ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Kolesterolün ve fenolik bileşiklerin tayini için amperometrik enzim elektrotların hazırlanması Derya KOYUNCU ZEYBEK KİMYA ANABİLİM DALI ANKARA 2010 Her hakkı saklıdır

2 TEZ ONAYI Derya KOYUNCU ZEYBEK tarafından hazırlanan Kolesterolün ve Fenolik Bileşiklerin Tayini için Amperometrik Enzim Elektrotların Hazırlanması adlı tez çalışması 19/10/2010 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği/oy çokluğu ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı nda DOKTORA TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI Jüri Üyeleri: Başkan: Prof. Dr. Selma ATEŞ Gazi Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Üye: Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü Üye: Prof. Dr. Esma KILIÇ Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü Üye: Prof. Dr. Ahmet YAŞAR Gazi Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Üye: Prof. Dr. Y. Murat ELÇİN Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü Yukarıdaki sonucu onaylarım. Prof. Dr. Orhan ATAKOL Enstitü Müdürü

3 ÖZET Doktora Tezi KOLESTEROLÜN VE FENOLİK BİLEŞİKLERİN TAYİNİ İÇİN AMPEROMETRİK ENZİM ELEKTROTLARIN HAZIRLANMASI Derya KOYUNCU ZEYBEK Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI Bu çalışmada, kolesterol ve fenolik bileşiklerin amperometrik tayini için polimer film temelli amperometrik biyosensörler hazırlandı. Bu amaçla, platin elektrotlar o-fenilendiamin (opd) veya opd ve 3-metiltiyofen (3MT) içeren asetonitril-su ortamı kullanılarak dönüşümlü voltametri tekniği ile polimer filmlerle kaplandı. Kolesterol oksidaz (COx) veya polifenol oksidaz (POx) enzimleri Pt/PoDP ve Pt/PoPD-3MT elektrotların yüzeyine immobilize edildi. Pt/PoPD/COx ve Pt/PoPD-3MT/POx elektrotların sırasıyla kolesterol ve fenolik bileşiklerin tayini için uygun oldukları gözlendi ve optimizasyon çalışmaları bu enzim elektrotları kullanılarak yapıldı. Kolesterol tayini enzimatik olarak oluşan hidrojen peroksidin Ag/AgCl e karşı +0,70 V da yükseltgenmesine dayanılarak yapıldı. Pt/PoPD/COx enzim elektrodu için optimum tampon cinsi, tampon derişimi, ph sı, optimum çalışma sıcaklığı sırasıyla fosfat tamponu; 0,05 M; 7,5 ve 40 C olarak belirlendi. Enzim elektrodun, kolesterol için doğrusal çalışma aralığı 9, , mm, gözlenebilme sınırı 9, mm, cevap süresi 150 s ve raf ömrü yaklaşık bir hafta olarak bulundu. Kolesterol oksidaz enzim elektrot üzerine gerçek numunelerde bulunan bazı muhtemel bozucu türlerin etkisi incelendi. Serum numunelerinde toplam kolesterol tayini hazırlanan Pt/PoPD/COx enzim elektrot kullanılarak yapıldı ve sonuçların spektroskopik olarak elde edilen sonuçlarla uyumlu olduğu görüldü. Fenolik bileşikler, enzimatik olarak oluşan o-kinonun Ag/AgCl e karşı 0,20 V da indirgenmesi yolu ile ölçüldü ve pirokateşol model substrat olarak kullanıldı. Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrot için optimum tampon cinsi, derişimi, ph sı, optimum çalışma sıcaklığı ve optimum çalışma potansiyeli sırasıyla fosfat tamponu; 0,10 M; 7,0; 25 C ve Ag/AgCl e karşı 0,20 V olarak belirlendi. Enzim elektrodun, pirokateşol için doğrusal çalışma aralığı 1, , mm, alt tayin sınırı 1, mm, cevap süresi 100 saniye ve raf ömrü yaklaşık 2 hafta olarak bulundu. Ayrıca, enzim elektrodun bazı diğer fenolik bileşikler için duyarlıkları karşılaştırıldı ve standart referans maddede toplam fenolik bileşiklerin tayini yapıldı. Ekim 2010, 137 sayfa Anahtar Kelimeler: Amperometri, Biyosensör, Enzim elektrot, Kolesterol, Fenolik bileşikler, Poli(o-fenilendiamin), 3-Metiltiyofen i

4 ABSTRACT Ph D Thesis Preparation of amperometric enzyme electrodes for determination of cholesterol and phenolic compounds Derya KOYUNCU ZEYBEK Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI In this study, the polymer-based amperometric biosensors were prepared for amperometric detection of cholesterol and phenolic compounds. For this purpose, platinum electrodes were coated by polymer films from asetonitrile-water media containing o-phenylendiamine (opd) or o-pd and 3-methylthiophene (3MT) with the cyclic voltammetry technique. Cholesterol oxidase (COx) or polyphenol oxidase (POx) enzymes were immobilized on to the surface of Pt/PoPD and Pt/PoPD-3MT electrodes. It was observed that Pt/PoPD/COx and Pt/PoPD-3MT/POx electrodes were appropriate for determination of cholesterol and phenolic compounds, respectively and these electrodes were used for optimization studies. The determination of cholesterol was performed via monitoring oxidation current of enzymatically produced H 2 O 2 at V vs. Ag/AgCl. Optimum buffer type, concentration, ph and optimum working temperature were determinated as phosphate, 0.05 M, 7.5 and 40 C, respectively for Pt/PoPD/COx named enzyme electrode. It was determined the linear working ranges of Pt/PoPD/COx enzyme electrode to cholesterol as mm, detection limit as mm, response time as 150 s and life time as about one week. The effects of possible interference species present in real samples on cholesterol oxidase enzyme electrode were examined. Analysis of total cholesterol in serum samples were performed by using proposed Pt/PoPD/COx enzyme electrode and good correlation was obtained between enzyme electrode results and those obtained by spectroscopic methods. Phenolic compounds were estimated by reduction of enzymatically liberated o-quinone at V vs. Ag/AgCl and pyrocatechol was used as a substrate model. Optimum buffer type, concentration, ph, optimum working temperature, optimum working potential were determinated as phosphate, 0.10 M, 7.0, 25 C and V vs. Ag/AgCl, respectively for Pt/PoPD-3MT/POx enzyme electrode. It was determined the linear working ranges of enzyme electrode for pirocatechol as mm, detection limit as mm, response time as 100 s and life time as about two weeks. Additionally, the sensitivity of enzyme electrode for many other phenolic compounds was compared and total phenolic compounds detection was performed in reference standard sample. October 2010, 137 pages Key Words: amperometry, biosensor, cholesterol, enzyme electrode, phenolic compounds, poly(o-phenylenediamine), 3-methylthiophene ii

5 TEŞEKKÜR Tez çalışmam boyunca bana her türlü imkânı sağlayan, benden desteğini ve yardımı esirgemeyen ve hayata dair önemli deneyimlerini benimle paylaşan değerli danışman hocam Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI ya, Ankara Üniversitesi ne ilk geldiğim günden itibaren, bana laboratuvarını açan, her konuda yardımını ve desteğini gördüğüm ve her türlü problemimde bana çözüm yolu gösteren değerli hocam ve TİK üyem Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyesi Sayın Prof.Dr. Esma KILIÇ a, Çalışmalarım sırasında yardımını benden esirgemeyen TİK üyem Gazi Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. Ahmet YAŞAR a, 106T359 nolu proje kapsamında gerekli cihaz ve kimyasal maddeleri sağlayan TÜBİTAK a, Bana göstermiş olduğu sabır, ilgi ve destekten dolayı çalışma arkadaşım ve eşim Arş. Gör. Dr. Bülent ZEYBEK e Tüm yaşamım boyunca hem maddi hemde manevi olarak yanımda olan AİLEME sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Derya KOYUNCU ZEYBEK Ankara, Ekim 2010 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... viii ŞEKİLLER DİZİNİ... xi ÇİZELGELER DİZİNİ... xiii 1. GİRİŞ ve AMAÇ Kolesterol Biyosensörleri ile İlgili Kaynak Araştırması Fenolik Bileşik Biyosensörleri ile İlgili Kaynak Araştırması Poli(o-fenilendiamin) ile İlgili Kaynak Araştırması Poli(3-metiltiyofen) ile İlgili Kaynak Araştırması KURAMSAL TEMELLER Biyosensörler Amperometrik enzim elektrotlar Polimer temelli amperometrik enzim elektrotlar Biyosensörlerde kullanılan immobilizasyon teknikleri İdeal biyosensörün özellikleri Enzimler Enzimatik reaksiyon hızına etki eden faktörler İmmobilize Enzimler Kolesterol Oksidaz ve Kolesterol Esteraz Enzimlerinin Özellikleri Polifenol Oksidaz Enziminin Özellikleri Kolesterol Tayininin Önemi ve Enzim Elektrot Geliştirilmesi Fenolik Bileşiklerin Tayinlerinin Önemi ve Enzim Elektrot Geliştirilmesi MATERYAL ve YÖNTEM Kullanılan Cihazlar Elektrokimyasal Hücre ve Elektrotlar Kullanılan Kimyasallar Argon gazı Oksijen gazı Kullanılan enzimler ve diğer kimyasallar iv

7 3.4 Serum Numunesi Referans Fenol Standardı Kullanılan Çözeltiler Fosfat tamponu TRIS tamponu Elektropolimerizasyon çözeltisi Referans elektrot iç dolgu çözeltisi Enzim çözeltileri Kolesterol çözeltisi Fenolik bileşik çözeltileri Girişim çalışmalarında kullanılan çözeltiler Hidrojen peroksit çözeltisi Platin Disk Elektrotların Temizlenmesi Elektropolimerizasyon ile Modifiye Elektotların Hazırlanması Pt, Pt/PoPD ve Pt/PoPD-3MT elektrotların hidrojen perokside duyarlıkların belirlenmesi Kolesterol Tayini için Enzim Elektrotların Hazırlanması Pt/PoPD/COx ve Pt/PoPD-3MT/COx enzim elektrotların kolesterole duyarlıklarının belirlenmesi Kolesterol enzim elektrodun en iyi çalışma koşullarının ve performans faktörlerinin belirlenmesi Tampon cinsi Tampon derişimi ph Sıcaklık Cevap süresi Tekrar kullanılabilirlik ve tekrar üretilebilirlik Ömür Kolesterol derişiminin etkisi Serbest kolesterol oksidaz varlığında Pt/PoPD elektrodun kolesterole duyarlığının belirlenmesi Pt/PoPD/COx enzim elektrodun cevabı üzerine çeşitli türlerin etkisinin belirlenmesi Pt/PoPD/COx enzim elektrot ile serumda kolesterol tayini Fenolik Bileşiklerin Tayini için Enzim Elektrotların Hazırlanması v

8 Pt/PoPD/POx ve Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrotlarının pirokateşole duyarlıklarının belirlenmesi Fenolik bileşik enzim elektrodunun en iyi çalışma koşullarının ve performans faktörlerinin belirlenmesi Tampon cinsi Tampon derişimi ph Sıcaklık Çalışma potansiyeli Cevap süresi Tekrar kullanılabilirlik ve tekrar üretilebilirlik Ömür Pirokateşol derişiminin etkisi Serbest polifenol oksidaz varlığında Pt/PoPD-3MT elektrodun pirokateşole duyarlığının belirlenmesi Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodun diğer fenolik bileşiklere duyarlıklarının belirlenmesi Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodu ile standart referans maddede bulunan toplam fenolik bileşiklerin tayini ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Polimer Film Kaplı Elektrotların Hazırlanması Kolesterol Enzim Elektrodu Pt, Pt/PoPD ve Pt/PoPD-3MT elektrotların hidrojen perokside duyarlığı Pt/PoPD/COx ve Pt/PoPD-3MT/COx enzim elektrotların kolesterole duyarlığı Pt/PoPD/COX enzim elektrodun en iyi çalışma koşulları ve performans faktörleri Tampon cinsi Tampon derişimi ph Sıcaklık Cevap süresi Tekrar kullanılabilirlik ve tekrar üretilebilirlik Ömür Kolesterol derişimi vi

9 4.2.5 Pt/PoPD elektrodun serbest kolesterol oksidaz varlığında kolesterole duyarlığı Pt/PoPD/COx enzim elektrodun cevabı üzerine çeşitli türlerin etkisi Pt/PoPD/COx enzim elektrodu ile serumda kolesterol tayini Fenolik Bileşik Enzim Elektrodu Pt/PoPD/POx ve Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrotların pirokateşole duyarlığı Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodun en iyi çalışma koşulları ve performans faktörleri Tampon cinsi Tampon derişimi ph Sıcaklık Çalışma potansiyeli Cevap süresi Tekrar kullanılabilirlik ve tekrar üretilebilirlik Ömür Pirokateşol derişimi Pt/PoPD-3MT elektrodun serbest polifenol oksidaz varlığında pirokateşole duyarlığı Pt/PoPD-3MT/POX enzim elektrodun diğer fenolik bileşiklere duyarlığı Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodu ile standart maddedeki fenolik bileşiklerin tayini SONUÇLAR KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ vii

10 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ µm mikromolar µmol mikromol 3MT 3-metiltiyofen A Amper CEt Kolesterol esteraz cm 2 Santimetre kare COx Kolesterol oksidaz COx ind COx yük CSA ÇDKNT DKE dl dm E ind E yük FAD FADH 2 Fe 3 O 4 FeMC FET GA GOx H 2 O 2 H 3 PO 4 HCl HPLC ISFET ITO kd İndirgenmiş kolesterol oksidaz Yükseltgenmiş kolesterol oksidaz (±)-10-kamforsülfonik asit Çok duvarlı karbon nanotüp Doygun kalomel elektrot Desilitre Desimetre İndirgenmiş enzim Yükseltgenmiş enzim Flavin adenin dinükleotit İndirgenmiş flavin adenin dinükleotit Demir(II, III) oksit Ferrosen karboksilik asit Alan etki transistörleri Glutaraldehit Glukoz oksidaz Hidrojen peroksit Fosforik asit Hidroklorik asit Yüksek performanslı sıvı kromatografisi İyon seçici alan etki transistörleri İndiyum kalay oksit Kilodalton viii

11 K m Li 2 CO 3 M ma mg M ind mm mmol mv M yük Na 2 HPO 4.7H 2 O NAD + NADH NaH 2 PO 4.2H 2 O NaOH nm nm opd P(NMPY)-PTS PANI ph PoPD POx POx ind POx yük Pt S s SiO 2 SPR T3A TEAP Michaelis-Menten sabiti Lityum karbonat Molar Miliamper Miligram İndirgenmiş medyatör Milimolar Milimol Milivolt Yükseltgenmiş medyatör di-sodyum monohidrojenfosfat heptahidrat Nikotinamit adenin dinükleotidin yükseltgenmiş şekli Nikotinamit adenin dinükleotidin indirgenmiş şekli Sodyum dihidrojenfosfat dihidrat Sodyum hidroksit Nanometre Nanomolar o-fenilendimin Poli-N-metilpirol-p-toluen sülfonat Polianilin Hidrojen iyonu derişiminin eksi logaritması Poli(o-fenilendimin) Polifenol oksidaz İndirgenmiş polifenol oksidaz Yükseltgenmiş polifenol oksidaz Platin Substrat Saniye Silisyum dioksit Yüzey plazmon rezonans Tiyofen 3-asetik asit Tetraetilamonyum perklorot ix

12 TRIS TTF-TCNQ U UV-VIS Ü V Tris(hidroksimetil)aminometan N-metilfenazinyum tetrasiyanokinodimetan Enzim ünitesi Ultraviyole-görünür spektroskopi Ürün Volt x

13 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Biyosensörün şematik gösterimi Şekil 2.2 Şekil 2.3 Amperometrik enzim elektrotların gelişim aşamalarına göre sınıflandırılması (M yük ve M ind yükseltgenmiş ve indirgenmiş medyatör, E yük ve E ind yükseltgenmiş ve indirgenmiş enzim, S ve Ü substrat ve ürün) Kolesterol oksidaz tarafından katalizlenen reaksiyon basamakları ve reaksiyonda yer alan bileşikler Şekil 2.4 Kolesterolün kimyasal formülü Şekil 2.5 Bazı fenolik bileşiklerin kimyasal formülleri Şekil 4.1 PoPD film oluşumu sırasında gözlenen çok döngülü voltamogram (0,10 M opd ve 0,20 M CSA içeren % 94 asetonitril-% 6 su ortamı, ( 0,4)- (2,2) V, 0,025 V/s, 50 döngü) Şekil 4.2 PoPD-3MT film oluşumu sırasında gözlenen çok döngülü voltamogram (0,10 M opd, 0,20 M 3MT ve 0,20 M CSA içeren % 94 asetonitril-% 6 su ortamı, ( 0,4 V)-(2,2) V, 0,025 V/s, 50 döngü) Şekil 4.3 Amperometrik kolesterol tayininin elektrot reaksiyon mekanizması Şekil 4.4 Pt/PoPD elektrodun hidrojen perokside duyarlığı (0,05 M ph 7,5 fosfat tamponu, +0,70 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.5 Pt/PoPD-3MT elektrodun hidrojen perokside duyarlığı (0,05 M ph 7,5 fosfat tamponu, +0,70 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.6 Modifiye edilmemiş Pt elektrodun hidrojen perokside duyarlığı (0,05 M ph 7,5 fosfat tamponu, +0,70 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.7 Pt/PoPD/COx enzim elektrodun kolesterole duyarlığı (0,05 M ph 7,5 fosfat tamponu, +0,70 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.8 Pt/PoPD-3MT/COx enzim elektrodunun kolesterole duyarlığı (0,05 M ph7,5 fosfat tamponu, +0,70 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.9 Pt/PoPD/COx enzim elektrodun cevabına tampon cinsinin etkisi: a. 0,05 M ph 7,5 fosfat tamponu, b. 0,05 M ph 7,5 TRIS tamponu (+0,70 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.10 Pt/PoPD/COx enzim elektrodun cevabına tampon derişiminin etkisi (ph 7,5 fosfat tamponu, +0,70 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.11 Pt/PoPD/COx enzim elektrodun cevabına tampon ph sının etkisi (ph 0,05 M fosfat tamponu, +0,70 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.12 Pt/PoPD/COx enzim elektrodun cevabına sıcaklığın etkisi (0,05 M ph 7,5 fosfat tamponu, +0,70 V) Şekil 4.13 Pt/PoPD/COx enzim elektrodun cevap süresi: a. 1, M kolesterol ve b. 1, M kolesterol (0,05 M ph 7,5 fosfat tamponu, +0,70 V, oda sıcaklığı) xi

14 Şekil 4.14 Pt/PoPD/COx enzim elektrodun ömrü (ph 0,05 M ph 7,5 fosfat tamponu, +0,70 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.15 Pt/PoPD/COx enzim elektrodun cevabına kolesterol derişiminin etkisi (0,05 M ph 7,5 fosfat tamponu, 0,70 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.16 Pt/PoPD/COx enzim elektrodu ile farklı derişim aralığında elde edilen kalibrasyon grafikleri (0,05 M ph 7,5 fosfat tamponu, 0,70 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.17 a. Pt/PoPD elektrodun serbest kolesterol oksidaz varlığında kolesterole cevabı b. Pt/PoPD/COx enzim elektrodun kolesterole cevabı (0,05 M ph 7,5 fosfat tamponu, +0,70 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.18 Serumda kolesterol tayininde yöntemlerin uyumluluğu Şekil 4.19 Amperometrik pirokateşol tayininin elektrot reaksiyon mekanizması Şekil 4.20 a. Pt/PoPD/POx enzim elektrodun pirokateşole duyarlığı b. Pt/PoPD- 3MT/POx enzim elektrodun pirokateşole duyarlığı (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, 0,20 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.21 Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodun cevabına tampon cinsinin etkisi: a. 0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, b. 0,10 M ph 7,0 TRIS tamponu ( 0,20 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.22 Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodun cevabına tampon derişiminin etkisi (ph 7,0 fosfat tamponu, 0,20 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.23 Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodun cevabına tampon ph sının etkisi (0,10 M fosfat tamponu, 0,20 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.24 Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodun cevabına sıcaklığın etkisi (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, 0,20 V) Şekil 4.25 Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodun cevabına çalışma potansiyelinin etkisi (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, oda sıcaklığı) Şekil 4.26 Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodun cevap süresi: a. 1, M pirokateşol, b. 1, M pirokateşol (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, 0,20 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.27 Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodun ömrü (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, 0,20 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.28 Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodun cevabına pirokateşol derişimin etkisi (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, 0,20 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.29 Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodu ile elde edilen kalibrasyon grafiği (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, 0,20 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.30 a. Pt/PoPD-3MT elektrodun serbest enzim varlığında pirokateşole duyarlığı b. Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodun pirokateşole duyarlığı (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, 0,20 V, oda sıcaklığı) Şekil 4.31 Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodun diğer fenolik bileşiklere duyarlığı (0,10 M ph 7,0 fosfat tamponu, 0,20 V, oda sıcaklığı) xii

15 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1.1 Kolesterol biyosensörlerinin karşılaştırılması... 8 Çizelge 1.2 Fenonik bileşik biyosensörlerinin karşılaştırılması Çizelge 2.1 Biyosörlerle tayin edilebilen analitler ve biyosensörlerde kullanılan biyobileşenler ve transduserler Çizelge 2.2 Elektrokimyasal transduser tipleri ve analizi yapılabilecek türler Çizelge 2.3 İmmobilizasyon yöntemlerinin avantaj ve dezavantajları Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan enzimler, IUPAC kodları, kaynakları, üniteleri ve temin edildikleri firmalar Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan diğer kimyasalların adları, temin edildikleri firmalar, katalog numaraları ve saflık dereceleri Çizelge 3.3 Elektropolimerizasyon koşulları Çizelge 3.4 Girişim etkisi incelenen türler ve ortamdaki derişimleri Çizelge 4.1 Çeşitli türlerin kolesterol enzim elektrodun cevabı üzerine etkisi Çizelge 4.2 Pt/PoPD/COx enzim elektrot kullanılarak kan numunesinde tayin edilen kolesterol miktarı Çizelge 4.3 Pt/PoPD/COx enzim elektrodun çalışma koşulları ve performans faktörleri Çizelge 4.4 Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrot kullanılarak standart maddede tayin edilen fenolik bileşiklerin toplam miktarı Çizelge 4.5 Pt/PoPD-3MT/POx enzim elektrodun çalışma koşulları ve performans faktörleri xiii

16 1. GİRİŞ ve AMAÇ Biyosensörler, tıp, eczacılık, ziraat, gıda sektörü ve çevresel kirlilik analizi gibi değişik alanlarda kullanım alanı bulan enzim, doku, mikroorganizma, antikor, hücre reseptörleri gibi biyolojik materyallerin, optik, elektrokimyasal, termometrik, piezoelektrik ya da manyetik temelli fizikokimyasal bir transduser ya da iletici bir mikrosistem ile birleştirilmesiyle oluşturulan analitik cihazlardır (Sharma vd. 2003, Castillo vd. 2004). Günümüze kadar geliştirilen pek çok biyosensör, elektrokimyasal esaslı transduser genellikle de amperomeri esaslı transduser kullanan biyosensörlerdir. Amperometri, elektroaktif türlerin elektrokimyasal yükseltgenmesi ya da indirgenmesiyle oluşan akımın ölçümü üzerine temellenmektedir. Bu, genellikle bir referans elektroda karşı platin, altın ya da karbon çalışma elektroduna sabit bir potansiyel uygulanarak yapılır. Elde edilen akım, doğrudan elektroaktif türlerin derişimi ya da biyokatalitik tabaka içindeki üretim ya da tüketim hızları ile orantılıdır (Thevenot vd. 1999). Amperometri temelli enzim elektrotlar ise uygun elektrotlara immobilizasyon teknikleri kullanılarak biyobileşen ya da biyomolekül olarak enzimlerin immobilizasyonu ile oluşturulmakta ve özellikle klinik ve çevresel analizlerde sıklıkla kullanılmaktadır (Castillo vd. 2004). Kolesterol ve onun yağ asiti esterleri memeli membranlarının temel bileşenidir. Kolesterol aynı zamanda safra asitleri, D vitamini ve steroit hormonlar gibi bazı biyolojik materyallerin öncül molekülüdür (Arya vd. 2008). Ancak, kolesterolün fazlası yağ asit esterleri halinde atar damarlarda biriktiği için kalp krizi ve inmelere yol açar (Özer vd. 2007). Normal insan kan plazması mg/dl kolesterol içermektedir. Bunun 2/3 ü yağ asitleri ile esterleşmiş durumda geri kalanı ise steroit yapısında bulunmaktadır. Kanda yüksek kolesterol seviyesi damar sertliği, yüksek tansiyon ve miyokardiyal enfarktüs gibi durumlarla ilişkilidir ve bu durumların klinik teşhisi ve önlenmesi için kolesterolün tayini çok önemlidir (Wang ve Mu 1999). Kolesterolün tayini için HPLC, gaz-sıvı kromatografi ve spektrofotometrik yöntemler duyarlı ve seçici analizler sunarken, bu yöntemler hızlı ve düşük maliyetli analizler için uygun değildir. Amperometrik enzim elektrotlar, yüksek duyarlık, geniş doğrusal çalışma 1

17 aralığı, yüksek kararlılık, hızlı cevap ve düşük maliyet gibi avantajlar sunmalarına bağlı olarak, diğer yöntemlere önemli bir alternatiftir (Singh vd. 2006a). Günümüze kadar serbest ve toplam kolesterolün tayini için pek çok biyosensör geliştirilmiştir. Serbest kolesterolün tayini için geliştirilen amperometrik biyosensörlerde biyobileşen olarak kolesterol oksidaz enzimi (Bongiovanni vd. 2001, Brahim vd. 2001, Shumyantseva vd. 2004, Vidal vd. 2004a, Özer vd. 2007, Solanki vd. 2007a, Khan vd. 2009, Türkaslan vd. 2009), toplam kolesterolü belirlemek için ise, kolesterol oksidaz yanında esterleşmiş kolesterolün hidrolizini katalizleyen kolesterol esteraz enzimi de (Nakaminami vd. 1999, Singh vd. 2004a, 2006a, b, Hooda vd. 2009, Shih vd. 2009) kullanılmaktadır. Ayrıca, toplam veya serbest kolesterolün tayini için optik (Marazuela vd. 1997, Arya vd. 2007a, Dhand vd. 2007, Singh vd. 2007) ve akustik dalga (Martin vd. 2003) esaslı biyosensörler de geliştirilmiştir. Fenolik bileşikler, doğada çok yaygın olarak bulunur. Bu bileşikler aynı zamanda kimyasal atık olarak çevreye salınarak ortamı kirletirler. Çevre kirliliğine yol açan bu toksik maddeler deri ve mukoz membran yolu ile kolayca adsorbe olarak akciğer, karaciğer, böbrek ve üreme sisteminde hasarlara neden olurlar (Shan vd. 2009). Bu nedenle fenolik bileşiklerin çevre, gıda ve endüstriyel örneklerde tayinleri oldukça önemlidir. Fenolik bileşiklerin tayinleri için gaz kromatografi ve spektrofotometri gibi yöntemler mevcuttur (Bagheri vd. 2004, Lupetti vd. 2004, Faraji 2005). Ancak, bu yöntemler karmaşık örnek hazırlama işlemleri içerir ve yerinde uygulamalar için uygun değildir. Yüksek seçicilik özelliğine sahip olan polifenol oksidaz enziminin kullanıldığı amperometrik biyosensörler hızlı ve duyarlı tayin için bir alternatiftir (Shan vd. 2007). Günümüze kadar çeşitli fenolik bileşiklerin tayinleri için pek çok amperometrik biyosensör geliştirilmiştir (Védrine vd. 2003, Dempsey vd. 2004, Rajesh vd. 2004, 2005, Rajesh ve Kaneto 2005, Shan vd. 2007). Bu tez çalışmasında klinik tanı ve çevre kirliliği açısından önemli olan kolesterol ve fenolik bileşiklerin amperometrik olarak tayinleri için, polimer film kaplı elektrotlar kullanılarak, iki farklı enzim elektrot geliştirilmesi amaçlandı. Bunun için o- 2

18 fenilendiamin (opd) veya opd ve 3-metiltiyofen (3MT) içeren monomer çözeltileri kullanılarak platin elektrotlar üzerine elektropolimerizasyon yolu ile polimer filmlerin kaplanmasına karar verildi. Hazırlanan polimer film elektrotlara ayrı ayrı kolesterol oksidaz (COx) ve polifenol oksidaz (POx) enzimleri immobilize edildi. Kolesterol oksidaz (COx) enzimi, oksijen varlığında, steroit halkasının 5-6 trans çift bağına sahip 3 -hidroksisteroitlerin yükseltgenmesini ve izomerizasyonunu katalizler ve reaksiyon sonucunda (Arya vd. 2008): 4-3-ketosteroit (Kolest-4-en-3-on) ve hidrojen peroksit oluşur Kolesterol + O Kolest-4-en-3-on + H O COx Kolesterol tayininin aşağıda verilen enzimatik reaksiyon sonucunda oluşan hidrojen peroksidin yükseltgenmesine dayanılarak yapılması düşünüldü. H2O2 O 2+ 2H + 2e + - Polifenol oksidaz (POx) veya tirozinaz enzimi oksijen varlığında monofenollerin pirokateşollere hidroksilasyonunu ve kateşollerinde o-kinonlara yükseltgenmesini katalizler: POx Fenol + O 2 Pirokateşol (Kateşol) Pirokateşol (Kateşol) + O o-kinon + H O POx 2 2 Reaksiyon sonucunda oluşan o-kinonlar ise hiçbir elektron medyatörü olmaksızın düşük potansiyellerde (Ag/AgCl e karşı 0,20 V gibi) o-difenollore indirgenir (Liu vd. 2003). Bu tez çalışmasında bu reaksiyon kullanılarak fenolik bileşiklerin tayininin yapılmasının uygun olacağı düşünüldü. o + - kinon + 2H + 2e Pirokateşol (Kateşol) 3

19 Bu çalışmada ayrıca, hazırlanan enzim elektrotların çalışma koşullarının ve performans faktörlerinin belirlenmesi, gerçek numunelerde bulunabilecek girişim yapan türlerin amperometrik cevaba etkisi ve ilgili türlerin tayininde kullanılabilirliği ile ilgili çalışmalar da yapıldı. 1.1 Kolesterol Biyosensörleri ile İlgili Kaynak Araştırması Serbest ve toplam kolesterolün tayini için günümüze kadar çeşitli yöntemler kullanılarak geliştirilen biyosensörlerin özeti aşağıda sunulmaktadır: Kolesterol tayini için geliştirilen biyosensörler çoğunlukla optik ve elektrokimyasal esaslı biyosensörlerdir. Optik yöntemlerin doğruluğunun yüksek olmasından dolayı, kolesterol tayini için geliştirilen pek çok optik temelli biyosensör mevcuttur. Marazuela vd. (1997) 620 nm dalga boyunda çalışarak kolesterol derişiminin bir fonksiyonu olarak rutenyum(ii) kompleksinin lüminesansındaki değişimi izleyerek optik esaslı kolesterol biyosensörü hazırlamışlardır. Law vd. (1997) tarafından yapılan bir çalışmada, kullanılan boyanın rengindeki ve şiddetindeki değişim üzerine temellenmiş bir çalışma ile kolesterol derişimini belirlemişlerdir. Enzimatik reaksiyonları içeren spektrofotometrik tekniklerde ise, 4-aminoantipirin, o-dianisidin ve 4-aminofenazon gibi boyaların yükseltgenmesine karşı analit derişimindeki artış sonucunda oluşan rengin şiddetinin belirlenmesi esas alınmıştır (Malik ve Pundir 2002, Suman Pundir 2003, Singh vd. 2004b, 2006b, 2007, Arya vd. 2007a). Wu ve Choi (2003) tarafından bir optik oksijen transduseri kullanarak, oksijen molekülleri ile kompleks oluşturan rutenyum(ii) nin floresans sönmesine dayanan kolesterol biyosensörü geliştirilmiştir. Kouassi vd. (2005) tarafından enzimatik reaksiyon sırasında oluşan 4-kolesten-3-on için absorpsiyon şiddetindeki değişiklik izlenerek kolesterol tayini için spektrofotometrik yöntem önerilmiştir. Optik transduserler içinde, yüzey plazmon rezonans (SPR) tekniği de, kolesterol biyosensörü geliştirilmek üzere kullanılmaktadır (Arya vd. 2006, 2007b, Solanki vd. 2007b). 4

20 Kolesterolün elektrokimyasal temelli biyosensörlerle tayini için dönüşümlü voltametri ve amperometrik tayin yöntemleri en çok kullanılan yöntemlerdir. Günümüze kadar yapılan pek çok çalışmada dönüşümlü voltametri tekniğinin kolesterol tayini için etkili bir yöntem olduğu belirtilmektedir (Kumar vd. 2000, Chou ve Liu 2005, Singh vd. 2006a, Zhou vd. 2006, Solanki vd. 2007a). Kumar vd. (2001) polipirol kaplı indiyum kalay oksit (ITO) elektrot üzerine fiziksel adsorpsiyon tekniği ile kolesterol oksidaz enzimini immobilize etmişler ve dönüşümlü voltametri tekniği kullanarak 2 8 mm aralığında doğrusal çalışma aralığı elde etmişlerdir. Singh vd. (2006a) polianilin kaplı ITO elektroda glutaraldehitle çapraz bağlama tekniği ile kolesterol esteraz ve kolesterol oksidaz enzimlerini immobilize ederek mg/dl doğrusal çalışma aralığı gösteren biyosensör geliştirmişlerdir. Solanki vd. (2007a) fiziksel adsorpsiyon ile ITO elektrot üzerinde oluşturulan ferrosen karboksilik asit-poli-n-metilpirol-p-toluen sülfonat tabakası üzerine kolesterol oksidaz enziminin immobilizasyonu ile 2 12 mm doğrusal çalışma aralığı ve yaklaşık iki ay raf ömrüne sahip biyosensör hazırlamışlardır. Amperometrik kolesterol biyosensörü geliştirmek amacıyla, genelde platin, altın ve karbon elektrot materyalleri polianilin, polipirol, poli(o-fenilendiamin), poli(vinilferrosenyum) gibi polimerik filmler ile kaplanmış ve bu modifiye elektrotlar üzerine çeşitli teknikler kullanarak kolesterol oksidaz enzimi tek başına ya da kolesterol esteraz enzimi ile birlikte immobilize edilmiştir (Singh vd. 2006a, Özer vd. 2007, Solanki vd. 2007a, Khan vd. 2009, Shih vd. 2009, Türkaslan vd. 2009). Vidal vd. (1999a) platin çalışma elektrodu üzerinde oluşturulmuş aşırı yükseltgenmiş polipirol film içine kolesterol oksidaz enzimini tutuklayarak Ag/AgCl e karşı +0,70 V çalışma potansiyelinde hidrojen peroksitin yükseltgenmesine dayanan biyosensör geliştirmişlerdir. Aynı çalışma grubu tarafından yapılan bir diğer çalışmada, poli(ofenilendiamin) ve aşırı yükseltgenmiş polipirol filmler matriks olarak kullanılmış ve tutuklama yöntemi ile polipirol film içine kolesterol oksidaz enzimi immobilize edilmiştir. Hazırlanan bu biyosensörle 3 mmol dm 3 derişime kadar kolesterole doğrusal cevap elde edilmiş ve poli(o-fenilendiamin) film tabakasının ürik asit ve askorbik asitin bozucu etkisini tamamen ortadan kaldırıldığını belirlemişlerdir (Vidal vd. 1999b). Wang ve Mu (1999) platin elektrot üzerinde polianilin film oluşturmuşlar ve elektrokimyasal dop yöntemi ile kolesterol oksidaz enzimini polimer filme immobilize etmişlerdir. 5

21 DKE a karşı +0,60 V luk bir potansiyelde kolesterole 0,01 0,10 mmol -1 dm -3 aralığında doğrusal cevap gözlenmiştir. Platinize edilmiş platin elektrot üzerine kaplanan polipirol film içine enzim tutuklanarak Ag/Ag/Cl e karşı +0,50 V potansiyelde medyatör olarak yapay ferrosen türevleri ve flavin nükleotitleri kullanarak medyatörlü kolesterol biyosensörü geliştirilmiştir (Vidal vd. 2000). Aynı çalışma grubunun yaptığı bir diğer çalışmada ise, yukarıdaki çalışmaya ilave olarak elektrot yüzeyinde poli(ofenilendiamin) film tabakası da oluşturulmuştur. Bu dış tabakanın mükemmel bir seçici geçirgen membran oluşturduğu belirtilmiştir (Vidal vd. 2001). Bongiovanni vd. (2001) tribütilmetil fosfonyum klorür polimer membranla kaplanan pirolitik grafit elektrotlara horseradish peroksidaz (HRP) ve kolesterol oksidaz enzimlerini immobilize ederek Ag/AgCl e karşı 0,28 V da kolesterol için 0,04 0,27 mm doğrusal çalışma aralığına sahip amperometrik biyosensör hazırlamışlardır. Tabaka üzeri tabaka (layer-by-layer) tekniği kullanılarak yapılan bir diğer çalışmada ITO elektrotlar poli(etilenimin) ve poli(sülfonat) filmlerle kaplanmış ve aynı teknikle enzim immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Kolesterol tayini Ag/AgCl e karşı +0,60 V da enzimatik reaksiyon sonucu oluşan hidrojen peroksitin izlenmesi ile yapılmış ve 1 mm a kadar kolesterole doğrusal cevap elde edilmiştir (Ram vd. 2001). Serum numunesindeki kolesterol miktarını belirlemek için kolesterol oksidaz enzimi, platin elektrot üzerinde oluşturulmuş poli(2-hidroksietilmetakrilat/polipirol) kompozit membranı içine tutuklanarak biyosensör geliştirilmiştir. Standart yöntemlerle, elde edilen sonuçlar karşılaştırıldığında 0,998 den büyük bir korelasyon elde edildiği belirtilmiştir (Brahim vd. 2001). Prusya mavisinin medyatör olarak kullanıldığı bir çalışmada, kolesterol oksidaz enzimi, platin elektrot üzerine polipirol film ile birlikte tutuklanmış ve elektrot üzeri nafyon ile kaplanmıştır. Amperometrik olarak hidrojen peroksit tayini Ag/AgCl e karşı 0,05 V da gerçekleştirilmiştir. Singh vd. (2004a, 2006a) tarafından yapılan çalışmalarda ITO elektrot yüzeyi polipirol veya polianilin filmler ile kaplanmış ve sırasıyla tutuklama ve glutaraldehit ile çapraz bağlama ile filmlere kolesterol oksidaz ve kolesterol esteraz enzimleri immobilize edilmiştir. Her iki çalışmada da kolesterol tayini amperometrik olarak platin tele karşı +0,50 V da gerçekleştirilmiştir. Kolesterol oksidaz enzimi poli(3,4-etilensioksipirol) içine tutuklanarak kolesterol biosensörü geliştirilmiştir. Amperometrik tayin herhangi medyatör kullanılmaksızın Ag/AgCl e karşı +0,70 V da hidrojen peroksin yükseltgenme akımının izlenmesi ile yapılmış ve 6

22 gözlenebilme sınırı 0,4 mm olarak belirlenmiştir (Türkaslan vd. 2009). Poli(vinilferrosenyum) film üzerine kolesterol oksidaz enzimi immobilize edilerek DKE e karşı +0,70 V da serbest kolesterol tayini için biyosensör hazırlanmış ve 0,1 0,5 mm aralığında doğrusal cevap gözlendiği belirlenmiştir (Özer vd. 2007). Ayrıca, perde baskılı elektrotlar kullanılarak da pek çok kolesterol biyosensörü geliştirilmiştir. Shih vd. (2009) tek kullanımlık elektrotlar üzerine Fe 3 O 4 ile kolesterol esteraz ve kolesterol oksidaz enzimlerini immobilize etmişler ve Ag/AgCl e karşı 200 mv da enzimatik reaksiyon sonucu oluşan hidrojen peroksitin indirgenmesine dayanan biyosensor geliştirmişlerdir. Kolesterol esterlerinin tayini için bir biyosensör hazırlamak için polivinil klorür temelli enzim reaksiyon hücresi oluşturulmuş ve buna kolesterol esteraz ve kolesterol oksidaz enzimleri kovalent olarak immobilize edilmiştir. Horseradish peroksidaz içeren karbon pasta elektrot çalışma elektrodu olarak kullanılmış ve Ag/AgCl e karşı 50 mv potansiyelde kolesteril asetat tayin edilmiştir (Hooda vd. 2009). Kolesterol biyosensörü geliştirmek için nanomateryaller de sıklıkla kullanılmaktadır. Toplam kolesterol tayini için çok duvarlı karbon nanotüp (ÇDKNT)/SiO 2 /kitosan nanobiyokompoziti hazırlanmış ve kolesterol oleat için doğrusal çalışma aralığı mg/dl olarak bulunmuştur (Solanki vd. 2009). ITO/ÇDKNT/polianilin elektrodu üzerine kolesterol oksidaz enziminin karbodiimit ve N-suksinimit kullanarak immobilize edilmesi ile hazırlanan biyosensörün 1,29 12,93 mm derişim aralığında cevap verdiğini belirlemişlerdir (Dhand vd. 2008). Yukarıda kısaca değilinen kolesterol biyosensörleri arasında karşılaştırma yapmak amacıyla Çizelge 1.1 hazırlandı. 7

23 8 Çizelge 1.1 Kolesterol biyosensörlerinin karşılaştırılması No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 1 Amperometri/COx/ -/Ag/AgCl e karşı +0,7 V/Tutuklama 2 Amperometri/COx- CEt/ Fe 3 O 4 /Ag/Ag + a karşı -0,2V/Fiziksel adsopsiyon 3 Amperometri/ COx-CEt-HRP/-/ Ag/AgCl e karşı -50 mv/ Kovalent Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Enzim, Pt elektrot üzerine poli(3,4- etilendioksipirol) film kaplanırken tutuklanmış Enzimlerin immobilize edildiği filtre kağıdı Fe 3 O 4 içeren karbon şeritler üzerine kaplanmış Polivinil klorürden ibaret behere COx ve CEt enzimleri immobilize edilmiş, çalışma elektrodu olarak da HRP içeren CPE hazırlanmış. Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Raf ömrü Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık Tampon/ ph/ Sıcaklık Bozucu Türler Uygulama 150 s/- 20 gün -/ 0,4 mm/- -/7,0/40 C - - Türkaslan vd s/ BSS % 5,06 (N=20) 20 s/ BSS%4 (biyosensörler arası) %BSS %2 (tek biyosensönsör) >10 ay mg/dl/ 19,4 mg/dl/- 100 gün sonunda aktivite %50 si azalmış 0,05 M Fosfat/5,5/ 25ºC -/2,5 mg/dl/- 0,1 M Fosfat/7,0/ 45 C Askorbik asit, ürik asit, glukoz, üre, kreatin, kreatinin, dopamin, laktik asit, aspirin, salisilik asit, asetaminofen önemli bir etki oluşturmamış Laktat, glukoz, ürik asit, askorbik asit, EDTA, aseton ve bilirubin, önemli bir etki oluşturmamış Ref. - Shih vd Kan serumu y=1,0271x 2,3611 R 2 =0,9916(kit ile uyum) Hooda vd

24 9 Çizelge 1.1 Kolesterol biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 4 Elektrokimyasal (DPV)/ COx- CEt/[Fe(CN) 3-/4-6 / (-0,1)-(0,6)V/ Çapraz B. Fotometrik/ COx- CEt /4- aminoantipiridin/ 500 nm/ Çapraz B. 5 Elektrokimyasal (LSV)/ COx/Fe(CN) 3-/4-6 / (-0,3)-(0,8)V /Kovalent bağlama Fotometrik /COx/ o-diansidin/500 nm/ Kovalent bağlama 6 Amperometri/COx/ -/ Ag/AgCl e karşı +0,4 V/ Adsorpsiyon Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Enzimler, indiyum kalay oksit üzerine biriktirilmiş SiO 2 - kitosan ve ÇDKNT temelli nanokompozite GA ile immobilize edilmiş ITO elektrot üzerine polianilin ve ÇDKNT nanokompoziti oluşturulmuş ve enzim karbodimit ve suksinimid ile immobilize edilmiş Camsı elektrot yüzeyinde oluşturulmuş karbon nanotüpkitosan-enzimden oluşan matriks üzerine platin biriktirilmiş Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Raf ömrü Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık 10 s/- 70 gün 0,15 7,68mM ( mg/dl) /-/3,8 μa/mm 10 s/ BSS %2 (3 sensör) 8 s/- 7 gün sonunda aktivite nin %60 ı kalmış 12 hafta 1,29 12,93 mm/- / 6800 na/nm Tampon/ ph/ Sıcaklık Fosfat/7,0/ 25ºC 50 mm Fosfat/7,4/ ºC -/4,79 µm/ 0,1 M 0,044 AM 1 cm 2 Fosfat/7,0/- Bozucu Türler Askorbik asit(>%5) dışında ürik asit, glukoz, laktik asit, sodyum piruvat, üre önemli bir etki oluşturmamış Askorbik asit, ürik asit, glukoz, laktik asit, üre % 8 in altında etki göstermiş Glukoz, askorbik asit, etki göstermezken ürik asit % 10 girişim yapmış Uygulama Ref. - Solanki vd Dhand vd Tsai vd

25 10 Çizelge 1.1 Kolesterol biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 7 Spektrofotometri/ COx/o-dianisidin/ 500 nm/ Kovalent B. 8 Optik/COx-HRP/-/ dianisidin/405 nm/ Kovalent B. 9 Elektrokimyasal (LSV)/COx/-/ (-0,5)-(0,9) V/ Kovalent B. Optik/COx/odianisidin 500 nm/ Kovalent B. Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon N-(2-amino-etil-)- 3-aminopropiltrimetoksilan biriktirilmiş ITO kaplı cam levhanın üzerine enzim immobilize edilmiş Au kaplı cam levha üzerinde oluşturulan 1- floro-2-nitro-4- azidobenzen modifiye poli-(3- hekziltiyofen) tabakasına enzim immobilize edilmiş Enzim ITO kaplı cam levha üzerinde oluşturulan polianilin-stearik asit tabakasına GA ile immobilize edilmiş Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Raf ömrü Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık -/- 10 hafta mgdl -1 / 15 mgdl -1 / 4, Abs(mg/dL) -1 -/- 10 hafta mg/dl/ 50 mg/dl/ 1,04 mº/(mgdl) -/- 10 hafta mg/dl/-/ 88,9 ma mg/dl Tampon/ ph/ Sıcaklık 50 mm Fosfat/7,0/ 50 ºC 50 mm Fosfat/7,0/ 50 ºC Bozucu Türler Glukoz, sodyum piruvat, askorbik asit %4 ün altında, ürik asit ve laktik asit % 7,69 etki göstermiş -/-/35 ºC Ürik asit, glukoz, laktik asit, askorbik asit, üre %7-9 arasında etki göstermiş Uygulama Ref. - Arya vd. 2007a - - Arya vd. 2007b - Matharu vd

26 11 Çizelge 1.1 Kolesterol biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 10 Amperometri(CV)/ COx/-/(-0,6)-(0,9) V/Kovalent B. Amperometri/COx/- /Ag/Cl e karşı 0,35 V/Kovalent B. 11 Amperometri-CV/ COx/ferrosen karboksilik asit/(- 0,6)-(1,1) V/Fiziksel adsorbsiyon ve Tutuklama 12 Amperometri/COx/ P-vinilferrosenyum/ Ag/AgCl e karşı 700 mv/tutuklama Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Au ve Pt elektrot üzerinde 3- merkaptopropiyonik asit tabakası oluşturulmuş ve karbodiimit ile enzim immobilize edilmiş Enzim, ITO elektrot üzerinde oluşturulmuş poli- N-metilpirol-ptoluen sülfonat filme immoblize edilmiş Enzim, Pt elektrot üzerinde oluşturulan poli(vinilferrosen yum) perklorat film içine immobilize edilmiş Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik 30 s/ R 2 0,99(3sensör) BSS %2 12 (n=4) Tutuklanmış 42 s /- Adsorpsiyon 35 s /- Medyatörlü 30 s /- Raf ömrü 1. gün cevap %50 azalmış 4 gün sonunda % 20 si kalmış 2 ay sonunda cevap %20 azalmış Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık Tampon/ ph/ Sıcaklık -/-/- 0,1 M fosfat/7,0/- Tutuklanmış 2 12 mm/-/ 0,2051 ma(mmcm 2 ) -1 Adsorpsiyon 2 12 mm/-/ 0,2449 ma(mmcm 2 ) -1 Medyatörlü 2 12 mm/-/ 0,4468 ma(mmcm 2 ) mm Fosfat/7,0/- -/- 2 hafta 0,1 0,5 mm/-/ 140 μa M 1 cm 2 0,05 M Fosfat/7,5/ 25 ºC Bozucu Türler Ürik asit, askorbik asittin büyük miktarda girişim yaptığı görülmüş Üre, ürik asit etki oluşturmamış glukoz ve ürik asit ise negatif etki yapmış Uygulama Ref. - Shen ve Liu Solanki vd. 2007a - - Özer vd

27 12 Çizelge 1.1 Kolesterol biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 13 Amperometri/COx- HRP/-/Ag/AgCl e karşı 0,75 V/ Kovalent B. Optik/COx-HRP/4- aminoantipiridin/-/ Kovalent B. 14 Amperometri/COx- CEt/-/Ag/AgCl karşı 0,5V/ Kovalent B. 15 Amperometri(CV)/ COx/ K 4 Fe(CN) 6 /K 3 Fe(C N) 6 / (0,45)-(-0,05) V/ Adsorpsiyon 16 Amperometri/COx- CEt- HRP/K 4 Fe(CN) 6 / Ag/AgCl e karşı 0,3 V/Fiziksel adsorpsiyon Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Enzimler ITO elektroda kaplanmış tetraetilortosilikat film üzerine BSA ile immobilize edilmiş Enzimler polianilin filme kovalent olarak immobilize edilmiş Altın partiküller kendi kendine düzenlenen modifiye elektrodun yüzeyine adsorbe edilmiş ve enzim immobilize edilmiş Enzimler perdebaskılı karbon elektrotlara immobilize edilmiş Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Raf ömrü Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık 10 s/- 8 hafta Amperometrik 2-12mM/-/- Optik 2-8 mm/-/- 40 s/- 6 hafta mg/dl/-/ 7, na/mgdl -/- - 7, s/ %BSS 1,259, 5,658 ve 8,70 (3 elektrot farkı derişimler) ve M/ M/- 2 ay mg/dl/- /0,0059 μa(mg/dl) -1 Tampon/ ph/ Sıcaklık 0,1 M Fosfat/ 7,2/- 0,05 M fosfat/7,0/ 46ºC Bozucu Türler Uygulama Ref. - - Kumar vd Laktat, glukoz, ürik asit, askorbik asit önemli bir etki yapmamış - Singh vd. 2006a -/-/- - - Zhou vd /7,0/25ºC Askorbik asit ve ürik asit normal seviyelerde girişim yapmamış Serum R 2 =0,9430 (hastane sonuçları ile uyum) Li vd

28 13 Çizelge 1.1 Kolesterol biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 17 Amperometri/COx- CEt/-/ Pt e karşı 0,5 V/ Tutuklama 18 Amperometri/COx/ Prusya mavisi/ag/agcl e karşı -0,05 V/Tutuklama 19 Amperometri/COx/ -/Ag/AgCl e karşı 0,7 V/ Tutuklama Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon ITO elektrotlar üzerinde oluşturulmuş polipirol film içine enzimler tutuklanmış Platin elektrotlar üzerinde PB tabakası oluşturulmuş bunun üzerine de enzim içeren monomer çözeltisi kullanılarak polipirol kaplanmış ve nafyon tabakası oluşturulmuş Pt elektrot yüzeyinde oluşturulmuş poli(2-hidroksietil metakrilat)/ polipirol filme enzim tutuklanmış Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Raf ömrü Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık Tampon/ ph/ Sıcaklık Bozucu Türler -/7,0/40ºC Glukoz, -/- 4 hafta 1-8 mm/-/ 0,15 μamm -1 Laktat, ürik asidin girişim etkisinin önemsiz olduğu görülmüş Nafyonsuz -/ BSS % 3,5 Nafyonlu -/BSS %3,8 30s/- 25 gün Nafyonsuz 0,025-0,3 mm/0,008 mm/ 5714 na mm -1 cm ay sonunda aktivite nin %80 i kalmış Nafyonlu 0,05-0,3 mm/ 0,012 mm/ 8572 na mm -1 cm , M/ 120 μm/19,05 na mm -1 0,05 M fosfat/7,0/- 0,1 M Fosfat/6-6,5/ 40ºC Ürik asit, askorbik asit, asetaminofeni n girişim etkileri incelenmiş Uygulama Ref. - Singh vd. 2004a Nafyonsuz Yapay serum BSS % 1,4 Accutrol BSS % 1,6 Nafyonlu Yapay serum BSS % -3,05 Accutrol BSS % -5,05 - Serum geri kazanım % (R 2 =0,998) Vidal vd. 2004b Brahim vd

29 14 Çizelge 1.1 Kolesterol biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 20 Amperometrik/COx /-/Ag/AgCl e karşı +0,5 V/Tutuklama 21 Amperometri/COx- HRP/-/Ag/AgCl e karşı -0,28 V/ Tutuklama 22 Amperometri/COx/ -/ Ag/AgCl e karşı 0,6 V/ Adsorpsiyon Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Enzim polipirol tabakası içine tutuklanmış ve dış membran olarak poli(ofeniledimin) kaplanmış Pirolitik grafit elektrot üzerinde oluşturulan tribütilmetil fosfonyum klorür polimer membrana enzim tutuklanmış ITO elektrot üzerinde oluşturulan polistiren ve polietilenimin tabakasına tabaka üzeri tabaka tekniği ile enzim immobilize edilmiş Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Pt/Pt/PPy-COx 6,3 s/bss %2,48 (n=10) Pt/Pt/PPy-COx/o- PPD 7,8 s/bss %1,64 (n=10) 30 s/ BSS %3 (n=10) Raf ömrü Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık 1 ay Pt/Pt/PPy-COx 0,4 M e kadar/14 μm/77,81 na mm -1 Pt/Pt/PPy-COx/o- PPD COx 0,35 M e kadar/142,6 μm/62,15 namm -1 Tampon/ ph/ Sıcaklık 0,05 M fosfat/7,0/- 7 gün 0,04-0,27 mm/-/ 0,1 M/ 1,02 na mm -1 Fosfat /7,0/25 ºC s/- - 1 mm a kadar 0,1 M fosfat/6,8/- Bozucu Türler Askorbik asit ve ürik asitin geçirgenliği incelenmiş ve o-ppd tabakasının seçici geçirgen olduğu görülmüş Düşük derişimde askorbik asit etki yapmamış ama yüksek seviyelerde etki görülmüş Uygulama Accutrol Standart katma BSS % 4,77 Kalibrasyon BSS %5,24 Ref. Vidal vd Bongiovanni vd Ram vd

30 15 Çizelge 1.1 Kolesterol biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 23 Amperometri/COx/ ferrosen türevleri ve flavin nükleotidleri/ Ag/AgCl e karşı 0,5 V/Tutuklama 24 Amperometri/COx/ -/Ag/AgCl e karşı 0,6 V/Tutuklama 25 Amperometri/COx/ -/ Ag/AgCl e karşı 0,7 V/ Tutuklama Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Platinize edilmiş Pt elektrot üzerinde oluşturulmuş polipirol tabakasına enzim tutuklanmış Enzim elektrokimyasal dop yöntemi ile polianilin film içine immobilize edilmiş Pt elektrot yüzeyine pirol ve enzim içeren çözelti kullanılarak polipirol film kaplanmış ve film aşırı yükseltgendikten sonra poli(ofenilendimin) film ile kaplanmış Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik 6,3 s/ BBS % 2,48 (n=10) Raf ömrü -/- 11 gün sonunda cevap % 51 ine inmiş Pt/PPy-COx 7,5 s/ BSS % 0,98 (n=10) Pt/PPy- COx/oPPD 7,0 s/ BSS % 0,70 (n=10) Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık 30 gün Pt/Pt/PPy-COx 0,4 mm a kadar/ 14 mm/77,81 na mm -1 %1 Triton X-100 0,05-0,2 mmol/dm 3 %5 Triton X-100 0,01-0,1 mmol/dm 3 15 gün Pt/PPy-COx 0,3 mm a kadar/1,35 µmol l -1 / 43,99 na l mmol -1 Pt/PPy-COx/o- PPD 0,3 mm a kadar/0,68 µmol l -1 / 35,78 na l mmol -1 Tampon/ ph/ Sıcaklık 0,05M/ Fosfat/7,0/- 0,1 M Fosfat/7,26 /35 0,05 M Fosfat/7,0/- Bozucu Türler Pt/PPy- COx+FcMC elektrodun askorbik asit ve ürik asite geçirgenliği en düşük Askorbik asit ve ürik asit büyük oranda cevabı etkilemiş, glukoz etki yapmamış Poli(ofenilendimin) film ürik asit ve askorbik asit etkisini engellemiş Uygulama Standard serum numunesinde analiz yapılmış Ref. Vidal vd Wang ve Mu 1999 Accutrol (BSS % - 2,02 ve % 3,03) Vidal vd. 1999a 15

31 16 Çizelge 1.1 Kolesterol biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 26 Amperometri/COx/ -/Ag/AgCl e karşı 0,7 V/Tutuklama Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Pt elektrot üzerine pirol ve enzim içeren çözelti kullanılarak polipirol ile birlikte enzim immobilize edilmiş ve polipirol aşırı yükseltgenmiş Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik 7,5 s/ BSS % 3,43 ve % 0,98 (n=10) BSS % 8,66 (6 sensör) Raf ömrü Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık Tampon/ ph/ Sıcaklık 15 gün 0,025-0,3 mm/- /43,99 na mm -1 0,05 M Fosfat/7,0/ - Bozucu Türler Askorbik asit ve ürik asit geçirgenlikleri % 10 ve %1 olarak belirlenmiş Uygulama Sentetik serum (BSS% -2,27) Accutrol (BSS % +3,79 Ref. Vidal vd. 1999b 16

32 1.2 Fenolik Bileşik Biyosensörleri ile İlgili Kaynak Araştırması Fenolik bileşiklerin tayini için günümüze kadar çeşitli yöntemler kullanılarak geliştirilen biyosensörlerin özeti aşağıda sunulmaktadır: Polifenol oksidaz (tirozinaz) (Rajesh vd. 2004, Shan vd. 2009, Wang vd. 2009), lakkaz (Gupta vd. 2003, Quan ve Shin 2004, Timur vd. 2004, Vianello vd. 2004) veya peroksidaz (Lindgren vd. 1997, Kane vd. 1998, Rosatto vd. 1999, 2002, Imabayashi vd. 2001, Serra vd. 2001, Yang vd. 2006) enzimleri kullanılarak hazırlanmış pirokateşol, fenol, hidrokinon, m-krezol, p-krezol, o-krezol, o-klorofenol, dopa, dopamin ve 4-metil kateşol gibi çeşitli fenolik bileşiklerin tayini için pek çok biyosensör geliştirilmiştir. Ancak, polifenol oksidaz enzimi fenolik bileşiklere daha duyarlıdır ve bu nedenle daha sıklıkla kullanılmaktadır (Ameer ve Adeloju 2009). Fenolik bileşiklerin tayini için polifenol oksidaz enzimin kullanıldığı elektrokimyasal yöntemler seçici olmalarından dolayı geniş bir çalışma alanı bulmuştur (Liu vd. 2003). Bu çalışmalar arasında potansiyometri (Ameer ve Adeloju 2009) ve kondüktometri (Anh vd. 2006) temelli biyosensörler de yer almasına rağmen, amperometri temelli biyosensörler ile ilgili çalışmaların daha çok olduğu görülmüştür. Polifenol oksidaz enziminin immobilizasyonu için pek çok farklı destek materyali ve yöntem önerilmiştir. Bunlar arasında çeşitli polimerik filmlerin (Wang vd. 2000a, 2009, Rajesh vd. 2004, 2005, Rajesh ve Kaneto 2005), sol-jel matrikslerin (Zhang vd. 2003,), kendi kendine düzenlenen tek tabakanın (Tatsuma ve Sato 2004), çok duvarlı karbon nanotüp-nafyon nanobiyokompozitlerin (Tsai ve Chiu 2007), laponit kil-kitosan nanokomposit matriksin (Fan vd. 2007) ve karbon pasta matrikslerin (Pedano ve Rivas 2000, Liu vd. 2003, Mailley vd. 2004) kullanıldığı çalışmalar yapılmıştır. Wang vd. (2009) polifenol oksidaz enzimini, 1-etil-3-metilimitazolyum etil sülfat içeren çözelti kullanarak elektrokimyasal olarak hazırlanan polianilin filme glutaraldehit ile immobilize etmişler ve amperometrik kateşol biyosensörü geliştirmişlerdir. Substrat olarak kateşol varlığında biyosensörün 0,2-80 μmol dm 3 doğrusal çalışma aralığı gösterdiği belirlenmiştir. N-(3-aminopropil) pirol polimer filme tirozinaz enzimi immobilize edilerek fenolik bileşiklerin tayini geliştirilen biyosensör ile Ag/AgCl e 17

33 karşı 0,20 V potansiyelde çalışıldığında fenol ve kateşol için sırasıyla 1,8-170,2 µm ve 1,3-110,1 µm derişim aralığında doğrusal cevap elde edildiği belirtilmiştir. (Rajesh ve Kaneto 2005). Rajesh vd. (2005) tarafından yapılan bir çalışmada tirozinaz ve potasyum hekzasiyanoferrat(ii), ITO cam levha elektrot üzerine kaplanan polipirol film içine tutuklanarak amperometrik fenol biyosensörü geliştirilmiştir. Ag/AgCl e karşı +0,12 V potansiyelde fenol için 4,5-107,4 µm doğrusal çalışma aralığı elde edilmiştir. Tiyoninin polimerik filmi üzerine polifenol oksidaz enziminin immobilizasyonu ile endokrin bozucu bileşiklerin tayini için biyosensör geliştirilmiştir (Dempsey vd. 2004). Rajesh vd. (2004) poli(n-3-aminopropil pirol-ko-pirol) film kopolimeri üzerine tirozinaz enziminin immobilizasyonu ile fenol ve kateşol tayini için Ag/AgCl e karşı -0,20 V çalışma potansiyelinde sırasıyla 1,35-222,3 µm ve 1,6-118,8 µm doğrusal çalışma aralığı elde edilmiştir. Elektrokimyasal olarak oluşturulmuş politiyofen film içine polifenol oksidaz enzimin tutuklanması ile geliştirilen amperometrik biyosensörle nm aralığında doğrusal çalışma aralığı elde edilmiştir. Ayrıca hazırlanan bu biyosensörlerle bazı herbisitlerin inhibisyon temelli tayini de yapılmıştır (Védrine vd. 2003). Polianilin-poliakrilonitril kompozit film içine polifenol oksidaz enzimi immobilize edilmiş ve fenol ve kateşol için sırasıyla 0,96 ve 2,03 AM 1 cm 2 lık duyarlıklar elde edilmiştir (Xue ve Shen 2002). Pirol amfifilik monomeri kullanılarak polifenol oksidaz-poli(amfifilik pirol) elektrodu geliştirilmiş ve yerinde fenol analizi yapılmıştır (Cosnier vd. 1999). Polimerik materyallerin yanında karbon pasta da matriks ortamı olarak çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Liu vd. (2003) tarafından yapılan çalışmada kolloidal altın ile modifiye edilmiş karbon pasta elektrotlara tirozinaz enziminin immobilizasyonu yapılmış ve 5 saniyeden daha kısa bir cevap süresi gösteren bir fenol biyosensörü hazırlanmıştır. Polipirol-temelli kompozit karbon pasta elektrot kullanılarak yapılan bir diğer çalışmada fenolik bileşiklerin tayini için amperometrik biyosensör hazırlanmış ve 4,7 AM 1 duyarlık elde edilmiştir (Mailley vd. 2004). Şarapta bulunan fenolik bileşiklerin tayini için yapılan bir çalışmada ferrosen ile modifiye edilmiş grafit perde baskılı elektrotlara tirozinaz ve lakkaz enzimleri immobilize edilerek biyosensör geliştirilmiştir (Montereali vd. 2010). Fenollerin ve 18

34 pestisitlerin tayini için tirozinaz, peroksidaz, asetilkolinesteraz ve bütirilkolinesteraz enzimlerinin dört elektrot sistemli perde baskılı elekrotlara immobilize edilmesi yoluyla çok enzimli elektrokimyasal biyosensör geliştirilmiştir (Solná vd. 2005). Sapelnikova (2003) tarafından yapılan bir çalışmada ise tirozinaz ile modifiye edilmiş perde baskılı elektrotlar hazırlanmış ve altı ay boyunca iyi bir duyarlık elde edildiği belirtilmiştir. Bunların yanında, fenolik bileşiklerin tayini için mikroorganizmaların kullanıldığı biyosensörler de hazırlanmıştır. Pseudomonas putita bakterisi, oksijen elektrodu üzerinde oluşturulmuş jelatin membrana immobilize edilerek, sentetik atık su numunelerinde fenolün tayini için amperometrik biyosensör geliştirilmiş ve fenol için çalışma aralığı 0,5-6,0 µm olarak bulunmuştur (Timur vd. 2003). Skládal vd. (2002) tarafından yapılan bir çalışmada ise Pseudononas bakterisi kullanılarak Ag/AgCl e karşı +50 mv potansiyelde fenolün tayini için amperometrik bir biyosensör hazırlanmıştır. Ayrıca Trichosporon türleri (Neujahr 1982, Riedel vd. 1995) ve Rhodococcus rhodochrous türü (Beyersdorf-Radeck vd. 1994) ile oluşturulmuş biyosörler de bulunmaktadır. Yukarıda kısaca değilinen fenolik bileşik biyosensörleri arasında karşılaştırma yapmak amacıyla Çizelge 1.2 hazırlandı. 19

35 20 Çizelge 1.2 Fenonik bileşik biyosensörlerinin karşılaştırılması No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 1 Amperometri/POx/ Ru kompleksi/ Ag/AgCl e karşı +0,65 V/Tutuklama 2 Amperometri/ LakkazPOx/ ferrosen/ Ag/AgCl e karşı +50 mv/ Tutuklama 3 Amperometri/POx/-/ Ag/AgCl karşı 100 mv/çapraz B. Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Enzim, perde baskılı Pt elektroda 1,2 diaminobenzen, Ru kompleksi ve enzim içeren çözelti kullanılarak immobilize edilmiş Digliserilsilan soljel matriks içinde tutuklanmış enzimler ferrosen ile modifiye edilmiş perde baskılı elektroda immobilize edilmiş Polianilin film kaplanmış platin elektrot üzerine GA kullanılarak enzim immobilize edilmiş Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik -/ BSS % 3,2 (n=5) -/ BSS %4,9 (5 elektrot, gallik asit)/ BSS %6,9 (n=12, fenol) BSS %9,8(n=12, gallik asit) -/ BSS %3,0(n=20) Raf ömrü 21 gün sonunda cevabın %81 i kalmış Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık 5,0 100,0 μm/ 2,385 μm/- - Fenol -/ 11,067±0,134 µa/mm/2 µa (Lakkaz-POx) Fenol -/ 4,814±0,028 µa/mm/10 µa (POx) Fenol -/ 0,072±0,004 µa/mm/620 µa (Lakkaz) 4 ay sonunda cevabın %80 i kalmış 0,2-80 μmol dm 3 / 0,1 μmol dm 3 /- Tampon/ ph/ Sıcaklık 0,05 M Fosfat/7,0/ 25 ºC Bozucu Türler/ Diğer fenolik bileşiklere cevap Askorbik asit ve glukoz bozucu etki göstermiş/ kateşol> tirozin>fenol -/6,0/- SO 2 ve sülfit/ Fenol>Kafeik asit>kateşin> Gallik asit >Kateşol B-R/6,0/ 40 ºC Uygulama Ref. - Akyılmaz vd Şarapta fenollerin tayini yapılmış ve standart yöntemle uyumlu olduğu görülmüş Montereali vd /- - Wang vd

36 21 Çizelge 1.2 Fenonik bileşik biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 4 Amperometri/POx/- /DKE e karşı -0,20 V/ Çapraz B. 5 Amperomeri/ Lakkaz-POx/-/ DKE e karşı 0,0 V/ Tutuklama 6 Amperometri/POx/- /DKE e karşı -50 mv/çapraz B. Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Camsı karbon elektrot üzerine polikristalin BiO x - POx kompoziti immobilize edilmiş Enzimler titanyum oksit jel matriks içine tutuklanarak immobilize edilmiş Camsı karbon elektrot üzerinde oluşturulan kitosan/laponit nanokomposit matriksine enzim immobilize edilmiş Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik <8 s/ BSS %5,6 (8 elektrot) BSS %4,1 (n=40) Raf ömrü 47 gün sonunda cevabın % 72 si kalmış -/- 40 gün sonunda cevabın %52 si kalmış 30 s/ BSS %6,2 (10 sensör)/bss %1(n=10) 60 gün sonunda cevabın %88 i kalmış Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık Kateşol M-1, M/ M/ 11,3 AM -1 cm -2 Fenol M M/ M/ 3,2 AM -1 cm -2 Kateşol 2, , /1, mol/l/ 234 malmol -1 Kateşol -/-/674 mam -1 cm 2 Tampon/ ph/ Sıcaklık 0,1 M Fosfat/6,0/ 25 ºC Bozucu Türler/ Diğer fenolik bileşiklere cevap Anilin, benzaldehit (%93,7), benzilalkol /p-krezol> kateşol>mkrezol>pkloro fenol>fenol -/6,0/25 C -/ kateşol>4- metil kateşol>3- klorofenol >2,6- dimetoksifenol> 4- Fosfat/6,5/ 40 C terbütilkateşol -/Kateşol>pkrezol> fenol>mkrezol Uygulama Nehir suyu örneklerine farklı derişimlerde kateşol ilaveleri yapılmış ve sonuçlar yüksek bulunmuş. Ref. Shan vd Kochana vd Fan vd

37 22 Çizelge 1.2 Fenonik bileşik biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 7 Amperometri/POx/ ferrosen/ag/agcl e karşı -0,2 V/ Adsorpsiyon 8 Amperometri/POx/- /Ag/AgCl e karşı -10 mv/ Adsorpsiyon 9 Amperometri/POx/- /Ag/AgCl e karşı -0,2 V/Çapraz B. Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Camsı karbon elektrot üzerinde biriktiririlen trimetilpropil amonyum grupları ile bağlanmış kile enzim immobilize edilmiş Camsı karbon elektrot üzerine enzim, nafyon ve ÇDKNTden oluşan karışım yerleştirilmiş ve kurutulmuş Nano kalsiyum karbonat kolloidal süspansiyonu enzim çözeltisi ile karıştırılmış ve camsı karbon elektrot yüzeyine konmuş, kurutulmuş ve GA buharında tutulmuş Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik -/ BSS %6,8 (4 sensör) Raf ömrü 2 ve 4 hafta sonunda cevabın sırasıyla % 90 ı ve % 43 ü kalmış Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık Kateşol , M/ M/ 3650 ma M 1 cm -2 8 s/- - Kateşol 1-23 µm/ 0,22 µm /346 µa mm s/-/bss % 7,7 (n=40) 56 gün sonunda cevabın %70 i kalmış Kateşol M/0,44 nm/ 474 ±9,3 ma M -1 Fenol M/ 0,62 nm/336 ±6,8 ma M -1 Tampon/ ph/ Sıcaklık 0,05 M Fosfat / 6,8/- 0,1 M Fosfat /7,0/- 0,1 M Fosfat /6,5/25 ºC Bozucu Türler/ Diğer fenolik bileşiklere cevap Uygulama Ref. -/- - Mbouguen vd /Kateşol> fenol>mkrezol> p-krezol> dopamin -/Kateşol>pkrezol>fenol> m-krezol>pklorofenol - Tsai ve Chiu Shan vd

38 23 Çizelge 1.2 Fenonik bileşik biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 10 Amperometri/POx/- /Ag/AgCl e karşı -0,2 V/Adsorpsiyon 11 Amperometri/POx/- /Ag/AgCl e karşı 0,18 V/Adsopsiyon 12 Amperometri/HRP/ -/ Ag/AgCl karşı -0,05 V/ Adsorpsiyon Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Enzim çözeltisi içine kitosan-zno komposit çözeltisi ilave edilmiş ve camsı elektrot yüzeyine uygulanmış Camsı karbon elektrot üzerinde enzim immobilize edilmiş biyokompozit jel matriks tabakası oluşturulmuş. Modifiye edilmiş altın elektrot yüzeyine enzim tabaka üzeri tabaka tekniği ile immobilize edilmiş. Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Raf ömrü 10 s/- 20 gün sonunda cevabın %91 i kalmış Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık Fenol 1, , mol L -1 / 5, M/ 182 µa mmol -1 L -/- > 2 ay L-Dopa 5, , M/ 1, M 2 s/ BSS %2,6 (n=8) 1 hafta boyunca cevap aynı kalmış 4 hafta sonunda % 65 ı kalmış Dopamin 2, , M/ 9, M μmol l -1 / 0,7 μmol l -1 / 48,97 μmol l -1 Tampon/ ph/ Sıcaklık 0,067 M Fosfat /7,0/ 50 ºC 0,1 M fosfat tamponu/6, 0/ 30ºC Sodyum barbital- HCl/8,0/- Bozucu Türler/ Diğer fenolik bileşiklere cevap Askorbik asit, H 2 O 2, ürik asit, glukoz, fruktoz bozucu etki yapmamış/pkrezol>fenol> kateşol -/L-Dopa, dopamin, DL-dopa,4- metil kateşol, p-krezol,mkrezol, o-krezol -/oaminofenol >hidrokinon> kateşol> o-klorofenol> fenol> fitomelin> rezorsinol> o-krezol> o- nitrofenol> p-nitrofenol Uygulama Su örneklerinde fenol için geri kazanım değerleri %92,9- %107,6 bulunmuş L-Dopa katılmış serum ve dopamin katılmış beyin omurilik sıvısında Ref. Li vd Tembe vd tayin yapılmış - Yang vd

39 24 Çizelge 1.2 Fenonik bileşik biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 13 Amperometri/ Lakkaz/-/ Ag/AgCl karşı -100 mv/ Adsorpsiyon ve Kovalent B. 14 Amperometri/POx/ [Fe(CN) 6 ] 4- / Ag/AgCl e karşı +0,12 V/Tutuklama 15 Amperometri/POx/- /Ag/AgCl e karşı -0,20 V/ Kovalent B. Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon A elektrodu enzim içeren GA çözeltisinde, B ve C enzim elektrotları ise karbodimit, HMDA ve enzim içeren GA çözeltilerinde grafit elektrodun bekletilmesi ile hazırlanmış ITO elektroda polipirol film kaplanırken enzim ve medyatör immobilize edilmiş Paslanmaz çelik elektrot üzerinde oluşturulmuş poli- (3-aminopropil pirol) filme karbodiimit ve suksinimit kullanılarak enzim immobilize edilmiş Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Raf ömrü -/- A 10 gün B 30 gün C 60 gün 80 s/ BSS % 10 (10 sensör) BSS % 6 (n=10) s/ BSS % 9 (10 sensör) BSS % 6 (n=10) Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık A 2 mm a kadar/-/ 9,7 μa/mm B 0,1 mm a kadar /-/196 μa/mm C 0,1 mm a kadar /-/490 μa/mm 4 ay Fenol 4,5-107,4 μm / 0,7 μm /0,33 AM -1 cm -2 3 ay Fenol 1,8 170,2 μm/0, 9 μm/ 57,6 mam -1 cm -1 Kateşol 1,3 110,1 μm/0, 7 μm/ 71,4 mam -1 cm -1 p-krezol 2,1 168 μm/1,1 μm/ 45,8 mam -1 cm -1 Tampon/ ph/ Sıcaklık 0,1 M Sodyum asetat/ 5,0/ 25ºC 0,1 M Fosfat/7,2/ 25ºC 0,1 M Fosfat/7,2/ 25ºC Bozucu Türler/ Diğer fenolik bileşiklere cevap Uygulama Ref. -/- - Portaccio vd /- - Rajesh vd / kateşol>fenol >p-krezol - Rajesh ve Kaneto

40 25 Çizelge 1.2 Fenonik bileşik biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 16 Amperometri/POx/- /Ag/AgCl e karşı -0,2 V/Tutuklama 17 Amperometri/POx/- /Ag/AgCl e karşı -0,2 V/Kovalent B. 18 Amperometri/POx/ Tiyonin/Ag/AgCl e karşı -0,2 V (fenol) /Tutuklama Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Karbon pasta, polipirol-karbon pasta ve polipirol biyokompozit CP elektrotlar hazırlanmış Enzim ITO kaplı cam levha üzerinde oluşturulmuş poli(n-3- aminopropil pirolko-pirol) filme karbodiimit ve suksinimit ile immobilize edilmiş Camsı karbon elektrot yüzeyine enzim tiyonin, BSA ve GA içeren çözeltisi uygulanmış, kurutulmuş ve tiyonin (-0,4)- (0,1) V aralığında elektropolimerize edilmiş Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik <20 s/ BSS %2,1 <10 s/ BSS % 5 (n=10) BSS % 9 (10 sensör) Raf ömrü 1 ay sonunda cevabın %80 i kalmış 4 ay sonunda % 80 i kalmış 33 s/- 5 gün sonunda cevap %43, 10 gün sonunda %94 azalmış Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık Tampon/ ph/ Sıcaklık -/-/4,7 A M -1 cm -2 0,1 M Fosfat/7,4/ 25 ºC Fenol 1,35-222,3 µm/0,7 µm/ 1,75 µa mm -1 Kateşol 1,6-118,8 µm/1,2 µm/ 3,46 µa mm -1 p-krezol 1,9-257,8 µm/1,6 µm/ 0,50 µa mm -1 17β-Östradiyol 0,8 mm/14,9 µm/ 4, A mm -1 Fenol 0,08 mm/1,0 µm/4, A mm -1 Nonilfenol 10,0 mm/0,5 µm/ 1, A mm -1 Fosfat/7,2/ 25 C 0,1 M Fosfat/6,5/ oda sıcaklığı Bozucu Türler/ Diğer fenolik bileşiklere cevap -/ kateşol>fenol >epikateşin> ferulik asit - /Kateşol>fenol > p-krezol -/Fenol> 17α- Etiniloestradiy ol> Nonilfenol> Bisfenol A>17β- Östradiyol Uygulama Ref. - Mailley vd Rajesh vd Dempsey vd

41 26 Çizelge 1.2 Fenonik bileşik biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 19 Amperometri/POx/- /DKE e karşı -0,20V/Tutuklama 20 Amperometri/ P. putita/-/ Ag/AgCl e karşı -700mV/Çapraz B. 21 Amperometri/POx/- /DKE e karşı -150 mv/adsorbsiyon Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Ti(OBu) 4 ve asetilaseton karşımı ile hazırlanan sol-jele enzim immobilize edilmiş ve bu karışım koloit camsı elektrot yüzeyine uygulanmış ve kurutulmuş Enzim Au elektrot üzerine oluşturulan jelatin membrana GA ile çapraz bağlanmış Kolloidal altın süspansiyonu grafit tozu ile karıştırılmış ve bu karışıma enzim ve parafin yağı eklenerek elektrot hazırlanmış. Ayrıca altın içermeyen karbon pasta elektrot da hazırlanmış Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik <10 s/ BSS %2,6 (n=15 BSS %6,6(10 sensör) dakika/ BSS % 4,4 (n=7) < 5s/ BSS %3,2( n=6) BSS %8,6 (6 sensör) Raf ömrü Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık >2 ay Fenol 7, M/ M/15,78 µa µm -1 cm -2 Tampon/ ph/ Sıcaklık 0,02 M sitrik asitfosfat/ 6,0/30 C ±0,5 C - Fenol 0,5-6 µm/ -/5,03 ma M -1 0,05 M Fosfat/6,9/- 20 gün sonunda aktivite nin % 90 ı kalmış Fenol 4-48 µm/6,1 nm/12,3 µ A cm -2 µm -1 0,1 M Fosfat/7,0/- Bozucu Türler/ Diğer fenolik bileşiklere cevap L-aspartik asit, ürik asit, L-glutamik asit, askorbik asit, galaktoz, L-tirozine cevap yok/ Kateşol>fenol >klorofenol> m-difenol> p-difenol -/L-tirozin> L-DOPA> fenol>metilparatiyon -/Kateşol 32 µm, Dopamin 16 µm a kadar doğrusal Uygulama Fenol için geri kazanım %92,8-104,5 olarak bulunmuş Sentetik atık su örneklerinde tayin yapılmış Ref. Zhang vd Timur vd Liu vd

42 27 Çizelge 1.2 Fenonik bileşik biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 22 Amperometri/POx/- /Ag/AgCl e karşı -200 mv/ Tutuklama 23 Amperometri/POx/- /Ag/AgCl e karşı -150 mv/ Tutuklama 24 Amperometri/POx/- /DKE e karşı -0,2 V/Tutuklama Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Tetrametoksiorto silikatdan hazırlanan sol-jel çözeltisi ve nafyon çözeltisine enzim çözeltisi ilave edilmiş ve karışım camsı karbon elektrot yüzeyine uygulanmış Enzim camsı karbon elektrot yüzeyinde oluşturulan titanyum oksit soljel matriks içine tutuklanmış Camsı karbon elektrot üzerine etilendioksitiyofen ve enzim içeren çözelti damlatılmış ve daha sonra polietilen glikol çözeltisine daldırılmış Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik 15 s/ BSS % 3,2 (n=5) BSS % 9,1(10 sensör) < 5s/ BSS %2,8(n=9) BSS % 2,3 (6 sensör) Raf ömrü 2 hafta sonunda cevabın % 74 ü kalmış 80 gün sonunda cevabın % 94 ü kalmış s/- 12 gün sonunda cevabın % 30 u kalmış Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık Kateşol µm/ 0,35 µm/ 200 mam -1 Fenol 5-100/1,0 µm/46 ma M -1 p-krezol 1-50 µm/ 0,34 µm/ 91 mam -1 1, , M/1, M/ 103µA/mM Kateşol 25 µm a kadar/-/1999 ma M -1 cm -2 Fenol 25 µm a kadar/ 50 nm/608 ma M -1 cm -2 Tampon/ ph/ Sıcaklık 0,05 M fosfat/7/- 0,02 M fosfat/7,0/- 0,1 M fosfat/6,5/ 25 C Bozucu Türler/ Diğer fenolik bileşiklere cevap -/Kateşol> 4-klorofenol> pkrezol>fenol >4-asetamido fenol Uygulama Ref. - Kim ve Lee /- - Yu vd /Kateşol>p- krezol>4- klorofenol>fe nol>dopamin> L-dopa> epinefrin> 3-klorofenol - Védrine vd

43 28 Çizelge 1.2 Fenonik bileşik biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 25 Amperometri/POx/ Fe(CN) -4 6 /DKE e karşı -0,20 V/ Çapraz B 26 Amperometri/POx/ Poli azur B/ Ag/AgCl e karşı -0,10 V/Fiziksel Tutuklama 27 Amperometri/POx/- /DKE e karşı -50 mv/tutuklama Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon (3-aoriloksipropil) dimetoksimetilsila n ile çapraz bağlanmış kitosan çözeltisi medyatör ve enzim ile karıştırılmış ve camsı karbon elektrot yüzeyine uygulanmış Poli azure B modifiye edilmiş camsı karbon elektrot üzerine laponit kil jele tutuklanmış enzim immobilize edilmiş Polianilinpoliakrilonitril kompozit matriksi için enzim immobilize edilmiş Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik 2 s/ BSS % 1,9 BSS % 4,9 (10 sensör) 28 s/ BSS %6 (n=10) Raf ömrü En az 70 gün cevabın %75 i kalmış 3 ve 5 saat sonra akım %72 ve % 67 si kalmış Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık Fenol 1, , M/5, M/150 na nm -1 Fenol 0, µm/4 nm/1867 ma M -1 cm -2 -/- 8 ay Fenol , M/-/ 0,96 A M -1 cm -2 Kateşol , M/-/ 2,03 A M -1 cm -2 Tampon/ ph/ Sıcaklık 0,025 M fosfat/7,4/ 25±0,1 C 0,1 M Fosfat/6,5/ 30 C 0,10 M fosfat/6,5/ 25 C Bozucu Türler/ Diğer fenolik bileşiklere cevap Glukoz, sistein, asetaminofen, ürik asit etki yapmamış; H 2 O 2 ve askorbik asit yapmış /Kateşol>dopa min>fenol> hidrokinon> p-nitrofenol pkrezol>fenol >m-krezol>pklorofenol>mterbütil fenol -/ kateşol>mkrezol> p-krezol>fenol Uygulama Ref. - Wang vd Shan vd Xue ve Shen

44 29 Çizelge 1.2 Fenonik bileşik biyosensörlerinin karşılaştırılması (devamı) No Yöntem/Enzim/ Medyatör/Çalışma Potansiyeli/ İmmobilizasyon Türü 28 Amperomeri/POx/ Tiyonin/DKE e karşı -0,20 V/ Adsorbsiyon Çalışma Elektrodu ve Modifikasyon Pt elektrot üzerine kaplanmış olan poli(dikarbazol) filme enzim kimyasal olarak graft edilmiş Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik Raf ömrü -/- 5 gün sonunda cevap % 55 azalmış Çalışma Aralığı/ Gözlenebilme sınırı/duyarlık Kateşol -/-/ 14,57 ma M -1 cm -2 Tampon/ ph/ Sıcaklık 0,10 M fosfat/7,0/- Bozucu Türler/ Diğer fenolik bileşiklere cevap Uygulama Ref. -/- - Cosnier vd

45 1.3 Poli(o-fenilendiamin) ile İlgili Kaynak Araştırması Poli(o-fenilendiamin) film kullanılarak çeşitli türlerin tayini için hazırlanan biyosensörler ile ilgili çalışmaların bir özeti aşağıda sunulmaktadır: Poli-fenilendiaminler, seçici geçirgen film oluşturduğu için biyosensör uygulamalarında oldukça fazla kullanılmaktadır. Özellikle oksidaz temelli biyosensörlerde tayin genellikle H 2 O 2 indirgenmesi ya da yükseltgenmesine dayandığından elde edilen filmin bu türe geçirgen olması ve gerçek numunelerde bulunabilecek diğer bazı girişim yapan türleri etkili bir şekilde engellemesi gerekmektedir. Poli-fenilendiaminlerin orto izomeri olan poli(o-fenilendiamin) (PoPD) hem seçici geçirgen bir film oluşturması hem immobilizasyon matriksi oluşturması gibi özelliklerinden dolayı en çok çalışılan formdur (Rothwell vd. 2008). Poli(o-fenilendiamin) film ile yapılan çalışmalarda, çoğunlukla, çeşitli matriks ortamlarında glukoz tayini için biyosensörlerin geliştirildiği görülmektedir (Malitesta vd. 1990, Moussy vd. 1993, Dumont ve Fortier 1996, Myler vd. 1997, Garjonyte ve Malinauskas 1999, Vidal vd. 1999c, Garjonyte ve Malinauskas 2000, Yasuzawa vd. 2000, Reyes de Corcuera vd. 2005). Ayrıca, fenol (Cosnier vd. 1999), L-lizin (Karalemas vd. 2000) ve etanol (Lobo-Castanon vd. 1997) türlerinin tayini için de çeşitli yöntemler kullanılarak poli(o-fenilendiamin) temelli biyosensörler geliştirilmiştir. Çeşitli elektrot materyalleri üzerine poli(o-fenilendiamin) filmin sentezi genellikle dönüşümlü voltametri veya sabit potansiyel teknikleri uygulanarak yapılmıştır. Sasso vd. (1990) tarafından glukoz tayinine yönelik yapılan bir çalışmada, DKE ye karşı 2 mv/s tarama hızıyla 0,0 0,8 V arasında dönüşümlü voltametri tekniğiyle polimer film ile kaplanan platinize edilmiş gözenekli camsı karbon elektrotların yüzeyine karbodiimit veya glutaraldehit kullanılarak enzim immobilize edilmiş ve elde edilen filmin serumda bulunabilecek L-askorbik asit, ürik asit ve L-sistein gibi elektrokimyasal olarak aktif türlerin etkisini azalttığı ve kan serumunda bulunan proteinler tarafından elektrodun zehirlenmesini önemli ölçüde engellediği tespit edilmiştir. Yapılan bir diğer çalışmada ise, glukoz oksidaz immobilize edilmiş organik 30

46 iletken tuz (TTF-TCNQ) dan ibaret olan elektrot üzerine, pirol ve o-fenilendiaminin içeren çözelti kullanılarak Ag/AgCl e karşı (+100)-(+650) mv aralığında dönüşümlü tarama ile elektropolimerizasyon yapılmış ve polipirol ve poli(o-fenilendiamin) ile kaplanmış sensörde, glukoz için doğrusal çalışma aralığı ve raf ömrü sırasıyla 1 12 mm ve 8 gün olarak bulunmuştur (Vidal vd. 1999c). Ayrıca, poli(o-fenilendiamin) filmin kaplanması potansiyostatik olarak da yapılmıştır. Glukoz tayini için geliştirilen biyosensörlerin pek çoğunda elektrot yüzeyleri enzim ve/veya monomer içeren sulu çözeltiler kullanılarak DKE ye karşı +0,65 V (Malitesta vd. 1990), Ag e karşı +0,70 V (Dumont ve Fortier 1996), Ag/AgCl e karşı +0,70 V (Zambonin ve Losito 1997, Garjonyte ve Malinauskas 1999, 2000), Ag/AgCl e karşı +0,65 V (Wang vd. 2000b, Reyes de Corcuera vd. 2005), DKE e karşı +0,70 V (Dixon vd. 2002) gibi çalışma potansiyelleri seçilerek polimer filmlerle kaplanmıştır. Yapılan çalışmaların çoğunda polimer membranın seçici geçirgenlik özelliğine bağlı olarak askorbat gibi muhtemel bozucuların etkisini bloke ettiği görülmüştür. Glukoz dışındaki türlerin tayini için yapılan bir çalışmada, polipirol ile modifiye edilmiş bir elektrot o-fenilendiamin ve laktat oksidaz içeren fosfat tamponu kullanılarak 15 dakika boyunca Ag/AgCl e karşı +0,70 V da poli(o-fenilendiamin) film ile kaplanmıştır. Endojen olarak bulunabilen elektroaktif bileşiklerden olan askorbat, ürat ve sisteinin, maksimum fizyolojik seviyelerinde bile, bozucu etki yapmadığı, ekzojen kaynaklı parasetamolün de etkili bir şekilde bozucu etkisinin engellendiği belirlenmiştir (Palmisano vd. 1995). L-lizin tayini için yapılan bir diğer çalışmada Sialtın şerit üzerine 5 mv/s lik bir tarama hızı ile mv arasında dönüşümlü voltametri tekniği kullanılarak ile poli(o-fenilendiamin) film kaplanmış ve glutaraldehit ile lizin oksidazın immobilizasyonu yapılmış ve biyosensörün tirozin ve sisteine cevap gösterdiği, ancak fenilalanin, arginin, histidin ve ornitine cevabının çok düşük olduğu bulunmuştur (Karalemas vd. 2000). Nikotinamit adenin dinükleotit ve alkol dehidrogenaz ile modifiye edilmiş karbon pasta elektrotların yüzeyi (-0,50) (+0,70) V potansiyel aralığında 50 mv/s tarama hızında dönüşümlü voltametri tekniği ile PoPD ile modifiye edilmiştir. Polimer filmin enzim ve kofaktör immobilizasyonuna izin verdiği, düşük potansiyellerde NADH ın yükseltgenmesini katalizlediği ve duyarlığı 31

47 arttırdığı sonuçlarına varılmıştır (Lobo-Castanon vd. 1996). Platin elektrotlar üzerine biriktirilen PoPD filmler içine glutamat oksidazın tutuklanması ile glutamat için yüksek duyarlığa sahip biyosensör geliştirilmiştir (McMahon ve Q Neill 2005). PoPD nin koruyucu bir kaplama olarak kullanıldığı bir çalışmada çok duvarlı karbon nanotüp modifiye altın elektrotlara kolesterol oksidaz enzimi immobilize edilmiş ve kolesterol tayini için elektroaktif türlerin etkisinin oldukça azaltıldığı bir biyosensör hazırlanmıştır (Guo vd. 2004). Kolesterol tayini için yapılan bir diğer çalışmada ise, kolesterol oksidaz enzimi polipirol film içine tutuklanmış ve bir dış membran olarak bu elektrot üzerine poli(o-fenilendiamin) film Ag/AgCl e karşı +0,65 V da potansiyostatik olarak biriktirilmiştir. Hazırlanan biyosensör ile Ag/AgCl e karşı +0,50 V potansiyelde kolesterolün amperometrik olarak tayini yapılmış ve duyarlık 62 na mm 1 olarak bulunmuştur (Vidal vd. 2001). NAD + ve gliserol ile modifiye edilmiş karbon pasta elektrotlar üzerine (-0,5)-(+0,7) V potansiyel aralığında 50 mvs 1 tarama hızında poli(o-fenilendiamin) film biriktirilmiş ve elde edilen biyosensör ile Ag/AgCl karşı 0,0 V da gliserol tayini yapılmıştır (Álvarez-González vd. 2000). 1.4 Poli(3-metiltiyofen) ile İlgili Kaynak Araştırması Poli(3-metiltiyofen) (P3MT) film kullanılarak çeşitli türlerin tayini için hazırlanan biyosensörler ile ilgili çalışmaların bir özeti aşağıda sunulmaktadır. Poli(3-metiltiyofen) film ile ilgili yapılan literatür taraması ışığında, pek çok uygun özelliğine rağmen, P3MT filmin amperometrik biyosensör yapımında çok fazla kullanılmadığı görüldü. Ancak, glukoz biyosensörü geliştirmek amacıyla, poli(3- metiltiyofen) ve poli(tiyofen-3-asetik asit) (PT3A) kopolimerinin kullanıldığı çalışmalar mevcuttur (Kuwahara vd. 2005a, b, Liu vd. 2007). Çalışmalar incelendiğinde, medyatör olarak çalışma ortamına benzokinon ilave edildiği ve daha çok da hazırlanan biyosensörün gerçek numunelerde tayin için kullanmak yerine, optimum monomer miktarlarının araştırıldığı görülmektedir. Liu vd. (2008) tarafından yapılan bir çalışmada ITO elektrotlar üzerinde polistiren kalıplar oluşturulmuş ve daha sonra 5/1 oranında 3-metiltiyofen (3MT) ve tiyofen-3-32

48 asetik asit (T3A) ve 0,1 M tetraetilamonyum perklorat (TEAP) içeren asetonitril kullanılarak DKE ekarşı +2,2 V da makroporlu kopolimer film hazırlanmıştır. Kopolimer film kuruduktan sonra tetrahidrofuran içerisinde 24 saat boyunca bekletilmiş ve polistiren kalıp uzaklaştırılmıştır. Kalıp içeren ve içermeyen kopolimer filmler enzim immobilizasyonu için 1-sikloheksil-3-(2-morfolinoetil)karbodiimit meto-ptoluensülfonat (CMC) ve glukoz oksidaz (GOx) içeren deiyonize suda 4 saat boyunca 4 C de tutulmuştur. Glukoz tayini 1 mm benzokinon içeren fosfat tamponu kullanılarak DKE e karşı +400 mv da yapılmıştır. Liu vd. (2007) tarafından yapılan bir diğer çalışmada ise 3MT ve T3A kopolimerizasyonu ile hazırlanmış filme GOx enzimi kovalent olarak immobilize edilmiştir. Elektrokimyasal polimerizasyon 0,1 M TEAP ve 5/1 oranında 3MT ve T3A içeren asetonitril çözeltisi kullanılarak kronoamperometrik olarak DKE e karşı +2,2 V da yapılmıştır. Daha sonra 3MT/T3A kopolimeri CMC ve GOx içeren iyon değiştirici suda 18 saat boyunca tutulmuştur. Glikoz tayini 1 mm benzokinon içeren fosfat tamponu kullanılarak DKE e karşı +400 mv da yapılmıştır. Kuwahara vd. (2005a) tarafından 3MT ve T3A monomerleri kullanılarak elektropolimerizasyon yolu ile hazırlanan kopolimer filme GOx immobilize edilmiştir. 3MT ve T3A toplam derişimi 0,5 M olan ve 0,1 M TEAP içeren asetonitril çözeltisi kullanılarak Au çalışma elektrodu DKE e karşı 2,2 V da kopolimer film ile kaplanmıştır. Amperometrik çalışmalar DKE e karşı +0,4 V da yapılmış ve p- benzokinon medyatör olarak kullanılmıştır. Çalışmada doğrusal çalışma aralığı belirtilmemiş ve kopolimerde bulunan T3A nın % si optimize edilmiştir. Aynı çalışma grubu tarafından yapılan bir diğer çalışmada, 3MT ve T3A kopolimerizasyonu ile hazırlanmış iletken kopolimere GOx enziminin kovalent immobilizasyonu ile glikoz tayini için enzim elektrotlar hazırlanmıştır. Bu amaçla, Au elektrotlar üzerine 0,45 M 3MT, 0,05 M T3A ve 0,10 M TEAP içeren asetonitril çözeltisi kullanılarak DKE e karşı +2,2 V da elektropolimerizasyon yolu ile kopolimer kaplanmıştır. Kopolimer film daha sonra sırasıyla i) N-hidroksisuksinimit (NHS) ve CMC içeren çözeltiye, ii) GOx içeren çözeltiye, iii) % glutaraldehit çözeltisine, iv) etilendimine (heksametilendiamin veya dodekametilendimin) ve v) 2,5-dihidroksibenzaldehit çözeltisine daldırılmıştır. Her bir daldırma işleminin 24 saat sürdüğü belirtilmiştir. Amperometrik çalışmalar DKE e karşı +0,40 V da yapılmış ve iv basamakta kullanılan bağlayıcılar 33

49 karşılaştırılmış ve dodekametilendimin ile en yüksek glukoz cevabı elde edilmiştir. Doğrusal çalışma aralığının her bir elektrot için 2,5 mm a kadar uzandığı belirtilmiştir (Kuwahara vd. 2005b). Somasundrum vd. (1996) tarafından çalışma elektrodu olarak kullanılan grafit levha elektroda 0,05 3MT ve 0,1 M tetrabütilamonyum tetrafloroborat içeren aseonitril kullanılarak 0-(+1,9 V) aralığında P3MT film kaplanmıştır. Rodyum (Rh) ile modifikasyon için ise elektrot, M RhCl 3 ve 0,1 M NaCl içeren tampon çözelti içinde 15 s boyunca 0-(-0,5) V aralında tutulmuştur. Glukoz tayini amperometrik olarak GOx içeren tampon çözelti kullanılarak -0,1 V da yapılmıştır. 34

50 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Biyosensörler Biyosensörler, biyokimyasal bir sinyali, ölçülebilir elektrik sinyallerine çevirmek için fizikokimyasal transduserlerle biyomoleküllerin seçiciliğini birleştiren analitik cihazlardır (Arya vd. 2008). Çevresel analizler, tarım, gıda ve ilaç endüstrilerinde sıklıkla kullanılan biyosensörler biyolojik bir tanıma sistemi (biyobileşen) ve fizikokimyasal transduser olmak üzere iki temel bileşen içerir (Şekil 2.1) Biyokimyasal tanıma sistemi, genellikle analit derişimi ile ilgili bilgileri, tayin edilebilen bir duyarlıkla, bir kimyasal ya da fiziksel sinyale çevirir. Tanıma sisteminin başlıca görevi, sensöre analitin ölçülebilmesi için yüksek düzeyde bir seçicilik sağlamaktır. Biyosensörün diğer bir parçası olan transduser ise tanıma sisteminden alınan bilgileri genellikle elektriksel alana iletir. Biyosensörün transduser kısmı genellikle, dedektör, sensör ya da elektrot olarak da adlandırılabilir (Thevenot vd. 1999). Şekil 2.1 Biyosensörün şematik gösterimi Biyosensörler, biyolojik özgüllük mekanizmalarına ya da fizikokimyasal sinyal dönüşümüne göre sınıflandırılabilirler. Biyosensörlerin biyolojik bileşeni, katalitik ve katalitik olmayan olmak üzere iki ayrı gruba ayrılır. Katalitik grup enzimleri, mikroorganizmaları ve dokuları içerirken, katalitik olmayan biyolojik bileşenler antikorları, reseptörleri ve nükleik asitleri içerir. Biyosensörler analitlerin tayini için kullanılan transduserlere göre de genel olarak elektrokimyasal (amperometrik, 35