ÖZET Yüksek Lisans Tezi GLUKOZ TAYİNİ İÇİN NİKEL OKSİT MODİFİYE KARBON PASTA ELEKTROTLARIN HAZIRLANMASI Ceren ERDEM Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ GLUKOZ TAYİNİ İÇİN NİKEL OKSİT MODİFİYE KARBON PASTA ELEKTROTLARIN HAZIRLANMASI CEREN ERDEM KİMYA ANABİLİM DALI ANKARA 2012 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi GLUKOZ TAYİNİ İÇİN NİKEL OKSİT MODİFİYE KARBON PASTA ELEKTROTLARIN HAZIRLANMASI Ceren ERDEM Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI Bu tez çalışmasında, glukozun amperometrik tayini için nikel oksit (NiO) nanopartikülü temelli amperometrik enzim elektrotlar hazırlandı. Bu amaçla, glukoz oksidaz (GOx) enzimi, NiO nanopartikülleri ile hazırlanmış karbon pasta içerisine tutuklama yöntemi ile hapsedildi. Glukoz tayini için uygun olduğu belirlenen NiO modifiye karbon pasta enzim elektrotların (NiO/GOx/CPE) optimizasyon çalışmaları yapıldı. Glukoz tayini, enzimatik olarak oluşan hidrojen peroksitin (H 2 O 2 ) +0,40 V da Ag/AgCl e karşı oksijene (O 2 ) yükseltgenmesine dayanılarak yapıldı. NiO/GOx/CPE için en uygun tampon 0,1 M ph 7,0 fosfat tamponu ve optimum çalışma sıcaklığı 40 o C olarak belirlendi. Enzim elektrodun doğrusal çalışma aralığının 1, mm 9, mm ve 1,3 mm 15 mm, gözlenebilme sınırının 1, mm, cevap süresinin 20 s ve raf ömrünün yaklaşık 101 gün olduğu gözlendi. Serumda bulunabilecek ve NiO/GOx/CPE nin glukoza karşı cevabına girişim yapabilecek çeşitli elektroaktif türlerin etkisi incelendi ve önemli bir etkilerinin olmadığı belirlendi. Serum numunelerinde glukoz analizi NiO/GOx/CPE u kullanılarak yapıldı. Elde edilen bulgular spektrofotometrik yöntemle bulunan sonuçlarla karşılaştırıldı ve sonuçların birbiri ile uyumlu olduğu görüldü. Haziran 2012, 84 sayfa Anahtar Kelimeler: Amperometri, Biyosensör, Glukoz, Glukoz oksidaz, Enzim elektrot, Nikel oksit nanopartikülleri, Karbon pasta elektrot i

3 ABSTRACT Master Thesis THE PREPARATION OF CARBON PASTE ELECTRODES WITH MODIFIED NICKEL OXIDE FOR DETECTION OF GLUCOSE Ceren ERDEM Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI In this thesis study, nickel oxide (NiO) nanoparticles-based amperometric enzyme electrodes were prepared for amperometric detection of glucose. For this purpose, glucose oxidase (GOx) was entrapped in carbon paste which are prepared with NiO nanoparticles by entrapment method. The optimization studies of NiO carbon paste enzyme elektrodes (NiO/GOx/CPE) that was appropriate for determination of glucose were realised. The determination of glucose was performed via monitoring oxidation current of enzymatically prodeced H 2 O 2 at V vs. Ag/AgCl. For NiO/GOx/CPE, the optimum buffer as 0.1 M ph 7.0 phosphate buffer solution and the optimum working temperature as 40 o C were determinated. It was observed the respectively linear working range of enzyme electrode as 1, mm 9, mm and 1,3 mm 15 mm, detection limit as 1, mm, response time as 20 s and storage stability as about 101 days. The effects of several electroactive species that present in serum samples and interference the response of NiO/GOx/CPE to glucose were investigated and it was found that there is no significant effect. The detection of glucose in serum samples was practised by NiO/GOx/CPE. The observed verities were compared with results that are found by spectrophotometric method and good correlation was obtained between those results. June 2012, 84 pages Key Words: Amperometry, Biosensor, Glucose, Glucose oxidase, Enzyme electrode, NiO nanoparticles, Carbon paste electrode ii

4 TEŞEKKÜR Tez çalışmam ve eğitimim boyunca desteğini ve ilgisini esirgemeyen, değerli görüşlerini benimle paylaşan bana her konuda öncülük eden danışman hocam Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI ya, Çalışmalarımı gerçekleştirebilmem için bana laboratuvarını açan, bilgisini paylaşan değerli hocam Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. Esma KILIÇ a, Bu tezde en az benim kadar emeği olan, büyük bir sabırla bana tüm bildiklerini öğreten, çalışmamın her aşamasında destek olan, bana hem ablalık hem de hocalık yapan Dumlupınar Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyesi Sayın Yard. Doç. Dr. Derya KOYUNCU ZEYBEK e ve değerli eşi sevgili hocam Dumlupınar Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyesi Sayın Yard. Doç. Dr. Bülent ZEYBEK e, Çalışmalarım boyunca aynı laboratuvarı paylaştığım sevgili çalışma arkadaşım Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü öğretim elemanı Araş. Gör. Gözde AYDOĞDU ya, Hayatım boyunca gösterdikleri maddi manevi desteklerinden ötürü AİLEME sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ceren ERDEM Ankara, Haziran 2012 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ... xii 1. GİRİŞ Nanopartikül Modifiye Glukoz Biyosensörleri ile İlgili Kaynak Araştırması KURAMSAL TEMELLER Biyosensörler Amperometrik enzim elektrotlar Nanoteknoloji Nanomateryal temelli amperometrik enzim elektrotlar Karbon pasta elektrotlar İdeal biyosensörün sahip olması gereken özellikler Enzimler Enzimlerin özellikleri Aktif bölge Seçicilik Katalitik etki Kofaktörler Aktivasyon ve inhibisyon Enzimatik reaksiyonların hızını etkileyen faktörler Sıcaklık Ortam ph sı Substrat derişimi İmmobilize enzimler Enzim immobilizasyon teknikleri Glukoz oksidaz enziminin özellikleri Glukoz Tayinin Önemi iv

6 3. MATERYAL ve YÖNTEM Kullanılan Cihazlar Elektrokimyasal Hücre ve Kullanılan Elektrotlar Kullanılan Kimyasallar Oksijen gazı Argon gazı Kullanılan enzim Diğer kimyasallar Serum Numunesi Kullanılan Çözeltiler Fosfat tamponu TRIS tamponu Enzim çözeltileri Glukoz çözeltisi Hidrojen peroksit çözeltisi Glutaraldehit çözeltisi Girişim çalışmalarında kullanılan çözeltiler NiO Nanopartikül ile Modifiye Edilmiş ve Modifiye Edilmemiş Karbon Pasta Elektrotların Hazırlanması NiO Nanopartikül ile modifiye edilmiş ve modifiye edilmemiş karbon pasta elektrotların H 2 O 2 ye duyarlığı NiO ile Modifiye Edilmiş Enzimsiz Karbon Pasta Elektrodun Çalışma Potansiyelinin Belirlenmesi Glukoz Tayini İçin Karbon Pasta Enzim Elektrotların Hazırlanması Glukoz tayini için hazırlanan enzim elektrotların glukoza duyarlığı NiO Nanopartikül Modifiye Karbon Pasta Enzim Elektrotların Optimum Çalışma Koşullarının ve Performans Faktörlerinin Belirlenmesi Tampon cinsinin etkisi Tampon derişiminin etkisi ph nın etkisi NiO nanopartikül miktarının belirlenmesi Enzim miktarının belirlenmesi Sıcaklığın etkisi v

7 3.9.7 Cevap süresinin belirlenmesi Glukoz derişiminin etkisi Girişim yapan türlerin NiO/GOx/CPE nin cevabı üzerine etkisi Tekrar kullanılabilirlik ve tekrar üretilebilirlik NiO/GOx/CPE nin raf ömrü NiO/GOx/CPE ile serumda glukoz tayini ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Glukoz Tayini için Karbon Pasta Elektrot Enzimsiz Karbon Pasta Elektrotlar CPE ve NiO/CPE nin hidrojen peroksite duyarlığı Çalışma potansiyelinin etkisi Karbon Pasta Enzim Elektrotlar GOx/CPE ve NiO/GOx/CPE nin glukoza duyarlığı NiO/GOx/CPE nin Optimum Çalışma Koşulları ve Performans Faktörleri Tampon cinsinin etkisi Tampon derişiminin etkisi ph nın etkisi NiO nanopartikül miktarının belirlenmesi Enzim miktarının belirlenmesi Sıcaklığın etkisi Cevap süresinin belirlenmesi Glukoz derişiminin etkisi Girişim yapan türlerin NiO/GOx/CPE nin cevabı üzerine etkisi Tekrar kullanılabilirlik ve tekrar üretilebilirlik NiO/GOx/CPE nin raf ömrü NiO/GOx/CPE ile serumda glukoz tayini SONUÇLAR KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ vi

8 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ µa mikroamper µm mikromolar µmol mikromol µl mikrolitre Ag AgCl Au BSA BSS CdS CHIT CPE dl DNA ES FAD FADH 2 Fe 3 O 4 GA GCE Gümüş Gümüş klorür Altın Sığır serum albümin Bağıl standart sapma Kadmiyum sülfür Kitosan Karbon pasta elektrot desilitre Deoksiribonükleik asit Enzim-substrat kompleksi Flavin adenin dinükleotit İndirgenmiş flavin adenin dinüklotit Demir (II, III) oksit Glutaraldehit Camsı karbon elektrot vii

9 GOx GOx (ind) GOx (yük) H 2 O 2 H 3 PO 4 HCl HPLC Ir ISFET ITO Li 2 CO 3 M M mg M (ind) ml mm mmol mv M (yük) MWCNT Glukoz oksidaz İndirgenmiş glukoz oksidaz Yükseltgenmiş glukoz oksidaz Hidrojen peroksit Fosforik asit Hidroklorik asit Yüksek performanslı sıvı kromotografisi İridyum İyon seçici alan etki transistörleri İndiyum kalay oksit Lityum karbonat Molar Medyatör miligram İndirgenmiş medyatör mililitre milimolar milimol milivolt Yükseltgenmiş medyatör Çok duvarlı karbon nanotüp viii

10 NaOH NiO na nm O 2 PANI ph Pt RNA s SCE TRIS U UV-VIS V ZnO Sodyum hidroksit Nikel oksit nanoamper nanometre Oksijen Polianilin Hidrojen iyonu derişiminin eksi logaritması Platin Ribonükleik asit Saniye Doygun kalomel elektrot Tris(hidroksimetil)aminometan Enzim ünitesi Ultraviyole-görünür spektroskopi Volt Çinko oksit ix

11 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Biyosensörün şematik gösterimi Şekil 2.2 Farklı nesillerdeki enzim elektrotların şematik gösterimi (M (yük) ve M (ind) yükseltgenmiş ve indirgenmiş medyatör, GOx (yük) ve GOx (ind) yükseltgenmiş ve indirgenmiş glukoz oksidaz) Şekil 2.3 Glutaraldehitin kimyasal formülü Şekil 2.4 Glukozun mutarotasyonu Şekil 3.1 IVIUMSTAT elektrokimyasal analiz cihazı ve BAS marka 5 girişli elektrokimyasal hücre standı Şekil 4.1 Glukoz tayini için hazırlanan enzim elektrodun çalışma prensibi (GOx (yük) ve GOx (ind) enzimin yükseltgenmiş ve indirgenmiş hallerini göstermektedir) Şekil 4.2.a. NiO ile modifiye edilmiş karbon pasta elektrodun hidrojen peroksite cevabı, b. NiO ile modifiye edilmemiş karbon pasta elektrodun hidrojen peroksite cevabı (0,1 M ph 7,0 fosfat tamponu, +0,4 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.3.a. Enzimsiz NiO/CPE nin Ag/AgCl e karşı +0,70 V da hidrojen peroksite cevabı, b. Enzimsiz NiO/CPE nin Ag/AgCl e karşı +0,40 V da hidrojen peroksite cevabı (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, oda sıcaklığı) Şekil 4.4.a.GOx/CPE nin glukoza cevabı, b. GOx/NiO/CPE nin glukoza cevabı (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.5 NiO/GOx/CPE nin glukoza cevabına tampon cinsinin etkisi a. 0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, b. 0,10 M ph 7,0 TRIS tamponu (+0,40 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.6 NiO/GOx/CPE nin glukoza cevabına tampon derişiminin etkisi (ph 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.7 NiO/GOx/CPE nin glukoza cevabına ph nın etkisi (0,10 M fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.8 NiO/GOx/CPE nin glukoza cevabına nanopartikül miktarının etkisi (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.9 NiO/GOx/CPE nin glukoza cevabına enzim miktarının etkisi (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.10 NiO/GOx/CPE nin glukoza cevabına sıcaklığın etkisi (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V) x

12 Şekil 4.11 NiO/GOx/CPE nin glukoza cevap süresinin belirlenmesi ( : 1, M glukoz, : 1, M glukoz, 0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.12 NiO/GOx/CPE nin glukoza cevabına glukoz derişiminin etkisi (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.13 NiO/GOx/CPE ile farklı glukoz derişim aralığında elde edilen kalibrasyon grafikleri (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.14 NiO/GOx/CPE nin ömrü (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.15 Kan serumunda glukoz tayini için yöntemlerin uyumluluğu xi

13 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1.1 Nanopartikül modifiyeli glukoz biyosensörlerinin karşılaştırılması... 8 Çizelge 2.1 Biyosensörlerde kullanılan analitler, biyolojik tanı materyalleri, çeviriciler ve bu çeviricilerin avantajları ile dezavantajları Çizelge 3.1 Glukoz oksidazın, IUPAC kodu, elde edildiği kaynak ve temin edildiği firma Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan diğer kimyasalların isimleri, temin edildikleri firmalar, saflık dereceleri ve katalog numaraları Çizelge 3.3 Girişim yapan türlerin hücre içindeki toplam derişimleri Çizelge 4.1 Girişim yapan türlerin enzim elektrodun duyarlığına etkisi (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) Çizelge 4.2 NiO/GOx/CPE kullanılarak kan numunelerinde tayin edilen glukoz derişimi (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) Çizelge 4.3 Literatürde bulunan bazı glukoz biyosensörlerinin, serum örneklerindeki glukoz tayini için geliştirdikleri yöntemin spektrofotmetrik yöntem ile uyumluluğu Çizelge 4.4 NiO/GOx/CPE nin elektrot bileşimi, optimum çalışma koşulları ve performans faktörleri xii

14 1. GİRİŞ Biyosensörler, tayin edilecek moleküle duyarlı biyolojik tanı materyallerini içeren ve bir çevirici yardımı ile biyolojik tanı materyali ve analit arasındaki etkileşim sonucu oluşan biyokimyasal sinyalleri ölçülebilir elektrik sinyallerine dönüştüren, küçük, analitik cihazlardır. Günümüzde biyosensörler özellikle klinik ve çevresel analizlerde, gıda ve ilaç sektöründe, ziraat ve biyoloji gibi alanlarda kullanılmaktadır (Zhang vd. 2000). Amperometri, sabit bir potansiyelde indirgenen ya da yükseltgenen bazı elektroaktif türlerin akımlarının ölçülmesi esasına dayanır. Genelde iki veya üç elektrotlu amperometrik bir hücre sistemi oluşturulur. Çalışma elektrodu olarak çoğunlukla metal veya karbondan yapılan elektrot gövdeleri kullanılır. Referans elektrot, çalışma elektroduna uygulanan potansiyele karşı sabit bir potansiyel sağlar. Amperometrik biyosensörler, en verimli ve en çok kullanılan biyosensör çeşitlerinden biridir. Bu biyosensörler kullanılarak elektrokimyasal hücrede 10-8 M dan daha düşük derişimlere sahip analitlerin tayini yapılabilir (Dzyadevych vd. 2008). Nanoteknoloji, maddelerin atomik ya da moleküler boyutta üretilerek çeşitli alanlarda kullanılmasına olanak verir. Biyosensörler, nanoteknolojinin en geniş kullanıldığı alanlardan biridir. Nanomateryallerin kullanımı, biyosensörlerde yeni sinyal iletim teknolojilerinin tanımlanmasını sağlar (Jianrong vd. 2004). Yarı iletken polimerler, metaller ve metal oksit nanopartikülleri gibi yapılar yeni biyosensörlerin geliştirilmesinde kullanılan nanomateryallerdendir. Özellikle metal ve metal oksit nanopartiküller geniş yüzey alanı, elektronik özellikleri, güçlü adsorplama yetenekleri, mekanik, katalitik etkileri ve kimyasal dayanımları sayesinde biyosensörlerin duyarlıklarını ve kararlılıklarını arttırmayı başarırlar (Luo vd. 2005, Siangproh vd. 2011). Son yıllarda nikel oksit (NiO) nanopartiküllerinin birçok alanda kullanılmasına rağmen biyosensörlerde kullanımı oldukça nadirdir. Fakat NiO nanopartikülleri; kimyasal kararlılığı, yüksek izoelektrik noktası (10,7), hızlı elektron transferi gibi birçok avantajından ötürü biyosensör uygulamaları için gelecek vaat etmektedir (Li vd. 2008). 1

15 Elektrot materyali olarak çoğunlukla karbon nanotüpler, gümüş, altın, platin, indiyum kalay oksit, camsı karbon ve karbon pasta elektrotlar kullanılmaktadır (Luong vd. 2008). Karbon nanotüpler ve metal nanoyapılar sahip oldukları birçok avantaja rağmen oldukça pahalı ve çalışılması zor malzemelerdir. Karbon pasta elektrotlar ise düşük maliyetli, kolay ve hızlı hazırlanabilir olduklarından biyosensör çalışmalarında kullanım kolaylığı sağlar (Santos vd. 2007). Glukoz, gelişmiş canlı organizmaların yaşamı için en önemli karbohidratlardan biridir. Hücrelerin enerji kaynağı olmasının yanı sıra proteinlerin üretiminde ve lipid metabolizmasında kullanılan 6 karbonlu bir şekerdir. Kandaki glukoz miktarı insülin ve glukagon hormonları ile belli değerlerde tutulur. Sağlıklı bir insanın kanındaki glukoz derişimi 4,4-6,6 mm olmalıdır (Li vd. 2009). Özellikle insülin hormonu tarafından baskılanan glukoz, bu hormonun yeterli miktarda üretilmediği durumlarda olması gereken derişimin üstüne çıkar. Glukozun kandaki derişiminin yüksek olması günümüzde sıkça karşılaşılan bir hastalık olan diyabete yol açar. Diyabetli hastalarda görme bozuklukları, sinir hasarı, kalp yetmezliği, yaraların geç iyileşmesi gibi rahatsızlıklar gözlenebilir. Bu bozukluk, halk sağlığını yakından ilgilendirdiği ve ileri dönemlerinde organlarda kalıcı hasarlara hatta ölüme yol açabildiği için kan glukozu sürekli olarak takip edilmelidir (Comba vd. 2010a). Kromatografik ve spektrofotometrik yöntemlerle kandaki glukoz tayini mümkün olsa da, glukoza duyarlı biyosensörler, özellikle diyabetli hastaların kendi glukoz ölçümlerini doğru, güvenilir ve hızlı yapabilmeleri için kolaylık sağlar (Cash ve Clark 2010). Günümüze kadar glukozun tayini için birçok yöntem geliştirilmiştir. Bunlardan ilki Clark ve Lyons tarafından geliştirilen amperometrik glukoz biyosensörüdür ve literatürde tanımlanan ilk enzim elektrot olma özelliğini taşır. Bu biyosensör, glukozun oksijen (O 2 ) varlığında glukoz oksidaz (GOx) tarafından glukonik asite yükseltgenmesi ile elektrokimyasal hücre içinde derişimi azalan O 2 nin tayini esasına dayanır (D Orazio 2003). Glukoz tayini için fluorimetrik (Danielson vd. 1999, Sanz vd. 2002) ve lüminesans (Chang vd. 2010) gibi optik yöntemler de geliştirilmiştir. 2

16 Bu tez çalışmasında, klinik açıdan, çevre ve gıda endüstrisi açısından tayini oldukça önemli olan glukoz derişiminin amperometrik olarak belirlenmesi için NiO nanopartikül modifiye karbon pasta enzim elektrot geliştirilmesi düşünüldü. Bu amaçla, NiO nanopartikülleri grafit tozu ile karıştırıldı ve karbon pasta matriks içerisine glukoz oksidaz enzimi immobilize edildi. Glukoz oksidaz enzimi (GOx), moleküler oksijen (O 2 ) varlığında, aşağıdaki reaksiyona göre glukozun glukonik asite dönüşümünü katalizler (Sun vd. 2009): β - D - Glukoz + GOx(FAD) β - D - Glukonolakton + GOx(FADH 2) GOx(FADH ) + O GOx(FAD) + H O Glukoz oksidaz enzimi FAD (flavin adenin dinükleotit) koenzimine gereksinim duyar. FAD elektron akseptörü olarak davranır ve glukozu yükseltger. Daha sonra moleküler oksijeni indirgeyerek hidrojen perokside dönüştürür, kendisi de tekrar okside haline döner. Amperometrik glukoz tayini, enzimatik reaksiyon sonucu oluşan hidrojen peroksidin (H 2 O 2 ) sabit potansiyelde yükseltgenmesi sonucunda oluşan anodik akımın ölçülmesine dayanılarak yapılmaktadır (Sun vd. 2009): H O O + 2H + 2e Glukoz miktarı, oluşan hidrojen peroksitle orantılı olduğu için ölçülen anodik akımdan glukoz derişimi bulunur. Bu çalışmada glukoz tayini için yeni bir enzim elektrodun hazırlanmasının yanı sıra, bu elektrodun performans faktörleri ve en uygun çalışma koşulları da incelendi. Hazırlanan enzim elektrodun cevabına serumda bulunabilecek ve bozucu etki gösterebilecek bazı 3

17 elektroaktif türlerin etkisi incelendi ve glukoz tayini için geliştirilen enzim elektrodun serum numunelerinde kullanılabilirliği test edildi. 1.1 Nanopartikül Modifiye Glukoz Biyosensörleri ile İlgili Kaynak Araştırması Glukoz tayini için HPLC, kapiler elektroforez, gaz-sıvı kromotografisi gibi birçok yöntem kullanılmaktadır (Benvenuto vd. 2008). Buna rağmen glukoz tayini için geliştirilen biyosensörler; küçük, taşınabilir, hızlı ve pratik oldukları için gün geçtikçe yaygınlaşmaktadır (Li vd. 2009). Bu tez çalışmasında nanopartiküllerden yararlanılarak enzim elektrot geliştirilmesi amaçlandığı için kaynak araştırması da nanopartikül modifiye glukoz biyosensörleri ile sınırlandırılmıştır. Glukoz tayini için geliştirilen nanopartikül modifiye enzim elektrotlar çoğunlukla elektrokimyasal ve optik ölçümlere dayanır. Optik biyosensörlerde genellikle floresans/fosforesans ve lüminesans/kemilüminesans gibi ölçüm tekniklerinden yararlanılır. Glukozun elektrokimyasal yöntemler ile tayininde ise genellikle amperometrik ve voltametrik ölçüm üzerine temelli biyosensörler üretilmektedir. Özellikle amperometrik ölçümler glukoz tayini için en yaygın kullanılan tekniklerin başında gelmektedir. Glukoz biyosensörlerinde çoğunlukla iletken veya yarı iletken metal ve metal oksit nanopartiküller ile en az iki nanoyapıdan oluşan nanokompozitler kullanılmaktadır: Metal nanopartiküller ile ilgili çalışmalar Comba vd. (2010b) tarafından yapılan bir çalışmada, öncelikle, demir nanopartikülleri ve GOx enzimi, mineral yağ ile karıştırılmış ve sonra içerisine grafit tozu eklenip tekrar karıştırılarak bir pasta elde edilmiştir. Hazırlanan karışım karbon pasta elektrot gövdesine doldurulmuş ve Ag/AgCl e karşı -0,10 V potansiyelde glukoz tayini yapılmıştır. 4

18 Shen vd. (2007) çalışmasında iridyum (Ir) nanopartikülü içeren iletken karbon mürekkebi kullanmıştır. Bu amaçla, Ir nanopartikülleri grafit tozu ile karıştırılmış ve karışım fosfat tamponu içinde çözülen polietilenimin ve hidroksietil çözeltisi ile muamele edilmiştir. GOx enzimi glutaraldehit kullanılarak Ir-karbon çalışma elektrodu içerisinde bulunan polietilenimin ile kovalent olarak bağlanmıştır. Hazırlanan enzim elektrot Ag/AgCl e karşı +0,20 V potansiyelde glukoz tayini için kullanılmıştır. Huang vd. (2005) hazırladığı enzim elektrotta kadmiyum sülfür (CdS) nanopartikülleri kullanmışlardır. GOx enzim çözeltisi CdS nanopartikülleri ile karıştırılmış ve karışım bir mikro şırınga yardımı ile pirolitik karbon disk elektrot yüzeyine yayılmıştır. Hazırlanan enzim elektrot ile dönüşümlü voltametri yöntemi kullanılarak glukoz tayini yapılmıştır. Haghighi vd. (2011) tarafından çok duvarlı karbon nanotüplerin (MWCNT) yüzeyi altın (Au) nanopartikülleri ile kaplanmıştır. Oluşan MWCNT-Au yapısını ve kitosan ile çapraz bağlanmış glukoz oksidaz enzimi bir camsı karbon elektrot yüzeyine modifiye edilerek elektrokemilüminesans temelli glukoz elektrodu geliştirilmiştir. Sun vd. (2009) tarafından yapılan bir çalışmada ise, yarı iletken kadmiyum sülfür (CdS) nanokristalleri ile modifiye edilmiş platin elektrot üzerine glukoz oksidaz enzimi immobilize edilmiştir. Mor ötesi ışın altında enzim ve CdS nanokristalleri arasındaki fotokimyasal etkileşimin ölçülmesi için fotoelektrokimyasal temelli bir biyosensör hazırlanmıştır. Metal oksit nanopartiküller ile ilgili çalışmalar Luo vd. (2009) tarafından yapılan bir çalışmada, kitosan çözeltisi içeren NiFe 2 O 4 nanopartikül modifiye camsı karbon elektrot üzerine GOx enzimi immobilize edilmiş ve ferrosen karboksilik asit medyatörü kullanılarak glukozun tayini, SCE ye karşı +0,60 V potansiyelde amperometrik yöntemle gerçekleştirilmiştir. 5

19 Li vd. (2008) GOx enzimini, kitosan kullanarak çapraz bağlama tekniği ile NiO boş nanokürelerin yüzeyine immobilize etmişlerdir. Hazırlanan enzim elektrot ile SCE ye karşı +0,35 V da yapılan glukoz tayini için en düşük tayin limiti 47 µm bulunmuştur. Salimi vd. (2007) tarafından 1 mm nikel nitrat içeren fosfat tamponu içinde Ag/AgCl e karşı 0,80 V potansiyelde camsı karbon elektrot yüzeyinde elektrokaplama yöntemi ile NiO nanopartikülleri oluşturulmuştur. Hazırlanan NiO modifiye camsı karbon elektrot GOx çözeltisi içine daldırılmış ve +0,80 V potansiyelde elektroçözünme yöntemi ile enzimin elektrot yüzeyine immobilizasyonu sağlanmıştır. NiO/GOx/GC elektrodu ferrosenmetanol medyatörü varlığında, +0,30 V potansiyelde glukozun yükseltgenmesine karşı üstün elektrokatalitik özellik göstermiştir. Ren vd. (2009) tarafından platin elektrot üzerine, çinko oksit (ZnO) nanopartikül ile modifiye GOx enzimi immobilize edilmiş ve enzim elektrot yüzeyindeki yarı iletken ZnO nanopartiküllerin fotovoltaik etkisinin yorumlanmasını temel alan fotoelektrokimyasal bir enzim elektrot hazırlanmıştır. Kong vd. (2009) yaptıkları bir çalışmada altın elektrot yüzeyini ZnO nanotüpleri ile kaplamış ve glutaraldehit ile çapraz bağlanan GOx enzimi Au-ZnO nanotüp elektrodun yüzeyine adsorplamıştır. Hazırlanan enzim elektrot ile SCE ye karşı +0,80 V potansiyelde glukoz tayini yapılmış ve tayin sınırı 1,0 µm olarak bulunmuştur. Liu vd. (2009) glukoz biyosensörü geliştirmek için, indiyum kalay oksit (ITO) cam elektrot yüzeyine dikey hizalanmış ZnO nanoçubuklarını kullanmışlardır. Hazırlanan elektrot üzerine GOx enzim çözeltisi damlatılarak yüzeye adsorpsiyonu sağlanmış ve nafyon çözeltisi kullanılarak hazırlanan enzim elektrot yüzeyinde koruyucu polimerik bir film oluşturulmuştur. ZnO/GOx/Nafyon/ITO enzim elektrodu ile SCE ye karşı -0,10 V potansiyelde glukoz tayin edilmiş ve 5, µm derişim aralığında doğrusal cevap elde edilmiştir. 6

20 Nanokompozitler ile ilgili çalışmalar Xian vd. (2005) tarafında yapılan bir çalışmada Au nanopartikülleri ve polianilin (PANI) nanofiberleri birleştirilerek bir nanokompozit sentezlenmiştir. Hazırlanan Au- PANI nanokompoziti camsı karbon elektrot yüzeyine kaplanmıştır. Glutaraldehit ve sığır serum albümin (BSA) ile karıştırılan GOx enzimi Au/PANI/GC elektrodu yüzeyine damlatılarak çapraz bağlanması sağlanmıştır ve hazırlanan enzim elektrot ile SCE ye karşı +0,60 V potansiyelde glukoz tayini için kullanılmıştır. Kaushik vd. (2008) kitosan (CHIT) ile birlikte Fe 3 O 4 nanokompozit filmi içeren enzim elektrot hazırlamıştır. Bu çalışmada kitosan, elektrodun mekanik dayanımı, yüksek su geçirgenliği, sahip olduğu amino grupları ile hidrofilik bir ortam yaratması ve enzimin bağlanması için kullanılmıştır. CHIT- Fe 3 O 4 filmi indiyum kalay oksit (ITO) cam elektrot yüzeyine yayılmıştır. CHIT- Fe 3 O 4 /ITO elektrodu yüzeyine immobilize edilen GOx enzimi ile hazırlanan elektrot dönüşümlü voltametri ve fotometrik yöntemler kullanılarak glukozun tayini için kullanılmıştır. Yukarıda kısaca anlatılan bazı nanopartikül modifiye glukoz biyosensörlerini karşılaştırabilmek için çizelge 1.1 hazırlandı: 7

21 Çizelge 1.1 Nanopartikül modifiyeli glukoz biyosensörlerinin karşılaştırılması Referans Çalışma elektrodu/analiz yöntemi/ Enzim modifikasyonu Enzim elektrodun hazırlanması Çalışma potansiyeli Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Tampon derişimi, ph sı ve cinsi /Sıcaklık Elektrodun duyarlığı/ Gözlenebilme sınırı/doğrusal derişim aralığı Numunede glukoz analizi Raf ömrü Li vd CHIT-NiO-GOx-GCE Amperometrik- Voltametrik Fiziksel adsorpsiyon NiO nanopartikülü ile modifiye edilen GC elektrodu üzerine önce GOx sonra CHIT çözeltisi damlatılıp kurutulmuş SCE ye karşı +0,35 V 8 s/1mm glukoz tayini için 10 kez aynı enzim elektrot kullanılmış ve duyarlıkların bağıl standart sapması (BSS) % 3,5 bulunmuş ph 6,98 PBS/- 3,43 µa/mm/ 47 µm/ 1,5-7,0 mm Farklı derişimde 5 serum örneğinde glukoz analizi yapılmış 20 gün sonunda ilk duyarlığın % 85 i korunmuş Mu vd NiO-CPE/ Amperometrik/ Enzim içermiyor 1:9 oranında karıştırılan grafit tozu ve NiO np leri parafin yağı ile pasta kıvamına getirilmiş. Hazırlanan karışım karbon pasta elektrot gövdesine yerleştirilmiş Ag/AgCl e karşı +0,70 V 5 s/1 mm glukoz tayini için aynı elektrot ile 5 kez ölçüm alınmış ve duyarlıkların bağıl standart sapması % 2,3 olarak belirlenmiş. - 43,9 na/µm/ 0,16 µm/ µm Seyreltik meyve suyu örneklerinde analizler yapılmış ve BSS % 1,8 bulunmuş 1 ay sonunda elektrodun glukoza cevabında azalma gözlenmemiş 8

22 Çizelge 1.1 Nanopartikül modifiyeli glukoz biyosensörlerinin karşılaştırılması (devam) Referans Luo vd Fang vd Çalışma elektrodu/analiz yöntemi/ Enzim modifikasyonu CHIT-NiFe 2 O 4 -GOx- GCE/ Amperometrik/ Çapraz bağlama Nafyon-ZnO-GOx- GCE/ Amperometrik/ Fiziksel adsorpsiyon Enzim elektrodun hazırlanması NiFe 2 O 4 np leri kitosan (CHIT) çözeltisinde çözülmüş ve karışıma GOx çözeltisi eklenmiş. Hazırlanan çözelti GCE yüzeyine damlatılıp kurutulmuş GCE elektrot yüzeyine biriktirilen ZnO ve GOx çözelti karışımı üzerine nafyon damlatılıp kurutulmuş Çalışma potansiyeli SCE ye karşı +0,60 V SCE ye karşı +0,80 V Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Tampon derişimi, ph sı ve cinsi /Sıcaklık 4 s/- 0,1 M ph 7 PBS/25 o C 5 s/ Aynı enzim elektrot ile CV de 50 döngü alınmış ve ilk duyarlığın % 96,5 i korunmuş 0,1 M ph 7,4 PBS/- Elektrodun duyarlığı/ Gözlenebilme sınırı/doğrusal derişim aralığı 45,6 µa/(mmol L 1 cm 2 )/ - / 1,0-8,0 mm 18,61 µa/mm/ 1 µm/ ,15 mm Numunede glukoz analizi Raf ömrü - 30 gün sonunda ilk duyarlığın %90 ından fazlası korunmuş Saf su ile seyreltilmiş farklı derişimlerde glukoz çözeltileri hazırlanmış ve BSS ler % 2 nin altında bulunmuş 20 gün sonunda ilk duyarlığın % 93,0 ü korunmuş 9

23 Çizelge 1.1 Nanopartikül modifiyeli glukoz biyosensörlerinin karşılaştırılması (devam) Referans Usman Ali vd Xian vd Çalışma elektrodu/analiz yöntemi/ Enzim modifikasyonu Nafyon/ZnO/GOx/ Gümüş elektrot/ Potansiyometrik/ Çapraz bağlama Nafyon-Au- PANI- GOx-GCE / Amperometrik/ Çapraz bağlama Enzim elektrodun hazırlanması Gümüş elektrot üzerinde sentezlenen ZnO nanotellerine GOx enzimi glutaraldehit ile çapraz bağlanmış ve nafyon damlatılıp kurutulmuş BSA ve GA ile karıştırılan GOx çözeltisi GCE yüzeyine kaplanan Au-PANI nanokompoziti üzerine damlatılarak enzimlerin yüzeye çapraz bağlanması sağlanmış ve son olarak nafyon damlatılıp kurutulmuş Çalışma potansiyeli Ag/AgCl e mv SCE ye karşı +0,60 V Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Nafyonsuz 1s, nafyonlu 4s/- Tampon derişimi, ph sı ve cinsi /Sıcaklık 0,01 M ph 7,4 PBS/23±2 o C 5 s/- 0,1 M ph 6,9 PBS/ 25 o C Elektrodun duyarlığı/ Gözlenebilme sınırı/doğrusal derişim aralığı -/-/ Nafyonsuz 0,5 µm- 1 mm nafyonlu 0,5 µm- 10 mm 2,3 ma/m/ 5, M/ 1, , M Numunede glukoz analizi Raf ömrü - 3 hafta sonunda ilk akımın % 90 ı korunmuş Hazırlanan elektrot ile 5 farklı derişimde glukoz içeren serum örnekleri için birer kez ölçüm alınmış 2 hafta sonunda ilk ölçülen duyarlığın %5 inden daha az bir duyarlık kaybı gözlenmiş 10

24 Çizelge 1.1 Nanopartikül modifiyeli glukoz biyosensörlerinin karşılaştırılması (devam) Referans Çalışma elektrodu/analiz yöntemi/ Enzim modifikasyonu Enzim elektrodun hazırlanması Çalışma potansiyeli Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Tampon derişimi, ph sı ve cinsi /Sıcaklık Elektrodun duyarlığı/ Gözlenebilme sınırı/doğrusal derişim aralığı Numunede glukoz analizi Raf ömrü Huang vd CdS-GOx-PGE/ Potansiyometrik/ Fiziksel adsorpsiyon 1:1 oranında karıştırılan CdS ve GOx çözeltisinden 30 µl alınmış ve pirolitik grafit disk elektrot (PGE) üzerine damlatılarak oda sıcaklığında bir gece kurutulmuş SCE ye karşı 0-(-)800 mv -/Hazırlanan elektrot 100 döngü boyunca kararlılığını korumuş 0,1 M ph 6,0 PBS/ 18±2 o C 7,0 µa/mm/ 0,05 mm/ 0,5-11,1 mm - 20 gün sonunda başlangıç cevabının % 92 si korunmuş Zhao vd Nafyon-GOx-PET-Ti- Au-ZnO:Co elektrodu/ Amperometrik/ Çapraz bağlama Sırasıyla metal Ti ve Au ince tabakaları implante edilmiş PET düzlemi üzerine ZnO:Co nanoyapısı çöktürülmüş ve elektrot yüzeyine GA- BSA ile karıştırılmış GOx ve nafyon damlatılıp kurutulmuş Ag/AgCl e karşı +0,80 V 8 s/- 0,1 M ph 7,4 PBS/24±2 o C 13,3 µa/ma cm 2 / 20 µm/ 0-4 mm - 2 hafta sonunda ilk duyarlığın % 10 undan daha az bir kayıp gözlenmiş 11

25 Çizelge 1.1 Nanopartikül modifiyeli glukoz biyosensörlerinin karşılaştırılması (devam) Referans Benvenuto vd Ren vd Shan vd Çalışma elektrodu/analiz yöntemi/ Enzim modifikasyonu Ti/Au/PB/GOx/TiO 2 / Amperometrik/ Çapraz bağlama Ag-Au-GOx-Pt tel Amperometrik/ Çapraz bağlama CaCO 3 /GOx/Pt elektrot/ Amperometrik/ Tutuklama Enzim elektrodun hazırlanması Prusya mavisi (PB) ve Au ile modifiye edilmiş sıralı TiO 2 nanotüplerinin üzerine GOx enzimi kitosan ile çapraz bağlanmış GOx çözeltisine, Ag-Au np leri içeren çözeltisi eklenmiş ve Pt tel hazırlanan karışıma 1 cm daldırılıp kurutulmuş GOx ve CaCO3 nanopartikül karışımı Pt elektrot üzerine dökülmüş ve 1 gece kurutulduktan sonra 15 dakika glutaraldehit içinde bekletilmiş Çalışma potansiyeli Ag/AgCl e karşı -0,10 V Ag/AgCl e karşı +0,40 V SCE ye karşı +0,60 V Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik 12 Tampon derişimi, ph sı ve cinsi /Sıcaklık 10s/- 0,1 M ph 6 PBS/25 o C -/- ph 6,8 PBS/ 25 o C 6 s/- 0,1 M ph 6,5 PBS/25 o C Elektrodun duyarlığı/ Gözlenebilme sınırı/doğrusal derişim aralığı 36 µa/mm/ 5 µm/ 0,015-4,00 mm 19 µa/mm cm 2 / -/- 58,1 ma cm -2 M -1 / 0,1 µm/ 0, mm Numunede glukoz analizi Raf ömrü - 3 hafta sonunda ilk akımın % 90 ı korunmuş - 1 ay sonunda ilk duyarlığın % 90 nı korunmuş gün sonunda ilk duyarlığın % 86 sı korunmuş

26 Çizelge 1.1 Nanopartikül modifiyeli glukoz biyosensörlerinin karşılaştırılması (devam) Referans Mahadeva ve Kim 2011 Salimi vd Çalışma elektrodu/analiz yöntemi/ Enzim modifikasyonu GOx/Selüloz-SnO 2 / Kondüktometrik/ Fiziksel adsorpsiyon NiO-GOx-GCE Amperometrik Fiziksel adsorpsiyon Enzim elektrodun hazırlanması Selüloz film yüzeyine SnO 2 çöktürülmesi ile oluşturulan nanokompozit yüzeyine GOx enzimi fizikel adsorpsiyon ile tutturulmuş NiO nanopartikülü ile kaplanmış ITO cam elektrot yüzeyine enzim immobilize edilmiş Çalışma potansiyeli Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Tampon derişimi, ph sı ve cinsi /Sıcaklık - -/- ph 7,2 PBS/ 25 o C Ag/AgCl e karşı +0,30 V < 3 s/- 0,05 M ph 7 PBS/ 20±1 o C Elektrodun duyarlığı/ Gözlenebilme sınırı/doğrusal derişim aralığı -/-/ 0,5-12 mm 446,2 na/mm/ 24 µm/ 30 µm-5,0 mm Numunede glukoz analizi Raf ömrü - Farklı zamanlarda alınan 5 ölçüm arasında % 5-10 hata oranı gözlenmiş - - Milardovic vd GOx/Ni/ Amperometrik/ Çapraz bağlama Ni elektroduna, GA ve BSA ile karıştırılan GOx çapraz bağlama yöntemi ile immobilize edilmiş Ag/AgCl e karşı -0,20 V 20s/- 0,1 M ph 7,4 PBS/- -/- 5 µm-2,9 mm Farklı derişimde glukoz içeren 10 kan serumunda glukoz analizi yapılmış 30 gün sonunda elektrodun ilk duyarlığının % 30 u azalmış 13

27 Çizelge 1.1 Nanopartikül modifiyeli glukoz biyosensörlerinin karşılaştırılması (devam) Referans Chen vd Shi ve Ma 2010 Çalışma elektrodu/analiz yöntemi/ Enzim modifikasyonu POAP-GOx/BCNT/ GCE/ Amperometrik/ Tutuklama B 2 O 3 tozu ve CNT arasındaki yer değiştirme reaksiyonu ile sentezlenen BCNT çözeltisi GC elektrot üzerine damlatılıp kurutulmuş, GOx ın elektroda immobilizasyonu poli(o-aminofenol) ve GOx ın coelektropolimerizasy onu ile sağlanmış Üçgensel olarak sentezlenen Ag nanopartikülleri GOx, kitosan ve glutaraldehit ile karıştırılmış, Pt elektrodun karışıma daldırılıp oda sıcaklığında kurutulması ile enzim elektrot hazırlanmış CHIT/GOx- AgTNPs/Pt/ Amperometrik/ Çapraz bağlama Enzim elektrodun hazırlanması Çalışma potansiyeli SCE ye karşı +0,60 V Ag/AgCl e karşı +0,60 V Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Tampon derişimi, ph sı ve cinsi /Sıcaklık 6 s/- 0,06 M ph 7,0 PBS/25 o C -/ard arda 50 ölçümden sonra başlangıç akımının % 80 i korunmuş 0,1 M ph 7,0 PBS/35 o C Elektrodun duyarlığı/ Gözlenebilme sınırı/doğrusal derişim aralığı 2,43 µa mm -1 3,6 µm 8 mm a kadar geniş bir derişim aralığı bulunmuş 67,17 µa cm -2 mm -1 / M/ M Numunede glukoz analizi 4 farklı glukoz derişimine sahip her bir kan serumunda 3 kez glukoz tayini yapılmış, bulunan sonuçlar hastane sonuçları ile karşılaştırılmış Raf ömrü 20 gün sonunda başlangıç akımının % 80 i korunmuş - 1 ay sonunda başlangıç akımının % 85 inin korunduğu gözlenmiş 14

28 Çizelge 1.1 Nanopartikül modifiyeli glukoz biyosensörlerinin karşılaştırılması (devam) Referans Baby ve Ramaprabhu 2009 Çalışma elektrodu/analiz yöntemi/ Enzim modifikasyonu GOD/Fe 3 O 4 - SiO 2 /MWNTs/GC/ Amperometrik/ Fiziksel adsorpsiyon Enzim elektrodun hazırlanması Fe 3 O 4 -SiO 2 /MWNT nanopartikülleri GC elektrot yüzeyine kaplanmış, üzerine GOx çözeltisi ve nafyon çözeltisi damlatılıp kurutulmuş Çalışma potansiyeli Ag/AgCl e karşı +0,10 V Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Tampon derişimi, ph sı ve cinsi /Sıcaklık 3-6 sn/- 0,1 M ph 7 PBS/ - Elektrodun duyarlığı/ Gözlenebilme sınırı/doğrusal derişim aralığı 58,9 µa/mm cm -2 / 800 nm/ 1 µm-30 mm Numunede glukoz analizi - - Raf ömrü Sheng vd GOx/NdPO 4 /CHIT/ GCE Amperometrik/ Fiziksel adsorpsiyon Kitosan içinde dağıtılan NdPO 4 np leri üzerine GOx çözeltisi eklenmiş ve 1 gece buzdolabında bekletildikten sonra karışım GCE üzerine damlatılıp kurutulmuş SCE ye karşı +0,40 V 5 s/- 0,05 M ph 6,8/ 25 o C 1,92 µa mm -1 0,08 mm/ 0,15-10 mm Farklı derişimde glukoz içeren 3 adet serum numunesinde glukoz analizi yapılmış 30 gün sonunda elektrodun ilk duyarlığının % 90 ının korunduğu belirlenmiş 15

29 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Biyosensörler Biyosensörler; analitlerin tanınmasını sağlayacak olan biyolojik tanı materyalini içeren ve bir fizikokimyasal çevirici yardımıyla analit ile biyolojik tanı materyali arasındaki etkileşim sonunda oluşan ürünü ölçülebilir sinyale dönüştürebilen analitik cihazlardır (Paddle 1996). Günümüzde biyosensörler; gıda endüstrisi, tıp, çevresel analizler, tarım vb. gibi birçok alanda kullanılmaktadır. Bir biyosensör biyolojik tanı materyali, çevirici ve dedektör olmak üzere üç temel kısımdan oluşur (Şekil 2.1). Biyosensörler, sahip oldukları biyolojik tanı materyaline ya da fizikokimyasal çevirici türüne göre adlandırılırlar. Şekil 2.1 Biyosensörün şematik gösterimi Biyolojik tanı materyalleri, tayin edilmesi hedeflenen analitlerle spesifik olarak tepkimeye giren biyomoleküllerdir. Bu biyomoleküllerin tipi biyosensörün seçiciliğinin ve spesifikliğinin derecesini belirler (Mello ve Kubota 2001). Sensörler, biyolojik tanı materyalleri özelliklerine göre biyoaffinite, biyokatalitik ve hibrid sensörler olmak üzere üç gruba ayrılırlar: 16

30 Biyokatalitik sensörler Enzimler, sahip oldukları aktif katalitik bölgeleri sayesinde substratları ile spesifik olarak etkileşime giren biyomoleküllerdir. Enzimlerin yanı sıra mikroorganizmalar, hücreler, hücre organelleri, bitki ve hayvan dokuları da substratlarına karşı katalitik aktivite gösterirler. Bu moleküller katalitik özellikleri nedeni ile biyokatalitik moleküller, enzim gibi biyokatalitik tanı materyalleri içeren biyosensörler ise enzim sensörleri olarak adlandırılırlar. Bu tür biyosensörlerde genellikle amperometrik, potansiyometrik, termal, optik ve piezoelektrik çevirici sistemleri kullanılır (Mello ve Kubota 2001). Biyoaffinite sensörleri Biyoaffinite temelli biyosensörler, antikor ve nükleik asit gibi biyomoleküller içerirler. Bu biyomoleküller, substratları ile spesifik bir şekilde etkileşmelerini sağlayan ligandlara sahiplerdir. Antikor, nükleik asit gibi biyospesifik tanı materyallerine sahip olan sensörler immünosensörler olarak adlandırılırlar. İmmünosensörler genellikle çeşitli hastalıkların tanısında ve gıda analitlerinin tayininde kullanılmaktadırlar. Bu biyosensörlerde optik ve piezoelektrik çevirici sistemleri kullanılır (Mello ve Kubota 2001). Hibrid sensörler DNA; adenin, guanin, sitozin ve timin bazlarını içeren çift polipeptid zincirli, RNA ise DNA dan farklı olarak timin yerine urasil bazı içeren tek polipeptit zincirli biyomoleküllerdir. DNA da guanin bazı sitozin, adenin bazı timin ile eşleşir. RNA da ise guanin bazı sitozin ile, adenin bazı urasil ile eşleşir. Bu eşleşmelerden yararlanılarak baz dizilimi bilinen DNA veya RNA tek polipeptid zincirinin eşleniği olan polipeptid zinciri biyolojik tanı materyali olarak kullanılır. DNA veya RNA sensörleri genellikle genetik modifikasyon çalışmalarında ya da gıda endüstrisinde E.Coli, Salmonella gibi patojenlerin tanısında kullanılır (Mello ve Kubota 2001). 17

31 Analitler ile etkileşen biyolojik tanı materyallerinin meydana getirdiği ürünler, biyosensörlerle birleştirilen fizikokimyasal çeviriciler ile okunabilir sinyallere dönüştürülürler. Biyokimyasal sinyalin türüne göre 4 çeşit fizikokimyasal çevirici bulunur (Mello ve Kubota 2001): Elektrokimyasal çeviriciler Analit ile biyolojik tanı materyali arasında elektron aktarımı, yüklü türlerin difüzyonu veya iyon transferi olduğu durumlarda elektrokimyasal çeviriciler kullanılır. En yaygın kullanılan çeviricilerdir. Elektrokimyasal çeviriciler; amperometrik, potansiyometrik, iyon seçici alan etki transistörleri (ISFET), kondüktometrik ve impedimetrik olarak sınıflandırılabilirler. Amperometrik çeviriciler; uygulanan potansiyelde analit ile biyolojik tanı molekülü arasındaki kimyasal reaksiyon sonucunda ortaya çıkan akımı ölçer. Amperometrik çeviricileri kullanan sensörlere amperometrik biyosensörler denir. Potansiyometrik çeviriciler; çalışma elektrodu yüzeyinde meydana gelen elektroaktif türlerin derişimi ile orantılı olarak değişen potansiyelleri ölçer. Bu tür sensörlere potansiyometrik sensörler denir. İyon seçici alan etki transistörleri (ISFET) iyon seçici elektrot üzerine immobilize edilmiş enzim veya antikor gibi biyolojik tanı materyallerinin substratları ile etkileşmesi ile oluşan potansiyel değişimlerini ölçer. Kondüktometrik çeviriciler; karbohidratlar gibi yüksüz metabolitlerin ya da laktik asit gibi ara ürünlerin analit olarak kullanıldığı durumlarda iki metal elektrot arasındaki iletkenlik değişimini ölçer. Bu tür biyosensörler kondüktometrik sensörler olarak adlandırılır. Kondüktometrik biyosensörler, zayıf sinyallere sahip oldukları ve analite karşı spesifiklik göstermedikleri için pek tercih edilmezler. İmpedimetrik çeviriciler; hem iletkenlik hem de elektriksel kapasite artışına neden olan ürünlerin impedansındaki azalmayı ölçer. İmpedans, maddenin öz direncidir. 18

32 Optik çeviriciler Optik çeviriciler, analit ile biyolojik tanı materyali arasındaki etkileşim sonucunda ortaya çıkan türlerin UV-VIS absorpsiyonu, lüminesans, floresans/fosforesans, yansıma ve ışık saçılması gibi yöntemler ile ölçülmesini sağlar. Termal çeviriciler Termal çeviriciler, biyolojik tanı materyali ile analit arasında gerçekleşen tepkime sonucunda meydana gelen ısı değişiminin ölçülmesini temel alır. Piezoelelektirik çeviriciler Piezoelektrik çeviriciler, bir piezoelektrik kristali yüzeyine immobilize edilmiş biyolojik tanı materyalinin analit ile etkileşmesi sonucunda kristalde meydana getirdiği titreşimin ölçülmesi esasına dayanır. Biyosensörler hedef analitleri, biyolojik tanı materyalleri, çevirici türleri, avantajları ve dezavantajlarına göre aşağıdaki çizelge 2.1 de özetlenmiştir (Mello ve Kubota 2001): Çizelge 2.1 Biyosensörlerde kullanılan analitler, biyolojik tanı materyalleri, çeviriciler ve bu çeviricilerin avantajları ile dezavantajları Çevirici Analit Biyolojik Tanı Materyali Elektrokimyasal Glukoz Biyokatalitik Galaktoz moleküller Kolesterol Fenolik bileşikler Laktat Histamin vb. Avantajı/Dezavantajı İndirgenme ve yükseltgenme tepkimelerine duyarlı, basit, minyatürize edilebilir / Çoklu enzim sistemleri için kullanışsız 19

33 Çizelge 2.1 Biyosensörlerde kullanılan analitler, biyolojik tanı materyalleri, çeviriciler ve bu çeviricilerin avantajları ile dezavantajları (devam) Çevirici Analit Biyolojik Tanı Materyali Optik Alkoller Biyokatalitik Karbohidratlar moleküller Bakteriler vb. Biyoaffinite molekülleri Hibrid moleküller Avantajı/Dezavantajı Düşük maliyet, çeşitli uygulama yöntemi (floresans,fosforesans vb.) / Yüksek enerji kaynaklarına ihtiyaç, ortam ışığının girişimi Piezoelektrik Mikroorganizmalar Lipidler Karbohidratlar vb. Biyokatalitik moleküller Biyoaffinite molekülleri Düşük maliyet, hızlı cevap, gaz analitler için uygunluk / Sıvı içinde düşük duyarlık, spesifik olmayan bağlanmaların girişim etkisi Termal Alkoller Karbohidratlar Lipidler vb. Biyokatalitik moleküller Optik yöntemlerde olduğu gibi türbidimetrik ya da renk girişimlerinin olmaması / Düşük seçicilik Amperometrik enzim elektrotlar Amperometrik çeviriciler, özellikle klinik tayinler için geliştirilen biyosensörlerde sıklıkla kullanılmaktadırlar. Amperometrik ölçümler, sabit bir potansiyelde elektrot yüzeyinde bazı elektroaktif türlerin indirgenme veya yükseltgenme akımlarının ölçülmesi esasına dayanır. Akım yoğunluğu elektroaktif türlerin derişimi ile doğru orantılıdır (D Orazio 2003). Amperometrik tayinlerde; çalışma elektrodu, referans elektrot ve karşıt elektrot olmak üzere üç elektrotlu elektrokimyasal hücre sistemleri kullanılır. En yaygın kullanılan çalışma elektrotları karbon pasta elektrotlar, karbon nanotüpler, camsı karbon 20

34 elektrotlar, altın, gümüş platin gibi metal elektrotlar ve kompozit elektrotlardır. Çalışma elektrodu tayin edilecek analite duyarlı biyolojik tanı materyalini içerir. Referans elektrot olarak genelde Ag/AgCl ve SCE elektrotları, karşıt elektrot olarak ise Pt tel ya da Pt elektrotlar kullanılır. Amperometrik enzim elektrotlarda en yaygın kullanılan biyolojik tanı materyalleri enzimlerdir. Literatürde kayıtlı ilk amperometrik enzim elektrot 1962 yılında Clark ve Lyons tarafından kanda glukoz tayini için geliştirilen enzim elektrottur (Zang vd. 2000). Elektroda glukoza duyarlı glukoz oksidaz (GOx) enzimi immobilize edilmiş ve enzimatik reaksiyon sonucunda oluşan hidrojen peroksitin (H 2 O 2 ) referans elektroda karşı +0,7 V potansiyelde O 2 ye yükseltgenmesi ile ortaya çıkan elektronların akım yoğunluğu ölçülerek kandaki glukoz derişimi belirlenmiştir (D Orazio 2003). Glukoz oksidaz tarafından katalizlenen reaksiyon aşağıda verilmiştir: Glukoz + O Glukonolakton + H O GOx Yukarıdaki eşitlikte görüldüğü gibi, glukoz O 2 varlığında glukonik asite dönüşürken, O 2 H 2 O 2 ye indirgenir. Amperometrik olarak glukoz tayini, +0,7 V da H 2 O 2 in tekrar O 2 ye yükseltgenmesine dayanılarak yapılmıştır: H O 2H + O + 2e Amperometrik enzim elektrotlar elektroaktif tür ile elektrot arasındaki ilişkiye göre 3 sınıfta incelenebilir (Dzyadevych vd. 2008): 21

35 Birinci nesil enzim elektrotlar Birinci nesil enzim elektrotlar, analit ile biyolojik tanı materyali arasındaki reaksiyon sonucu oluşan elektroaktif türlerin hiç bir aracı olmaksızın amperometrik yöntemlerle doğrudan ölçülmesi esasına dayanır (Şekil 2.2). Birinci nesil enzim elektrotların çalışma prensibi glukoz üzerinden aşağıdaki eşitliklerde gösterilmiştir (Dzyadevych vd. 2008): Glukoz + GOx GOx + Glukonolakton (yük) (ind) GOx (ind) + O2 GOx (yük) + H2O2 İkinci nesil enzim elektrotlar İkinci nesil elektrotlarda analit ve biyolojik tanı materyali arasındaki tepkime sonucu ortaya çıkan elektroaktif türler bir medyatör aracılığı ile elektroda iletilir (Şekil 2.2). Yapay veya doğal elektron transfer aracıları olan medyatörler (M) iyon aktarımını kolaylaştıracağı ve hızlandıracağı için daha düşük potansiyellerde çalışma imkanı sunar ve bu sayede ortamda girişim yapabilecek türler engellenir (Chaubey ve Malhotra 2001). Medyatörlü enzim elektrodunun çalışma prensibi glukoz üzerinden aşağıdaki eşitliklerde verilmiştir: Glukoz+ GOx Glukonolakton+ GOx ( yük) ( ind) GOx + 2M GOx + 2M + 2H + ( ) (ind) (yük) (yük ) ind 2M 2M + 2e ( ind) (yük) 22

36 Üçüncü nesil enzim elektrotlar Üçüncü nesil enzim elektortlarda, analit ve biyolojik tanı materyali arasındaki tepkime sonucu ortaya çıkan elektroaktif türler ile elektrot yüzeyi arasında herhangi bir e - taşıyıcı olmaksızın doğrudan elektron transferi gerçekleşir (Şekil 2.2) (Zang ve Li 2003). Bu olay biyoelektrokataliz olarak adlandırılır. Üçüncü nesil enzim elektrotlarda biyolojik tanı materyali olarak Sitokrom c gibi küçük redoks proteinlerin kullanımında doğrudan e - transferi sırasında sıkıntı gözlenmez. Fakat; glukoz oksidaz gibi büyük redoks enzimlerin kalın protein bir kabukla kaplanmış ve aktif bölgesinin enzimin içine gömülmüş olmasından dolayı bu tür enzimlerde elekrot yüzeyi ile enzimin aktif bölgesi arasındaki direk elektron transferi zordur. Bu durumu aşmak için elektrot yüzeyi genellikle tetrasiyanokuinodimetan (TCNQ) ve tetratiyafulvalen (TTF) gibi yüksek iletkenliğe sahip organometalik tuzlarla kaplanır (Vastarella 2001). Şekil 2.2 Farklı nesillerdeki enzim elektrotların şematik gösterimi (M (yük) ve M (ind) yükseltgenmiş ve indirgenmiş medyatör, GOx (yük) ve GOx (ind) yükseltgenmiş ve indirgenmiş glukoz oksidaz) 23

37 2.1.2 Nanoteknoloji Günümüzde nanoteknoloji; bilgisayar, fizik, kimya, tıp, tekstil, çevre ve elektronik gibi birçok alanda sıkça karşılaşılan bir terimdir. Nanoteknoloji, maddeleri atomik ve moleküler boyutta inceleme ve kullanma olanağı sunar. Ayrıca birçok alanda gelişmeye ve yeniliğe imkan sağlar (Roco 2003). Nanomateryaller nm arasında boyutlara sahip, istenilen ölçü ve şekillerde sentezlenebilen maddelerdir. Nanomateryallerin yenilik sağladığı en önemli alanlardan biri kuşkusuz biyosensörlerdir. Bu yapılar, biyosensörlerde genelde nanotüpler, nanofiberler, nanoçubuklar, nanopartiküller ve ince filmler olarak kullanılırlar (Jianrong vd. 2004). Karbon nanotüpler ve altın, demir, platin, bakır, zirkonyum oksit, titanyum oksit, iridyum oksit, demir oksit gibi metal ve metal oksitler biyosensörlerde kullanılan bazı nanoyapılardır (Salimi vd. 2006). Özellikle yarı iletken metal ve metal oksit nanopartiküller mekanik, optik, manyetik, kimyasal vb. özellikleri sebebiyle kimyasal katalizör veya ışık emisyonu yapan kuantum dot olarak kullanılırlar Nanomateryal temelli amperometrik enzim elektrotlar Nanomateryal temelli amperometrik enzim elektrotlar, elektrot yüzeyine veya içine tutuklanmış nanopartiküllerden ve immobilize enzimden ibarettir. Biyosensörlerde enzim ve elektrot arasındaki elektron transferinin hızlı ve kolay olması oldukça önemlidir. Fakat kullanılan biyomoleküllerin karmaşık ve büyük yapıları elektrot yüzeyi ile biyomolekül arasındaki elektron transferini zorlaştırır. Nanopartiküller, enzimin aktif bölgesi ile elektrot yüzeyi arasındaki tersinir elektron transferini kolaylaştırarak hızlı ölçümler alınmasını sağlar ve bu sayede elektron transferi için medyatör kullanımına ihtiyaç duyulmaz (Salimi vd. 2007). Nanopartiküller sahip oldukları nano boyutlar sayesinde geniş yüzey alanı ve serbest yüzey enerjisi sağlayarak elektrodun hızını ve duyarlığını arttırırlar (Li vd. 2008). 24

38 Yüksek spesifik yüzey alanı, kararlılık ve biyouyumluluk gibi özellikleri sayesinde metal nanopartiküllerin yanı sıra demir oksit, çinko oksit, zirkonyum oksit, titanyum oksit gibi metal oksitler de biyosensörlerde kullanılan en yaygın nanopartiküllerdendir (Liu vd. 2009). Bu nanoyapılar arasında NiO nanopartikülleri son zamanlarda; katalizör, gaz sensörleri, elektrokromik film gibi uygulamaları sayesinde dikkat çekmiştir. Buna rağmen NiO nanopartiküllerinin biyosensörlerde kullanılması oldukça nadirdir. 10,7 gibi yüksek izoelektrik noktasına sahip NiO nanopartikülleri, düşük izoelektrik noktasına sahip enzimlerin adsorpsiyonu için oldukça idealdir. Özellikle yüksek kimyasal kararlılık, elektrokataliz, hızlı ve direk elektron transferi kabiliyeti sayesinde biyosensör uygulamaları için gelecek vaad etmektedir (Li vd. 2008) Karbon pasta elektrotlar Grafit tozu ve bağlayıcı olarak çeşitli mineral yağlarının karıştırılması ile hazırlanan karbon pasta elektrotlar çeşitli elektrotların, sensörlerin ve dedektörlerin hazırlanmasında kullanılan en yaygın elektrot materyallerinden biridir. İlk kez 1958 yılında Ralph Norman Adams ve çalışma grubu tarafından geliştirilmiştir. Karbon pasta elektrotların en önemli bileşeni yüksek saflıkta ve µm boyutlarında partiküllere sahip grafit tozudur. Elektrodun diğer bir bileşeni ise inert ve elektroinaktif, yüksek viskosite ve düşük volatiliteye sahip bir pasta bağlayıcı sıvıdır. Karbon pastaların hazırlanmasında genellikle parafin, nujol ve uvasol gibi yağlar kullanılır. Nanoteknolojinin gelişimi ile birlikte karbon pasta elektrotların kullanımı da yaygınlaşmıştır. Özellikle çeşitli nanoyapıların kolayca modifiye edilmesi için karbon pasta elektrotlar oldukça uygun matrikslerdir (Švancara vd. 2008). Son yıllarda önemli ölçüde ilerleme gösteren nanopartikül modifiyeli karbon pasta elektrotlar aşağıda belirtildiği gibi birçok avantaja sahiptir (Santos vd. 2007): 25

39 Hazırlaması oldukça pratik ve hızlıdır Pasta yüzeyi kolayca yenilenebilir Düşük maliyetlidir Birçok biyosensör materyalini bir arada içerebilir İdeal biyosensörün sahip olması gereken özellikler İdeal bir biyosensörün sahip olması gereken özellikler aşağıda kısaca verilmiştir: Seçicilik Hedef analit dışında ortamda var olan diğer elektroaktif türler biyosensörün cevabını etkilememelidir. Kullanılan biyolojik tanı materyali, çalışılan potansiyelde sadece analizlenmesi istenilen türe duyarlık göstermelidir. Bu yüzden ortamda girişim yapabilecek türlerin girişim yüzdeleri belirlenmeli ve girişimi engelleyecek önlemler alınmalıdır. Duyarlık Duyarlık, hedef analitin derişimine bağlı olarak biyosensör cevabındaki doğrusal değişimin gözlenmesi ile belirlenir. Hazırlanan elektrodun duyarlığı hesaplanırken glukoz derişimine karşı çizilen akım farkları grafiğinin eğiminden faydalanılır. İdeal bir biyosensörün analizlenecek maddeye karşı yüksek duyarlık göstermesi istenir. Doğrusal çalışma aralığı ve gözlenebilme sınırı Doğrusal çalışma aralığı belirlenirken, hazırlanan elektrot bir tampon çözelti içinde çalışılan potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletilir. Stok substrat çözeltisinden ard arda belli miktarlarda hücreye eklenir ve elektodun substrata karşı cevapları okunur. Elde edilen akım farkları substrat derişimlerine karşı grafiğe 26

40 geçirilerek bir kalibrasyon grafiği elde edilir. Elektrot cevabı ile substrat derişiminin doğrusal olduğu aralığa doğrusal derişim aralığı adı verilir. Bu doğrusal aralığın başladığı en alt sınır gözlenebilme sınırı dır. İdeal bir biyosensörün doğrusal derişim aralığının geniş, gözlenebilme sınırının düşük olması istenir. Kararlılık Biyosensörlerin performansını korumasına biyosensör kararlılığı adı verilir. İdeal bir biyosensörün uzun süre performansını koruması istenir. Bu sayede analiz maliyetleri azalır ve kullanım süresi artar. Tekrarlanabilirlik ve tekrar üretilebilirlik Substrata karşı aynı enzim elektrot ile ard arda alınan ölçümlerden elde edilen duyarlıklar o biyosensörün tekrarlanabilirliğinin; aynı koşullarda ve içerikte hazırlanan farklı enzim elektrotların substrata karşı belirlenen duyarlıkları ise o biyosensörün tekrar üretilebilirliğinin ölçüsüdür. Her iki durumda da elde edilen duyarlıkların birbirine yakın değerlerde olması hazırlanan biyosensör ile yapılan analizlerin güvenilirliğinin ve doğruluğunun anlaşılması için önemlidir. Cevap süresi Hedef analitin hücreye eklendiği andan itibaren kararlı hal akımları elde edilen ana kadar geçen süreye cevap süresi denir. İdeal bir biyosensörün analizlenecek maddeye karşı hızlı cevap vermesi istenir. Ömür Bir biyosensörün ömrü, hedef analite olan duyarlığın zaman karşı grafiğe geçirilmesi ile bulunur. Bu grafik incelendiğinde biyosensörün duyarlığını koruduğu süre biyosensörün 27

41 ömrü olarak belirlenir. İdeal bir biyosensörün uzun ömürlü olması istenir. Ömrü etkileyen en önemli faktör enzimin immobilizasyon yöntemi ve elektrodu saklama koşullarıdır. 2.2 Enzimler Enzimler, canlılarda kimyasal reaksiyonların hızlı gerçekleşmesini sağlayan ve tepkime sonunda hiçbir değişikliğe uğramadan kalan biyolojik katalizörlerdir. Enzimler katıldıkları kimyasal reaksiyonlara göre 6 sınıfta incelenebilirler (Nelson ve Cox 2008): Oksidoredüktazlar: İndirgenme ve yükseltgenme reaksiyonlarını katalizleyen enzimlerdir. Transferazlar: H + iyonları hariç, bir fonksiyonel grubu bir molekülden diğerine aktaran enzimlerdir. Hidrolazlar: Kimyasal bağların hidrolizini katalizleyen enzimlerdir. Liyazlar: Hidroliz ve yükseltgenme dışındaki yollarla kimyasal bağları kırıp yerine bir çift bağ ya da halka yapısı oluşumunu katalizleyen enzimlerdir. İzemorazlar: Optik, geometrik veya yapısal izomerlerin yeniden düzenlenmesini katalizleyen enzimlerdir. Ligazlar: Büyük moleküllerin bir kimyasal bağ yardımı ile bağlanmasını katalizleyen enzimlerdir. Bağlanma esnasında moleküllerden birine ait küçük kimyasal grupların ayrılması gerçekleşebilir. 28

42 2.2.1 Enzimlerin özellikleri Enzimler, bazı katalitik RNA molekülleri dışında, protein yapısında bulunan biyokatalizörlerdir. Enzimleri diğer protein yapılardan ayıran en önemli özellikler aşağıda verilmiştir (Harvey ve Champe 2007): Aktif bölge Enzimler substratlarını bir cep şeklinde bulunan aktif bölgelere bağlarlar. Aktif bölgede, substrata eşlenik olan amino asitler bulunur. Substrat, eşleniği olan amino asitlere bağlanarak enzim-substrat (ES) kompleksini oluşturur. Daha sonra substrat ürüne dönüştürülerek ortama bırakılır. Hiçbir değişikliğe uğramadan kalan enzim ise başka bir substratı bağlamak için hazır hale gelir Seçicilik Enzimler belirli substratlarla etkileşerek hep aynı tip reaksiyonları katalizler. Enzimlerin seçiciliği, canlı organizmalarda katalizlenen reaksiyonların yanı sıra kimyasal analizler için de oldukça önemlidir Katalitik etki Enzimin, reaksiyonun aktivasyon enerjisini düşürerek, substratı ürüne çevirmesine katalitik etki denir. Aktivasyon enerjisi, kimyasal bir reaksiyonun gerçekleşebilmesi için aşılması gereken enerji değeridir. Enzimler tarafından katalizlenen reaksiyonların hızı katalizlenmeyen reaksiyonlara göre kat daha fazladır. Her enzim molekülü saniyede arası substrat molekülünü ürüne çevirebilir. 29

43 Kofaktörler Bazı enzimler katalitik aktivitelerini gerçekleştirmek için organik veya anorganik moleküllere ihtiyaç duyarlar. Metal iyonları gibi anorganik yapıdaki moleküllere ya da koenzim adı verilen vitamin türevleri gibi büyük organik moleküllerin tamamına kofaktör denir. Kofaktörüne bağlanmış enzime haloenzim adı verilir. Apoenzim ise enzimin hangi madde ile etkileşeceğini belirleyen ve bir kofaktöre bağlanmamış protein kısmıdır. Apoenzim, kofaktörü olmadan aktivite gösteremez. Kofaktörler genellikle enzimlere zayıf kuvvetlerle bağlanırlar ve bu sayede diyalizle uzaklaştırılabilirler. Çeşitli yöntemlerle uzaklaştırılamayan, enzime sıkıca bağlı kofaktörlere ise prostetik grup adı verilir Aktivasyon ve inhibisyon Enzimlerin katalizledikleri reaksiyonlardaki hızları ve aktiviteleri başka moleküller tarafından kontrol edilebilir. Enzimin aktivitesinin arttırılmasına aktivasyon ve bu olayı gerçekleştiren moleküllere aktivatör, enzimin aktivitesinin azaltılmasına ya da tamamen durdurulmasına inhibisyon ve bu olayı gerçekleştiren moleküllere inhibitör adı verilir Enzimatik reaksiyonların hızını etkileyen faktörler Farklı enzimlerin aktiviteleri sıcaklık, ph ve substrat derişimi gibi etkenlerden farklı şekilde etkilenir. Bu yüzden enzimlerle çalışırken optimum çalışma koşulları belirlenmelidir. Enzimlerin hızını etkileyen faktörler aşağıda verilmektedir: 30

44 Sıcaklık Sıcaklık artışıyla tüm kimyasal reaksiyonların hızı artar. Enzim reaksiyonlarında belli bir sıcaklığa kadar reaksiyon hızı sıcaklıkla artar, ancak daha sonra yüksek sıcaklıkla enzim denatüre olabildiği için reaksiyon hızı düşer Ortam ph sı Her enzimin maksimum aktivite gösterdiği optimum ph değeri vardır. Bu değerin altında ve üstünde enzim aktivitesi düşer. Enzimin substratı ile etkileşime girebilmesi için aktif bölgedeki iyonlaşabilen grupların pka sı önemlidir. Ortamın ph sı da bu grupların iyonizasyonunu etkileyen en önemli etmenlerdendir. Uç ph değerlerinde enzim denatüre olabilmektedir. Bu nedenle ortamın ph sını belirli bir değerde tutmak için tampon çözeltiler kullanılır Substrat derişimi Enzimatik bir reaksiyonun hızı birim zamanda ürüne dönüştürülen substrat miktarıdır ve maksimum hıza ulaşana kadar substrat miktarı ile artar. Enzimin tamamı substrat ile doyduğu zaman ise reaksiyonun hızı sabit kalır. Substrat miktarının çok fazla olduğu ya da oluşan ürünün ortamda birikmesi durumunda enzim inhibe olur ve reaksiyon hızı azalır İmmobilize enzimler Enzimlerin, suda çözünmemeleri için matriks adı verilen ve destek görevi gören materyaller üzerine çeşitli yöntemlerle tutturulmalarına enzim immobilizasyonu adı verilir. Enzimlerin matrikslere aktif grupları kapanmayacak şekilde immobilizasyonu gerekir. Aktif gruplar kapanırsa enzim substratı bağlayamaz ve verimi azalır. 31

45 İmmobilize enzimler, serbest halde bulunan enzimlere göre birçok avantaja sahiptir. Bu avantajlar aşağıda verilmektedir: Enzim, bir matrikse tutturulduğu için ph ya da ısı değişimlerinden daha az etkilenir. Oluşan ürünler, çözeltinin ph sının ya da iyonik şiddetinin değiştirilmesi gibi yöntemler ile kolayca ortamdan uzaklaştırılabilirler. İmmobilize enzimlerin aktivitesi, serbest enzimlere göre daha kolay kontrol edilebilir. Enzimler tekrar tekrar kullanılabilirler. Aynı anda birden fazla reaksiyonu katalizleyebilirler. Serbest enzimlere göre daha pratik, hızlı ve ucuz analiz olanağı sağlarlar (Costa vd. 2004, Enzim immobilizasyon teknikleri Biyosensörlerde kullanılan en yaygın enzim immobilizasyon teknikleri tutuklama, kovalent bağlama, çapraz bağlama ve adsorpsiyon olarak 4 sınıfta incelenebilir (D Souza 2001): Tutuklama Tutuklama sadece enzimler için değil hücreler için de kullanılan en yaygın immobilizasyon yöntemlerinden biridir. Bu yöntemde enzim molekülleri polimerizasyon yardımı ile agar, agaroz gibi doğal ya da poliüretan, poliakrilamit gibi sentetik polimer matrikslerde hapsedilir. Bu yöntem kolay ve ucuzdur; fakat zamanla enzimin sızması, yüksek difüzyon sınırı ve sterik engel gibi dezavantajlara sahiptir (Mello ve Kubota 2001). 32

46 Kovalent bağlama Enzimler sahip oldukları fonksiyonel grupları ile bir matrikse ya da doğrudan elektrot yüzeyine kovalent olarak bağlanabilirler. Bu yöntem, enziminn fonksiyonel grupları (katalitik aktivite göstermeyen) ile matrikste bulunan reaktif gruplar arasındaki reaksiyona dayanmaktadır (Mello ve Kubota 2001). Fiziksel adsorpsiyon Enzimin fiziksel adsorpsiyonu, van der Waals etkileşimlerine dayalı olan en eski ve en kolay immobilizasyon yöntemidir. Bu yöntemde enzimler, elektrot üzerine kaplanmış geçirgen bir membran üzerine doğrudan adsorbe edilir. Kimyasal bir modifikasyona ihtiyaç duyulmaz. Yöntem basit ve ucuz olması gibi avantajlarının yanı sıra, ölçümler esnasında ph, sıcaklık ve iyonik şiddetin değişmesi ile adsorbe edilmiş enzimin kaybı gibi dezavantajlara da sahiptir (Mello ve Kubota 2001). Çapraz bağlama Bu yöntem bifonksiyonel ajanlar sayesinde enzimlerin kovalent şekilde matrikslere bağlanmasına dayanır. Enzimlerin çapraz bağlanmasında glutaraldehit, karbodiimid gibi bifonksiyonel ajanlar kullanılabilir. En sık kullanılan bifonksiyonel ajan olan glutaraldehitin kimyasal formülü şekil 2.3 de verilmektedir (D Souza 2001): Şekil 2.3 Glutaraldehitin kimyasal formülüü 33

47 2.2.5 Glukoz oksidaz enziminin özellikleri IUPAC kodu EC olan glukoz oksidaz enzimi, oksijen varlığında glukozun hidrojen peroksit ve glukonik asite dönüşümünü katalizleyen oksidoredüktaz sınıfı bir enzimdir. Glukoz oksidazın bir katalizör olarak işlev görebilmesi için flavin adenin dinükleotit (FAD) koenzimine ihtiyacı vardır. Glukoz oksidaz tarafından katalizlenen indirgeme reaksiyonlarında FAD elektron alıcısı olarak görev alır ve FADH 2 ye indirgenir. Daha sonra FADH 2 moleküler oksijen tarafından tekrar FAD a yükseltgenir ve oksijen de hidrojen peroksite indirgenir: Glukoz + GOx(FAD) Glukonolakton + GOx(FADH 2) GOx(FADH ) + O GOx(FAD) + H O Glukoz oksidaz, 6 karbonlu bir şeker olan glukozun hemiasetal formu olan β-dglukopiranoza bağlanırken α-d-glukopiranoz ile etkileşmez. Bu yüzden D-glukoz çözeltisi bir süre dinlendirilerek β-d-glukopiranoz ve α-d-glukopiranoz formlarının dengeye gelmesi sağlanır. Bu olaya mutarotasyon adı verilir (Şekil 2.4). Glukoz oksidaz dengedeki glukoz çözeltisinde bulunan β-d glukopiranoz ile etkileşir (Vastarella 2001, ). Şekil 2.4 Glukozun mutarotasyonu 34

48 Glukoz oksidaz vücut sıvılarında, gıdalarda ve bitkisel ham maddelerde bulunan serbest glukozun tayini için biyolojik tanı materyali olarak sıklıkla kullanılmaktadır. Özellikle son yıllarda oldukça artış gösteren diyabet hastalığının en önemli tanı materyalidir (Wang vd. 2010). 2.3 Glukoz Tayinin Önemi Halk arasında şeker hastalığı olarak bilinen diyabet, karbohidrat metabolizmasının en önemli hastalıklarından biridir. Vücudun yeteri kadar insülin üretememesi ya da üretilen insülinin işlevinde bir bozukluk olması durumunda Tip I diyabet, insülinin etkisine karşı direnç gelişmesiyle de Tip II diyabet gözlenir (Wang vd. 2007). İnsülin eksikliğinden dolayı kandaki şeker seviyesi olması gereken değerin üstüne çıkar. Yüksek kan şekeri (hiperglisemi); görme bozukluklarına, sinir hasarlarına, dolaşım sistemi hastalıklarına ve kalp yetmezliğine sebep olabilir. Hipoglisemi ise kan şekerinin olması gerekenden daha düşük olmasıdır. Özellikle Tip I diyabetli hastalar insulin tedavisinden ötürü haftada bir veya iki kez hipoglisemi atağı geçirirler. Hipoglisemik ataklar, beyindeki sinir hücrelerinin (nöronların) hasarına ve ölümüne neden olabilir. Bu yüzden gerekli durumlarda tanı ve tedavi için diyabet hastalarında sık sık ve hızlı bir şekilde serumdaki şeker miktarının ölçülmesi gerekir (Comba vd. 2010a). Glukoz, diyabet gibi bazı hastalıkların tanısının yanı sıra gıda endüstrisinde de tayini yapılan analitlerden biridir. Glukoz tayini, HPLC ve gaz-sıvı kromotografisi gibi cihazlarla yapılmasına rağmen glukoz biyosensörleri daha ucuz, hızlı ve kolay tayin imkanı sunar. Özellikle diyabetli hastaların kan şekeri seviyesinin hızlı ve güvenilir bir şekilde ölçülmesi için glukoz biyosensörlerinden faydalanılır (Cash ve Clark 2010). 35

49 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1 Kullanılan Cihazlar Amperometrik çalışmalarda, bir bilgisayara bağlı şekil 3.1 de gösterilen IVIUMSTAT elektrokimyasal analiz cihazı ve BAS marka 5 girişli elektrokimyasal hücre standı kullanıldı. Şekil 3.1 IVIUMSTAT elektrokimyasal analiz cihazı ve BAS marka 5 girişli elektrokimyasal hücre standı Deneylerde kullanılan çözeltileri hazırlamak için ELGA Purelab Classic cihazı ile iki kere damıtılmış ultra saf su kullanıldı. Deney çözeltilerinin ph ları ORION marka numaralı kombine cam ph elektrodu kullanılarak ORION 720A cihazı ile ayarlandı. Cihazı kalibre etmek için ph sı 4,13 olan potasyum hidrojenftalat ve ph sı 8,20 olan sodyum bikarbonat çözeltileri kullanıldı. Çözeltilerin hazırlanmasında ve hücre içine çözelti ilavelerinde Biohit Proline-Pipette marka mikro pipetler kullanıldı. Sıcaklık çalışmalarında sabit sıcaklık elde etmek için Grant LTD GG marka sirkülasyonlu ve termostatlı su banyosu kullanıldı. 36

50 Deney çözeltilerindeki katıların çözünmesi için Elma LC 30 H marka ultrasonikasyon cihazından yararlanıldı. Çözeltilerin karıştırılmasında Chiltern marka MS21S model manyetik karıştırıcı kullanıldı. Kan serum numunelerindeki proteinleri ayırmak için Nahita marka 2650 model santrifüj cihazı kullanıldı. 3.2 Elektrokimyasal Hücre ve Kullanılan Elektrotlar Amperometrik çalışmalar, çalışma elektrodu, referans elektrot ve karşıt elektrodu içeren elektrokimyasal hücre sistemi kullanılarak yapıldı. Çalışma elektrodu olarak 3 mm çapında karbon pasta elektrot gövdeleri; referans elektrot olarak BAS firmasından alınan Ag/AgCl elektrodu (MF 2052) ve karşıt elektrot olarak da yine BAS firmasından alınan platin tel elektrot (MW 1034) kullanıldı. Sıcaklığın amperometrik cevap üzerine etkisinin incelendiği çalışmalarda hücre çözeltisinin sıcaklığını istenilen sıcaklıkta sabit tutabilmek için su sirkülasyonu sağlayan çift cidarlı ve termostatlı hücre kullanıldı. 3.3 Kullanılan Kimyasallar Oksijen gazı Glukozun, glukoz oksidaz enzimi ile etkileşerek glukonik asite yükseltgenebilmesi oksijenli ortam gerektirdiğinden, enzim elektrotların kullanıldığı amperometrik tayinlerde ortamdan % 99,95 saflıkta oksijen gazı geçirildi. 37

51 3.3.2 Argon gazı Hazırlanan karbon pasta elektrotların hidrojen perokside duyarlığını belirlemek için yapılan deneylerde, ortamdaki oksijeni uzaklaştırmak amacıyla sistemden inert %99,999 saflıkta argon gazı geçirildi Kullanılan enzim Çalışmada kullanılan glukoz oksidazın, IUPAC kodu, elde edildiği kaynak ve temin edildiği firma çizelge 3.1 de verilmiştir. Çizelge 3.1 Glukoz oksidazın, IUPAC kodu, elde edildiği kaynak ve temin edildiği firma Enzimin Adı Kodu Kaynağı Firma Glukoz oksidaz EC Aspergillus niger Sigma Diğer kimyasallar Çalışmada kullanılan diğer kimyasalların isimleri, temin edildikleri firmalar, saflık dereceleri ve katalog numaraları çizelge 3.2 de verilmiştir. 38

52 Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan diğer kimyasalların isimleri, temin edildikleri firmalar, saflık dereceleri ve katalog numaraları Kimyasal Madde Firma Adı Saflık Derecesi β-d-(+)-glukoz Fluka % 99,5 di-sodyum monohidrojenfosfat heptahidrat (Na 2 HPO 4.7H 2 O) Riedel de Haën >% 99 Etanol Riedel de Haën % 99,8 Fosforik asit Pandeac % 85 Glutaraldehit Sigma, Grade II % 25 Grafit tozu Fluka Yüksek saflıkta Hidrojen peroksit Riedel de Haën % 35 Hidroklorik asit Pandeac % 37,5 Kreatinin Fluka % 99 L-Askorbik asit Sigma Ultra saf L-Aspartik asit Aldrich >% 98 Lityum karbonat Riedel de Haën % 99 NiO nanopartikülleri < 50 nm Aldrich % 99,8 Parafin yağı Fluka IR spektr. için Parasetamol Fluka % 98 Sığır serum albümin (BSA) Fluka % 97 Sodyum dihidrojenfosfat dihidrat (NaH 2 PO 4.2H 2 O) Riedel de Haën >% 99 Sodyum hidroksit Merck Saf Trikloroasetik asit Fluka % 98 39

53 Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan diğer kimyasalların isimleri, temin edildikleri firmalar, saflık dereceleri ve katalog numaraları (devam) Kimyasal Madde Firma Adı Saflık Derecesi Tris(hidroksimetil)aminometan (TRIS) Fluka >% 99,5 Üre Sigma % 99,5 Ürik asit Sigma >% Serum Numunesi Çalışmalarda kullanılan serum örnekleri Gazi Üniversitesi Biyokimya Laboratuvarı ndan temin edilmiştir. 3.5 Kullanılan Çözeltiler Fosfat tamponu 0,10 M fosfat tamponu hazırlamak için hesaplanan miktarlarda sodyum dihidrojenfosfat dihidrat ve disodyum monohidrojenfosfat heptahitrat tartılarak saf suda çözüldü. Hazırlanan fosfat çözeltilerini istenilen ph lara ayarlarken 0,10 M NaOH ve 0,10 M H 3 PO 4 çözeltileri kullanıldı. ph çalışmalarında kullanılmak üzere sırasıyla 0,10 M derişimde 5,0; 6,0; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0 ph larda fosfat tamponları ve tampon derişimi çalışmalarında kullanılmak üzere ph 7,0 de sırasıyla 0,05 M; 0,10 M; 0,15 M; 0,20 M fosfat tampon çözeltileri hazırlandı. Hazırlanan çözeltiler kullanılmadıkları zaman buzdolabında +4 o C de muhafaza edildi. 40

54 3.5.2 TRIS tamponu 0,10 M TRIS tamponu hazırlamak için hesaplanan miktarlarda tris(hidroksimetil)aminometan tartıldı ve 0,10 M HCl çözeltisi kullanılarak istenilen ph değerine ayarlandı. Hazırlanan çözelti buzdolabında +4 o C de saklandı Enzim çözeltileri Glukoz oksidaz enzimi (GOx) 5,04 mg tartılıp 0,5 ml fosfat tamponunda çözülerek 100 µl lik porsiyonlara ayrıldı ve buzdolabında -20 o C de muhafaza edildi. Kullanılacağı zaman istenilen miktarda enzim çözeltisi alınarak karbon pasta enzim elektrot karışımına ilave edildi Glukoz çözeltisi Çalışmalarda kullanılan 1, M glukoz çözeltisi, ilgili katının gerekli miktarlarda tartılıp saf suda çözülmesiyle hazırlandı. Glukoz çözeltisi, kullanılmadan önce, 24 saat glukozun mutorotasyonu için buzdolabında +4 o C de bekletildi. Farklı derişimlerdeki glukoz çözeltileri de benzer şekilde hazırlandı Hidrojen peroksit çözeltisi 1, M hidrojen peroksit çözeltisini hazırlamak için % 35 lik hidrojen peroksit çözeltisinden hesaplanan miktarda alındı ve saf su ile seyreltildi. H 2 O 2, kolay bozunduğu için çalışmalardan hemen önce taze olarak hazırlandı. Bozunmasını geciktirmek için ısı ve ışıktan korundu Glutaraldehit çözeltisi % 1,25 lik glutaraldehit çözeltisi hazırlamak için % 25 lik glutaraldehit çözeltisinden hesaplanan miktarda alındı ve saf su ile seyreltildi. 41

55 3.5.7 Girişim çalışmalarında kullanılan çözeltiler Serumda bulunan bazı türlerin enzim elektrotların cevabına etkisinin araştırılması için bu türlerin stok çözeltileri hazırlanıp hücreye eklendi. Bu çözeltiler aşağıda verildiği şekilde hazırlandı: Kreatinin, L- askorbik asit, parasetamol, üre ve L-aspartik asit stok çözeltileri her birinin derişimleri 1, M olacak şekilde ilgili katılarının tartılıp saf suda çözülmesi ile hazırlandı. Ürik asit stok çözeltisi ise derişimi 1,0x10-2 M olacak şekilde uygun miktarda tartılıp % 0,45 (k/h) lik Li 2 CO 3 çözeltisinde çözülerek hazırlandı. Girişim çalışmalarında verilen maddelerin fizyolojik derişimleri, stok çözeltilerinin belirli miktarlarının elektrokimyasal hücreye katılmasıyla elde edildi. 3.6 NiO Nanopartikül ile Modifiye Edilmiş ve Modifiye Edilmemiş Karbon Pasta Elektrotların Hazırlanması NiO nanopartikül ile modifiye edilmiş ve edilmemiş karbon pasta elektrotların karşılaştırılması için iki farklı elektrot aşağıdaki gibi hazırlandı: Modifiye edilmemiş karbon pasta elektrotların (CPE) hazırlanması için 40 mg grafit tozu tartıldı ve üzerine 15 µl parafin yağı konularak cam bir petri kabında yaklaşık 10 dakika karıştırıldı. Hazırlanan karışım karbon pasta elektrot gövdesi içine yerleştirildi ve yüzeyi pürüzsüzleştirildi. NiO nanopartikül ile modifiye karbon pasta elektrotların hazırlanması için grafit tozu ve ticari NiO nanopartikülleri karışımdaki miktarları 3:1 oranında olacak şekilde tartıldı. 30 mg grafit tozu ve 10 mg NiO nanopartikülü cam bir petri kabında homojen bir dağılım elde edilene kadar karıştırıldı. Buna 15 µl parafin yağı eklendi ve yaklaşık 20 42

56 dakika spatül yardımıyla karıştırılmaya devam edildi. Hazırlanan pasta karbon pasta elektrot gövdesi içine yerleştirildi ve elektrot yüzeyi pürüzsüz bir yüzeyde düzleştirildi NiO Nanopartikül ile modifiye edilmiş ve modifiye edilmemiş karbon pasta elektrotların H 2 O 2 ye duyarlığı Bölüm 3.6 da anlatıldığı şekilde hazırlanan NiO içeren elektrot 0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu içerisine daldırılarak Ag/AgCl e karşı +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletildi. Taze hazırlanan stok hidrojen peroksit çözeltisinden hesaplanan miktarlarda hücreye eklendi. Hücreden argon gazı geçirildikten sonra çözeltinin karışması sağlandı ve +0,4 V da amperometrik ölçümler alındı. Hidrojen peroksit derişimine karşı akım farkları grafiğe geçirildi. Elde edilen kalibrasyon grafiğinin eğiminden yararlanarak hazırlanan elektrodun bu potansiyelde hidrojen peroksite karşı duyarlığı belirlendi. Aynı işlemler Ag/AgCl e karşı +0,7 V da da tekrarlandı. NiO nanopartikül içermeyen karbon pasta elektrotların hidrojen perokside cevabı da yukarıda anlatıldığı şekilde yapıldı. İki farklı elektrot için çalışılan potansiyellerde elde edilen duyarlıklar karşılaştırıldı. 3.7 NiO ile Modifiye Edilmiş Enzimsiz Karbon Pasta Elektrodun Çalışma Potansiyelinin Belirlenmesi NiO/CPE nin optimum çalışma potansiyelinin belirlenmesi için hazırlanan elektrot 0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu içine daldırıldı ve Ag/AgCl a karşı +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletildi. 1, M hidrojen peroksit çözeltisinden hesaplanan miktarlarda hücreye eklendi, argon gazı geçirildi ve +0,4 V da amperometrik ölçümler alındı. Elde edilen akım farkları hidrojen peroksit derişimine karşı grafiğe geçirildi ve çizilen grafiğin eğiminden elektrodun hidrojen peroksite karşı duyarlığı hesaplandı. Aynı işlemler +0,7 V potansiyelde de tekrarlandı. Farklı çalışma potansiyellerinde bulunan duyarlıklar karşılaştırıldı ve en uygun çalışma 43

57 potansiyeli belirlendi. Enzimli ve enzimsiz elektrotlar ile yapılan tüm çalışmalar belirlenen potansiyelde gerçekleştirildi. 3.8 Glukoz Tayini İçin Karbon Pasta Enzim Elektrotların Hazırlanması Glukoz tayini için sırasıyla NiO nanopartikül içeren ve içermeyen karbon pasta enzim elektrotlar aşağıdaki şekilde hazırlandı: NiO nanopartikül içermeyen karbon pasta enzim elektrotların (GOx/CPE) hazırlanması için 40 mg grafit tozu tartıldı. Enzimlerin çapraz bağlanmasını sağlamak için 10 µl glutaraldehit ve 1,5 mg sığır serum albümin (BSA) tartılarak bir ependorf tübü içerisine konuldu ve üzerine Bölüm de anlatıldığı gibi hazırlanan glukoz oksidaz enzim çözeltisinden uygun miktarda eklendi. Enzimlerin çapraz bağlanabilmesi için birkaç dakika beklendikten sonra enzim çözeltisi karışımı grafit tozu üzerine eklendi ve yaklaşık 15 dakika karıştırıldı. Hazırlanan karışıma 15 µl parafin yağı ilave edildi ve homojen bir pasta elde edilene kadar karıştırılmaya devam edildi. Hazırlanan pasta karbon pasta elektrot gövdesine yerleştirildi ve elektrot yüzeyi pürüzsüzleştirildi. NiO nanopartikül içeren karbon pasta enzim elektrotların (NiO/GOx/CPE) hazırlanması için belli oranlarda grafit tozu ve NiO nanopartikülü cam bir petri kabında homojen hale gelene kadar karıştırıldı. Yukarıdaki gibi hazırlanan glutaraldehit-glukoz oksidaz-bsa karışımı petri kabına eklendi ve yaklaşık 15 dakika karıştırıldı. Karışım üzerine 15 µl parafin yağı ilave edilerek karıştırılmaya devam edildi. Hazırlanan pasta karbon pasta elektrot gövdesine yerleştirildi ve yüzeyi pürüzsüz bir yüzeyde düzleştirildi Glukoz tayini için hazırlanan enzim elektrotların glukoza duyarlığı Bölüm 3.8 deki gibi hazırlanan NiO nanopartikül içeren karbon pasta enzim elektrot 0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu içine daldırılarak Ag/AgCl e karşı +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletildi. 1, M stok glukoz çözeltisinden uygun miktarlarda hücreye eklendi, ortamdan oksijen gazı geçirildi ve bu potansiyelde 44

58 amperometrik ölçümler alındı. Elde edilen akım farkları glukoz derişimine karşı grafiğe geçirildi ve grafiğin eğiminden yararlanılarak glukoza karşı duyarlık hesaplandı. NiO içermeyen enzim elektrodun da glukoza duyarlığı, yukarıda anlatıldığı şekilde, belirlendi ve iki farklı elektrot için bulunan duyarlıklar karşılaştırıldı. 3.9 NiO Nanopartikül Modifiye Karbon Pasta Enzim Elektrotların Optimum Çalışma Koşullarının ve Performans Faktörlerinin Belirlenmesi Tampon cinsinin etkisi Hazırlanan NiO/GOx/CPE nin glukoza karşı cevabına tampon cinsinin etkisini belirlemek amacı ile Bölüm de ve Bölüm de anlatıldığı gibi hazırlanan 0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu ve 0,10 M ph 7,0 TRIS tamponu içinde ayrı ayrı daldırılan enzim elektrot Ag/AgCl e karşı +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımı elde edilene kadar bekletildi. Stok glukoz çözeltisinden ilaveler yapılarak amperometrik ölçümler alındı. Elde edilen akım farkları glukoz derişimine karşı grafiğe geçirildi ve belirlenen duyarlıklar her iki tampon cinsi için karşılaştırıldı Tampon derişiminin etkisi Tampon derişiminin enzim elektrodun duyarlığına etkisini incelemek için Bölüm de açıklandığı şekilde ph sı 7,0 olan 0,05; 0,10; 0,15 ve 0,20 M lık fosfat tamponları hazırlandı. NiO/GOx/CPE sırası ile bu tamponlara daldırıldı ve Ag/AgCl a karşı +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene kadar beklendi. Stok glukoz çözeltisinden ilaveler yapıldı ve amperometrik cevaplar kaydedildi. Glukoz derişimlerine karşı akım farkları grafiğe geçirildi ve yukarıda verilen farklı derişimlerdeki fosfat tamponları için bulunan duyarlıklar karşılaştırıldı. 45

59 3.9.3 ph nın etkisi ph nın amperometrik cevap üzerine etkisini belirlemek amacıyla NiO/GOx/CPE, Bölüm de anlatıldığı gibi hazırlanan 0,10 M derişimde farklı ph lardaki fosfat tamponları içinde Ag/AgCl e karşı +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletildi. Glukoz çözeltisinden eklemeler yapılarak çalışılan tamponda duyarlıklar belirlendi. Elde edilen duyarlık değerleri ph ya karşı grafiğe geçirildi ve en yüksek duyarlığın elde edildiği tampon ph sı optimum ph olarak seçildi NiO nanopartikül miktarının belirlenmesi NiO nanopartikül miktarının enzim elektrodunun duyarlığına etkisini incelemek için grafit ve nanopartikül miktarları arasındaki oranlar 3:0,5; 3:1; 3:1,5 ve 3:2 olacak şekilde grafit tozu ve nanopartikül tartıldı. Bölüm 3.8 de anlatıldığı gibi enzim elektrotlar hazırlandı ve 0,10 M ph 7,0 fosfat tampon içerisinde daldırıldı, Ag/AgCl e karşı + 0,4 V da dengeye gelene kadar bekletildi. 1, M stok glukoz çözeltisinden hücreye ilaveler yapıldı ve amperometrik cevaplar alındı. Elde edilen akım farkları glukoz derişimine karşı grafiğe geçirilerek duyarlıklar hesaplandı. Bulunan duyarlıklar karşılaştırıldı ve en uygun NiO nanopartikül miktarı belirlendi Enzim miktarının belirlenmesi Enzim miktarının etkisini incelemek amacı ile 5; 8; 10; 12; 15 U GOx içeren enzim elektrotlar Bölüm 3.8 de anlatıldığı gibi hazırlandı. Her bir elektrot 0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu içerisinde +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletildi. Glukoz çözeltisinden hesaplanan miktarlarda hücreye eklendi, oksijen gazı geçirildikten sonra amperometrik ölçümler alındı. Akım farkları glukoz derişimlerine karşı grafiğe geçirildi ve farklı miktarda enzim içeren elektrotlar için duyarlıklar karşılaştırılarak en uygun enzim miktarı belirlendi. 46

60 3.9.6 Sıcaklığın etkisi NiO/GOx/CPE için optimum sıcaklığının belirlenmesi amacı ile çift cidarlı elektrokimyasal hücreye sahip termostatlı su banyosu kullanıldı. Su banyosunun sıcaklığı sırası ile 15, 20, 25, 30, 35 ve 40 o C ye ayarlandı. Enzim elektrot 0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu içerisine daldırıldı ve +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletildi. Glukoz çözeltisinden hesaplanan miktarlarda hücreye eklendi, oksijen gazı geçirildi ve karıştırma sonrası amperometrik ölçümler alındı. Akım farklarına karşı glukoz derişimleri grafiğe geçirildi ve çizilen kalibrasyon grafiğinin eğiminden enzim elektrodun glukoza karşı duyarlığı hesaplandı. Farklı sıcaklıklarda elde edilen duyarlıklar sıcaklığa karşı grafiğe geçirildi ve en uygun çalışma sıcaklığı belirlendi Cevap süresinin belirlenmesi NiO/GOx/CPE nin cevap süresini belirlemek için enzim elektrot 0,10 M ph 7,0 fosfat tamponuna daldırıldı ve +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde edene kadar bekletildi. Glukoz derişimi 1, M olacak şekilde elektrokimyasal hücreye stok glukoz çözeltisinden eklendi ve oksijen gazı geçirildikten sonra belli süre boyunca amperometrik cevaplar kaydedildi. Akım farkları zamana karşı grafiğe geçirildi ve akım farkının hemen hemen sabit kaldığı süre elektrodun cevap süresi olarak belirlendi. Aynı işlemler hücreye 1, M glukoz eklenerek de tekrarlandı Glukoz derişiminin etkisi Glukoz derişiminin enzim elektrodun cevabına etkisini incelemek için farklı derişimlerde glukoz çözeltileri hazırlandı. Enzim elektrot çalışma tamponu içinde +0,4 V da dengeye getirildikten sonra farklı derişimlerdeki glukoz çözeltilerinin uygun miktarları hücreye ilave edildi ve amperometrik ölçümler alındı. Akım farkları glukoz derişimlerine karşı grafiğe geçirildi. Çizilen grafikten yararlanılarak gözlenebilme sınırı ve doğrusal çalışma aralığı belirlendi. 47

61 3.9.9 Girişim yapan türlerin NiO/GOx/CPE nin cevabı üzerine etkisi NiO/GOx/CPE un cevabına serumda bulunabilecek ve cevap üzerine bozucu etki yapabilecek bazı türlerin etkisini incelemek için L-aspartik asit, L-askorbik asit, kreatinin, parasetamol, üre ve ürik asit çözeltileri Bölüm de anlatıldığı şekilde hazırlandı. Bunun için, ilk olarak enzim elektrot 0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu içine daldırıldı ve +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletildi. Hücredeki derişimi 1, M olacak şekilde stok glukoz çözeltisinden uygun miktarda eklendi ve akım farkı belirlendi. Elde edilen akım farkı I 0 olarak adlandırıldı. Daha sonra, 1, M glukoz içeren hücreye, çizelge 3.3 de verilen derişimlerde ilgili bozucu türün ilave edilmesiyle I x olarak adlandırılan akım farkı belirlendi. Her bir tür için girişim yüzdeleri ayrı ayrı aşağıdaki eşitliğe göre hesaplandı: % ş %100 Çizelge 3.3 Girişim yapan türlerin hücre içindeki toplam derişimleri Girişim Yapan Tür Hücredeki Derişimi (M) L- Aspartik asit 1, L- Askorbik asit 1, Kreatinin 1, Parasetamol 1, Üre 8, Ürik asit 5,

62 Tekrar kullanılabilirlik ve tekrar üretilebilirlik NiO/GOx/CPE nin tekrar kullanılabilirliğini incelemek için, hazırlanan enzim elektrodun ard arda 3 kez glukoz derişimine karşı kalibrasyon grafiği çizildi ve elde edilen duyarlıkların bağıl standart sapması hesaplandı. Enzim elektrodun tekrar üretilebilirliği de 5 ayrı enzim elektrodun glukoza karşı duyarlıklarının belirlenmesi ile çalışıldı. Bu amaçla her bir elektrot için elde edilen duyarlıkların bağıl standart sapma değeri hesaplandı NiO/GOx/CPE nin raf ömrü NiO/GOx/CPE nin ömrünü belirlemek amacı ile hazırlanan enzim elektrot 0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu içinde +0,4 V potansiyelde bekletildi. 1, M stok glukoz çözeltisinden hesaplanan miktarlarda ortama ilaveler yapıldı ve amperometrik cevaplar kaydedildi. Akım farkları glukoz derişimine karşı grafiğe geçirilerek duyarlık belirlendi Aynı enzim elektrot ile belli periyotlarla farklı günlerde yukarıda anlatıldığı gibi amperometrik ölçümler alındı. Bulunan duyarlıklar güne karşı grafiğe geçirildi ve elektrodun duyarlığının zamanla nasıl değiştiği incelenerek elektrot ömrü belirlendi NiO/GOx/CPE ile serumda glukoz tayini NiO/GOx/CPE ile serumda glukoz tayini yapmak için Gazi Üniversitesi Biyokimya Laboratuvarı ndan farklı derişimlerde glukoz içeren 4 adet serum örneği temin edildi. Serum örnekleri iki şekilde kullanıldı: İlkinde %10 luk trikloroasetik asit çözeltisi serum örneğine ilave edilerek serumda bulunan proteinler çöktürüldü. İkinci olarak ise serum örnekleri herhangi bir ön işlemden geçirilmeden doğrudan analiz için kullanıldı. NiO/GOx/CPE ile proteinli ve proteinsiz serum örneklerinde glukoz tayini standart katma yöntemi kullanılarak yapıldı. Bunun için, hazırlanan enzim elektrot, 5,0 ml 0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu içerisine daldırıldı ve Ag/AgCl e karşı +0,4 V da kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletildi. Serum örneğinden 25 µl hücreye eklendi, 49

63 ortamdan oksijen gazı geçirildikten sonra +0,4 V da amperometrik ölçüm alındı. Ardından aynı hücreye belli derişimde glukoz çözeltisinden ilaveler yapıldı ve her bir ekleme sonrası oksijen gazı geçirildi. Hesaplanan akım farkları glukoz derişimine karşı grafiğe geçirildi. Çizilen standart katma eğrisinden yararlanılarak serumdaki glukoz derişimi hesaplandı. Hazırlanan enzim elektrot kullanılarak elde edilen sonuçlar hastane sonuçları ile veri çifti t testi analizi yapılarak karşılaştırıldı. Her bir serum örneği için en az 3 tane ölçüm alındı ve bu ölçümlerin standart sapma değerleri hesaplandı. 50

64 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Bu tez çalışmasında, glukozun amperometrik tayini için NiO nanopartikülü içeren karbon pasta enzim elektrotların geliştirilmesi amaçlandı. Bunun için NiO nanopartikülleri grafit tozu ile karıştırıldı ve bu karışıma glukoz oksidaz enzimi ilave edildi. Hazırlanan enzim elektrodun optimum çalışma koşulları ve performans faktörleri belirlendi. Elde edilen sonuçlar ve yorumlar aşağıda sunuldu. 4.1 Glukoz Tayini için Karbon Pasta Elektrot Bu çalışmada glukozun amperometrik tayini için karbon pasta enzim elektrotlar hazırlandı. Bu amaçla NiO nanopartikülleri, grafit tozu, parafin yağı ve enzim çözeltisinin belirli miktarları karıştırılarak NiO ile modifiye edilmiş karbon pasta enzim elektrotlar elde edildi. Biyosensörlerde electron transferinin ve duyarlığın artırılması için genellikle iletken veya yarı iletken metal nanopartiküllerden yararlanılmaktadır (Jianrong vd. 2004). Nanopartiküller sahip oldukları nano boyutlar sayesinde enzimin aktif bölgesi ile elektrot arasındaki mesafeyi azaltarak e - aktarımını kolaylaştırır ve daha düşük potansiyellerde çalışma olanağı sunarak girişim yapan elektroaktif türlerin bozucu etkisini önler (Murphy 2006). Literatür araştırması sonucunda NiO nanopartikülü içeren enzim elektrotlarla ilgili çok fazla çalışma bulunmadığı belirlenmiştir. Yapılan bazı çalışmalarda ise seçilen yöntemin, kullanılan elektrotların ve tayin edilen türün farklı olduğu görülmüştür. Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda çalışma elektrodu olarak genellikle GCE ve ITO cam elektrotlar tercih edilmiştir (Salimi vd. 2007, Li vd. 2008, Luo vd. 2009). Bu çalışmada ise maliyeti düşük ve hazırlanması kolay olduğu için karbon pasta elektrot kullanılmıştır. Ayrıca NiO nanopartikülleri ile geliştirilen biyosensörlerin bir kısmı enzimatik olmayan reaksiyonlara dayanmaktadır (Watanabe ve Einaga 2009, Mu vd. 2010, Wang vd. 2010). Bu çalışmada ise GOx enziminin, O 2 varlığında, glukozu glukonikasite katalizleme reaksiyonu esas alınmıştır: 51

65 Glukoz + O Glukonolakton + H O GOx Bu reaksiyonda harcanan O 2 ve oluşan H 2 O 2 derişimi glukoz derişimi ile orantılıdır. Bundan yararlanarak O 2 derişimindeki azalma veya H 2 O 2 derişimindeki artmanın incelenmesi ile glukoz tayin edilebilir (Fang vd. 2003). Amperometrik tayin, yukarıdaki reaksiyon sonucu oluşan H 2 O 2 nin elektrot yüzeyinde belli bir potansiyelde moleküler O 2 ye yükseltgenmesine dayanmaktadır (Heller 1996): H O O + 2H + 2e Glukoz tayini için hazırlanan karbon pasta enzim elektrodun çalışma prensibi şekil 4.1 de verilmektedir: Şekil 4.1 Glukoz tayini için hazırlanan enzim elektrodun çalışma prensibi (GOx (yük) ve GOx (ind) enzimin yükseltgenmiş ve indirgenmiş hallerini göstermektedir) Hazırlanan enzim elektrodun glukoza olan duyarlığını birçok parametre etkileyebilir. Bu amaçla cevap üzerine ph nın, sıcaklığın, tampon cinsi ve derişiminin, nanopartikül miktarının, enzim miktarının, glukozderişiminin etkisi çalışıldı. Ayrıca enzim elektrodun ömrü, tekrar kullanılabilirliği ve üretilebilirliği, cevap süresi gibi performans faktörleri belirlendi. Optimum çalışma koşulları belirlendikten sonra, serumda bulunabilecek ve cevap üzerine bozucu etki yapabilecek bazı türlerin etkisi incelendi. Son olarak hazırlanan enzim elektrodun serum numunelerinde glukoz tayini için kullanılıp kullanılamayacağı araştırıldı. Elde edilen sonuçlar ve yorumlar aşağıda verilmiştir. 52