmesine belirgin bir katkı sağlayabilir, bu da nazokomial enfeksiyon hızlarının azalmasını ve tedaviye dirençli mikroorganizmalar için kullanılan pahali antimikrobiyallere gereksinimin azalmasını sağlayabilir (Hacek, 1999; Pfaller, 2001). Moleküler tanısal yöntemler açıkça daha pratik ve maliyet-etkin hale gelmektedir ve hastalara faydası daha iyi anlaşılmaktadır; ancak, bu hala eğitimli personel gerektiren pahalı bir teknolojidir ve ücret iadesi konuları sorunludur (Kant, 1995; Ross, 1999). Bu konular ışığında, enfeksiyöz hastalıkların tanısında moleküler tanıya olan kurumsal ihtiyaç, ilgili klinik ve laboratuar hizmetleri tarafından eleştirel olarak değerlendirilmelidir (Pfaller, 2001; Cockerill, 2004). Birçok durumda test isteğinin

2 dikkatle gözden geçirilmesi ve referans laboratuarının ihtiyatlı kullanımı en uygun seçenektir. Enfeksiyöz hastalıkların tanısında kullanılan modern teknikler I. Doğrudan Belirleme A. Moleküler belirleme 1. Nükleik asit probları a. sıvı faz hibridizasyonu b. floresan in-situ hibridizasyon (FISH) 2. Hedef amplifikasyonu 3. Sinyal amplifikasyonu B. DNA mikro-array C. Flow sitometri D. Elektron mikroskobi (EM) II. Modern Seroloji A. Antijen mikroarray B. Sentetik antijenler III. Moleküler Teşhis ve Antimikrobiyal Direnç Testleri A. Nükleik asit sekanslama B. DNA mikroarray 1. genler, türler ve ırk belirlenmesi 2. direnç genleri 3. gen mutasyonu 4. gen ekspresyon analizi C. Moleküler epidemiyolojik tiplendirme D. Kitle spektrometri Prob ile doğrudan tanı hızlı konur ve hedef amplifikasyonu ile ilişkili kontaminasyon problemleri ortaya çıkmaz ve bir çok amplifikasyon prosedürüne göre daha az inhibisyon görülür. Standart prob hibridizasyonun bir limitasyonu tespit için 10 4 veya daha fazla hedef nükleik asit kopyasına ihtiyaç olmasıdır. Bazı uygulamalar için elverişli, hızlı, kültüre gerek olmayan bir yöntem bu sensitivite seviyesinde değerlidir ve sinyal amplifikasyon stratejileri 500/µL kadar düşük sayıda gen kopyasının tespit edilmesini sağlayabilir (Shah, 1994; Murphy, 1999). Ancak, en karmaşık sinyal amplifikasyon biçimleri bile, mikrolitrede 50 den az gen kopyasını tespit edebilen hedef amplifikasyonu temelli yöntemlerin çözümleyici sensitivitesini henüz sağlamamaktadır (Erali, 1999). Ticari prob sistemleri non-izotopik işaretleme ile birlikte solüsyon bazlı hibridizasyon kullanıyorlar. Sinyal amplifikasyonu kullanmayanlar ilk olarak incelenecektir. Kemiluminesan tespitle birlikte akridinyum-ester işaretli PACE2 ürünleri (Gen-Probe) belkide en yaygın kullanılanıdır. Gen prob ölçümleri radyoaktif olmayan prob işaretleme kullanırlar, bu da uzun raf ömrü sağlar. Ek olarak, biçimlendirme görece olarak daha kullanıcı dostudur ve küçük veya büyük sayıda numune için kullanılabilir. Nükleik asit prob hibridizasyon ölçümleri, mevcut örnekleme yöntemlerinin ileri amplifikasyon gerekmeksizin ölçümlerde tespit edilebileceği yeterli konsantrasyonda patojenin varolduğu enfeksiyöz işlemleri hedefler Nükleik asit amplifikasyonunun, belirlenebilir seviyelerin daha altındaki mevcut spesifik hedefleri seçici olarak amplifiye ederek, tanısal prob hibridizasyonunun en önemli limitasyonunun üstesinden gelme potansiyeli vardır. PCR (Roche Molecular Systems) geliştirilmiş ilk amplifikasyon tekniğidir ve halen en çok araştırılan ve uygulanan yöntemdir. Daha yeni hedef

3 amplifikasyon teknolojileri, nükleik asit dizi bazlı amplifikasyon (NASBA, BioMerieux), dizi yerdeğiştirme amplifikasyonu (SDA, Becton Dickinson) ve transkripsiyon aracılı amplifikasyon (TMA, Gen-Probe); bunlar şu anda mevcut ek sistemlerin başlıcalarıdır (Wolk, 2001). Bu teknolojiyi genişletmek ve geliştimek çabasıyla geleneksel PCR ın birçok modifikasyonu geliştirilmiştir (Wolk, 2001). Multipleks PCR birçok primer düzenekte kullanılır ve tek bir reaksiyon karışımında birçok organizmanın veya birçok hedefin teşhisinde kullanılabilir. Nested- PCR PCR ın duyarlılığını artırmak için sekans amplifikasyon adımlarını kullanır. Reverse transkriptaz PCR (RT_PCR) bir RNA hedefinden tamamlayıcı DNA (cdna) oluşturmak için reverse transkriptaz aktiviteli bir enzim kullanarak RNA nın belirlenmesinde kullanılır. Nicel PCR bir internal standar kullanır ve hasta numunesinde mevcut mikrop miktarının değerlendirilmesinde kullanılır. PCR teknolojisinde yakınlarda ki belki de en önemli gelişme tek bir kapalı sistemde floresan amplikon tespiti ile eşzamanlı yapılan hızlı döngülü nükleik asit amplifikasyonunun kullanılmasıdır (saatler ve günler süren geleneksel PCR a göre bu PCR 30 dakikada yapılır), bu ayrıca gerçek zamanlı PCR olarak da bilinir (Wolk, 2001; Klinik ve Laboratuar Standartları Enstitüsü, 2003; Cockerill, 2004). Gerçek zamanlı PCR amplikonun çapraz kontaminasyon riskini en aza indirir ve çok esnek, hızlı ve duyarlı PCR platformlarıdır). Gerçek zamanlı PCR protokolleri, daha özgül hibridizasyon ve ürün sağlamak için spesifik internal floresan problar ile eriyen kıvrım belirleyicilerini (solüsyonda dizilerin yarısının ayrıldığı sekans bağımlı sıcaklık) eşleştirir (Wolk, 2001). Değişik internal prob biçimi mevcuttur, hibridizasyon probları, floresan rezonans enerji transfer (FRET) probları, Taqman (Applied Biosystems) kimya kullanan hidroliz probları ve moleküler işaret probları gibi (Klinik ve Laboratuar Standartları Enstitüsü, 2003; Wolk, 2001). Gerçek zamanlı PCR çok duyarlı nicel bir tespit ölçümü olarak uygulanabilir veya bir numunede patojene özgü nükleik asit miktarının tayininde kullanılabilir. Özellikle gerçek zamanlı nicel PCR ölçümleri sıklıkla geleneksel PCR ölümlerinden daha geniş lineer sınırlar sağlar (Wolk, 2001). Birçok yüksek otomatize gerçek zamanlı PCR aracı şimdi mevcuttur. Bu araçlar değişik dalga boylarında floresan yayımı belirleyecek optik sistemleri içermektedir ve PCR reaksiyonlarının hızını ve multiplex PCR becerisini artırma potansiyelleri vardır (Wolk, 2001). Mevcut sistemler şunlardır; LightCycler malzemesi (Roche), ABI Prism (Applied Biosystems), SmartCycler malzemesi (Cepherid) ve icycler intrument (Bio-Rad) (Wolk, 2001; Cockerill, 2004 Ticari PCR ürün gelişimi esas olarak spesifik viral enfeksiyonların ve M.tuberculosis bileşiğinin ve cinsel yolla bulaşan hastalıkların başlıca aracılarını (HCV, HBV, HIV, CMV, EBV) teşhis ve ölçüm sistemleri üzerine odaklanmıştır (C. trachomatis ve N. gonorrhoea Gerçek zamanlı PCR ın uyumluluğu seçilmiş gittikçe artan yeni ve tekrar artan patojenler (Cockerill, 2004; Raoult, 2004) gibi, ilaca dirençli patojenler MRSA ve VRE dahil, (Cockerill, 2004; Diekema, 2004; Sakail, 2004; Warren, 2004) ticari sistemler tarafından tespit edilebilen patojen sayısını artırmıştır. Ticari ürünler kullanıcının kabul edebilirliği, kontaminasyondan korunma, reaktif ve durumun standardizasyonu ve otomasyon potansiyeli dikkate alınarak dizayn edilirler. İki veya daha fazla amplifikasyon yöntemini kıyaslayan bazı çalışmalar bildirilmiştir (Griffith, 1997; Scheprtiuk, 1997; Stary, 1998; Brown, 1999; Van Dyck, 2001; Klein, 2004; Koenig, 2004) ve genel olarak yeni yöntemlerin hiçbiri (NASBA; TMA; SDA) PCR dan daha yüksek duyarlılık birldirmemiştir. Sistemler arasında tercih yaparken, mevcut ürünler içerisinden, bireysel laboratuarın çalışma uygulamalarına ve maliyete göre karar verilir. Muhtemelen bir laboratuar için en uygunu ihtiyacı olan testlerin tümünü sağlayan tek bir amplifikasyon platformu seçmektir. Bazı üreticilerin gerçek zamanlı PCR cihazının analize spesifik reaktif (ASR) kullanımını destekleme becerisi, birçok klinik mikrobiyoloji laboratuarı için yeni ölçümlerin kolayca uyarlanabilmesini sağlamaktadır (Cockerill, 2004). Şu anda, bazı viral enfeksiyonların klinik tanı ve tedavisinin yapılması ve kan ürünlerinin güvenliğinden emin olunması açısından moleküler yöntemlerin kabul edilmiş bir rolü vardır (Roth, 1999; Smith, 2004). Ayrıca bu moleküler yöntemler Laboratory Response Network aracılığı ile potansiyel biyoterörizm ajanlarının tespit edilmesi ve (yeni) ortaya çıkan ve tekrar-ortaya çıkan enfeksiyöz hastalıkların tanısı için çok önemli kabul edilmektedir (Cockerill, 2004). Birçok

4 bakteriyal patojen için moleküler yöntemlerin kültür veya immünolojik yöntemlere göre değerlendirme rolünü kıyaslamak güçtür (Hall, 2004a; Hayden, 2004; Ieven, 2004). Birçok çalışmada amplifikasyon temelli ölçümlerle pozitif çıkan fakat kültür veya immünolojik yöntemlerle negatif sonuç veren bazı numuneler vardır. Bu testlerin sonuçlarının amplifikasyonla yanlış-pozitif veya kültür/antijen yakalama ile yanlış-negatif olarak sınıflandırılmasının amplifikasyon temelli ölçümlerin duyarlılık ve özgüllüğünün hesaplanması amacı için ve laboratuar tanısına bu farklı yaklaşımların görece özelliklerinin kıyaslanması için önemli derecede karmaşa oluşturucu etkileri vardır. Birçok araştırmacı bu problemi tutarsızlık analizi tekniği kullanarak dile getirmiştir. Tutarsızlık analizinin değeri ve limitasyonları halen tartışmalıdır; savunucuları bunu mevcut en uygun yaklaşım olarak kabul etmektedirler (Schachter, 1998), ancak karşı çıkanlar bu işlemin amplifikasyon temelli ölçümler lehine sonuç verme eğiliminde olduğuna inanmaktadırlar (Hadgu, 1996; Miller, 1998). Bu endişelere ek olarak diğer yazarlar ifade edilen birçok yayınlanmış çalışmanın niteliklerinin epey değişken olduğunu bildirmişlerdir (Koumans, 1998). Kesin bir referans test yerine (latent class analizi) genişletilmiş bir gold standart veya bir bağımsız testler dizisi kullanımı, bu ikilemin olası çözümü olarak önerilmiştir (Ieven, 2004). İdeal olarak, yeni ortaya çıkmış nükleik asit amplifikasyon test (NAAT) sensitif bir kültür ve en az bir onaylanmış bir PCR veya farklı bir gen veya aynı genin farklı bir sekansını hedefleyen diğer bir NAAT ölçümü ile kıyaslanarak onaylanmalıdır (Ieven, 2004). Gerçek Zamanlı PCR Avantajları 1. Hızlı (30-40 dakika) 2. Kapalı sistem eşzamanlı amplifikasyon ve tespit kontaminasyon riskini sınırlar 3. Nicel 4. Floresan tespit (jel temelli değil) 5. Esnek 6. Geliştirilmiş standardizasyon Kitlerin bulunabilirliği Analize özgü reaktifler (ASR ler Moleküler biyoloji teknikleri ile HCV nin tespiti mümkün olmuştur; bu nedenle tanısında PCR ve diğer moleküler yöntemlerin önemli bir rolü olması şaşırtıcı değildir. Seroloji önceki HCV enfeksiyonunu tespit etmeye izin verir fakat şu anki enfeksiyonla ve virüsü spontan temizlemiş hastaların ayırıcı tanısına izin vermez. HCV bir RNA virüsü olduğundan cdna ya reverse transkripsiyon PCR ile amplifikasyon için önemli bir hazırlık basamağıdır. Reverse transkriptaz ve DNA polimeraz kullanan değişik evde hazırlanan PCR ölçümleri tanımlanmıştır (Fiebelkorn, 2004). Roche Diagnostics reverse transkripsiyon ve amplifikasyonun Thermus thermophilus dan alınana Tth adlı aynı enzim tarafından yapıldığı bir ürün pazarlamaktadır (Amplicor RT-PCR), ve bu işlem otomatik yapılır (COBAS Amplicor System)(Poljak, 1997; Phaller, 2004a). Moleküler yöntemlerle virüsün tespit edilmesi o anda enfeksiyon olduğunu gösterir ve HCV enfeksiyonunun klinik tanısında ve tedaviye cevabın izlenmesinde kabul edilen bir rolü vardır (Fiebelkorn, 2004). HIV enfeksiyonunun tanısında virüse özel antikorlar serolojik testlerle tespit edilir ve HIV in spontan temizlenmesi mümkün olmadığından bu antikorların açık bir şekilde tespit edilmesi genellikle şu anki enfeksiyonun kanıtı olarak kabul edilir. Yenidoğanda antikorların tespit edilmesi anne antikorlarının transplasental transferini yansıtıyor olabilir ve sadece serolojik yöntemler kullanarak tanının onaylanması için uzun bir takip dönemi (18 aya kadar) gerekebilir. HIV kanda hem RNA virüs hem de periferik kan mononükleer hücreleri genleri ile birleşmiş proviral DNA virüsü olarak bulunur. Proviral DNA yı tespit etmek için reverse transkriptaza ihtiyaç yoktur ancak serbest HIV RNA sının tespit ve ölçümü için gereklidir. Amplicor Monitor ölçümünün (Roche) bdna (Bayer) veya NASBA (BioMerieux) temelli HIV tespitine göre daha duyarlı olduğu bildirilmiştir (Bootman, 1999) ve özel RNA ekstraksiyon protokolleri ile 20 HIV RNA kopyası/mililitre kadar düşük seviyelerin bile tespiti yapılabilir (Fisher, 1999, Murphy, 2000; Pfaller, 2004a).

5 Transplant hastalarında CMV enfeksiyonu tanısında PCR geniş olarak çalışılmıştır ve tespit için ticari sistemler PCR (Long, 1998; Razonable, 2002; Pang, 2003; Smith, 2004), HCA (Mazulli, 1999) ve NASBA (Aono, 1998; Diaz-Mitoma, 2003) şimdi mevcuttur. CMV hastalığının tanısındaki problemler HCV ve HIV enfeksiyonlarından farklıdır, burada virüs çoğu yerde bulunur ve bu nedenle kanda herhangi bir yöntemle varlığının gösterilmesi klinik hastalığı göstermez (Razonable, 2002). CMV tanısındaki güçlük, CMV enfeksiyonunun klinik olarak belirgin olmadığı kişilere göre hastalığı olan veya yakalanmaya eğilimli immünkompromize hastalarda yaklaşımın farklı olmasıdır (Patel, 1995; Pellegrin, 2000; Razonable, 2002). Bu sebeplerle, CMV PCR ile ölçümü ilk araştırılan virüslerden biridir (Gerna, 1994; Boeckh, 1998; Caliendo, 2000; Diaz-Mitoma, 2003; Pang, 2003). CMV mesajcı RNA nın (NASBA kullanarak) tespit edilmesi, viral genomun aktif transkripsiyonunu gösterir, ayrıca CMV hastalığının tanısında ve tedaviye cevapta kullanılmıştır fakat PCR veya HCA ile viral yük tespiti kadar kullanışlı değildir (Patel, 1995; Blok, 2000; Pelligrin, 2000; Diaz-Mitoma, 2003). Moleküler yöntemlerle virüsün ölçümü HBV, HCV, HIV, CMV ve EBV enfeksiyonlarının tanı ve tedavisinde anlamlı olarak kabul edilmektedir (Kimura, 1999; Murphy, 2000; Jabs, 2001; Diaz-Mitoma, 2003; Maurmann, 2003; Pang, 2003; Fiebelkorn, 2004). Geleneksel PCR ölçümüne ek olarak bdna, HCA, TMA ve gerçek zamanlı PCR yaklaşımları kullanılmıştır. HCV viral yükünün ölçülmesi hastalık prognozu ve tedavinin izlenmesi için önemlidir (Fiebelkorn, 2004). En yaygın çalışılmış yöntemler RT-PCR (Roche Monitor) ve bdna (Bayer) ölçümleridir (Hawkins, 1997; Jacob, 1997; Lu, 1998; Fiebelkom, 2004); ancak NASBA (BioMerieux), TMA (Bayer) ve yeni gerçek zamanlı PCR da tanımlanmıştır (Lunel, 1999; Martel, 1999; Kleiber, 2000; Sawyer, 2000). Değişik sistemlerin varlığı ve gelişmenin hızı, değişik sistemlerin zorluğunın kıyaslanması için sınırlı ifadeler sağlar. Dikkate alınması gereken önemli konular; mevcut sistemlerin dinamik aralığı (yöntemin en doğru ve üretken olduğu viral genom konsantrasyonlarının aralığı), farklı HCV viral genotipleri tespit ve ölçmedeki becerilerinde farklar ve kalibrasyon için uygun standartlar geliştirmede güçlüklerdir. Şu anda College of American Pathologists in (CAP) nükleik asit amplifikasyon beceri test programına katılan laboratuarların %80 i HCV RNA için Roche Amplicor HCV kitleri kullanarak reverse-transkriptaz PCR (RT_PCR) uygulamaktadırlar (Fiebelkorn, 2004). HIV viral yükünün ölçümü hastalık prognozunu ve antiretroviral tedavi sonuçlarını değerlendirmede kullanışlı bir biyolojik markerdir (Ledergerber, 1999). HIV RNA ölçümü ile ilişkili teknik yaklaşım ve problemler genellikle daha önce HCV için belirtilenlerle benzerdir (Garcia-Lerma, 1998; Erali, 1999; Triques, 1999; Murphy, 2000). RT-PCR (Roche), NASBA (BioMerieux/Organon Teknika) ve bdna nın (Bayer) çok merkezli kıyaslaması bu üç ölçümün yüksek derecede korele olduğunu göstermiştir; ancak hastadan hastaya ölçümlerde RNA miktarı farklı olduğundan bu çalışmanın yazarları hasta takibinde RT-PCR, NASBA ve bdna yöntemlerinin değiştirilerek birlikte kullanılmamasını önermişlerdir (Murphy, 2000). Ölçüm performansına ek olarak, viral yük ölçümü seçerken kullanılan numune ve gerekli hacim, tespit sınırı, yürütme kolaylığı, malzeme için gerekli çalışma alanı ve reaktif kullanma maliyetlerinin dikkate alınmasını önermişlerdir (Murphy, 2000). Nükleik asit amplifikasyonu, özellikle gerçek zamanlı PCR, değişik diğer viral enfeksiyonların tanısında kullanılmıştır, bunlar; enterovirus (Rotbart, 1994; Pozo, 1998; Landry, 2003), HSV (Tremblay, 1997; Smith, 2004), JC virüsü (Garcia de Viedma, 1999), parvovirüs (Jordan, 1998), VZV (Scheuermann, 2004), variola virüs (Cockerill, 2004), Batı Nil virüsü (Cockerill, 2004) ve SARS koronavirüs (Cockerill, 2004; Drosten, 2004) ve diğerleri Amplifikasyon temelli yöntemler, spesifik antiviral ajanların sorumlu olduğu enfeksiyonların sayısı artmaya devam ettikçe ve santral sinir sistemi enfeksiyonu gibi özellikle önemli durumlarda gittikçe viral enfeksiyonların tanı ve tedavisinde önemli hale gelmektedir (Read, 1997; Cockerill, 2004; Smith, 2004). Bazı viral enfeksiyonların benzer klinik durumlarında, tanısal verimi artırmak ve günlük laboratuar işlemlerini daha etkin hale getirmek için multiplex PCR ın mantıklı ve etkin kullanılabileceği birçok düzenleme vardır (Elnifro, 2000; Gruteke, 2004). Multiplex PCR ın en büyük uygulama alanı viral menenjit,

6 ensefalit, meningoensefalit (Elnifro, 2000) ve çocuklarda akut solunum yolu enfeksiyonu tanısının konmasıdır (Gruteke, 2004). Bu düzenlemelere uygulandığında multiplex PCR ın tanı verimini artırdığı, uygunsuz antimikrobiyal tedavi kullanımını azalttığı, daha patojene özgü tedaviyi artırdığı, enfeksiyon kontrol önlemlerinin uygulanmasını kolaylaştırdığı ve hasta sonucuna katkı sağladığı gösterilmiştir (Elnifro, 2000; Cockerill, 2004; Gruteke, 2004; Smith, 2004). M. tuberculosis kompleksinin (MTBC) solunum yolu ve solunum yolu dışı numunelerde tespiti için şimdi birçok ticari amplifikasyon ölçümü mevcuttur. Bunlar PCR (Roche), TMA (Gen-Probe) ve SDA (Becton Dickinson). Genel olarak bu ölçümlerin duyarlılığı smear asit-fast basil (AFB) pozitif olan numunelerde mükemmeldir (%95-100), fakat smear-negatif numunelerde daha düşüktür (%50-90)(Ieven, 1997; Piersimoni, 1998; 2002; Pfyffer, 1999; Tortoli, 1999, Watterson, 2000; woods, 2001; Dowdy, 2003; Hall, 2004a; Kivihya-Ndugga, 2004; Sloutsky, 2004; Thwaiters, 2004). In-house PCR yöntemleri, hedef amplifikasyonu ve numune hazırlanması için değişik işlemler kullanırlar, laboratuarların kör numunelerde MTBG yi doğru olarak tespit etme becerilerinin çok farklı olduğunu gösteren Noordhoek in (1994) de belirttiği gibi standardizasyon yokluğu ile bu durum ilişkilidir. Klinik laboratuarlar için kötü standardizasyon problemi reaktif kalitesinin merkezi kontrolü ve standart uygulama prosedürleri ile ticari ölçümlerin kullanılmasıyla azalmış gibidir. Genel olarak MTBG tespitinde nükleik asit amplifikasyon ölçümleri AFB smear dan daha duyarlıdır fakat kültürden daha az duyarlıdır (Cloud, 2004; Kivhya-Ndugga, 2004; Thwaites, 2004). Şu anda iki ticari sistem, Amplicor MTB ([PCR], Roche) ve Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test (AMTDT [TMA], Gen-Probe), AFB smear-pozitif solunum yolu numunelerinde uygulanmak üzere Food and Drug Administration (FDA) tarafından onaylanmıştır. Ek olarak, AMTDT nin smear-negatif sonunum yolu numunelerinde kullanımı onaylanmıştır. Bazı çalışmalar iki veya daha fazla amplifikasyon temelli yöntemi kıyaslamıştır (Piersimoni, 1998, 2002; Brown, 1999; Tortoli, 1999, Cleary, 2003) ancak hiçbiri tüm sistemlerin görece değerlerini kesin biçimde tartışmaya izin verecek ölçüde yeterince kapsamlı değildir. Genel olarak, tüm ticari sistemlerin duyarlılık ve özgüllüğü kıyaslanabilir (Watterson, 2000). Bu sistemlerin tümünde test numuneleri antitüberküloz tedavi başlangıcından sonra elde edilirse (Sloutsky, 2004; Thwaites, 2004) ve serebrospinal sıvı (CSF) gibi solunum yolu olmayan bir numuneye uygulanırsa (Woods, 2001; Piersimoni, 2002; Cloud, 2004; Thwaites, 2004) duyarlılık kültüre göre daha düşüktür. Amplifikasyonun non spesifik inhibisyonunun tüm sistemleri az yada çok etkilediği gösterilmiştir (Carpentier, 1995; Lumb, 1999, Piersimoni, 2002). SDA-bazlı BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex Direct Detection Assay (Becton Dickinson) bir avantajı inhibitör maddelerin varlığını tespit etmek üzere dizayn edilmiş internal amplifikasyon kontrolü içermesidir, bu da yanlışnegatif test sonuçlarının bildirilmesini en aza indirir (Piersimoni, 2002). ASR kullanan gerçek zamanlı PCR ın klinik numuneleri test etmede geleneksel PCR (Amplicor, Roche) ve TMA yla (AMTD) duyarlılık ve özgüllük açısından kıyaslanabilir olduğu gösterilmiştir (Lachnik, 2002; Cleary, 2003; Lemaitre Tüberküloz tanısında kültür merkezi rolünü korumaktadır çünkü mevcut amplifikasyon ölçümleri tüm kültür pozitif numuneleri tespit edememektedir ve duyarlılık testi için organizmanın izole edilmesi gereklidir (ve epidemiyolojik tiplendirme için, eğer endike ise). Şu anda amplifikasyon testleri AFB smear ın yerini alamaz çünkü AFB smear tedaviye başlangıç cevabını değerlendirmede ve hastaların enfektivite seviyelerini belirlemede kullanılır (smear pozitif hastalar smear negatiflere göre çok daha fazla enfeksiyözdürler). Amplifikasyon temelli yöntemlerin yorumlanması konusunda yeterli kaynak yoktur. Ek olarak amplifikasyon yöntemleri smear ın yaptığından (AFB var mı?) çok daha spesifik bir soruyu cevaplar (MTBC var mı?) ve böyle yapması spesifik bir enfeksiyöz hastalık ipuçlarını kaçırmasına neden olabilir. Halen amplifikasyon

7 ölçümlerinin tüberküloz ve diğer mycobacterial enfeksiyonların tanısındaki rolü mikroskopi ve kültür için tamamlayıcı olarak durmaktadır (Watterson, 2000). Cinsel yolla bulaşan hastalıkların tanısı amplifikasyon ölçümlerinin gelişimi ve uygulanması için önemli bir alan olmuştur. N. gonorrhoea uygun bir geleneksel agar ortamında hızla çoğalır ve kültürü optimal koşullarda yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir (Koumans, 1998). N. gonorrhoea kültürde zor gelişir ve uygun toplama, taşıma ve uygun kültür koşulları çok önemlidir ve her yerde kolayca sağlanamayabilir. C. trachomatis kültürü, doku kültür yardımcılarına ihtiyaç duyan çaba gerektiren bir kültürdür, bu nedenle Chlamydia antijeninin tespiti için kültür dışı yöntemler çok kullanılır. Genital numunelerde C. trachomatis tespiti için hemen hemen tüm amplifikasyon yöntemleri uygulanmıştır (Schepetiuk, 1997; Stary, 1998; Morre, 1998; Pasternack, 1999; Vincelette, 1999; Van Dyck, 2001; Hall, 2004a; Koenig, 2004). Genel olarak yayınlanmış değerlendirmeler amplifikasyon temelli yöntemlerin hücre kültürü veya immünolojik yöntemlere göre daha özgül ve daha duyarlı olduğunu göstermektedir (Schepetiuk, 1997; Stary, 1998; Wylie, 1998; Vincelette, 1999; Van Dyck, 2001; Hall, 2004a). otomatik COBAS Amplicor CT/NG PCR testinin (Roche) çokmerkezli bir çalışmasında duyarlılık ve özgüllük numune tipine göre değişmiştir (Vincelette, 1999). Erkek üretra sürüntüleri bu testte %100 duyarlılık ve %98,5 özgüllük göstermiştir; endoservikal sürüntüler için duyarlılık %96,5 ve özgüllük %99,4 ve idrar için duyarlılık %94,4 95,1 ve özgüllük %99,8 100 arasında idi. Amplifikasyon ölçümlerinin idrar numunelerindeki performansı C. trachomatis enfeksiyonunun takibini kolaylaştırabilir, daha invazif örnekleme yöntemlerine göre idrar numunesi elde edilmesi daha kolaydır. C. trachomatis için değişik amplifikasyon yöntemlerinin birçok kıyaslaması bildirilmiştir (Schepetiuk, 1997; Stary, 1998; Pasternack, 1999; Van Dyck, 2001; Koenig, 2004). Van Dyck ve arkadaşları (2001) 396 endoservikal sürüntü numunesinde (50 kültür-pozitif) C. trachomatis tespiti için PCR (Roche), SDA (Becton Dickinson) ve LCR ın (Abbott) performansını kıyaslamışlar ve aynı sırayla %98,0, %94,0 ve %90,0, %98,0 ve %100, %98,6 duyarlılık ve özgüllük bildirmişlerdir. SDA ve gerçek zamanlı PCR ı karşılaştıran son yapılan bir çalışma genel birbirine uygunluğu %91,2 olarak bildirmiştir (Koenig, 2004). Dikkat çekici olarak, MOTA (aselerasyon hariç bir yöntem) skoru 2000 ile 9999 arasında (şüpheli) olan SDA sonuçları üretilebilir değildi ve PCR ve kültüre göre yanlış pozitiflik verme eğilimindeydi. Mevcut veriler C. trachomatis tespiti için, sonucu şüpheli olan numunelere tekrar veya konfirmasyon testi yapılması gerektiği uyarısıyla birlikte, değişik sistemlerden kıyaslanabilir performans beklenebiliceğini belirtmektedir (örn. SDA MOTA skoru 2000 ile 9999 arasında). PCR (Roche), SDA (Becton Dickinson) veya TMB (Gen-Probe) ile C. trachomatis ve N. gonorrhoea tespiti için tek bir numune kullanılabilir (Vincelette, 1999; Koenig, 2004; Van Dyck, 2001). Servikal numunelerde N. gonorrhoea tespitinde bu üç yöntemin de kültürden daha duyarlı olduğu ( %88,9-95,2 ye göre %69,8 aynı sırayla) bildirilmiştir (Kehl, 1998; Van Dyck, 2001). SDA da belirtildiği gibi düşük MOTA skorlu ( ) numunelerde C. trachomatis le birlikte N. gonorrhoea için yanlış-pozitif sonuçlar bildirilmiştir ve konfirmasyon testi yapılması gerekir (Koenig, 2004). Neisseria subflava varlığında Amplicor PCR (Roche) ile yanlış-pozitif sonuç potansiyeli ile bu bulgular uyuşmaktadır ve bu teknolojilerin iyileştirilmeleri gereğini gösterir (Farrell, 1999a