ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ DOĞU AKDENİZ BÖLGESİ NDE TURUNÇGİL MAT SOLGUNLUK HASTALIĞI (CITRUS BLIGHT) ETMENİNİN ARAŞTIRILMASI BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI ADANA, 2008

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOĞU AKDENİZ BÖLGESİ NDE TURUNÇGİL MAT SOLGUNLUK HASTALIĞI (CITRUS BLIGHT) ETMENİNİN ARAŞTIRILMASI Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ YÜKSEK LİSANS TEZİ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI Bu tez 19/09/2008 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza... İmza İmza Doç.Dr. Mukadder KAYIM Prof.Dr. Saadettin BALOĞLU Doç.Dr. Nihal BUZKAN DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Bitki Koruma Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2007YL11 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ DOĞU AKDENİZ BÖLGESİ NDE TURUNÇGİL MAT SOLGUNLUK HASTALIĞI (CITRUS BLIGHT) ETMENİNİN ARAŞTIRILMASI Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KOURUMA ANABİLİM DALI Danışman : Doç. Dr. Mukadder KAYIM Yıl : 2008, Sayfa: 63 Jüri : Doç. Dr. Mukadder KAYIM : Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU : Doç. Dr. Nihal BUZKAN Bu çalışmada, Doğu Akdeniz Bölgesi nde Turunçgil Mat Solgunluk hastalığı (Citrus Blight: CB) etmeninin araştırılması ve tanılanması amacıyla farklı lokasyonlardaki 20 yaşından büyük turunçgil bahçelerinde surveyler yapılmıştır. Turunçgil Mat Solgunluk hastalığına benzer simptom gösteren ağaçların gövdesine şırınga ile su injeksiyon testi uygulanmış ve moleküler analiz için saçak kök örnekleri alınmıştır. Survey çalışmaları yılları arasında Adana-Merkez, Adana-Karataş yolu, Adana-Havutlu, Misis-Yakapınarı-Abdioğlu, Kozan- Çukurköprü, Mersin-Dikilitaş, Mersin-Iğdır, Mersin-Ataş Rafinerisi, Tarsus- Yenice deki toplam 23 farklı turunçgil bahçesinde gerçekleştirilmiştir. Şırınga ile toplam 198 ağacın gövdesine 60 sn de ve 1 sn de injekte edilen su miktarı ml olarak hesaplanmıştır. Buna göre ml/sn arasında su injekte edilen 81 ağaç, ml/sn arasında su injekte edilen 76 ağaç, 0.3 ml den fazla su alan 12 ağaç ve 1.5 ml den fazla su alan 29 ağacın olduğu belirlenmiştir. Su alımı test sonuçlarına göre 198 ağaçtan 81 i CB hastalığı açısından şüpheli bulunmuştur. Bu ağaçlar arasından ml/sn arasında su alan 45 ağaç CB hastalığı ile ilişkili p12 proteinine spesifik p12 geni için RT-PCR ile moleküler analize tabi tutulmuştur. Bu ağaçlardan 38 i RT- PCR ile p12 geninin 396 baz çifti (bç) açık okuma çerçevesinin çoğaltımı ile pozitif sonuç vermiştir. Anahtar Kelimeler: CB, p12, RT-PCR, Su testi, Turunçgiller I

4 ABSTRACT MSc THESIS SEARCHING OF CITRUS BLIGHT DISEASES POSSIBILITY IN THE EASTERN MEDITERRANEAN REGION Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ DEPARTMENT OF PLANT PROTECTION INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Doç. Dr. Mukadder KAYIM Year : 2008, Pages: 63 Jury : Doç. Dr. Mukadder KAYIM : Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU : Doç. Dr. Nihal BUZKAN In this study, surveys have been done to investigate the presence of Citrus Blight disease and diagnosis of the disease in different locations and different citrus orchards which are more than 20 years old in The Eastern Mediterranean Region. Trunks of trees showing CB-like symptoms have been water injected by syringe within 60 seconds and samples from their fibrious roots have been collected for molecular analysis. The surveys have been done in 23 different citrus orchards in Adana-Balcalı, Adana-Karataş, Adana-Havutlu, Misis-Yakapınarı-Abdioğlu, Kozan- Çukurköprü, Tarsus-Yenice, Mersin-Dikilitaş, Mersin-Iğdır and Mersin-Ataş Rafineri during One hundred and ninty eight trees have been water injected on their trunks within 60 seconds and water uptake by the trunk has been calculated as ml per second. Based on water injection test, ml of water has been uptaken by 81, ml of water has been uptaken by 76, over 0.3 ml of water has been uptaken by 12, and over 1.5 ml of water has been taken by 29 trees within one second. It has been concluded that 81 trees out of 198 have been found suspicious for CB based on water uptake test. Among these trees, 45 trees have uptaken ml of water in one second and these trees have been studied for RT- PCR for p12 gene which is spesific for CB associated protein p12. Thirty eight trees out of forty five gave positive result for the 396 bp of p12 ORF gene amplification by RT-PCR. Key Words: CB, Citrus spp., p12, RT-PCR, Water uptake II

5 TEŞEKKÜR Çalışmam boyunca bana her türlü desteği sağlayan, değerli katkılarını ve yardımlarını esirgemeyen sayın hocam Doç. Dr. Mukadder Kayım a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Araştırmada survey çalışma alanlarının saptanmasında yardımcı olan Prof. Dr. Saadettin Baloğlu na, survey esnasındaki katkılarından dolayı Yard. Doç Dr. Muharrem A. Kamberoğlu na da ayrıca teşekkür ederim. Tez çalışmasının farklı aşamalarında her türlü desteğini aldığım Bitki Koruma Bölümü personeline ve özellikle Hacı Çay a, survey çalışmamızda olan katkısından dolayı teşekkür ederim. Araştırmayı maddi olarak destekleyen Ç.Ü. Rektörlük Araştırma Fonu na katkılarından dolayı teşekkürü bir borç bilirim. Tüm hayatım boyunca yanımda olan maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen aileme, özellikle eşime ve oğluma sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Bu çalışmada emeği geçen adı geçmeyen herkese sonsuz teşekkürlerimi sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VI ŞEKİLLER DİZİNİ... VIII SİMGELER VE KISALTMALAR... X 1.GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hastalığın Etiyolojisi ve Epidemiyolojisi ile İlgili Yapılan Çalışmalar CB Hastalığının Deneysel Olarak Taşınması Hastalığın Teşhisinde Su ve Çinko Testi Analizleri Hastalığın Teşhisinde Ksilem İletim Demetlerinde Tıkaçların Mikroskobik Gözlenmesi Hastalığın Teşhisinde Serolojik Çalışmalar Hastalığın Teşhisinde Moleküler Çalışmalar MATERYAL VE METOD Materyal Metod Survey Alanları Şırınga ile Ağaç Gövdesine Su İnjeksiyon Tekniği Turunçgil Mat Solgunluk Hastalığının Moleküler Analizi Total RNA İzolasyonu cdna (Komplementer DNA) Sentezi Reverse Transcription ile Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) Agaroz Jel Elektroforez İstatistik Analiz BULGULAR VE TARTIŞMA IV

7 4.1. Ağaç Gövdesine Şırınga ile Su Testi Uygulaması Reverse Transcription ile Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) Çalışmaları İstatistik Analiz SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ EKLER EK 1 TE Tampon Çözeltisi EK 2 1 M Tris-HCl ph EK M Na 2 -EDTA ph EK 4 5XTris Borik Asit Tampon Çözelti (TBE) EK 5 Etidyumbromid (EtBr) (0.8 µg/ml) EK 6 Yükleme Tamponu (Yükleme Boyası) EK 7 PCR Reaksiyon Karışımı V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Turunçgil Mat Solgunluk (CB) hastalığının araştırılması amacıyla şırınga ile su injeksiyon testi yapılan ağaçların sayısı ve bulunduğu bölgeler Çizelge 3.2. CB hastalığının moleküler teşhisinde kullanmak amacı ile saçak kök örneklerinin alındığı bölgeler ve ağaç sayıları Çizelge 3.3. PCR kokteylinin hazırlanışı Çizelge 4.1. Adana-Balcalı da CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge 4.2. Karataş yolu ve Havutlu daki CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge 4.3. Misis-Yakapınarı-Abdioğlu nda CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı WN portakallarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge 4.4. Misis-Yakapınarı-Abdioğlu nda CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı on yaşındaki Fremont mandarin ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge 4.5. Kozan-Çukurköprü deki CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge 4.6. Tarsus-Yenice de gidilen birinci ve ikinci bahçedeki CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge 4.7. Tarsus-Yenice deki üçüncü bahçede CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı Washington Navel (WN) portakallarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları VI

9 Çizelge 4.8. Tarsus-Yenice dördüncü bahçedeki CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge 4.9. Tarsus-Yenice de beşinci ve altıncı bahçedeki CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge Mersin-Iğdır daki birinci ve ikinci bahçede CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı WN portakalı ve Minneola ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge Mersin-Iğdır da gidilen üçüncü ve dördüncü bahçede CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı WN portakalı ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge Mersin-Ataş Rafinerisi nde CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı Enterdonat limonu ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge Mersin-Dikilitaş ta gidilen 1. bahçede CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge Mersin-Dikilitaş 2. bahçede CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge Mersin-Dikilitaş 3. bahçede CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Çizelge Ağaç gövdelerinin şırınga ile su testinde bahçeler arasındaki farkların Duncan çoklu karşılaştırma testi değerleri VII

10 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Şırınga ile ağaç gövdesine su injeksiyon testinde kullanılan malzemeler Şekil 3.2. CB benzeri simptom gösteren ağaçların gövdesine şarj edilebilir bir matkap ve ahşap delici uç ile 4-6 cm lik deliğin açılması (A) ve gövdeden şırınga ile suyun injeksiyonu (B) Şekil 4.1. CB ile infekteli olduğu saptanan sağda bir Washington Navel (WN) portakalı, solda ise sağlıklı taç görünümüne sahip bir WN portakalı Şekil 4.2. Şırınga ile su testi için seçilen orta şiddette (A) ve yoğun şiddette (B) hastalık simptomları gösteren ağaçların genel taç görünümü Şekil 4.3. Karataş Yolu üzerinde CB ile infekteli olduğu şırınga ile su testi sonucu saptanan bir Fremont mandarin ağacı Şekil 4.4. Misis-Yakapınarı-Abdioğlu turunçgil bahçesinde CB için su testi yapılan ve RT-PCR için testlenen WN portakal ağaçları Şekil 4.5. Kozan-Çukurköprü de 35 yaşından büyük bir turunçgil bahçesinde şırınga ile su testi ve RT-PCR çalışmaları için kullanılan Klemantin mandarin ağaçlarının genel görünümü Şekil 4.6. Tarsus-Yenice de CB simptomu gösteren altıntop ağaçlarının (soldan iki ağaç) genel taç görünümü Şekil 4.7. CB benzeri simptom gösteren Minneola ağaç tacında seyrekleşme, dallarda kuruma, yapraklarda sararma ve sürgünlerde geriye ölüm (solda), CB benzeri simptom gösteren çoğu ağacın yakınındaki yabancı otlardan yabani böğürtlende besin elementi eksikliği görülmektedir (sağda) Şekil 4.8. Tarsus-Yenice de 30 yaşından büyük ağaçlarla genç fidanların birlikte bulunduğu bir bahçe VIII

11 Şekil 4.9. Kozan-Çukurköprü, Tarsus-Yenice, Mersin-Dikilitaş ve Mersin-Iğdır gibi farklı bölgelerin farklı turunçgil bahçelerinden saçak kök örneklerinden yapılan RT-PCR analizleri. 1-9: Tarsus-Yenice, 10: Mersin-Dikilitaş, 11: Mersin-Iğdır, 12-16,K: Kozan-Çukurköprü turunçgil bahçeleri. 1-2: Altıntop, 3-4 ve 6: WN portakalı, 5, 7-8: Satsuma mandarin, 9,10,12: WN portakal,11: Yafa Portakalı 13-16: Klemantin mandarin, 16: Sağlıklı kontrol, St: 100bç DNA standartı Şekil Balcalı-Kampüs, Kozan-Çukurköprü, Mersin-Dikilitaş ve Mersin- Iğdır gibi farklı bölgelerin farklı turunçgil bahçelerinden saçak kök örneklerinden yapılan RT-PCR analizleri , 22-23: Kozan, 20-21: Balcalı, 24,26-27: Mersin-Dikilitaş, 25, 28, 29: Mersin-Iğdır turunçgil bahçeleri. 17: WN portakalı, 18-19: Fremont mandarin, 20-24: WN portakalı, 25, 29: Minneola, 26-28: WN portakalı, 30: Psorosis ile infekteli WN portakalı, St: 100bç DNA standartı Şekil Misis-Yakapınarı-Abdioğlu ve Kozan-Çukurköprü gibi farklı bölgelerin farklı turunçgil bahçelerinden saçak kök örneklerinden yapılan RT-PCR analizleri. 31,36: Abdioğlu, 32-35: Kozan- Çukurköprü turunçgil bahçeleri. 31:WN portakalı, 32-33, 35 Fremont mandarini, 34: Psorosis ile infekteli Fremont mandarini, 36: Sağlıklı Fremont mandarini, St: 100bç DNA standartı IX

12 SİMGELER VE KISALTMALAR bç: baz çifti (base pair) CB: Turunçgil Mat Solgunluk Hastalığı (Citrus Blight) cdna: Tamamlayıcı Deoksi Ribonukleik Asit DNA: Deoksi ribonukleikasid dntp: Di nükleotid trifosfat K: Kontol KDa: Kilo Dalton µl: Mikrolitre ml: Mililitre N: Negatif Nt: Nükleotid P: Pozitif PCR: Polymerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) RNA: Ribonukleikasit RT: Reverse Transcription St: DNA Standartı (Marker) U: Unite %: Yüzde WN: Washington Navel X

13 1. GİRİŞ Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ 1. GİRİŞ Türkiye de yaş meyve ve sebze ihracatının % 5 ine sahip olan turunçgiller önemli ekonomik meyve grupları arasında yer almaktadır. Turunçgil üretimi dünyada 2007 yılı itibariyle yaklaşık olarak 115 milyon ton olup, bunun tonu Türkiye den karşılanmaktadır (FAO, 2007). Türkiye de ise turunçgil üretiminin yaklaşık % 75 i Akdeniz Bölgesi nden karşılanmaktadır. Dünyada olduğu gibi ülkemizde de turunçgillerde birçok virüs ve virüs benzeri hastalıklar önemli derecede ürün kayıplarına neden olmaktadır. Virüs benzeri hastalıklar içerisinde değerlendirilen ancak, etmeni hala gizemini koruyan Turunçgil Mat Solgunluk (Citrus Blight: CB) hastalığı dünyada turunçgil yetiştiriciliği yapılan birçok ülkede turunçgil bahçelerinde ekonomik boyutlarda yıkımlara neden olmaktadır. Brezilya da bu hastalık nedeni ile yılda ağaç, Florida da ise ağaç sökülmektedir. Bu hastalık yüz yılı aşkın zamandan beri üzerinde çalışılmasına rağmen etiyolojisi bilinmemektedir. (Swingle ve Webber, 1896). CB sadece infekteli ağaçların kök kaynaşması ve kök aşısı yolu ile taşınmaktadır (Tucker ve ark., 1984; Timmer ve ark., 1991). CB ile infekteli ağaçlarda genel olarak hastalık simptomları ağacın taç kısmında seyrekleşmeye, meyve ve yapraklarda küçülme ile yapraklarda çinko eksikliğine neden olmaktadır (Cohen, 1974; Syvertsen ve ark., 1980; Albrigo ve Young, 1981;). Diğer taraftan ağacın gövdede odun dokusunda normal ağaçlara göre 4 kat daha fazla çinko birikimi meydana gelmektedir (Wutscher ve ark., 1977). Hastalık etmeni iletim demetlerinde amorf ve lifimsi yapıda tıkaçlar oluşturduğu için ağacın su ve besin alış-veriş fizyolojisini bozmakta ve zamanla tepeden aşağıya doğru solgunluk ile birlikte kurumalar başlamaktadır (Brlansky ve ark., 1985). Bu durum özellikle şiddetli infeksiyonların olduğu ve hastalığa çok duyarlı Kaba limon ve Rangpur laymı anaçlarının kullanıldığı kombinasyonlarda görülmektedir. Turunçgil Mat Solgunluk hastalığı dünyada turunçgil yetiştirilen tüm alanlarda özellikle ılıman ve nemli iklim koşullarının hakim olduğu Amerika Birleşik Devletleri nde Florida da, Güney Amerika da Brezilya, Arjantin ve Venezuela da, Güney Afrika da, Hindistan ın güneyinde ve Avustralya da yaygın olduğu 1

14 1. GİRİŞ Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ bildirilmiştir (Derrick ve Timmer, 2000; Villalobos ve ark., 2005). Son olarak Kosta Rika ve Panama da da olduğu rapor edilmiştir (Villalobos ve ark., 2005). Akdeniz iklim kuşağına sahip ülkelerde ise CB hastalığının varlığı bildirilmemiştir. Turunçgil yetiştirilen ülkelerde farklı anaçların kullanılması bu hastalığın ortaya çıkış zamanını ve şiddetini etkilediğinden Akdeniz iklim kuşağında bu etmene rastlanmaması veya şiddetli olmaması buna bir neden olabilir. Ancak hastalık etmeni su stresine benzer simptom gösterdiğinden bu tür ağaçlar tüm bir bahçe içerisinden zaman zaman sökülerek uzaklaştırıldığından hastalığın teşhisinin yapılmasına da olanak sağlamamıştır (survey gözlemleri). Bu etmen özellikle Kaba limon (Citrus jambhiri L.) a aşılı portakal, mandarin ve limon çeşitlerini çok ciddi boyutlarda etkilemekte, ağaçların meyve vermeye başlaması ile birlikte gözle görülebilir simptomları ortaya çıkmaktadır. Genelde tüm turunçgil tür ve çeşitleri hastalıktan etkilenmekte ancak simptomların gelişimi türlere göre değişmektedir. Simptomların gelişimi yönünden değerlendirildiğinde hastalığa en duyarlı türler Kaba limon (Citrus jambhiri), Rangpur laymı (Citrus limonia) ve Üç yapraklı (Poncirus trifoliata), duyarlı türler Carrizo citrange (C. sinensis x P. trifoliata) ve Volkamer limon (Citrus volkameriana), tolerant varsayılan türler ise Cleopatra mandarini (Citrus reticulata), turunç (Citrus aurantium) ve portakal (Citrus sinensis) türleri sıralanabilir (Derrick ve Timmer, 2000). Hastalığa duyarlı ve tolerant anaçlar dikkate alındığında Doğu Akdeniz Bölgesinde turunç anacı kullanılmaktadır. Turunç anacı hastalığa en tolerant türler arasında yer almakta, dolayısı ile bu hastalık etmeni ile infekteli bir ağaç ancak yıl sonra simptom geliştirmektedir. Nitekim yapılan surveyler dikkate alındığında birçok bahçede üniform bir ağaç gelişimi gözlenmemektedir. Aralıklı olarak sökülmüş ve yerine yeni dikilmiş turunçgil fidanlarına sıklıkla rastlanmaktadır. Bu durum bu hastalığın mevcut olma ihtimalini güçlendirmiştir. Hastalığın tanılanmasında kullanılan moleküler ve serolojik testler için ticari kitlerin olmaması, hastalığın varlığının ancak bu konuda çalışan uzman kişiler tarafından testlenebileceğini göstermektedir. Hastalığın tanılanmasında önceleri simptomatolojik gözlemlerin yanısıra yerçekimine bağlı olarak veya şırınga ile gövdeden ksilem iletim demetine injeksiyon yaparak suyun ağaç tarafından alınması, yaprak ve köklerde çinko miktarının analizi gibi metodlar yaygın olarak 2

15 1. GİRİŞ Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ kullanılmıştır (Wutscher ve ark.,1977; Lee ve ark.,1984a). Daha sonraları hastalıkla infekteli ağaçlarda sağlıklı ağaçlara göre daha fazla ve farklı proteinleri sentezledikleri keşfedildikten sonra bu hastalığı tanılamada mevcut proteinlerin varlığına göre serolojik testler geliştirilmiştir (Derrick ve ark., 1991; Derrick ve ark 1992; Derrick ve ark., 1993). CB ile infekteli ağaçların sentezlediği proteinlerden 12 KDa ağırlığında olan p12 proteini ve 35 KDa moleküler ağırlığında olan p35 proteinin monoklonal antiserumları bu hastalığın teşhisinde kullanılmaktadır. P12 proteini doğrudan hastalıkla ilişkili olup CB hastalığını teşhis etmede en geçerli moleküler metod olarak p12 proteinine spesifik nükleotid dizisi RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) ile sentezlenebilmekte ve hastalık teşhis edilmektedir. P35 proteini ise sadece kök ve gövde dokularının serolojik analizlerinde kullanılmaktadır (Ceccardi ve ark., 1998). Yapılan bu tez çalışmasında yoğun olarak Doğu Akdeniz Bölgesi nde Adana ve İçel başta olmak üzere 20 yaşından büyük bahçelere gidilerek hastalıktan şüphe edilen ağaçlara şırınga ile su injeksiyon testi yapılmış ve su testine pozitif sonuç veren ağaçların saçak köklerinden doku örnekleri alınarak RT-PCR ile p12 proteinine spesifik 396 bç nükleotidlik DNA sentezlenmiştir. Bu çalışmada Doğu Akdeniz Bölgesinde Turunçgil Mat Solgunluk hastalığına benzer simptom gösteren ağaçların surveyi ve hastalık ile bulaşık olduğu şüphe edilen ağaçların gövdelerine su injeksiyon testi uygulaması ile tanılama amaçlanmıştır. Su injeksiyonu testine pozitif sonuç veren ağaçlardan moleküler tanılama amacı ile saçak köklerinden bitki doku örnekleri alınarak total RNA dan RT-PCR ile moleküler testleri de ayrıca yapılmıştır. 3

16 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Turunçgil Mat Solgunluk (CB) hastalığının varlığı ilk olarak Swingle ve Webber (1896), tarafından simptomotalojik olarak saptandıktan sonra, hastalığın etiyolojisi ile ilgili çalışmalar yoğunluk kazanmış ancak etmeni hala bulunamamıştır. Hastalık dünyanın turunçgil yetiştirilen tüm ülkelerinde özellikle ılıman ve nemli iklim koşullarının hakim olduğu Florida da, Güney Amerika da Brezilya, Arjantin, Venezuela ve Kosta Rika da, Güney Afrika da, Hindistan ın güneyinde ve Avustralya da yaygın olduğu bildirilmiş, ancak Akdeniz iklim kuşağına sahip ülkelerde ise bu hastalığın varlığı henüz bildirilmemiştir (Derrick ve Timmer, 2000, Villalobos ve ark., 2005) Hastalığın Etiyolojisi ve Epidemiyolojisi ile İlgili Yapılan Çalışmalar Turunçgil Mat Solgunluk hastalığının etiyolojisi üzerinde yüz yılı aşkın zamandan beri çalışılmaktadır (Swingle ve Webber, 1896), bununla birlikte hastalık etmeni hala gizemini korumaktadır yılından önce CB ile infekteli ağaçların köklerinden çıkan obur sürgün dallarındaki gözlerle çoğaltılarak taşınması üzerinde birçok girişimlerde bulunulmuş, ancak tüm girişimler başarısızlıkla sonuçlanmıştır (Rhoads, 1936; Cohen, 1968; Smith, 1974; Wutscher ve ark., 1983). Bu başarısızlıklar hastalığın abiyotik olma olasılığını gündeme getirmiş ve toprak ph sının, toprak yapısı ve gübreleme oranlarının bu hastalığı teşvik edebileceği üzerinde durulmuştur (Nemec ve ark., 1977; Iley ve Guilford, 1978; Wutscher ve Hardesty, 1979; Wutscher ve Lee, 1988). Ancak CB tüm toprak tiplerinde aynı tür turunçgil anacı üzerinde tüm turunçgil ağaçlarını etkilediğini ve bahçelerde infekteli ağaçların dağılım modelinin etmenin biyotik kökenli bir patojenin olduğu fikrini benimsetmiştir (Tubelis ve ark., 1991). CB ile infekteli ilk ağaçlar bahçe içerisinde rastgele dağılım göstermektedir, ancak birkaç bahçede tesadüfi olmayan dağılım modeli olduğu da bildirilmiştir (Yokomi ve ark., 1984; Chellemi ve ark., 1991). CB genelde aynı sıradaki infekteli ağacın etrafını saran ağaçları ve bitişik sıradaki sağlıklı ağaçları da bulaştırarak yayılmaktadır. Bahçenin yaşı, infekteli ağaçların sağlıklı olan ağaçlara uzaklığı, hastalığın yayılmasında ve yeni infeksiyon 4

17 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ odaklarının oluşumunda rol oynamaktadır. CB ile infekteli bahçelerde, sağlıklı ağaçlar da bulunmaktadır. Bu hastalık bahçede çok yavaş yayılmakta yılda %10 dan daha az oranda hastalık linear olarak yayılım göstermektedir. Abiyotik hastalıklar linear yayılım gösterdiğinden CB hastalığının da abiyotik olabileceğini düşündürmüştür (Yokomi ve ark., 1984; Chellemi ve ark., 1991). Brezilya da CB hastalığının çok şiddetli olarak görüldüğü bahçelerde hastalık dağılımının linear olduğu görülmüştür. Yine başka bir bahçede ise CB hastalığının artarak yayıldığı bildirilmiştir (Timmer ve Graham, 1992). Hastalığın doğal olarak kök kaynaşması yolu ile suni olarak da kök aşılaması ile taşındığı belirlendikten sonra CB hastalığı kesin olarak biyotik bir etmen olarak değerlendirilmiştir (Tucker ve ark., 1984; Lee ve ark., 1987;1988; Timmer ve ark., 1991) CB Hastalığının Deneysel Olarak Taşınması Rhoads 1936 yılında yapmış olduğu çalışmalarda Turunçgil Mat Solgunluk hastalığını farklı aşılama yöntemlerini kullanarak sağlıklı ağaçlara taşıyamadığı için bu hastalığın parazitik olmadığını bildirmiştir (Rhoads, 1936). Rhoads ın denemesinden sonra birçok araştırıcı CB ile infekteli ağaçların kök ve gövdesinden gelişen obur sürgünleri ve normal sürgün gözlerini aşılamada kullanmışlar ancak, hastalığı sağlıklı bitkilere taşıyamamışlardır (Smith, 1974; Wutscher ve ark., 1983). Feldman ve Hanks (1976) CB (Genç Ağaç Geriye Ölümü (YTD) ve Kumsaltepe Geriye Ölümü (SHD) ile benzer olarak değerlendirilmiş) ile infekteli ağaçlardan alınan doku ile Kaba limon (Citrus jambhiri L.) fidanlarını aşıladıklarında Kaba limon fidanlarının kök gelişiminde durma olduğunu bildirmişlerdir. Ancak hiç bir zaman CB ile infekteli ağaçlarda kök gelişimde azalma olduğu bildirilmemiş, ayrıca bu Kaba limon ağaçlarında CB nin tipik simptom gelişimleri de gözlenmemiştir. Lima ve Borducchi (1982) CB ile infekteli ağaçların çinko içeriğinin dört kat daha fazla olan dokularını genç turunçgil fidanlarına aşılayarak çinko birikimini taşıdıklarını ancak CB nin tipik simptomlarını elde edemediklerini bildirmişlerdir. Çinko birikim faktörünün taşınmasını daha sonraki çalışmalarında gerçekleştirememişlerdir. Yapılan tüm bu öncü çalışmalarda hiçbir araştırıcı deneysel 5

18 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ koşullarda yaptıkları aşılama yoluyla tipik hastalık simptomlarını elde edememişlerdir. Sonuç olarak bu hastalığın aşıyla taşınamadığı görüşünde birleşmişlerdir. Hastalığın aşıyla taşınması üzerinde yapılan öncü çalışmaların çoğunluğu genç fidanlara CB simptomlarının taşınması veya CB ile infekteli ağaçların kök ve sürgün gözlerinden yeni fidanlar oluşturarak hastalığı çoğaltma üzerinde olmuştur. Bu hastalığın ilk olarak aşıyla taşınması ve tipik CB simptomlarının geliştirilmesi ancak 1984 yılında Tucker ve arkadaşları tarafından kök aşısı yapılarak gerçekleştirilmiştir (Tucker ve ark., 1984). Bu araştırıcılar Turunçgil Mat Solgunluk hastalığı ile infekteli, 8 adet Kaba limon (Citrus jambhiri L.) anacına aşılı, meyve veren Pineapple portakalı (C. sinensis L.) ağaçlarını sökerek hastalığın en az görüldüğü bir alana aralarına sağlıklı ve meyve verme olgunluğuna gelmiş olan fidanlar ile birlikte dikmişlerdir. Aynı şekilde bitişik sıralara da kontrol fidanlar dikilmiştir. CB ile infekteli ağaçların kökleri ile sağlıklı ağaçların dört farklı yönden kökleri yarı dilim şeklinde kesilerek birbirlerini bütünleyecek şekilde bağlanarak aşılanmışlardır. Üç yıl sonra kök aşısı ile aşılanan fidanların gövde floem dokusunda kontrollere göre önemli derecede fazla çinko biriktirdikleri saptanmıştır. Dört yıl sonra ise bu 8 ağaçtan 7 sinin tipik CB simptomlarını (odun dokusunda çinko birikimi, ksilem iletim demetlerinde amorf ve lifimsi tıkaçlar, ağacın gövdesinde düşük su alımı vb.) oluşturduğu gözlenmiştir. Sekiz sağlıklı kontrol ağaçlardan ise sadece birisinin tipik CB simptomunu geliştirdiği bildirilmiştir. Daha sonra Timmer ve ark., (1991) kök aşısı inokülasyonu ile Turunçgil Mat Solgunluk hastalığının taşınmasını ve simptom gelişimini araştırmışlardır. Bu çalışmaya göre 1987 yılı Haziran ayında Kaba limon anacı üzerine aşılı CB ile infekteli 12 adet meyve veren Valensiya portakal ağaçları aynı kültivarın eşit sayıda sağlıklı ağaçlarının yanına dikilmiş ve daha sonra 8-10 hastalıklı kök ile sağlıklı ağacın kökleri yaklaştırılarak aşılanmıştır. Nisan 1989 da hastalıklı köklerle aşılanan sağlıklı ağaçlardan 12 tanesinden 6 sı, Ekim 1989 da ise 12 ağaçtan 7 si tipik CB simptomlarını geliştirmişlerdir. Tüm simptomlu ağaçlarda ağaç gövdesi odun dokusunda çinko birikimi ve ksilem iletim demetlerindeki amorf tıkaç oluşumu su alımını azaltmıştır. Aşılanmayan kontrol ağaçların hiçbirisi hastalıkla 6

19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ infektelenmemiştir. İkinci deneylerinde ise birinci grup olarak, Kaba limon anacına aşılı 14 Valensiya portakalının köklerini CB ile infekteli yavaş su alımı yapan ağaçların 8 kök parçası ile ikinci grup olarak, aynı şekilde diğer 14 Valensiya portakalının köklerini hızlı su alımı yapan CB ile infekteli ağaçların 8 kök parçası ile aşılamışlardır. Üçüncü grup olarak 14 Valensiya portakalı ise kontrol olup hiç aşı yapılmamıştır. İki yıl sonra birinci grupta 14 ağaçtan 11 tanesinde geriye ölüm simptomları görülmeye başlanmış, ikinci grubun 14 ağacından 8 tanesinde hastalık simptomlarının gelişimi gözlenmiş ve üçüncü grup aşılanmamış olan kontrollerde ise hiçbir simptom gözlenmemiş olup sağlıklı kalmışlardır. Aşı ile inokulasyondan iki buçuk yıl sonra ise birinci grup ağaçlardan 14 tanesinden 13 ü, ikinci grup ağaçların 14 tanesinden 9 u hastalık simptomları gösterirken, sağlıklı kontrol ağaçlardan sadece bir tanesi hastalık gelişim simptomları göstermeye başlamıştır. Bu çalışmayla Turunçgil Mat Solgunluk hastalığının kök aşılamalarıyla taşınabilen infekte edici bir ajan olduğu saptanmıştır Hastalığın Teşhisinde Su ve Çinko Testi Analizleri Cohen (1974), ilk olarak CB ile infekteli ağaçlara su testi uygulamasını yapmıştır. Su testi olarak atmosfer basıncı altında yerçekimi etkisi ile suyun ağaç gövdesinden iletim demeti yoluyla 24 saatte alınan miktarını hesaplamıştır. Bu amaçla Turunçgil Mat Solgunluk hastalığı (Citrus Blight; CB), Genç Ağaç Geriye Ölüm (Young Tree Decline; YTD) ve Kumsaltepe Geriye Ölüm (Sandhill Decline; SHD) hastalık belirtilerini gösteren ağaçların gövdesine bir matkapla delik açmış ve deliğe hipodermik bir iğne yerleştirerek ucu yukarıdan destile su asılı bir plastik boruya bağlamıştır. Hastalıklı ağacın gövdesinden 24 saat içerisinde normal atmosfer basıncı altında alınan suyun miktarını hesaplayarak aynı koşullar altında sağlıklı ağaç tarafından alınan su miktarı ile karşılaştırmıştır. Buna göre sağlıklı ağaçlar normal atmosfer basıncı altında hastalıklı ağaçlardan en az 10 kat daha fazla iletim demetlerine su alırlarken, YTD ve CB ile infekteli ağaçlarda bazen hiç su alımı olmadığını, buna karşılık Tristeza, Exocortis, Xyloporosis ve Phytophthora ile infekteli ağaçlarda yüksek miktarlarda ( ml/24 saat) su alımı gerçekleştiğini tespit etmiştir. 7

20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Wutscher ve ark., (1977) CB ile infekteli ağaçların su alımının düşük olduğunu ve gövdedeki odun dokusunda çinko birikimi ile suda çözünebilir fenoliklerin yüksek oranda olduğunu tespit etmişlerdir. Wutscher ve ark., (1977) CB simptomu gösteren ağaçların sağlıklı ağaçlardan ( ml/24 saat) önemli bir şekilde daha az su aldığını (0-22 ml/24 saat), tristeza, su zararı, Rio grande gummosis, exocortis, xyloporosis, dip çürüklüğü ve nematodlardan dolayı ağaçlarda oluşan geriye ölümler karşılaştırıldığında tristezayla infekteli altıntopun (527 ml/24 saat) ve xyloporosis ile infekteli Valensiya portakalının (471 ml/24 saat) sağlıklı kontrollerden ( ml/24 saat) daha fazla su aldığını tespit etmişlerdir. CB ile infekteli ağaçlarda odun dokusundaki çinko seviyelerinin önemli bir şekilde daha yüksek olduğunu saptamışlardır. Ayrıca suda çözülebilir fenolik bileşikler CB ve Exocortis ile infekteli ağaçlarda daha yüksek oranda bulunmuştur. Türkiye de ise Azeri (1980) nin İzmir ilinde yapmış olduğu Üç yapraklı (Poncirus trifoliata L. Raf.) anacı üzerine aşılı ve ani ölüm simptomları gösteren Satsuma mandarini (Citrus unshiu Marc.) ağaçlarının köklerinden alınan örnekler ile yapılan mikroskobik incelemelerde ölüm belirtileri gösteren hasta ağaçların kökleri ile bu ağaçlara yakın olan sağlıklı ağaçların kök kesitlerinin, ksilem iletim demetlerinde CB nin karakteristik belirtisi olan tıkaçlar saptanmıştır. Işık mikroskobu ile yapılan bu anatomik incelemeler için Üç yapraklı (Poncirus trifoliata L. Raf.) anacına ait kök örneklerinden dondurucu mikrotom aleti ile uzunlamasına 40 mikron incelikte kesitler alınmış ve alınan bu kabuk kesitleri pamuk mavisi ve laktofenol ile boyandıktan sonra CB nin ksilem iletim demetlerinde oluşturduğu tipik tıkaçlar incelenmiş ve mm³ teki tıkaç miktarı saptanmıştır. Azeri den sonra bu konuda yılına kadar hiçbir çalışmaya rastlanmamıştır. Turunçgil Mat Solgunluk hastalığının daha hızlı testlenmesinde su analizi için şırınga ile suyun ağaç gövdesine injeksiyonu Lee ve ark., (1984b) tarafından geliştirilmiş ve kullanımı diğer testlere göre çok daha pratik bulunmuştur. Şırınga ile su testini uygulayan Lee ve ark., (1984b) ağaçların dikkatli bir şekilde görsel tanısıyla kombinasyon içindeki şırınga injeksiyon testinin CB nin tanılanmasında oldukça güvenilir olduğunu ve sağlıklı ağaçların saniyede 0.5 ile 1.5 ml arasında, CB ile infekteli ağaçların ise 0 ile 0.3 ml arasında su aldığını bildirmişlerdir. 8

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ 2.4. Hastalığın Teşhisinde Ksilem İletim Demetlerinde Tıkaçların Mikroskobik Gözlenmesi Cohen ve ark., (1983) ile Brlansky ve ark., (1984) amorf tıkaçların Turunçgil Mat Solgunluk Hastalığı ile etkilenen ağaçlarda karakteristik olduğunu ve bu tıkaçların varlığı ile ağacın gövdesindeki çinko birikimi ve su alımında azalmanın tanılamada kullanılabileceğini tespit etmişlerdir. Brlansky ve ark., (1984) yaptığı çalışmada lifimsi tıkaçların su akışını kısıtlamada katkıda bulunabildiğini ancak CB için spesifik olmadığını saptamışlardır. Su alımında amorf tıkaçların sayısı ve ağaç tacındaki seyrekleşme ve ölüm arasında bir ilişki olduğunu tespit etmişlerdir. Enine kesit alınmış 200 ksilem iletim demetinde 5-10 amorf tıkaç bulunduğunda sağlıklı ağaçlarda 0.82 ml/sn olan su alımı 0.30 ml/sn olarak azaldığını gözlemlemişlerdir. Brlansky ve ark., (1987), CB li ve geriye ölüme neden olan diğer hastalıklarla infekteli turunçgil ağaçlarının gövdesindeki ksilem demetlerini yapısal olarak karşılaştırmışlardır. Buna göre CB, tristeza, Psorosis A, Concave gum, Stubborn (Spiroplasma citri), Phytophthora dip çürüklüğü hastalık etmenleri ve nematod (Pratylenchus coffeae) ile infekteli ağaçları karşılaştırmışlar. Lifimsi tıkaçları çoğunlukla CB ile infekteli ağaçlarda gözlemişler ancak Stubborn, hastalık kombinasyonlarından dolayı turunçgilde geriye ölüm, Tristeza, Phytophthora dip çürüklüğü ve sağlıklı ağaçların ksilem iletim demetlerinde de bu yapıların mevcut olduğunu tespit etmişlerdir. Yalnız, amorf tıkaçlar CB ile infekteli ağaçlarda daha çok gözlenmiştir. Bu tıkacın benzer bir tipi Psorosis ve Concave gum ile infekteli ağaçlarda ışık mikroskobuyla gözlenmiştir. Ancak Psorosis ve Concave gumlı ağaçlardaki amorfa benzer tıkaçlar Scanning elektron mikroskobuyla CB ile infekteli ağaçlarda bulunanlardan ayırt edilmiştir. Böylece amorf tıkaçların CB li ağaçlarda karakteristik olduğu, çinko birikimi ve su alımında azalmayla beraber tanılamada kullanılabileceği tespit edilmiştir. Beretta ve ark., (1988) Brezilya da turunçgil ağaçlarının geriye ölümünün sebebi bilinmeyen vaskular bir hastalık olduğu ve Florida daki Turunçgil Mat Solgunluk hastalığına benzediğini saptamışlardır. Her iki hastalık ağaç gövdesinin odun dokusunda ağaçlardaki su akışının sınırlanmasına sebep olan çinko birikimi ve 9

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ ksilemde oluşan tıkaçlarla karakterize edilmektedir. Brezilya daki Declinio ve Florida daki CB ile infekteli ağaçlardaki ksilem iletim demetlerinde bulunan tıkaçların histokimyasal boyama reaksiyonlarını karşılaştırmışlardır. Her iki hastalıkta amorf tıkaçlar kalloz, lignin, pektik maddeler, zamklar (reçineler), proteinler ve lipidlerle pozitif bir şekilde reaksiyon göstermektedir. Lifimsi tıkaçlar ligninler, reçineler, proteinler ve lipidlerle pozitif bir şekilde koyulaştırılmaktadır. Bu sonuçlar Declinio ve CB hastalığında bulunan benzer ksilem tıkaçlarını göstermekte ancak iki tıkaç tipide kimyasal oluşumlarıyla farklılık göstermektedir. Lee ve ark., (1991) yaptığı survey çalışmasında Güney Afrika ve Swaziland ın yoğun olarak turunçgil üretimi yapılan alanlarında Turunçgil Mat Solgunluk hastalığının varlığını doğrulamak için yürütmüşler ve hastalığın dağılımını saptamışlardır. Bu amaçla su injeksiyon testleri ağaç gövdesinin ksilemindeki analizleri ve bazı durumlarda ksilem iletim demetlerindeki tıkaçlar için histolojik tetkikler yapılarak CB yi tanılayarak test etmişlerdir. Survey yapılan alanların turunçgil yetiştiriciliğinin yapıldığı daha sıcak bölgelerinde CB nin meydana gelmesinin daha fazla olduğunu saptamışlardır. Timmer ve ark., (1988) ise geriye ölüm simptomu gösteren ağaçlarla sağlıklı turunçgil ağaçlarının iletim demetlerindeki su akışına, ağaç gövdesi ksileminin derinliğinin, lifimsi ve amorf yapıdaki tıkaçların etkisini araştırmışlardır. CB ve diğer CB benzeri geriye ölüm hastalıkları tarafından etkilenen ağaçların ksilem iletim demetindeki su akışının ksilem emilmeleriyle kısıtlandığını gözlemlemişlerdir. Florida da CB ve Arjantin de Declinamiento ile etkilenen ağaçların gövdesinin, Arjantin deki sağlıklı görünen ancak iyi gelişmeyen ağaçların, Florida da Phytophthora dip çürüklüğü ve Tristeza ile etkilenen ağaçların, Florida ve Arjantin de sağlıklı ağaçların ksilem iletim demetlerini içeren gövde kısımlarını incelemişler. Buna göre amorf ve lifimsi tıkaçların ve ağaç gövdesi ksilemindeki derinliğin su akışındaki azalmaya katkıda bulunduğu ancak amorf tıkaçların CB li turunçgil ağaçlarındaki su akışının azalmasında en önemli faktör olduğunu tespit etmişlerdir. 10

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ 2.5. Hastalığın Teşhisinde Serolojik Çalışmalar Derrick ve ark., (1990a; 1990b; 1991; 1992) ile Bausher (1990), Bausher ve Sweeney (1991), ilk olarak CB ile infekteli ağaçların serolojik tanılama yapmaya olanak sağlayacak 7 farklı proteini sentezlediklerini SDS-PAGE elektroforez ve Dot Blot analizleri ile göstermişlerdir. Derrick ve ark., (1991) sağlıklı ve CB li ağaçların kök ve gövdelerinden alınan parçalarının vakumla hazırlanan ekstraktlarının SDS- PAGE de analiz edilmesiyle sağlıklı ağaçların ekstraktlarındaki düşük ya da hiç olmayan konsantrasyonlarla hastalıklı ağaçların ekstraktlarındaki birkaç proteini ortaya çıkarmışlardır. Bu araştırıcılar ayrıca ekstraktları santrifüj ederek elektron mikroskobu ile tortuları incelendiklerinde lifimsi yapıları gözlemlemişlerdir. CB ile infekteli ağaçların köklerinde ve yapraklarında bulunan kendine özgü proteinlerin diğer hastalıklardan ayırt edilmesinde kullanılması serolojik testlerin gelişimine yol açmıştır. Derrick ve ark., (1992) CB etmeninden etkilenen ağaçların köklerinin ksilem iletim demeti sıvısından saflaştırılan 35 KDa ve 12 KDa proteinlerden poliklonal antiserumları üretmişlerdir. 35 KDa proteinin antiserumu CB li ağaçların köklerinden ve gövdelerinden izole edilen ekstraktların saptanması için, 12 KDa proteinin antiserumu ise CB li ağaçların kök ve olgun yapraklarının özsu ekstraktları için CB hastalığını saptamak amacı ile kullanılmaktadır. P12 proteini için spesifik 12 KDa antiserumun ilk testi Western blot analiziyle yapılmıştır. Turunçgil Mat Solgunluk hastalığı ile infekteli ağaçların ksilem iletim demeti sıvısında özellikle 35 KDa ve 12 KDa proteinlerin bulunduğu Derrick ve ark., (1993) tarafından ispatlanmış ve bu proteinlere spesifik mono ve poliklonal antiserumların geliştirilmesi sağlanmıştır. CB ile infekteli ağaçların teşhisinde rutin çalışmalar için p12 proteinine spesifik olan monoklonal antiserumu yaprak ekstraktları için kullanılmaktadır. P12 proteini patentli olup, bu proteinlerin antiserumları hala ticari olarak üretilmemektedir. Sadece bilimsel çalışma amacı ile antiserumlarının üretimi mümkündür. Brlansky ve Howd (2002), Florida da CB ile infekteli Carrizo citrange (C. sinensis (L.) Osbc. X Poncirus trifoliata (L.) Raf.) ve Kaba limon (C. jambhiri L.) anacına aşılı portakal ağaçlarının köklerinden doku örnekleri alarak çeşitli testler 11

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ yapmışlardır. Bu testlerden birisi cesium sulfate gradient santrifüj yöntemini kullanarak bu doku örneklerinden ipliğimsi yapıda virüs benzeri partikülleri izole ettiklerini elektron mikroskobu çalışmaları ile göstermişlerdir. Diğer bir testte kök dokularında 23 ve 29 KDa büyüklüğünde proteinlerin varlığını SDS-PAGE jel ve Western blot analizleri ile göstermişlerdir. Ancak bu araştırıcılar virüs benzeri partikülleri sağlıklı bitkilere inokule ettiklerinde, CB hastalığına spesifik olan p12 proteinin varlığını saptayamamışlardır Hastalığın Teşhisinde Moleküler Çalışmalar Derrick ve ark., (1992) tarafından p12 proteinin antiserumu CB için spesifik olduğu belirlendikten sonra bu proteinin aminoasit dizilimi ve gen dizi analizleri Ceccardi ve ark., (1998) tarafından gerçekleştirilmiş ve elde edilen gen dizisinin gerçekten başka genlerle örtüşmediği, sadece CB hastalığına özel olduğu anlaşılmıştır. Bu şekilde teşhisleri daha hızlı yapmak amacı ile CB için moleküler tanılama yöntemi geliştirilmiştir yılında p12 proteini Li ve arkadaşları tarafından yeni bir protein familyası olan Gamma Ekspansin olarak sınıflandırılmıştır (Li ve ark., 2002). P12 proteinin fonksiyonunun belirlenmesi amacı ile ilk olarak Kayım ve ark., (2004) p12 proteinini kodlayan genin 396 bç açık okuma bölgesi (ORF) ni sens ve antisens yönlerde klonlayarak Carrizo citrange (C. sinensis (L.) Osbc. X Poncirus trifoliata (L.) Raf.) bitkilerine aktarmışlardır. Yaptıkları çalışma sonunda çok sayıda sens ve antisens transgenik bitkileri elde etmişlerdir. Bu bitkilerden sens transgeniklerin p12 proteine spesifik proteini sentezlediklerini, antisens transgenik bitkilerin ise p12 protein sentezini bloke ettiklerini göstermişlerdir. Ancak proteinin ekspansin familyasına bağlı olması nedeni ile hücresel yapıda genleşme veya hücre hacim büyümesi gibi bazı değişiklikler yapması beklenirken transgenik bitkilerdeki hücre yapısında herhangi bir farklılık yapmadığını konfokal mikroskopta yapmış oldukları inceleme sonucunda bildirmişlerdir. Proteinin hastalıkla ilişkisini transgenik bitkiler meyve verme olgunluğuna ulaştığında elde edeceklerini bildirmişlerdir. Bu konuda çalışmaları hala devam etmektedir (Kayım ve ark., 2008). 12

25 3. MATERYAL ve METOD Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ 3. MATERYAL ve METOD 3.1. Materyal Çalışma yılları arasında Çukurova Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bitki Koruma Bölümü, Biyoteknoloji laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. Çalışmada Turunçgil Mat Solgunlık (CB) hastalığının araştırılması amacı ile bitki materyali olarak Adana-Merkez, Adana-Karataş yolu, Adana-Havutlu, Misis- Yakapınarı-Abdioğlu, Kozan-Çukurköprü, Mersin-Dikilitaş, Mersin-Iğdır, Mersin- Ataş Rafinerisi ve Tarsus-Yenice deki turunçgil bahçelerindeki hastalık simptomu gösteren ağaçların gövdesi su injeksiyon testi için, saçak kökleri ise moleküler analizler için kullanılmıştır. Su testi için şarj edilebilir bir matkap, mm çapında 4-6 cm uzunluğunda ahşap delici uç, 20 ml lik plastik şırınga ve destile su kullanılmıştır (Şekil 3.1.). RT-PCR analizi için şırınga testinden pozitif sonuç alınan ağaçların toprak yüzeyine yakın saçak köklerinden en az 2-5 gr kadar doku örnekleri alınarak moleküler analizler yapılıncaya kadar -20 C de muhafaza edilmiştir (Çizelge 3.1.). Moleküler analiz için RT-PCR çalışmalarında kullanılan kitler PROMEGA firmasından temin edilmiş olup, agaroz jel elektroforez için gerekli solüsyonlar ve tampon çözeltiler ekler kısmında verilmiştir. Şekil 3.1. Şırınga ile ağaç gövdesine su injeksiyon testinde kullanılan malzemeler 13

26 3. MATERYAL ve METOD Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Çizelge 3.1. Turunçgil Mat Solgunluk (CB) hastalığının araştırılması amacıyla şırınga ile su injeksiyon testi yapılan ağaçların sayısı ve bulunduğu bölgeler Şırınga ile Su İnjeksiyon Testinin Şırınga ile Su injeksiyon Testi Yapıldığı Bölgeler Yapılan Ağaçların Sayısı Adana-Havutlu 3 Mersin-Ataş Rafinerisi 9 Adana-Karataş Yolu 13 Adana-Balcalı Kampüsü 15 Kozan-Çukurköprü 18 Misis-Yakapınarı-Abdioğlu 29 Mersin-Iğdır 30 Mersin-Dikilitaş 37 Tarsus-Yenice 44 Toplam 198 Çizelge 3.2. CB hastalığının moleküler teşhisinde kullanmak amacı ile saçak kök örneklerinin alındığı bölgeler ve ağaç sayıları Saçak Kök Örneklerinin Alındığı Bölgeler Ağaç Sayısı Mersin Ataş Rafinerisi 1 Adana- Balcalı Kampüsü 6 Adana-Havutlu 3 Mersin-Iğdır 11 Mersin-Dikilitaş 8 Misis-Yakapınarı-Abdioğlu 6 Adana-Karataş Yolu 8 Tarsus-Yenice 18 Kozan-Çukurköprü 18 Toplam 81 14

27 3. MATERYAL ve METOD Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ 3.2. Metod Survey Alanları Doğu Akdeniz Bölgesi turunçgil bahçelerinde tipik CB simptomuna benzer hastalıklı ağaçları saptamak amacı ile Adana-Merkez, Adana-Karataş yolu, Adana- Havutlu, Misis-Yakapınarı-Abdioğlu, Kozan-Çukurköprü, Mersin-Dikilitaş, Mersin- Iğdır, Mersin-Ataş Rafinerisi, Tarsus-Yenice deki toplam 23 farklı turunçgil bahçesinde survey çalışmaları yürütülmüştür Şırınga ile Ağaç Gövdesine Su İnjeksiyon Tekniği Aşı noktasının cm yukarısında ağaç gövdesine şarj edilebilir matkap (Şekil 3.1.) kullanılarak mm çapında matkap ucu ile 4-6 cm uzunluğunda bir delik açılmış ve deliğin ağzındaki doku parçaları temizlendikten sonra 10 ml destile su içeren 20 ml lik plastik şırınganın (Şekil3.1.) ucu ağaç gövdesindeki deliğe yerleştirildikten sonra maksimum insan gücü (60-90 kg) kullanılarak şırınga içerisindeki su piston ile durmaksızın gövdeye enjekte edilmiştir (Şekil 3.2.). Bu şekilde enjekte edilen su miktarı ölçülerek Lee ve ark., (1984b), tarafından geliştirilen yönteme göre saniyede ml su enjekte edilen ağaçlar hastalıklı varsayılmış. Bu değerlerin üzerinde ağaç gövdesine su enjekte edildiğinde ise bu hastalığın olmadığı varsayılmıştır. Veriler 10 ml suyun injeksiyonu için gereken zaman (sn) veya 60 sn de enjekte edilen su miktarı (ml) olarak hesaplandıktan sonra 1 sn de enjekte edilen su miktarı (ml) belirlenmiştir. 15

28 3. MATERYAL ve METOD Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ A B Şekil 3.2. CB benzeri simptom gösteren ağaçların gövdesine şarj edilebilir bir matkap ve ahşap delici uç ile 4-6 cm lik deliğin açılması (A) ve gövdeden şırınga ile suyun injeksiyonu (B) Turunçgil Mat Solgunluk Hastalığının Moleküler Analizi CB hastalığının moleküler teşhisi için RT-PCR analizi Ceccardi ve ark., (1998), tarafından hastalığa spesifik p12 proteini için izole edilen gen için yapılmıştır. Bu amaçla öncelikle hastalıklı ve sağlıklı ağaçların saçak köklerinden toplam RNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. RNA izolasyonundan sonra p12 genine spesifik olan tamamlayıcı DNA (cdna) sentezlenmiş ve bu cdna dan polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yapılmıştır Total RNA İzolasyonu Şırınga ile su injeksiyon testinden pozitif sonuç alınan ağaçların köklerinden toplam RNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. RNA izolasyonu için RNA Qiagen mini bitki RNA izolasyon kiti kullanılmıştır. Buna göre RNA izolasyonu aşağıda belirtildiği şekilde gerçekleştirilmiştir. RNA izolasyonunda bitki materyali olarak kullanılacak olan kökler yıkanıp saf sudan geçirildikten sonra kurutulup 100mg olarak tartılarak 2ml lik efendorf tüplere konulmuştur. Tartılan örnek hemen sıvı azot içerisine daldırılmış ve içerisine sıvı azot alınan örnek bir çubuk yardımıyla 16

29 3. MATERYAL ve METOD Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ ezilmiştir. Daha sonra bir kürdan yardımıyla sıvı azotun buharlaşması sağlanmıştır. Toz halindeki bu bitki dokusuna 450μl RLT solüsyonu (Qiagen kiti) konulmuş ve 56ºC deki su banyosunda 3 da bekletilmiştir. Sonra rpm de 15 sn santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda tüpün üst kısmında toplanan sıvı kısım alınarak koleksiyon tüpü içerisindeki QIAshredder mini kolona (lila) aktarılmış ve rpm de 1 da santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda toplam RNA kolondan koleksiyon tüpüne geçmiştir. Koleksiyon tüpü dikkatli bir şekilde tutularak, tabanda biriken tortuya dokunmadan sıvı kısım (yaklaşık 400 μl) yeni bir santrifüj tüpüne transfer edilmiş ve içerisine total RNA hacminin yarısı kadar 200 μl saf etanol konularak pipet ile karıştırılmıştır. Yaklaşık 600μl olan toplam RNA sıvısı 2ml lik koleksiyon tüpü içerisine konulan QIAshredder mini kolon (pembe) içerisine pipetle konularak kapağı yavaşça kapatılmış ve rpm de 15 sn santrifüj edilmiştir. Bu aşamada toplam RNA nın kolonda tutulması sağlanmıştır. Santrifüjden sonra koleksiyon tüpü boşaltılmış ve temiz bir peçeteye vurularak tamamen kuruması sağlanmıştır. Sonra tekrar RNA nın toplandığı QIAshredder mini kolon (pembe) koleksiyon tüpü içerisine yerleştirilerek içerisine RW1 solüsyonundan 600μl konulmuş ve rpm de 15sn santrifüj edilmiştir. Koleksiyon tüpünde biriken RW1 atık solüsyon boşaltılmış ve tekrar içerisine QIAshredder mini kolon (pembe) yerleştirilmiş ve 500μl RPE solüsyonu ilave edilerek rpm de 15 sn santrifüj edilmiştir. İkinci kez QIAshredder mini kolon (pembe) 500μl RPE solüsyonu ile yıkanmış ve tekrar rpm de 2 da santrifüj edilmiştir. Bu arada RNA için hazır su 56ºC su banyosunda inkübe edilerek ılıtılmıştır. QIAshredder mini kolonun (pembe) ucu temiz bir peçeteye silinerek başka bir 1,5ml lik efendorf tüpe alınmış, daha sonra 30μl ılıtılmış hazır su bir pipet ile kolonun tam ortasına emdirilmiş ve 1 da oda sıcaklığında bekletildikten sonra 1 da rpm de santrifüj edilmiştir. Bu şekilde toplam RNA nın kolondan efendorf tüpe geçmesi sağlanmıştır. Yaklaşık 26-28μl toplam RNA solüsyonu elde edilmiştir. 17

30 3. MATERYAL ve METOD Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ cdna (Komplementer DNA) Sentezi Bu çalışmada RNA dan tamamlayıcı DNA (cdna) sentezi iki farklı yöntemle gerçekleştirilmiştir. Birinci yöntemde Kayım ve ark. (2004) nın protokolleri uygulanmış, ikinci yöntemde ise Roche kitleri için Roche protokolleri uygulanmıştır. Kayım ve ark. (2004) na göre uygulanan yöntemde RNA dan komplementer DNA (cdna) elde etmek için; bir santrifüj tüpüne 9 µl RNA, 2μl p12- revers primer (5'- AGCCTGATTGAACTCATCTTGATC-3') ve 4.5 μl steril miliq H 2 0 konulup karıştırılarak 65 C de 5 da inkübe edilmiş ve hızlı bir şekilde buz üzerinde 2 da soğutulmuştur. Daha sonra toplam 25 μl hacim cdna sentezi olacak şekilde yukarıda belirtildiği üzere hazırlanan15.5 μl sıcaklık uygulanmş total RNA karışımı 9.5μl cdna kokteyli [5 μl 5X AMV tampon çözelti, 1 μl rrnasin (40U/1μl), 2.5 μl dntp (2mM), 1μl AMV revers transcription (RT) (9U/1μl)] ile birleştirilerek 42 C de 1 saat inkübe edilmiş ve p12 protein genine spesifik cdna sentezi gerçekleştirilmiştir. Roche protokollerine göre yapılan cdna sentezinde ise 5 µl RNA, 1,4μl p12- revers primer ve 5 μl steril miliq H 2 0 solüsyonu bir 1.5 ml lik efendorf tüpte karıştırılarak 65 C de 10 da inkübe edilmiş ve hızlı bir şekilde buz üzerinde 2 da soğutulmuştur. Daha sonra bu karışım 8.5 μl cdna kokteyli[4 μl 5XReaction tampon çözelti, 0.5 μl protector RNase inhibitor (40U/1 μl), 2 μl dntp (2mM), 1μl DDT, 1 μl RT ] ile birleştirilip, 42 C de 30 da inkübe edilmiş ve daha sonra buzda 2 da soğutularak rpm de 10 sn santrifüj edilerek sentezlenen cdna nın tüpün dip kısmında toplanması sağlanmıştır Reverse Transcription ile Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) Daha önceden hazırlanmış olan PCR kokteyli (5 µl 5XAMV tampon çözelti, 2.5 µl dntps, 1 µl Rnasin, 0.5 µl AMV reverse transcription enzimi) RNA solüsyonu üzerine ilave edilerek 42 C de 1 saat inkübe edilmiştir (Çizelge 3.3.). Bu süre sonunda cdna elde edilmiştir. Elde edilen cdna santrifüj ile 10 sn çöktürüldükten sonra içerisinden 1 µl alınarak şablon DNA olarak PCR da 18

31 3. MATERYAL ve METOD Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ kullanılmıştır. PCR amacı ile kullanılacak olan primerler p12 proteinini kodlayan (cdna: 396 nt, ORF: açık okuma bölgesi) genin 5' ve 3' yönünden tüm gen için dizayn edilmiş olan sens p12f5'-atgggtgtaggcacaaaagttctg-3' ve antisens p12r-5'-agcctgattgaactcat-cttgatc-3' 10µM olarak, 200µM dntp, 3mM MgCl 2, 1/10 hacim 10X tampon çözelti, 1 µl cdna, 25µl ye tamamlayacak kadar miliq H 2 O ve 1U Taq polimeraz solüsyona ilave edilmiştir. 396 nt sentezi için RT-PCR döngüsü başlangıç için 94 C de 2 da tutulduktan sonra 30 döngü için, 94 C de 30 sn, 62 C de 30 sn, 72 C de 1 da ve son bitiş döngüsü 72 C de 5 da olarak tamamlanmıştır (Ceccardi ve ark., 1998). Çizelge 3.3. PCR kokteylinin hazırlanışı PCR Kokteyli 10XTampon Çözelti+3mMMgCl 2 Primer p12-f (10μM) Primer p12-r (10μM) dntp10x (2mM) dh 2 0 cdna (en son ilave edilir) (20-50ng) Taq polimeraz(5u/1μl) Toplam 25μl Hacim için 2,5 μl 2,5 μl 2,5 μl 2, 5 μl 13,8 μl 1.0 μl 0,2 μl 25 μl Agaroz Jel Elektroforez Agaroz jel 1XTBE [(Trizma, Borik asit, EDTA) (EK 4)] elektroforez tampon çözeltisi kullanılarak hazırlanmıştır. %2 lik agaroz (Tip I, SİGMA) içeren jeller 1XTBE içerisinde mikrodalga fırında eritilmiş ve 60 C ye kadar soğutulduktan sonra iki tarafı kapalı taraklı jel kalıbına dökülmüştür. Agaroz katılaştıktan sonra tarak çıkartılmış, jel kalıbı aynı tampon çözeltiyi içeren elektroforez tankına 19

32 3. MATERYAL ve METOD Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ yerleştirilmiştir. cdna örnekleri 1/10 yükleme tampon çözeltisi (%25 bromofenol mavisi ve %25 Fikol ( )) içerisinde bir pipet yardımı ile çukurlara yerleştirilerek 70 Voltta 1.5 saat elektroforez edilmiştir. Bu şekilde ( ) yüklü DNA nın (+) yüklü anota doğru ilerlemesi sağlanmış ve bromofenol mavi boya DNA dan belirli bir mesafe uzaklaştıktan sonra elektroforez tamamlanmıştır. Daha sonra jel 0.5 μg/ml etidyum bromid ile dakika boyanmış ve destile su ile yıkanmıştır. Bu şekilde etidyum bromid ile boyanan PCR ile çoğaltılmış cdna örnekleri 260 nm dalga boyunda bir UV transillimünatör (Vilber Lourmat) üzerinde görülebilir duruma getirtilmiş ve digital fotoğrafı çekilmiştir İstatistik Analiz Ağaç gövdelerine injekte edilen suyun bahçeler arasındaki istatiksel değeri saptamak amacı ile SPSSX programı kullanılarak tek yönlü varyans analizi ile yapılmış olup, ortalamalar ise Duncan çoklu karşılaştırma testi kullanılarak uygulanmıştır (SPSSX 2006). 20

33 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ 4. BULGULAR ve TARTIŞMA yılları arasında Adana ve Mersin illeri merkez ve ilçelerindeki turunçgil bahçelerinde yapılan survey çalışmaları sonucunda ağaç gövdesine uygulanan şırınga ile su testi verileri bölgelere göre sırasıyla değerlendirilerek aşağıda verilmiştir. Şırınga ile su testi verileri CB hastalığı açısından pozitif bulunan ağaçların saçak kök örneklerinden moleküler tanılama amacı ile yapılan RT-PCR çalışma sonuçları da ayrıca verilmiştir Ağaç Gövdesine Şırınga İle Su Testi Uygulaması Survey yapılan turunçgil bahçelerinde Turunçgil Mat Solgunluk (CB) benzeri simptom gösteren ağaçlarda ve kontrol amaçlı olarak sağlıklı görünen ağaçlarda su testi uygulanmıştır (Şekil 4.1., 4.2.). Ayrıca CB Hastalığı ile diğer hastalık etmenlerinin sonuçlarını karşılaştırmak amacı ile Psorosis, Tristeza, Phytophtora citrophthora ve Spiroplasma citri ile infekteli ağaçlara da şırınga ile su analizi yapılmıştır. Testler sonucunda ağaçların 60 sn de ve 1 sn de gövdelerine aldıkları su miktarları ml olarak belirlenmiştir. Ağaç gövdesine su alımı testi 23 farklı bahçede, toplam 198 farklı turunçgil ağacı gövdeleri üzerinde yapılmış ve sonuçları sırasıyla Çizelge 4.1., 4.2., 4.3., 4.4., 4.5., 4.6., 4.7., 4.8., 4.9., 4.10., 4.11., 4.12., 4.13., ve de verilmiştir. Şekil 4.1. CB ile infekteli olduğu saptanan sağda bir Washington Navel (WN) portakalı, solda ise sağlıklı taç görünümüne sahip bir WN portakalı 21

34 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ A B Şekil 4.2. Şırınga ile su testi için seçilen orta şiddette (A) ve yoğun şiddette (B) hastalık simptomları gösteren ağaçların genel taç görünümü Adana Balcalı Kampüsü turunçgil bahçesinde sağlıklı taç görünümüne sahip bir ve hastalıklı taç görünümüne sahip 14 adet olmak üzere, toplam 15 farklı 22

35 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ mandarin, portakal ve limon ağaç gövdelerine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelge 4.1. de verilmiştir. Çizelge 4.1. Adana-Balcalı da CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Kalem a Su alımı (ml/60sn) Su alımı (ml/sn) Sağlıklı taç görünümü Satsuma ** Gövde ve ana dallarında çatlama Rize ** Gövdede çukurlaşma,kavlama Satsuma ** Taçta seyrekleşme ve kuruma WN * Ana gövdede çukurlaşma,kavlama Enterdonat * Ana gövdede çukurlaşma, çatlama WN * Geriye ölüm Satsuma Gövde ve ana dallarında çatlama Rize Taçta seyrekleşme ve kuruma WN Yaprakta renk açılmaları WN Geriye ölüm Enterdonat Geriye ölüm WN Yapraklarda renk açılması ve kıvrılma WN Gövde ve ana dallarında çatlama WN Ana gövdede çukurlaşma WN 60 1 a Ağaçlar yirmi yaşından büyük * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar ** CB için moleküler teşhisi yapılan ağaçlar Yapılan su testinde 60 sn de en az 5 ml ve en fazla 60 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte edilmiştir. Buna göre 1 sn de 0.5 ile 1 ml su alan 2 ağaç, 0.08 ile 0.3 ml arasında su alan 11 ağaç, 1 ağacın 0.33 ml ve 1 ağacında 0.45 ml su aldığı belirlenmiştir (Çizelge 4.1.). Sağlıklı taç görünümüne sahip Satsuma mandarin ağacı 23

36 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ simptomatolojik açıdan hastalıklı görünüme sahip ağaçlardan gövdesine daha az su (0.11 ml) alımı gerçekleşmiş, diğer taraftan ana gövdede çukurlaşma simptomu gösteren limon ağacı gövdesine sağlıklı ağaçlarda olduğu gibi saniyede 1.0 ml su alımı gerçekleşmiştir. Karataş yolu ve Havutlu daki turunçgil bahçesinde ise 3 sağlıklı görünüme sahip 13 hastalıklı, toplam 16 farklı mandarin, portakal ve limon ağaç gövdelerine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelge 4.2. de verilmiştir. Bu bahçedeki Fremont mandarin ağaçları bizim tarafımızdan yapılan şırınga ile su injeksiyon testinden hemen sonra kesilerek imha edilmiştir (Şekil 4.3.). Şekil 4.3. Karataş yolu üzerinde CB ile infekteli olduğu şırınga ile su testi sonucu saptanan bir Fremont mandarin ağacı Yapılan su testinde 60 sn de en az 9 ml ve en fazla 200 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su injekte edilmiştir. Buna göre 1 sn de 0.58 ile 1 ml arasında su alan 7 ağaç, ml su alan 5 ağaç, 0.33 ml su alan 1 ağaç, 0.4 ve 0.43 ml su alan 2 ağaç ve bir ağacında 3.33 ml su aldığı belirlenmiştir. Phytophtora citrophthora ile 24

37 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ infekteli limon ağaçları ile Psorosis ve Stubborn ile infekteli portakal ağaçlarında daha yüksek su alımları gerçekleşmiş, diğer taraftan simptomatolojik olarak hem sağlıklı hem de hastalıklı görünüme sahip mandarinlerde ise daha az su alımı gerçekleşmiştir. Çizelge 4.2. Karataş yolu ve Havutlu daki CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Kalem a Bahçenin Yeri Su alımı (ml/60sn) Su alımı (ml/sn) Sağlıklı taç görünümü Fremont Karataş Yolu ** Sağlıklı taç görünümü Fremont Karataş Yolu ** Sağlıklı taç görünümü Fremont Karataş Yolu Taçlarda seyrekleşme ve Fremont Karataş Yolu ** yapraklarda küçülme Taçlarda seyrekleşme ve Fremont Karataş Yolu ** yapraklarda küçülme Taçlarda seyrekleşme ve Fremont Karataş Yolu ** yapraklarda küçülme Taçlarda seyrekleşme ve Klemantin Havutlu ** yapraklarda küçülme Taçlarda seyrekleşme ve Fremont Karataş Yolu ** yapraklarda küçülme Taçlarda seyrekleşme ve Fremont Karataş Yolu ** yapraklarda küçülme Stubborn WN Havutlu * Stubborn WN Karataş Yolu Stubborn WN Havutlu * Stubborn WN Karataş Yolu 60 1 Phytophthora citrophthora Kütdiken Karataş Yolu 60 1 Anaç kısmında zamklanma Psorosis WN Karataş Yolu 60 1 Phytophthora citrophthora Anaç kısmında zamklanma Kütdiken Karataş Yolu a Ağaçlar yirmi beş yaşından büyük * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar ** CB için moleküler teşhisi yapılan ağaçlar Misis-Yakapınarı-Abdioğlu nda WN portakalı bahçesinde iki sağlıklı görünüme sahip ve 12 hastalıklı, toplam 14 ağaç gövdesine şırınga ile enjekte edilen 25

38 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ su miktarları Çizelge 4.3. de verilmiştir. Yapılan su testinde 60 sn de en az 50 ml ve en fazla 200 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte edilmiştir. Buna göre 1 sn de 0.83 ile ml arasında su alan 6 ağaç, ml den fazla su alan 8 ağaç belirlenmiş, bunun yanında 0 ile 0.3 ml arasında su alan hiçbir ağaç belirlenmemiştir. Simptomatolojik açıdan hastalıklı görünüme sahip ağaçlar ile sağlıklı görünüme sahip ağaçlarda yüksek su alımı nedeni ile şırınga ile su testinde CB hastalığı açısından negatif olarak değerlendirilmişlerdir. Buna karşın Misis-Yakapınarı- Abdioğlu nda gidilen bahçelerde WN portakalı ağaçlarının CB benzeri simptom gösterdikleri gözlenmiştir (Şekil 4.4.). Çizelge 4.3. Misis-Yakapınarı-Abdioğlu nda CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı WN portakallarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Kalem a Su alımı Su alımı (ml/60sn) (ml/sn) Sağlıklı taç görünümü WN Sağlıklı taç görünümü WN * Geriye ölüm ve yapraklarda sararma WN ** Geriye ölüm ve yapraklarda sararma WN 60 1* Geriye ölüm ve yapraklarda sararma WN * Geriye ölüm ve yapraklarda sararma WN Geriye ölüm ve yapraklarda sararma WN Geriye ölüm ve yapraklarda sararma WN Geriye ölüm ve yapraklarda sararma WN Geriye ölüm ve yapraklarda sararma WN Geriye ölüm ve yapraklarda sararma WN Geriye ölüm ve yapraklarda sararma WN Geriye ölüm ve yapraklarda sararma WN ** Geriye ölüm ve yapraklarda sararma WN a Ağaçlar yirmibeş yaşından büyük * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar ** CB için moleküler teşhisi yapılan ağaçlar 26

39 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Şekil 4.4. Misis-Yakapınarı-Abdioğlu turunçgil bahçesinde CB için su testi yapılan ve RT-PCR için testlenen WN portakal ağaçları Misis-Yakapınarı-Abdioğlu nda Fremont mandarini bahçesinde 4 sağlıklı görünüme sahip ve 11 hastalıklı, toplam 15 ağaç gövdesine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelge 4.4. de verilmiştir. Yapılan su testinde 60 sn de en az 8 ml ve en fazla 100 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte edilmiştir. Buna göre sn de 27

40 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ 0.13 ml su alan 1 ağaç, ile ml arasında su alan 10 ağaç, ve ml den fazla su alan 4 ağaç belirlenmiştir. Simptomatolojik olarak ağaçlarda geriye ölüm ve yapraklarda sararma belirtileri gösteren ağaçların gövdesi hastalık belirtisi skalasının üzerinde yüksek su alımını gerçekleştirmiş, diğer taraftan sağlıklı görünüme sahip bir ağacın gövdesi hastalık belirtisi skalası değerleri içerisinde bulunan 0.13 ml su alarak en düşük su alımını gerçekleştirmiştir. Çizelge 4.4. Misis-Yakapınarı-Abdioğlu nda CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı on yaşındaki Fremont mandarin ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Kalem a Su alımı Su alımı (ml/60sn) (ml/sn) Sağlıklı taç görünümü Fremont Sağlıklı taç görünümü Fremont 60 1 Sağlıklı taç görünümü Fremont Sağlıklı taç görünümü Fremont Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Fremont * Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Fremont * Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Fremont 60 1* Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Fremont Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Fremont Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Fremont Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Fremont Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Fremont Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Fremont Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Fremont Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Fremont a Ağaçlar on yaşında * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar 28

41 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Kozan-Çukurköprü de survey yapılan turunçgil bahçesinde toplam 178 ağacın %80 i simptomatolojik olarak hastalıklı görünüme sahip olup, genel olarak ağaç taç hacminde küçülme, seyrekleşme, yapraklarda küçülme ve sararma olarak görülmektedir (Şekil 4.5). Şekil 4.5. Kozan-Çukurköprü de 35 yaşından büyük bir turunçgil bahçesinde şırınga ile su testi ve RT-PCR çalışmaları için kullanılan Klemantin mandarin ağaçlarının genel görünümü Bu ağaçlardan en şiddetli hastalık belirtisi gösterenlerden 18 adeti hem şırınga ile su testi hem de moleküler teşhis yöntemlerinden RT-PCR analizlerinin yapılmasında saçak kök örneklerinin alınması amacı ile seçilmiştir. Ağaçların gövdesine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelge 4.5. de verilmiştir. Yapılan su testinde 60 sn de en az 0 ml ve en fazla 20 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte edilmiştir. Buna göre 18 ağacın hepsininde 1 sn de 0 ile 0.3 ml su aldığı belirlenmiştir. 29

42 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Çizelge 4.5. Kozan-Çukurköprü deki CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Kalem a Su alımı (ml/60sn) Su alımı (ml/sn) Psorosis, ağaç tacında seyrelme, yapraklarda WN 0 0* küçülme ve sararma Ağaç tacında seyrelme, yapraklarda küçülme ve Klemantin 0 0** sararma Psorosis, ağaç tacında seyrelme, yapraklarda WN ** küçülme ve sararma Psorosis, ağaç tacında seyrelme, yapraklarda WN * küçülme ve sararma Ağaç tacında seyrelme, yapraklarda küçülme ve Klemantin * sararma Ağaç tacında seyrelme, yapraklarda küçülme ve Klemantin * sararma Ağaç tacında seyrelme, yapraklarda küçülme ve Klemantin * sararma Ağaç tacında seyrelme, yapraklarda küçülme ve Fremont * sararma Ağaç tacında seyrelme, yapraklarda küçülme ve Fremont ** sararma Psorosis, ağaç tacında seyrelme, yapraklarda WN * küçülme ve sararma Ağaç tacında seyrelme, yapraklarda küçülme ve Klemantin ** sararma Psorosis, ağaç tacında seyrelme, yapraklarda WN * küçülme ve sararma Ağaç tacında seyrelme, yapraklarda küçülme ve Fremont ** sararma Ağaç tacında seyrelme, yapraklarda küçülme ve Fremont * sararma Ağaç tacında seyrelme, yapraklarda küçülme ve Fremont * sararma Ağaç tacında seyrelme, yapraklarda küçülme ve Klemantin * sararma Ağaç tacında seyrelme, yapraklarda küçülme ve Klemantin * sararma Ağaç tacında seyrelme, yapraklarda küçülme ve Klemantin * sararma a Ağaçlar otuz yedi yaşında * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar ** CB için moleküler teşhisi yapılan ağaçlar Bu bahçedeki ağaçlarda Turunçgil Psorosis Virüsü simptomlarına ve ağaçların aşı noktasının üzerinde Gummy bark zamk paketlerine de rastlanmıştır. Bununla birlikte bu bahçelerde drenaj problemi de bulunmaktadır. CB hastalığın 30

43 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ özellikle su zararının olduğu bölgelerde kendini kolaylıkla hissettiren bir hastalık olduğu daha önceki araştırıcılar tarafından da bildirilmiştir (Ceccardi ve ark., 1998). Tarsus-Yenice Bölgesi turunçgil bahçelerinde gidilen birinci ve ikinci bahçede sağlıklı taç görünümüne sahip 1 ve hastalıklı taç görünümüne sahip 7 olmak üzere, toplam 8 farklı mandarin, portakal, altıntop ve limon ağaç gövdelerine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelde 4.6. da verilmiştir. Çizelge 4.6. Tarsus-Yenice de gidilen birinci ve ikinci bahçedeki CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Kalem Ağaçların Yaşı Su alımı (ml/60sn) Su alımı (ml/sn) Sağlıklı taç görünümü WN Ağaç tacında küçülme, Altıntop ** seyrekleşme ve yapraklarda küçülme Ağaç tacında küçülme, Altıntop ** seyrekleşme ve yapraklarda küçülme Taçta seyrekleşme Valensiya * Yaprak kırışıklığı Enterdonat Gövdede kavlama Satsuma * Geriye ölüm ve ağaç ana Klemantin gövdesinde ur Yaprak Kırışıklığı Limon Dikenli * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar ** CB için moleküler teşhisi yapılan ağaçlar Yapılan su testinde 60 sn de en az 0 ml ve en fazla 25 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte edilmiştir. Buna göre sn de 0 ile 0.14 ml arasında su alan 6 ağaç, 0.8 ml su alan 1 ağaç, ve 1 ağacında 0.35 ml su aldığı belirlenmiştir. Simptomatolojik açıdan taçlarda seyrekleşme ve yapraklarda küçülme gösteren iki altıntop ağacının gövdesine hiç su alımı gerçekleşmemiş, bunun yanında yaprak kırışıklığı gösteren dikenli limonda 1 sn de 0.8 ml su alımıyla en yüksek su alımı 31

44 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ gerçekleşmiştir. CB ile infekteli olduğu düşünülen altıntop ağaçlarının genel taç görünümü Şekil 4.6. da verilmiştir. Şekil 4.6. Tarsus-Yenice de CB simptomu gösteren altıntop ağaçlarının (soldan iki ağaç) genel taç görünümü Tarsus-Yenice deki turunçgil bahçelerinden survey yapılan üçüncü bahçede sağlıklı taç görünümüne sahip 1 ve hastalıklı taç görünümüne sahip 14 adet olmak üzere, toplam 15 WN portakalı ağaç gövdelerine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelge 4.7 de verilmiştir. Yapılan su testinde 60 sn de en az 0 ml ve en fazla 54.5 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte edilmiştir. Buna göre 1 sn de 0.5 ile 0.91 ml arasında su alan 10 ağaç, 0 ml su alan 4 ağaç, ve 0.35 ml su alan 1 ağaç belirlenmiştir (Çizelge 4.7). Spiroplasma simptomu gösteren 2 ağaçtan birinin 1 sn de hiç su almadığı belirlenirken diğerinin 0.91 ml su aldığı belirlenmiştir. Taçlarda seyrekleşme, yapraklarda sararma ve küçülme gösteren 12 ağaçtan ikisinin 1 sn de hiç su almadığı belirlenirken geri kalan hastalıklı taç görünümüne sahip 10 ağacın tamamı sağlıklı taç görünümüne sahip ağaçla benzer su alımı gösterdikleri belirlenmiştir. 32

45 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Çizelge 4.7. Tarsus-Yenice deki üçüncü bahçede CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı Washington Navel (WN) portakallarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Kalem a Su alımı Su alımı (ml/60sn) (ml/sn) Sağlıklı taç görünümü WN Taçlarda seyrekleşme ve sararma, ana WN 0 0* gövdede çatlama Taçlarda seyrekleşme, yapraklarda WN 0 0** sararma ve küçülme Spiroplasma citri WN 0 0** Taçlarda seyrekleşme, yapraklarda WN 0 0** sararma ve küçülme Taçlarda seyrekleşme, yapraklarda WN sararma ve küçülme Taçlarda seyrekleşme, yapraklarda WN sararma ve küçülme Taçlarda seyrekleşme, yapraklarda WN sararma ve küçülme Taçlarda seyrekleşme, yapraklarda WN sararma ve küçülme Taçlarda seyrekleşme, yapraklarda WN sararma ve küçülme Taçlarda seyrekleşme, yapraklarda WN sararma ve küçülme Ağaç tacında çok az seyrekleşme WN Taçlarda seyrekleşme, yapraklarda WN sararma ve küçülme Taçlarda seyrekleşme, yapraklarda WN sararma ve küçülme Spiroplasma citri WN a Ağaçlar 30 yaşından büyük * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar ** CB için moleküler teşhisi yapılan ağaçlar Tarsus-Yenice bölgesinde survey yapılan dördüncü bahçede sağlıklı taç görünüme sahip bir ve hastalıklı taç görünümüne sahip 9 adet olmak üzere, toplam 10 farklı mandarin ve portakal ağaç gövdelerine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelge 4.8. de verilmiştir. 33

46 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Çizelge 4.8. Tarsus-Yenice dördüncü bahçedeki CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Kalem a Su alımı Su alımı Şekli (ml/60sn) (ml/sn) Sağlıklı taç görünümü Satsuma ** Ağaç ana dallarda kuruma WN ** Taçlarda seyrekleşme Satsuma ** Ağaç ana dallarda kuruma WN ** Ağaç ana dallarda kuruma WN Taçlarda seyrekleşme Satsuma 6 0.1* Ağaç ana dallarda kuruma WN Ağaç ana dallarda kuruma WN Ağaç ana dallarda kuruma Satsuma Ağaç ana dallarda kuruma WN a Ağaçlar 25 yaşından büyük * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar ** CB için moleküler teşhisi yapılan ağaçlar Yapılan su testinde 60 sn de en az 2 ml ve en fazla 30 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte edilmiştir. Buna göre 1 sn de, ile ml arasında su alan 9 ağaç ve 0.5 ml su alan 1 ağaç belirlenmiştir (Çizelge 4.8.). Simptomatolojik açıdan hastalıklı taç görünümüne sahip Satsuma mandarini ağaçlarının hastalıklı taç görünümüne sahip WN portakalı ağaçlarına göre daha az su alımı gerçekleşmiştir. Bununla birlikte sağlıklı taç görünümüne sahip Satsuma mandarin ağaçlarının simptomatolojik açıdan hastalıklı görünüme sahip diğer ağaçlardan gövdesine daha az su (0.033ml) alımı gerçekleşmiştir. Tarsus-Yenice de survey yapılan beşinci ve altıncı turunçgil bahçelerinde toplam 11 hastalıklı taç görünümüne sahip 10 WN portakalı ve 1 Fremont mandarini ağaç gövdelerine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelge 4.9. da verilmiştir. Yapılan su testinde 60 sn de en az 0 ml ve en fazla 85.7 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte edilmiştir. Buna göre 1 sn de 0.5 ile 1.42 ml arasında su alan 6 ağaç ve 34

47 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ 0 ile 0.23 ml arasında su alan 5 ağaç olduğu belirlenmiştir (Çizelge 4.9.). Taçlarda seyrekleşme ve yapraklarda sararma simptomu gösteren ağaçların yarısında yüksek su alımı gerçekleşmiş yarısında da düşük su alımı gerçekleşmiş, bunun yanında ağaç gövdesinde kavlama simptomu görülen WN portakalı ağacında su alımının olmadığı belirlenmiştir. Çizelge 4.9. Tarsus-Yenice de beşinci ve altıncı bahçedeki CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Ağaç ana gövdesinde kavlama (CPsV) Taçlarda seyrekleşme ve yapraklarda sararma Taçlarda seyrekleşme ve yapraklarda sararma Taçlarda seyrekleşme ve yapraklarda sararma Taçlarda seyrekleşme ve yapraklarda sararma Taçlarda seyrekleşme ve yapraklarda sararma Taçlarda seyrekleşme ve yapraklarda sararma Taçlarda seyrekleşme ve yapraklarda sararma Kalem Ağaçların Su alımı Su alımı Yaşı (ml/60sn) (ml/sn) WN * WN ** WN * WN * Minneola * WN WN WN Taçlarda seyrekleşme ve WN yapraklarda sararma Taçlarda seyrekleşme ve WN yapraklarda sararma Taçlarda seyrekleşme ve yapraklarda sararma WN * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar ** CB için moleküler teşhisi yapılan ağaçlar Mersin-Iğdır bölgesinde yapılan survey çalışmasında gidilen birinci ve ikinci turunçgil bahçesinde sağlıklı taç görünümüne sahip 1 ve hastalıklı taç görünümüne sahip 13 adet olmak üzere, toplam 15 WN portakalı ve bir Minneola ağaç gövdelerine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelge da verilmiştir. Yapılan su testinde 60 sn de en az 0 ml ve en fazla 100 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte edilmiştir. Buna göre 1 sn de 0.5 ile ml arasında su alan 4 ağaç, 0 35

48 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ ile 0.23 ml arasında su alan 4 ağaç, 1.5 ml den fazla su alan 4 ağaç ve 2 ağacında 0.33 ml su aldığı (Çizelge 4.10.). Sağlıklı taç görünümüne sahip WN portakalı ve Minneola ağaçlarında şırınga ile su testi negatif sonuç vermiş, bunun yanında hastalıklı taç görünümüne sahip bazı Minneola ağaçlarında da şırınga ile su testinin negatif sonuç verdiği belirlenmiştir. Simptomatolojik olarak geriye ölüm, yapraklarda, sararma ve ana gövdede Concave gum oluşumu gözlenen Minneola ağaçlarının birisinde ise hiç su alımının olmadığı belirlenmiştir (Şekil 4.7.). Ayrıca bu bahçede ve survey yapılan alanların çoğunda CB benzeri simptom gösteren ağaçların yakınındaki yabancı otlarda besin elementi eksikliği gözlenmiştir (Şekil 4.7.). Şekil 4.7. CB benzeri simptom gösteren Minneola ağaç tacında seyrekleşme, dallarda kuruma, yapraklarda sararma ve sürgünlerde geriye ölüm (solda), CB benzeri simptom gösteren çoğu ağacın yakınındaki yabancı otlardan yabani böğürtlende besin elementi eksikliği görülmektedir (sağda) Mersin-Iğdır da survey yapılan üçüncü ve dördüncü turunçgil bahçelerinde sağlıklı taç görünüme sahip 4 ve hastalıklı taç görünümüne sahip 11 adet olmak üzere, toplam 15 WN portakalı ağaç gövdelerine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelge de verilmiştir. Yapılan su testinde 60 sn de en az 0 ml ve en fazla 200 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte edilmiştir. Buna göre 1 sn de ile ml arasında su alan 3 ağaç, 0 ile 0.26 ml arasında su alan 8 ağaç, 1.5 ml den daha fazla su alan 3 ağaç ve 1 ağacında 0.33 ml su aldığı belirlenmiştir (Çizelge 4.11.). Üçüncü bahçedeki sağlıklı taç görünümüne sahip WN portakalı 36

49 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ ağaçlarının şırınga ile su testine negatif sonuç verdiği bunun yanında dördüncü bahçedeki sağlıklı görünümlü WN portakalı ağaçlarının şırınga ile su testine pozitif sonuç verdiği belirlenmiştir (Çizelge 4.11.). Çizelge Mersin-Iğdır daki birinci ve ikinci bahçede CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı WN portakalı ve Minneola ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Kalem Ağaçların Yaşı Su alımı (ml/60sn) Su alımı (ml/sn) Sağlıklı taç görünümü WN Sağlıklı taç görünümü Minneola Geriye ölüm, yapraklarda sararma ve Minneola * ana gövdede Concave gum Geriye ölüm, yapraklarda kaşıklaşma, WN * sararma ve ana gövdede çatlama Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Minneola * Geriye ölüm, yapraklarda sararma ana Minneola ** gövdede mısır patlağı görünümü Geriye ölüm yapraklarda sararma, ana Minneola gövdede Concave gum ve kabukta kavlama Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Minneola Geriye ölüm Minneola Geriye ölüm yapraklarda ve sararma Minneola Geriye ölüm yapraklarda ve sararma Minneola Alt dallarda seyrelme Minneola Geriye ölüm yapraklarda ve sararma Minneola Alt dallarda seyrelme ve ana gövdede Minneola çukurlaşma Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Minneola * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar ** CB için moleküler teşhisi yapılan ağaçlar Mersin Ataş Rafinerisinin arka kısmında bulunan Enterdonat limonu bahçesinde hastalıklı taç görünümüne sahip toplam 9 adet ağacın gövdelerine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelge de verilmiştir. Yapılan su testinde 60 sn de en az 18 ml ve en fazla 100 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte 37

50 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ edilmiştir. Buna göre 1 sn de ile 1.42 ml arasında su alan 7 ağaç, 1 ağacın 0.3 ml ve 1 ağacın da 1.6 ml su aldığı belirlenmiştir. (Çizelge 4.12). Çizelge Mersin-Iğdır daki üçüncü ve dördüncü bahçede CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı WN portakalı ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Kalem Ağaçların Su alımı Su alımı Yaşı (ml/60sn) (ml/sn) Sağlıklı taç görünümü WN * Sağlıklı taç görünümü WN Sağlıklı taç görünümü WN Sağlıklı taç görünümü WN Geriye ölüm, ana gövdede zamklanma ve WN ** kabukta kavlama Geriye ölüm, ana dallarda çatlama ve WN ** kavlama Geriye ölüm WN ** Geriye ölüm, yapraklarda sararma ve ana gövdede çatlama WN ** Geriye ölüm WN ** Geriye ölüm, yapraklarda sararma ana WN * gövdede çatlama ve kabuk kavlamaları Geriye ölüm, yapraklarda sararma ana WN gövdede çatlama ve kabuk kavlamaları Geriye ölüm, yapraklarda sararma ve ana WN gövdede çatlama Geriye ölüm WN Yapraklarda dikleşme ve sararma WN Geriye ölüm WN * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar ** CB için moleküler teşhisi yapılan ağaçlar Buna göre bu bahçedeki hastalıklı taç görünümüne sahip ağaçların hepsinin şırınga ile su testine negatif sonuç verdiği gözlenmiştir. Bu bahçede bulunan tüm Enterdonat limonlarda taçta seyrekleşme ve geriye ölüm simptomları olduğu gözlenmiştir (Çizelge 4.12.). 38

51 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Çizelge Mersin-Ataş Rafinerisi nde CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı Enterdonat limonu ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Kalem Su alımı (ml/60sn) Su alımı (ml/sn) Taçta seyrekleşme yapraklarda sararma kaşıklaşma ana gövdede çatlama ve kavlama Enterdonat * Geriye ölüm yapraklarda sararma ve ana gövdede zamklanma Enterdonat Geriye ölüm Enterdonat Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Enterdonat 60 1 Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Enterdonat 60 1 Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Enterdonat 60 1 Geriye ölüm ve ana gövdede çatlama Enterdonat Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Enterdonat Taçta seyrekleşme ve yapraklarda sararma Enterdonat a Ağaçlar 25 yaşından büyük * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar Mersin-Dikilitaş a yapılan surveyde gidilen birinci bahçede sağlıklı taç görünümüne sahip 2 ve hastalıklı taç görünümüne sahip 10 adet olmak üzere, toplam 12 farklı mandarin, portakal ve altıntop ağaç gövdelerine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelge de verilmiştir. Yapılan su testinde 60 sn de en az 6 ml ve en fazla ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte edilmiştir. Buna göre 1 sn de 0.58 ile ml arasında su alan 7 ağaç, 0.1 ml su alan 1 ağaç, 1.6 ml su alan 2 ağaç, 1 ağacın 0.45 ml su aldığı ve 1 ağacında 0.35 ml su aldığı belirlenmiştir. Phytophthora citroptora ile infekteli Satsuma mandarini ağaçlarının birinde 1 sn de su alımı 1.6 iken diğerinde 0.1 ml olduğu belirlenmiştir. Sağlıklı taç görünümüne sahip WN portakalı ağaçlarında şırınga ile su testi negatif sonuç verirken hastalıklı taç görünümüne sahip ağaçlarda da şırınga ile su testine negatif sonuç verdiği belirlenmiştir (Çizelge 4.13.). 39

52 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Çizelge Mersin-Dikilitaş ta gidilen 1. bahçede CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Kalem a Su alımı Su alımı (ml/60sn) (ml/sn) Sağlıklı WN 60 1 Sağlıklı WN Phytophthora citrophthora Satsuma 6 0.1* Yaprak damar aralarında renk açılması Altıntop Tristeza Satsuma Phytophthora citrophthora Altıntop Phytophthora citrophthora Altıntop Phytophthora citrophthora WN Phytophthora citrophthora WN Phytophthora citrophthora ve Altıntop yapraklarda kaşıklaşma Phytophthora citrophthora Satsuma Phytophthora citrophthora Altıntop a Ağaçlar otuz beş yaşından büyük * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar Mersin-Dikilitaş ta gidilen ikinci bahçede hastalıklı taç görünümüne sahip toplam 15 adet farklı mandarin ve portakal ağaç gövdelerine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelge de verilmiştir. Yapılan su testinde 60 sn de en az 5 ml ve en fazla 150 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte edilmiştir. Buna göre 1 sn de ile ml arasında su alan 6 ağaç, ile 0.26 ml arasında su alan 4 ağaç ve 1.5 ml den fazla su alan 5 ağacın olduğu belirlenmiştir (Çizelge 4.14.). Hastalıklı taç görünümüne sahip toplam 13 adet Yafa portakalı ağaçlarının ikisi hariç diğerlerinin şırınga ile su testine negatif sonuç verdiği belirlenmiş, bununla birlikte WN portakalı ağacı ve Satsuma mandarini ağacının da pozitif sonuç verdiği belirlenmiştir. 40

53 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Çizelge Mersin-Dikilitaş 2. bahçede CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Kalem a Su alımı (ml/60sn) Su alımı (ml/sn) Geriye ölüm, ana gövdede kavlama Satsuma * ve ur oluşumu Geriye ölüm ve yapraklarda sararma WN * Geriye ölüm, ana gövdede çatlama ve kavlama Yafa * Geriye ölüm, ana gövdede çatlama Yafa ve kavlama Geriye ölüm, ana gövdede çatlama Yafa ve kavlama Yapraklarda kaşıklaşma ve sararma Yafa Geriye ölüm, yapraklarda sararma ana gövdede çatlama ve kavlama Geriye ölüm, ana gövdede kavlama ve ur oluşumu Geriye ölüm ve ana gövdede kavlama Ana gövdede ve kabukta hafif çıkıntılar Yafa Yafa Yafa Yafa Gövdede kavlama Yafa Geriye ölüm ve ana gövdede çatlama Yafa Geriye ölüm ve ana gövdede kavlama Ana gövdede ur ve yapraklarda sararma Geriye ölüm, ana gövdede çatlama, zamklanma ve ana dallarda kavlama Yafa Yafa Yafa a Ağaçlar kırkbeş yaşından büyük * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar Mersin-Dikilitaş Bölgesinde gidilen üçüncü bahçede sağlıklı taç görünüme sahip bir ve hastalıklı taç görünümüne sahip 9 adet olmak üzere, toplam 10 portakal ağacı gövdelerine şırınga ile enjekte edilen su miktarları Çizelge de verilmiştir. Yapılan su testinde 60 sn de en az 0 ml ve en fazla 120 ml ağaç gövdelerine şırınga ile su enjekte edilmiştir. Buna göre 1 sn de 0.66 ile ml arasında su alan 5 ağaç, 0 ile 0.3 ml su alan 4 ağaç ve 1 ağacında 2 ml su aldığı belirlenmiştir (Çizelge 4.15.). 41

54 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Hastalıklı taç görünümüne sahip Yafa portakalı ağaçlarının şırınga ile su testine 1 sn de hem negatif hemde pozitif sonuç verdiği belirlenmiş, bunun yanında sağlıklı taç görünümüne sahip ağacın ise negatif sonuç verdiği belirlenmiştir. Çizelge Mersin-Dikilitaş 3. bahçede CB hastalığından şüphe edilen turunç anacına aşılı farklı türdeki turunçgil ağaçlarının gövdesine şırınga ile su testi sonuçları Ağaçlarda Simptom Gelişim Şekli Kalem a Su alımı (ml/60sn) Su alımı (ml/sn) Sağlıklı taç görünümü Yafa Geriye ölüm ve ana gövdede çatlama Yafa 0 0** Geriye ölüm ve ana gövdede çatlama Yafa * Geriye ölüm yapraklarda sararma ana Yafa * gövdede çatlama ve zamkalanma Geriye ölüm Yafa * Geriye ölüm ve ana gövdede çıkıntılar Yafa Geriye ölüm ve yapraklarda sararma Yafa Geriye ölüm ve ana gövdede çıkıntılar Yafa Gövdede kavlama,yaprakta sararma Yafa Geriye ölüm ve ana gövdede kavlama Yafa a Ağaçlar 35 yaşından büyük * CB için moleküler teşhisde kullanmak üzere saçak kökleri alınan ağaçlar Şırınga ile su testi uygulaması için ağaçlar öncelikle belli simptomlarına göre seçilmiştir. Bunlar ağaç tacında seyrekleşme, tepe dallarda kuruma, yapraklarda küçülme ve sararmadır. Bu nedenle, survey amacı ile girilen her bahçe öncelikle görsel olarak simptom durumları açısından incelenmiş ve taçlarda seyrelme, ince dallarda kuruma, yapraklarda küçülme ve sararma simptomları gösteren ağaçlar su testi için seçilmiştir. Nitekim şırınga ile su testi analiz yöntemini geliştiren Lee ve ark., (1984) ıda aynı şekilde CB benzeri simptom gösteren ağaçları seçmiştir. Yalnız bu araştırıcılar ağaçlardaki simptom şiddetine göre hastalık gösterge çizelgesi kullanmışlardır. Bu araştırıcılar çalışmalarını CB hastalığının kesin olarak bulunduğu 42

55 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Florida eyaletinde yürütmüş olduklarından daha önceden çinko analiz yöntemi ile CB hastalığı olduğu tahmin edilen ağaçlardan hastalık gösterge çizelgesi oluşturmuşlardır. Bu çalışma özellikle Doğu Akdeniz Bölgesi için ilk olduğundan bu hastalığın varlığı henüz bilinmemektedir. Bu nedenle survey yapılan alanda CB benzeri simptom gösteren ağaçlar değerlendirilmiştir, ancak bahçedeki ağaçların genel durumu dikkate alınarak bunlar içerisinden en şiddetli hastalık simptomu gösterenler seçilmiştir. Doğu Akdeniz Bölgesi nde turunçil ağaçlarının hemen hemen tamamı turunç anacına aşılanmaktadır. Turunç bu bölgede toprak yapısına daha iyi uyum sağladığı gibi verimi de olumlu etkilemektedir. Turunç bilindiği üzere CB hastalığına en tolerant turunçgil türleri arasında yer almaktadır. CB hastalığının yoğun olarak görüldüğü ülkelerde turunç anaç olarak kullanıldığında bu hastalık turunç anacını ancak 20 yaşından sonra etkileyebilmekte ve ağaç 25 yaşına geldiğinde tipik CB simptomları gözlenmektedir. Dolayısıyla ülkemizde turuncun bu bölgede anaç olarak kullanılması hastalığın simptomunun ortaya çıktığı ilerleyen yıllarda sağlıklı görülmeyen ağaçların sökülmesine neden olmaktadır. Yapılan surveylerde 30 yaşından büyük birçok bahçede özellikle Tarsus-Yenice de yaşlı ağaçların yanı sıra bir çok genç fidanların sonradan dikildiği göze çarpmaktadır (Şekil 4.8). Bu şekilde ağaçların yenilenmesi hastalığın varlığı konusundaki kuşkuları daha belirgin ortaya koymaktadır. Diğer taraftan bu hastalığın tanısının diğer biyotik patojenlere göre daha yorucu çalışmaları gerektirmesi, tanısında kullanılan antiserumun ticari olarak üretilmemesi hastalığın tanısını daha da zorlaştırmaktadır. Bu nedenle de ismi konulmamış hastalıklar nedeni ile sağlıklı görülmeyen birçok ağaç, Karataş yolu üzerinde 25 yaşındaki tüm Fremont ağaçlarında olduğu gibi sökülmektedir. Aynı şekilde Kozan-Çukurköprü de 2004 yılında 35 yaşından büyük WN portakal ağaçlarından oluşan bir bahçe tamamen sökülmüştür. Bu ağaçlar taçlarda seyrekleşme, tepe dallarda kuruma, yapraklarda sararma, küçülme vb. simptomları göstermekteydi. Bahçe sahibi ile yapılan görüşmede bahçede drenaj probleminin olduğu ve bu nedenle ağaçların 30 yaşından sonra taç kısmında seyrekleşme, yapraklarda solma ve sararma simptomlarının olduğu, meyve veriminde ciddi bir 43

56 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ azalma ile birlikte kalitenin düştüğünü ve bu nedenle tüm ağaçları kökleri ile beraber söktüklerini beyan etmişlerdir. Şekil 4.8. Tarsus-Yenice de 30 yaşından büyük ağaçlarla genç fidanların birlikte bulunduğu bir bahçe CB nin görsel olarak tanılanmasını doğrulayan şırınga ile su testi yöntemi CB için kullanılan diğer testlere göre (yerçekimi injeksiyon testi ve çinko analizi ) daha ucuz, daha az zaman ve daha az ekipman gerektiren bir tekniktir. Test için gereken süre her bir ağaç için 5 dakika kadardır. Bu yöntem özellikle serolojik ve moleküler teşhis yöntemlerinin henüz geliştirilmediği yıllarda 1984 lü yıllarda Florida ve Güney Afrika daki CB simptomlu ağaçların şırınga ile su testinde kullanılmış ve simptom gelişimi ile şırınga testinin Florida daki ağaçlar için %96, Güney Afrika daki ağaçlar için %95 orantılı olduklarını saptamışlardır. Bu çalışma kapsamında ise simptomlu ağaçlarla şırınga ile su testinin %52 orantılı olduğu ortaya çıkarılmıştır. Toplam 176 hastalıklı ağaçtan 155 adedi CB benzeri simptom açısından değerlendirilmiş olup, bunlardan da 81 ağacın su testine göre CB hastalığı ile infekteli olabileceği varsayılmıştır. Lee ve ark., (1984b), Florida daki ağaçlar için şırınga ile su testini (%96) normal atmosfer basıncı altında yerçekimi etkisi ile ağaç tarafından alınan su testine ve çinko analizine göre sırasıyla %16 (%80) ve %9 (%87) farkla daha güvenilir bulmuşlardır. CB hastalığı için serolojik analizler 1990 yılından sonra geliştirildiği için bu araştırıcılar hastalık teşhisinde su ve çinko analiz yöntemlerini kullanmışlardır. CB ile infekteli ağaçların yapraklarında genel olarak çinko eksikliği, gövde kabuk dokularında ise normal ağaçta bulunan miktarın 4 katı 44

57 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ kadar daha fazla çinko içermektedir (Wutscher ve ark., 1977; Lee ve ark., 1984a; Timmer ve ark., 1991). Burada testlenen ağaçların taçlarında aşırı seyrekleşme ve sararma olduğundan çinko eksikliği maskelenmiş olabilir. Ayrıca çinko eksikliğinin ülke ve bölgelere göre de değişkenlik gösterdiği Afrika da yapılan çalışma ile ortaya konmuştur (Lee ve ark. 1984a). Günümüzde ise simptomolojik olarak ağaçlar saptandıktan sonra bu ağaçların yaprak veya kök dokularından alınan örneklerde serolojik analizlerin yapılması ile hastalığın varlığı kolaylıkla saptanabilmektedir (Derrick ve ark., 1993). Ancak sözkonusu hastalığın serolojik analiz için gerekli olan p12 antiserumu ticari olarak üretilmediğinden bu antiserumu elde etmek her zaman mümkün olmamaktadır. Bununla birlikte CB hastalığı varlığından şüphe edildiğinde öncelikle ağaçların simptomotalojik olarak seçilmesi gerekmektedir. Bölgemizde turunçgillerde birçok farklı virüs, viroid, fitoplasma vb. hastalık etmenlerinden en az 14 tanesi bilinmekte ve bunlar ağaçlarda gövde dokusunda ve ana dallarda kavlama, aşı noktasında şişme, anaç kısmında urlar, yapraklarda küçülme, kaşıklaşma, kıvrılma, sararma, meyvelerde asimetrik görünümler, küçülme ve meyve kabuğunda zamansız renk oluşumları ve benzeri simptomlar oluşturduğundan CB benzeri simptom oluşturan ağaçların simptomolojik olarak seçimi zor gibi görünmektedir. Bu nedenle şırınga ile su testi hastalığın saptanmasında birinci aşama seleksiyon için önemli olmuştur. Nitekim elde edilen sonuçların moleküler analiz detayı 4.2. de verilmiştir Reverse Transcription ile Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) Çalışmaları CB ile infekteli ağaçlar 12 KDa büyüklüğünde hastalıkla ilişkili bir protein sentezledikleri Derrick ve ark., (1993) nın yaptıkları çalışmada bulunmuş, daha sonraki yıllarda Ceccardi ve ark., (1998), bu proteinin açık okuma bölgesini kodlayan geni ile tüm genomik genini izole etmiş ve bu gene spesifik primerler kullanarak hastalığın moleküler teşhis yöntemlerini geliştirmişlerdir. Bu çalışmada Ceccardi ve ark., (1998) nın dizayn ettikleri primerler kullanılarak, hastalıklı ağaçların saçak köklerinden izole edilen toplam RNA dan RT-PCR analizleri 45

58 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ yapılmıştır. RT-PCR çalışmaları özellikle şırınga ile su testinde pozitif sonuç veren toplam 45 ağacın köklerinden izole edilen RNA dan yapılmıştır. Bu amaçla öncelikle saçak köklerden izole edilen toplam RNA dan tamamlayıcı DNA (cdna) sentezlenmiş ve cdna kullanılarak PCR çalışmaları yürütülmüştür. RT-PCR analizleri ile ilgili sonuçlar Şekil 4.9., ve 4.11 de verilmiştir. Şekil 4.9. da görüldüğü gibi CB ile infekteli olduğu tahmin edilen toplam 16 farklı turunçgil ağacının ve negatif kontrol olarak şırınga ile gövde iletim demetinden su alımının yüksek olduğu bir Klemantin mandarin ağacının saçak köklerinden elde edilen RT-PCR analiz sonuçları verilmiştir. Buna göre Tarsus-Yenice deki survey yapılan ilk bahçede 2 adet altıntop ağacının saçak kök RNA sı p12 proteinine spesifik olan p12 geni için 396 bç lik cdna amplifikasyonunu sağlamış olup, bunlar Şekil 4.9. da görülen 1 ve 2 nolu DNA bantlarıdır. Aynı şekilde Tarsus-Yenice deki 3. bahçeden alınan 3 ve 4 numaralı WN portakallarının, 4. bahçeden alınan 5-8 numaralı Satsuma mandarini ağacı köklerinden ve 5. bahçeden 9 numaralı WN portakalı ağacı köklerinden elde edilen RNA larda p12 proteinine spesifik p12 geni için aynı büyüklükte cdna amplifikasyonu sağlamıştır. Şekil 4.9. Kozan-Çukurköprü, Tarsus-Yenice, Mersin-Dikilitaş ve Mersin-Iğdır gibi farklı bölgelerin farklı turunçgil bahçelerinden saçak kök örneklerinden yapılan RT-PCR analizleri. 1-9: Tarsus-Yenice, 10: Mersin-Dikilitaş 11: Mersin-Iğdır, 12-16,K: Kozan Çukurköprü turunçgil bahçeleri. 1-2: altıntop, 3-4 ve 6: WN portakalı, 5, 7, 8: Satsuma mandarini, 9,10,12: WN portakalı,11: Yafa Portakalı 13-16: Klemantin mandarini, K:Sağlıklı Kontrol, St: 100bç DNA standartı 46

59 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Mersin-Dikilitaş tan 10 numaralı WN portakalı ve Mersin-Iğdır dan 11 numaralı Yafa portakalı ağacı köklerinden elde edilen RNA larda p12 proteinine spesifik p12 geni için aynı büyüklükte 396 bç cdna amplifikasyonu sağlamıştır. Aynı sonuçlar Kozan-Çukurköprü deki bahçelerden alınan numaralı WN portakalı saçak kök örnekleri, Tarsus-Yenice deki bahçelerden alınan 1 ve 2 numaralı altıntop, 3,4,6,9 numaralı WN portakalı ve 5,7-8 numaralı DNA bantlarının içeren Satsuma mandarini içinde geçerli olup, p12 geni için 396 bç lik cdna çoğaltımını sağlamışlardır. Bu RT-PCR analizinde p12 geni için pozitif sonuç veren cdna örnekleri özellikle şırınga ile su injeksiyon testine de pozitif sonuç vermiştir. Diğer bir ifade ile bu ağaçların gövdesine sürekli bir insan basınç ile 0.3 ml den daha fazla su injekte edilememiştir. RT-PCR ile elde edilen pozitif sonuçların yanı sıra Tarsus- Yenice de ikinci bahçede su injeksiyon testi ile pozitif sonuç veren Valensiya portakalı, üçüncü bahçeden 3 adet WN portakalı ve 5. bahçeden bir adet WN portakalı saçak kök örnekleri cdna sentezini gerçekleştirememişler ve RT-PCR ile 396 bç lik DNA bantı elde edilememiştir (verileri negatif olduğundan sunulmamıştır). Diğer taraftan Kozan-Çukurköprü den 35 yaşından büyük bir turunçgil bahçesi WN portakal ağaçlarından örnek 10 ağaç seçilmiş ve bunların köklerinden de RT-PCR analizi yapıldığında tüm örneklerden 396 bç büyüklüğündeki cdna bantları çoğaltılmış ancak sonuçların hepsi burada verilmemiştir. Diğer 14 örneğin RT-PCR analiz sonuçları Şekil da verilmektedir. Şekil da görüldüğü gibi 17 ve 18 nolu cdna örnekleri hariç diğer (19-29) 396 bç büyüklüğündeki cdna örnekleri PCR ile çoğaltılmıştır. Burada RT-PCR amacı ile saçak kök örneklerinin alındığı ağaçların gövdelerine ya hiç su enjekte edilememiş veya en fazla 1 sn de 0.23 ml su enjekte edilebilmiştir. Bu ağaçların tamamında taçlarda aşırı seyrekleşme, yapraklarda küçülme ve ağaçlarda geriye ölüm simptomları gözlenmiştir. Burada 17 ve 18 nolu saçak köklerin cdna örneklerinden 396 bç lik p12 geninin çoğaltılamamış olması cdna sentezinin bozulmasından kaynaklanabilir. Bu örneklerden tekrar cdna elde edilerek PCR yapıldığında onlarda pozitif sonuç vermiştir (veriler sunulmamıştır). Bunun dışında diğer tüm saçak kök RNA larından RT-PCR ile cdna amplifikasyonu sağlanmıştır. Özellikle 47

60 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Metanet AKKUŞ ÇİFTCİ Mersin-Dikilitaş ve Mersin-Iğdır bölgelerinden farklı turunçgil türlerinden (portakal ve Minneola) alınan örneklerin hepside RT-PCR analizi ile pozitif sonuç vermiştir. Şekil Balcalı-Kampüs, Kozan-Çukurköprü, Mersin-Dikilitaş ve Mersin-Iğdır gibi farklı bölgelerin farklı turunçgil bahçelerinden saçak kök örneklerinden yapılan RT- PCR analizleri , 22-23:Kozan, 20-21: Balcalı, 24,26-27:Mersin-Dikilitaş, 25, 28, 29:Mersin-Iğdır turunçgil bahçeleri, 17:WN portakalı, 18-19:Fremont mandarini, 20-24:WN portakalı, 25, 29:Minneola, 26-28: WN portakalı, 30:Psorosis ile infekteli WN portakalı, St:100bç DNA standartı Şekil Misis-Yakapınar-Abdioğlu ve Kozan-Çukurköprü gibi farklı bölgelerin farklı turunçgil bahçelerinden saçak kök örneklerinden yapılan RT-PCR analizleri. 31,36:Abdioğlu, 32-35:Kozan-Çukurköprü turunçgil bahçeleri. 31:WN portakalı, 32-33, 35 Fremont mandarini, 34: Psorosis ile infekteli Fremont mandarini, 36: Sağlıklı Fremont mandarini, St: 100bç DNA standartı 48