ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Şebnem Gözde DEMİRKÖK GF-677, AK-1 ve AK-2 BADEM x ŞEFTALİ MELEZ ANAÇLARININ SÜRGÜN UCU YÖNTEMİYLE in vitro KLONAL MİKROÇOĞALTIMI BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2006

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GF-677, AK-1 ve AK-2 BADEM x ŞEFTALİ MELEZ ANAÇLARININ SÜRGÜN UCU YÖNTEMİYLE in vitro KLONAL MİKROÇOĞALTIMI Şebnem Gözde DEMİRKÖK YÜKSEK LİSANS TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Bu tez 02/06/2006 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir. İmza... İmza... İmza..... Prof. Dr. Ayzin B. KÜDEN Prof. Dr Ali KÜDEN Doç. Dr. Mehmet Nuri NAS DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No:ZF2004YL69 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserle

3 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... V ŞEKİLLER DİZİNİ... VI 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL ve METOD Materyal GF-677 Anaç Genotipinin Genel Özellikleri AK-1 ve AK-2 Anaç Genotiplerinin Genel Özellikleri Metod Sürgün Ucu Yöntemiyle In vitro Klonal Mikroçoğaltım Çalışmaları Kültür Ortamları ve Hazırlanması Dokuların Hazırlanması Sürgün Uçlarının Kültüre Alınması ve Kültür Koşulları Alt Kültüre Alma ve Köklendirme Deneme Değişkenleri Çalışmada Yapılan Sayım ve Gözlemler BULGULAR ve TARTIŞMA Sürgün Gelişmesi Aşamasına Ait Deneme Sonuçları Sürgünlerin Canlılık Oranları Sürgünlerin Kardeşlenme Sayıları Sürgünlerin Köklenme Aşamasına Ait Deneme Sonuçları Sürgünlerin Kök Oluşturma Oranları Mikrosürgün Başına Düşen Kök Sayıları... 31

4 5. SONUÇ ve ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ... 41

5 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ GF-677, AK-1 ve AK-2 BADEM x ŞEFTALİ MELEZ ANAÇLARININ SÜRGÜN UCU YÖNTEMİYLE in vitro KLONAL MİKROÇOĞALTIMI Şebnem Gözde DEMİRKÖK ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Ayzin KÜDEN Yıl : 2006, Sayfa: 41 Jüri : Prof. Dr. Ayzin KÜDEN Prof. Dr. Ali KÜDEN Doç. Dr. Mehmet Nuri NAS Bu çalışma, yılları arasında periyodunda Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Biyoteknoloji Laboratuvarı nda yürütülmüştür. Çalışmada Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Araştırma ve Uygulama parselinde bulunan AK-1, AK-2 ve GF-677 badem x şeftali melez genotiplerine ait sürgün uçları kullanılmıştır. Alınan sürgün uçlarının canlılık, sürgün oluşturma ve köklenme oranları incelenmiştir. Araştırmada MS makro ve mikro besin elementleri, vitaminleri ve Fe-NaEDTA kompozisyonu kullanılmıştır. Sürgün geliştirme ve çoğaltma aşamasında 0, 0.5, 1.0, 1.5 mg/l BAP ve 0.1 mg/l GA 3 konsantrasyonları, köklendirme aşamasında ise 0, 0.5, 1.0, 1.5 mg/l IBA ve 0.1 mg/l GA 3 konsantrasyonları ile büyümeyi düzenleyici içermeyen kontrol MS ortamları kullanılmıştır. Çalışmada, canlılık oranı AK-2 genotipinde % 91.25, AK-1 genotipinde % ve GF-677 genotipinde % 85; kardeşlenme sayısı ise AK-1 genotipinde 2.43 sürgün/eksplant, GF-677 genotipinde 0.88 sürgün/eksplant ve AK-2 genotipinde 0.5 sürgün/eksplant; köklenme oranı AK-1 genotipinde % 24.06, GF-677 genotipinde % 22.25, AK-2 genotipinde % 6.19; mikrosürgün başına düşen kök sayısı AK-1 genotipinde 2.78 kök/mikrosürgün, GF-677 genotipinde 1.95 kök/ mikrosürgün ve AK-2 genotipinde 0.94 kök/mikrosürgün olarak bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: GF-677, AK-1, AK-2 badem x şeftali melez anaçları, sürgün ucu kültürü, mikro çoğaltma I

6 ABSTRACT M.Sc. THESIS In vitro CLONAL MIKROPROPAGATION of GF-677, AK-1 and AK-2 ALMOND x PEACH HYBRID ROOTSTOCKS by SHOOT-TIP CULTURE Şebnem Gözde DEMİRKÖK DEPARTMENT OF HORTICULTURE INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Ayzin KÜDEN Year : 2006, Pages: 41 Jury : Prof. Dr. Ayzin KÜDEN Prof. Dr. Ali KÜDEN Doç. Dr. Mehmet Nuri NAS This study was carried out in Biotechnology laboratory of C.U. Faculty of Agriculture, Department of Horticulture during The shoot tips of AK-1, AK-2 and GF-677 almond x peach hybrid genotypes taken from the orchards of C.U. Faculty of Agriculture, Department of Horticulture were used. As the experimental material the viability, shoot elongation and rooting rates of the shoot tips were investigated. In the experiment, MS macro and micro nutrients, vitamins and Fe-Na EDTA composition was used. During shoot elongation and multiplication stage 0, 0.5,1, 1.5 mg/l BAP and 0.1 mg/l GA 3 concentrations, during the rooting stage 0, 0.5,1, 1.5 mg/l IBA, 0.1 mg/l GA 3 concentrations and MS medium with no hormones as the control were used. In this work, viability rate was found to be % in AK-2, % in AK-1 and 85 % in GF-677; multiplication rate was 2.43 shoot/explant in AK-1 genotype, 0.88 shoot/explant in GF-677 and 0.5 shoot/explant in AK-2 genotype; rooting rate was % in AK-1 genotype, % in GF-677 and 6.19 % in AK-2 genotype; root number per mikroshoot was 2.78 in genotype AK-1, 1.95 root/mikroshoot in GF-677 genotype and 0.94 root/mikroshoot in AK-2 genotype. Key Words: GF-677, AK-1, AK-2 almond x peach hybrid rootstocks, shoot tip culture, micro propagation II

7 TEŞEKKÜR Yüksek lisans tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve yazım aşamasında yönlendirici katkılarıyla her zaman destek olan Danışman Hocam Sayın Prof. Dr. Ayzin B. KÜDEN e sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Tezimin yürütülmesi sırasında bölümümüzün tüm olanaklarını kullanmama izin veren Bölüm Başkanımız Sayın Prof. Dr. Turgut YEŞİLOĞLU na, laboratuar ve arazi çalışmalarımda her türlü desteğini gördüğüm Prof. Dr. Ali KÜDEN, Doç. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ, Yrd. Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR a teşekkürlerimi sunarım. Denememin kurulması ve yazım aşamasında yardımlarını esirgemeyen Ar. Gör. Songül ÇÖMLEKÇİOĞLU, Ar. Gör. Safder BAYAZİT, Uzman Burhanettin İMRAK, Ar. Gör. Hatice BİLİR, Ar.Gör. Ferhan SABIR, Zir. Yük. Müh. Turgut TAMDOĞAN a ve değerli arkadaşlarım Zir. Müh. Aydın DEMİREL, Biyolog Taylan ÇELİK, Biyolog Sinem SERBEST KOBANER ve tüm biyoteknoloji laboratuvarı çalışanlarına teşekkürlerimi sunarım. En son olarak fakat kesinlikle en az olmayarak her konuda olduğu gibi tezimin hazırlanması sırasında da sonsuz desteklerini gördüğüm tüm aile fertlerime, sevgili arkadaşım Zir. Müh. Ayça IŞIKTAN, Oya IŞIKTAN ve kıymetli ailesine şükranlarımı sunarım. III

8 SİMGELER VE KISALTMALAR BA: NAA: IAA: BAP: FAO: GA 3 : IBA: Benzyladenin Naphtalene Asetic Acid Indole Asetic Acid Benzylaminopurin Food and Agriculture Organization Giberellic acid Indole-3-Butyric Acid M: Molar mg: ml: mm: µl: µm: Miligram Mililitre Milimolar Mikrolitre Mikromolar MS: Murashige and Skoog (1962) WPM: Lloyd and McCown (1980) DKW: Driver and Kuniyuki (1984) AP: Almehdi and Parfitt (1986) LS: Linsmaier and Skoog (1965) IV

9 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. Ülkeler Bazında Dünya Şeftali Üretimi... 1 Çizelge 1.2. Ülkeler Bazında Dünya Badem Üretimi... 2 Çizelge 1.3. Kamu ve özel kuruluşlara ait sertifikalı meyve fidanı üretim miktarları 3 Çizelge 3.1. GF-677, AK-1 ve AK-2 melez anaçlarının odun çeliklerine 1000 ppm IBA uygulamasının köklenme ve kallus oluşumu üzerine etkileri 17 Çizelge 3.2. Sürgün geliştirme ve kardeşlenme aşamasında kullanılan kültür ortamının bileşimi Çizelge 3.3. Köklendirme aşamasında kullanılan kültür ortamının bileşimi 20 Çizelge 4.1. Farklı BA konsantrasyonlarının GF-677, AK-1 ve AK-2 anaçlarında canlılık oranları üzerine etkileri Çizelge 4.2. Farklı IBA konsantrasyonlarının GF-677, AK-1 ve AK-2 anaçlarında kardeşlenme sayıları üzerine etkileri Çizelge 4.3. Farklı IBA konsantrasyonlarının GF-677, AK-1 ve AK-2 anaçlarında köklenme oranları üzerine etkileri Çizelge 4.4. Farklı BA konsantrasyonlarının GF-677, AK-1 ve AK-2 anaçlarında mikrosürgün başına düşen kök sayısı üzerine etkisi V

10 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. AK-2 badem x şeftali melez yaprağının GF-677, badem ve şeftali yaprağı ile karşılaştırılması 16 Şekil 3.2. AK-1 badem x şeftali melez yaprağının GF-677, badem ve şeftali yaprağı ile karşılaştırılması Şekil 4.1. Büyütme odasındaki denemeden genel bir görüntü.. 25 Şekil 4.2. Steril kabin içerisinde eksplantların kültüre alınması 27 Şekil 4.3 AK-1 genotipininin köklü bitkicikleri Şekil 4.4. AK-2 genotipininin köklü bitkicikleri.. 30 Şekil 4.5. GF-677 genotipininin köklü bitkicikleri Şekil 4.6. AK-1 genotipininin 1.5 mg/l IBA içeren ortamdaki köklü bitkicikleri. 32 VI

11 1.GİRİŞ Şebnem Gözde DEMİRKÖK 1. GİRİŞ Dünya şeftali (Prunus persica L.) üretim miktarı 2005 yılında ton olmuştur (Çizelge 1). Türkiye de 2003 yılında üretim ton iken 2005 yılında bu değer tona yükselmiştir. Dünya badem (Prunus amygdalus L.) üretim miktarı ise, 2005 yılında ton olmuştur (Çizelge 2). Türkiye de 2003 yılında olan üretim miktarı 2005 yılında tona düşmüştür (Anonymous, 2005). Şeftali ve badem yetiştiriciliği için uygun iklim koşullarına sahip olan ülkemizin dünya pazarlarındaki yerini yükseltme şansı bulunmaktadır. Ancak bunun için uygun çeşitlerin ve modern yetiştiriciliğin getirdiği uygun anaç kullanımı ile bahçe tesisinden pazarlamaya kadar bir çok sorunun çözülmesi gerekmektedir. Ülkemizde üretilen badem ve şeftali fidanları çöğür anaçlarına aşılı olarak üretilmektedir. Oysa, çöğür anaçlarına göre çok üstün özelliklere sahip klon anaçlar birçok ülkede kullanılmaktadır. Bizde kullanımı henüz yaygınlaşmamış olan bu anaçların kolay köklenme, kuvvetli gelişme, hastalıklara dayanıklılık gibi bazı üstün özellikleri vardır. Bu bakımdan çöğür anaçlara göre daha büyük avantajlara sahip olabilmektedir. Ülkemizde, klonal anaç kullanımı pratikte henüz yaygınlaşmamıştır. Bu nedenle bir çok meyve türünde hala çöğür anaçlar kullanılmaktadır (Küden ve Kaşka, 1990). Çizelge 1.1. Ülkeler Bazında Dünya Şeftali Üretimi (2005) ÜLKELER ÜRETİM (ton) Çin İtalya ABD İspanya Yunanistan Türkiye Fransa İran Dünya

12 1.GİRİŞ Şebnem Gözde DEMİRKÖK Çizelge 1.2. Ülkeler Bazında Dünya Badem Üretimi (2005) ÜLKELER ÜRETİM (ton) ABD İspanya Suriye İtalya İran Fas Yunanistan Türkiye Dünya Yılmaz (1992), klonal anaçların, tohumdan üretilen anaçlara göre genetik bakımdan bir örnek materyal oluşturduğunu belirtmiştir. İleri teknoloji kullanılarak meyve yetiştiriciliği yapılan ülkelerde hemen hemen tümüyle özellikleri bilinen ve bu özellikleri mutasyonlar dışında değişmeyen anaçlar kullanılmaktadır. Sözü edilen bu anaçların kullanılmasıyla hem verim ve kalite arttırılabilmekte, hem de bahçe kurulması aşamasından başlayarak öteki teknik ve kültürel bakım işlemlerinde büyük kolaylıklar sağlanabilmektedir (Çelik, 1983). Trefois (1985) e göre, meyve ağaçlarında kullanılacak anaçlarda bulunması gereken bazı özellikler şunlardır: Anaçlar, aşılandıkları çeşitlerle uyumlu olmalı, hastalık taşımamalı, düşük sıcaklıklara özellikle donlara karşı dayanıklı olmalı, ağaçların erken ve düzenli verim vermelerini sağlamalı, kuvvetli kök sistemine sahip olmalıdır. Klonal anaçların üstün özelliklerinden faydalanmanın ilk koşulu vegetatif yolla kolay çoğalması ve en uygun çoğaltma yönteminin belirlenmesidir. Hızla ilerleyen teknolojide bu anaçlar in vivo veya in vitro yöntemleriyle çoğaltılabilmektedir. Doku kültürünün üreticiye sağladığı en büyük avantajlardan biri kısa sürede gereksinim duyulan sayıda bitki materyali elde edilmesidir. Aynı zamanda doku 2

13 1.GİRİŞ Şebnem Gözde DEMİRKÖK kültürü ile elde edilen bitkiler daha sağlıklı, genetik bakımdan damızlık olarak seçilen materyalin aynısı ve büyük ölçüde homojen olacağından son yıllarda bu yöntem özellikle in vivo koşullarda çoğalma problemi olan bazı türler için daha çok tercih edilmektedir. Meyve fidanında sertifikasyon uygulaması, aşılı ve çelikten üretilen fidanlar ile klon anaçları kapsamaktadır. İki bin üç yılında, kamu ve özel sektör tarafından 20 türe ait toplam adet sertifikalı meyve fidanı ve meyve çöğürü üretilmiştir. Aynı yıl sertifikalanan fidan sayısı ise, olarak gerçekleşmiştir. Son iki yılın üretim değerlerine bakıldığında, her yıl özel sektöre ait işletmelerde sertifikalı fidan üretiminin giderek yaygınlaştığı görülmektedir (Gençtan ve ark. 2005) Kamu ve özel kuruluşlara ait sertifikalı meyve fidanı üretim miktarları Çizelge 1.3 te verilmiştir. Çizelge 1.3. Kamu ve özel kuruluşlara ait sertifikalı meyve fidanı üretim miktarları (1000 adet) 2002 Yılı Üretimleri 2003 Yılı Üretimleri Meyveler Kamu Özel Sekt. Toplam Kamu Özel Sekt. Toplam Yum. Çek Sert Çek Sert Kabuk Turunçgiller Zeytin Üzümsü Mey Toplam Ilıman iklim meyve türleri içerisinde dünyada en yaygın klonal anaç kullanımı elmalardadır. Bunun yanı sıra armut, kiraz, şeftali ve erikte de klonal anaçlar bulunmuş, ancak yeterince yaygınlaşmamıştır. Özellikle son yıllarda şeftaliye anaç olarak kullanılan GF-677 badem x şeftali melez klon anacı kireçli topraklara uygun, kloroz, phytopthora ve kök kanserine dayanıklı, yüksek kalitede meyve veren kuvvetli bir anaçtır (Yapıcı, 1992). 3

14 1.GİRİŞ Şebnem Gözde DEMİRKÖK Nonpareil badem çeşidinin tohumlarından tesadüf çöğürü olarak bulunan AK-1 ve AK-2 badem x şeftali melezleri 1995 yılında ekilen tohumlardan elde edilmiş ve bugüne kadar in vivo veya in vitro koşullarda yapılan köklendirme denemelerinde GF-677 ile benzer veya daha iyi performans göstermiş, umutlu anaç adaylarıdır. Bu çalışmanın amacı, ana ebeveyni Nonpareil badem çeşidi olan AK-1 ve AK-2 badem x şeftali tesadüf melezlerinin, özellikleri bilinen GF-677 anacı ile çoğalma ve köklenme yetenekleri bakımından in vitro koşullarda karşılaştırılması ve üstün yanlarının ortaya konmasıdır. Bu yöntemle elde edilen bitkiler daha sonra anaçlık özellikleri incelenmek üzere başka çalışmalarda kullanılacaktır. 4

15 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem Gözde DEMİRKÖK 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bahçe bitkilerinde bir çok bitki türü, hücre ve doku kültürü teknikleri kullanılarak çoğaltılabilir ve köklendirilebilir. Ancak bu işlemler yoğun çaba gerektirir ve yüksek maliyetlidir. Ayrıca, laboratuvar çalışmalarında kullanılan cam yada plastik malzemenin cinsi, bitkinin kalitesi, büyümesi, yaşama süresi ve çoğaltılmasında etkili olmaktadır (Cluster, 1992). Mansuroğlu ve Gürel (2001) tarafından belirtildiği gibi, mikro çoğaltım konusundaki ilk çalışma 1902 yılında, tek hücreden tam bir canlının yaratılabileceğini kanıtlamaya çalışan botanikçi Haberlandt tarafından yapılmıştır. Araştırıcı, izole ettiği bitki hücrelerini besin ortamına yerleştirmiş, ancak hücrelerin hacmi 11 kat artmasına rağmen çoğalmamıştır. Bunu izleyen çalışmalar başarısızlığın nedeninin, hücre bölünmesi, gelişmesi ve farklılaşması için gerekli olan hormonların o yıllarda bilinmemesine bağlı olduğunu göstermiştir. Meristem ve sürgün ucu kültürleri virüssüz bitki elde etmek, mikro çoğaltım, gen kaynaklarının muhafazası, genetik transformasyonlar, uluslararası bitki materyali değişimi (Grout, 1990), bitkilerden mantar ve bakterilerin eleminasyonu (George, 1993) amaçlarıyla kullanılmaktadır (Bürün ve Türkoğlu, 1996). Bir bitki paçası (explant) in vitro kültüre alındığında dikkat edilmesi gereken faktörler şu şekilde sıralanabilir (Debergh,1988): 1) Doku (genotip, kaynak ve tarih) 2) Ortam (mineraller, hormonlar ve diğer organik destekleyici maddeler) 3) Çevre (ışık, sıcaklık, gazlar, kaplar) 4) Zaman (alt kültür periyodu ve sayısı) 5)Yukarıdaki faktörler arasındaki interaksiyonlardır. Battistini Nursery fidancılık şirketi mikro çoğaltma ile tüm şeftali anaçlarını çoğaltmaktadır. Ancak bu çoğaltma tekniklerini geliştirmek için her bir klona özel denemelere gereksinim duymaktadırlar. Mikro çoğaltılan şeftali anaçları şunlardır: Ishtara, GF-677, Penta, Tetra, Mr 2/5, Fire, Cadaman, Barrier 1, Adara, Genisa ve 5

16 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem Gözde DEMİRKÖK Julior. Şeftali anaçları mikro çoğaltım çalışmalarında önemli farklılıklar göstermişlerdir. Bazı anaçların mikro çoğaltımı çok kolay olurken, bazılarının oldukça zor olmuştur. Ayrıca bazı klonların farklı iklim koşullarına adaptasyonu da farklı olmuştur (Battistini ve Paoli, 2002). Arazi koşullarında yapılan çalışmalarda, demir noksanlığına dayanıklı olduğu belirtilen dört şeftali anacı (GF-677, Adesoto, Barrier ve Cadaman) doku kültürü yöntemiyle çoğaltılmış ve 90 μm Fe(III)-EDTA içeren su kültürü ortamına konulmuştur. Bitkiler 9 gün süreyle bu ortamlarda tutulduktan sonra 4 gün süreyle demir içermeyen besin ortamına aktarılmıştır. Daha sonra bu bitkilere 1 ve 3 gün süreyle 45 ve 180 μm Fe (III)-EDTA verilmiştir. Sonuç olarak demiri yeterli olan GF-677 ve Adesoto genotiplerinde köklerde demir şelat redüktaz aktivitesinde kısa süreli bir artış saptanırken, demir noksanlığı görülen Barrier ve Cadaman genotiplerinde böyle bir artış görülmemiştir (Yolanda ve ark., 2004). GF-677 klon anacının mikro çeliklerinin in vivo köklenme yeteneğini araştırmak için, çelikler köklendirme ortamına alınmış ve oksin uygulamasının köklenme üzerine etkisi test edilmiştir. Düşük konsantrasyondaki oksinler kök oluşumunu arttırdığı ve iyi bir kök sistemi gelişiminin yaklaşık günde meydana geldiği belirlenmiştir (Fasolo ve ark., 1987). Sert kabuklu meyve türlerinde sürgün ucu kültürü ile yapılan çoğaltma çalışmasında, kardeşlenmeyi teşvik etmek amacıyla bir protokol geliştirilmiş ve sürgün rejenerasyonu elde edilmiştir. In vitro sürgünlerden alınan sürgün uçları rejenerasyon için 8.8 μm BA, 1.0 μm NAA ve 250 mg/l sefatoksin içeren bir LP ortamında, karanlıkta, 30 gün süreyle tutulmuştur. Eksplantlar oksin içermeyen bir ortama transfer edilmiş daha sonra 1.4 μm GA 3 ilave edilmiş ve 4 haftada bir yeni bir ortama aktarılmıştır. M-55 badem tipi üzerinde yapılan histolojik çalışmalar, sürgünlerin yara dokusundan meydana geldiğini açıkça göstermiştir. Yara dokusu, aylarca sürgün oluşturma yeteneğini korumuştur (Lauri ve ark., 2001). Gisella 5 kiraz anacı; MS, 2 MS, ½ MS, ¼ MS ve 4.4 μm BA, 0.5 μm NAA ve 0.3 μm GA 3 bulunan ortamlarda mikro çoğaltmaya alınmıştır. Kültüre alma işleminden sonra ilk gün, 20. gün ve 40. günde tüm özellikler incelenmiştir. Kültüre alma süresince aktarılan dokuların yaş ve kuru ağırlığı artarken, ortamın yaş ve kuru 6

17 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem Gözde DEMİRKÖK ağırlığı azalmıştır. Kültüre alma süresince ortamın ph'sı azalmış, daha sonra ½ MS ve ¼ MS ortamlarında az bir artış olmuştur. Gisella 5, en yüksek azot ve fosfor alımı olan 2 MS ve MS ortamlarında en iyi büyüme ve gelişmeyi göstermiştir (Ruzic ve ark., 2000). In vivo da gelişen GF-677, M-51 klon anaç genotipleri ve Babygold şeftali çeşidinin sürgünleri, in vitro da kültüre alınmıştır. MS ortamına, Fe-EDTA, ½ Fe-EDTA veya ¼ Fe- EDTA ilave edilmiştir. Ayrıca 1 μm KHCO 3 ilavesiyle eşit molarda FeSO 4 ile yer değiştirmiş olan MS ortamı kullanılmıştır. Çoğalma hızları hesaplanmış ve klorofil içeriği belirlenmiştir. Fe eksikliği semptomları genotipe bağlı olarak, bikarbonat ilaveli FeSO 4 bulunan ortamda daha açık görülmüştür. En belirgin semptomlar Babygold şeftali çeşidinde, orta dereceli semptomlar GF-677 ve M-51 klon anaç genotiplerinde ve daha az belirgin semptomlar da badem genotiplerinde görülmüştür. In vitro ve dış ortam arasında bir korelasyon olduğu ileri sürülmüştür. Bu ilk sonuçlar, badem ve diğer sert çekirdekli meyve türlerinde kloroza toleransın hızlı kontrolü için doku kültürlerinin kullanımının mümkün olduğunu göstermiştir (Caboni ve Lauri, 2002). Sert çekirdekli meyve anaçlarının çoğaltılmasındaki amaç, yan gözlerden başlatılan in vitro çoğaltma için en uygun BAP konsantrasyonunun ve kültür ortamınının belirlenmesidir. G x N22, GF-677, Mr.S 2/5, Marianna ve Myrobalan erik anaçları, farklı 4 BAP dozu (0.1, 0.3, 0.5 ve 0.7 mg/l) içeren iki MS konsantrasyonunda (MS ve ¾ MS) test edilmiş ve genotipler bu ortamlarda farklı tepkiler vermişlerdir. G x N-22 ve Mr. S 2/5 anaçları için ¾ MS ortamında 0.7 mg/l BAP daha iyi sonuçlar verirken, Myrobalan anacı 0.5 mg/l BAP içeren ¾ MS ortamında daha iyi sonuçlar vermiştir ve test edildiği iki MS konsantrasyonunda da BAP konsantrasyonunun artmasıyla sürgün uzunluğu azalmıştır. GF-677 anacı ise mikro çoğaltmada iyi sonuçlar göstermemiştir (Silveira ve ark., 2001). Molassiotis ve ark., (2004) tarafından yapılan bir çalışmada GF-677 klon anacının Fe-EDTA uygulanmış mikro çeliklerinde in vitro köklenme sırasında meydana gelen peroksidaz ve katalaz aktivitesindeki değişimler araştırılmıştır. İlk kökler, köklenme ortamına alma işleminden yaklaşık 12 gün sonra görülmüştür. Köklenmemiş mikro çeliklerin aksine köklenmiş olan mikro çelikler 9. günde en 7

18 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem Gözde DEMİRKÖK yüksek peroksidaz aktivitesi göstermiştir. 6. ve 12. günlerde peroksidaz yoğun bir şekilde iyonik olarak hücre duvarına geçiş yapmış, 6. ve 15. günlerde ise katalaz enzimi maksimum aktivite göstermiştir. Çözünür peroksidaz izoenzimlerinin zamanla değişimleri sadece köklenmiş mikro çeliklerde görünür bir bant meydana getirmiştir. GF-677 anacının doku kültürü yöntemiyle mikro çoğaltılmasının araştırıldığı çalışmada dokular nisan ayında sürgün uçlarından alınmıştır. 1mg/l BA içeren ortam çoğaltma için en iyi sonucu vermiştir. En yüksek köklenme 0.3 mg/l NAA ile 1.6 mg/l thiamine içeren ortamda ve 7 günlük karanlık uygulamasından elde edilmiştir (Kamali ve ark., 2001). Ne Plus Ultra ve Nonpareil in sürgün uçları, 4 C de aydınlık koşullarda 4 hafta büyümeye alınmıştır. Kök oluşumunda optimum oksin konsantrasyonunun belirlenmesi için IBA ve NAA nın farklı konsantrasyonları karşılaştırılmıştır. Buna ek olarak kök bölgesinde gölgelemenin etkisi ve bazal tuz kompozisyonu incelenmiştir. Her iki çeşit için en iyi sonuç, 1,0 µm I ile % 0,6 lık su-agar solüsyonu içinde 12 saat bekletilen sürgünlerin bu işlemden sonra 2 hafta oksin içermeyen ortama transfer edilmesinden alınmıştır. Aktarılan dokular, başlangıçta 3 gün karanlık koşullar altında tutulmuş ve daha sonra ışığa çıkarılmışlardır. Karanlık periyodunun uzatılması köklenmeyi arttırmamıştır. ½ MS ortamı, Ne Plus Ultra sürgünlerinin köklenmesi için uygun olurken, Almehdi ve Parfitt ortamı, Nonpareil sürgünlerinin köklenmesinde en iyi sonucu vermiştir. Bu koşullar altında aktarılan dokuların %60 ı kök geliştirmiştir (Ainsley ve ark., 2001). Nonpareil 15-1, Ne Plus Ultra ve Titan x Nemaguard (badem x şeftali melezi) anaçlarından 0.7 cm uzunluğundaki sürgün uçları kültüre alınarak, başarılı bir şekilde çoğaltılmıştır. Nonpareil 15-1 genotipi için µm IBA, 3 µm BAP, M sakkaroz ve % 0.7 agar içeren AP ortamı, Ne Plus Ultra genotipi için ise µm IBA, 5 µm BAP, M sakkaroz ve % 0,7 agar içeren MS ortamı uygun bulunmuştur. Titan x Nemaguard melezi için 10 µm BAP, M sakkaroz ve % 0.7 agar içeren MS ortamı en iyi sürgün çoğaltılmasını sağlamıştır. Yaklaşık 2 cm uzunluğundaki sürgünler, 2.4 µm IBA, M sakaroz % 0.7 agar içeren ½ MS 8

19 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem Gözde DEMİRKÖK ortamında 1 hafta karanlıkta ve 2 hafta ışıkta bekledikten sonra % 88 oranında köklenmiştir (Channuntapipat ve ark., 2003). Bir araştırmada, Texas ve Nonpareil badem (Amygdalus communis L.) çeşitlerinin sürgün ucu kültürü ile in vitro çoğaltma olanakları araştırılmıştır. Bu amaçla; farklı IBA ve BAP düzeyleri, birbirini izleyen üç farklı kültür aşamasında (ilk dikim, şaşırtma ve çoğaltma) ayrı ayrı test edilmiştir. Sonuçlar sürgün gelişmesi için hormon içermeyen veya sadece düşük düzeyde IBA (0.1 mg/l) içeren ortamların daha uygun olduğunu göstermiştir. Hem şaşırtma hem de çoğaltma aşamasında, 0.1 mg/l IBA ile 1.0 mg/l BAP kombinasyonu sürgün verimi ve gelişmesi bakımından en iyi sonucu vermiştir. Genel olarak, sürgün oluşumu için her iki aşamada BAP ın gerekli olduğu saptanmış, ancak yüksek düzeyde BAP (2.0 veya 3.0 mg/l BAP) kullanıldığında sürgünlerde camlaşma, sürgünlerin canlılığında azalma ve kallus oluşumuna neden olduğu görülmüştür (Gürel ve Gülşen, 1998). Prunus anaç adaylarının in vitro koşullarda çoğaltılması için ortam denemeleri kurulmuştur. 1 cm uzunluğunda alınan sürgün uçları 16 saat fotoperiyot ve 25 ± 2 o C sıcaklıkta tutulmuştur. Deneme MS, ¾MS, SH ve Villegas ortamlarıyla kurulmuş, çoğaltma ortamı olarak SH ve ¾MS kullanılmıştır. Ayrıca ¾MS ortamında farklı agar miktarları da (4.5, 5.5 ve 6.5 g/l) denenmiştir. Denemede, bitkilerin gelişme, infeksiyon ve oksidasyon yüzdeleri saptanmıştır. Çoğaltma ortamında en yüksek büyüme, gelişme ve kardeşlenme oranı 5.5 g/l agar içeren ¾ MS ortamında bulunmuştur (Rodrigues ve ark., 2003). Damiano ve Monticelli nin (1998) yaptıkları bir in vitro çoğaltma çalışmasında, Fascinello, Ferragnes, Tuono badem çeşitleri; M49, M50, M51, M52, M53 ve M55 badem seleksiyonları; Gala ve McIntosh elma çeşitleri; Prunus pyraster klonlarının üç tipi (P8, P38 ve P50); Ontario erik çeşidi; Citation (erik x şeftali) ve GF-677 (badem x şeftali) melez anaçları kullanılmıştır. Deneme her çeşit veya seleksiyon başına 3 tekerrür, her tekerrürde 8-10 sürgün olacak şekilde planlanmıştır. Ontario erik çeşidi SH ortamında, diğer türler ise MS ortamında daha iyi çoğalmıştır. GF-677, 0.35 mg/l BAP, 0.1 mg/l GA 3 ve 1.0 mg/l IBA ilave edilen MS temel besin ortamına ortamda diğer tüm genotiplerden daha yüksek oranda (% 85) köklenmiştir. 9

20 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem Gözde DEMİRKÖK GF-677 anacının in vitro da köklenmesi, besin ortamına eklenen mineral madde konsantrasyonlarından ve tüp kapaklarının parafilm veya lastik olmasından etkilenmiştir. WPM ortamında mineral madde konsantrasyonunun yarım dozdan (0.5x) iki katına (2x) çıkarılması; köklenme oranı, köklenen bitki sayısı, ortalama kök uzunluğu ve taze kök ağırlığını önemli derecede arttırmıştır. MS ortamı kullanıldığında kök sayısı ve ortalama kök uzunluğu 1x ve 0.5x mineral madde konsantrasyonlarında daha iyi olmuştur. Her iki ortamda mineral madde konsantrasyonu arttıkça kök taze ağırlığı artmıştır. MS ortamı düşük mineral madde konsantrasyonunda WPM ortamına göre daha iyi sonuç vermiştir. Lastik kapak kullanımı, köklenme oranı, kök sayısı ve kök taze ağırlığı bakımından parafilm kapağa göre daha iyi sonuç vermiş, ancak kök uzunluğu azalmıştır (Dimassi ve Theriou, 1995). GF-677 anacının in vitro köklendirilmesi üzerine, organik (Fe-EDTA ve Fe- EDDHA) ve inorganik (FeCl 3 ) demir ilavesinin etkileri incelenmiştir. Fe-EDDHA eklenmiş eksplantlarda % 100 köklenme elde edilmiş, demir noksanlığında yada FeCl 3 kullanıldığında daha az köklenme olmuştur. Fe-EDTA ilave edilen ortamda kök elde edilememiş ve Fe-EDTA uygulaması sonucunda bitkicikler oldukça düşük klorofil ve yüksek Fe içeriği göstermiştir (Molassiotis ve ark., 2003). GF-677 şeftali anacının in vitro çoğaltılmasında, MS ve Anderson temel besin ortamları ve farklı BA konsantrasyonları (0.3, 0.6 ve 0.9 mg/l) kullanılmıştır. MS ortamında sürgün çoğalması, uzaması ve gelişimi en iyi olmuştur. Anderson ortamında bitkiciklerde daha az gelişime olmuş, nekrotik lekeler ve camlaşma görülmüştür. BAP ın 0.9 mg/l dozu kallus oluşumuna ve sürgün tepe nekrozlarına neden olmuştur. En iyi kök gelişimi 0.3 mg/l IBA içeren ½MS ortamından alınmıştır. 4 mg/l IBA dozu, kallus oluşumunu teşvik ederken kök gelişimini engellemiştir (Ahmad ve ark., 2003). In vitro köklenen GF-677 melez anacında B 2 (Riboflavin) vitamininin etkisi üzerinde çalışılmıştır. Riboflavinin 0, 0.5, 1.0, 1.5 ve 2.0 mg/l konsantrasyonları denenmiştir. 4 hafta sonra tanık uygulamasıyla karşılaştırıldığında köklenmenin çok düşük olduğu ve riboflavinin eksplantlarda yan kök oluşumunu teşvik etmediği görülmüştür. B 2 vitamininin en yüksek (1.5 ve 2.0 mg/l) iki konsantrasyonunu içeren 10

21 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem Gözde DEMİRKÖK köklenme ortamında, sürgünlerin büyük bir kısmında, tepe nekrozu ve kloroz semptomları görülmüştür (Antonopoulou ve ark., 2005). Yunanistan Pomoloji Enstitüsünde selekte edilen PR 204/84 (şeftali x badem) anacı, GF-677 klon anacına alternatif bir anaçtır. MS ortamının mineral madde konsantrasyonunun indirgenmesi ve IBA konsantrasyonlarının 2,5 ve 5 µm olması durumunda PR 204/84 eksplantlarının ana kök sayısında ve bu eksplantların köklenme oranlarında önemli bir artış olmuştur. ½ MS ve MS ortamlarında, IBA konsantrasyonlarının tümünde kök uzaması teşvik edilmiştir. Yine bu iki (½MS ve MS) ortamda, IBA miktarının 0 dan 10 µm a doğru artışıyla sürgün başına düşen ana kök sayısında artış olduğu gözlenmiştir. Kültür ortamının mineral madde konsantrasyonu ve IBA kök uzunluğunda önemli bir etkide bulunmamıştır. Sürgünler oksinsiz tanık ortamında köklenmemiştir. 2.5, 5.0 ve 10 µm IBA içeren ½ MS ortamı ile 5 ve 10 µm IBA içeren MS ortamında sürgün köklenmesinin %100 olduğu gözlenmiştir (Fotopoulos ve Sotiropoulos, 2005). In vitro çalışmalarda MS ortamındaki mineral madde konsantrasyonunun normalden yarım doza indirgenmesi köklenme yüzdesi ve kök uzunluğunu arttırmıştır (Dimassi ve Theriou, 1995). Embrapa Temperate Climate Doku Kültürü Laboratuvarı nda Mirabolan, Marianna, Mr.S 2/5, GF-677 ve G x N 22 anaçları için in vitro çoğaltma protokolleri geliştirilmiştir. Bu amaçla MS ve ¾ MS ortamı ve BAP ın 4 farklı konsantrasyonu (0.1, 0.3, 0.5 ve 0.7 mg/l) test edilmiştir. Genotipler, bu iki ortamda ve farklı BAP konsantrasyonlarında farklı tepkiler vermişlerdir. Mr.S 2/5 ve G x N22 anaçları ¾MS ortamında BAP daha iyi sonuçlar sağlamıştır. Marianna anacı, 0.7 mg/l BAP içeren MS ortamında en iyi sonucu verirken, Mirabolan anacı 0.5 mg/l BAP içeren ¾ MS ortamında en iyi sonucu vermiştir. Kullanılan her iki ortamda (MS ve ¾ MS) BAP dozu arttıkça sürgün uzunluğunda azalma gözlenmiştir. G x N22 anacı aynı tepkiyi MS ortamında vermiştir. In vitro çoğaltma çalışmasıyla en iyi sitokinin konsantrasyonu ve en iyi kültür ortamı saptanmış, daha sonra köklenme durumunun incelenmesi için oksin çalışmaları yapılmıştır. Denemede yer alan 4 anacın her biri için IBA, IAA ve NAA nın 4 farklı dozu (0, 0.01, 0.1 ve 1.0 µm) test edilmiştir. Anaçlar, oksinler ve konsantrasyonlarına göre farklı tepkiler vermiştir. IBA ve IAA 11

22 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem Gözde DEMİRKÖK oksinleri tüm uygulamalarda NAA dan daha iyi sonuçlar vermiştir. G x N 22 anacı en iyi sonucu IBA ve IAA nın 0.01 µm konsantrasyonunda verirken, Marianna anacı µm konsantrasyonlarında en iyi sonucu vermiştir. Mirabolan anacı, oksin tipleri ve konsantrasyonlarına göre önemli tepkiler vermemiştir. Sonuçta, NAA in Prunus anaçlarının in vitro çoğaltımı için uygun olmadığı tespit edilmiştir (Silveira, 2000). Doku eksplantları, Pennsylvania daki bahçede bulunan Prunus serotina Ehrh. nin (Kara kiraz) kış tomurcuklarından ve New York ta yetiştirilen 50 yaşındaki üç ağaçtan sağlanmıştır. Kış sonunda tomurcuklar kabarmaya başladığı zaman ince dallar alınmış ve eksplantlar hazırlanmıştır. MS ortamına 100 mg/l I- inositol, 0.4 mg/l thiamine- HCl, 1.0 mg/l BAP, 0.1 mg/l GA 3, 0.1 mg/l IBA, % 2 sakkaroz ve % 0,7 phytagar eklenmiştir. Kardeşlenmeler, 0.75 mg/l BAP, 0.2 mg/l GA 3, mg/l IBA ve % 3 sakkaroz içeren MS ortamında elde edilmiştir. Her 3-4 haftada 5 kat sürgün çoğaltımı sağlanmıştır. Sürgünler, 100 mg/l I-inositol, 0.4 mg/l thiamine-hcl, 1.0 mg/l IBA, %3 sakkaroz, % 0.7 pytagar ilave edilen MS ortamında, 16 saat fotoperiyot uygulamasında, 14 gün sonra köklenmişlerdir. Karanlık uygulamasıyla da köklenme arttırılabilmiştir. Bitkiciklerin in vitro çoğaltma, köklenme ve dış ortama transferi başarılı olmuştur (Tricoli ve ark., 1985). (Cos ve ark., 2004) çalışmalarında, MS, WPM, DKW kültür ortamları ile şeftali x badem melezi olan Mayor için özel olarak hazırlanan ME kültür ortamını kullanılmışlardır. Mayor un kullanılan bu 4 kültür ortamındaki çoğalma miktarı ve çoğalma oranının belirlenmesine çalışılmıştır. Ayrıca elde edilen bitkilerin, yaprak sayısı ve boyu, vitrifikasyon gösteren eksplantların oranı da incelenmiştir. Büyümeyi düzenleyici madde olarak 1.0 mg/l BAP ve 0.1 mg/l IBA kullanılmıştır. Ortamlara 30 g/l sukroz ve 7 g/l Bacto Agar Difco ilave edilmiştir. Büyümeyi düzenleyici maddeler daha önce yapılan ön çalışmalar sonrasında belirlenmiştir. Sonuçlar, en iyi kültür ortamının ME olduğunu göstermiştir. Bu ortamda eksplantların çoğalma oranı 5.21 olarak bulunmuştur. Bu sonuç, diğer 3 ortamdan alınan çoğalma oranlarıyla karşılaştırıldığında önemli bir fark teşkil etmiştir. Eksplant uzunluğu ve yaprak sayısı da bu ortamda daha fazla olmuş ayrıca vitrifikasyon semptomları daha az görülmüştür. Büyümeyi düzenleyici maddelerle yapılan çalışmada en iyi çoğalma 12

23 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem Gözde DEMİRKÖK oranı 1.0 mg/l ve 1.5 mg/l BAP ile 0.1 mg/l IBA içeren ortamlardan alınmıştır. 1.0 mg/l BAP ve 0.1 mg/l IBA kullanıldığında vitrifikasyon semptomları azalmış ve bu konsantrasyon optimum olarak belirlenmiştir. 2 mg/l GA 3 eklendiğinde çoğalma miktarı azalmış ancak eksplantların boyunda artış olduğu tespit edilmiştir. (Zilkah ve ark., 1993) çalışmalarında, PNRSV için kullanılan indikatör bitkilerin in vitro çoğaltımı için bir protokol geliştirmişlerdir. Prunus tomentosa ve Prunus serrulata (Shirofugen) indikatörleri bu yöntemle çoğaltılmıştır. Sürgün gelişim aşamasında, Shirofugen için 0.09 µm 2,4-D, µm GA 3 ve 4.4 µm BA içeren Boxus ortamı ve Prunus tomentosa için 0.05 µm IBA, 0.89 µm BA içeren AP (Almehdi and Parfitt) kültür ortamı için kullanılmıştır. Kardeşlenme aşamasında, Shirofugen için AP µm IBA, 2.2 µm BA ve 0.58 µm GA 3 ve Prunus tomentosa için AP µm BA, 0.05 µm IBA, köklenme aşamasında ise Prunus tomentosa için ½ MS µm NAA ve Shirofugen için 4.9 µm IBA ortamları kullanılmıştır. PNRSV infekteli şeftaliler steril koşullarda indikatörlerle resiplokal olarak aşılanmıştır. İndikatörlerde virüs taşınması ELISA yöntemiyle test edilmiştir. Amerika nın merkezinde ve doğusunda tomruk ve kereste üretimi için önemli olan Prunus serotina Ehrh. (Kara Kiraz) için rejenerasyon protokolü oluşturulmuştur. Nodal parçalar 4.44 µm BA, 0.49 µm IBA ve 0.29 µm GA 3 içeren MS ortamında kültüre alınmıştır. 3 genotipin yaprak eksplantları WPM ortamına konulmuştur. Ortama 0, 2.27, 4.54 ve 6.81 µm TDZ (thidiazuron); 0, 0.54, 1.07 ve 5.37 µm NAA, 0, 4.44, 8.88 ve µm BA; 0, 0.54, 1.07 ve 5.37 µm NA büyümeyi düzenleyicileri ilave edilmiştir. Kültürler 3 veya 5 hafta karanlık ortamda tutulmuş ve sonra 16 saat fotoperiyod koşullarına alınmışlardır. Sürgün rejenerasyonunda TDZ ve genotip kombinasyonu çok önemli bir etkiye sahip olmuştur. Sürgün rejenerasyonunda en fazla (5.05 ± 1,14) eksplant sayısı 2.27 µm TDZ µm NAA, 3 hafta karanlık ve daha sonra 16 saatlik fotoperiyod koşullarından elde edilmiştir. En yüksek sürgün rejenerasyon oranı (38.3) ve sürgün sayısı (4.13 ± 0.97), 6.81 µm TDZ ve 1.07 µm NAA içeren ortamdan alınmıştır. Adventif sürgünlerde en yüksek köklenme (% 27) ve kök sayısı (2.3 ± 0.2), 2.5 µm IBA içeren ortam ve 7 gün karanlık uygulamasından sonra 16 saat fotoperyod uygulamasından elde edilmiştir. Nodal eksplantları çıkarılmış stok kültürlerin en yüksek köklenme oranı 13

24 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem Gözde DEMİRKÖK % 70 olmuştur. 4 gün karanlık ardından 16 saat fotoperyod uygulamasıyla, 2.5 µm IBA içeren ortamdan sürgün başına 2.7 ± 0.9 kök elde edilmiştir. Yaşama oranı kışın soğuk muhafazasından sonra % 100 ve serada iklimlendirme ile % 86 olarak bulunmuştur (Espinosa ve ark., 2006). MM-106 yapraklarından, 5.4 µm IAA ile 11 veya 22 µm BA içeren MS ortamında % 50 oranında sürgün rejenerasyonu sağlanmıştır. Ortama 0 dan % 20 ye doğru artan bir konsantrasyonda Phytophthora cactorum eklenmiş ve sürgün rejenerasyonunda azalma olduğu belirlenmiştir (Ancherani ve ark., 1990). Vişne bitkileri; 35, 100, 150 ve 250 mm NaCl ile 3 ve 10 mm lık CaCl 2 ilave edilen LS ortamında kültüre alınmışlardır. 3 mm CaCl 2 ile mm NaCl dozlarının kombinasyonları olumsuz etkiler göstermiştir. Ortama 10 mm CaCl 2 eklendiğinde önemli bir gelişme görülmüştür (Lucchesini ve Vitagliano, 1993). Işığın ( nm) kalitesi, karanlık uygulaması ve kimyasal kompozisyonunun GF-677 klonal anacının köklenmesine etkisi üzerinde çalışılmıştır. Sürgün eksplantları sarı, yeşil, mavi, kırmızı ve beyaz (tanık) flouresan tüplerinde 4 hafta aydınlatmaya maruz bırakılmıştır. Bazı eksplantlar köklenme aşaması boyunca karanlıkta tutulmuştur ve diğerleri sadece ilk 2 veya 4 gün için yalnızca kırmızı, mavi, yeşil, sarı ışıkta veya karanlıkta tutulmuş, daha sonra beyaz (tanık) ışığa transfer edilmiştir. Beyaz ışığın adventif kök için en etkili radyasyon kaynağı olduğu belirlenmiştir. Sürekli karanlıkta tutulan bitkilerin kök gelişimi durmuş, kırmızı ışıkta tutulan bitkilerde ise köklenme azalmıştır. İlk 2 veya 4 gün karanlık, sarı yada mavi ışığa maruz bırakılan bitkilerde kök gelişiminin beyaz ışığa maruz kalan bitkilerin sonuçlarına yakın sonuçlar verdiği belirlenmiştir. Yeşil ışık köklerde Fe konsantrasyonunun artmasını sağlamıştır (Antonopoulou ve ark., 2004). 14

25 3. MATERYAL VE METOD Şebnem Gözde DEMİRKÖK 3. MATERYAL VE METOD Çalışma, yıllarında Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Biyoteknoloji Laboratuvarı nda yürütülmüştür. Materyal olarak Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Araştırma ve Uygulama Parseli nde bulunan AK-1, AK-2 ve GF-677 badem x şeftali melez anaç genotiplerine ait sürgün uçları kullanılmıştır Materyal GF-677 Anaç Genotipinin Genel Özellikleri Kireçli topraklara uygun, kloroz, Phytopthora ve kök kanserine dayanıklı, yüksek kalitede meyve oluşumu sağlayan kuvvetli bir anaçtır. Diğer meyve türleri gibi meyveye yatma sorunu olmayıp, ağaçları hemen ikinci yılda meyve vermeye başlayan şeftaliler için kısa sürede büyük taçlı ağaçlar oluşturması bakımından GF- 677 bugün dünyanın birçok yerinde olduğu gibi Ege, Akdeniz, Marmara ve GAP bölgesi için de önerilebilen bir anaçtır (Küden, 2000). GF-677 nin Genel Özellikleri(Rahan Meristem, 1998): Badem x şeftali melez anacıdır. Fransa orjinlidir. Vegetatif yolla çoğaltılır (Doku kültürü ve aşı ile). Erik, badem, nektarin ve şeftaliler için aşılamaya uygundur. Patojensiz bitkilerdir. Arazi koşullarında bir örnek büyüme sağlarlar. Yeniden dikim için önerilir. Kuvvetli gelişim gösteren güçlü ağaçlardır. Toprakta gelişimi iyidir. Kuraklığa toleransı yüksektir. Yüksek verim sağlar. Ağır, orta ve hafif topraklar için uygundur. 15

26 3. MATERYAL VE METOD Şebnem Gözde DEMİRKÖK AK-1 ve AK-2 Anaç Genotiplerinin Genel Özellikleri AK-1 ve AK-2 melez genotipleri, Nonpareil (Prunus dulcis Mill.) badem tohumlarından elde edilmiş badem (Prunus dulcis Mill.) x şeftali ( Prunus persica L.) melezleridir (Şekil 3.1 ve Şekil 3.2). Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Öğretim Üyeleri Prof. Dr. Ayzin B. KÜDEN ve Prof. Dr. Ali KÜDEN tarafından badem tohumlarının tesadüf çöğürlerinden seçilmiş melez bireyler olarak bulunmuştur. In vivo koşullarda yapılan köklendirme denemelerinde Kasım ayında alınan çeliklere IBA nın farklı dozları uygulanarak sisleme ünitesine alınmış ve AK-1 ile GF-677 genotipleri benzer oranlarda (% 40), AK-2 her ikisinden daha üstün oranlarda (% 90) köklenme sağlamıştır (Gangal, 2004). Çizelge 3.1 de GF-677, AK-1 ve AK-2 melez anaçlarında 1000 ppm IBA uygulamasının köklenme ve kallus oluşumu üzerine etkileri verilmiştir. Şekil 3.1. AK-2 badem x şeftali melez yaprağının GF-677, badem ve şeftali yaprağı ile karşılaştırılması. 16

27 3. MATERYAL VE METOD Şebnem Gözde DEMİRKÖK Şekil 3.2. AK-1 badem x şeftali melez yaprağının GF-677, badem ve şeftali yaprağı ile karşılaştırılması. Çizelge 3.1. GF-677, AK-1 ve AK-2 melez anaçlarının odun çeliklerine 1000 ppm IBA uygulamasının köklenme ve kallus oluşumu üzerine etkileri (Gangal,2004). Anaçlar Köklenme Oranı (%) Kallus Oluşumu(%) Ort. Kök Sayısı (adet) GF AK AK

28 3. MATERYAL VE METOD Şebnem Gözde DEMİRKÖK 3.2. Metod Sürgün Ucu Yöntemiyle In vitro Klonal Mikroçoğaltım Çalışmaları Kültür Ortamları ve Hazırlanması Araştırmada Murashige ve Skoog (1962) makro ve mikro besin elementleri, vitaminleri ve Fe-NaEDTA kompozisyonu sürgün geliştirme, çoğaltma ve köklendirme aşamalarında değiştirilmeden kullanılmıştır. Büyümeyi düzenleyicilerden; sürgün geliştirme ve çoğaltma aşamasında 0, 0.5, 1.0 ve 1.5 mg/l BAP konsantrasyonları, 0.1 mg/l GA 3 ve köklendirme aşamasında ise 0.5, 1.0 ve 1.5 mg/l IBA konsantrasyonları ile büyümeyi düzenleyici madde içermeyen tanık MS ortamları kullanılmıştır. Sürgün geliştirme, kardeşlenme ve köklendirme aşamalarında kullanılan kültür ortamlarının bileşenleri ayrıntılı olarak Çizelge 3.2. ve Çizelge 3.3 te verilmiştir. Bütün kimyasallar eritildikten sonra hacim tamamlanmış ve 1 N lik HCl ve 1 N lik KOH kullanılarak ph 5.8 e ayarlanmıştır. Katılaştırıcı olarak agar kullanılmıştır. Hazırlanan ortamlar, ısıtıcı üzerinde kaynamaya başlayıncaya kadar ısıtılmış ve 2.5 cm çap ve 25 cm uzunluğundaki deney tüplerine 10 ml/tüp olacak şekilde dağıtılarak 121 C sıcaklık ve 1.05 kg/cm 2 basınç altındaki otoklavda 15 dakika süre ile sterilize edilmiştir. Çoğaltma ve köklendirme aşamalarında da yine 2.5 x 15 cm boyutlarındaki tüpler kullanılmıştır Dokuların Hazırlanması Çalışmada kullanılan AK-1, AK-2 ve GF-677 badem x şeftali melez genotiplerine ait taze sürgünler laboratuvara getirilmiş, musluk altında yıkandıktan sonra, yüzey direncini kırmak amacıyla 4 dakika %70 lik etil alkol çözeltisinde, daha sonra % 20 lik sodyum-hipoklorit ve bir iki damla Tween-20 içeren solüsyonda 5 dakika bekletilmiş ve steril kabin içerisinde 3-4 kez steril saf su ile çalkalanmıştır. 18

29 3. MATERYAL VE METOD Şebnem Gözde DEMİRKÖK Çizelge 3.2. Sürgün geliştirme ve kardeşlenme aşamasında kullanılan kültür ortamının bileşimi (Murashige ve Skoog, 1962) Makro Elementler (mg/l) KNO NH 4 NO CaCl MgSO 4.7H 2 O 370 KH 2 PO Mikro Elementler (mg/l) KI 0.83 H 3 BO MnSO 4.H 2 O 16.9 ZnSO 4.7H 2 O 8.6 Na 2 MoO 4.2H 2 O 0.25 CuSO 4.5H 2 O CoCl 2.6H 2 O Fe-NaEDTA Vitaminler (mg/l) Myo-inostol 100 Thiamine-HCl 0.4 Büyümeyi Düzenleyiciler(mg/l) BA GA Karbonhidratlar(g/l) Sukroz 30 Diğer Maddeler (g/l) Agar 8 19

30 3. MATERYAL VE METOD Şebnem Gözde DEMİRKÖK Çizelge 3.3. Köklendirme aşamasında kullanılan kültür ortamının bileşimi (Murashige ve Skoog, 1962) Makro Elementler (mg/l) KNO NH 4 NO CaCl MgSO 4.7H 2 O 370 KH 2 PO Mikro Elementler (mg/l) KI 0.83 H 3 BO MnSO 4.H 2 O 16.9 ZnSO 4.7H 2 O 8.6 Na 2 MoO 4.2H 2 O 0.25 CuSO 4.5H 2 O CoCl 2.6H 2 O Fe-NaEDTA Vitaminler (mg/l) Myo-inostol 100 Thiamine-HCl 0.4 Büyümeyi Düzenleyiciler(mg/l) IBA GA Karbonhidratlar(g/l) Sukroz 30 Diğer Maddeler (g/l) Agar 8 20

31 3. MATERYAL VE METOD Şebnem Gözde DEMİRKÖK Sürgün Uçlarının Kültüre Alınması ve Kültür Koşulları Sterilizasyonu yapılan bitki materyallerinden büyüme konisi ve 2-3 yaprak taslağı kalacak şekilde yaklaşık mm büyüklüğündeki sürgün uçları alınarak, 0.5, 1.0 ve 1.5 mg/l BA içeren ve BA içermeyen sürgün geliştirme ortamında kültüre alınmışlardır. Dikim işleminden sonra tüplerin kapakları kapatılmış ve kapakların alt kısımları hava almayacak biçimde şeffaf folyo ile sarılmıştır. Fenolik bileşik salgısının azaltılması için sürgün uçları 1 hafta süre ile karanlıkta tutulmuş, daha sonra tüpler 25-26ºC ve lüks ışık yoğunluğundaki kültür odasına alınmışlardır Alt Kültüre Alma ve Köklendirme Sürgün geliştirme ortamında gelişen sürgünler 4 haftada bir yeni ortamlara aktarılmışlardır. Yeterli bitki sayısına ulaşılınca sürgünler 0, 0.5, 1.0 ve 1.5 mg/l IBA içeren köklendirme ortamlarına alınmışlardır. Köklendirme ortamında 4 hafta sonra köklenen bitkiciklerin dış ortama adaptasyonlarını sağlamak amacıyla, tüplerin kapakları kademeli olarak açılmış daha sonra tamamen çıkarılmış ve bitkiciklerde kök sayımları yapılmıştır Deneme Değişkenleri Araştırmada Eylül ayında alınan sürgün uçlarının canlılık, sürgün oluşturma ve köklenme oranları incelenmiştir. Sürgün geliştirme ortamında gelişen ve sürgün haline dönüşen sürgün uçları kardeşlenme ortamına transfer edilmiştir. Sürgün ortamında gelişen bitkicikler köklendirme ortamına aktarılmışlardır. 21

32 3. MATERYAL VE METOD Şebnem Gözde DEMİRKÖK Çalışmada Yapılan Sayım ve Gözlemler Sürgün geliştirme aşamasında, sürgünlerin canlılık oranı, sürgün verme katsayısı aşağıda belirtilen şekilde hesaplanmıştır. Canlı Sürgün Sayısı Sürgünlerin Canlılık Oranı (%) = x 100 Toplam Sürgün Sayısı Alt Kültürdeki Sürgün Sayısı Sürgün Verme Katsayısı = Sürgün Veren Bitki Sayısı Sürgün geliştirme ortamında gelişen bitkicikler 4 hafta sonunda köklendirme ortamına aktarılmışlardır. Köklendirme ortamına alınan bitkiciklerin 4 hafta sonunda köklenme oranı ve mikrosürgün başına düşen kök sayıları aşağıda belirtilen şekilde hesaplanmıştır. Köklenen Bitki Sayısı Köklenme Oranı (%) = x 100 Toplam Bitki Sayısı Toplam Kök Sayısı Mikrosürgün Başına Düşen Kök Sayısı = Toplam Köklenen Bitki Sayısı 22

33 3. MATERYAL VE METOD Şebnem Gözde DEMİRKÖK In vitro çoğaltmada deneme, tesadüf parselleri deneme desenine göre 4 yinelemeli ve her yinelemede 10 sürgün ucu olacak şekilde düzenlenmiş ve gruplandırmada Tukey Testi kullanılmıştır. 23

34 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Şebnem Gözde DEMİRKÖK 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Sürgün Gelişmesi Aşamasına Ait Deneme Sonuçları Sürgün gelişmesi aşamasında farklı dozlarda kullanılan BA konsantrasyonlarının GF-677, AK-1 ve AK-2 klonal anaç genotiplerinde sürgün canlılığı, gelişimi ve kardeşlenme üzerine olan etkileri incelenmiştir. Şekil 4.1 de bitkilerin büyütme odasındaki genel görünümleri verilmiştir Sürgünlerin Canlılık Oranları Farklı BA konsantrasyonlarının GF-677, AK-1 ve AK-2 anaçlarının canlılık oranları üzerine etkileri Çizelge 4.1 de verilmiştir. Kullanılan genotipler ve ortamlar istatistiksel olarak değerlendirilmiş ve BA içermeyen kültür ortamı, diğer kültür ortamlarından farklı grupta yer almıştır. Genotipler değerlendirildiğinde; AK-1 ve AK-2 aynı istatistiksel grupta yer alırken, GF-677 farklı bir grupta yer almıştır. BA içermeyen kültür ortamında en düşük (% 53.33) canlılık oranı elde edilmiştir. Kullanılan diğer ortamlardaki ( ve 1.5 mg/l BA) sürgün uçlarının canlılık oranı % 100 olarak bulunmuştur. Çeşitler kıyaslandığında AK-2 (% 65) ve AK-1 (% 55) klonal anaç genotipleri, GF-677 (% 40) klon anacına göre daha yüksek canlılık oranlarına sahip olmuşlardır. AK-2 genotipinin tüm ortamlardaki canlılık oranı ortalaması % 91.25, AK-1 genotipinin % 88.75, GF-677 klon anacının ise % 85 olmuştur. Genotiplerin canlılık oranları ve kullanılan ortamlara gösterdikleri tepkiler arasındaki farklılıklar, Battistini ve Paoli (2002) nin çalışmalarında belirttikleri gibi klonların farklı olmasından kaynaklanmaktadır. Araştırıcılar şeftali anaçlarında yaptıkları çalışmada, önemli farklılıklar tespit etmiş ve bunların genotipten ve genotiplerin adaptasyon kabiliyetinin ayrı olmasından kaynaklandığını, bu nedenle klona özel çalışmaların yapılması gerektiğini bildirmişlerdir. 24

35 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Şebnem Gözde DEMİRKÖK Çizelge 4.1. Farklı BA konsantrasyonlarının GF-677, AK-1 ve AK-2 anaçlarında canlılık oranları (%) üzerine etkileri. BA (mg/l) Ortalama Çeşit GF b AK a AK a Ortalama b a a a D%5 (çeşit x ortam) : 6.76 D%5 (çeşit ) : 3.38 D%5 (ortam) : 3.90 Şekil 4.1. Büyütme odasındaki denemeden genel bir görünüm. 25

36 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Şebnem Gözde DEMİRKÖK Sürgünlerin Kardeşlenme Sayıları Farklı BA konsantrasyonlarının GF-677, AK-1 ve AK-2 klonal anaç genotiplerinde kardeşlenme sayıları üzerine etkileri Çizelge 4.2 de verilmiştir. Denemede kullanılan genotipler ve ortamlar istatistiksel açıdan farklı gruplarda yer almıştır. En iyi kardeşlenme sayısı (2.42 sürgün/eksplant) 1.5 mg/l BA içeren ortamdan elde edilmiştir. Bu ortamı 0.5 mg/l BA (1.36 sürgün/eksplant) ve 1 mg/l BA (1.11 sürgün/eksplant) içeren ortamlar izlemiştir. En düşük değerler (0.20 sürgün/eksplant) BA içermeyen ortamdan alınmıştır. Kullanılan genotipler istatistiksel açıdan değerlendirilmiş ve farklı gruplarda yer almışlardır. AK-1 (4 sürgün/eksplant) ve GF-677 (2 sürgün/eksplant) genotipleri 1.5 mg/l BA içeren ortamda en iyi kardeşlenme sayısını vermişlerdir. Genotipler genel olarak değerlendirildiğinde en yüksek kardeşlenme (2.43 sürgün/eksplant) AK-1 genotipinden elde edilmiş bunu GF-677 genotipi (0.88 sürgün/eksplant) ve AK-2 genotipi (0.50 sürgün/eksplant) izlemiştir. Elde ettiğimiz bulgular, Silveira ve ark. (2001) nın yaptıkları çalışmanın aksine GF-677 anacının mikro çoğaltmada daha iyi sonuçlar verdiğini göstermiştir. Yapılan bir diğer çalışmada araştırıcılar, GF-677 genotipinde 1 mg/l BA içeren ortamın çoğaltmada en iyi sonucu verdiğini saptamıştır (Kamali ve ark., 2001). Yaptığımız çalışmada ise en iyi çoğaltma değerleri 0.5 ve 1.5 mg/l BA içeren ortamdan alınmıştır. Şekil 4.2 de eksplantların kültüre alınması aşamasından bir görünüm yer almaktadır. 26

37 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Şebnem Gözde DEMİRKÖK Çizelge 4.2. Farklı BA konsantrasyonlarının GF-677, AK-1 ve AK-2 anaçlarında kardeşlenme sayıları üzerine etkileri. BA (mg/l) Ortalama Çeşit GF b AK a AK c Ortalama 0.20 d 1.36 b 1.11 c 2.42 a D%5 (çeşit x ortam) : D%5 (çeşit ) : D%5 (ortam) : Şekil 4.2. Steril kabin içerisinde eksplantların kültüre alınması. 27