ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Burcu ÖZBEK BAZI SERT ÇEKİRDEKLİ MEYVE ANAÇLARININ IN VITRO ÇOĞALTIMI VE KÖK-UR NEMATODLARINA KARŞI DAYANIKLILIKLARININ ARAŞTIRILMASI BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI ADANA, 2011

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAZI SERT ÇEKİRDEKLİ MEYVE ANAÇLARININ IN VITRO ÇOĞALTIMI VE KÖK-UR NEMATODLARINA KARŞI DAYANIKLILIKLARININ ARAŞTIRILMASI Burcu ÖZBEK YÜKSEK LİSANS TEZİ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI Bu Tez 22/12/2011 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir Prof. Dr. Mukaddes KAYIM DANIŞMAN Prof. Dr. İ. Halil ELEKÇİOĞLU ÜYE Prof. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ ÜYE Bu Tez Enstitümüz Bitki Koruma Anabilim Dalında Hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2010YL94 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAZI SERT ÇEKİRDEKLİ MEYVE ANAÇLARININ IN VITRO ÇOĞALTIMI VE KÖK-UR NEMATODLARINA KARŞI DAYANIKLILIKLARININ ARAŞTIRILMASI Burcu ÖZBEK ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Mukaddes KAYIM Yıl: 2011, Sayfa: 63 Jüri : Prof. Dr. Mukaddes KAYIM : Prof. Dr. İ. Halil ELEKÇİOĞLU : Prof. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ Çalışmada, Garnem, GF-677, Cadaman ve Myrobalan 29 klonunun sürgün ucu ile in vitro klonal çoğaltılması ve bu bitkilerin kök-ur nematodlarına (M. incognita ve M. javanica) dayanıklılığının araştırılması hedeflenmiştir. Bu amaçla, GA 3 ün sabit 0.05 mg/l ve BAP nin farklı konsantrasyonlarını (0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l) içeren MS ve modifiye MS (MST) ortamları mikroçoğaltımda kullanılmıştır. IBA ve Fe- EDDHA kombinasyonlarını içeren MS ve MST ortamları sürgünlerin köklendirmesi amacıyla kullanılmıştır. En yüksek yan sürgün sayısı Garnem, GF-677 ve Cadaman anacı için 2.0 mg/l BAP içeren MST ortamından, Myrobalan 29 klonu için 1.0 mg/l BAP içeren MS ortamından elde edilmiştir. En iyi köklenme yüzdesi, 1.5 mg/l IBA içeren ortamda GF-677 için 100 mg/l, Garnem için 500 mg/l ve Cadaman anacı için 500 mg/l Fe-EDDHA ilavesiyle elde edilmiştir. In vitro koşullarda üretimi yapılan Garnem, Cadaman ve Myrobalan 29 klonu Meloidogyne incognita ırk 2 ve M. javanica nın 1000 adet 2. dönem larvası ile inokule edilmiştir. İnokulasyondan 3 ay sonra anaçların köklerinde kök-ur nematodlarının oluşturduğu gal oranı ve topraktaki nematod populasyonu saptanmıştır. M. incognita ve M. javanica ile inokule edilen anaçlarda, nematodların gelişmediği ve çoğalmadığı saptanmıştır, çoğalma oranı (R) 0 olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca köklerdeki gal oluşum oranı değerlendirildiğinde, Cadaman anacında gal indeksi 1 iken, diğer anaçlarda 0 olarak saptanmıştır. Anahtar Kelimeler: Dayanıklık, Meloidogyne spp., Mikroçoğaltım, PCR, Prunus anaçları I

4 ABSTRACT Ms.C. THESIS IN VITRO MICROPROPAGATION OF SOME PRUNUS ROOTSTOCKS AND EVALUATION OF RESISTANCE FOR ROOT-KNOT NEMATODES Burcu ÖZBEK ÇUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF PLANT PROTECTION Supervisor : Prof. Dr. Mukaddes KAYIM Year: 2011, Pages: 63 Jury : Prof. Dr. Mukaddes KAYIM : Prof. Dr. İ. Halil ELEKÇİOĞLU : Prof. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ In this study, it was targeted to micropropagate in vitro condition of peach, nectarin, GF-677 and Myrobalan 29 C rootstocks by means of shoot-tıp culture. Besides, In vitro grown Garnem, Cadaman, and Myrobalan 29C were tested for resistance to root-knot nematodes, M. incognita race 2 and M. javanica. MS and modified MS (MST) media containing of different concentrations of BAP (0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l) with a 0.05 mg/l concentration of GA 3 were used in vitro clonal propagation of rootstocks. MS and MST media suplemented with different concentration and combination of IBA and Fe-EDDHA were used for rooting of shoots. The highest number of adventitious shoots for Garnem, GF-677, and Cadaman were obtained on MST medium with 2.0 mg/l of BAP. The best shoot formation for Myrobalan 29 C was obtained on MS medium supplemented with 1.0 mg/l of BAP. The best root formation for GF-677, Garnem, and Cadaman was found on MST medium containing 1.5 mg/l of IBA and 100, 500, 500 mg/l of Fe-EDDHA respectively. Potted plants were inoculated with 1000 second stage of juveniles (J2) of M. incognita race 2 and M. javanica. Three months after inoculation, the ratio of galling in the roots and the number of nematod in the soil of infested rootstocks were recorded. Reproduction ratio of M. incognita race 2 and M. javanica was calculated as 0 on all tested rootstocks. When gall ration was evaluated, gall index of Cadaman was 1 and the gall index of the rest of rootstocks was 0. Key words: Micropropagation, Meloidogyne spp., PCR, Prunus Resistance rootstocks, II

5 TEŞEKKÜR 2009 yılında Tarım Bakanlığı nın yurt dışından anaç ithalini yasaklaması nedeni ile sert çekirdekli meyve anaçlarının doku kültürü ile üretilmesi gündeme gelmiştir. Her nekadar bu konuda sürgün çoğaltma çalışmaları yürütülmüşse de köklendirmede birtakım zorluklar ile karşılaşılmakta ve tüm bir bitki üretim sistemi kullanılan anaçların tamamında istenilen düzeyde olamamıştır. Dolayısıyla bu sorunların bir kısmını çözmek, kök-ur nematodlarına dayanıklılıklarını saptamak ve bu konuda çalışacak eleman ihtiyaçlarını karşılamak amacı ile danışman hocam sayın Prof. Dr. Mukaddes KAYIM ve Bölüm başkanımız sayın Prof. Dr. İ. Halil ELEKÇİOĞLU bana bu tez çalışma konusunu vermişlerdir. Değerli görüş ve katkılarıyla beni her zaman destekleyen her iki hocamada sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım esnasında yardımcı olan Arş. Gör. Ali ENDES e, Dr. Behçet Kemal ÇAĞLAR a, Zir. Yük. Müh. Gülten KAÇAR a, Yüksek lisans öğrencisi Pınar POLAT a ve tüm laboratuvar ekibine teşekkür ederim. Ayrıca Denememi yürütmemde yardımlarını esirgemeyen ve her zaman yanımda olan değerli arkadaşlarım, Zir. Yük. Müh. Hülya DEMİRBAŞ a ve Zir. Yük. Müh. Feray KARABÜYÜK e sonsuz teşekkür ederim. Eğitimimin her aşamasında her türlü desteği benden esirgemeyen biricik annem ve babama, yine her zaman bana destek olan ve büyük sabır gösteren ablama ve kardeşim Emrah ÖZBEK e sonsuz sabrı ve desteğiyle her zaman yanımda olan A. İnanç UZUN a teşekkür ederim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VI ŞEKİLLER DİZİNİ... VIII SİMGELER VE KISALTMALAR... XII 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR In Vitro Doku Kültürü ile İlgili Yapılan Çalışmalar Sert Çekirdekli Meyve Anaçlarında Kök-Ur Nematodlarına Dayanıklılıkla İlgili Yapılan Çalışmalar MATERYAL VE METOD Materyal Bitki Materyali Nematod Materyali Metod Myrobalan 29 Klonu, Garnem, GF-677 ve Cadaman Anaçlarının In Vitro Sürgün Ucu Kültürü Yöntemi İle Çoğaltılması Kültür Ortamları ve Hazırlanması Eksplantların Hazırlanması Sürgün uçlarının Kültüre Alınması Mikro Çoğaltma ve Köklendirme Kök-Ur Nematodlarının Yetiştirilmesi Nematodların Elde Edilmesi Baermann Huni Yöntemi Nematodların Köklerden Doğrudan Elde Edilmesi In Vitro Sürgün Ucu Kültürü Yöntemi ile Elde Edilen Anaçların Kök-ur Nematodlarına Karşı Dayanıklılığın Araştırılması IV

7 Moleküler Çalışmalar DNA İzolasyonu PCR Analizi Agaroz Jel Elektroforez BULGULAR VE TARTIŞMA In vitro Sürgün Ucu İle Yan Sürgünlerin Çoğaltılması In vitro Koşullarda Elde Edilen Sürgünlerin Köklendirilmesi Myrobalan 29 klonu, Garnem ve Cadaman Anaçların Meloidogyne incognita ırk 2 ve M. javanica ya Karşı Dayanıklılığının Araştırılması PCR Analizi SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ EKLER EK 1. TAE Tampon çözeltisi EK 1. Etidyum Bromid in hazırlanması V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Garnem, GF-677 ve Cadaman anaçlarının sürgün geliştirme, kardeşlenme ve köklendirme aşamasında kullanılan modifiye edilmiş MS (Murashige ve Skoog, 1962) kültür ortamı bileşenleri Çizelge 3.2. Myrobalan 29 klonu için sürgün geliştirme, kardeşlenme ve köklendirme aşamasında kullanılan MS (Murashige ve Skoog, 1962) kültür ortamı bileşenleri Çizelge 3.3. PCR kokteylinin hazırlanışı Çizelge 4.1. In vitro da üretimi yapılan bazı sert çekirdekli meyve anaçları üzerinde nematod inokulasyonundan 3 ay sonra Meloidogyne javanica nın gelişme durumu ve gal indeksi Çizelge 4.2. In vitro da üretimi yapılan bazı sert çekirdekli meyve anaçları üzerinde nematod inokulasyonundan 3 ay sonra Meloidogyne incognita nın gelişme durumu ve gal indeksi VI

9 VII

10 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Türkiye de bazı sert çekirdekli meyvelerin yıllara göre üretim alanı (ha) (FAO, 2009)... 1 Şekil 1.2. Türkiye de bazı sert çekirdekli meyvelerin yıllara göre ağaç sayısı (bin) (TÜİK, 2010)... 2 Şekil 1.3. Türkiye de bazı sert çekirdekli meyvelerin yıllara göre üretim miktarları (ton) (TÜİK, 2010)... 2 Şekil 1.4. Sert çekirdekli meyve anacı kök-ur nematodunun kökte oluşturduğu galler (oklar gallerden bazılarını göstermektedir)... 4 Şekil 3.1. In vitro klonal çoğaltım amacı ile kullanılan sürgün uçlarının sterilizasyonu (A), steril edilmiş sürgün uçlarının filtre kağıdında kurutulması (B) Şekil 3.2. In vitro koşullarda Myrobalan (A) ve GF-677 (B) anaçları sürgün uçlarının 1.0 mg/l BAP mg/l GA 3 hormon kombinasyonu içeren MS ve MST ortamlarında kültüre alınması Şekil 3.3. In vitro sürgün ucu kültürü yöntemiyle elde edilen farklı anaçlara ait sürgünlerin mikro çoğaltımı. 2.0 mg/l BAP içeren MST ortamında GF-677 anacı sürgün uçlarından yan sürgünlerin gelişimi (A) 1.0 mg/l BAP mg/l GA 3 içeren MS ortamında Myrobalan anaç sürgün ucundan yan sürgünlerin gelişimi (B) Şekil 3.4. In vitro sürgün ucu kültürü yöntemiyle elde edilen bitkilerin toprağa adaptasyonu. Transpirasyonu engellemek amacı ile bitkilerin plastik torbalarla örtülmesi (A), Toprağa adaptasyonu sağlanmış Myrobalan 29 anacı (B) Şekil 3.5. Meloidogyne incognita ırk 2 ve Meloidogyne javanica ile infekteli Rio Grande domates bitkisi (A) bitki köklerindeki kök-ur nematodlarının oluşturduğu galler (B) Şekil 3.6. Nematodların elde edilmesinde kullanılan geliştirilmiş Baermann huni yöntemi VIII

11 Şekil 3.7. Domates bitkisi köklerinden çıkartılmış bitki dokusu içinde yumurta paketi (A) ve larvaların Baermann huni yöntemi ile elde edilmesi (B).. 27 Şekil 4.1. BAP nin iki farklı konsantrasyonunun ve BAP+GA 3 hormon kombinasyonlarının MST ortamında kültüre alınan GF-677 anacında kardeşlenme sayısı ve sürgün uzunluğu üzerine etkileri Şekil mg/l BAP içeren MST ortamında kültüre alınan GF-677 anacı sürgün uçlarından yan sürgünlerin çoğaltılması Şekil 4.3. BAP nin iki farklı konsantrasyonunun ve BAP+GA 3 hormon kombinasyonlarının MST ortamında kültüre alınan Garnem anacında kardeşlenme sayısı ve sürgün uzunluğu üzerine etkileri Şekil 4.4. MST ortamında kültüre alınan Garnem anacı sürgünlerinin genel görünümü Şekil 4.5. BAP nin iki farklı konsantrasyonunun ve BAP+GA 3 hormon kombinasyonlarının MST ortamında kültüre alınan Cadaman anacında kardeşlenme sayısı ve sürgün uzunluğu üzerine etkileri Şekil 4.6. BAP nin üç farklı konsantrasyonunun ve BAP+GA 3 hormon kombinasyonlarının MS ortamında kültüre alınan Myrobalan 29 klonunda kardeşlenme sayısı ve sürgün uzunluğu üzerine etkileri Şekil 4.7. MS ve MST ortamında kültüre alınan Cadaman (A) ve Myrobalan anacı (B) sürgünlerinin genel görünümü Şekil 4.8. MST ortamında kültüre alınan GF-677 anacı köklenme yüzdesi ve ortalama kök sayısı üzerine farklı IBA ve Fe-EDDHA konsantrasyon ve kombinasyonlarının etkisi Şekil 4.9. MST ortamında kültüre alınan Garnem anacı köklenme yüzdesi ve ortalama kök sayısı üzerine farklı IBA ve Fe-EDDHA konsantrasyon ve kombinasyonlarının etkisi Şekil MST ortamında kültüre alınan Cadaman anacı köklenme yüzdesi ve ortalama kök sayısı üzerine farklı IBA ve Fe-EDDHA konsantrasyon ve kombinasyonlarının etkisi IX

12 Şekil In Vitro koşullarında 1.5 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA içeren MST ortamında Garnem sürgünlerinden kök gelişimi, Garnem bitkisinin köklendirme ortamında görünüşü (A), köklü Garnem bitkisi (B), 1.0 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA içeren MS ortamında köklendirilmiş Myrobalan 29 klon bitkisi (C), 1.5 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA içeren MST ortamında köklendirilmiş GF-677 bitkisi (D) Şekil Meloidogyne javanica ve Meloidogyne incognita ırk 2 ile inokule edilen Garnem, Myrobalan 29 ve Cadaman anaçlarının SCAL19JF1, SCAL19JF2 ve SCAL19-2 ile PCR analiz sonuçları. M: 100 bç plus markör, 1-3: Cadaman, 4-6: Garnem, 7-9: Myrobalan X

13 XI

14 SİMGELER VE KISALTMALAR C : Santigrat derece bp : Baz çifti (Base pair) dak. µg µl µm BAP CaCI 2 cm CTAB : Dakika : Mikrogram : Mikrolitre : Mikromolar : 6-Benzil amino pürin (6-Benzylaminopurine) : Kalsiyum klorür (Calcium Chloride) : Santimetre : Setil tri metil amonyum bromid (Cetyltrimethylammonium bromide) CuSO 4 5H 2 O CoCI 2 6H 2 O DNA dntp EDTA EtBr EtOH FAO Fe-EDDHA : Bakır Sülfat (Copper sulphate penta hydrate) : Kobalt Klorür (Cobalt Chloride) : Deoksiriboz nükleik asit : Di nükleotid trifosfat : Etilen daimin tetra asitik asit (Ethylenediaminetetraacetic acid) : Etidyum bromide : Etil alkol (Ethyl alcohol) : Food and Agriculture Organization : Etilen diamin di hidroksi fenil asetik asit demir tuzu (iron salt of ethylenediamine di-o-hydroxyphenylacetic acid) Fe-NaEDTA :Etilen daimin tetra asetik asit demir sodyum tuzu (Ethylenediamine tetraacetic acid iron (lll) sodium salt) g GA 3 H 3 BO 3 IBA KH 2 PO 4 KI : Gram : Giberellik asit (Gibberellic acid) : Borik asit (Boric acid) : İndol bütrik asit (Indole-3-butyric acid) : Potasyum di hidrojen fosfat (Potassium Dihydrogen Phosphate) : Potasyum iyodür (Potassium Iodide) XII

15 KNO 3 l mg MgCl 2 MgSO 4 7H 2 O ml mm mm MnSO 4 H 2 O MS MST Na 2 MoO 4 2H 2 O NH 4 NO 3 nm PCR PVP rpm sn TAE TE TÜİK U ZnSO 4 7H 2 O : Potasyum Nitrat (Potassium Nitrate): : Litre : Miligram : Magnezyum Klorür : Magnezyum Sülfat (Magnesium sulphate heptahydrate) : Mililitre : Milimetre : Milimolar : Mangan Sülfat (Manganese (II) Sulfate Monohydrate) : Murashige ve Skoog : Modifiye edilmiş Murashige ve Skoog : Sodyum Molibdat (Sodium Molybdate Dihydrate) : Amonyum Nitrat (Ammonium Nitrate) : Nanometre : Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction) : Polivinil pirolidon (Polyvinylpyrrolydone) : Dakikada dönüş sayısı : Saniye : Tris Asetat-EDTA (Tris Acetate-EDTA : Tris-EDTA : Türkiye İstatistik Kurumu : Ünite : Çinko Sülfat (Zinc Sulphate Heptahydrate) XIII

16 1. GİRİŞ Burcu ÖZBEK 1. GİRİŞ Avrupa da özellikle sert çekirdekli bodur ve yarı bodur meyve yetiştiriciliğinin yaygınlaşması, Türkiye de de var olan sert çekirdekli meyve yetiştiriciliğinin hem popülaritesini hem de üretim alanını tüm bölgelere yaymış, özellikle Akdeniz Bölgesinde turfanda meyve yetiştiriciliğini ön plana çıkarmıştır. Ülkemiz dünya kayısı üretiminde 1. sırada yer alırken, erik üretiminde 5. sırada şeftali ve nektarin üretiminde ise 7. sırada yer almaktadır (FAO, 2008) yılı itibari ile toplam hektar alanda yapılan kayısı, şeftali, nektarin, erik yetiştiriciliği 2009 yılı itibari ile hektara ulaşmış (Şekil 1) toplam ağaç sayısı ise 2005 de den 2010 da e ulaşmıştır (Şekil 2). Kayısı Şeftali -nektarin Erik Şekil 1.1. Türkiye de bazı sert çekirdekli meyvelerin yıllara göre üretim alanı (ha) (FAO, 2009) 1

17 1. GİRİŞ Burcu ÖZBEK Kayısı Şeftali Erik Şekil 1.2. Türkiye de bazı sert çekirdekli meyvelerin yıllara göre ağaç sayısı (bin) (TÜİK, 2010) Kayısı Şeftali Erik Şekil 1.3. Türkiye de bazı sert çekirdekli meyvelerin yıllara göre üretim miktarları (ton) (TÜİK, 2010) Ülkemizin coğrafik şekli, toprak yapısı ve ekolojik koşulları her ne kadar meyve yetiştiriciliğe uygun olsada bazı hastalıklar, zararlılar ve nematodlar 2

18 1. GİRİŞ Burcu ÖZBEK nedeniyle önemli derecede ürün kayıpları gözlenmekte ve ekonomik düzeyde zarar meydana gelmektedir. Bu zararlı nematod grubundan, Meloidogyne (Tylenchida, Meloidogynidae) cinsine bağlı kök-ur nematodları Dünya genelinde ekonomik değeri yüksek bir çok bitki türünde ve özellikle Rosaceae familyası bitki türlerinde (sert ve yumuşak çekirdekli meyveler, çilek ve süs bitkileri) oldukça geniş konukçu dizisini etkileyen obligat bitki parazitleridir (Sasser 1977; Lamberti 1979). Türkiye de daha önce değişik bölgelerde yürütülen çalışmalarda (Akdeniz, Marmara, Ege, Karadeniz, Güneydoğu Anadolu, İç ve Doğu Anadolu Bölgeleri) farklı bitki türlerinde (sebze, muz, bazı yumuşak ve sert çekirdekli meyve ağaçları) kök-ur nematodu türlerinden M. incognita, M. javanica, M. arenaria, M. hapla, M. acrita, M. exiqua ve M. thamasi nin bulunduğu, M. incognita ve M. javanica nın en yaygın ve ekonomik olarak en önemli türler olduğu, M. arenaria ve M. hapla nın ise ender rastlanan türler olduğu bildirilmektedir (Yüksel, 1974; Ağdacı, 1978; Elekcioğlu ve Uygun 1994; Elekcioğlu ve ark., 1994; Mennan ve Ecevit, 1996; Söğüt ve Elekcioğlu, 2000). Akdeniz Bölgesinde kök-ur nematodlarından M. arenaria, M. incognita ve M. javanica, meyve ağaçlarının aktif gelişimini yavaşlatarak ağaçların mukavemetini (direncini) azaltmak ve verim kaybına neden olmaktan dolayı Prunus cinsi meyve ağaçlarının (şeftali, badem, kayısı, erik ve kiraz) en büyük sorunlarından birisi olarak ortaya çıkmaktadır (Rom ve Carlson 1987; Nyczepir ve Halbrendt 1993). Kök-ur nematodlarıyla mücadelede; kimyasal savaş, biyolojik mücadele, ekim nöbeti, solarizasyon ve dayanıklı çeşitler önerilmekte (Gheysen ve ark., 1996; Sijmons ve ark., 1994), ancak bu yöntemlerden birçoğu çeşitli nedenlerden dolayı kullanılmamaktadır. Odunsu meyve ağaçlarının yetiştiriciliğinde bu nematod zararlılarına karşı dikim öncesi toprak fumigasyonu en çok uygulanan mücadele yöntemlerinden birisi olmakla birlikte fumigasyonda kullanılan pestisitin çok toksik olması, çevreye olan olumsuz etkisinden dolayı bu uygulama da önemli kısıtlamalar getirmiştir. Bu durumda en güvenilir yöntem bu zararlı nematod grubuna dayanıklı anaçların seçilerek yetiştirilmesidir. 3

19 1. GİRİŞ Burcu ÖZBEK Şekil 1.4. Sert çekirdekli meyve anacında kök-ur nematodunun kökte oluşturduğu galler (oklar gallerden bazılarını göstermektedir) 4

20 1. GİRİŞ Burcu ÖZBEK Ülkemizde sert çekirdekli meyve gruplarından kayısı ve erik için Myrobalan erik anacı, şeftali ve nektarin için Garnem, GF-677 ve Cadaman anaçları kullanılmaktadır. Myrobalan erik anaçlarında kök-ur nematodlarına en hassas klonlardan en dayanıklı klonlara kadar birçok klonlar bulunmaktadır. Myrobalan 29 kök-ur nematodlarına dayanıklı klon olarak seçilmiş olup, erik ve kaysı çeşitleri bu klon üzerine aşılanmaktadır. Şeftali ve nektarin anaçlarından Garnem ve Cadaman kök-ur nematodlarına dayanıklı (Pinochet ve ark., 1999), GF-677 anacının ise duyarlı olduğu bilinmektedir (Fernandez ve ark., (1994). Anaçların dayanıklılık durumları kök-ur nematodlarının ırklarına göre değişiklik gösterebilmektedir. Doğu Akdeniz Bölgesinde yürütülen bir çalışmada kök-ur nematodlarından Meloidogyne incognita nın ırk 2 populasyonunun hakim olduğu saptanmıştır (Söğüt ve Elekçioğlu, 2000). Bir çeşidin dayanıklı veya duyarlı olması bir çok etmene bağlı olup, bunlar bazı durumlarda dayanıklılığın sürekliliğini etkilemektedir (Fassuliotis, 1985). Bu etmenlerden en önemlisi sıcaklık olup, toprak sıcaklığının nematod ırklarının virülensliğini etkileyen diğer bir faktör olarak ortaya çıktığı belirtilmektedir (Fernandez ve ark., 1993). Yine farklı coğrafik yapı ve toprak yapısında da nematodların farklı davrandıkları da yapılan çalışmalarla gözlenmiştir. Bu çalışma, ülkemizde hızla yetiştiriciliğinin arttığı kaysı, erik, şeftali ve nektarin anaçlarında öncelikle in vitro koşullarda klonal üretim sistemlerini kurmak, daha sonra bölgemizde sorun olan kök-ur nematodlarından M. incognita ırk 2 ve M. javanica ya karşı dayanıklılık düzeylerini araştırmak amacıyla yürütülmüştür. 5

21 1. GİRİŞ Burcu ÖZBEK 6

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Burcu ÖZBEK 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. In Vitro Doku Kültürü ile İlgili Yapılan Çalışmalar Dimassi ve Theriou (1995), sert çekirdekli meyve anaçlarının in vitro çalışmalarında MS ortamındaki mineral madde konsantrasyonunun normal dozun yarısına indirgenmesinin kök uzunluğunu ve köklenme yüzdesini arttırdığını bildirmişlerdir. Silveira (2000), Embrapa Temperate Climate Doku Kültürü Laboratuvarın da Myrobalan, Marianna, Mr.S 2/5, GF-677 ve G x N22 anaçları için in vitro çoğaltma protokolleri geliştirilmiştir. Bu amaçla MS ve ¾MS ortamı ve BAP nin 4 farklı konsantrasyonu (0.1, 0.3, 0.5 ve 0.7 mg/l) test edilmiştir. Genotipler, bu iki ortamda ve farklı BAP konsantrasyonlarında farklı tepkiler vermişlerdir. Mr.S 2/5 ve G x N22 anaçları ¾MS ortamında BAP daha iyi sonuçlar sağlamıştır. Marianna anacı, 0.7 mg/l BAP içeren MS ortamında en iyi sonucu verirken, Mirabolan anacı 0.5 mg/l BAP içeren ¾MS ortamında en iyi sonucu vermiştir. Kullanılan her iki ortamda (MS ve ¾MS) BAP dozu arttıkça sürgün uzunluğunda azalma gözlenmiştir. G x N22 anacı aynı tepkiyi MS ortamında vermiştir. In vitro çoğaltma çalışmasıyla en iyi sitokinin konsantrasyonu ve en iyi kültür ortamı saptanmış, daha sonra köklenme durumunun incelenmesi için oksin çalışmaları yapılmıştır. Denemede yer alan 4 anacın her biri için IBA, IAA ve NAA nın 4 farklı dozu (0, 0.01, 0.1 ve 1.0 μm) test edilmiştir. Anaçlar, oksinler ve konsantrasyonlarına göre farklı tepkiler vermiştir. IBA ve IAA oksinleri yapılan tüm uygulamalarda NAA e göre daha iyi sonuçlar vermiştir. G x N22 anacı en iyi sonucu IBA ve IAA nın 0.01 μm konsantrasyonunda verirken, Marianna anacı μm konsantrasyonlarında en iyi sonucu vermiştir. Mirabolan anacı, oksin tipleri ve konsantrasyonlarına göre önemli tepkiler vermemiştir. Sonuçta, NAA nın Prunus anaçlarının in vitro çoğaltımı için uygun olmadığı tespit edilmiştir Kamali ve ark., (2001), GF-677 anacının doku kültürü yöntemiyle mikro çoğaltımını araştırmış ve sürgün ucu eksplantlarının nisan ayında alındığında, 1 mg/l BA içeren besi ortamında kültüre alınmasının en iyi kardeşlemeyi sağladığını 7

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Burcu ÖZBEK saptamışlardır. En yüksek köklenme oranını ise 0.3 mg/l NAA ile 1.6 mg/l thiamine içeren besi ortamında ve 7 günlük karanlık uygulamasından elde etmişlerdir. Silveira ve ark., (2001), bazı sert çekirdekli meyve anaçlarını in vitro koşullarda çoğaltmak için yan gözleri BAP nin 4 farklı konsantasyonunu (0.1, 0.3, 0.5 ve 0.7 mg/l) ve MS in iki farklı tuz konsantrasyonu içeren besi ortamlarında kültüre almışlardır. Bu amaçla G x N22, GF-677 (Peache amnedier), Mr.S 2/5, Marianna ve Myrobalan (Prunus cerasifera) erik anaçlarını bitki materyali olarak kullanmışlardır. G x N-22 ve Mr. S 2/5 anaçlarının ¾MS ortamında 0.7 mg/l BAP nin iyi sonuçlar verdiğini, Myrobalan anacının ise aynı MS tuz konsantrasyonunda 0.5 mg/l BAP ile daha iyi sonuç verdiğini saptamışlardır. Test edilen iki farklı MS tuz konsantrasyonunda BAP konsantrasyonunun artmasıyla sürgün uzunluğunun azaldığını bildirmişlerdir. GF-677 anacının mikro çoğaltımında denenen bu ortam ve hormon konsantrasyonlarının iyi sonuç vermediğini rapor etmişlerdir. Ahmad ve ark., (2003), GF-677 şeftali anacının in vitro çoğaltımında, MS ve Anderson temel besin ortamları ile farklı BAP konsantrasyonları (0.3, 0.6 ve 0.9 mg/l) kullanmışlardır. MS ve Anderson temel besin ortamlarını karşılaştırdıklarında MS ortamının sürgün çoğaltımı, boyuna uzama ve bitki gelişimi üzerinde en iyi olduğunu bildirmişlerdir. Anderson ortamında ise bitkiciklerde gelişmenin MS ortamındakine göre daha az olduğunu, nekrotik lekeler ve camlaşmanın meydana geldiğini rapor etmişlerdir. BAP nin 0.9 mg/l konsantrasyonunun kallus oluşumuna ve sürgün tepe nekrozlarına neden olduğunu bildirmişlerdir. En iyi kök gelişimini 0.3 mg/l IBA içeren ½MS ortamından aldıklarını ve 4 mg/l IBA konsantasyonunun kallus oluşumunu teşvik ederken, kök gelişimini engellediğini gözlemlemişlerdir. Molassiotis ve ark., (2003), GF-677 anacının in vitro köklendirilmesi üzerine, organik (Fe-EDTA ve Fe-EDDHA) ve inorganik (FeCl 3 ) demir ilavesinin etkilerini incelemişlerdir. Fe-EDDHA eklenmiş eksplantlarda % 100 köklenme elde edildiğini, demir noksanlığında yada FeCl 3 kullanıldığında daha az köklenme olduğunu bildirmişlerdir. Fe-EDTA ilave edilen ortamda ise kök elde edilemediğini ve Fe- EDTA uygulaması sonucunda bitkiciklerde oldukça düşük klorofil ve yüksek Fe içeriği gösterdiğini saptamışlardır. 8

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Burcu ÖZBEK Rodrigues ve ark., (2003), Prunus anaç adaylarının in vitro koşullarda çoğaltılması için ortam denemeleri kurmuşlardır. Anaç sürgünlerinden ortalama 1 cm uzunluğunda kesilen sürgün uçlarını 16 saat fotoperiyot ve 25 ± 2 o C sıcaklıkta tutmuşlardır. Deneyleri, MS, ¾MS, SH ve Villegas içeren ortamlar ile kurmuşlar, çoğaltma ortamı olarak SH ve ¾MS kullanmışlardır. Ayrıca ¾MS ortamında farklı agar miktarlarını (4.5, 5.5 ve 6.5 g/l) da denemişlerdir. Denemede bitkilerin gelişme, infeksiyon ve oksidasyon yüzdelerini de saptamışlardır. Çoğaltma ortamında en iyi büyüme, gelişme ve kardeşlenme oranını 5.5 g/l agar içeren ¾MS ortamında bulmuşlardır. Couto ve ark., (2004), Cadaman ve Barrier anaçlarının mikro çoğaltımında kullanılacak en iyi tuz ve BAP konsantrasyonunu belirlemek amacı ile yaptıkları çalışmalarında, farklı tuz konsantrasyonları (MS, ½MS, 2/3MS) ve BAP konsantrasyonları (0, 1.5, 2.5, 3.5 ve 4.5 µm) kullanmışlardır. Tuz konsantrasyonlarının azalmasının sürgün oluşumunu arttırdığını fakat sürgün boyunu azalttığını bildirmişlerdir. Tomurcuk sayısı, sürgün sayısı ve sürgün uzunluğunu maksimum 31.2 tomurcuk/eksplant, 4.6 sürgün/eksplant ve 8.1 mm uzunluğunda sırasıyla 3.3, 3.1 ve 3.1 µm BAP konsantrasyonlarından elde etmişlerdir. Demirkök (2006), GF-677, AK-1 ve AK-2 Badem x Şeftali melez anaçlarının MS makro ve mikro besin elementleri, vitaminleri ve Fe-Na EDTA kompozisyonu ile in vitro klonal mikro çoğaltımını yapmıştır. Sürgün geliştirme ve çoğaltma aşamasında BAP nin 4 farklı konsantrasyonunu ve 0.1 mg/l GA 3 kombinasyonu ile büyüme düzenleyici içermeyen kontrol MS ortamları kullanmıştır. En iyi kardeşlenme sayısını 1.5 mg/l BAP içeren ortamda, en yüksek köklenme oranını ise 0.5 mg/l IBA içeren MS ortamında elde etmiştir. Arıcı (2008), Myrobalan 29-C, MaxMa 14, MaxMa 60, GF-677 ve Garnem anaçlarının sürgün uçları ve yan sürgünlerini kullanarak doku kültürü ile mikro çoğaltma olanaklarını araştırdığı çalışmada en fazla sürgün oluşumunu Myrobalan 29 klonu için 1 mg/l BAP+0.2 mg/l NAA, MaxMa 60 için 2 mg/l BAP+0.02 mg/l NAA, MaxMa 14 için 2 mg/l BAP+0.2 mg/l NAA+0.5 mg/l GA 3, GF 677 için 1 mg/l BAP+0.02 mg/l NAA, GN için 1 mg/l BAP+0.02 mg/l NAA+ 0.5 mg/l GA 3 içeren MS ortamlarında elde etmiştir. 9

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Burcu ÖZBEK 2.2. Sert Çekirdekli Meyve Anaçlarında Kök-Ur Nematodlarına Dayanıklılıkla İlgili Yapılan Çalışmalar Yüksel (1974), Türkiye deki kök-ur nematodlarının yaygınlıkları üzerine yaptığı çalışmada, Karadeniz Bölgesi nde M. incognita ve M. arenaria; Marmara Bölgesi nde M. incognita, M. incognita acrita, M. javanica, M. arenaria ve M. hapla; Ege Bölgesi nde M. incognita, M. javanica, M. arenaria ve M. hapla; Akdeniz Bölgesi nde M. incognita, M. javanica, M. arenaria ve M. hapla nın bulunduğunu belirlemiştir. Wehunt (1984), şeftali ağaçlarının M. incognita, M. arenaria, M. javanica ve M. hapla'ya duyarlı olduğunu ve şeftali yetiştirilen tüm alanlarda bulunduğunu, Japonya'da armut ağaçlarının M. hapla ve M incognita ile bulaşık olduğunu bildirmiştir. Sasser ve Carter (1985), 70 ülkeden topladıkları 850 kök-ur nematod populasyonu üzerinde yürüttükleri çalışmada, bu populasyonların % 97 sinde, Dünyada en fazla yaygın olarak dört kök-ur nematod türünün (M. incognita, M. arenaria, M. javanica, M. hapla) olduğunu tespit etmişlerdir. Hashmi ve ark., (1991), in vitro koşullar altında kök-ur nematoduna dayanıklı yada toleranslı hem somaklonal varyantlar seçmek hem de genetik olarak değiştirilmiş bitkiler geliştirmek için optimum nematod inokulum seviyelerinin bilinmesi gerektiğini söylemişlerdir. Domates (Lycopersicon esculentum) kök eksplantlarında M. incognita nın 2. larvalarının penetrasyonu ve in vitro da çoğaltılmış şeftali bitkileri (P. persica (L.) Batsch) M. incognita nın 5 inokulum seviyesi (domates için 25, 50, 75, 100 ve larva ve şeftali için 50, 100, 200, 500 ve larva) ile karşılaştırılmıştır. Şeftali de maksimum penetrasyon 2.larva seviyesinde 200 nematod ile yalnızca % 8 iken, domatesde, köke penetrasyonun en büyük oranı 2.larva seviyesinde 75 larva ile % 30 bulunmuştur. Bu konukçular içinde (bütün inokulum seviyelerinde) M. incognita nın penetrasyon oranındaki bu önemli farklılık (P<0.05) in vitro koşullar için optimum nematod seviyelerinin türden türe belirlenmesi gerektiğini ortaya koymuştur. 10

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Burcu ÖZBEK Esmenjaud ve ark., (1993), in vitro koşullarda çoğaltılmış ve köklendirilmiş Prunus cerasifera (Myrobalan) nın kök-ur nematodu M. arenaria ya dayanıklı iki genotipini (P.1079 ve P.2175) ve duyarlı bir genotipini (P.2032) kumlu toprak içeren saksılara transfer ettikten 70 gün sonra, kök-ur nematodunun 2. dönem larvalarının farklı inokulum seviyeleri ile (0, 500, 1500, 4500) inokule etmişlerdir. İnokulasyondan iki ay sonra, köklerde nematod artışının ve gal oluşumunun gözlenmediği genotipleri dayanıklı olarak değerlendirmişlerdir. In vitro koşullarda IBA ile köklendirilen bitkiciklerin nematod dayanıklılık testlerinde rahatlıkla kullanılabileceklerini, kök-ur nematoduna duyarlı olan genotipin IBA ile köklendirildikten sonra yapılan nematod inokulasyonu sonucunda da yine duyarlı olduğunu, dolayısı ile dışardan veilen IBA hormonunun dayanıklılık düzeyini değiştirmediğini de vurgulamışlardır. Fernandez ve ark., (1993), M. incognita ile inokule edilmiş Prunus anaçlarının 5 dayanıklı 1 duyarlı genotipi üzerinde nematod çoğalmasının ve gal oluşumunda sıcaklığın etkisini belirlemişlerdir. 26 ve 30ºC de 5000 adet nematod ile inokule edilmiş GF-677 anacında aşırı derecede gal oluştuğunu ve üreme olduğunu bildirmiştir. 23 ve 31 ºC de M. incognita nın 4000 adet 2. dönem larvası ile inokule edildikten sonra da benzer oranlarda gal oluşmuştur. GxN No22 de ise 23 ºC de önemsiz derecede çoğalma olmuş fakat 31 ºC de gal oluşumu ve üremesinde önemli sayıda farklılıklar olduğunu saptamışlardır. Huettel ve ark., (1993), M. incognita ile inokulasyona, Nemaguard ve Lovell anaçları ve Redhaven, Compact Redhaven, Jerseyqueen ve Rio Oso Gem şeftali aşı kültivarlarının in vitro ve küçük parsellerde tepkisini karşılaştırmışlardır. Anaçların dikiminden 4 yıl sonra, in vitro da gözlemlenen bir yada daha çok parametre ile ilişkili en az bir parametre mikro parselde gözlemlenmiştir (1989). Meloidogyne e karşı gösterilen tepkilerin sınıflandırılmasında Nemaguard da dayanıklılık, Lovell de ise duyarlılık reaksiyonu gözlenmiştir. In vitro ve küçük parsellerdeki veriler sırasıyla, Redhaven ve compact Redhaven de M. incognita ya dayanıklılık düzeylerinin orta ve yüksek olduğunu, hem Jerseyqueen i hem de Rio Oso Gem in M. incognita ya duyarlı olduğunu, fakat Lovell kadar duyarlı olmadığını bildirmişlerdir. In vitro koşullarda kendi üzerine köklenen şeftali 11

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Burcu ÖZBEK kültivarları ve anaçlarının nematodlara karşı tepkisi, açık alan koşulları altında bu nematodların herbirine karşı reaksiyonunu belirlemek için güvenilir bir metod olarak kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Fernandez ve ark., (1994), İspanya ve Fransa orijinli erik, şeftali-badem hibritleri olan sert çekirdekli meyve anaçlarının M. arenaria, M. incognita ve M. javanica ya karşı reaksiyonlarını değerlendirmişlerdir. İlk denemede, P-AH Hansen2-168 (P. persica x P. dulcis), GF-31 (P. cerasifera Ehr.) ve GF8-1 (P. cerasifera x P. munsoniana) in M. javanica nın 5 izolatına son derece dayanıklı olduğunu saptamışlar. P-AH S Barrier in dayanıklı ve Titan x Nemared hibritinin ise orta düzeyde dayanıklı olduğunu kaydetmişlerdir. GF-677, MB 3-13, MB 2-2 ve MB 2-6 nın ise duyarlı olduğunu vurgulamışlar. İkinci ve üçüncü denemede, P 1079 ve P 2175 erik anaçları, Afgano (Mor Kaysı) (P. dasycarpa Ehrh.), G x N No 22 ve G x N No 15, P-AH s ve Nemared şeftali hibritleri M. incognita ve M. arenaria nın 5 izolatına oldukça dayanıklı olduğunu bildirmişlerdir. Aynı zamanda her iki kök-ur nematoduna karşı testlenmiş P2980 (P. cerasifera) ve GF 8-1 erik anaçlarının oldukça dayanıklı olduğunu bildirmişlerdir. Cachirulo x (G x N No 9) hibriti, P-AH, M. arenaria ya M. İncognita dan daha az dayanıklı bulmuşlardır. Montclar (şeftali) (P. persica), P-AH s, Torrents AC ve GF-677 yi her iki türe karşı duyarlı bulmuşlardır. Esmenjaud ve ark., (1995), Myrobalan (Prunus cerasifera) ın 13 farklı genotipi üzerinde, 50 ve 105 günlük taze yeşil çelikleri ile 15 aylık odun çelikleri M. arenaria nın 2. dönem 3000 larvası ile inokule edilerek tepkilerini karşılaştırmışlar ve yüksek düzeyde dayanıklıdan duyarlılığa doğru sınıflandırmışlardır. Çeliklerin nematod ile inokulasyonundan 30 gün sonra gal indeksi ve gal sayısı kaydedilmiş, perlitte köklendirilmiş 50 günlük çeliklerde infeksiyondan sonra bir çok kökçük gelişmiş ve sadece gal başlangıçları gözlemlemişlerdir. Kumda IBA uygulaması yapılmadan köklendirilmiş 50 günlük çeliklerde nematoda dayanıklılık çok değişken olduğundan değerlendirme yapılamamıştır. IBA ile köklendirilmiş benzer çeliklerde daha fazla gal oluşmuş ancak, ne bitki başına oluşan gal ne de gal indeksi konukçu duyarlılığını saptamada güvenilir olmamıştır. IBA uygulaması ile köklendirme sonuçları daha iyi olduğu için, 105 günlük odun çelikleri önce perlitte IBA ile 12

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Burcu ÖZBEK köklendirilmiş, daha sonra nematod inokulasyonu için kuma transfer edilmiştir. Son derece dayanıklı genotip olarak bilinen Myrobalan erik anacının odun çeliklerinde nematod ile inokulasyondan sonra hiç gal oluşmadığı, aynı şekilde diğer genotiplerin odun çeliklerinin de tepkisi benzer olmuştur. Myrobalan erik anacının nematoda dayanıklılıkta kök dokusunun olgunluğunun önemli bir faktör olduğu ortaya konmuştur. Pinochet ve ark., (1996), 20 adet Prunus anacının kök-ur nematod türlerine (Meloidogyne spp.) ve kök lezyon nematodu, Pratylenchus vulnus a karşı dayanıklılıklarını değerlendirmek amacı ile sera koşullarında iki seleksiyon denemesi yapmışlardır. Deneysel amaçla kullanılan ticari anaçların ve genotiplerin hepsi Fransız ve İspanyol orijinli olup, hemen hemen hepsi türler arası melezleme ile elde edilmiş hibrit bitkilerden oluşmaktadır. İlk denemede, kullanılan anaçlardan Bruce, Cadaman, Mirac, GxN No. 1 5, Cachirulo x (GxN No. 9) ve P. myra x şeftali genotipleri M. incognita nın 7 izolatına dayanıklı yada bağışık olarak değerlendirilmiştir. İkinci denemede, erik hibriti P 2588 kök lezyon nematodu Pratylenchus vulnus un 4 izolatına zayıf konukçu olduğu, yani bu nematoda dayanıklı olduğu saptanmıştır. Geriye kalan 7 anaç ise kök lezyon nematodu için iyi bir konukçu olduğu, diğer bir ifade ile duyarlı anaçlar olarak saptanmıştır. Dayanıklılık değerlendirme denemesinde GF-31, G x N No. 15, Torinel, AD-101, Monpol, Nemaguard ve Cadaman M. incognita, M. javanica, M. arenaria, M. hapla ve M. hispanica nın 17 izolatına yüksek derecede dayanıklılık göstermişlerdir. Stalin ve ark., (1998), in vitro koşullarda çoğaltılmış 9 Myrobalan klonunu kök-ur nematodlarının 4 izolatına [M. incognita (2), M. javanica (1) ve M. hispanica (1)] ve kök lezyon nematodu Pratylenchus vulnus a karşı testlemişlerdir. Kök-ur nematodlarına dayanıklı 5 klonu (P.2175, P.1079, P.2980, H.17 ve H.21) ve konukçusu 4 klonu (P.2794, H.18, H.23 ve P.16.5) M. arenaria, M. incognita ve M. javanica ya dayanıklılığı kontrol eden Ma major gene göre karakterize edilmişler. Kök lezyon nematodu P. Vulnus testlerinde bütün klonlarda son populasyon başlangıç populasyonuna (Pf:Pi>1) göre daha yüksek olduğunu, kök-ur nematodlarında (Pf:Pi) eşit oranlarda olduğunu bildirmişlerdir. Sonuç olarak, 13

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Burcu ÖZBEK Myrobalan da kök-ur nematodlarına dayanıklılığı sağlayan Ma allel geni, kök lezyon nematodunun çoğalmasında major etkiye sahip olmadığını bildirmişlerdir. Pinochet ve ark., (1999), kök-ur nematodu M. javanica ya dayanıklılık için sera koşulları altında 20 sert çekirdekli meyve anacı içeren 2 deneme kurmuşlardır. İlk denemede Adesoto 101 (P. insititia L.) (Mürdüm eriği), Bruce (P. salicinaxp. angustifolia) (Japon eriği x chickasaw eriği melezi), Ishtara, AC-952 (P. insititia) (Japon eriği), Garnem (P. dulcis x P. persica) (badem x şeftali melezi), Cadaman (P. persica x P. davidiana) (şeftali x Çin e özgü yabani şeftali melezi) ve Orotava (P. salicina) (Japon eriği) anaçlarının M. javanica nın 10 izolatının karışımına dayanıklı ve bağışık olduğunu bildirmişlerdir. İkinci denemede ise erik anaçları Adesoto 101, Adara (P. cerasifera) (Kiraz eriği), Myro-10 (P. cerasifera), Constanti (P. domestica L.) (Erik) ve AD 105 (P. insititia) (Japon eriği) in kök ur nematodlarına bağışık olduğunu bildirmişlerdir. Cadaman, GxN No.17 (P. dulcis x P. Persica) ve Tetra (P. domestica) nın dayanıklı olduğunu bildirmişlerdir. Laroda F1OP (P. salicina) (Japon eriği), Myro-badem (P. cerasifera x P. dulcis) (kiraz eriği x badem melezi) ve şeftali badem hibritleri Mayor, Adafuel ve Sirio nun duyarlı olduğunu bildirmişlerdir. Söğüt ve Elekçioğlu (2000), Doğu Akdeniz Bölgesi nde yürüttükleri çalışmada M. javanica ya ait ırk 1, M. incognita ya ait ırk 2 ile ırk 4 olmak üzere toplam 3 kök-ur nematodu ırkı tespit etmişlerdir. M. javanica ya ait 4, M. incognita ya ait 1 ve M. hapla ya ait 1 populasyonun ise konukçu testine göre uygun reaksiyon göstermediği için ırk düzeyinde teşhisinin yapılamadığını bildirmişlerdir. Zhen-Xiang Lu ve ark., (2000), hem M. incognita ya hem de M. javanica ya duyarlı Lovell in melezlerinden geliştirilen K62-68 ve P F 1 hibrid Prunus anaçları ve her iki kök-ur nematodlarına da dayanıklı Nemared 2F 2 hibrid populasyonu geliştirmek için kendilenmiştir. Otsu gövde çelikleri ile vejetatif çoğaltma, çoğalmanın işleyişi için herbir F 2 fidelerinin 4 yada 8 kendi kendine köklenen bitkiler üretmek için kullanmışlardır. M. incognita ve M. javanica nın yumurtalarını bitkilerin aktarıldığı saksıların içine inokule etmişler ve yaklaşık 120 gün sonra bitkiler sökülmüş ve köklerdeki kök-ur nematod infeksiyonu ile ilişkili simptomları ve belirtileri incelemişlerdir. Nemared de M. incognita ya dayanıklı olduğu ileri sürülen her 2F 2 ailesindeki ayrım oranları 2 baskın gen tarafından (Mi ve 14

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Burcu ÖZBEK Mij) ve M. javanica ya dayanıklılık 1 baskın gen (Mij) tarafından kontrol edildiğini bildirmişlerdir. Böylece, Mij geninin hem M. incognita ya hemde M. javanica ya dayanıklılık sağladığını bildirmişlerdir. Di Vito ve ark., (2005), yaptıkları çalışmada 950 cm 3 lük saksılarda şeftali anaçlarının büyümesi üzerine kök-ur nematodu M. javanica nın İtalyan populasyonunun üzerine etkisini araştırmışlardır. In vitro da üretilmiş GF-677 anaçlarını saksılara transfer ettikten sonra, her bir saksıya 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 ve 1024 yumurta paketi ve 2. dönem larva ile inokule etmişlerdir. Nematoda tolerans limitini taze ağırlığını ve boyunu sırasıyla 0.85 ve 0.57 yumurta ve 2. dönem larva/cm 3 toprakta olduğunu bildirmişlerdir. Minimum bağıl verimlerinin, taze ağırlığı için Pi 64 yumurta ve 2.dönem larva/cm 3 toprakta 0.29 ve bitki boyu için Pi 32 yumurta ve 2.dönem larva/cm 3 toprakta 0.58 olduğunu rapor etmişlerdir. Maksimum nematod çoğalma oranının ise en küçük başlangıç populasyon oranının 6.2 katı olduğunu bildirmişlerdir. Prunus cinsinde kök-ur nematodlarına dayanıklılıktan sorumlu iki dominant gen, heterozigot Myrobalan eriklerinde (Euprunus bölümü, Prunophora alt cinsi) geniş spektrumlu Ma geni ve Nemared ve Shalil şeftalilerinde (Amygdalus alt cinsi) daha dar spektrumlu RMia geni bulunmaktadır (Esmenjaud ve ark., 2009). Bu genlere ait moleküler markörler kök-ur nematodlarına çok dayanıklı ve çok duyarlı hatların melezlenerek kromozom bağlantı haritalarının geliştirilmesiyle elde edilmiştir (Claverie ve ark., 2004a). Ma geni SCAR markörleri, SCAL19, (Lecouls ve ark., 1999), SCAFLP2 (Lecouls ve ark., 2004) ve SCAFLP4 (Claverie ve ark., 2004b) kullanılarak belirlenebilmektedir. Rmia geni hem M. arenaria hem de M. incognita ya dayanıklılığı sağlamaktadır (Claverie ve ark., 2004a; Dirlewanger ve ark., 2004). Ayrıca, toplu açılım analizleri (BSA) ve rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA (RAPD) analizleri Ma1 genine bağlı markörleri belirlemektedir (Lecouls ve ark., 1999). Bu amaçla OPAL ve OPA RAPD markör olarak kullanılmakatadır. Aynı zamanda SCAL ve SCAN dominant SCAR markörleri olarak Prunus anaçlarının markör yardımıyla seçiminde kullanılmaktadır. 15

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Burcu ÖZBEK 16

32 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK 3. MATERYAL VE METOD Bu çalışma yılları arasında Çukurova Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bitki Koruma Bölümü, Biyoteknoloji ve Nematoloji labaratuarında yürütülmüştür Materyal Bitki Materyali Bu çalışmada kök-ur nematodlarına karşı dayanıklılıklarını saptamak amacıyla in vitro koşullarda yetiştirilmiş sert çekirdekli meyve anaçlarından; erik ve kaysı anacı olarak kullanılan Myrobalan 29 klonu, şeftali ve nektarin anacı olarak Garnem, GF-677 ve Cadaman bitki materyalleri kullanılmıştır. Nematodların çoğaltılarak saf kültürlerinin elde edilmesinde domates bitkisi de bitki materyali olarak kullanılmıştır Nematod Materyali Bölgemizde sert çekirdekli meyve anaçlarında zararlı olan M. incognita ve M. javanica nın özellikle 2. dönem larvaları, anaçları infekte etmek ve dayanıklılık düzeylerini araştırmak amacıyla kullanılmıştır Metod Myrobalan 29 Klonu, Garnem, GF-677 ve Cadaman Anaçlarının In Vitro Sürgün Ucu Kültürü Yöntemi İle Çoğaltılması 17

33 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK Kültür Ortamları ve Hazırlanması Çalışmada Myrobalan 29 klonu için Murashige ve Skoog, (1962) makro ve mikro besin elementleri, vitaminleri ve Fe-NaEDTA (Ethylenediamine tetraacetic asid iron (lll) sodium salt), Garnem, GF-677 ve Cadaman genotipleri için modifiye MS [Murashige ve Skoog makro ve mikro elementleri (1962), 0.4 mg/l thiamine, % 3 Sakkaroz ve % 0.85 Sigma agar] (MST) (Çizelge 3.1) kompozisyonu sürgün geliştirme, çoğaltma ve köklendirme aşamalarında kullanılmıştır (Çizelge 3.1 ve 3.2) MST ve MS ortamlarının tüm bileşenleri ve büyüme düzenleyiciler eklendikten sonra, besi ortamının ph sı otoklav ile steril edilmeden önce 5.75 e ayarlanmış ve otoklavda 121 ºC de 20 dak. steril edilmiştir Eksplantların Hazırlanması Çalışmada kullandığımız Garnem, GF-677 ve Myrobalan 29 klonu anaçlarına ait sürgün uçları yıllarında Nisan-Ağustos aylarında taze sürgünlerden alınarak çoğaltılmıştır. Bu amaçla anaçlardan alınan taze sürgünler laboratuvara getirilmiş ve önce musluk suyunda yıkanmış, sonra yüzey sterilizasyonu amacıyla 30 sn % 70 lik etil alkolde, daha sonra iki kez % 5 lik ticari sodyum hipoklorit çözeltisinde 5 dakika tutularak sterilize edilmiştir. Sterilize edilen sürgün uçları steril su ile 4-5 kez yıkanarak sodyum hipokloritin uzaklaştırılması sağlanmış ve steril filtre kağıtlarında kurutulmuştur (Şekil 3.1). 18

34 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK Çizelge 3.1. Garnem, GF-677 ve Cadaman anaçlarının kardeşlenme ve köklendirme aşamasında kullanılan modifiye edilmiş MS (Murashige ve Skoog, 1962) (MST) kültür ortamı bileşenleri Makro Elementler (mg/l) KNO NH 4 NO CaCl MgSO 4.7H 2 O 370 KH 2 PO Mikro Elementler (mg/l) KI 0.83 H 3 BO MnSO 4.H 2 O 16.9 ZnSO 4.7H 2 O 8.6 Na 2 MoO 4.2H 2 O 0.25 CuSO 4.5H 2 O CoCl 2.6H 2 O Fe-NaEDTA Fe-EDDHA(köklendirme aşamasında) Vitaminler Myo-inostol 100 Thiamine-HCl 0.4 Büyümeyi Düzenleyiciler g/10 cc (mg/l) (mg/l) BAP GA IBA Karbonhidratlar (g/l) Sakkaroz 30 Diğer Maddeler (g/l) Sigma agar

35 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK Çizelge 3.2. Myrobalan 29 klonu için sürgün geliştirme, kardeşlenme ve köklendirme aşamasında kullanılan MS (Murashige ve Skoog, 1962) kültür ortamı bileşenleri Makro Elementler (mg/l) KNO NH 4 NO CaCl MgSO 4.7H 2 O 180 KH 2 PO Mikro Elementler (mg/l) KI 0.83 H 3 BO MnSO 4.H 2 O 16.9 ZnSO 4.7H 2 O 8.6 Na 2 MoO 4.2H 2 O 0.25 CuSO 4.5H 2 O CoCl 2.6H 2 O Fe-NaEDTA Fe-EDDHA(köklendirme aşamasında) Vitaminler Myo-inostol 100 MS Vitamin Büyümeyi Düzenleyiciler g/10 cc (mg/l) 10 ml/l (mg/l) BAP GA IBA Karbonhidratlar (g/l) Sakkaroz 30 Diğer Maddeler (g/l) Sigma agar

36 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK Şekil 3.1. In vitro klonal çoğaltım amacı ile kullanılan sürgün uçlarının sterilizasyonu (A), steril edilmiş sürgün uçlarının filtre kağıdında kurutulması (B) Sürgün uçlarının Kültüre Alınması Sterilize edilen sürgünlerden bir bistüri yardımı ile yaklaşık 3-5 mm büyüklüğünde kesilen Garnem ve GF-677 genotiplerine ait sürgün uçları, BAP nin 2 farklı konsantrasyonunda (1.0 ve 2.0 mg/l) ve BAP + GA 3 hormon kombinasyonları (1.0 mg/l BAP mg/l GA 3, 2.0 mg/l BAP mg/l GA 3 ) içeren katılaştırılmış MST ortamında, Cadaman genotipleri, BAP nin 2 farklı konsantrasyonunda (1.0 ve 2.0 mg/l) ve BAP + GA 3 hormon kombinasyonları (1.0 mg/l BAP mg/l GA 3, 1.0 mg/l BAP mg/l GA 3, 2.0 mg/l BAP mg/l GA 3, 2.0 mg/l BAP mg/l GA 3 ) içeren katılaştırılmış MST ortamında ve Myrobalan 29 klonu ise BAP nin 3 farklı konsantrasyonunda (0.5, 1.0 ve 2.0 mg/l) ve BAP + GA 3 kombinasyonları (0.5 mg/l BAP GA 3, 1.0 mg/l BAP mg/l GA 3, 2.0 mg/l BAP mg/l GA 3 ) içeren katılaştırılmış MS ortamında cam deney tüplerinde (12 ml) kültüre alınmıştır (Şekil 3.2). 21

37 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK Şekil 3.2. In vitro koşullarda Myrobalan (A) ve GF-677 (B) anaçları sürgün uçlarının 1.0 mg/l BAP mg/l GA 3 hormon kombinasyonu içeren MS ve MST ortamlarında kültüre alınması Mikro Çoğaltma ve Köklendirme Mikro çoğaltım amacı ile geliştirilen sürgünler yan sürgünlerinden ayrıştırılarak her bir macenta kutusunda en az 4, en fazla 9 bitki olacak şekilde alt kültürlere alınmıştır (Şekil 3.3). Yan sürgünlerin değerlendirmeleri sürgünlerin kültüre alınmasından 6-8 hafta sonra yapılmıştır. Köklendirme için yeterli sayıda sürgün elde edilinceye kadar alt kültüre alma işlemi devam ettirilmiştir. Köklendirme amacıyla farklı konsantrasyon ve kombinasyonlarda IBA (Indol 3- bütrik asit) ve Fe-EDDHA (Etilen diamin di hidroksifenil asetik asit demir tuzu: iron salt of ethylenediamine di-o-hydroxyphenylacetic acid) modifiye MST ve MS ortamında kullanılmıştır. Sürgün uçlarının kültüre alınmasından yaklaşık 8 hafta sonra gelişen sürgünler IBA nın iki farklı konsantrasyonlarını (1.0, 1.5 mg/l) ve Fe-EDDHA nın (50, 100, 500 ve 1000 mg/l) konsantrasyonlarını içeren MST ve MS ortamlarına aktarılarak kök oluşumları teşvik edilmiştir. Çoğaltılan sürgünlerin kök gelişim değerlendirmeleri sürgünlerin kültüre alınmasından 4-6 hafta sonra yapılmıştır. Köklenen bitkiler, içinde 0.5 litre hazır torf (potgrond P) bulunan 20 cm çapındaki plastik saksılara aktarılıp, naylon poşet ile kapatılmış ve 22

38 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK 2500 lux ışıklandırma, 26±2 ºC sıcaklıktaki kontrollü iklim odasında adaptasyonları sağlanmıştır (Şekil 3.4). Şekil 3.3. In vitro sürgün ucu kültürü yöntemiyle elde edilen farklı anaçlara ait sürgünlerin mikro çoğaltımı. 2.0 mg/l BAP içeren MST ortamında GF-677 anacı sürgün uçlarından yan sürgünlerin gelişimi (A) 1.0 mg/l BAP mg/l GA 3 içeren MS ortamında Myrobalan anaç sürgün ucundan yan sürgünlerin gelişimi (B) Şekil 3.4. In vitro sürgün ucu kültürü yöntemiyle elde edilen bitkilerin toprağa adaptasyonu. Transpirasyonu engellemek amacı ile bitkilerin plastik torbalarla örtülmesi (A), Toprağa adaptasyonu sağlanmış Myrobalan 29 anacı (B) 23

39 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK Kök-Ur Nematodlarının Yetiştirilmesi Anaçların nematod ile inokulasyonunda M. incognita ırk 2 ve M. javanica nın ikinci dönem larvaları kullanılmıştır. Her iki türün kitle üretimi Çukurova Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bitki Koruma Bölümü, Nematoloji laboratuvarı klima odasında yapılmıştır. Sürekli çoğaltılmakta olan kültürlerden mevcut populasyonun devamlılığını sağlamak için 2 ay aralıklarla kültürler yenilenmiştir. Kök-ur nematodunun üretimi elde mevcut bulunan ve nematodun iyi geliştiği Rio Grande domates çeşidi üzerinde yapılmıştır (Şekil 3.5). Populasyon devamlılığını sağlamak amacıyla nematod ile bulaşık fideler sökülüp, kökleri çeşme suyunda yıkanıp kurutma kağıdına alınmıştır. Denemede kullanılan yaklaşık 15 cm boyundaki domates fideleri 12 cm çapında 0.5 lt hacmindeki saksılara şaşırtılmıştır. Denemede 1:1 kum kil karışımından olan otoklav edilmiş toprak kullanılmış ve her saksıya bir domates fidesi şaşırtılmıştır. Şaşırtılan fidelerin kök bölgesi yakınına birer delik açılıp daha önceden sökülmüş ve çeşme suyunda yıkanmış M. incognita ve M. javanica ile bulaşık kökler küçük parçacıklara kesilerek açılan deliklere konulmuştur. Daha sonra açılan delikler tekrar steril edilmiş toprak ile kapatılmıştır. Kök-ur nematodlarının gelişme dönemini sıcaklığa ve kültür bitkisi çeşidine bağlı olarak 4-8 hafta arasında tamamlamaları (Netscher ve Sikora, 1990) nedeniyle nematod ile bulaşık bitkiler en az 8 hafta 26± 3 ºC de % 60 ± 10 orantılı neme sahip klima odasında bekletilmiş ve 8 hafta sonunda fideler sökülüp kökleri yıkanmıştır. 24

40 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK Şekil 3.5. Meloidogyne incognita ırk 2 ve Meloidogyne javanica ile infekteli Rio Grande domates bitkisi (A) bitki köklerindeki kök-ur nematodlarının oluşturduğu galler (B) Nematodların Elde Edilmesi Rio Grande Domates bitkisinin köklerinde bulunan kök-ur nematodlarının dişi bireyleri ve 2. dönem larvalarının elde edilmesi için 2 farklı yöntem kullanılmıştır Baermann Huni Yöntemi Rodriguez ve ark. (1981), Pratylenchus, Meloidogyne ve Heterodera ile yaptıkları karşılaştırmalarda en yüksek nematod yoğunluğunu geliştirilmiş Baermann huni yöntemi ile elde ettiklerini bildirmişlerdir. Baermann huni yönteminin geliştirilmiş şekli olan Petri yöntemi, hareketli nematod olan M. incognita ve M. javanica nın elde edilmesinde en iyi sonucu verdiği için domates fidesinin köklerinde bulunan kök-ur nematodlarının hareketli olan 2. dönem larvalarını elde etmek amacı ile çalışmaların tamamında bu yöntem tercih edilmiştir (Hooper, 1986). Elek ile petri arasında bir yükseklik sağlamak için petri kutularının tabanına 0.5 cm yüksekliğinde plastik çubuklar yerleştirilmiştir. Eleklerin yüzeyine bir çift filtre kağıdı konulup M. incognita ve M. javanica ile bulaşık kökler 3 cm kesilip filtre kağıdının üzerine her bir nematod türü ile bulaşık fideler ayrı yerleştirilmiştir (Şekil 3.6). Bu şekilde 48 saat bekletilip, köklerde bulunan nematodların petri kutusunda bulunan suya geçmesi 25

41 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK sağlanmıştır. Bu süre sonunda petrilerin içerisinde nematodların bulunduğu su 100 ml lik mezürlere doldurularak nematodlar suyun tabanına çökünceye kadar 4-6 saat bekletilmiştir. Daha sonra mezürdeki su üstten alınarak nematodların 1 ml lik suda kalması sağlanmıştır. Nematod sayımları sterio mikroskop (Leica, 10X) ile 1 ml su içerisinde kalan nematodlardan yapılmıştır. Şekil 3.6. Nematodların elde edilmesinde kullanılan geliştirilmiş Baermann huni yöntemi Nematodların Köklerden Doğrudan Elde Edilmesi Domates bitkisi köklerinde kök-ur nematodlarının meydana getirdiği urlardan yumurta paketi sterio mikroskop altında, bir iğne ve bistüri yardımıyla zedelemeden çıkartılıp geliştirilmiş Baermann huni yöntemi ile 2. dönem larvalar elde edilmiştir (Şekil 3.7 A ve B). 26

42 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK Şekil 3.7. Domates bitkisi köklerinden çıkartılmış bitki dokusu içinde yumurta paketi (A) ve larvaların Baermann huni yöntemi ile elde edilmesi (B) In Vitro Sürgün Ucu Kültürü Yöntemi ile Elde Edilen Anaçların Kök- Ur Nematodlarına Karşı Dayanıklılığının Araştırılması Deneme klima odasında tesadüf parselleri deneme desenine göre 4 tekerrürlü olacak şekilde saksılarda yürütülmüştür. In vitro da yetiştirilmiş cm boyunda toprağa adaptasyonu sağlamış olan Garnem, Cadaman ve Myrobalan 29 klon anaçları 12 cm çapında, 0.5 lt hacminde otoklav edilmiş 1:1 oranında kum kil karışımı toprak içeren saksılara şaşırtılmıştır. Saksılara aktarılmış anaçların kök bölgesinin yakınında bir delik açılmış ve M. incognita ve M. javanica nın 1000 adet 2. dönem larvaları her bir anaca ayrı ayrı 4 tekerrürlü olacak şekilde pipet yardımıyla inokule edilmiştir. İnokulasyondan sonra açılan delikler tekrar steril edilmiş toprak ile kapatılmıştır. Kök-ur nematodlarının gelişme dönemini sıcaklığa ve kültür bitkisi çeşidine bağlı olarak 6-8 hafta arasında tamamlamaları (Netscher ve Sikora, 1990) nedeniyle nematod ile bulaştırılan anaçlar 12 hafta 26±3 ºC de % 60±10 orantılı neme sahip klima odasında bekletilmiştir. 12 haftadan sonra anaçlar sökülüp bitkilerin hem kök sistemi hem de toprak analizleri yapılarak değerlendirme yapılmıştır. Topraktaki nematod varlığı analizi geliştirilmiş Baermann-huni yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Denemeye alınan anaçların dayanıklılık veya duyarlılık özelliklerinin ortaya konması yalnızca gal 27

43 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK veya ur oluşumuna göre değil, aynı zamanda kök-ur nematodlarının yumurta oluşturmasına bağlıdır. Kök-ur nematodunun beslenmesi sonucu bir çeşidin köklerinde ur oluşabilir, ancak iyi bir konukçu olmadığı için kök-ur nematodu yumurta üretemez. Bu nedenle bu denemede ur indeksi yapılan köklerde Hartman ve Sasser (1985) in 0-5 skalasına göre değerlendirme yapılarak köklerde nematod gelişimi olup, olmadığı dikkate alınmıştır. İndekse göre köklerde 0-2 skala değeri bulunan bitkiler dayanıklı, 3-5 skala değeri alan bitkiler ise duyarlı olarak değerlendirilmiştir. 0-5 Yumurta kesesi sayısı veya gal sayısı indeksi; 0: Kökte yumurta kesesi ve gal oluşumu yok. 1: Kökte 1-2 yumurta kesesi ve gal oluşumu var. 2: Kökte 3-10 yumurta kesesi ve gal oluşumu var. 3: Kökte yumurta kesesi ve gal oluşumu var. 4: Kökte yumurta kesesi ve gal oluşumu var. 5: Kökte 100 den fazla yumurta kesesi ve gal oluşumu var. 0-2 skala değeri (-), 3-5 skala değeri (+) Moleküler Çalışmalar DNA İzolasyonu Ahrens and Seemüller (1992) tarafından tanımlanan DNA izolasyonu modifiye edilerek kullanılmıştır. Genç yapraklardan DNA izolasyonu aşağıdaki basamaklara göre gerçekleştirilmiştir. a) 1 g yaprak örneği 4 ml CTAB tampon çözelti (2 % w/v cetyltrimethylammonium bromide, 1.4 M NaCl, 0.2 % 2-mercaptoethanol, 20 mm EDTA, 100 mm Tris-Base, 2 % polyvinylpyrrolydone (PVP), ph 8.0) ile havanda ezilerek homojen duruma getirilmiştir. b) Ezilen yaprak ekstraktının 0.5 ml si 1.5 ml lik ependorf tüplere konularak ve 65 C de 30 dak. inkübe edilmiştir. 28

44 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK c) Elde edilen bitki doku ekstraktına eşit miktarda kloroform-izoamil alkol (24:1) eklenerek, 1 dak. vorteks ile karıştırılmış ve rpm de 10 dak. santrüfüj edilmiştir. d) Santrüfüjden sonra üstte biriken sıvı kısım alınmış ve yeni ependorf tüpe aktarılmış ve bu şekilde aynı işlem tekrar edilmiştir. e) Ependorf tüpün üst kısmında nükleik asiti içeren sıvı kısım yeni ependorf tüpe aktarılmış üzerine eşit miktarda soğuk isopropanol ilave edilmiş ve çökelmesi için -20 C de 1 gece bekletilmiştir. f) Ertesi gün DNA ekstraktlatını içeren ependorflar rpm de 15 dak. santrifüj edilmiştir. g) Ependorf tüpün alt kısmında biriken tortuya 250 µl % 98 lik etil alkol (EtOH) eklenerek sulandırılmış ve -20 C de 1 saat inkübe edilmiştir. h) Tüpler rpm de 15 dak. santrifüj edilerek, pellet soğutulmuş, % 70 lik EtOH ile yıkanmış ve oda sıcaklığında kurutulmuştur. i) Kurutulan pellet 50 µl steril saf su ile çözülerek daha sonra kullanılmak üzere -20 C de dondurucuda saklanmıştır PCR Analizi Kök-ur nematoduna karşı dayanıklılığı sağlayan Ma 1 allel gen markör primerleri olarak 2 adet ileri primer, SCAL19JF1 (5 - TTAGGTGCAGGAATACCA-3 ), SCAL19JF2 (5 - CAAATTGATCACCAATGATAC-3 ) ve bir adet geri primer SCAL19-2 (5 - CATTGGAGAAGATTGGCCC-3 ) kullanılmıştır. PCR analizi her bir örnek için toplam 25 µl hacimde gerçekleştirilmiş olup, PCR kokteyli 10 µm primerler, 200 µm dntp, 2 mm MgCI 2, 1/10 hacim 10X tampon çözelti, 1 µl bitki DNA sı, 1 unite Taq polimeraz ve 25 µl ye tamamlayacak kadar steril miliqh2o içermektedir. Yaklaşık 700 bç PCR sentez ürünü için başlangıçta 94 ºC de 3 dak. ve sonraki 35 döngü için 94 ºC de 45 sn, 55 ºC de 45 sn, 72 ºC de 1 dak. ve son bitiş döngüsü 72 ºC de 5 dak. olarak ayarlanmıştır. 29

45 3. MATERYAL VE METOD Burcu ÖZBEK Çizelge 3.3. PCR kokteylinin hazırlanışı PCR Kokteyli 25 µl Hacim için 10X Buffer 2,5 µl MgCI2 2,5 mm 2,5 µl dntp 2 mm 2,5 µl Scal 19JF1 10uM 0,25 µl Scal 19JF2 10uM 0,25 µl Scal uM 0,25 µl Taq Polymerase 1U (5U/1ul) 0,2 µl Şablon DNA (anaç bitkiden) 1 µl sdh2o 15,55 µl TOPLAM 25 µl Agaroz Jel Elektroforez Agaroz jel 1xTAE [(Trizma, Glacial acetic acid, EDTA) (EK 1)] elektroforez tampon çözeltisi kullanılarak hazırlanmıştır. % 2 lik agaroz (Tip I, SIGMA) içeren jeller 1xTAE içerisinde mikrodalga fırında eritilmiş ve 60 C ye kadar soğutulduktan sonra iki tarafı kapalı taraklı jel kalıbına dökülmüştür. Agaroz katılaştıktan sonra tarak çıkartılmış, jel kalıbı aynı tampon çözeltiyi içeren elektroforez tankına yerleştirilmiştir. DNA örnekleri 1/10 yükleme tampon çözeltisi (% 25 bromofenol mavisi ve % 25 Fikol ( )) içerisinde bir pipet yardımı ile çukurlara yerleştirilerek 50 Voltta 1.5 saat elektroforez edilmiştir. Bu şekilde (-) yüklü DNA nın (+) yüklü anota doğru ilerlemesi sağlanmış ve bromofenol mavi boya DNA dan belirli bir mesafe uzaklaştıktan sonra elektroforez tamamlanmıştır. Daha sonra jel 0.5 µg/ml etidyum bromide (EK 2) ile boyanan PCR ile çoğaltılmış DNA örnekleri 260 nm dalga boyunda bir UV transillimünatör (Vilber Lourmat) üzerinde görülebilir duruma getirtilmiş ve dijital fotoğrafı çekilmiştir. 30

46 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. In vitro Sürgün Ucu ile Yan Sürgünlerin Çoğaltılması Sürgün uçlarından yan sürgünlerin çoğaltılması aşamasında farklı konsantrasyonlarda kullanılan BAP nin ve BAP+GA 3 hormon kombinasyonlarının GF-677, Garnem, Cadaman ve Myrobalan 29 klonunun kardeşlenme sayıları üzerine etkileri Şekil 4.1, 4.2, 4.3 ve 4.4 de verilmiştir. Şekil 4.1. BAP nin iki farklı konsantrasyonunun ve BAP+GA 3 hormon kombinasyonlarının MST ortamında kültüre alınan GF-677 anacında kardeşlenme sayısı ve sürgün uzunluğu üzerine etkileri Denemede kullanılan farklı konsantrasyonlardaki hormonlar içerisinde en iyi kardeşlenme sayısı (1.8 sürgün/eksplant) 2.0 mg/l BAP içeren ortamdan elde edilmiştir (Şekil 4.1). Bunu hormon içermeyen MST (1.2 sürgün/eksplant), 1.0 mg/l BAP (1.06 sürgün/eksplant), 2.0 mg/l BAP+0.05 mg/l GA 3 (1 sürgün/eksplant) ve 1.0 mg/l BAP+0.05 mg/l GA 3 (0.8 sürgün/eksplant) içeren ortamlar izlemiştir. Kullanılan ortamlar içerisinde sürgün boyu en iyi (3,5 cm/sürgün) GA 3 içeren ortamdan elde edilmiştir (2.0 mg/l BAP mg/l GA 3 ). Elde ettiğimiz bulguların 31

47 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK aksine, Silveira ve ark., (2001) GxN22, GF-677 ve Myrobalan erik anaçlarını BAP nin dört farklı konsantrasyonunu (0.1, 0.3, 0.5 ve 0.7 mg/l) içeren iki MS ve ¾MS ortamında test etmişlerdir. Denemeye aldıkları anaçlar içerisinde GF-677 anacının mikro çoğaltımda iyi sonuçlar vermediğini bildirmişlerdir. Kamali ve ark., (2001) GF-677 genotipinin mikro çoğaltımında, MS ve modifiye Knop ortamında 6 farklı BA konsantrasyonlarını (0, 0.1, 0.4, 0.7, 1.0 ve 2.0 mg/l) denemişler ve çoğaltım için en uygun en uygun besi ortamının modifiye edilmiş Knop ortamına 1 mg/l BA ilavesinin verdiğini saptamışlardır. Bununla birlikte bu ortamda sürgünlerde camlaşma olduğunu gözlemlemişlerdir. MS ortamında ise sürgünlerin yapraklarında dökülme olduğunu ve öldüğünü bildirmişler. Demirkök, (2006) GF-677 anacının sürgün ucu yöntemiyle in vitro klonal mikroçoğaltımını yaptığı çalışmasında en yüksek kardeşlenmeyi (0.88 sürgün/eksplant) MST ortamında 1.5 mg/l BA içeren ortamdan elde etmiştir. Yaptığımız çalışmada ise en iyi çoğaltma değerleri MST ortamında 2.0 mg/l BAP içeren ortamdan alınmıştır. Kullanılan ortamda sürgünlerin yapraklarında dökülme olmadığı gibi camlaşma da gözlenmemiştir (Şekil 4.2). Şekil mg/l BAP içeren MST ortamında kültüre alınan GF-677 anacı sürgün uçlarından yan sürgünlerin çoğaltılması Garnem sürgün ucundan elde edilen değerler Şekil 4.3 de verilmiştir. 32

48 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK Şekil 4.3. BAP nin iki farklı konsantrasyonunun ve BAP+GA 3 hormon kombinasyonlarının MST ortamında kültüre alınan Garnem anacında kardeşlenme sayısı ve sürgün uzunluğu üzerine etkileri Garnem (GN) anacının en iyi kardeşlenme sayısı (3.8 sürgün/eksplant) 2.0 mg/l BAP içeren MST ortamından elde edilmiştir (Şekil 4.3). Bunu sırasıyla 1.0 mg/l BAP (1.8 sürgün/eksplant), 2.0 mg/l BAP mg/l GA 3 (1.2 sürgün/eksplant), 1.0 mg/l BAP mg/l GA 3 (0.8 sürgün/eksplant) ve kontrol (0.6 sürgün/eksplant) ortamları izlemektedir. Sürgün boyundaki en iyi artış da (3cm/sürgün) 2.0 mg/l BAP içeren ortamdan elde edilmiştir. Arıcı, (2008) yaptığı çalışmasında Garnem anacının en fazla sürgün oluşumunu, (1.88 sürgün/eksplant) MS mg/l BAP mg/l NAA mg/l GA 3 içeren ortamda gözlemlemiştir. Silveira ve ark., (2001) çalışmalarında MS ve ¾ MS ortamında 4 farklı BAP konsantrasyonunu (0.1, 0.3, 0.5 ve 0.7 mg/l) test etmiş, Garnem anacının 0.7 mg/l BAP içeren ¾ MS ortamında iyi sonuçlar verdiğini bildirmiş, ayrıca MS ortamında BAP konsantrasyonunun arttırılmasıyla sürgün uzunluğunda da azalma meydana geldiğini rapor etmiştir. Aynı şekilde bazı araştırıcılarda yaptıkları çalışmalarda BAP konsantrasyonunun yüksek olmasının yan sürgün artışını azalttığını, sürgünlerde nekrozlar meydana geldiğini ve kallus oluşumunu arttırdığını rapor etmişlerdir (Hu ve Wang, 1983; Ahmad ve ark., 2003). Elde ettiğimiz bulgular ise MST ortamının 2.0 mg/l BAP konsantrasyonunun 33

49 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK yan sürgün oluşumu ve sürgün uzunluğunda iyi sonuç verdiğini, sürgünlerin morfolojik yapılarının iyi olduğu ve kallus benzeri yapıların oluşmadığı gözlemlenmiştir (Şekil 4.4). Bu durumda, büyüme düzenleyici hormonların etkisinin, kullanılan besi ortamı ile değişebileceği sonucu ortaya çıkabilmektedir (McCown ve Sellmer, 1987). Şekil 4.4. MST ortamında kültüre alınan Garnem anacı sürgünlerinin genel görünümü Şekil 4.5 de Cadaman anacının en iyi yan sürgün oluşumu (4.5 sürgün/eksplant) 2.0 mg/l BAP içeren MST ortamından elde edilmiştir (Şekil 4.7). 34

50 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK Şekil 4.5. BAP nin iki farklı konsantrasyonunun ve BAP+GA 3 hormon kombinasyonlarının MST ortamında kültüre alınan Cadaman anacında kardeşlenme sayısı ve sürgün uzunluğu üzerine etkileri Bunu sırasıyla 2.0 mg/l BAP mg/l GA 3 (1.8 sürgün/eksplant), 1 mg/l BAP mg/l GA 3 (1.5 sürgün/eksplant), 1 mg/l BAP mg/l GA 3 (1 sürgün/eksplant), 2.0 mg/l BAP mg/l GA 3 (1 sürgün/eksplant) ve kontrol (0.8 sürgün/eksplant) ortamları izlemektedir. 1.0 mg/l BAP içeren MST ortamında kültüre alınan Cadaman anacında herhangi bir yan sürgün oluşumu gözlenmemiştir. Couto ve ark., (2004) maksimum sürgün sayısını (4.6 sürgün/eksplant) 3.1 µm BAP içeren MS ortamından elde etmişlerdir. 35

51 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK Şekil 4.6. BAP nin üç farklı konsantrasyonunun ve BAP+GA 3 hormon kombinasyonlarının MS ortamında kültüre alınan Myrobalan 29 klonunda kardeşlenme sayısı ve sürgün uzunluğu üzerine etkileri En iyi yan sürgün oluşumu (7 sürgün/eksplant) ve sürgün boyu (2.50 cm/sürgün) 1.0 mg/l BAP içeren MS ortamından elde edilmiştir (Şekil 4.6). Yan sürgün oluşumunu sırasıyla 0.5 mg/l BAP (5 sürgün/eksplant), 1.0 mg/l BAP mg/l GA 3 (4 sürgün/eksplant), 0.5 mg/l BAP GA 3 (3 sürgün/eksplant) ve 2.0 mg/l BAP ile 2.0 mg/l BAP GA 3 (2 sürgün/eksplant) içeren ortamlardan elde edilmiştir. Arıcı, (2008) çoğaltma aşamasında kullandığı farklı hormon konsantrasyonları ve kombinasyonlarında en iyi yan sürgün oluşumunu (5.38 sürgün/eksplant) 1.0 mg/l BAP mg/l NAA içeren MS ortamından elde etmiştir. Yapılan bir diğer çalışmada araştırıcılar MS ve ¾MS ortamında 4 farklı BAP konsantrasyonunu (0.1, 0.3, 0.5 ve 0.7 mg/l) test etmişler, denemeye aldıkları besin ortamları içerisinde 0.5 mg/l BAP içeren ¾MS ortamının daha iyi sonuç verdiğini ve test ettikleri iki MS konsantrasyonunda da BAP konsantrasyonunun artmasıyla sürgün uzunluğunun azaldığını gözlemlemişler (Silveira ve ark., 2001). Yaptığımız çalışmada ise en iyi çoğaltma değerleri sırasıyla 1.0 mg/l BAP ve 0.5 mg/l BAP içeren MS ortamından elde edilmiştir (Şekil 4.7). Rodrigues ve ark., (2003) in vitro 36

52 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK koşullarda çoğaltılması için 9 farklı Prunus anaçlarının üzerinde yaptıkları çalışmada çoğaltma ortamında en yüksek gelişme ve kardeşlenme oranını Myrobalan 29 klonunda 4.98 sürgün/eksplant olarak 5.5 g/l agar içeren ¾ MS ortamından almışlardır. Şekil 4.7. MS ve MST ortamında kültüre alınan Cadaman (A) ve Myrobalan anacı (B) sürgünlerinin genel görünümü Yapılan bu çalışmada, GF-677, Garnem, Cadaman ve Myrobalan 29 gibi dört farklı sert çekirdekli meyve anacı sürgün uçları BAP nin farklı konsantrasyonlarını içeren kültür ortamında başarılı bir şekilde çoğaltılmıştır. Ortam içerisine ilave edilen BAP in denenen tüm farklı konsantrasyonları yan sürgünlerin oluşumunu ve gelişmesini farklı oranlarda teşvik etmiştir. Daha önce farklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda da ortam içerisindeki BAP hormonunun sürgün gelişimini başarılı bir şekilde teşvik ettiği rapor edilmiştir (Muna ve ark., 1999, Pruski ve ark., 2000; Kamali ve ark., 2001; Durkovic, 2006; Sedlak ve Paprstein, 2008). Kullanılan anaçlar genel olarak değerlendirildiğinde GF-677, Garnem ve Cadaman anaçları 2.0 mg/l BAP içeren MST ortamında en iyi yan sürgün oluşumunu sağlanarak, Myrobalan 29 klonu 1.0 mg/l BAP içeren MS ortamında en iyi yan sürgün sayısını vermiştir. Çalışmada kullanılan anaçların, kullanılan besi ortamı ile hormon konsantrasyon ve kombinasyonlarına gösterdikleri tepkiler arasındaki farklılıklar, Battistini ve Paoli (2002) nin çalışmalarında belirttikleri gibi klonların farklı olmasından kaynaklanmaktadır. Ayrıca şeftali anaçlarında yaptıkları çalışmalarda 37

53 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK önemli farklılıklar tespit etmişler ve bunların genotipten ve genotiplerin adaptasyon kabiliyetlerinin ayrı olmasından kaynaklandığını ve klona özel çalışmaların yapılması gerektiğini bildirmişlerdir In vitro Koşullarda Elde Edilen Sürgünlerin Köklendirilmesi GF-677, Garnem, Cadaman ve Myrobalan anaçlarının köklendirilmesi çalışmalarında MST ve ½MST ortamına farklı konsantrasyonlarda IBA (0.5, 1.0 ve 1.5 mg/l) ve mg/l Fe-EDTA ilavesiyle köklendirme elde edilmeye çalışılmış fakat Fe-NaEDTA nın köklendirmeyi olumsuz etkilediği ve kullanılan 4 anaçta da kök oluşturmadığı gözlenmiştir. Köklenme elde edilemediğinden dolayı sonuçlar grafik olarak sunulmamıştır. MST temel besin ortamına eklenen farklı IBA ve Fe- EDDHA dozlarının sürgünlerde kök oluşumları üzerine etkileri incelenmiştir. Elde edilen bulgular Şekil 4.8, 4.9 ve 4.10 da verilmiştir. Şekil 4.8. MST ortamında kültüre alınan GF-677 anacı köklenme yüzdesi ve ortalama kök sayısı üzerine farklı IBA ve Fe-EDDHA konsantrasyon ve kombinasyonlarının etkisi En yüksek köklenme oranı % 50 olarak 1.5 mg/l IBA mg/l Fe- EDDHA içeren ortamdan elde edilirken, bunu sırasıyla % 44.4 oranında 1.5 mg/l 38

54 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK IBA mg/l Fe-EDDHA ve % 40 oranında 1.5 mg/l IBA + 50 mg/l Fe-EDDHA içeren ortamlar takip etmiştir (Şekil 4.8). 1.5 mg/l IBA ya farklı konsantrasyonlarda Fe-EDDHA ilavesi 1.0 mg/l IBA ya aynı oranlarda verilen Fe-EDDHA ilavesi sonuçları ile karşılaştırdığımızda en yüksek köklenme oranları 1.5 mg/l IBA içeren ortamlardan elde edilmiştir. Ayrıca sürgün başına düşen ortalama kök sayısı da en yüksek (4 kök/sürgün) 1.5 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA içeren ortamdan elde edilmiş olup, bunu (3 kök/sürgün) 1.5 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA içeren ortam izlemiştir. Hormon ve Fe-EDDHA içermeyen kontrol ortamında ise köklenme elde edilememiştir. Bazı araştırıcılarda benzer sonuçları almıştır. Demirkök, (2006) ün bu çalışma kapsamında kullanılan MST ortamı üzerinden Fe-EDTA kullanarak yaptığı çalışmasında kullandığı genotipleri kıyasladığında en yüksek köklenme oranını % ile GF-677 anaç genotiplerinden elde etmiş, IBA içermeyen ortamda köklenme elde edememiştir. Fotopoulos ve Sotiropoulos un (2005) yaptığı köklendirme çalışmasında da benzer sonuçlar alınmış ve araştırıcılar Fe-EDTA içeren MS ortamında yürüttükleri çalışmalarında oksin içermeyen ortamda köklenme elde edemediklerini belirtmişlerdir. Ahmad ve ark. (2003) nın GF-677 anaç genotipinde en iyi köklenme sonuçlarını Fe-EDTA ilaveli 3 mg/l IBA içeren 1/2 MS ortamından almışlardır. IBA içermeyen ortamda köklenme olmamıştır. Yaptığımız çalışmada ise GF-677 genotipinin köklendirme aşamasında kullanılan ortamların sonuçları genel olarak değerlendirildiğinde % köklenme oranı elde edilmiştir. Ayrıca GF-677 anacının en yüksek köklenme oranı olan % 50 değeri 1.5 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA içeren ortamdan alınmıştır. Yine araştırıcıların bulduğu sonuçların aksine IBA içermeyen MST ortamında da Fe-EDDHA ilavesiyle % 30 oranında köklenme elde edilmiştir. Diğer taraftan demir, Fe-EDTA şelat formunda verildiğinde kontrol dahil farklı IBA konsantrasyonlarının (0.5, 1.0 ve 1.5 mg/l) hiçbirisinde GF-677 sürgünlerinden kök gelişimi teşvik edilememiştir. Yaptığımız çalışmada Fe-EDDHA nın köklendirmede olumlu etkisini destekleyen bir çalışmayı yapan, Molassiotis ve ark., (2003) GF-677 anacının in vitro köklendirilmesi üzerine Fe-EDTA ve Fe-EDDHA ilavesinin etkilerini incelemişler ve Fe-EDDHA ilave edilmiş ortamdaki eksplantlarda % 100 köklenme elde ederlerken Fe-EDTA içeren ortamlardaki eksplantlardan hiçbir kök elde 39

55 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK edememişlerdir. Demir, bitki hücresinde DNA sentezi, klorofil ve hormon oluşumu gibi biyokimyasal olayların temel taşını oluşturduğundan bitki doku kültüründe mutlak kullanılmaları gereken esensiyal elementlerdendir. Kök oluşumundaki asıl rolü tam olarak bilinememekle birlikte, Hewitt ve Smith, (1974) hücre bölünmesini ve kök ucu meristemlerinin demir noksanlığına çok duyarlı olduklarını bildirmişlerdir. Dunlap ve Robacker, (1988); Stasinopoulus ve Hangarter, (1990) Fe- EDTA nın fotodinamik aktivitesi ile bitki doku kültürü ortamındaki IAA i yıkarak bitki kök hücrelerinde bölünmesi dolayısı ile büyümeyi engellediğini düşünmektedirler. Hangarter ve Stasinopoulus, (1991) Arabidopsis köklerinde yaptıkları çalışmada Fe-EDTA nın MS ortamında fotokimyasal olarak yıkıma uğradığını ve bitki gelişimine karşı toksik bir bileşik olan formaldehite dönüştüğünü göstermişlerdir. Mollasitois ve ark., (2003); Antonopoulou ve ark., (2007) nın GF- 677 nin köklendirilmesi amacıyla, Fe-EDDHA ilave edilen ortamlardaki sürgünlerde oldukça yüksek oranda köklenme elde ederlerken, Fe-EDTA içeren ortamda bulunan sürgünlerde hiçbir kök oluşumuna rastlamamışlardır. Nitekim bu araştırıcıların elde ettikleri sonuçlar bizim elde ettiğimiz sonuçlar ile birebir uyuşmaktadır. Antonopoulou ve ark., (2007) nın GF-677 anacının köklendirilmesinde Fe- EDDHA nın 4 farklı konsantrasyonunun etkisini araştırmışlar ve Fe-EDDHA nın denenen tüm konsantrasyonlarının 4 haftada sürgünlerde köklenmeyi teşvik ettiğini, özellikle yüksek konsantrasyonun hem kök uzunluğu hem de kök sayısında en etkili olduğunu saptamışlardır. Ancak yüksek konsantrasyondaki Fe-EDDHA nın aynı zamanda deneme süresi sonunda klorosise de neden olduğunu gözlemlemişlerdir. Denemelerimizde de özellikle Myrobalan 29 klonu uzun süre Fe-EDDHA içeren ortamda bekletildiğinde yapraklarda nekrozlar gözlenmiştir. 40

56 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK Şekil 4.9. MST ortamında kültüre alınan Garnem anacı köklenme yüzdesi ve ortalama kök sayısı üzerine farklı IBA ve Fe-EDDHA konsantrasyon ve kombinasyonlarının etkisi MST ortamında kültüre alınan Garnem anacının köklenme oranını ve kök sayısını değerlendirdiğimizde, en yüksek köklenme oranı (% 66.6) ve sürgün başına düşen en yüksek kök sayısı (7 kök/sürgün) 1.5 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA içeren ortamdan alınmıştır (Şekil 4.9). Bunu % 60 köklenme oranı ile 1,5 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA, % köklenme oranı 1.0 mg/l IBA mg/l Fe- EDDHA ve % 35.5 köklenme oranı ile 1.0 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA içeren ortamlar takip etmektedir. Sadece 50 mg/l Fe-EDDHA içeren MST ortamında da % 35 oranında köklenme elde edilmiştir. Garnem anacında Fe-EDDHA nın in vitro köklenme üzerine yapılmış herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. 41

57 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK Şekil MST ortamında kültüre alınan Cadaman anacı köklenme yüzdesi ve ortalama kök sayısı üzerine farklı IBA ve Fe-EDDHA konsantrasyon ve kombinasyonlarının etkisi Şekil 4.10 da Cadaman anacının en yüksek köklenme oranı (% 50) ve sürgün başına düşen ortalama kök sayısı (4,5 kök/sürgün) 1.5 mg/l IBA mg/l Fe- EDDHA içeren ortamdan elde edilmiştir. Bunu 1.0 mg/l IBA mg/l Fe- EDDHA, 1.5 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA ile sadece 50 mg/l Fe-EDDHA ve 1 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA içeren ortamlarda sırasıyla köklenme oranı (% 40, % 35, % 35, % 33.3) ve sürgün başına düşen ortalama kök sayıları (4, 3.3, 3, 3.5) elde edilmiştir. Cadaman anacının in vitro köklendirilmesi üzerine daha önceden yapılmış bir çalışmaya rastlanmamıştır. Yapılan bu çalışmada Garnem, GF-677, Cadaman ve Myrobalan 29 klonunda bitki başına düşen köklenme oranları incelenmiş, Fe-EDDHA içeren MS ve MST ortamlarında farklı düzeylerde köklenme oranları elde edilmiştir. En iyi köklenme yüzdesi Garnem, GF-677 ve Cadaman anacında 1.5 mg/l IBA konsantrasyonunda MST ortamından elde edilmiştir. Myrobalan 29 klonunun köklenmesi üzerine deneme kurulmamış olup iyi köklenme gösterdiği (% 85) 1.0 mg/l IBA mg/l GA mg/l Fe-EDDHA kombinasyonunu içeren MS ortamından elde edilmiştir (Şekil 4.11). Köklendirme denemelerinde daha önce yaptığımız ön çalışmalarda denemeye aldığımız 4 anaçta da kullandığımız MS ve MST ortamına Fe-NaEDTA 42

58 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK ilave edildiğinde köklenme elde edilememiştir. Bununla birlikte IBA hormonu içermeyen sadece Fe-EDDHA ilave edilen MS ve MST ortamlarında sürgünlerin hepsinde kayda değer kök gelişimleri gözlenmiştir. Şekil In vitro koşullarında 1.5 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA içeren MST ortamında Garnem sürgünlerinden kök gelişimi, Garnem bitkisinin köklendirme ortamında görünüşü (A), köklü Garnem bitkisi (B), 1.0 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA içeren MS ortamında köklendirilmiş Myrobalan 29 klon bitkisi (C), 1.5 mg/l IBA mg/l Fe-EDDHA içeren MST ortamında köklendirilmiş GF-677 bitkisi (D) 43

59 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK 4.3. Myrobalan 29 klonu, Garnem ve Cadaman Anaçların Meloidogyne incognita ırk 2 ve M. javanica ya Karşı Dayanıklılığının Araştırılması Laboratuvar koşullarında Garnem, Cadaman ve Myrobalan 29 klonunun M. incognita ırk 2 ve M. javanica ya karşı dayanıklılıklarını araştırmak amacı ile iklim odalarında saksı denemesi kurulmuştur. Bu denemede, başlangıç inokulasyon yoğunluğuna göre son populasyon yoğunlukları ve çoğalma oranları (R=Pf/Pi) belirlenmiştir (Çizelge 4.1 ve 4.2). Anaçların son populasyon yoğunlukları M. incognita ve M. javanica ile inokulasyondan 3 ay sonra topraktaki nematod yoğunluğuna göre yapılmıştır. Kök-ur nematodunun olup olmadığı geliştirilmiş Baermann huni yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Ayrıca denemeye alınan anaçların köklerinde gal olup olmadığı Hartman ve Sasser (1985) in 0-5 skalasına göre değerlendirilmiş ve nematod gelişimi olup, olmadığı dikkate alınmıştır. Ülkemizde sert çekirdekli meyve gruplarında anaç olarak kullanılan kayısı ve erik için Myrobalan (P. cerasifera x P. munsoniana) 29 klonu erik anacı, şeftali ve nektarin için Garnem (P. dulcis x P. persica) ve Cadaman (P. persica x P. davidiana) anaçlarının M. javanica ve M. incognita ya karşı gösterdiği reaksiyon ve dayanıklılık durumu Çizelge 4.1 ve 4.2 de verilmiştir. M. javanica nın denemeye alınan anaçlar üzerindeki gelişme durumu Çizelge 4.1 de verilmiştir. 44

60 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK Çizelge 4.1. In vitro da üretimi yapılan bazı sert çekirdekli meyve anaçları üzerinde nematod inokulasyonundan 3 ay sonra Meloidogyne javanica nın gelişme durumu ve gal indeksi Anaçlar Anaç sayısı (n) Ort. Toprak sıcaklığı ( C) İnokulasyon yoğunluğu (Pi) Larva/cm 3 toprakta (Pf) R (Pf/Pi) (Çoğalma oranı) Gal indeksi (0-5) Dayanıklılık durumu MYROBALAN 29C ± R GARNEM 9 26 ± R CADAMAN 3 26 ± R Pi: İnokulasyon yoğunluğu Pf: Sonuç populasyon yoğunluğu R: reproduction (çoğalma oranı) R: dayanıklı (Resistant) M. javanica nın 1000 adet 2. dönem larvası ile inokule edilen anaçlarda, inokulasyondan 3 ay sonra saksılardan sökümü yapılan anaçların topraklarından alınan örnekler e göre incelendiğinde nematodların denemeye alınan 3 anaçtada gelişemediği ve çoğalamadığı görülmektedir. (Çizelge 4.1). Garnem ve Cadaman anaçlarının topraklarından alınan örneklerde M. javanica nın 2. dönem larvalarına rastlanmamıştır. Myrobalan 29 klonunda ise 35 gibi önemsiz sayıda 2. dönem larva saptanmıştır. Bu sonuçlara göre, denemeye alınan M. javanica populasyonu anaçlarda çoğalmamıştır. Çoğalma oranları (R) 0 olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca denemeye alınan anaçların köklerinde gal oluşmadığı saptanmış ve gal indeksine göre 0 olarak değerlendirilmiştir. M. javanica ya karşı denemeye alınan anaçların tümü dayanıklı bulunmuştur. Stalin ve ark., (1998) Myrobalan ın in vitro da çoğaltılmış 9 klonunu kök-ur nematodunun sırasıyla Fransa, Fas ve İspanya orjinli 4 izolatına [M. incognita (2), M. javanica (1), M. hispanica (1)] testlemişler. Kök-ur nematodunun inokulasyon yoğunluğunda bile Myrobalan ın dayanıklı klonlarında herhangi bir gal oluşumuna rastlanmamışdır. Fernandez, (1994) mikro çoğaltılmış GF-677 anaçlarını M. incognita nın 5000 adet 2. dönem larvası ile inokule etmişler ve inokulasyondan sonra GF-677 nin köklerinde çok sayıda gal oluştuğunu (121 gal/bitki) ve M. incognita ya oldukça duyarlı olduğunu bildirmişlerdir. Esmenjaud ve ark., (1996) Myrobalan ın dayanıklı 45

61 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK genotiplerinin (P 1079, P 2175) yüksek sıcaklık ve inokulum yoğunluğuna tepkisini araştırmak için yaptıkları çalışmalarında genotiplerin yüksek sıcaklıktan (32 C) etkilenmediğini devamlı inokulum baskısında da dayanıklı olduğunu rapor etmişlerdir. Canals ve ark., (1992) şeftali x badem hibriti GxN No 1 in nematod dayanıklılığının araştırıldığı çalışmada yüksek sıcaklıkta (31 C) daha çok gal oluştuğunu ve nematodların daha fazla çoğaldığını gözlemlemişlerdir. Bizim çalışmalarımızda denemeye alınan nematodların optimum gelişme sıcaklığı 26±3 C kullanıldığı için bitkilerde kök-ur nematoduna ait gal veya larvaların gelişmemesi, denemeye alınan bitkilerin dayanıklı olduğu sonucuna varılmıştır. Çizelge 4.2 de gösterilen M. incognita ile inokule edilmiş anaçlar içinde aynı durum söz konusudur. M. incognita ırk 2 nin denemeye alınan Myrobalan 29 klonu, Garnem ve Cadaman anaçları üzerindeki gelişme durumu Çizelge 4.2 de verilmiştir. Çizelge 4.2. In vitro da üretimi yapılan bazı sert çekirdekli meyve anaçları üzerinde nematod inokulasyonundan 3 ay sonra Meloidogyne incognita nın gelişme durumu ve gal indeksi Anaçlar Anaç sayısı (n) Ort. Toprak sıcaklığı İnokulasyon yoğunluğu (Pi) Larva/cm 3 toprakta (Pf) R (Pf/Pi) (Çoğalma oranı) Gal indeksi (0-5) Dayanıklılık durumu MYROBALAN 29C ± R GARNEM 8 26 ± R CADAMAN 3 26 ± R Pi: İnokulasyon yoğunluğu Pf: Sonuç populasyon yoğunluğu R: reproduction (çoğalma oranı) R: dayanıklı (Resistant) Çizelge 4.2 de M. incognita nın 1000 adet 2. dönem larvası ile inokule edilen anaçlarda, inokulasyondan 3 ay sonra saksılardan sökümü yapılan anaçların topraklarından alınan örnekler incelendiğinde, Garnem ve Cadaman anaçlarının topraklarından alınan örneklerde M. javanica nın 2. dönem larvalarına rastlanmamıştır. Myrobalan 29 klonunda ise 2. dönem larvalarında dikkate değer bir çoğalma (35 larva/cm 3 toprak) görülmemiştir. Başlangıçta verilen inokulasyon yoğunluğu ve sonuç populasyon yoğunlukları karşılaştırıldığında (Pf/Pi) çoğalma 46

62 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK oranları (R) 0 olarak değerlendirilmiştir. M. incognita nın denemeye alınan anaçlar üzerindeki gelişme durumu incelendiğinde, Myrobalan 29 klonu ve Garnem anaçlarının köklerinde herhangi bir gal oluşumu gözlenmemiş ve gal indeksine göre 0 olarak değerlendirilmiştir. Cadaman anacında ise bir bitkiye ait kökte 1 gal oluştuğu saptanmış olup, gal indeksine göre 1 olarak değerlendirilmiştir. M. incognita ya karşı denemeye alınan anaçların tümü dayanıklı bulunmuştur. Hashmi ve ark., (1991) domates (Lycopersicon esculentum) kök eksplantlarında ve in vitro da çoğaltılmış şeftali bitkilerinin ( P. persica (L.) Batsch) M. incognita nın 5 inokulum seviyesi (domates için 25, 50, 75, 100 ve larva ve şeftali için 50, 100, 200, 500 ve larva) ile karşılaştırılmışlar. Şeftali de maksimum penetrasyonun 2. larva seviyesinde 200 nematod ile yalnızca % 8 olarak bulmuşlardır. Fernandez ve ark. (1993) nın GF-677, GxN No 22 ve Myrobalan 29C anaçları üzerinde yaptıkları sıcaklık denemesinde GF-677 anacının 26 C toprak sıcaklığında 5000 adet 2. dönem larva ile inokulasyonundan 3 ay sonra toprakta ve kökte nematod populasyonun ve kökte gal oranının arttığını saptamışlardır. 30 C de topraktaki son populasyonun ve gal oranının 26 C ye göre çok daha fazla arttığını saptamışlardır. Yine GxN No22 anacının ise 23 C de M. incognita ya dayanıklı olduğunu fakat 31 C de önemli ölçüde daha çok gal oluşturduğunu ve topraktaki nematod populasyonunun daha çok olduğunu gözlemlemişlerdir. Myrobalan 29 klonunun ise sıcaklıktan etkilenmediğini, her iki sıcaklık durumunda da en yüksek düzeyde dayanıklılık gösterdiğini bildirmişlerdir. Yine aynı araştırıcının yaptığı bir başka çalışmasında ise yeşil taze ve odunsu çeliklerden elde ettikleri GxN No 15, GxN No 22 ve in vitro koşullarda mikro çoğaltılmış Myrobalan ın P 1079, P 2175 ve P 2980 klonları üzerinde yaptıkları denemede M. incognita nın Fransa ve İspanya da farklı kültür bitkilerinden elde ettikleri 5 izolatı kullanmışlar. Her bitkiye 5000 larva inokule ettikten 3 ay sonra Garnem ve Myrobalan da gal oluşumuna ve toprak+kökte nematod populasyonuna rastlamamışlar ve bu anaçları oldukça dayanıklı bulmuşlardır. Nitekim bu araştırıcıların elde ettikleri sonuçlar bizim elde ettiğimiz sonuçlar ile uyuşmaktadır. Yaptığımız çalışmada da, M. incognita nın 1000 adet 2. dönem larvası ile inokulasyonundan 3 ay sonra toprakta nematod populasyonuna 47

63 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Burcu ÖZBEK rastlanmamış ve Garnem, Cadaman ve Myrobalan 29 klonu kök-ur nematodlarına dayanıklı olabilecek aday anaçlar olarak değerlendirilmiştir PCR Analizi Şekil Meloidogyne javanica ve Meloidogyne incognita ırk 2 ile inokule edilen Garnem, Myrobalan 29 ve Cadaman anaçlarının SCAL19JF1, SCAL19JF2 ve SCAL19-2 ile PCR analiz sonuçları. M: 100 bç plus marker, 1-3: Cadaman, 4-6: Garnem, 7-9: Myrobalan 29 Myrobalan erik anaçlarının dayanıklı hatlarında bulunan kök-ur nematodlarına dayanıklılık sağlayan Ma 1 allel genine spesifik SCAL19JF1, SCAL19JF2 ve SCAL19-2 primerleri (Claverie ve ark., 2004) ile yaklaşık 700 bp kadar DNA sentezi denemeye alınan tüm anaçlarda sağlanmıştır. Myrobalan 29 klonunun 2 hattında (7 ve 8) birbirine yakın uzunlukta iki farklı DNA bandı elde edilmiş diğer hattında sadece beklenilen bir adet DNA bandı elde edilmiştir. Ayrıca hafif birer DNA bandı 700 bç uzunluğunun hemen altında da gözlenmiştir. Ma 1 allel geni ile bağlantılı SCAR markörü SCAL 19 primerleri Lecouls ve ark., (1999) tarafından Prunus anaçlarında dominant markör olarak kullanılmıştır. Bu markör dominant olup Prunuslarda tek bir fragment vermektedir. Ancak Myrobalan 29 klonunda 3 adet farklı büyüklükte fragment vermiştir. Aynı markör primerler Garnem anacında 2 farklı büyüklükte DNA fragmenti vermiş, ancak Cadaman anacında tek bir fragment oluşturmuştur. Nitekim Lecouls ve ark., (1999) yaptığı PCR analizinde nematoda dayanıklı olduğu bilinmeyen bitkilerde tek bir fragment vermediği bildirilmiştir. 48