T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Transkript

1 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI NORMAL, POLİKİSTİK OVARYUM SENDROMU, HİPERSTİMÜLE VE HİPOSTİMÜLE OVARYUM FOLİKÜLÜ KÜMÜLÜS HÜCRELERİNDE ENDOPLAZMİK RETİKULUM STRES PROTEİNLERİNİN REGÜLASYONUNUN ARAŞTIRILMASI YÜKSEK LİSANS TEZİ Bahar KÜÇÜKOĞLU Tez Danışmanı Prof. Dr. M. Tahir HATİPOĞLU Yardımcı Danışman Doç. Dr. Ümit Ali KAYIŞLI ANKARA Haziran 2011

2 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI NORMAL, POLİKİSTİK OVARYUM SENDROMU, HİPERSTİMÜLE VE HİPOSTİMÜLE OVARYUM FOLİKÜLÜ KÜMÜLÜS HÜCRELERİNDE ENDOPLAZMİK RETİKULUM STRES PROTEİNLERİNİN REGÜLASYONUNUN ARAŞTIRILMASI YÜKSEK LİSANS TEZİ Bahar KÜÇÜKOĞLU Tez Danışmanı Prof. Dr. M. Tahir HATİPOĞLU Yardımcı Danışman Doç. Dr. Ümit Ali KAYIŞLI ANKARA Haziran 2011

3 i

4 İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Fotoğraflar, Grafikler ve Tablolar Kısaltmalar ve Simgeler i ii v vi 1. GİRİŞ 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Ovaryumların Gelişimi Oogenezis Doğum Öncesi Prenatal Olgunlaşma Doğum Sonrası Postnatal Olgunlaşma 2.2. Ovaryumların Anatomisi Ovaryumların Arterleri Ovaryumların Venleri Ovaryumların Lenf Damarları Ovaryumların Sinirleri 2.3. Ovaryumların Fizyolojisi Ovaryal Döngünün Hormonal Düzenlenmesi 2.4. Ovaryumların Histolojisi Ovaryum Medullası Ovaryum Korteksi Ovaryum Folikülleri Primordiyal Foliküller Büyüyen Foliküller Primer Foliküller Sekonder Foliküller Graaf Folikülü Atretik Folikül ii

5 Ovulasyon Korpus Luteum 2.5. Kümülüs Hücreleri 2.6. Endoplazmik Retikulum Endoplazmik Retikulumda Protein Katlanması Endoplazmik Retikulum Stresi Katlanmayan Proteinlere Yanıt (UPR) nin Düzenlenmesi UPR Yolağında Görev Alan Transmembran Proteinler İnositol Requiring Kinase 1 alfa (IRE1 alfa) Activating Transcription Factor 6 (ATF6) Protein Kinase Like ER kinase (PERK) ER Stresi ve Apoptozis 2.7. Tunikamisin 2.8. Tauroursodeoxycholic Acid (TUDCA) 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Doku Örneklerinin Toplanması ve Gruplandırılması 3.2. Kullanılan Yöntemler Western Blot Yöntemi Western Blot Yöntemi İçin Kullanılan Kimyasallar Western Blot İşleminde Kullanılan Tampon ve Çözeltiler Protein Ekstraktı Hazırlanması Örneklerin Hazırlanması, Jele Yüklenmesi ve Elektroforezi SDS- Poliakrilamid Jel Üzerindeki Proteinlerin Nitroselüloz Membrana Aktarılması Nitroselüloz Membran Üzerindeki Proteinlerin İmmünolojik Saptanması iii

6 PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) RNA İzolasyonu DNA Muamelesi RNA Muamelesi PCR Kurumu Agaroz Jelin Hazırlanması Kümülüs Hücre Kültürü MTT (3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromid) Proliferasyon Yöntemi Tunel (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)- Mediated dutp Nick End Labeling) İstatistiksel Değerlendirme 4. BULGULAR 4.1. MTT Analizi Bulguları 4.2. TUNEL Bulguları 4.3. İn Vitro Fertilizasyon (IVF) Tedavisi İçin Stimule Edilen Farklı Hasta Gruplarında ER Stress Yolağının Anahtar Molekülü GRP78 in Protein Seviyesinin Western Blot Tekniği İle Araştırılması 4.4. XBP-1 ve sxbp-1 Bulguları 5. TARTIŞMA 6. SONUÇ 7. ÖZET 8. SUMMARY 9. KAYNAKLAR 10. EKLER 11. TEŞEKKÜR 12. ÖZGEÇMİŞ iv

7 ŞEKİLLER ve GRAFİKLER Şekiller Şekil 1. Kümülüs hücre kültüründe tunukamisinin hücre apopitozuna etkisi Şekil 2. Normal, polikistik ovaryum sendromu, hiperstimüle ve hipostimüle hasta gruplarından elde edilen GRP78 seviyesi Şekil 3.Normal, polikistik ovaryum sendromu, hiperresponsif ve hiporesponsif hasta gruplarından elde edilen sxbp-1/xbp-1 mrna seviyeleri. Grafikler Grafik 1.Kümülüs hücre kültüründe MTT hücre proliferasyonu Grafik 2.Normal,polikistik ovaryum sendromu, hipostimüle ve hiperstimüle hasta gruplarının yaş ortalamaları Grafik 3.Normal, polikistik ovaryum sendromu, hipostimüle ve hiperstimüle hasta gruplarından elde edilen oosit ortalamaları v

8 KISALTMALAR VE SİMGELER ATF6 :Aktive Edici Transkripsiyon Faktörü 6 ATPaz BİP DMEM:F12 DNA EGF :Adenozin Trifosfataz :Bağlayıcı Protein :Dulbecco s Modified Eagle s Medium :Deoksiribonükleik Asit :Epidermal Büyüme Faktörü eif2 :Ökaryotik Translasyon Başlatıcı Faktör 2 ER ERAD FSH GnRH GRP GTP GV HCG IGF IRE1 alfa IVF KL :Endoplazmik Retikulum :Endoplasmic Reticulum Associated Degradation :Folikül Stimüle Edici Hormon :Gonadotropin Serbestleştirici Hormon :Glucose-Regulated Protein :Guanin Trifosfat :Germinal Vezikül :İnsan Karyonik Gonadotropin Hormon :İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü :İnositol-Requiring Kinase 1 alfa :İn Vitro Fertilizasyon :Korpus Luteum vi

9 LH Met mrna MTT NaCl OMI OST PCR PDI PERK RT-PCR SDS :Lüteinleştirici Hormon :Metiyonin :Mesajcı Ribonükleik Asit :3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromid :Sodyum Klorür :Oosit Maturasyon İnhibitörü :Oligosakkarittransferaz Enzimi :Polimeraz Zincir Reaksiyonu :Protein Disülfit İzomeraz :Protein Kinase-Like ER :Ters Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu :Sodyum Dodesil Sülfat S1P :Kısmi Proteaz 1 S2P :Kısmi Proteaz 2 TBE TBF TBS TBS-T TM Tris-HCl trna :Tris - borate EDTA :Testis Belirleyici Faktör :Tris Tuz Çözeltisi :Tris Tuz-Tween Çözeltisi :Tunikamisin :Tris Hidrokliorik Asit :Taşıyıcı RNA vii

10 TUDCA :Tauroursodeoxycholic Acid TUNEL dutp Nick End Labeling :Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)-Mediated UPR :Unfolded Protein Response XBP1 :X Box Binding Protein 1 ZP :Zona Pellusida viii

11 1. GĠRĠġ Ovaryumlar ovaryal döngü boyunca sürekli gelişimsel değişiklikler geçirir. Her döngüde bu değişimler tekrarlanır. Onun bu özelliği insan vücudundaki en dinamik dokulardan birisi olduğunu gösterir. 28 günde bir olaylanan döngü 2 ana evreye ayrılır. Bunlar; 1) Foliküler evre 2) Luteal evre Foliküler evre boyunca, granüloza hücre proliferasyonuna bağlı olarak ovaryumlarda folikülogenez gerçekleşir. Bu dönem tamamen östrojen hormonun kontrolündedir. Bu süreçte ovaryumdaki bir kısım primordiyal folikül hücresi, nedeni tam olarak bilinmemekle birlikte, proliferasyona başlar. Foliküler evrenin başlamasıyla birlikte programlanmış olan öncü foliküllerde LH reseptör sayısı artarak folikül gelişimi uyarılır. Bu süreçte primer folikül, sekonder folikül ve ardından tersiyer folikül (Graaf folikül) oluşur. Graaf folikülü oositin çevresindeki kümülüs hücreleriyle ile birlikte atılır. Bu olaya ovulasyon denir. Ovaryumda teka ve granüloza hücreleri korpus luteumu oluşturmak üzere farklılaşmaya başlar. Bu evreye de luteal evre denir. Bu hücrelerin farklılaşmasıyla ortaya çıkan korpus luteum (corpus luteum) endokrin bir organ gibi işlev görür ve gebeliğin ilk 4 ayına kadar progesteron hormonu salgılar. 1,2 Oositlerde sitoplazmik olgunlaşma ve oosit aktivasyonu ile oosit çekirdeğinin olgunlaşması arasında doğrudan bir ilişki vardır. 1

12 Kümülüs hücrelerinin bu süreçteki rolü, oositte protein sentezini uyararak oosit olgunlaşması sürecine katkıda bulunmaktır. Ancak olgun (metafaz II (MII) fazındaki) bir oositin fertilizasyon kapasitesi olduğu düşünüldüğünde, kümülüs hücrelerinin oosit üzerindeki olgunlaştırıcı ve aktive edici rolü çok daha iyi açığa çıkmaktadır. Ayrıca yeterince olgunlaşmamış profaz I (PI) ve metafaz I (MI) fazındaki oositlerin fertilizasyon şansının olmaması kümülüs hücrelerinin bu süreçteki rolünü pekiştirmektedir. 2,3 Benzer olarak, İn vitre fertilizasyon tekniklerinden yararlanan hasta gruplarında eve sağlıklı bebek götürme oranı ile olgun oositin elde edilmesi arasında doğru orantılı bir ilişki vardır. İn vitro fertilizasyon tekniğinde kullanılmak üzere elde edilen oositlerin metefaz II fazında olması, in vitro fertilizasyon laboratuarlarında fertilizasyon ve preimplantasyon dönemde kültür ortamında embriyonik gelişim şansını önemli derecede artırmaktadır. 4,5 Endoplazmik retikulum (ER), hücrenin canlı kalması ve işlevlerini yerine getirmesi için gerekli role sahip bir organeldir. ER hücre içi kalsiyum dengesini ayarlamakta, protein sentezi ve homeostaziyi düzenlemekte ve lipit biyosentezini sağlamaktadır. 6,7 Hücredeki protein sentezi ve taşınmasındaki rolünden dolayı, 78 kda GRP78 (glucose regulated protein 78) diğer adıyla BİP (binding protein), GRP94 (glucose regulated protein 94), kalneksin ve kalretikülin gibi kalsiyum bağımlı moleküler şaperonlardan zengindir. Bu şaperonlar, protein katlanmasını sağlayan aracı molekülleri sabitler. Bunlara ek olarak ER lümeni hücre yüzeyinde salgılanan proteinlerin doğru katlanmasını sağlamaktan ve disülfit bağlarını oluşturan protein disülfit izomeraz (PDI) içeren oksidatif mikroçevreyi oluşturmaktan sorumludur. Ayrıca ER hücre membran lipitlerinin biyosentezinde ve kolesterol üretiminin kontrolünde yaşamsal rol oynamaktadır. 2

13 Birçok faktör katlanamayan proteinlerin ER lümeninde yığılmasına neden olabilir. Bu katlanamayan proteinlerin ER lümeninde birikmesi evrimsel olarak oldukça iyi korunmuş olan katlanmayan proteinlere yanıt olarak adlandırılan (UPR), ER bağımlı bir hücresel yanıtı tetikler. 8,9 Hücrede ER stresiyle tetiklenen UPR Nil etkileri 3 grupta toplanır; adaptasyon, uyarı, apopitozis. Hipoksi ve oksidatif ajanların neden olduğu hücresel redoks yolunun bozulması ER lümenindeki disülfit bağlarının ortadan kalkmasına ve proteinlerin katlanamamasına ya da yanlış katlanmasına neden olur. İn vitro fertilizasyon tekniklerinden yararlanmak üzere başvuran hasta populasyonlarında folikül stimülasyonlarına bağlı olarak yanıt veren 3 farklı hasta grubu gözlenmektedir. Bunlar arasında normal stimülasyon gösterenler birinci grubu, hipostimülasyon gösterenler ikinci grubu, hiperstimülasyon gösterenler üçüncü grubu oluşturmaktadır. 35 yaş altı IVF hastalarında folikül stimülasyonuna yanıt olarak toplanan oosit sayısının 10 ile 20 arasında olması normostimülasyon olarak kabul edilmektedir. Buna karşılık aynı doz uyarıya 30 ve üzerinde oosit toplanması hiperstimülasyon sendromu olarak kabul edilirken, bu grup hastalara polikistik over sendromu da girmektedir. 6 ve daha az oosit toplanması ise hipostimülasyon olarak kabul edilmektedir. Her üç grupta gerek folikül gelişimi açısından gerekse toplanan olgun oosit (MII) sayısı veya olgun olmayan (PI (GV) veya MI) oosit sayısı açısından anlamlı farklılıklar göstermektedir. Yukarıda verilen bilgiler ışığında, hipotezimiz ovulasyon indüksiyonuna normal, hiperstimülasyon ve hipositümulasyon yanıtı veren hasta gruplarının kümülüs hücrelerinde endoplazmik retikulum bağımlı UPR sinyal molekülerinin farklı regule edildiğidir. 3

14 Bu çalışmada ovulasyon indüksiyonuna farklı yanıt veren hastalarda ortaya çıkabilecek ER stresine bağlı UPR Nil düzenlenmesi incelenecektir. Böylece ovaryumdaki kümülüs hücre populasyonunun oosit olgunlaşmasındaki rolüne yeni bir yaklaşımla açıklık getirmeyi amaçlamaktayız. Ayrıca bu durum yardımcı üreme tekniklerinden yararlanan hasta grupları için yeni bir tedavi yaklaşımının önünü açabilir. 4

15 2.GENEL BĠLGĠLER 2.1. OVARYUMLARIN GELĠġĠMĠ Dölet cinsiyeti, genetik açıdan fertilizasyon sırasında belirlenmiş olmasına rağmen, gelişimin 7. haftasına kadar gonadlar erkek veya dişi yapısal özelliklere sahip değillerdir. 10 Gonadlar başlangıçta kölom epitelinin çoğalması ve altındaki mezenşimin yoğunlaşmasıyla oluşmuş, bir çift uzunlamasına düzenlenmiş genital ya da gonadal kabartılar halinde belirirler. Gelişimin 6. haftasına kadar genital kabartılar içinde germ hücreleri görülmez. 10 Primordiyal germ hücreleri, insan embriyosunda, gelişimin erken evrelerinde vitellüs kesesinin allontoise yakın duvarındaki endoderm hücreleri arasında belirirler. Bu hücreler, ameboid hareketlerle, son bağırsağın mezenterinin dorsali boyunca ilerleyerek, 5. haftanın başında primitif gonadlara ulaşırlar. 6. haftada da genital kabarıklığı işgal ederler. Bu hücreler genital kabartılara ulaşamadıklarında gonadlar gelişemez. Gonadların ovaryum ya da testise farklanmasında ilkel germ hücrelerinin indükleyici etkisi vardır. 10 Primordiyal germ hücrelerinin, primitif gonadlara ulaşması sırasında, genital kabarıklığın kölomik epiteli prolifere olur ve epitel hücreleri altındaki mezenşim içine girerler. Bunlar burada primitif cinsiyet kordonları denilen düzensiz şekilli kordonlar oluştururlar. Hem erkek, hem 5

16 dişi embriyolarında bu kordonlar yüzey epiteline bağlıdır ve bu dönemde erkek veya dişi embriyoların birbirinden ayırt edilebilmesi olası değildir. Bu devredeki gonad farklanmamış gonad olarak bilinir. 10 Cinsiyetin farklanması, otozomal ve çekinik çok sayıda genin rol oynadığı bir süreçtir. Seksüel farklanmanın anahtarı kısa kolunda (Yp11) SRY genini taşıyan Y kromozomudur. Bu genin protein ürünü testis belirleyici faktördür (TBF). TBF, cinsiyet organlarının farklanmasını gerçekleştirir. Bu faktörün varlığında fötüsun cinsiyeti erkek tipinde, yokluğunda ise kız olur. 11 Y kromozomu olmayan ve XX cinsiyet kromozom komplemanına sahip olan dişi embriyoların, gonadal gelişim daha yavaştır. 10. haftaya değin, ovaryumlar histolojik olarak ayırt edilemezler. Primitif cinsiyet kordonları dişi embriyoların erkekteki kadar belirgin değildir. Gonad taslağının medullasına kadar uzanırlar ve rudimenter bir yapı olan rete ovariiyi oluştururlar. Daha sonra rete ovarii ve primitif cinsiyet kordonları dejenere olarak ortadan kalkarlar ve yerlerini, ovaryum medullasını oluşturan damarlı stromaya bırakırlar. 12 Erken dölütsel dönemde kortikal kordonlar denilen ikinci nesil kordonlar gelişmekte olan gonadın yüzey kölom epitelinden başlayarak, alttaki mezenşime doğru gelişmeye başlar. Kortikal kordonlar kölom epitelinin çoğalmasıyla kalınlaşırken, primitif germ hücreleri kordonların içine karışırlar. 12 6

17 Yaklaşık 16. haftada bu kordonların, her biri bir yada daha çok sayıda ilkel germ hücresi içeren, izole hücre topluluklarına ayrılır. Bu germ hücreleri zamanla oogonyumlara dönüşür. Yüzey epitelinden aşağıya göç eden ve germ hücrelerini çevreleyen epitel hücrelerinden de foliküler hücreler oluşur Oogenezis Doğum öncesi prenatal olgunlaģma Olgun kadın ve erkek üreme hücreleri doğrudan, gelişimin 3. haftası sonunda vitellus kesesi duvarında beliren ilkel üreme hücrelerinden gelişirler. Bu hücreler vitellus kesesinden, gelişmekte olan gonadlara ameboid hareketlerle göç eder ve 4. haftanın sonu veya 5. haftanın başında gonadlara ulaşırlar. 25 Doğum öncesi olgunlaşma olarak adlandırılan prenatal olgunlaşma evresi primordiyal üreme hücrelerinin kadın gonada ulaşır. Oogonyumlara farklanması ve primer oositi içeren primordiyal foliküllerin oluşması sürecidir. Ardarda mitozla çoğalan oogonyumlar, kümeler oluşturarak 3. ayın sonunda etrafları yassı epitel hücreleriyle çevrilir. Bir küme içinde yer alan oogonyumların tamamın tek bir germ hücresinden geliştiği varsayılır. Folikül hücreleri olarak adlandırılan oogonyumların çevresindeki yassı epitel hücreleri ovaryumun yüzey epitelinden köken alırlar. 25 7

18 Oogonyumların çoğu mitozla bölünmeyi sürdürürken, bir kısmı da büyüyerek primer oositlere farklanır. Oluşan primer oositler hemen DNA larını bir kat arttırarak, birinci mayoz bölünmenin profaz evresine girerler. Birkaç ay içinde oogonyumların sayısı hızla artar ve gelişimin 5. ayında ovaryum içindeki üreme hücrelerinin sayısı en yüksek düzeye, yaklaşık a ulaşır. Bu dönemden sonra başlayan hücre dejenerasyonuyla, oogonyumların ve primer oositlerin büyük çoğunluğu atretik hale gelir. 7. ayda yüzeye yakın yerleşmiş birkaçı dışında çoğunluğu dejenere olur. Canlı kalan primer oositlerin tamamı, birinci mayoz bölünmeye girmiş ve her biri ayrı ayrı tek katlı yassı epitel hücreler ile çevrelenmiştir. Primer oosit, çevresindeki tek katlı yassı epitel hücreleriyle birlikte primordiyal folikül olarak adlandırılır. 11,25, Doğum sonrası postnatal olgunlaģma Doğum sonrası olgunlaşma süreci postnatal olgunlaşma olarak adlandırılır. Doğumda, tüm primer oositler birinci mayoz bölünmenin profaz evresindedir. Ancak, bölünmenin metafaz ile devam etmesi gerekirken, primer oositler çekirdek kromatinin seyrek ve düzensiz bir yapılaşma gösterdiği birinci mayoz bölünmenin profaz evresinin diploten evresine girerler ve puberteye kadar dinlenme halinde kalırlar. Bu süre boyunca, oositin olgunlaşması, folikül hücreleri tarafından salgılanan oosit olgunlaşmasını inhibe eden bir madde olan oosit maturasyon inhibitörü (OMI) tarafından baskılanır. Doğumda ovaryumlardaki primer oositlerin sayısının, yaklaşık ile arasında değiştiği sanılmaktadır. Puberteye kadar bu oositlerin büyük çoğunluğu atretik hale gelir ve puberte 8

19 başlangıcında bu sayı e düşer. Ancak, bir kadının üreme periyodu içinde kadarı ovulasyonla atılır. 25 Pubertenin başlamasıyla, her ovaryum döngüsünde 5 ile 15 arasında değişen sayıda primordiyal folikül olgunlaşmaya başlar. 1. mayoz bölünmenin profaz evresinin diploten evresinde dinlenme halinde olan primer oosit büyümeye başlar; oositi çevreleyen yassı epitel hücreleri önce kübikleşir; bu durumdaki folikül, unilaminar primer folikül olarak adlandırılır. Daha sonra bu hücreler çoğalarak çok sıralı bir epitel tabakası oluşturur, çoğalan bu hücrelere granüloza hücreleri, oluşturdukları katmana ise granüloza hücre katmanı denir. Folikül artık bu haliyle multilaminar primer folikül olarak adlandırılır. 25,27,28 Granüloza hücreleri bazal lamina üzerine otururlar. Etrafları teka folikül katmanı ile çevrelenmişlerdir. Bu süreçte, granüloza hücreleri ve oosit glikoprotein yapıda bir madde salgılayarak, homojen, koyu boyanan ve asidofilik özellikte bir katman oluştururlar bu katman zona pellusida olarak adlandırılır. 11,27,28 Folikül büyümeye devam ederken teka folikülünün hücreleri, içte salgı yapan hücrelerden oluşan teka interna ve dışta fibroblast benzeri hücreler içeren, bağ dokusundan oluşan, teka eksterna adlı iki belirgin kata farklanırlar. 25 Foliküllerin büyümesi hipofizden salınan folikül uyarıcı hormon (FSH), büyüme faktörleri, epidermal büyüme faktörü (EGF), insülin benzeri büyüme faktörü (IGF-1) ile kalsiyum iyonlarının etkisine bağlıdır. 29 Folikül büyüdükçe granüloza hücreleri arasındaki boşluklarda sıvı (likör folikülü) birikmeye başlar. Bu boşluklar birleşerek daha büyük 9

20 boşlukları (antrum) oluşturur. Bu durumdaki foliküle sekonder folikül denir. 29 Başlangıçta ay şeklinde olan antrum zamanla büyür. Oositi çevreleyen granüloza hücreleri antrumun yanında bozulmadan kalarak kümülüs ooforusu (cumulus oophorus) oluştururlar. Ovulasyona yakın evrede folikül giderek büyür ve olgun folikül olarak adlandırılan Graaf folikülü oluşur. 11,27,30 İnsanlarda Gonadotropin Salgılatıcı Hormon (GnRH) artışının LH ve FSH seviyesini düzenlediği ve bu sayede folikülü ovulasyona götürdüğü bilinmektedir. Pubertede GnRH salınımının başlaması hipofizden FSH ve LH salınımını sitimüle eder. Hipofiz hormonlarının etkisiyle ovaryumda gün süren ovaryal döngü şekillenir. Her döngüde FSH etkisiyle 5-15 adet folikül gelişmeye başlasa da bunlardan ancak bir tanesi tam anlamıyla olgunluğa erişebilir. Diğerleri atretik hale gelir. Hangi folikülün o ay büyüme evresine gireceği ve hangisinin dominant folikül olarak seçileceğini belirleyen faktörler bilinmemektedir. 31 Folikül olgunlaşması tamamlanırken primer oosit birinci mayoz bölünmesini tamamlayarak büyüklükleri farklı, ancak her biri 23 çift yapılı (2nDNA) kromozom içeren 2 yavru hücre oluşturur. Bu hücrelerden biri sitoplazmanın büyük bir kısmını içeren sekonder oosit diğeri ise çok az sitoplazma içeren 1. kutup cismidir. 1. kutup cismi, oositin hücre zarı ile zona pellusida arasındaki perivitellin aralıkta yer alır. I. mayoz bölünme ovulasyondan hemen önce tamamlanır. Bundan hemen sonra sekonder oosit DNA eşleşmesi olmadan II. mayoz bölünmeye girer. Oosit II de bölünme mekiği oluşur. Kromozomlar ovulasyondan 3 saat önce metefaz plağında dizildiklerinde ovulasyon gerçekleşir ve oosit ovaryumdan dışarıya atılır. II. mayoz bölünme ancak oosit II, bir spermiyumla döllendiği 10

21 zaman tamamlanır. Döllenme gerçekleşmez ise, ovulasyondan 24 saat sonra dejenere olur OVARYUMLARIN ANATOMĠSĠ Ovarium, pelvis boşluğunda (cavitas pelvis) arka duvarda sağda ve solda olmak üzere fossa ovarica da yerleşmiş, iri badem büyüklüğünde bir çift organdır. Ovaryumlar, döletsel yaşamın başlarında karın arka duvarında yerleşimlidirler. Gelişimin ikinci ayından itibaren testis gibi pelvis boşluğuna inmeye başlarlar. Ovaryum bu inişini gebeliğin 7. ayında tamamlar ve pelvis minor un duvarındaki fossa ovarica (Krause çukuru) denilen çukurlara yerleşmiş olur. 13 Fossa ovarica, a. İliaca externa ile a. iliaca interna arasında bulunur. Fossa ovarica, alttan ve önden, lig. latum uteri nin tabanı; yukarıdan, a.iliaca externa ve arkadan, üreterler ile sınırlanır. Çukurun dibinde ve periton (peritoneum) un altından a.-v. obturatoria ile n. obturatorius geçer. Doğum yapan kadınlarda ovaryumlar daha aşağıda bulunurlar. Lig. latum uteri içinde bulunan, tuba uterina nın arka-alt kısmında yerleşmiş ve pembemsi-gri renkte olan ovaryumların yüzü puberteye kadar periton la örtülü olup düz ve parlaktır. Puberteden sonra periton özelliğini yitirir ve matlaşır. Ovaryum un anatomik olarak, facies lateralis ve facies medialis olmak üzere iki yüzü vardır. Margo liber ve margo mesoovaricus, iki kenarı iken; extremitas tubaria ve extremitas uterina ise iki ucu olarak bilinir

22 Facies medialis: Ovaryumun tuba uterina ile örtülü olan kısmıdır. Tuba uterina nın infundibulum parçasıyla ovaryumun arka kısmı komşudur. Facies medialis, pelvis boşluğuna bakar. İnce bağırsak (intestinum tenue) ve sigmoid kolonla (colon sigmoideum) komşulukları vardır. Facies lateralis: Ovaryumun pelvis duvarına bakan yüzüdür. Paryetal periton (peritoneum parietale) aracılığıyla facies lateralis, fossa ovarica denilen çukurcuğa yerleşmiştir. Margo liber: Arka kenar olarak isimlendirilir. Margo liber, a. iliaca interna, v. iliaca interna ve üreter ile komşuluk yapan, serbest ve hareketli kenardır. Margo mesovaricus: Ön kenar olarak isimlendirilir. Bu kenarda Farre-Waldeyer çizgisi bulunmaktadır. Bu çizgi ovaryum u lig. latum uteri ye bağlayan, mesovarium denilen bir periton katlantısının tutunduğu çizgidir. Ayrıca bu kenar üzerindeki mesovarium içinde yer alan damar ve sinirlerin, organa girip çıktığı yer olarak bilinen hilum ovarii bulunmaktadır. Extremitas tubaria: Tuba uterina nın infundibulum parçası ile komşu olan üst ucudur. Fimbriae tubae ve lig. suspensorium ovari adı verilen, içinde ovaryum a ait ven, arter ve sinirlerin yer aldığı periton kıvrımı bulunur. Üst uçtan, tuba uterina nın infundibulum parçası ile komşudur. 12

23 Extremitas uterina: : Üst uçtan daha dar olan alt ucudur. Ligamentum ovarii proprii denilen ve fibröz dokudan yapılmış olan bir bağ, ovaryum un alt ucundan uterus un dış köşesine tutunur Ovaryumların Arterleri A. ovarica lar, aorta abdominalis ten çıkarlar. Aorta abdominalis ten ayrılan a. ovarica, lig. ovarii suspensorium içerisinde ilerler. Daha sonra mesovarium a gelir ve a. uterina nın bir dalı olan ramus ovaricus ile anastomoz yapar. Ovaryuma arter, hilum ovarii den girer; foliküllerin çevresinde zengin kapiller ağları oluşturur. Damarların çapı döngü evrelerine göre değişmektedir. Damarlar foliküllerin gelişimi sırasında genişler, ovulasyondan sonra ise daralırlar Ovaryumların Venleri Venler, arterlerle birlikte hilum ovarii den çıkarlar. Plexus ovaricus denilen venöz ağ yaparlar. Bu ağdan ayrılan venlerin, bir bölümü plexus uterovaginalis e, diğerleri ise lig. ovarii suspensonum içerisindeki v. ovarica ya açılırlar. V. ovarica, a. ovarica larla birlikte uzanırlar. Sol v. ovarica v. renalis e, sağ v. ovarica ise v. cava inferior a açılır. 13

24 Ovaryumların Lenf Damarları Lenf damarları, lenf kapillerleri olarak başlarlar. Kan damarlarıyla birlikte uzanırlar. Nodi lymphatici preaortici ve nodi lymphatici aortici lateralis lere açılırlar Ovaryumların Sinirleri Ovaryum un sinirleri, plexus hypogastricus inferior ve a. ovarica nın çevresindeki plexusovaricus dan gelir. Parasempatikleri 10. kafa çifti n. vagus tan, sempatikleri ise n. splanchnicus minor ve bir kısım torakal medulla spinalis segmentlerinden gelir OVARYUMLARIN FiZYOLOJiSi Kadın hormonal sistemi, üç ayrı hormon grubundan oluşur: 1. Hipotalamik serbestleştirici hormon ya da gonadotropin serbestleştirici hormon (GnRH). 2. Hipofiz ön lobu hormonları olan Folikül Uyaran Hormon (FSH) ve Luteinleştirici Hormon (LH) dur. Bu hormonların her ikisi de hipotalamusta sentezlenen GnRH-serbestleştirici hormon etkisiyle salgılanırlar. 14

25 3. Ovaryum hormonları: Östrojen ve progesteron. Bu hormonlar hipofiz ön lobundan salınan FSH ve LH nin ovaryumlar tarfından salgılanırlar. Kadında aylık menstrüal döngü sürecinde, bu hormonların salınımları değişiklik gösterir. Döngünün farklı evrelerinde bu hormonların salgılanma hızları da farklıdır Ovaryal Döngünün Hormonal Düzenlenmesi Ovaryumlardan olgun bir oositin oluşturularak atılması (ovulasyon) erinlikte (pubertede) başlar ve menopoza kadar devam eder. İnsanda ovulasyon menstrüasyonun başlangıcından sonraki günlerde gerçekleşir. Her 28 günde bir oositin atılmasıyla yinelenen bu olaylar ovaryal döngü olarak bilinir. Bu döngü 3 fazdan oluşur; 1- Folikül büyüme ve gelişiminin görüldüğü foliküler faz, 2- Ovulasyon, 3- Korpus luteum oluşumunun gözlendiği luteal faz. 16 Her menstrüel döngüde ovaryum, düzenli değişikliklere uğrar ve foliküler fazdan luteal faza geçer. İki faz birbirinden ovulasyon ile ayrılır. Foliküler fazın başlangıcında adet preantral folikül FSH ve LH etkisiyle gelişmeye başlar. 16,17,18 Döngünün ilk günlerinde folikül büyümesini etkileyen başlıca hormon FSH dir. FSH teka ve granüloza hücrelerini uyararak foliküler lümene östrojen sentezlemelerini sağlar. Yüksek seviyelerdeki 15

26 FSH nin, erken sekonder foliküllere ait granüloza hücrelerinin bölünme ve farklılaşmalarının tamamlamalarını sağlayarak, foliküllerin canlı kalabilmelerini sağlar. Böylece, söz konusu foliküller LH ye yanıt olarak lüteinize olma potansiyeli kazanırlar. 19 İleri foliküler fazda, ovulasyondan önce LH nin etkisi altında progesteron artmaya başlar, folikül lümeninde östrojen birikmeye başlar. Sonunda LH öyle bir değere ulaşır ki, folikül sürekli büyüme ve gelişme için FSH den bağımsız hale gelir. Östrojen seviyesi adenohipofizden FSH salınımını inhibe eder. FSH den bağımsız aşamaya ulaşamayan foliküller dejenere olur. Hormonal olarak kontrol edilen gelişim sonucunda sadece bir folikül tam olarak olgun hale gelir ve ovaryumdan atılır. LH nin en yüksek seviyesi ovulasyonu başlatırken, FSH daha az oranda yükselir. 19 LH, ovulasyona gidecek olan dominant folikülün steroidojenik fonksiyonu için menstrüel döngünün ortasında salınır. Folikül tarafından östrojen üretimi için iki hücre tarafından, iki gonadotropin ile açıklanır. 19 Teka interna hücreleri LH reseptörleri içerir ve artan LH ye yanıt olarak androjen üretimini artırır. Granüloza hücreleri ise, FSH reseptörü bulundurur ve FSH ye yanıt olarak androjen-östrojen dönüşümünü artırır. Dolaşımdaki östradiol seviyesinin artması, hipotalamik-hipofizer aks gibi hedef organlarda döngünün ortasındaki gonadotropin salınımını sağlayarak olgun folikülde periovulatuar olaylara neden olur. 20 Ovulasyonun ardından luteal faz başlar ve granüloza ve teka hücreleri korpus luteumu oluşturmak üzere hızlı bir değişime uğrarlar. Korpus luteum östrojen ve büyük oranda progesteron salgılar. Bu iki hormonun etkisiyle daha çok progesteron olmak üzere endometrium sekretuvar faza girer. Bu faz, döllenmiş yumurtanın implantasyonu için hazırlık fazıdır. Menstrüel döngü boyunca LH, KL nin gelişmesi ve 16

27 sürekliliğinden sorumlu görülür. Döllenme olmadığı taktirde, hormon seviyesi düşer ve KL birkaç gün içinde dejenere olur. Döllenme ve implantasyon olduğu zaman ise, KL progesteron ve östrojenleri salgılamaya devam eder. İnsan karyonik gonadotropin hormon u (HCG), fetüs tarafından daha sonra da plasenta tarafından salgılanarak KL yi uyarır ve gebelik boyunca sürekliliğinden sorumludur. 19 LH nin preovulatuvar dönemdeki salınımından önce ovaryumda üretilen başlıca hormon östrojendir. LH ile birlikte teka ve granüloza hücrelerinin lüteinize olması sonucunda her iki hücreden de salınan temel hormon artık progesterondur OVARYUMLARIN HĠSTOLOJĠSĠ Ovaryumlar yaklaşık 3 cm uzunluğunda 1,5 cm genişliğinde ve 1 cm kalınlığında badem biçiminde organlardır. Yüzeyleri tek katlı yassı ya da kübik epitel ile örtülüdür. 21 Germinatif epitel olarak adlandırılan bu epitelin peritona bakan yüzünde mikrovilluslar ve az sayıda kinosilyalar gözlenir. Epitelin altında tunika albuginea adı verilen bağ dokusundan katman bulunur. Tunika albuginea az damarlı, düzensiz sıkı bağ dokusu yapısındadır. iki katmandan oluşurlar. 13 Ovaryumlar dışta korteks (cortex), içte medulla olmak üzere 17

28 Ovaryum Medullası Kan ve lenf damarları ile sinirlerden zengin, açık renkli iç bölgedir. Elastik liflerden zengin, düz kas hücreleri içeren fibroelastik gevşek bağ dokusu yapısındadır. İnsan ovaryum medullasında menstrüasyon öncesi östrojen salgılayan küçük gruplar halinde epiteloit interstitial hücreler vardır. Yaşamın ilk yıllarından başlayarak ve ergenlik çağının erken evreleri süresince foliküler atreziye koşut olarak interstitial hücrelerin sayısı artar ve interstitial bezler oluşur. Ovaryum medullasındaki diğer epiteloit hücre grubu ise, küçük adacıklar halinde hilusta gözlenen, hilus hücreleridir. Bu hücreler, testis in Leydig hücrelerine (endocrinocytus interstitialis) benzerler ve sitoplazmalarında yağ damlacıkları, lipofüskin pigmenti, Reinke kristallerini içerirler ve androjen salgılarlar Ovaryum Korteksi Ovaryumun medulla bölgesini sarar ve dış kısımda bulunur. Korteks bölgesi, hücreden zengin bağ dokusuna gömülmüş farklı gelişim aşamalarında bulunan ovaryum foliküllerini içerir. Foliküller etrafında stromada dağılmış olarak düz kas fibrilleri bulunur Medulla ve korteks arasındaki sınır belirgin değildir. 23 Ovaryum folikülleri (folliculi ovari) ortada bir oosit ve bunun çevresinde tek yada çok sıralı folikül (granüloza) hücreleriyle çevrili yuvarlak ya da oval yapılardır. 18

29 Ovaryumda histolojik olarak 3 ana tip folikül bulunur: 24 1) Primordiyal Folikül 2) Büyüyen Folikül a. Primer Folikül b. Sekonder (Antral) Folikül 3) Olgun (Graaf) Folikül Ovaryum Folikülleri Primordiyal Foliküller Fötal yaşamın 3. ayında belirirler. Olgunlaşmış ovaryumda primordiyal foliküller tunika albugineanın hemen altında korteks stroması içinde bulunurlar. Primordiyal foliküllerde oosit tek tabaka yassı epitel hücreleriyle sarılmıştır. Folikül hücrelerinin dış bölümü bazal lamina ile sınırlandırılmıştır. Bu aşamada folikül içindeki oosit yaklaşık 30 μm çapındadır. Kenarda yerleşmiş nükleusu içinde çok belirgin nükleolusu vardır. Oosit sitoplazmasında Balbiani cisimciği görülür. Balbiani cisimciği, Golgi aygıtı membranları ve vezikülleri, endoplazmik retikulum (ER), birçok mitokondriya ve lizozomların birikmesiyle oluşmuş bir yapıdır

30 Büyüyen Foliküller Primer Foliküller Primordiyal folikül büyüyen folikül aşamasına geldiğinde folikülde, oositte ve stromada değişiklikler meydana gelir. Başlangıç olarak oosit genişler ve bunu saran folikül hücreleri kübikleşir. Folikül hücreleri kübik yapıya farklılaştığında bu durumdaki folikül primer folikül olarak adlandırılır. 32 Tek katlı kübik folikül hücre katmanı içeren folikül, unilaminar primer folikül olarak adlandırılır. 21 Oosit büyüdükçe, oosit ve folikül hücreleri arasında asidofilik, ışık kırıcı ve homojen bir tabaka olan zona pellusida belirir. Zona pellusida ışık mikroskobunda ilk olarak oositin etrafı kübik ya da silindirik folikül hücreleri ile çevrildiğinde ve oosit çapı μm ye ulaştığında görülür. Jel kıvamında ve glikozaminoglikan ve glikoprotein bakımından zengin bir yapıda olan zona pellusida büyümekte olan oosit ve etrafındaki folikül hücreleri tarafından sentezlenir. 24,33 Tek tabaka olan folikül hücreleri mitotik bölünmelerle birlikte çok katlı epitel görüntüsü alır ve buna membrana granülosum denir. Bu aşamadaki folikül hücreleri ise granüloza hücreleri olarak adlandırılır. 34 Bu durumdaki folikül multilaminar primer folikül ya da preantral folikül olarak adlandırılır. 21 Granüloza hücreleri aralık bağlantıları (gap junction) aracılığıyla iletişim kurarlar. Oosit ve granüloza hücre katmanında bu değişiklikler oluşurken, folikülün hemen bitişiğindeki stromada yer alan fibroblastlar, teka folikülü (thecae folliculi) katını oluşturmak üzere farklılaşırlar. Bu katman daha sonra teka interna (theca interna) ve teka eksterna (theca externa) olarak iki alt kata ayrılır

31 1- Teka interna: İç tarafta bulunan, damardan zengin, ve salgı yapan hücrelerdir. Teka interna hücrelerinde çok sayıda LH reseptörü vardır. LH uyarımına yanıt olarak, östrojenin öncüsü olan androjenleri sentezler ve salgılarlar. Teka internada salgı yapan hücrelere ek olarak fibroblastlar, kollajen lifler ve zengin bir damar ağı vardır. 2- Teka eksterna: Bağ doku hücrelerinden yapılmış dış kısımdır. Esas olarak düz kas hücreleri ve kollajen lif demetlerinden oluşur. Teka tabakaları arasında ve teka eksterna ile çevre stroma arasındaki sınır belirgin değildir. Bununla birlikte granüloza hücreleri ile teka tabakası arasında bulunan bazal lamina bu iki tabakayı kesin şekilde ayırır. Böylece bazal lamina, foliküler büyüme sırasında damarsız olan granüloza hücre tabakasını, teka interna tabakasından ayırmış olur Sekonder Foliküller Bu aşamada granüloza hücreleri arasında sıvı (liquor follicularis) toplanmaya başlar. Sıvıyı içeren küçük boşluklar birleşir ve daha büyük bir boşluk olan antrum(antrum folliculare) oluşur. Bundan sonra bu foliküller sekonder (ikincil folikül) ya da antral folikül olarak adlandırılır. Folikül sıvısı plazma bileşenleri ve folikül hücreleri tarafından salgılanan ürünleri içerir; bu sıvıda glikozaminoglikanlar, steroid-bağlayıcı proteinler de dahil olmak üzere bazı proteinler ve yüksek konsantrasyonda steroidler bulunur. 21 Sekonder folikülün boyutu arttıkça granüloza hücre tabakası ile çevrili olan antrumun da genişliği artar. Granüloza hücre tabakası oositi 21

32 çevreleyen bölge dışında her bölümde aynı kalınlıktadır. Oosit çevresinde ise granüloza hücrelerinin oluşturduğu tepe şeklindeki kümeye kümülüs ooforus (cumulus ooforus) adı verilir Graaf Folikülü Graaf folikülü olarak da bilinen olgun foliküller 10 mm veya daha fazla çaptadır. Büyüklüklerinden dolayı ovaryumun yüzeyinde çıkıntı yaptıkları gözlenebilir. Antrum genişledikçe granüloza hücre tabakası incelir. Granüloza hücrelerinin arasındaki boşluk arttıkça ovulasyona hazırlık olarak kümülüs oosit kompleksi ile folikülün geriye kalan kısmı arasındaki bağlantı zayıflar. Folikül olgunlaşmasının bu aşamasında teka hücre tabakası belirgin bir özellik kazanır. Teka interna hücrelerinin sitoplazmasında yağ damlacıkları belirir ve hücreler morfolojik olarak steroid üreten hücre görüntüsünü alır Atretik Folikül Ovaryum foliküllerinin büyük bölümü, folikül hücreleri ve oositin ölümüyle geriler ve fagositoz yapan hücrelerce ortadan kaldırılırlar. Bu süreçte granüloza hücrelerinde mitoz durur, granüloza hücreleri bazal membrandan ayrılır ve folikül hücreleri dejenere olur

33 Ovulasyon İnsanda LH, teka interna hücrelerinde östrojen öncülü olan androjenin sentezlenmesini uyarır. Bazı androjenler granüloza hücrelerindeki düz ER lere taşınırlar. Androjenlerin, FSH ye yanıt olarak, granüloza hücrelerinde, granüloza hücre proliferasyonunu ve folikül boyutunu artıran östrojenlere dönüşümü katalizlenir. Ovulasyondan yaklaşık 24 saat önce adenohipofizden FSH ve LH salımında artış olur. LH düzeyindeki artışa yanıt olarak granüloza hücrelerindeki LH reseptörleri azalır ve granüloza hücrelerinde LH ye yanıt olarak östrojen üretimi durur. LH salınımındaki artıştan saat sonra, primer oosit birinci mayoz bölünmesini tamamlayarak sekonder oosit ve birinci kutup cisimciğini oluşturur. 20 Ovulasyondan hemen önce ovaryum yüzeyinde Graaf folikülünün bulunduğu yerde soluk, kansız, ince duvarlı bir kabarıklık görülür. Bu alana stigma (stigma folliculare) denir. Dejenerasyonla stigma bölgesinde açılan delikten sekonder oosit (oosit II) ve çevresindeki bir miktar kümülüs hücresi, folikül sıvısıyla birlikte periton boşluğuna atılır. Bu olaya ovulasyon (yumurtlama) denir. Ovulasyon, 28 günlük menstüriyal döngünün yaklaşık 14. gününde olaylanır. Atılan oosit II tuba uterina nın fimbriya ovarikaları ile tutularak tuba içerisine alınır. Oosit in tuba uterinadaki yolculuğu yaklaşık dört gün sürer, bu sürede bir spermiyum tarafından döllenirse ikinci mayoz bölünmesi tamamlanır. Ovum ve ikinci kutup cisimciği oluşur. Döllenme olmadığında sekonder oosit 24 saat içinde dejenere olur

34 Korpus Luteum Ovulasyondan sonra arta kalan granüloza ve teka hücrelerinden oluşan folikül duvarı folikül katlandıkça kıvrıntılar oluşturur ve korpus luteum a (KL) dönüşür. 39 Başlangıçta damarsız olan granüloza hücre kümesi içine kan damarları girer. Antrum boşluğuna kan dolar ve pıhtılaşır; böylece, geçici bir yapı olan korpus hemorajikum oluşur. Daha sonra, yeni oluşmuş kan damarları, fibroblastlar ve kollajen lifler fibrin pıhtı içine girer. Granüloza hücreleri, granüloza lütein hücrelerine dönüşüp, lipit damlacıkları, gelişmiş düz ER ve tübüler kristalı mitokondriyonları ile tipik olarak steroid sentezleyen hücre özelliği gösterirler. Bu özelliği kazandıktan sonra, FSH ve LH uyarısına yanıt olarak progesteron ve östrojen salgılarlar. Teka interna hücreleri de teka lütein hücrelerine dönüşür ve LH uyarısına yanıt olarak androstenedion ve progesteron üretirler. 38 Bu luteal hücrelerin boyutları artar ve yağ damlacıklarıyla dolar taze preparatlarda hücrelerin sitoplazmasında bulunan, yağda çözülebilen bir pigment olan lipokrom, sarımtırak bir renk verir. 37 Granüloza lütein hücreleri, yaklaşık 30 μm çapında, büyük ve merkezi yerleşimlidir. Teka lütein hücreleri ise, yaklaşık 15 μm çapında, granüloza lütein hücrelerine göre daha küçük ve çevresel yerleşimlidir. Teka lütein hücreleri, granüloza hücrelerine göre daha koyu boyanır. 39 Korpus luteum un durumu gebeliğin oluşup oluşmamasına bağlıdır. LH uyarımının ardından, korpus luteum gün süreyle hormon salgılamak üzere programlanmıştır. Bunun dışında hormonal uyarı olmaz ve gebelik oluşmazsa, korpus luteum dejenere olur. Progesteron salgısındaki azalmanın sonuçlarından biri menstruasyondur. 24

35 Mentruasyonda uterus mukozasının endometriyum katmanı dökülür. Östrojen, hipofizden folikül uyarıcı hormonun salgılanmasını baskılar. Korpus luteum dejenerasyonundan sonra, steroid hormonların kandaki yoğunlukları azalır ve folikül uyarıcı hormon salgılanır. Folikül uyarıcı hormon diğer foliküllerin büyümesini uyarır ve bir sonraki menstrüel döngü başlar. Yalnızca menstrüel döngünün bir kısmı süresince kalan korpus luteum, menstruasyon korpus luteumu olarak adlandırılır ve hücresel kalıntıları, makrofajlar tarafından ortadan kaldırılır. Korpus luteum un bulunduğu yer fibroblastlar tarafından doldurulur ve burada sıkı bağ dokusundan oluşan bir cisim gelişir. Bu cisme korpus albikans (corpus albicans) denir. Gebelik oluşursa, embriyonun trofoblastik hücreleri tarafından sentezlenen insan karyonik gonadotropin hormon u (HCG) korpus luteumu uyaran sinyaller gönderir. HCG nin etkisi LH ye eşdeğerdir, böylece korpus luteum un dejenerasyonu engellenir. Korpus luteum daha da büyür ve progesteron hormonu salgılar. Progesteron ayrıca uterus bezlerinin salgı yapışını da uyarır. Bu bezlerin salgıları, plasenta işleve başlamayıncaya değin embriyonun beslenmesi açısından önemli görülmektedir. Gebelikteki korpus luteuma gebelik korpus luteumu (corpus luteum graviditatis) denir. Gebelik korpus luteumu 4 5 aya değin aktiftir, daha sonra geriler. Yerini korpus albikans alır

36 2.5. KÜMÜLÜS HÜCRELERĠ Foliküler gelişim sürecinde, antral foliküldeki granüloza hücreleri folikül içinde yerleşim yerlerine göre iki alt gruba ayrılır. Folikül duvarında yerleşim gösteren granüloza hücreleri mural granüloza hücreleri olarak adlandırılırken, oositi yakından çevreleyen granüloza hücreleri ise kümülüs hücreleri olarak adlandırılır. Bu hücre gruplarının gen ifadeleri ve işlevleri birbirlerinden farklıdır. Mural granüloza hücreleri folikül duvarında sıra halinde dizilirler, teka hücrelerine yakın bulunurlar ve folikülün çatlaması için gerekli olan genleri ifade ederler. Kümülüs hücreleri ise folikül gelişimi ve fertilizasyon için aracı hücreler olarak görev yaparlar. 40,41,42 Austin ve arkadaşlarının 1982 yılında yayınladıkları bir çalışmada ovulasyon ile atılan sekonder oositin etrafında vizkos matrikse gömülmüş, geniş yayılımlı kümülüs hücreleriyle birlikte atıldığını belirtilmiştir. 43 Ortiz ve arkadaşlarının 1982 yılında yayınladıkları bir çalışmada ovulasyondan çok kısa bir zaman sonra, oositin etrafındaki kümülüs hücrelerinin sayılarının yaklaşık e kadar ulaştığını belirtilmişlerdir. 44 Oositi çevreleyen kümülüs hücrelerinin boyutları 9 ile 17 µm arasında olup, düzensiz yuvarlak şekilli hücrelerdir. Kümülüs hücrelerinin yüzeylerinde mikrovilluslar vardır. Nukleusları hücrenin şekline uygundur ve dağınık kromatine sahiplerdir

37 Kümülüs hücreleri çok iyi gelişmiş granüllü endoplazmik retikuluma ve Golgi kompleksine sahiptirler. Sitoplazmalarında çok sayıda lipid damlacıkları içerirler. Mitokondrileri tübüler kristalıdır. Bağımsız yada kümeler halinde kortikal granülleri vardır. 46 Kümülüs hücrelerinin oosite olan yakınlığı, oosit ile devamlı bir ilişkide olduğunun göstergesidir. 47 Oosit ile kümülüs hücreleri arasındaki hücre-hücre iletişimi, ovaryum foliküllerinin gelişimini koordine eder. Bu hücresel iletişim ağı endokrin, otokrin ve parakrin faktörleri ve gap junction tipi bağlantıları içermektedir. Oosit ve foliküler hücrelerin gelişiminin koordinasyonu, ovulasyon ile atılan oosit II Nil fertilizasyona gideceğinin ve sonrasında embryogenezin başarılı bir şekilde olacağını temin etmektedir. 48 Sitoplazma olgunlaşması ve oosit aktivasyonu, çekirdek olgunlaşması ile paralel yürür. Kümülüs hücrelerinin etkisiyle oositte protein sentezi uyarılarak, özellikle steroid salınımı artar. MII deki oositin sitoplazma olgunlaşması spermiyumla karşılaştığında daha da indüklenir. Bu olaylar dizisi oosit aktivasyonu olarak tanımlanır. 49 Kümülüs ooforus hücrelerinin oositin in vitro olgunlaşmasına da olumlu etkileri vardır. Bu hücreler salgıladıkları gonadotropinlerle reseptörler aracılığıyla oositin ilk etkileşimini sağlamaktadırlar. 50,51 Kümülüs hücreleri, sitoplazmik uzantılarıyla zona pellusida(zp) yı geçerek oosit plazmalemmasına ulaşırlar ve böylelikle oositin olgunlaşması için gerekli maddelerin bir kısmını sağlarlar. Bu hücreler hem endokrin hem de parakrin özellik taşımaktadırlar. 52 Kümülüs hücrelerinin yüzey arttırıcı mikrovillus ve sitoplazmik çıkıntılarının ZP üzerinde oosit sitoplazma zarının mikrovilluslarıyla gap-junction tipi bağlantılarla oosite küçük moleküllerin ve kendi salgıladıkları az miktardaki gonadotropinlerin iletimini sağlayarak, reseptör artışını indüklemek suretiyle östrojen, 27

38 progesteron ve kısmen de androjen salgısında artışa yol açarak bunun yanı sıra IGF II salgılayarak oosit olgunlaşmasına katkıda bulunurlar. 5,45 Granüloza hücrelerinde ise preovulatuvar dönemde FSH ve LH reseptör sayısı artarak folikül gelişimi uyarılır. Bu etki ilk önce granüloza hücrelerinde yapılan E2 ile kuvvetlenir. 1 İnsülin benzeri büyüme faktörleri (IGF I,II) de FSH etkisi ile kuvvetlenmektedirler. IGF ler granüloza hücre fonksiyonunda mitojen olarak etkilidir ve gonadotropinlerin etkilerini de arttırırlar. IGF lerin biyolojik aktivitelerinde bağlayıcı proteinlerin (IGF BP 1-6) de rolü önem taşımaktadır. IGF I in sistemik dolaşımdan, IGF II nin ise granüloza hücrelerinden kaynaklanır. 53,54 Artan IGF I in etkisi ile; FSH etkisiyle birlikte progesteron ve östrojen sentezi artar, LH reseptörleri artar. Yeterli LH reseptörü oluşunca, LH direkt olarak granüloza hücrelerine etki ederek luteinizasyona ve progesteron yapımına yol açar. İnhibinin LH aktivitesini kuvvetlendirmesi sonucu androjen ve östrojen sentezi artış gösterir. 55 Teka hücrelerinde LH etkisi ile yapılanan androjenler (testosteron ve androstenedion) granüloza hücrelerine taşınır ve FSH nin aromataz enzimlere etkisi ile burada östrojenlere (östradiol ve östron) dönüşür. 56, ENDOPLAZMĠK RETĠKULUM Endoplazmik Retikulum (reticulum endoplasmicum) bütün ökaryatik hücrelerde bulunan dallı tübüllerden ve yassılaşmış keselerden oluşan bir organeldir. 88 Endoplazmik retikulum (ER), transmembran, salgılanan ve ER de yerleşik proteinlerin katlanması, olgunlaşması, hücre içinde işlev gösterecekleri bölgelere taşınması ve bu süreçte proteinlerin kalite kontrolünden sorumludur. Kalsiyum deposu olan ER protein 28

39 katlanması ve taşınması rolünden dolayı aynı zamanda kalsiyum bağımlı moleküler şaperonlardan GRP78 ve GRP94 den zengindir. 58,59 Salgı yolaklarına gidecek olan proteinler sitoplazmadan ER ye aktarılırlar. Bu proteinler ER de translasyon sonrası değişikliklere uğratılır ve katlanırlar Endoplazmik Retikulumda Protein Katlanması Bütün organizmalarda, proteinlerin görevlerini yerine getirebilmeleri için protein katlanması gerekli bir süreçtir. Ökaryotik hücrelerde salgı yolaklarına gidecek olan proteinler, Golgi ye geçmeden önce, katlanmak üzere ER de toplanırlar. 60 Proteinlerin kalite kontrolü olarak adlandırılan bu mekanizmanın amacı, sadece düzgün katlanan proteinlerin ER den çıkmasına izin vererek diğer hücre içi organellere gitmesini sağlamaktır. Proteinlerin katlanma mekanizmaları, uygun bir çevreye, genetik faktörlere ve metabolik duruma bağlıdır. Protein katlanmasındaki bozukluk hücre canlılığı için bir tehdit oluşturur. ER, yeni sentezlenmiş ve ER lümenine girmiş proteinlerin doğru katlanabilmesini sağlayan oksidatif bir mikroçevreye sahiptir. BİP (bağlayıcı protein), GRP94 ve kalretikulin, protein katlanma reaksiyonlarında görev alırlar ve ER lümeninde protein birikimini engellerler. 60,61 ER lümenine giren, yeni sentezlenmiş polipeptid zincirleri amino uçlarından karbonhidrat yan zincirleri (3glikoz- 2Mannoz- 2N Asetilglikozamin) eklenerek translasyon sonrası değişikliğe uğrarlar. Bu 29

40 reaksiyon OST (oligosakkarittransferaz enzimi) tarafından katalizlenir. Daha sonra devreye Glikozidaz I ve II enzimleri girerek en uçtaki 2 glikoz molekülünü uzaklaştırarak tek bir glikoz molekülü içeren katlanmamış protein halini almasını sağlar. ER şaperon proteinlerinden kalneksin ve kalretikulin, Erp57 ile birlikte protein katlanmasını gerçekleştirir. Düzgün katlanmış proteinler kalneksin/ kalretikulin döngüsünden çıkarak Golgi ye geçerler Endoplazmik Retikulum Stresi ER de katlanmamış veya hatalı katlanmış proteinlerin birikmesi ve ER homeostazisinin bozulması durumunda ortaya çıkan hücresel yanıt ER stresi olarak tanımlanmaktadır. 63,64 ER de protein birikimini tetikleyen etkenler, salgı proteinlerinin yüksek miktarda sentezlenmesi, hatalı katlanmış proteinlerin fazla miktarda birikmesi, katlanma işlevinin gerçekleştirilmesinde görevli proteinlerdeki mutasyonlar, besin kıtlığı, ER deki kalsiyum seviyesindeki anormal değişimler ve viral enfeksiyonlar olarak sayılabilir. 63,65 ER lümeninde katlanmayan proteinlerin birikmesiyle oluşan ER stresi, katlanmayan proteinlere yanıt olarak adlandırılan UPR (Unfolded Protein Response) yolağını aktifleştirir. UPR sinyal yolağının amacı, hatalı katlanmış yada katlanmamış proteinlerin düzgün bir şekilde katlanmasını sağlamak ve ER homeostazisini düzenlemektir. 66,67 30

41 UPR yolağı, ER nin normal işlevini yeniden yerine getirmesini ve değişen çevreye adaptasyonu sağlamak, ER lümenine gelecek yeni proteinlerin miktarını azaltmak, ER de proteinlerin katlanma kapasitesini artırmak, ER de bulunan katlanmamış veya hatalı katlanmış proteinleri ERAD (Endoplasmic Reticulum Associated Degradation) yolağına yönlendirmek ve tekrar sitoplazmaya dönüşünü sağlamaktan sorumludur. 64,65 UPR sinyal yolağında IRE1 alfa (inositol-requiring kinase 1 alfa), PERK (protein kinase-like ER kinase) ve ATF6 (activating transcription factor 6) olmak üzere 3 farklı ER transmembran proteini görev alır. Bu transmembran proteinler ER lümeninde gerçekleştirilen protein katlanmasına duyarlıdırlar ve bu bilgiyi ER membranından sitoplazmaya iletirler. 68,69 UPR yolağında sinyal, ER transmembran proteinleri tarafından başlatılır. Bu transmembran proteinleri ER de protein katlanmasına duyarlı bir lüminal domain ile transkripsiyon veya translasyon ile ilişkide olan sitoplazmik efektör kısma sahiptirler. 70, UPR nin Düzenlenmesi Endoplazmik retikulumda bulunan şaperonlardan bağlayıcı protein BİP (GRP78) bir UPR düzenleyicisidir

42 BiP, ısı şok protein 70 ailesinin üyesi bir ATPaz dır ve ER ye gelmiş yeni sentezlenen proteinlere geçici olarak, glikozillenme sürecinde olan ve hatalı katlanmış veya katlanmamış proteinlere ise kalıcı olarak bağlanmaktadır. Stres olmadığı koşullarda BiP, IRE1 alfa, PERK ve ATF6 nın lüminal domainlerine bağlanarak ER de inaktif durumda kalmalarını sağlamaktadır. Ancak katlanmamış veya hatalı katlanmış proteinlerin birikimi sonucunda oluşan ER stresine yanıtta BiP, IRE1 alfa, PERK ve ATF6 yı serbest bırakarak bu proteinlerin aktivasyonlarına yol açmaktadır. 86,87 Proteinler UPR Yolağında Görev Alan Transmembran Ġnositol Requiring Kinase 1 alfa (IRE1 alfa) IRE1 alfa, ER lümeninde protein katlanmasına duyarlı lüminal domain ile protein kinaz aktivitesi gösteren sitoplazmik domaine sahiptir. ER stresi sürecinde BİP tarafından serbest bırakılan IRE1 in ER membranı yüzeyinde oligomerizasyonu gerçekleşir. Oligomerizasyon sonucunda, IRE1 in protein kinaz domainlerinin otofosforilasyonu olaylanır. Bu olayda direkt olarak katlanmayan proteinlerin IRE1 in lüminal domainine bağlanmasını sağlar. 72,73 IRE1 protein kinaz aktivitesi ve endoribonükleaz aktivitesine sahiptir. IRE1 endonükleaz aktivitesini, metazoalarda tek substratı olan XBP1 (X box binding protein 1) üzerinde gösterir. 74,75 IRE1 öncül XBP1 mrna iki yerinden keserek intronları uzaklaştırır, geriye kalan 5 ve 3 32

43 mrna parçaları birleştirilerek alternatif form sxbp1 mrna meydana getirilir. 76 Yeni oluşan sxbp1 transkripsiyon aktivatörüdür ve UPR de görev alan hedef genlerin transkripsiyonlarını aktifleştirerek ER de protein katlanma kapasitesini arttırır ATF6 ( Activating Transcription Factor 6) Etkin olmayan öncüller halinde sentezlenir. ER membranına transmembran bir parça ile bağlıdır ve ER lümeninde ER stresine duyarlı bir lüminal domaini vardır. ER stresi altında, BİP tarafından serbest bırakılan ATF6, ER den Golgi ye geçerek burada yerleşik proteazlar S1P (kısmi proteaz 1) ve S2P (kısmi proteaz 2) tarafından kısmi olarak kesilerek transkripsiyon faktör domaini serbest bırakılır. ATF6 nın serbest kalan transkripsiyon faktörü kısmı nukleusa göç ederek burada UPR de görev alan hedef genlerin transkripsiyonunu aktifleştirir PERK ( Protein kinase-like ER kinase ) ER stresine en hızlı yanıt, kısa süreliğine protein translasyonunu azaltmaktır. Böylece yeni sentezlenmiş polipeptidlerin ER lümeninde birikmesi engellenir. 79 Protein translasyonundaki azalma PERK tarafından gerçekleştirilir. PERK, ER de bulunan transmembran bir protein kinazdır. 33

44 ER de katlanmayan proteinlerin birikmesi sonucunda oluşan ER stresine yanıtta BİP tarafından serbest bırakılan PERK in homodimerilizasyonu ve otofosforilasyonu gerçekleşir. 80,81 Aktif PERK, ökaryotik translasyon başlatıcı faktör 2 (eif2) nin alfa alt ünitesini fosforlar. elf2alfa nın fosforilasyonu sonucunda, Guanin nükleotid değiştirme faktörü engellenir. Bu geri dönüşümde elf2 nin aktif GTP ye bağlı bir forma dönüşmesini sağlar. Bu üçlü translasyon başlama kompleksinin (elf2-gtp-trna met) aktivitesinin düşük olması, translasyonunda çok az seviyede olmasına neden olur.böylece yeni sentezlenen protein miktarı azaltılmış olur. 80,82,83 PERK in genel olarak protein sentezini azaltma görevine ek olarak, ayrıca UPR yolağında görev alan genlerin yaklaşık üçte birinin transkripsiyonunu indükler. PERK in elf2 alfayı fosforiğe etmesiyle, transkripsiyon faktör 4 (ATF4) seçici translasyon ile aktifleşir. ATF 4 de UPR yolağında görev alan hedef genlerin transkripsiyonlarını aktifleştirir. 82,83, ER Stresi ve Apoptozis ER de hatalı katlanmış veya katlanmamış protein birikimine ERAD ve UPR yolakları ile yanıt verilmeye çalışılsa da hatalı katlanmış protein miktarının çok fazla olması strese karşı verilen yanıtları yetersiz kılabilmektedir. Böyle bir durumda ER stresi apopitozu (programlı hücre ölümünü) tetiklemektedir. 64 ER stresi sonunda oluşan apopitoz mitokondri-bağımlı ve bağımsız yolaklardan uyarılabilir

45 2.7. Tunikamisin Tunikamisin (TM), diğer antibiyotiklerden farklı olarak memeliler için yüksek derecede toksiktir, bu yüzden antibakteriyal olarak kullanılmaz. 90 Tunikamisin post translasyonel glikozilasyonu inhibe etme kapasitesinden dolayı hücre yüzeyi ile ilişkili proteinlerin salgılanması ve hücre içi aktarımı, virüslerin enfeksiyonu ve yayılması gibi çeşitli olaylardaki proteinlerin N-glikozil bağlı oligosakkarit kısımlarının fonksiyonlarını araştırmada kullanılmaktadır. 91 Tunikamisin Nil protein sentezi üzerinde genel bir etkisi yoktur. Protein glikozilasyonunu tamamen inihibe etme yeteneğine sahiptir ve bu nedenle biyolojik deneylerde sıklıkla kullanılmaktadır. 92 Tunikamisin bitki ve memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum stresini uyarır, N- bağlı glikozilasyonu inhibe eder ve bu inhibisyon apoptozisi indükler TUDCA ( Tauroursodeoxycholic acid ) TUDCA, insanlarda az miktarda bulunan hidrofilik bir safra asitidir. Eski Asyalılar TUDCA nın iyileştirici etkisinden dolayı ilaçların bileşiminde TUDCA yı kullanmışlardır. Bu etkiler karaciğere karşı anti 35

46 enflamatuar etkisi, böbrek taşlarını eritme etkisi ve merkezi sinir sistemi hücrelerini koruma etkisi olarak sayılabilir. 94,95 Sürekli yapılan araştırmalar sonucu TUDCA nın apopitik etkiyi azalttığı saptanmıştır. Apopitoz yada programlı hücre ölümü büyük bir ölçüde mitokondrinin etkisi altındadır. Mitokondride oluşabilecek bozuklukta sitokrom c serbest bırakılır. Sitokrom c de apopitozda rol alan kaspazları tetikler. TUDCA Bax yolağındaki rolüyle apopitozu engeller. Bax hücrenin sitozolünde yerleşik bir moleküldür ve mitokondriye göç ederek sitokrom c yi serbest bırakır ve bu durumda apopitoz yolağını aktifleştirir. 96 TUDCA Bax ın mitokondriye geçişini engeller bu durumda mitokondriyi hasardan ve kaspazların aktivasyonundan korur

47 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Doku Örneklerinin Toplanması ve Gruplandırılması Gazi Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanan çalışmamız, Gen Art Tüp Bebek Ve Kadın Sağlığı Ve Üreme Biyoteknolojisi Merkezi nde infertilite tanısı amacıyla başvuran toplam 40 gönüllü hastadan alınan kümülüs hücreleriyle gerçekleştirilmiştir. Proje kapsamında hastaların klinik tanı bilgileri kullanılarak 40 gönüllü hasta 4 grupta toplanmıştır. 1. grup: Normostimülasyon ( n=10 ) 2. grup: Hipostimülasyon ( n=10 ) 3. grup: Hipersitimülasyon ( n=10 ) 4. grup: Polikistik Over Sendromu (PKOS) ( n=10 ) İn vitro fertilizasyon tekniği kullanılarak 35 yaş altı, endometriosis olmayan 40 gönüllü hastadan kümülüs hücreleri toplanmıştır. Çalışmada kümülüs hücre örnekleri kullanılan tüm hastalara, çalışmayı detayları ile anlatan bilgilendirilmiş gönüllü hasta onay formu imzalatılmıştır. Çalışmanın deneysel işlemleri ABD Yale üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Doğum, Jinekoloji ve Üreme Bilimleri Anabilim Dalında, yardımcı tez danışmanım Doç. Dr. Ümit A. Kayışlı nın gözetiminde yapılmıştır. 37

48 3.2. Kullanılan Yöntemler Dokuların bir kısmının protein lizatları yapıldı ve sonrasında UPR sinyal molekülü GRP78 seviyesine Western Blot tekniği ile bakılıp, daha sonra β-aktin seviyesine oranları alınarak gruplar istatistiksel olarak One-way ANOVA ile kıyaslandı. İstatistiksel anlamlılık seviyesi p<0.05 olarak kabul edildi. Dokuların diğer kısmında ise RT kiti ile RNA izolasyonu yapıldı ve devamında UPR sinyal moleküllerinin gen düzeyindeki seviyesini gösteren XBP-1 ve alternatif formu olan sxbp-1 mrna ifadelerine RT-PCR tekniği ile bakılıp, daha sonra β-aktin mrna seviyesine oranları alınarak gruplar istatistiksel olarak One-way ANOVA ile kıyaslandı. İstatistiksel anlamlılık seviyesi p<0.05 olarak kabul edildi. Kümülüs Hücre Kültürü deneyleri : Kümülüs hücreleri hücre kültür ortamında (%5 CO 2 de) %80 doygunluğa ulaşıncaya kadar çoğaltıldı ve daha sonra farklı UPR sinyal yolu inhibitörleri ile muamele edilerek bu hücrelerdeki proliferasyon ve apopitoz oranları sırasıyla MTT ve TUNEL teknikleri kullanılarak analiz edildi ve istatistiksel olarak Oneway ANOVA ile kıyaslandı. İstatistiksel anlamlılık seviyesi p<0.05 olarak kabul edildi. 38

49 3.2.1 Western Blot Yöntemi Blotlama yöntemi, protein ve nükleik asitlerin belirlenmesi amacıyla kullanılan farklı yöntemlerin genel ismidir. 98,99 Blotlama, elektriksel ortamda jel üzerine göç ettirilen ve ayrıştırılan protein veya nükleik asitlerin bir destek tabakaya aktarıldıktan sonra özgül olarak belirlenmelerini ifade eder. 100 Western blot (protein blotlama) yöntemi, elektroforez işlemiyle poliakrilamid jelde göç ettirilen proteinlerin, destek membrana aktarımı ve membrandaki proteinlerin immünolojik yöntemlerle gösterilmesidir. 101,102 Blotlamadan önce, çalışılan örnekteki proteinler elektriksel ortamda jel üzerine aktarılmaktadır. Proteinlerin elektroforezleri sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jelde gerçekleştirilmektedir. Bu jel, proteinlerin ayrıştırılması ve saflaştırılmasında kullanılan biyokimyasal yöntemlerden birisidir. Çalışılan örnekteki SDS-polipeptid kompleksleri, poliakrilamid jele yüklenip, elektrik akımına maruz bırakıldıkları zaman proteinin moleküler ağırlığıyla orantılı olarak, artı kutba doğru göç etmekte ve jelde bulundukları yerde bantlar halinde yığılım göstermektedir. Yapılan bu işleme elektroforez denilmektedir

50 aşamada gerçekleştirilir: Western Blot yöntemi, elektroforez işlemini izleyen 4 1.Jeldeki proteinlerin nitroselüloz membrana aktarımı (blotlama) 2.Özgül olmayan reaksiyonları engellemek amacıyla nitroselüloz membranda protein bağlanmamış bölgelerin ilgisiz proteinlerle kaplanması (bloklama) 3.Özgül antikorlarla tepkime 4. Proteinlerin görüntülenmesi aşamalarıdır. 101,102, Western Blot Yöntemi Ġçin Kullanılan Kimyasallar Sodyum dodesil sülfat (SDS) (American Bionalytical) Triz hidroklorür (Tris-HCl ) (American Bionalytical) Gliserol ( American Bionalytical) Yükleme boyası ( Cell Signaling ) Merkaptoetanol ( Cell Signaling) Glisin (American Bionalytical) Metanol (J.T.Baker) Sodyum klorür (NaCl) (SIGMA) Tween- 20 ( Sigma) Bromofenol mavisi (American Bionalytical ) Hidroklorik asit ( HCl) Trizma Base (Sigma) Kemuluminisans madde (GE Healthcare, Western Blotting Detection Reagents) 40

51 Çözeltiler Western Blot ĠĢleminde Kullanılan Tampon ve Jel Elektroforez (Yürütme) Tamponu (5X) 43.2 g glisin, 9 g trizma base, 3 g SDS tartılarak 600 ml distile su içinde çözülerek 4 ºC derecede korundu. Her kullanımda 200 ml (5X) stok tampona, 800 ml distile su eklenerek (1X) yürütme tamponu elde edildi. Jelden Membrana Proteinleri Aktarım Tamponu (1000 ml) 3 g Trizma base, 14.3 g glisin tartılarak,800 ml distile su içinde iyice çözüldükten sonra, üzerine 200 ml metanol eklenerek 20 C e kaldırıldı, aktarımdan 5 dakika önce çıkarılarak kullanıldı. Örnek Tampon (4X) 0.5M Tris-HCl 5 ml ph:6.8, 0.8 gr SDS, 4ml gliserol, 800 µl beta merkaptoetanol, 40 µg bromofenol mavisi eklendi. Hazırlanan karışım -20 C de saklandı. 41

52 Tris - tuz Çözeltisi (TBS) ( 10X ) 24.2 g Trizma base, 80 g NaCl tartılarak, 1000 ml distile su içinde çözülerek hazırlandı. Tris-tuz-tween 20 Çözeltisi (TBS-T) ( 1X ) 100 ml 10X TBS, 900 ml distile su eklenerek dilue edildi. Üzerine 1 ml, % 0.1 Tween-20 eklenerek hazırlandı. Her Western Blot işleminde yeni çözelti hazırlandı. Bloklama Solüsyonu ( 20 ml) hazırlandı. 1 g yağsız süt tozu tartılarak 20 ml TBS-T içinde çözünerek Antikor Çözeltileri Hazır antikorlar GRP78 (C50B12 Rabbit mab, Cell Signaling lot= 31775) ve Beta Aktin ( Cell signalling) ve peroksidaz işaretli sekonder antikorla (Peroxidase Labeled Anti-Rabbit, Vector) belirtilen miktarda TBS-T ile dilue edilerek ve -20 C de saklandı. 42

53 Protein Ekstraktı Hazırlanması -80 C de saklanan ependorf tüpler içerisindeki kümülüs hücreleri, çıkarılarak buz dolu kap içerisine aktarıldı ve erimeleri beklendi. Örnekler eridikten sonra, sonifikasyon aleti (ses dalgalarıyla parçalama) ile hücreler parçalandı ve tekrar buz içine aktarıldı. 30 dakika beklendikten sonra 1200 rpm de 5 dakika +4 C de santrifüj edildi. Santrifüj sonunda tüplerde üstte süpernatan, altta pellet olmak üzere iki faz oluştu. Süpernatan kısmı dikkatlice yeni ependorf tüplerine alındı. Örnekler derin dondurucuda -20 C de saklandı. Elektroforezi Örneklerin Hazırlanması, Jele Yüklenmesi ve -20 C de saklanan örnekler, buz üzerine alınarak erimeleri beklendi. Proteinler 4:1 oranında örnek tamponuyla eşitlendi ve vortekslenip, spin edilerek tekrar buz üzerine konuldu. Daha sonra 5 dakika 95 C de kaynatıldı ve tekrar vortekslenip, spin edilerek buz üzerine yerleştirildi. Çalışılacak olan proteinin kilo dalton ağırlığı dikkate alınarak uygun yüzdelerde jeller hazır olarak alındı. Jel, elektroforez tankına yerleştirildi. Jelin her kuyucuğuna, başta 5 µl moleküler ağırlık işaretleyicisi olmak üzere, 20 µl protein içeren örnekler yüklendi. Örnekler kuyucuklardan inene kadar, ilk önce 100 V da, sonra 80 V da 1,5 saat, oda sıcaklığında jelin sonuna kadar (1X) yürütme tamponu içerisinde yürütüldü. 43

54 SDS-Poliakrilamid Jel Üzerindeki Proteinlerin Nitroselüloz Membrana Aktarılması Elektroforez işleminden sonra jeldeki proteinler membrana aktarıldı. Bu işlem sırasında jel sistemine ait jel kaseti kullanıldı. Bu işlemde, jelden membrana proteinleri aktarım tamponu büyük bir kabın içine döküldü. Kasetin bir kapağı tamponun içinde diğer kapağı ise açık olarak yerleştirildi. Kasetin tampon içindeki kapağının üzerine jel sistemine ait sünger, aktarım tamponuyla ıslatılarak yerleştirildi. Jel plağının kapağı açıldı, jel, aktarım tamponu ile dolu kaba aktarıldı ve filtre kağıdı ile alınarak süngerin üzerine konuldu. Nitroselüloz membran diğer bir aktarım tamponu ile dolu kapta ıslatılarak, jelin üzerine konuldu. Nitroselüloz membran yerleştirildikten sonra üzerine, tekrar jelden membrana aktarım tamponunda ıslatılmış, filtre kağıdı ve üzerine sünger yerleştirildi. Bu işlemlerden sonra sünger, filtre kağıdı, jel, nitroselüloz membran ve üzerine tekrar filtre kağıdı ve sünger konularak kasetin iki kapağı arasında sıkıştırıldı. Daha sonra kaset jelden membrana proteinleri aktarım tamponuyla dolu olan tanka yerleştirildi. Jelden proteinlerin nitroselüloz membrana aktarım işlemi gece boyu soğuk ortamda 32 volt elektrik akımı gücüyle gerçekleştirildi ve proteinlerin nitroselüloz membrana aktarımı yapıldı. 44

55 Ġmmünolojik Saptanması Nitroselüloz Membran Üzerindeki Proteinlerin Ertesi sabah, nitroselüloz membran kasetten çıkarılarak, TBS-T çözeltisiyle dolu küçük bir kapta, 10 dakika yatay karıştırıcı üzerinde yıkandı. Ardından membran 1 saat süre ile oda ısısında, yatay karıştırıcı üzerinde, TBS-T ile hazırlanan % 5 lif yağsız süt tozu ile bloklandı. Bloklama işleminden sonra, membran TBS-T çözeltisiyle sulandırılmış birincil antikorla bir gece soğuk odada, yatay karıştırıcı üzerinde, muamele edildi. Ertesi sabah membran birincil antikordan alınarak, TBS-T çözeltisiyle dolu kaba aktarıldı ve 6 kez 5 er dakika yıkandı. Yıkama işleminden sonra membran TBS-T çözeltisiyle sulandırılmış ikincil antikorla bir saat oda sıcaklığında, yatay çalkalayıcı üzerinde inkübasyonu yapıldı. İnkübasyon sonrasında tekrar TBS-T ile 6 kez 5 er dakika yıkandı. Ardından kemuluminisans madde (GE Healthcare, Western Blotting Detection Reagents) ile 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edilip karanlık odada membrandaki protein bantları filme ( Premium Autoradyography Film, cat. No: E 3018) aktarıldı PCR ( Polimeraz Zincir Reaksiyonu) Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) DNA nın spesifik bir bölgesinin in vitro enzimatik şekilde çoğaltılması işlemidir. 104 PCR temel olarak çoğaltılması planlanan hedef bölgenin iki ucundaki DNA dizilerini özgül olarak tanıyıp karşı iplikçiklerini hibridize eden iki oligonükleotid primer, primerlere bağlanıp bunlara 3 ucundan nükleotidleri ekleyerek sentez yapacak olan DNA polimeraz, sentez için gerekli olan deoksinükleotid trifosfatlar (dntp; adenin (A) guanin (G) sitozin (C) timin 45

56 (T) ) polimerazın çalışması için gerekli tampon maddeler ve kofaktör olan Mg+ iyonları kullanılarak bir DNA parçasının çoğaltılması esasına dayanmaktadır. PCR temel olarak 3 aşamalı bir yöntemdir: 1-Denatürasyon: Çift iplikli kalıp DNA nın birkaç saniye C de ısı ile tek iplikli DNA ya ayrılması. 2-Bağlanma: Örnek birkaç dakika C de tutularak primerin tek zincirli DNA daki hedef bölgelere hibridizasyonu sağlanır. Bu olay hidrojen bağlarının yardımıyla olur. 3-Uzama: DNA polimeraz enzimi yardımıyla tek zincirli DNA 105, 106 kalıplarına bağlanan primerlerin 5-3 yönde uzatılmasıdır RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) RNA nın analizinde birçok yöntem kullanılabilir. RT- PCR bir mrna analiz yöntemidir. 107 Ancak, PCR işlemi yalnız DNA üzerinde uygulanabilmektedir. Bu nedenle RNA, PCR çalışmasından önce reverse transkriptaz (RNA bağımlı DNA polimeraz) enziminin yardımıyla tamamlayıcı DNA ya (cdna) çevrilerek bilinen PCR prosedürüne devam edilmektedir. Bu teknikte Reverse Transcriptase Polimerase Chain 46

57 Reaction (RT-PCR) olarak adlandırılmaktadır. RT-PCR, RNA hedeflerinin çoğaltılması amacıyla kullanılır. 106 Bu yöntemde ilk işlem RNA nın dokulardan veya hücrelerden izole edilmesidir. Daha sonra izole edilen RNA, reversetranskriptaz enzimince kalıp olarak kullanılır ve komplementer DNA yani cdna sentezlenir. Bu defa cdna, PCR için kalıp olarak kullanılır. 108 PCR yapılır ve amplifiye ürün agaroz jele uygulanır. Amplifiye olmuş cdna, baz çifti (bp) uzunluğuna göre agaroz jel elektroforezinde ayrılır. Ethidium bromürle boyanır ve incelenir. 108, RNA izolasyonu Bu çalışmada RNA izolasyonu için RNA izolasyon kiti (Ambion RNAqueous-Micro cat no: Am1931) kullanıldı. RNA izolasyon kiti +4 C den çıkarıldı, her örnek için 100 µl lizis tamponu, 50 µl %100 etil alkol eklenerek vortekslendi. Oluşan karışım filtrelere aktarıldı (Micro Filter Cardigates + Tubes lot= ) ve rpm de 15 saniye spin santrifüj edildi. Daha sonra yıkama basamaklarına geçildi. Yıkama solüsyonu 1 den, 180 µl filtreye aktarılarak rpm de 15 saniye spin santrifüj edildi. Aynı işlem yıkama solüsyonu 2/3 içinde tekrarlandı.elüsyon solüsyonu örnek sayısına göre hesaplanarak steril ependorf tüpe konuldu ve ısıtıcı 75 C geldiğinde, her örnek için 2 kez 6,5 µl elüsyon solüsyonu filtreye konuldu, 1 dakika oda sıcaklığında beklendi ve rpm de 15 saniye spin santrifüj edildi. Yeni PCR tüpleri etiketlenerek, 10 µl lik pipet ile ependorf tüpün dibindeki sıvı alındı. Filtreye 47

58 tekrar 10 µl elüsyon solüsyonu eklendi, 1 dakika oda sıcaklığında beklendikten sonra rpm de 15 saniye spin santrifüj edildi ve yedek olarak -80 C ye kaldırıldı DNA Muamelesi Bu işlem -20 C de saklanan DNA muamelesi kiti kullanılarak gerçekleştirildi (Dnase Treatment, cat. No: AM1931 ). Kit - 20 C den çıkarıldı ve örneklere uygulanması gereken bir karışım hazırlandı. 10X DNaz Tamponu, rdnaz solüsyonları örnek sayısı ve hata payı göz önüne alınarak, katsayılar ile çarpıldı ve karışım hazırlandı. Bu karışımdan her örneğe 2 µl dağıtıldı, vortekslenip spin santrifüj edildi. Örnekler PCR makinesine 37 C DNaz adlı program ayarlanarak 20 dakika süreyle konuldu. Örnekler çıktıktan sonra her örneğe DNaz İnaktivasyon solüsyonundan 3 er µl konuldu, vortekslendi ve spin santrifüj edildi. 1 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra, tekrar vortekslendi ve spin santrifüj edildi aynı işlem bir defa daha tekrarlandıktan sonra örnekler rpm de 1,5 dakika santrifüj edildi. Bu işlem sonrasında tüplerde üstte RNA ve altta DNA olmak üzere 2 faz görüldü. 10 µl pipet ile üst kısım alınarak yeni ependorf tüplere aktarıldı. Bu işlem sonrasında RNA, DNA dan ayrılmış oldu. 48

59 RNA Muamelesi Bu işlem, RT kiti ( Retroscript Reverse Transcription for RT- PCR cat no:am1710 ) kullanılarak gerçekleştirildi. Her örneğe 2 µl Random decamers eklendi, vorteks ve spin santrifüj edilelerek, PCR makinesinde Retro 85 programı ayarlanarak 3 dakika süreyle örnekler konuldu. Daha sonra tekrar, 10x RT Tamponu, dntp Karışımı, MMLV-RT, RNaz inhibitör solüsyonlarının katsayıları, örnek sayısı, hata payı ve kontrol grubu, göz önüne alınarak hesaplandı ve karışım solüsyonu hazırlandı. Hazırladığımız karışımdan her örneğe 8 µl dağıtıldı. Vorteks ve spin santrifüj edildi. PCR makinesi Retro 42 programı ayarlanarak 1 saat 10 dakika süreyle örnekler konuldu PCR Kurumu Bu işlem -20 C de saklanan Taq Polimeraz kiti ( Taq Polimerase cat no: ) kullanılarak gerçekleştirildi. 10X CL tamponu, 5X Q solüsyonu, 5 mm dntp karışımı, Taq DNA polimeraz, ribonükleaz içermeyen su, F Primer ve R Primer solüsyonları kullanılıp, örnek sayısı, kontrol grubu ve hata payı gözönüne alınarak karışım solüsyonu hazırlandı. Bu karışım çalışmada kullanılan her primer için ayrı ayrı hazırlandı. Yeni PCR tüpleri etiketlendi ve tüplere ayrı ayrı her örneğe ait 2 µl cdna ve 23 µl hazırlanan karışımdan eklenerek toplam hacim 25 µl olacak şekilde hazırlandı. Vortekslenip, spin santrifüj edildi. PCR makinesine TDown 30, 30 siklus ayarlanarak konuldu. 49

60 Kullanılan primerler: Beta Aktin Geni Primerleri MACTIN F 5 - TGCGTGACATCAAAGAGAAG-3 MACTIN R 5 - CGGATGTCAACGTCACACTT-3 GRP78 Geni Primerleri HGRP78 F 5 - AGTTGTGGCCACTAATGGAGA-3 HGRP78 R 5 - TCAGCATCAAGCAAGAATTGA-3 XBP1 Geni Primerleri HXBP1 sense HXBP1 antisense 5 - ACACGCTTGGGAATGGACAC CCATGGGAAGATGTTCTGGG Agaroz Jelin Hazırlanması Jel için %1,5 agaroz jel den 2.25 g tartılarak, 155 ml 1X TBE ( Tris - borate EDTA) tamponunda çözüldü. Hazırlanan karışım 2 dakika boyunca, çalkalanmak üzere aralıklarla çıkarılıp tekrar konularak, mikrodalgada kaynatıldı. Oda sıcaklığında 5 dakika soğuması beklendikten sonra üzerine 10 µl ethidium bromür eklendi ve çalkandı. Soğuyan jel, jel kabının içine döküldü ve tarakları takılarak 45 dakika beklendi. Jel donduktan sonra, elektroforez küvetine yerleştirildi. PCR makinesinden çıkan örneklerimiz, başta 10 µl işaretleyici olmak üzere, örneklerimizden 25 µl alınarak sırasıyla yüklendi. Elektroforez 100V akım ile 30 dakika boyunca örnekler yürütüldü. Jelde yürütüldükten sonra UV altında bantlar görüntülendi. 50

61 3.2.3 Kümülüs Hücre Kültürü Kümülüs hücreleri üzerine 5ml DMEM:F12 besiyeri eklenerek petri kaplarına eşit miktarda dağıtıldı. Hücre besiyeri her iki günde bir değiştirildi. Kümülüs hücreleri petri yüzeyinde %60-70 lif bir yoğunluğa geldikleri zaman deneye alındı. Hücreler (1X) ılık PBS ile yıkanarak hücrelerin üzerlerine 5 ml tripsin eklenerek hücrelerin yapıştıkları yüzeyden ayrılmaları için 5 dakika 37 0 C de inkübe edildi. Hücreler faz-kontrast mikroskobu altında kontrol edildikten sonra, tripsin aktivitesini yok etmek için üzerlerine 5 ml DMEM:F12 besiyeri ilave edilerek falkon tüpe aktarıldı. Daha sonra 1800 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası supernatant uzaklaştırılıp, kalan hücre pelleti üzerine 5ml DMEM: F12 besiyeri eklendi ve pipetle homojenleştirildikten sonra petrilere eşit miktarlarda dağıtıldı. Hücre besiyeri her iki günde bir değiştirildi ve hücreler % yoğunluğa geldiklerinde tripsinize edildi. Tripsin aktivitesini yok etmek için üzerine tekrar besiyeri eklendi ve falkon tüpe aktarıldı.1800 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Supernatant uzaklaştırılıp pellet üzerine 5 ml besiyeri eklenerek homojenleştirildikten sonra hücreler 96-kuyucuklu kültür kaplarına her bir kuyucuğa 100 µl olmak üzere ve 4-gözlü hücre kültür lamlarına her göze 400 µl olmak üzere hücreler aktarıldı. 24 saat için hücrelere serum içermeyen besiyeri uygulandı. 24 saat sonunda farklı UPR inhibitörleri ve ER stres uyaran maddelerle muamele edilerek proliferasyon ve apopitoz indeksleri belirlendi. 51

62 3.2.4 MTT (3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromid) Proliferasyon Yöntemi MTT yöntemi, hücre canlılığının belirlenmesi için sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. 110,111 MTT, hücrelere aktif olarak absorbe olan ve mitokondriyal redüktaz enzimiyle renkli, suda çözünmeyen formazana indirgenen bir maddedir. 111 Hücrelerin MTT indirgeme özelliği hücre canlılığının ölçütü olarak kabul edilir ve MTT analizi sonucunda elde dilen boya yoğunluğu canlı hücre sayısıyla doğru orantı gösterir kuyucuklu kültür kabına aktarılan kültüre edilmiş kümülüs hücrelerine 24 saat için serum içermeyen besiyeri uygulandı. 24 saat sonunda UPR inhibitörü olan TUDCA (Tauroursodeoxycholic Acid) ve ER stresi uyaranıtm (Tunicamycin) uygulanarak hücreler 4 gruba ayrıldı: eklendi. 1.grup : Kontrol hücrelerin üzerine 1ml serumsuz besiyeri 2.grup : 10-3 µl/ml TUDCA 3.grup : 0.5 µg/ml TM 4.grup :10-3 µl/ml TUDCA ve 0.5 µg/ml TM birlikte uygulanarak hücreler 48 saat boyunca muamele edildi. 52

63 Daha sonra kuyucuklar PBS ile yıkandı. İlk kolona hiç hücre ekilmeyip bu kolon kontrol olarak okundu. Diğer kuyucuklara ise deney sonlanmadan 4 saat önce karanlık ortamda 10X MTT1 solüsyonu, 50 ml PBS içerisine 50 ug MTT1 ( CAL B ochem Cat no: ) eklenerek hazırlandı. Hazırlanan solüsyondan 1 ml alındı, üzerine 9 ml serum içermeyen besiyeri eklendi ve 1X MTT1 solüsyonu elde edilerek kullanıldı. Hazırlanan 1X MTT1 solüsyonu her kuyucuğa 100 ul olacak şekilde dağıtıldı. 96 kuyucuklu plak aliminyum folyoya sarılıp 4 saat süreyle 37 0 C de inkübe edildi. İnkübasyon sonunda plak karanlık ortamda buz üzerine alındı MTT1 solüsyonu uzaklaştırılarak, plak iyice kurulandı. MTT2 solüsyonu 49 ml izoproponel üzerine, 1ml 2N HCl eklenerek hazırlandı ve kuyucuklara 100 ul olmak üzere dağıtıldı. Hemen mikroskop altında mikroplate okuyucuyla 3 defa okundu ve bu değer karışım öncesi değer olarak adlandırıldı. 96-kuyucuklu plak tekrar buz üzerine alındı. 10 ar defa her kolondaki MTT2 solüsyonu birbirleriyle iyice karıştırıldıktan sonra tekrar mikroskop altında mikroplate okuyucuğla 3 defa okunarak karışım sonrası değer belirlendi. Daha sonra istatiksel anlamlığı belirlendi TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)-Mediated dutp Nick End Labeling) Kültüre edilmiş kümülüs hücreleri 4 gözlü hücre lamına aktarıldı ve 24 saat için hücrelere serum içermeyen besiyeri uygulandı. 24 saat sonunda ER stres indükleyicisi kimyasal bir şaperon olan tunikamisin ile uyarılmak üzere hücreler 2 gruba ayrıldı: 53

64 1.grup : Kontrol hücrelerin üzerine 1ml serumsuz besiyeri eklendi. 2.grup : 0.5 µg/ml tunikamisin uygulanarak hücreler 48 saat boyunca muamele edildi. UPR sinyal yolunun inhibisyonundan sonra alkaline fosfataz işaretlemesi kullanılarak DNA kırıkları TUNEL kiti kullanılarak (Roche, In Suti Cell Death Detection Kit, AP cat no: ) belirlendi. 4- gözlü hücre kültür lamlarında bulunan hücreler PBS ile yıkanarak buz üzerine alındı. Her göze %4 lük paraformaldehitten 1 ml konularak +4 0 C de 30 dakika inkübe edildi. PBS ile iki defa yıkandıktan sonra permeabilizasyon solüsyonu (0.1% tritonx-100 içeren 0.1% sodyum sitrat solüsyonu) hazırlandı. Hazırlanan permeabilizasyon solüsyonundan her göze 1 ml dağıtılarak 5 dakika +4 0 C de inkübe edildi. Sonrasında preperatlar PBS ile 2 kez yıkandı. 450 µl işaret solüsyonu üzerine, 50 µl enzim solüsyonu eklenerek TUNEL reaksiyon solüsyonu hazırlandı. Hazırlanan solüsyonu ile preperatlar karanlık ortamda, 1 saat, 37 0 C de inkübe edildi. Negatif kontrol için hücrelere enzimsiz TUNEL solüsyonu konuldu. Daha sonra hücreler tekrar PBS yıkamalarından geçirilerek 30 dakika Converter AP solüsyonunda bekletildi. Yıkama işleminin ardından, hücreler sonraki basamakta TUNEL pozitif hücreleri görüntülemek amacıyla Fast-Red substratı ile 10 dakika inkübe edildi. Daha sona mikroskopta pozitif/negatif hücre sayımı yapılarak UPR aracılı sinyal yolağının inhibisyonunun hücreleri apopitoza götürme oranları saptandı. 54

65 3.2.6 Ġstatistiksel Değerlendirme Tüm veriler SigmaStat 3 istatistik programına yüklenecektir. Veriler ortalama ± standart hata olarak gösterilecektir. Gruplar arasındaki farklar one-way ANOVA posthoc TUKEY testi ile değerlendirilecektir. P<0.05 anlamlılık düzeyi esas alınacaktır. 55

66 4. BULGULAR 4.1. MTT Analizi Bulguları Kümülüs hücrelerinde ER stresinin hücre proliferasyonuna etkisini araştırmak amacıyla hücre kültürüyle çoğaltılmış kümülüs hücreleri 96-kuyucuklu kültür kaplarına her bir kuyucuğa 500 bin hücre/100 µl olmak üzere ekildi. 24 saat için hücrelere serum içermeyen medya uygulandı. Daha sonra 48 saat boyunca Kontrol grubu kümülüs hücreleri sadece serum içermeyen medyada inkübe edildi. Grup I hücreler UPR inhibitörü olan tauroursodeoksikolik asit (TUDCA; 10-3 µl/ml) ile, Grup II hücreler ER stres uyaranı tunikamisin ile, Grup III hücreler ise tunikamisin (0.5 µg/ml) ve TUDCA nın birlikte uygulanmasıyla uyarıldı. Kümülüs hücrelerinde 48 saatlik inkübasyon sonunda MTT yöntemiyle hücre proliferasyonu ölçüldü. MTT analizi sonucunda kontrol grubuna ait kümülüs hücrelerinin proliferasyon indeksi 0.142±0.01 (ortalama ± standart hata) olarak saptandı ve tunikamisin ile muamele edilen kümülüs hücrelerinde ise proliferasyon indeksinin (0.02±0.002) kontrol grubuna kıyasla istatiksel olarak anlamlı düzeyde azaldığı gözlendi (P< 0.05; Grafik 1) Buna karşılık, sadece ER stres inhibitörü TUDCA uygulanan kümülüs hücrelerinin proliferasyon indeksi (0.143 ±0.01) ile kontrol grubu kümülüs hücrelerinin proliferasyon indeksleri arasında anlamlı bir fark gözlenmedi (p>0.05; Grafik 1). TUDCA ve tunikamisin ile birlikte uyarılan kümülüs hücrelerinde proliferasyon indeksi 0.04±0.002 seviyesinde olup kontrol grubuna kıyasla anlamlı düzeyde azalmıştı. Diğer taraftan, TUDCA ve tunikamisin ile birlikte uyarılan kümülüs hücrelerinin proliferasyon indeksi, sadece tunikamisin ile uyarılan kümülüs hücrelerininkiyle kıyaslandığında 56

67 proliferasyonun, TUDCA ve tunikamisin birlikte uygulanan grupta anlamlı olarak 2 kat daha yüksek seviyede olduğu tespit edildi (p>0.001)(grafik 1). Grafik 1. Kümülüs hücre kültüründe MTT hücre proliferasyonu. Kont: Kontrol grubu; TUD: 10-3 M TUDCA ile uyarılan kümülüs hücreleri, TUN: 0.5µg/ml tunikamisin ile uyarılan kümülüs hücreleri; TUN+TUD: Tunikamisin+TUDCA ile uyarılan kümülüs hücreleri. * P<0.05 ve ** P<0.01. Barlar ortalama ± standart hatayı göstermektedir TUNEL Bulguları MTT analizi sonucunda tunikamisin ile uyarılan kümülüs hücrelerinde anlamlı düzeyde azalan hücre proliferasyonunun proliferasyondaki azalmayla mı yoksa artan apopitozla mı ilişkili olup 57

68 olmadığını belirlemek amacıyla kümülüs hücrelerinde ER stresini tunikamisin ile indükleyerek apopitoz indeksleri saptanarak kontrol grubu ile kıyaslandı. Hücre kültüründe çoğaltılan kumulus hücreleri 4 gözlü hücre kültür lamlarına ekildi. Kültürde %70 yoğunluk gösteren kümülüs hücrelerine 24 saat serum içermeyen medya uygulandı. Daha sonra 48 saat süreyle kümülüs hücreleri 1 ml serum içermeyen medya uygulanan kontrol grubu ve 0.5 ug/ml tunikamisin uygulanan grup olmak üzere 2 gruba ayrıldı. 48 saat sonunda apopitoz indeksleri TUNEL yöntemi kullanılarak belirlendi. TUNEL sonuçlarına göre kümülüs hücrelerinin apopitoz indeksi ± olarak hesaplandı (Şekil 1). Buna karşılık ER stres indükleyicisi tunikamisin ile uyarıldıklarında apopitoz indeksi ± olarak hesaplandı ve tunikamisin uygulamasının kümülüs hücrelerinde kontrol grubuna kıyasla apopitozu anlamlı derecede arttırdığı gözlendi. (p<0.001) (şekil 1) 58

69 ġekil 1. A-C. Kümülüs hücre kültüründe tunukamisinin hücre apopitozuna etkisi. A) Kontrol grubu kümülüs hücreleri; B) Tunukamisin ile uyarılan kumulus hücreleri. Kırmızı renkli hücre çekirdekleri TUNEL pozitif hücreleri göstermektedir. Mavi renkli hücre çekirdekleri TUNEL negatıf hücreleri göstermektedir ve hematoksilen ile boyanmıştır. C) Apopitoik kümülüs hücrelerinin kantitatif analizi gözlenmektedir. * P<0.01. Barlar ortalama ± standart hatayı göstermektedir. 59

70 4.3. Ġn Vitro Fertilizasyon (IVF) Tedavisi Ġçin Stimüle Edilen Farklı Hasta Gruplarında ER Stres Yolağı nın Anahtar Molekülü GRP78 in Protein Seviyesinin Western Blot Tekniği Ġle AraĢtırılması IVF tedavisine verdikleri yanıta ve klinik bulgularına dayanarak, oosit sayısına bağlı olarak hastalar normostimülasyon (normorisponsif), polikistik over sendromu (PKOS), hiperstimüle (hiperrisponsif) ve hipostimüle (hiporisponsif veya poor-responsder)olmak üzere 4 farklı grupta incelendiler. Hasta grupları yaşlarına göre istatistiksel olarak analiz edildiğinde guruplar arasında anlamlı bir fark bulunamadı. (Grafik 2) 40 HASTA YASLARI (YIL) Normal PKOS Hipo Hiper Grafik 2. Normal, polikistik ovaryum sendromu, hipostimüle ve hiperstimüle hasta gruplarının yaş ortalamaları. Gruplar arası anlamlı fark gözlenemedi. p>0.45. Barlar otralama ± standart hatayı göstermektedir. 60

71 Hasta grupları toplanan ortalama oosit sayısı açısından değerlendirildiğinde PKOS ve hiperresponsif hasta grupları, normal ve hiporesponsif hasta gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha fazla oosite sahipti. Ayrıca normal hasta grupları hiporesponsif, hasta gruplarına göre anlamlı olarak daha fazla oosit sayısına sahiptir. (Grafik 3) OOSIT SAYISI Normal PKOS Hipo Hiper Grafik 3. Normal, polikistik ovaryum sendromu, hipositimüle ve hipersitümüle hasta gruplarından elde edilen oosit ortalamaları. PKOS ve hiperstimüle hasta grupları arasında hariç, tüm grupların birbirleri ile kıyaslanmasında elde edilen oosit sayısı bakımından anlamlı fark gözlendi (p<0.05). Barlar ortalama ± standart hatayı göstermektedir. Normal, polikistik ovaryum sendromlu, hiperstimüle ve hipostimüle ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde UPR yolağının başlıca düzenleyicisi olan GRP78 in protein seviyesi Western blot yöntemiyle analiz edildi. GRP78 ekspresyon seviyesinin, β-aktin seviyesine oranı 61

72 alınarak, sonuçlar normalize edildi. Normal, polikistik ovaryum sendromlu ve hiperstimüle gruplarına ait kümülüs hücrelerinde GRP78 seviyeleri sırasıyla ± 0.048, ± ve ± olarak saptandı ve gruplar arasında anlamlı bir değişim gözlenmedi (Şekil 2). Diğer taraftan, hipostimüle gurubunun kümülüs hücrelerinde diğer guruplara kıyasla 2 kat (1.706 ± 0.288) daha yüksek GRP78 protein seviyesi saptandı (p<0.05). ġekil 2. Normal, polikistik ovaryum sendromu, hiperstimüle ve hipostimüle hasta gruplarından elde edilen GRP78 seviyesi. A) Gruplara ait GRP78 ve β-aktin Western blot örnekleri. B) Hasta gruplarının GRP78 seviyesinin, β-aktin seyiyesine oranının semikantitatif analizi. Hipostimüle grubunda GRP78 seviyesi diğer gruplarla kıyaslandığında anlamlı olarak daha yüksektir (p<0.05). Barlar otralama ± standart hatayı göstermektedir. 62

73 4.4. XBP-1 ve sxbp-1 Bulguları Normal, polikistik ovaryum sendromu, hiperresponsif ve hiporesponsif ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde, ER stresi etkisinin mrna düzeyine yansıyıp yansımadığını araştırmak amacıyla, XBP-1 ve sxbp-1 in mrna düzeyleri RT-PCR yöntemi ile analiz edildi. Normal, polikistik ovaryum sendromu ve hiperresponsif gruba ait kümülüs hücrelerinde sxbp-1/xpb-1 seviyeleri sırasıyla ± 0.256, ± ve ± olarak saptandı ve gruplar arasında anlamlı bir değişim gözlenmedi (Şekil 3). Diğer taraftan, hiporesponsif gurup kümülüs hücrelerinde diğer guruplara kıyasla 1,5 kat (1.043 ± 0.165) daha yüksek sxbp-1/xbp-1 mrna seviyesi saptandı 63

74 ġekil 3. Normal, polikistik ovaryum sendromu, hiperresponsif ve hiporesponsif hasta gruplarından elde edilen sxbp-1/xbp-1 mrna seviyeleri. A) Gruplara ait sxbp-1, XBP-1 ve β-aktin den elde edilen RT- PCR örnekleri. B) Hasta gruplarinin sxbp-1/xbp-1 seviyesinin β-aktin seyiyesine oranın normalize edilerek semikantitatif analizi. Hiporesponsif gruplarda GRP78 seviyesi diger gruplarla kıyaslandığında anlamlı olarak daha yüksek olarak gözlenmektedir. Barlar ortalama ± standart hatayı göstermektedir. 64

75 5. TARTIġMA Endoplazmik retikulumun geniş membran ağı fiziksel ve işlevsel olarak diğer hücresel birimlerle yakından ilişkilidir. ER hücresel homeostasiyi düzenlemekten sorumludur. ER çeşitli hücresel işlemlerin merkezi koordinatörüdür. ER de yeni sentezlenmiş salgı ve transmembran proteinlerinin modifikasyonu, katlanması ve taşınması olaylanır. Ayrıca ER başlıca kalsiyum deposudur. ER membranının sitozolik yüzünde lipogenik reaksiyonlar oluşum gösterir. Ayrıca glikogeneziz ve yağ asidi oksidasyonu için gerekli olan özelleşmiş yolak enzimleri de ER de bulunmaktadır. ER, hücredeki diğer membran yapılarıyla da yakından ilişki kurmaktadır. Bu ilişki lipidlerin, kalsiyumun ve diğer moleküllerin çift yönlü aktarımını kolaylaştırır. Bu fiziksel ve işlevsel birliktelik ER ye hücresel homeostaside merkezi bir rol yüklemiştir. Bir çok düzensizlik ER lümeninde katlanmayan proteinlerin birikmesine neden olur. Bu durumlar hipoksi, glikoz eksikliği, oksidatif stres, viral enfeksiyonlar olarak sayılabilir. 113,114 65

76 Katlanmayan proteinlerin ER lümeninde birikmesi, bir seri oluşumu kapsayan katlanmayan proteinlere yanıt olarak adlandırılan UPR yolağını aktifleştirir. 115 ER de bulunan şaperonlar, ER nin normal fonksiyonlarını yerine getirmesini sağlarlar. 116 En iyi karakterize edilmiş ER şaperonu, GRP78 dir. Bu şaperon proteini BİP olarak da adlandırılır. GRP78, yeni sentezlenmiş proteinlerin katlanmasında ve biraraya getirilmesinde, hatalı katlanmış proteinlerin ERAD a yönlendirilmesinde, kalsiyum homeostasisinin düzenlenmesinde ve ER stres sensörlerinin harekete geçmesi dahil bir çok hücresel işlemde rol oynamaktadır. 117,118,119 Stres olmayan durumlarda BİP, UPR yolağında görev alan ER transmembran proteinleri PERK, IRE1 ve ATF6 nın lüminal domainlerine bağlanarak onların inaktif durumda kalmalarını sağlar. ER stresi durumda ise bunları serbest bırakarak aktivasyonlarına izin verir. 120 PERK tip 1 transmembran serin treonin kinazdır.stres olmayan durumlarda PERK in GRP78 tarafından bağlanması inaktif formda kalmasını sağlar. ER stresi sürecinde bu bağlanma bozulduğu zaman PERK in kendi kendine homodimerilizasyonu ve fosforilasyonu gerçekleşir. Aktif PERK ökaryotik transkripsiyon başlatıcı faktör 2 alfayı fosforlar. EIF2 alfa nın fosforilasyonu, genel olarak birçok proteinin translasyonunda azalmaya neden olur. Ancak ATF4 ve GRP78 gibi bazı seçilmiş proteinlerin translasyonunda artışa neden olur

77 ER stresinde GRP78 tarafından serbest bırakılan ATF6, ER den Golgi ye geçer. Golgi de site1 proteaz (S1P) ve S2P tarafından kısmi olarak kesilir. 50-kDa ağırlığındaki kesilmiş ATF6 alfa nukleusa göç eder ve burada UPR da görev alan GRP78 (BİP olarakta bilinir) ve GRP94 gibi şaperon proteinlerini kodlayan genlere bağlanır. GRP94 ısı şok proteini 90 ailesi üyesi bir şaperondur. Bu olaylar dizisi UPR da görev alan proteinlerin expresyonlarını arttırarak, ER de protein katlanma kapasitesini arttırır. 122,123 IRE1 alfa nın aktifleşmesi ona endonükleaz aktivite kazandırır ve XBP-1 mrna nın kesilmesine ve alternatif form sxbp-1 mrna nın meydana gelmesine neden olur. sxbp-1, ER de proteinlerin katlanması ve ER den ayrılması, hatalı katlanan proteinlerin ortadan kaldırılmasında rol oynanayan genlerin kuvvetli transkripsiyonel transaktivatörü olarak görev yapar. 124,125 Daha önce yapılan çalışmalarda GRP78 ve ER stresinin hastalık oluşumlarıyla yakından ilişkili olduğu belirtilmiştir. 126 Fang Chai ve arkadaşları tarafından 2010 yılında glokom hastalarının (POAG) trabeküler meshwork (TM) hücrelerinde ER stresinin anahtar belirteci olarak rol oynayan GRP78 in protein ve mrna seviyeleri Western blot ve real time PCR yöntemleri kullanılarak incelenmiştir. 127 Real-time ve Western blot analizleri benzer sonuçlar vermiştir. GRP78 mrna ekspresyonu ve GRP78 protein seviyeleri, POAG hastalarında normallere göre artış göstermiştir. (127) 67

78 Bizde çalışmamızda normal, polikistik ovaryum sendromu, hiperstimüle ve hipostimüle ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde ER stres proteinlerinin regülasyonunu araştırmak amacıyla UPR yolağının başlıca düzenleyicisi olan GRP78 in protein seviyesini Western blot yöntemiyle analiz ettik. Normal (normoresponsif), polikistik ovaryum sendromlu ve hiperstimüle (hiperresponsif) ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde GRP78 protein seviyesinde, gruplar arasında anlamlı bir değişim gözlenmedi. Diğer taraftan, hipostimüle (hiporesponsif) hastaların kümülüs hücrelerinde diğer guruplara kıyasla 2 kat daha yüksek GRP78 protein seviyesi saptadık.biz de bu bulgulara dayanarak hipostimüle ( hiporesponsif) hastalarda ER stresinin arttığını, buna bağlı olarak bu hasta guruplarında anlamlı derecede protein katlanma mekanizmalarının bozulmuş olabileceğini önermekteyiz. Bozulmuş bu mekanizma daha az folikül gelişmesine ve daha kalitesiz oosit gelişmesine neden olan mekanizmalardan bir tanesidir. Daha önce yapılan çalışmalarda bazı kanser hücre hatlarında ve tümör gelişiminde UPR yolağının aktifleştiği saptanmıştır. Ancak UPR yolağının leukemogenezis sürecindeki rolü bilinmemektedir. 128 Julian A. Schardt ve arkadaşları tarafından 2010 yılında yapılan bir çalışmada akut myeloid lösemi hastalığı sürecinde UPR yolağının aktivasyonu incelenmiştir. 128 Yüzbeş akut myeloid lösemi (AML) hastasından alınan lösemili hücrelerde UPR yolağını incelemek amacıyla XBP-1 mrna nın ve alternatif formu olan sxbp-1 mrna nın, kalretikulinin, GRP78 in ve CHOP mrna nın seviyeleri araştırılmıştır. AML hastalarının %16.2 sinde 68

79 sxbp-1 mrna nın varlığı tespit edilmiştir. Bununla birlikte bu grupta kalretikulin, GRP78 ve CHOP ifadeleri seviyelerinde önemli derecede artış gözlenmiştir. Sonuç olarak UPR yolağının AML hastalarında aktifleştiği ve UPR yolağı aktif AML hastalarının özelleşmiş kliniksel karakterlere sahip olduğu ve hastalığın kliniksel sürecini daha iyi geçirdikleri saptanmıştır. Bu sonuçlar doğrultusunda AML hücrelerinde sxbp-1 mrna nın varlığı aktif UPR yolağının saptanması için duyarlı bir belirteç olduğu saptanmıştır. 128 Jın Yu Zhang ve arkadaşlarının 2011 yılında yaptığı bir çalışmada XBP-1 in,upr yolağında rol alan genlerin transkripsiyon aktivatörü olarak anahtar rol oynadığını belirtilmişlerdir. UPR yolağında yer alan bu genler, protein katlanmasını ve hatalı katlanmış proteinlerin birikimini engelleyerek ER nin fonksiyonlarını yeniden yerine getirmesini sağlamaktadır. 138 Bu çalışmada domuzlarda bulunan organlarda ve domuz embriyonik fibroblast hücrelerinde ( PEF) ER stresinde domuz XBP-1 ( pxbp1) analizi RT- PCR ve Western blot yöntemleri kullanılarak incelenmiştir. 138 Olgun organlarda pxbp1 mrna ve pxbp1s mrna ve protein seviyeleri tespit edilmiştir. 138 Aynı çalışmada hücreler tunikamisinle muamele edilerek ER stresi indüklenmiş ve hücre canlılığı MTT analiziyle incelenmiştir. PEF 69

80 hücrelerinde pxbp1 in yokluğunda hücre ölümlerinin arttığı saptanmıştır. 138 Bu çalışmada ilk defa domuzlarda pxbp1 ve UPR mekanizması incelenmiş ve bu bulgular pxbp1 in diğer hayvan sistemlerinde olduğu gibi domuz sisteminde de ER stresi sürecinde önemli rol oynadığı saptanmıştır. 138 Bizde çalışmamızda ovulasyon indüksiyonuna farklı yanıt veren hastaların ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde ER stresini mrna düzeyinde araştırmak amacıyla XBP-1ve sxbp-1 mrna seviyesini RT- PCR yöntemiyle incelendik. Normal hücre siklusunda XBP-1, hücreler strese girmediği sürece alternatif formundan yoksun çalışmaktadır. Hücrede ER stresi aktif olduğunda, bu dönem içinde tüm form XBP-1 endonükleazlar tarafından kesilerek sxbp-1 üretimini aktifleştirir. Böylece tüm form XBP-1 oranı içinde sxbp-1 formunu gördüğümüz zaman hücrelerde ER stres yolağının mrna düzeyine kadar indiğini ve ER stres aracılı transkripsiyonun arttığını göstermektedir. Bizim çalışmamızda tüm form XBP-1 mrna nın içinde sxbp-1 mrna nın miktarı, diğer gruplarla kıyaslandığında, sadece hiporesponsif hastalarda artış göstermiştir. Bu sonuç GRP78 için bulduğumuz sonuçla benzerlik göstermektedir. Ve bizim hiporesponsif hastalarda saptadığımız artmış ER stresinin veya bozulmuş protein katlanma mekanizmasının bu 70

81 hastalarda folikülogenez ve oosit olgunlaşmasını önemli derecede etkileyeceği hipotezimizi desteklemektedir. Jing WU ve arkadaşlarının 2010 yılında yaptıkları bir çalışmada insan akciğer kanseri SPCA-1 hücre hattında GRP78 in antitümör ilacı olan sisplatin dayanıklılıktaki rolü araştırılmıştır. A23187 tarafından farklı konsantrasyonlarda indüklenen, SPCA-1 hücre hattında GRP78 mrna ve GRP78 protein seviyeleri, RT- PCR ve Western blot yöntemleri kullanılarak analiz edilmiştir. GRP78 in protein ve mrna seviyeleri, A23187 tarafından indüklenen SPCA-1 hücre hattında önemli derecede artış göstermiştir. 129 Aynı çalışmada MTT analiziyle de, sisplatinin hücre canlılığı üzerindeki etkisi incelenmiştir. MTT analizi sonucunda, A23187 ile indüklenen grupta hücre canlılığının kontrol grubuna oranla azaldığı saptanmıştır. Sisplatinle muamele edildiğinde, hücre canlılık oranıyla, GRP78 in artışı negatif bir ilişki göstermektedir. Sonuç olarak insan akciğer kanseri SPCA-1 hücre hattında GRP78 in fazla ekspresyonunun sisplatine duyarlılığı arttırdığı ve GRP78 in ekspresyonu ve sisplatin dayanıklılığı arasında ilişki olduğu belirtilmiştir. 129 Yapılan bir çalışmada fare serebral korteksinde, 6 saat ve üzeri uykusuzluğun ER stresini ve UPR yolağını indüklediği belirtilmiştir. BİP protein seviyesinin de 6, 9 ve 12 saat süren uykusuzluk süreçlerinde arttığı belirtilmiştir

82 Aynı çalışmada PERK ve eif2alfa nın fosforilasyonunun protein translasyonunu inhibe ettiği saptanmıştır. Ayrıca 6 saat uykusuzluğa maruz bırakılan farelerdeki ribozom profile de protein translasyonunda azalma olduğunu desteklemiştir. 130 Uyku yoksunluğunda UPR yolağını araştırmak ereğiyle Drosophila 131, rat serebral korteksi 132,133,134, fare serebral korteksinde 135,136 yapılan çalışmalarda BİP in arttığı saptanmıştır. Linda Lin-Yan Wu ve arkadaşları tarafından 2011 yılında yapılan bir çalışmada fazla yağlı beslenmenin neden olduğu lipotoksisitenin kümülüs-oosit kompleksinde yanıtı ve fertilizasyon oranında ki azalma incelenmiştir. 137 Obezitede, lipidlerin adipoz dokular dışında birikiminin lipotoksisiteye neden olduğu ve bu durumda ER stresi, mitokondriyal fonksiyon bozuklukları ve apoptoz ile ilişkili olduğu belirtilmiştir. Fazla yağlı besinlerle beslenen farelerde lipid miktarlarında artiş ve mitokondriyal membran potansiyelinde azalış gözlenmiştir. 137 Fazla yağlı beslenen farelerin kumulus-oosit kompleksleri incelendiğinde ER stresi belirteç genlerinden olan ATF4 ve GRP78 in ifadelenmelrinde artış gözlenmiştir. Fazla yağlı beslenen farelerin granüloza hücrelerinde ve kümülüs-oosit komplekslerinde apopitozun arttığı saptanmıştır

83 Fazla yağlı beslenen farelerde anovulasyonda artış ve in vivo fertilizasyon oranlarında da azalış gözlenmiştir. 137 Sonuç olarak fazla yağlı beslenen farelerin ovaryum hücrelerinde lipid birikiminin, ER stresinin, mitokondriyal fonksiyon bozukluklarının ve apoptozun önemli derecede arttığı saptanmıştır.aynı çalışmada farklı vücut kütle indekslerine sahip kadınların granüloza hücrelerinde ve folikul sıvılarında, ER stres belirteçleri analiz edilmiştir. Obez kadınların, obez olamayan kadınlar ile kıyaslandığında, granüloza hücrelerinde ATF4 artışı ve foliküler sıvılarında kalsiyum artışı gözlenmiştir. 137 Takao Iwawaki ve arkadaşlarının 2010 yılında yaptığı bir çalışmada IRE1 alfa da oluşan hasarın ekzokrin dokularda histolojik anomalilere, kan glikoz seviyesinde artışa ve serum imminoglobulin seviyesinde azalışa neden olduğu belirtilmiştir. IRE1 alfa nin ( Inositol Requiring Enzyme 1) UPR yolağında önemli bir role sahip olduğu belirtilmiştir. IRE1 alfa ve XBP1 den yoksun farelerde yapılan incelemeler XBP1 in ekzokrin bezlerin salgılamalarında, plazma hücre farklılaşmasında ve hepatik lipogenezisde gerekli olduğunu belirtmişlerdir. 139 IRE1 alfa dan yoksun farelerde ağırlık azalışı, kanda düşük miktarda insülin ve hiperglisemi gözlenmiştir. Ayrıca IRE1 alfa daki hasarın, pankreatik asiner hücrelerde histolojik anomalilere ve plazma hücrelerinde serum imminoglobulin üretiminde azalışa neden olduğu saptanmıştır

84 Michael L. Mulhern ve arkadaşlarının 2007 yılında yaptığı çalışmada galaktozemik ratların lens epitelyal hücrelerinde (LECs) katarakt oluşumuna neden olan birçok stres faktörünün ER stresini de indüklediği belirtilmiştir. Galaktozemik ratlarda ER stresi, UPR bağımlı apop toz yolaklarının aktifleşmesine ROS meydana gelmesine ve hücre ölümüne neden olmaktadır. Bu olayların hepsinin katarak oluşumunu indüklediğini belirtmişlerdir. 140 Hücresel osmoliteler PBA (4-phenylbutyric acid ), TMAO (trimethylamine N-oxide) ve TUDCA gibi maddelerin ER stres indüksiyonunu baskıladığı bilinmektedir. Bu çalışmada galaktoz ile beslenen ratların lenslerinde bu küçük moleküllerin katarak oluşumundan koruyabileceği hedeflenmiştir. LECs hücreleri galaktoz ve diğer moleküllerle muamele edilmiştir. PBA, TMAO ve TUDCA nın LEC hücre ölümünü ve katarakt oluşumunu baskılayabilme yetenekleri test edilmiştir.sonuç olarak bu ratlarda LEC hücre ölümü belirgin şekilde azalma göstermiş ve katarak oluşumunda gecikme gözlenmiştir. 140 B. Mosbah ve arkadaşları tarafından 2010 yılında yapılan çalışmada ER stres inhibisyonunun steatoz ve steatoz olmayan karaciğerleri koruduğu belirtilmiştir. Steatoz alkolizme bağlı karaciğer yağlanması olarak tanımlanmıştır. Ayrıca steatoz karaciğerlerin rejenerasyona yanıtta düzensizlik ve karaciğer hasarlarına karşı düşük tölerans gösterdikleri belirtilmiştir. 140 Bu çalışmada TUDCA ve 4 fenil butirik asitin (PBA) nın steatoz ve steatoz olmayan karaciğerler üzerine etkisi iskemi - reperfüzyon altında kısmi hepatektomi boyunca incelenmiştir. Ayrıca bu maddelerin ER stresine ve UPR yolağına etkileri de araştırılmıştır

85 PBA ve özellikle TUDCA nın her iki tip karaciğerde inflamasyonu apopitozu ve nekrozu azalttığı ve karaciğer rejenerasyonunu geliştirdiği saptanmıştır. Ayrıca TUDCA nın her iki tip karaciğeri ER hasarına karşı koruduğu ve UPR sinyal yolağınının aktivitesini 3 te 2 azalttığı saptanmıştır. 141 Bizde kümülüs hücre kültürü yaptıktan sonra kümülüs hücrelerini UPR yolağı inhibitörü TUDCA ve ER stresi uyaranı tunikamisin ile birlikte 48 saat muamele ettik.hücre canlılığını saptamak amacıyla MTT analizi yaptık. MTT proliferasyon analizi bulgularımıza göre tunikamisinle indüklenen ER stresiyle UPR nin aktifleşmesi sonucunda kümülüs hücre proliferasyonu baskılanmaktadır. Kümülüs hücrelerine TUDCA ve tunikamisin birlikte uygulayarak ER stresini baskıladığımızda ise hücre proliferasyonunda tunikamisin uygulanan gruba kıyasla bir miktar artış gözledik. Bu bulgularda bize İleriki çalışmalarda TUDCA nın daha uzun süreli veya daha yüksek dozda kullanımının tedavi şansını ve hücre proliferasyonunu arttırabileceğini gösterdi. Kümülüs hücrelerinde ER stresinin indüklediği apopitozu belirlemek amacıyla kümülüs hücrelerini hücre kültürüyle çoğalttıktan sonra ER stresini indükleyen kimyasal bir şaperon olan tunikamisin ile 48 saat muamele ettik. Tunikamisin uygulamasının kümülüs hücrelerinde kontrol grubuna kıyasla apopitozu anlamlı derecede arttırdığını saptadık. Bu bulguda bize MTT analizinde belirlediğimiz ER stresinin baskıladığı hücre proliferasyonunun büyük olasılıkla azalan proliferasyonla değil artan apopitozdan kaynaklandığını göstermektedir. 75

86 Bizim düşüncemiz hiporesponsif hastaların folikülogenez ve oosit gelişimindeki temel etki mekanizmasının kümülüs hücrelerinde artan apopitoza bağlı olarak, kümülüs-oosit etkileşiminin bozulmasından kaynaklanabileceğidir. Bizim TUNEL ve MTT analiz sonuçlarımız bu düşüncemizi desteklemektedir. Çalışmamızda IVF tedavisi sürecinde folikül stimülasyonuna farklı yanıt veren hastaların klinik tabloları ve oosit sayıları bakımından farklılık göstermeleri hasta gruplarını bilimsel olarak doğru seçtiğimizi göstermektedir. 76

87 6. SONUÇ Bu çalışmayla litaretürde ilk kez insan ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde ER aracılı sinyal yolağı ve molekülleri GRP78, XBP1 ve sxbp1 bulunduğunu gösterdik. Kümülüs hücrelerinin ER stres ilişkili sinyal yolağına maruz kaldıklarında hücre proliferasyonunda azalmaya ve/veya apopitozda artışa gidebileceğini gösterdik. IVF tedavisine maruz kalan hastalardan hiporesponsif (hiperstimüle) grup oluşturan hastaların ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde artmış, ER stresinin olduğunu ve bu stresin mrna düzeyinde sxbp1 ile gösterdik. Son olarakta bu çalışmanın tüm sonuçları sağlıklı bir folikülogenezis ve kaliteli bir oosit elde edebilmek için ER stres ve UPR sinyal yolağının fizyolojik sınırlar içerisinde tutulması gerektiğini ve ayrıca hiporesponsif hasta gruplarında patolojik ER stres seviyesini azaltacak ajanların kullanılmasıyla yeni bir tedavi yaklaşımı öngörülebilineceğini önermekteyiz. 77

88 7. ÖZET Oositlerde sitoplazmik olgunlaşma ve oosit aktivasyonu ile oosit çekirdeğinin olgunlaşması arasında doğrudan bir ilişki vardır. Kümülüs hücrelerinin bu süreçteki rolü ise oositte protein sentezini uyararak oosit olgunlaşması sürecine katkıda bulunmaktır. Ancak olgun (metafaz II ) bir oositin fertilizasyon kapasitesi olduğu düşünüldüğünde kümülüs hücrelerinin oosit üzerindeki olgunlaştırıcı ve aktifleştirici rolü çok daha iyi açığa çıkmaktadır. Endoplazmik retikulum, hücrenin hayatta kalmasında ve işlevlerini yerine getirmesi için gerekli role sahip bir organeldir. ER hücre içi kalsiyum dengesini ayarlamakta, protein sentezi ve homeostaziyi düzenlemekte ve lipit biyosentezini sağlamaktadır. Hücredeki protein sentezi ve transportundaki rolünden dolayı, 78 kda GRP78, GRP94 ve kalretikülin gibi kalsiyum bağımlı moleküler şaperonlardan zengindir. Bu şaperonlar protein katlanmasını sağlayan aracı molekülleri stabilize eder. Birçok faktör katlanamayan proteinlerin ER lümeninde birikmesine neden olur. Bu katlanamayan proteinlerin ER lümeninde birikmesi evrimsel olarak oldukça iyi korunmuş olan katlanmayan proteinlere yanıt yolağını UPR (Unfolding Protein Response) tetikler. Hücrede ER stresiyle tetiklenen UPR nin etkileri 3 grupta toplanır: Adaptasyon, Uyarı, Apopitoz. Hipoksi ve oksidatif ajanların neden olduğu hücresel redoks yolunun bozulması ER lümenindeki disülfit bağlarının ortadan kalkmasına ve proteinlerin katlanamamasına ya da yanlış katlanmasına neden olur. 78

89 İn vitro fertilizasyon tekniklerinden yararlanmak üzere başvuran hasta populasyonlarında folikül stimülasyonlarına bağlı olarak yanıt veren 3 farklı hasta grubu gözlenmektedir. Bunlar arasında normal stimülasyon gösterenler birinci grubu, hipostimülasyon gösterenler ikinci grubu, hiperstimülasyon gösterenler üçüncü grubu oluşturmaktadır. 35 yas altı IVF hastalarında folikül sitimülasyonuna yanıt toplanan oosit sayısının 10 ile 20 arasında olması normostimülason olarak kabul edilmektedir. Buna karşılık aynı doz uyarıya 30 ve üzerinde oosit toplanması hiperstimülasyon sendromu olarak kabul edilirken bu grup hastalara polikistik over sendromuda girmektedir. 6 ve daha az oosit toplanması ise hipostimülasyon olarak kabul edilmektedir. Her üç grupta gerek folikül gelişimi açısından gerekse toplanan olgun oosit (MII) sayısı veya olgun olmayan (PI (GV) veya MI) oosit sayısı açısından anlamlı farklılıklar göstermektedir. Bu çalışmada ovulasyon indüksiyonuna farklı yanıt veren hastalarda ortaya çıkabilecek ER stresine bağlı UPR nin düzenlenmesi incelenmiştir. (ing var) UPR yolağının başlıca regülatör proteini olan GRP78 in protein seviyesi Western Blot yöntemiyle analiz edilmiştir. GRP78 protein seviyeleri gruplar arasında anlamlı bir değişim gözlenmedi. Diğer taraftan, hiporisponsif hastaların kümülüs hücrelerinde diğer guruplara kıyasla 2 kat daha yüksek GRP78 protein seviyesi saptadık. ER stresini mrna düzeyinde incelemek için XBP1 ve sxbp1 mrna seviyeleri RT PCR yöntemiyle incelenmiştir. Bizim çalışmamızda tüm form XBP1 mrna nın içinde XBP1s mrna nın 79

90 miktarı, diğer gruplarla kıyaslandığında, sadece hiporisponsif hastalarda artış göstermiştir. Bu sonuç GRP78 için bulduğumuz sonuçla benzerlik göstermektedir. Ve bizim hiporisponsif hastalarda saptadığımız artmış ER stresinin veya bozulmuş protein katlanma mekanizmasının bu hastalarda folikülogenez ve oosit olgunlaşmasını önemli derecede etkileyeceği hipotezimizi desteklemektedir. Kümülüs hücreleri hücre kültürüyle çoğaltılıp UPR yolağı inhibitörü olan TUDCA ve ER stresi uyaranı tunikamisin ile muamele edilip proliferasyon ve apopitoz indeksleri MTT ve TUNEL yöntemleriyle belirlendi. Kümülüs hücre kültürü yaptıktan sonra kümülüs hücrelerini UPR yolağı inhibitörü TUDCA ve ER stresi uyaranı tunikamisin ile birlikte 48 saat muamele ettik.hücre canlılığını saptamak amacıyla MTT analizi yapıldı. MTT proliferasyon analizi bulgularımıza göre tunikamisinle indüklenen ER stresiyle UPR nin aktifleşmesi sonucunda kümülüs hücre proliferasyonu baskılanmaktadır. Kümülüs hücrelerine TUDCA ve tunikamisin birlikte uygulayarak ER stresini baskıladığımızda ise hücre proliferasyonunda tunikamisin uygulanan gruba kıyasla bir miktar artış gözledik. MTT analizi sonucunda tunikamisin ile ER stresi uyarılan kümülüs hücrelerinde anlamlı düzeyde azalan hücre proliferasyonuna proliferasyondaki azalma mı yoksa artan apopitozla mı ilişkili olup olmadığını belirlemek amacıyla kümülüs hücrelerinde ER stresini tunikamisin ile indükleyerek apopitoz indeksleri saptanarak kontrol grubu ile kıyaslandı. 80

91 TUNEL yöntemi sonucunda tunikamisin uygulamasının kümülüs hücrelerinde kontrol grubuna kıyasla apopitozu anlamlı derecede arttırdığı gözlendi. Bu bulguda bize MTT analizinde belirlediğimiz ER stresinin baskıladığı hücre proliferasyonunun büyük olasılıkla azalan proliferasyonla değil artan apopitozdan kaynaklandığını göstermektedir. IVF tedavisine verdikleri yanıta ve klinik bulgularına dayanarak, oosit sayısına bağlı olarak hastalar normostimülasyon, polikistik over sendromu, hiperstimüle ve hipostimüle olarak 4 farklı grupta incelendiler.hasta grupları yaşlarına göre istatistiksel olarak analiz edildiğinde guruplar arasında anlamlı bir fark bulunamadı. Hasta grupları toplanan ortalama oosit sayısı açısından değerlendirildiğinde PKOS ve hiperstimüle hasta grupları, normal ve hipostimüle hasta gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha fazla oosite sahipti. Ayrıca normal hasta grupları hipostimüle, hasta gruplarına göre anlamlı olarak daha fazla oosit sayısına sahipti. Bu çalışmayla litaretürde ilk kez insan ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde ER aracalı sinyal yolağı ve molekülleri GRP78, XBP1 ve sxbp1 bulunduğunu gösterdik. Kümülüs hücrelerinin ER stres ilişkili sinyal yolağına maruz kaldıklarında hücre proliferasyonunda azalmaya ve/veya apopitozda artışa gidebileceğini gösterdik.ivf tedavisine maruz kalan hastalardan hiporisponsif ( hiperstimüle) grup oluşturan hastaların ovaryum folikülü kümülüs hücrelerinde artmış ER stresinin olduğunu ve bu stresin mrna düzeyinde sxbp1 ile gösterdik. Son olarakta bu çalışmanın tüm sonuçları sağlıklı bir folikülogenez ve kaliteli bir oosit elde edebilmek için ER stres ve UPR sinyal yolağının 81

92 fizyolojik sınırlar içerisinde tutulması gerektiğini ve ayrıca hiporisponsif hasta gruplarında patolojik Er stres seviyesini azaltacak ajanların kullanılmasıyla yeni bir tedavi yaklaşımı öngörülebilineceğini önermekteyiz. 82

93 8. SUMMARY There is a direct relationship between the maturation of the nucleus and cytoplasmic maturation and biological activation in oocytes. Cumulus cells contribute to this process by stimulating protein synthesis in oocytes and, therefore, the maturation of oocytes. Moreover, when we consider the fact that only a mature oocyte (in MII [metaphase II]) has the capability of fertilization, it is clear to see responsibility cumulus cells have for the maturation and activation of oocytes. In addition, the fact that oocytes found in PI (prophase I) and MI (metaphase I), which are not mature enough, do not have the capability of fertilization shows another aspect of the importance of cumulus cells. Endoplasmic reticulum is an essential organelle in maintaining cells vital function. ER regulates intracellular calcium concentration, protein synthesis and homeostasis and it also enables the biosynthesis of lipids.ca dependent molecules like 78kDA GRP78 (known as HSPA5), GRP94 ( known as HSP90B1) and calreticulin are chaperon rich molecules due to their role in protein synthesis and its intracellular transport. These chaperons stabilize intermediary proteins which enable protein folding. Several factors may be the basis for the aggregation of unfolding proteins in ER lumen. This aggregation of unfolding proteins in ER lumen induces a reaction called Unfolding Protein Response (UPR), an ER dependent cellular reaction which is evolutionally quite well conserved. The effects of UPR induced by ER stress are categorized into 3 major groups; adaptation, stimulation and apoptosis. Hypoxia and 83

94 damage to the redox pathway caused by oxidative agents bring about termination of the disulfide bonds within ER lumen and the unfolding or misfolding of the proteins. Of the patients applying for IVF techniques, 3 subtypes of patient groups are distinguished according to their response to follicle stimulations; the first group being composed of those demonstrating normal stimulation, the second group composed of patients demonstrating hypostimulation, and the third group demonstrating hyperstimulation. Normostimulation is considered as retrieval of oocytes in IVF patients aged less than 35 years as a response to follicle stimulation. In contrast, retrieval of 30 or more oocytes as a response to the same stimulus is considered to be ovarian hyperstimulation syndrome, which includes polycystic ovary syndrome. Retrieval of 6 or less oocytes is considered to be hypostimulation. There are significant differences among these 3 groups in terms of both follicle development and the number of mature oocytes (MII) or immature (PI [GV] or M I) oocytes retrieved. In this study we examined the regulation of UPR due to ER stress which may occur in patients responding differently to the induction of ovulation. The protein level of GRP78, which is the main regulator protein of UPR pathway, is analysed by the Western Blot method. No significant change is observed between the GRP78 protein levels groups. On the other hand, we have determined that GRP78 protein levels in the cumulus cells of the hyporesponsive patients are two times higher than the other groups. 84

95 In order to evaluate the ER stress at mrna level; XBP1 and sxbp1 mrna levels are examined by the RT PCR method. In our study, when the quantity of XBP1s mrna in the whole form XBP1 mrna is compared to the other groups, it has only shown an increase in the hyporesponsive patients. This result is similar to the result which we have found for GRP78. Also the increased ER stress or the impaired protein doubling mechanism which we have determined in the hyporesponsive patients, support our hypothesis about folliculogenesis and oocyte ripening in these patients in a significant way. Cumulus cells are reproduced with the cell culture and the tunicamycine which is the TUDCA and ER stress stimulus of the UPR pathway inhibitor is processed with tunicamicyne and proliferation and apoptosis indexes are determined with MTT ad TUNEL methods. After the cumulus has performed the cell culture, we have processed the cumulus cells for 48 hours with tunicamicyne which is the TUDCA and ER stress stimulus of the UPR pathway inhibitor. MTT analysis is performed in order to determine the cell activity. According to our findings of MTT proliferation analysis; cumulus cell proliferation is pressurized as a result of the activation of UPR by ER stress which is induced with tunicamycine. When we have pressurized ER stress by applying TUDCA and tunicamycine on the cumulus cells together; we have observed a little increase in the cell proliferation when compared to the tunicamycine treated group. 85

96 As a result of the MTT analysis, the ER stress in the cumulus cells are induced with tunicamycine and their apoptosis indexes are determined and then they are compared to the control group in order to determine whether the significantly decreased cell proliferation in the cumulus cells stimulated with ER stress and tunicamycine is related to the decrease in proliferation or the increased apoptosis. As a result of the TUNEL method; it is observed that apoptosis in the cumulus cells is increased by the tunicamycine when compared to the control group. This finding shows us that the cell proliferation pressurized by the ER stress in MTT analysis has probably risen from the increased apoptosis, not by the decreased proliferation. Based on the response to the IVF treatment and the clinical findings, the patients are inspected in 4 different groups related to the oocyte quantity as normostimulation, polycystic over syndrome, hyperstimuli and hypostimuli. When the patient groups are analysed statistically according to the ages, no significant difference is observed between the groups. When the patient groups are evaluated according to the collected average oocyte quantities, PKOS and hyperstimuli patient groups have statistically significant more oocyte quantity than the normal and hypostimuli patient groups. Also the normal patient groups have significantly more oocyte quantity than the hypostimuli patient groups. 86

97 In this study, we have shown in the literature for the first time that ER signal pathway and its molecules GRP78, XBP1 and sxbp1 are present in the cumulus cells of the human ovarian follicle. We have shown that when the cumulus cells are exposed to the signal pathway related to the ER stress; a decrease in the cell proliferation and/or increase in apoptosis can occur. We have demonstrated that an increased ER stress in the cumulus cells of the ovarian follicle of the patients forming the hyporesponsive (hyperstimuli) group from the patients subject to IVF treatment is present and we have shown this stress by sxbp1 at the mrna level. Finally we recommend that a new treatment approach can be foreseen by keeping the ER stress and UPR signal pathway in the physiological limits in order to obtain a health folliculogenesis and a qualified oocyte and also by using the agents which will decrease the pathological ER stress levels in the hyporesponsive patient groups. 87

98 9. KAYNAKLAR 1. Beck WW, editors. The menstruel cycle. Obstetrics & Gynaccology. New York: John Wiley Sons; 1989: Lorenzs PL. Influence of growth factors on the time-dependent meiotic progression of the bovine oocytes during their in-vitro maturation. Rev Esp Fisiol 1995; 51: Mattioli M, et al. Cell to cell communication in the cumulus-oocyte complex and cytoplasmic maturation in pig oocytes. Bull Assoc Anat. (Nancy): 1991; 75 (228): Hampl A, et al. Analysis of the mechanisms of metaphase I arrest in maturing mouse oocytes Development 1995; 121 (4): Lopata A. The fertilizability of human oocytes at different stages of meiotic maturation. USA: Ann NYAcad Sc 1988; 541: Anelli T, Sitia R. Protein quality control in the early secretory pathway. EMBo J 2008; 27, Ma Y, Hendershot LM. ER chaperone functions during normal and stress conditions. J Chem Neuroanat 2004; 28, Ron D, Walter P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Rev Mol Cell Biol 2007; 8: Malhotra JD, Kaufman RJ. The endoplasmic reticulum and the unfolded protein response. Semin Cell Dev Biol 2007; 18: Sadler T W. Medikal Embriyoloji. Başaklar C (Çev), 9. baskıdan çeviri. Ankara: Palme Yayıncılık;

99 11. Moore KL, Persaud TVN. İnsan Embriyolojisi (Çev.) 6.Baskı. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri 2002; Moore KL, Persaud TVN. Klinik Yönleri ile İnsan Embriyolojisi. Yıldırım M, Okar I, Dalçık H (Çev). 6. baskıdan çeviri. Ankara: Nobel Tıp Kitabevleri; Arıncı K, Elhan A. Anatomi 1. Cilt. Ankara: Güneş Kitap Evi; Erkoçak A: Özel Histoloji. Ankara: A.Ü. Tıp Fak Basım Evi; Speroff L, Glars RH, Kase NG, Ortaç F, Aytaç R. Menstruel Siklusun Regülasyonu. Erk A. (Çev.) Klinik Jinekolojik Endokrinoloji ve İnfertilite. 5. baskı. İstanbul. Nobel Tıp Kitapevi; 1996: McGee EA, Hsueh AJ. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles. Endocr Rev 2000; 21(2): Hardy K, Wright CS, Franks S, Winston RML. In vitro maturation of oocytes. Br Med Bull 2000; 56(3): Ross MH, Reith EJ, Romrell LJ. Female Reproductive System Histology: A text and Atlas. 2. edition. USA: Williams&Wilkins; 1989: Niswender GD, Juengel JL, Silva PJ, Rollyson MK, McIntush EW. Mechanisms Controlling the Function and Life Span of the Corpus Luteum. Physiol Rev 2000; 80: Guyton AC, Hall J E. Tıbbi Fizyoloji. Çavuşoğlu H (Çev). 10. baskı. İstanbul: Nobel Tıp Kitap Evleri; Tekelioğlu M. Özel Histoloji İnce Yapı ve Gelişme. Ankara: Antıp AŞ yayınları;

100 23. Andolf E, et al. Ultrasound measurement of the ovarian volume. Acta Obstet Gynecol Scand 1987; 66(5): Ross MH. Histology: A Text and Atlas. 4th ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins; 2003: Sadler TW. Langman s Medical Embryology. 7th ed. Baltimore: Williams & Wilkins, Gartner LP, Hiatt LJ. Color Text Book of Histology. 2. Edition. London: WB Saunders Co; 2001: Ross MH. Histology a Text and Atlas of Histology. 4 th ed. Philedelphia: Williams and Wilkins; 2003: Kierszenbaum AL. Histoloji ve Hücre Biyolojisi (Türkçe çeviri). Ankara: Palme Yayıncılık; 2006: Gürsoy E, Ergin K. Dişi Üreme Sistemi Atlası. Nobel Tıp Kitabevleri Arıncı K, Elhan A. Anatomi. 4. Baskı. İstanbul: Güneş Kitabevi; 2006: Bükülmez O, Arici A. Over fizyolojisi. Kişnişçi HA. Temel Kadın Hastalıkları ve Doğum Bilgisi. Ankara: Güneş Kitabevi; 1996: Fair T. Follicular oocyte growth and acquisition of developmental competence. Anim Reprod Sci 2003; 78(3-4): Larsen WJ. Human Embryology. 3rd ed. Philadelphia, Pennsylvania: Churchill Livingstone; 2001: Himelstein-Braw R, et al. Follicular atresia in the infant human ovary. J Reprod Fertil 1976; 46(1):

101 35. Junqueira LC, Carneiro J. Temel Histoloji. (Türkçe Çeviri) 10. baskı. Nobel Tıp Kitap Evleri; McGee EA, Hsueh AJ. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles. Endocr Rev 2000; 21(2): Syrop CH, et al. Ovarian volume may predict assisted reproductive outcomes better than follicle stimulating hormone concentration on day 3. Hum Reprod (7): Demir R, editör. Histoloji ve Hücre Biyolojisi. Ankara: Palme Yayıncılık; 2006: Korzekwa A, Okuda K, Woclawek-Potocka I, Murakami S, Skarzynski DJ. Nitric Oxide Induces Apoptosis in Bovine Luteal Cells. J Reprod Develop 2006; 52: Eppig JJ. London: Nature;1979; 281: Eppig JJ. J Exp Zool. 1979; 208, Armstrong DT, Hang Z, Vanderhyden BC, Khamsi F. Ovarian Function, Regulation, and Pathophysiology Part V 43. Hyttel P, Westergaard L, Byskov AG. Ultrastructure of human cumulus oocyte complexes from healthy and atretic follicles. 1986; Human Reproduction 33 : Motta PM, Nottolax SA, Pereda J, Croxatto HB, Familiari G. Ultrastructure of human cumulus oophorus:a transmission electron microscopic study on oviductaloocytes and fertilized eggs. Human Reproduction 1995; 10 (9) :

102 45. Motta PM, et al. 45 of human cumulus ooforus: A transmission elektron microscopic study on oviductal oocytes and fertilized eggs. Hum Reprod 1995; 10 (9): Matos L, Stevenson D, Gomes F, Silva-Carvalho JL, Almeida H. Superoxide dismutase expression in human cumulus oophorus cells. Molecular Human Reproduction 2009; 15 (7) : , Hunter RHF, Cook B, Baker TG. London: Nature;1976; 260, Zuelke KA et al. Increased glutamine metabolism in boxine cumuluse ceell-enclosed and denuded oocytes after in vitro maturation with luteinizing hormone. Biol Reprod 1993; 48 (4): Armstrong DT. Hormonal actions during oocyte maturation influence fertilization and early embryonic development. NewYork Academy of Sciences; Hampl A, et al. Analysis of the mechanisms of metaphase I arrest in maturing mouse oocytes Development 1995; 121 (4): Demir R. İnsanın gelişimi ve implantasyon biyolojisi. Palme Yayıncılık, 1995: Daya S. Follicle stimülating hormone versus HMG for IVF. Results of meta-analysis. Horn Res 1995, 43: Rojas FJ, Geisthovel R. Local insülin-like growth factors in the ovary. Asch R, Studd J, eds. Progress Reproductive Medicine. New York: Parthenon Publ; 1995: Şahmay S. Folliküler Maturasyon. Organon Yayınları, 1996:

103 56. Tesarik J, et al. Human nonovulatory oocyte-cumulus complexes: Ultrastructure, macromolecular synthesis and developmental potential. Gamete Research 1984, 9: Şahmay S. İnfertilitede ovulatuvar faktör. Reprodüktif Endokrinoloji ve İnfertilite. İstanbul: Meta Basım, 1995: Orrenius S, Zhivotovsky B, Nicotera P. Regulation of cell death: the calcium-apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol 2003; 4: Schroder M, Kaufman RJ. ER stress and the unfolded protein response. Mutat Res 2005; 569: Kaufman RJ. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest 2002;110: Wu J, Kaufman RJ. From acute ER stress to physiological roles of the unfolded protein response. Cell Death Differ 2006;13: Molinari M. N-glycan structure dictates extension of protein folding or onset of disposal. Nat Chem Biol 2007;3: Kincaid MM, Cooper AA. ERADicate ER stress or die trying. Antioxidants & Redox Signaling 2007; 9: Xu C, Baily-Maitre B, Reed JC. Endoplasmic reticulum stress: cell life and death decisions. J Clin Invest 2005; 115: Zhang K, Kaufman RJ. Signaling the unfolded protein response from the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 2004; 279: Sidrauski C, Walter P. The transmembrane kinase Ire1p is a sitespecific endonuclease that initiates mrna splicing in the unfolded protein response. Cell 1997;90:

104 67. Yoshida H, Matsui T, Yamamoto A, Okada T, Mori K. XBP1 mrna is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell 2001;107: Schroder M, Kaufman RJ. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem 2005; 74, Bernales S, Papa FR, Walter P. Intracellular signaling by the unfolded protein response. Annu Rev Cell Dev Biol 2006; 22: Cox JS, Shamu CE, Walter P. Transcriptional induction of genes encoding endoplasmic reticulum resident proteins requires a transmembrane protein kinase. Cell 1993; 73: Mori K, Ma W, Gething MJ, Sambrook JA. Transmembrane protein with a cdc2+/cdc28-related kinase activity is required for signaling from the ER to the nucleus. Cell 1993; 74: Shamu CE, Walter P. Oligomerization and phosphorylation of the Ire1p kinase during intracellular signaling from the endoplasmic reticulum to the nucleus. EMBO J 1996; 15: Papa FR, Zhang C, Shokat K, Walter P. Bypassing a kinase activity with an ATP-competitive drug. Science 2003; 302: Yoshida H, Matsui T, Yamamoto A, Okada T, Mori K. XBP1 mrna is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell 2001; 107: Calfon M, et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mrna. Nature 2002; 415, Sidrauski C, Cox JS, Walter P. trna ligase is required for regulated mrna splicing in the unfolded protein response. Cell 1996; 87:

105 77. Lee AH, Chu GC, Iwakoshi NN, Glimcher LH. XBP-1 is required for biogenesis of cellular secretory machinery of exocrine glands. Embo J 2005; 24: Cox JS, Walter P. A novel mechanism for regulating activity of a transcription factor that controls the unfolded protein response. Cell 1996; 87: Kaufman RJ. Regulation of mrna translation by protein folding in the endoplasmic reticulum. Trends Biochem Sci 2004; 29: Harding HP, Zhang Y, Bertolotti A, Zeng H, Ron D. Perk is essential for translational regulation and cell survival during the unfolded protein response. Mol Cell 2000; 5: Harding HP, Novoa I, Zhang Y, Zeng H, Wek R, Schapira M, et al. Regulated translation initiation controls stress-induced gene expression in mammalian cells. Mol Cell 2000; 6: Scheuner D, Song B, McEwen E, Liu C, Laybutt R, Gillespie P, et al. Translational control is required for the unfolded protein response and in vivo glucose homeostasis. Mol Cell 2001;7: Harding HP, Zhang Y, Ron D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature 1999; 397: Ron D. Translational control in the endoplasmic reticulum stress response. J Clin Invest 2002; 110: Bertolotti A, Zhang Y, Hendershot LM, Harding HP, Ron D. Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfoldedprotein response. Nat Cell Biol 2000; 2:

106 86. Bertolotti A, Zhang Y, Hendershot LM, Harding HP, Ron D. Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfoldedprotein response. Nat Cell Biol 2000; 2: Liu CY, Xu Z, Kaufman RJ. Structure and intermolecular interactions of the luminal dimerization domain of human IRE1alpha. J Biol Chem 2003; 278: Inokuchi Y, Nakajima Y, et al. Effect of an inducer of BiP, a molecular chaperone, on endoplasmic reticulum (ER) stress-induced retinal cell death. Investigative ophthalmology & visual science 2009; 50(1): Malhotra JD and Kaufman RJ. The endoplasmic reticulum and the unfolded protein response." Seminars in cell & developmental biology 2007; 18(6): Kimura K. Bugg TD. Recent advances in antimicrobial nucleoside antibiotics targeting cell wall biosynthesis. Natural product reports 2003; 20(2): Duksin D, Seiberg M, Mahoney WC. Inhibition of protein glycosylation and selective cytotoxicity toward virally transformed fibroblasts caused by B3-tunicamycin. European journal of biochemistry / FEBS 1982;129: Mahoney WC, Duksin D. Separation of tunicamycin homologues by reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of chromatography 1980; 198:

107 93. Yoshimi M, Sekiguchi T, Hara N, Nishimoto T. Inhibition of N-linked glycosylation causes apoptosis in hamster BHK21 cells. Biochemical and biophysical research communications 94. Boatright JH, Nickerson JM, Moring AG, Pardue MT. Bile acids in treatment of ocular disease. J Ocul Biol Dis Infor 2009; 2(3): Duan WJ, Zhang FK, Ou XJ, Zhang T, Wang XM, Wang Y, Cui Y, Zhao XY, Jia JD. The clinical profiles of primary biliary cirrhosis with a suboptimal biochemical response to ursodeoxycholic acid. 2011;19(2): Rivard AL, Steer CJ, Kren BT, Rodrigues CMP, Castro RE, Bianco RW, Walter C. Administration of Tauroursodeoxycholic Acid (TUDCA) Reduces Apoptosis Following Myocardial Infraction in Rat. The American Journal of Chinese Medicine. 35(2): Taub K. TUDCA: Tauroursodeoxycholic Acid Kricka LJ. Nucleic acid detection technologies-labels, strategies and formats. Clin Chem 1999; 45: Hodinka RL. The clinical utulity of viral quantitation using molecular methods. Clin Diagn Virol 1998;10: Stoler DL, Michael NL. Nucleic acid blotting techniques for virus detection. Wiedbrauk DL, farkas DH (ed.). Molecular Methods for Virus Detection. Academic Press San Diego; 1995: Burnette WN. Western Blotting. Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulphate-polyacrylamid gels to unmodified nitrocellulose and radioiodionated protein A. Analaytical Bioch 1981; 112:

108 102. Harlow E, Lane D. Antibodies. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; 1988: Harlow E, Lane D. Antibodies. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1988: Kipreos ET, Wang JYJ. Cell cycle-regulated binding of c-abi tyrosine kinase to DNA. Science 1992; Arı Ş. DNA nın Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile Çoğaltılması. İçinde. Temizkan G, Arda N, editörler. Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler. 2.baskı. İstanbul : Nobel Tıp Kitapevleri : 2004; Hayden RT. İn Vitro Nükleik Asit Amplifikasyon Teknikleri. Persing DH, White TJ, editors. Molekuler Mikrobiyoloji Tanı Prensipleri ve Uygulamaları. 1. baskı Ankara: Palme Yayınevi; McGee JOD, Isaacson PO, Bright NA. Oxford textbook of pathology. Oxford University Press 1992; Akyar GH. Kronik Myeloid Lösemi Ve Akut Lenfoblastik Ön Tanılı Olgularda Konvensiyonel Sitogenetik Ve Floresan İn- Situ Hibridizasyon Yöntemi İle Analizler; 1999: 7, 11, Özkul Y. Kronik Myelositler Lösemide ( KML) BCR ABL Ve ABL- BCR Hibrit Genlerinin RT- PZR Ve Southern Blot Yöntemi İle Gösterilmesi. Gazi Üniversitesi Kütüphanesi 1994; Mosmann T. Rapid calorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods 1983; 65: Alley MC, Scudiero DA, Monks A, Hursey ML, Czerwinski MJ, Fine DL, Abbott BJ, Mayo JG, Shoemaker RH, Boyd MR. Feasibility of drug 98

109 screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res 1988; 48: Abe K, Matsuki N. Measurement of cellular 3-(4,5- dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenytetrazolium bromide (MTT) reduction activity and lactate dehydrogenase release using MTT. Neurosci Res 2000; 38: Bertolotti A, Zhang Y, Hendershot LM, Harding HP, Ron D. Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfoldedprotein response. Nat Cell Biol 2000;2: Shen J, Chen X, Hendershot L, Prywes R. ER stress regulation of ATF6 localization by dissociation of BiP/GRP78 binding and unmasking of Golgi localization signals. Dev Cell 2002;3: Rutkowski DT, Kaufman RJ. A trip to the ER: coping with stress. Trends Cell Biol 2004; 14: Ni M, Lee AS. ER chaperones in mammalian development and human diseases. FEBS Lett 2007; 581: Hendershot LM. The ER function BiP is a master regulator of ER function. Mt Sinai J Med 2004; 71: Imai Y, Soda M, Inoue H, Hattori N, Mizuno Y, and Takahashi R. An unfolded putative transmembrane polypeptide, which can lead to endoplasmic reticulum stress, is a substrate of Parkin Cell 2001; 105: Li J, Lee AS. Stress induction of GRP78=BiP and its role in cancer. Curr Mol Med 2006; 6: Zhang K, Kaufman RJ. The unfolded protein response: a stress signaling pathway critical for health and disease. Neurology 2006;66:

110 121. Harding HP, Zhang Y, Bertolotti A, Zeng H, Ron D. Perk is essential for translational regulation and cell survival during the unfolded protein response. Molecular Cell 2000; 5 (5): Yoshida H, Haze K, Yanagi H, Yura T, Mori K. Identification of the cis-acting endoplasmic reticulum stress response element responsible for transcriptional induction of mammalian glucose-regulated proteins. Involvement of basic leucine zipper transcription factors. Journal of Biological Chemistry 1998; 273 (50): Okada T, Yoshida H, Akazawa R, Negishi M, Mori K. Distinct roles of activating transcription factor 6 (ATF6) and double-stranded RNAactivated protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) in transcription during the mammalian unfolded protein response. Biochemical Journal 2002; 366(2): Yoshida H, Matsui T, Hosokawa N, Kaufman RJ, Nagata K, Mori K. A time-dependent phase shift in the mammalian unfolded protein response. Developmental Cell 2003; 4(2): Lee K, Tirasophon W, Shen X, et al. IRE1-mediated unconventional mrna splicing and S2Pmediated ATF6 cleavage merge to regulate XBP1 in signaling the unfolded protein response. Genes & Development 2002; 16(4): Morris JD, Harris RE, Hashmi R, Sambrano JE, Gruppo RA,Becker AT, Morris CL. Antithrombin-III for the treatment ofchemotherapy-induced organ dysfunction following bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 1997; 20: Fang Chai, Rongjiang Luo, Yiqing Li, Yujing Bai, Yuan He, Yantao Wei, Zhichao Yan, Jian Ge,Yehong Zhuo. Down-regulation of GRP78 in 100

111 human glaucomatous trabecular meshwork cells. Molecular Vision 2010; 16: Julian A. Schardt, Daniel Weber, Marianne Eyholzer, et al. Activation of the Unfolded Protein Response Is Associated with Favorable Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. Clin Cancer Res 2009;15: Jing WU, Qi WANG, Jiarui WANG, Lichuan ZHANG, Long ZHAO The Role of GRP78 on the Resistance to Cisplatin in SPCA-1 Cell Line 130. Naidoo N, Giang W, Galante RJ, Pack AI. Sleep deprivation induces the unfolded protein response in mouse cerebral cortex. J Neurochem 2005; 92(5): Shaw PJ, Cirelli C, Greenspan RJ, Tononi G. Correlates of Sleep and Waking in Drosophila melanogaster. Science 2000; 287: Cirelli C, Gutierrez CM, Tononi G. Extensive and Divergent Effects of Sleep and Wakefulness on Brain Gene Expression. Neuron 2004; 41: Cirelli C. How sleep deprivation affects gene expression in the brain: a review of recent findings. Journal of Applied Physiology 2002; 92(1): Terao A, Steininger TL, Hyder K, et al. Differential increase in the expression of heat shock protein family members during sleep deprivation and during sleep. Neuroscience 2003; 116(1): Mackiewicz M, Shockley KR, Romer MA, et al. Macromolecule biosynthesis: a key function of sleep. Physiol Genomics 2007; 31(3):

112 136. Maret S, Dorsaz S, Gurcel L, et al. Homer1a is a core brain molecular correlate of sleep loss. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007; 104(50): Wu LL, Dunning KR,Yang X, Russell DL, Lane M, Norman RJ, Rebecca LR. High-Fat Diet Causes Lipotoxicity Responses in Cumulus Oocyte Complexes and Decreased. Fertilization Rates Endocrinology 2010; 151: Zhang JY, Lee KS, Kim JS, Song BS, Jin D, Koo DB, Yu K. Functional characterization of the ER stress induced X-box-binding protein-1 (Xbp-1) in the porcine system. BMC Molecular Biology 2011; 12: Iwawaki T, Akai R, Kohno K. IRE1a Disruption Causes Histological Abnormality of Exocrine Tissues, Increase of Blood Glucose Level, and Decrease of Serum Immunoglobulin Level. Plos one; 5(9): e Mulhern LM, Madson CJ, Kador PF, Randazzo J, Shinohara T. Cellular osmolytes reduce lens epithelial cell death and alleviate cataract formation in galactosemic rats. Molecular Vision 2007; 13: Mosbah BI, Alfany-Fernandez I, Martel C, Zaouali MA, Bintanel- Morcillo M, Rimola A, Rodes J, Brenner C, Rosello J, Peralta C. Endoplasmic reticulum stress inhibition protects steatotic and non-steatotic livers in partialhepatectomy under ischemia-reperfusion. Cell Death and Disease 2010; Takuma K, Yan SS, Stern DM, Yamada K. Mitochondrial dysfunction, endoplasmic reticulum stress, and apoptosis in Alzheimer s disease. J Pharmacol Sci. 2005; 97:

113 143. Bian ZM, Elner SG, Elner VM. Dual involvement of caspase-4 in inflammatory and ER stress-induced apoptotic responses in human retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2009; 50: Hitomi J, Katayama T, Eguchi Y, Kudo T, Taniguchi M, Koyama Y, et al. Involvement of caspase-4 in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis and Abeta-induced cell death. J Cell Biol. 2004; 165:

114 10. EKLER EK 1: ARAġTIRMA BAġVURUSU ONAYI 104