FOLLİKÜLER LENFOMADA TÜMÖR HÜCRESİ VE MİKROÇEVRE İLİŞKİSİNİN İMMÜNFENOTİPİK DEĞERLENDİRİLMESİ

Transkript

1 T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI TEMEL ONKOLOJİ PROGRAMI FOLLİKÜLER LENFOMADA TÜMÖR HÜCRESİ VE MİKROÇEVRE İLİŞKİSİNİN İMMÜNFENOTİPİK DEĞERLENDİRİLMESİ Biyolog NURTEN BAŞEL YÜKSEK LİSANS TEZİ TEZ DANIŞMANI PROF.DR. BERKSOY ŞAHİN ADANA

2 T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI TEMEL ONKOLOJİ PROGRAMI FOLLİKÜLER LENFOMADA TÜMÖR HÜCRESİ VE MİKROÇEVRE İLİŞKİSİNİN İMMÜNFENOTİPİK DEĞERLENDİRİLMESİ Biyolog NURTEN BAŞEL YÜKSEK LİSANS TEZİ TEZ DANIŞMANI PROF.DR. BERKSOY ŞAHİN Bu tez, Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından TF2009YL28 nolu proje olarak desteklenmiştir. Tez No:.. ADANA 2010

3 TEŞEKKÜR Tez çalışmamda katkıda bulunan hocam Prof. Dr. Berksoy ŞAHİN e, Patoloji Anabilim Dalı ndan hocam Prof. Dr. Melek ERGİN e, Biyoistatistik Anabilim Dalı ndan hocam Doç.Dr.Gülşah SEYDAOĞLU na Patoloji Anabilim Dalı ndan Uzm.Dr. Arbil AÇIKALIN a, Patoloji Anabilim Dalı ndan Teknisyen Kezban BOSTANER e ve Her zaman bana destek olan aileme II

4 İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR..II İÇİNDEKİLER III TABLO LİSTESİ..V ŞEKİL LİSTESİ..VI KISALTMA LİSTESİ VII ÖZET VE ANAHTAR KELİMELER..VIII ABSTRACT AND KEYWORDS.. IX 1. GİRİŞ VE AMAÇ.1 2. GENEL BİLGİLER Folliküler Lenfoma Sınıflama ve İmmünfenotipleme Folliküler lenfoma biyolojisi Folliküler lenfoma epidemiyolojisi Etyolojik faktörler Folliküler lenfoma patogenezi Klinik bulgular Laboratuvar bulguları Tanısal değerlendirme Evreleme Görüntüleme Prognostik faktörler Folliküler lenfoma tedavisi Evre I-II FL tedavisi Evre III-IV FL tedavisi Kemoterapi İnterferon Rituximab Lenfoma idiotip aşılar Kök hücre transplantasyonu Folliküler lenfomada yeni tedaviler Tümör İmmünolojisi.14 III

5 Tümörlere karşı immün yanıtlar Tümör antijenleri Kansere bağlı immünolojik baskılanma Kanser Tedavisine İmmünolojik Yaklaşımlar GEREÇ YÖNTEM Hastalar İmmünohistokimyasal testler CD4, CD8, CD57, CD68, FOXP3 Monoklonal Antikor Testleri İçin Öncelikle Yapılan Ortak Çalışma Prosedürü CD4 çalışma prosedürü CD8 çalışma prosedürü CD57 çalışma prosedürü CD68 çalışma prosedürü FOXP3 çalışma prosedürü İstatistik analiz BULGULAR Hasta bulguları Çalışılan monoklonal antikor sonuçları TARTIŞMA SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ.43 IV

6 TABLO LİSTESİ Tablo-1. Folliküler lenfoma Uluslararası Prognostik İndeksi (FLIPI) 11 Tablo-2. FLIPI ye göre sağ kalım oranları 11 Tablo-3. Olguların Karakteristik Özellikleri 23 Tablo-4. Follikül çevresi ve Follikül içi alandaki immün hücre miktarına 25 göre hasta sayıları Tablo-5. Bulundukları mikroçevre alanına göre her gruptaki hayatta olan hasta sayısı 26 V

7 ŞEKİL LİSTESİ Şekil-1. Hastaların Yaş Dağılımı 22 Şekil-2. Evrelere göre popülasyon dağılımı 23 Şekil-3. Hastalıksız sağkalım grafiği 25 Şekil-4. Toplam sağkalım grafiği 26 VI

8 KISALTMA LİSTESİ AEC : 3-Amino-9-Ethyl Carbazole BT : Bilgisayarlı Tomografi CSR : Class-Switch Recombinations DLBCL : Diffüz Büyük B Hücreli Lenfoma EBV : Ebstain Barr Virüsü FDG-PET : 18F-Fluorodeoksiglukoz Pozitron Emisyon Tomografi FL : Folliküler Lenfoma FLIPI : Folliküler Lenfoma Uluslararası Prognostik İndeks FOXP3 : Forkhead box protein P3 Hb : Hemoglobin HL : Hodgkin Lenfoma Hpf : Büyük büyütme mikroskop alanı IPI : Uluslararası Prognostik İndeks LAP : Lenfadenopati LDH : Laktik Dehidrogenaz µ : Mikron NHL : Non-Hodgkin Lenfoma NK : Naturel Killer PBS : Phosphate Buffer Saline PET-CT : Pozitron Emisyon Tomografi W : Watt WHO : Dünya Sağlık Örgütü VII

9 ÖZET Folliküler Lenfomada Tümör Hücresi Ve Mikroçevre İlişkisinin İmmünfenotipik Değerlendirilmesi Folliküler Lenfoma (FL), patogenezinde tümör supressör genleri ve protoonkogenleri etkileyen, multiple genetik lezyonların progressiv ve klonal birikimi sözkonusu olan B hücreli neoplazi sınıfındandır. Batı ülkelerinde görülme sıklığı daha yüksektir. Amerika Birleşik Devletleri nde Non-Hodgkin lenfomaların %35 ini, Avrupa ülkelerinde %22 sini ve Türkiye de %9 unu folliküler lenfoma oluşturur. Folliküler lenfomada klinik davranış tümör hücreleri ile lenf nodundaki mikroçevre arasındaki interaksiyonla belirlenmektedir. FL'yı tanımlayan gen ekspresyon çalışmalarında, mikroçevrenin immün hücre kompanentlerinde eksprese edilen genlerin önemi anlamlı bulunmuştur. İmmün hücreleri ve lenfoma hücreleri arasındaki etkileşimlerin prognozda önemli olduğu görülmüştür. Tümör mikroçevresinin, FL'nın biyolojik davranışında önemli bir rol oynadığı anlaşılmış fakat bu düzenlemeyi içeren bazı hücre subgruplarının rolü keşfedilememiştir. Bu amaçla biz çalışmamızda Türkiye'de FL daki mikroçevreyi ve immün yanıt profilini araştırmayı ve Türkiye ile Batı Avrupa farkını ortaya koymayı hedefledik. Çalışmaya FL lı 27 hasta dahil edildi. Bu 27 hastanın 8 i kadın,19 u erkek ve yaş ortalaması 55.4 ± 13.40; yıl (ortanca yaş 54) idi. Ann-Arbor evreleme sistemine göre, 2 hasta evre I, 3 ü evre II, 12 si evre III ve 10 u evre IV olarak değerlendirildi. Hastalar, ortanca 28 ay takip edildiler. Retrospektif veri olarak yaş, cinsiyet, evre, tanı tarihi, aldığı kemoterapiler, kemoterapi yanıtları, nüks olup olmaması, progresyonsuz sağkalım zamanı, tanı anında tutulum bölgesi, tanı anında LDH düzeyi, B semptomları, toplam takip süresi ve son durumda hayatta olup olmamaları gibi klinik bilgiler incelendi. FL lı hastaların tanı anındaki doku örneklerinde CD4, CD8, CD57, CD68 ve FOXP3 monoklonal antikorları immünohistokimyasal olarak ölçüldü. Her bir monoklonal antikor için follikül çevresi ve follikül içi olmak üzere immün hücre sayımı yapıldı. İstatistiksel analiz için SPSS (The Statistical Package for the Social Sciences) paket programı kullanıldı. Veriler ortalama değer ± standart sapma olarak belirtildi. Hastaların toplam sağkalımı, ortanca 63 ay, hastalıksız sağkalım oranı ortanca 59 ay olarak bulundu. Follikül çevresi ve follikül içi alanda değerlendirilen monoklonal antikorlar (CD4, CD8, CD57, CD68 ve FOXP3) çalışmaya alınan olguların hepsinde, sayıları farklı olmakla birlikte, pozitif bulundu. Biz bu tümör belirleyicileri, literatürdeki çalışmalara göre kıyaslandığında FOXP3 ve CD4 ü azalmış bulduk. CD8, CD68, CD57 yi ise, FOXP3 ve CD4 pozitif hücre sayısına göre artmış bulduk. Tümör hücreleri ve değerlendirilen bu monoklonal antikorlar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmadı. Folliküler lenfoma mikroçevresindeki immün hücrelerin, folliküler lenfoma patogenezindeki rolü henüz netlik kazanmamıştır. Bu çalışmadaki sonuçlardan istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşılamaması, hasta sayısının yetersiz olmasıdır. Daha yüksek popülasyonlarla yeni çalışmalara gereksinim vardır. Anahtar sözcükler: Folliküler lenfoma, Mikroçevre immünfenotip, Tümör ilişkili makrofajlar, FOXP3, CD57 VIII

10 ABSTRACT Evaluation Immunophenotypically Of Relations Between Tumor Cells And Their Microenvironment In Follicular Lymphoma Follicular lymphoma(fl), is classified as a B-cell neoplasia with progressive and clonal accumulation of multiple genetic lessions that effected tumor supressor genes and protooncogens in their pathogenesis. Its frequency is higher in Western countries. In USA 35% of Non- Hodgkin s lymphomas are follicular lymphoma while it is 22% in European countries and 9% in Turkey. Clinical behaviour in follicular lymphoma is determined by interaction between tumor cells and microenvironment in lymp nodes. Genes that expressed in the immun cell components of microenvironment found as significant in genes expression studies that defined FL. Interactions between immun cells and lymphoma cells have been seen important in prognosis. It is understood that tumor microenvironment played an important role in biological behaviour of FL but is not explored a role of subtypes that some cells involved this regulation. We aimed to investigate the microenvironment of follicular lymphoma in Turkey and the profile of immun response and we targeted to expose the difference between Turkey and West Europe. Twenty-seven patients with FL have been included to study. 8 females, 19 males and mean age 55.4 ± 13.40; years (median age 54 years). According to classification 2 patients were in stage I, 3 were in stage II, 12 were in stage III and 10 were evaluated as stage IV FL. Patient s median follow up time was 28 months). As retrospective data; age, sexuality, stage, date of diagnosis, received chemotherapies, responses of chemotherapies, relapse, PFS (progression free survival), involvement regions, LDH (Lactic Dehidrogenase) level in time of diagnosis, B symptoms, overall follow up time and live-death status have been examined. CD4, CD8, CD57, CD68, FOXP3 monoclonal antibodies have been measured by immunohistochemistry from biopys samples in the time of diagnosis of patients with FL. Number of immun cells have been counted as interfollicular and intrafollicular for each one of monoclonal antibody. The statistical Package for the Social Sciences (SPSS) program was used for statistical analysis. Data are expressed as mean values ± Standard deviation. Overall survival of patients with Follicular Lymphoma found as median 63 months. Progression free survival found as median 59 months. In intrafollicular and interfollicular areas evaluated monoclonal antibodies that CD4, CD8, CD57, CD68, FOXP3 were found as positive but their numbers were different in all patients. We found the FOXP3 and CD4 decreased according to studies compared in literatüre. We found the CD8, CD68 and CD57 increased according to FOXP3 and CD4 positive cells number. Correlation between tumor cells and evaluated monoclonal antibodies is not found a significance as statistic. The role of immun cells in follicular lymphoma microenvironment is unknown in follicular lymphoma pathogenessis. In this study, due to insufficient of patient number findings of trial are not significant as statistic. There is need to new clinic trials in more populations. Key words: Follicular lymphoma, immunfenotype of microenvironment, Tumorassociated macrophages, FOXP3, CD57. IX

11 1. GİRİŞ VE AMAÇ Dünya Sağlık Örgütü (WHO) lenfoma sınıflamasına göre folliküler lenfoma matür B hücreli neoplazi sınıfındandır. Folliküler lenfoma, Asya gibi dünyanın bazı bölgelerinde daha düşük insidansı olmasına rağmen, Avrupa ve Amerika da NHL (Non Hodgkin Lenfoma) vakalarının % kadarını oluşturur. NHL alt tiplerinin en yaygın ikincisidir 1. Ortalama yaşam süresi 8-10 yıldır. Bazen farkedilmeyen küçük-orta büyüklükte lenf nodlarıyla FL lı hastalar görülebilir. Genellikle servikal, aksillar, inguinal ve femoral bölgelerde ağrısız periferal lenfadenopatiler (LAP) vardır 2. Bazen de iliak, mesenteric, retroperitonel alanlar gibi derin bölgelerdeki lenf nodlarının yavaş büyümesiyle ilişkilidir. Bazı vakalarda, tek ve çoklu lenf nodlarıyla tümör hacmi önemli olabilirken, dalak büyümesi gibi atipik semptomlar da görülebilir 1. Son yıllarda, FL nın biyolojik davranışında tümör mikroçevresinin önemli bir rol oynadığı anlaşılmıştır. Fakat bu düzenlemede dahil olan spesifik hücre altgrupları bilinmemektedir 3. Daha önceki çalışmalarda, FL lı hastalar arasında uzayan sağkalımın, tanıda tümörde bulunan nonmalignent immün hücrelerinin moleküler özellikleriyle ilişkili olabileceği ileri sürülmüştür. FL sağkalımının geliştirilmesinde, lenfoma hücreleri ve onların hücresel partnerleri ve modelleri arasındaki interaksiyonların yol gösterici olabileceği düşünülmektedir 4. Foliküler lenfoma(fl) prognozunda farklı hasta gruplarında, prognostik öneminin olabileceği parametreler bugüne kadar tam olarak yapılamamıştır. Yeni biyolojik görüşlere imkan tanınarak yapılan gen ekspresyon çalışmalarında, mikroçevrede eksprese edilen genler anlamlı bulunmuştur. İmmün hücreleri ve lenfoma hücreleri arasındaki interaksiyonun dikkate değer olduğu görülmüştür. Bazı çalışmalarda CD8 + in prognozla uyumlu olabileceği bulunurken, bazı çalışmalarda CD8 ve CD4'ün önemli etkisi bulunamamıştır. CD68+ boyanmasıyla, yüksek bir makrofaj içeriğini tanımlayan zıt prognostik değer rapor edilmiştir. Bu bulgular, interferon+rituximab kombinasyonu alan bazı hasta gruplarında desteklenememiştir 1. FOXP3'ün, kesin olmamakla birlikte prognozla olumlu sonuçla ilgili olabileceği düşünülmüştür 3. Sonuçta çeşitli çalışmalarda bazı çelişkili bulgular rapor edilmiştir. Ayrıca bu immünohistokimyasal teknikler, B hücreli lenfomalarda henüz onaylanmamıştır 1. 1

12 Genetik kompanentlerin biyolojilerini daha iyi anlamak ve tümör mikroçevresinin immümmodülasyonunda temel terapötik stratejilerin gelişmesinde yardımcı olabileceği amacıyla, biz bu çalışmada folliküler lenfomada CD68, CD4, CD8, CD57 ve FOXP3 antikorlarını çalışarak, Türkiye'de FL daki mikroçevreyi ve immün yanıt profilini araştırmayı, elde edilen verilerle bu hastalığın prognostik ve prediktif etkilerini belirlemeyi ve Türkiye ile Batı Avrupa farkını ortaya koymayı hedefledik. 2

13 2. GENEL BİLGİLER Folliküler lenfoma (FL) batı dünyasında en sık görülen düşük dereceli bir Non- Hodgkin Lenfoma (NHL) tipidir. Bu grup hastalıkta da normal lenfoid yapı yerine anormal hücre birikimi vardır. FL, morfolojik ve biyolojik özellikleriyle nodal bir lenfoma olmakla birlikte, tanı anında sıklıkla kemik iliği tutulumunu da içeren yaygın hastalıkla karakterizedir. Nadir olarak ekstranodal tutulumlar da vardır. Hastalar genelde yaşlı erişkinlerdir. Folliküler lenfomalar başlangıçta indolent (yavaş) bir seyir izler. Ancak %25-35 olguda genelde diffüz büyük hücreli lenfomaya dönüşüm göstermektedir ve ilerlemiş vakalarda mevcut tedavilere yanıtsız kalabilmektedir 5. Folliküler lenfoma etyolojisini aydınlatmaya yönelik araştırmalar giderek artmaktadır. Neoplastik hücrelerin, immünmikroçevre ile olan ilişkileri ve sağkalım üzerindeki etkileri tam olarak aydınlatılamamıştır. FL için günümüze kadar tanımlanabilmiş küratif bir tedavi seçeneği yoktur, fakat yaşam kalitesini arttıran ve uzun dönem sağkalımı sağlayabilen tedaviler tanımlanmıştır. Çabalar bu hastalığın doğal hikayesini değiştirebilen stratejiler üzerinde odaklanmaktadır FOLLİKÜLER LENFOMA Son yıllardaki moleküler genetikteki gelişmelerin zenginleştirilmesi, özellikle tedavide yeni prensiplerin belirlenmesinde yol gösterici olmuştur. Artan biyolojik ve moleküler bilgiler umut verici bir biçimde FL nın daha iyi anlaşılmasının yanı sıra, terapötik olarak yeni yolların saptanmasını da sağlamıştır. Bu bakımdan gelecekte kür sağlayabilecek tedavi yöntemlerinin gereksinimi ve toplam sağkalımın geliştirilmesi için, FL mikroçevresindeki hücreler arasındaki etkileşim önemlidir Sınıflama ve İmmünfenotipleme WHO(Dünya Sağlık Örgütü) NHL sınıflandırmasına göre FL, matür-b-hücre neoplazmı sınıfındandır. Tipik olarak FL vakaları, çoğunlukla folliküler büyüme paterni ile karakterizedir. Neoplastik hücrelerin, sentrositler ve sentroblastların germinal merkez B-hücrelerinden kaynaklandığı düşünülmektedir. FL lar, 40x büyük büyütme 3

14 mikroskop alanındaki (hpf) sentroblastların sayısına göre gradlandırılırlar. Grade 1 FL larda 0-5 sentroblast/hpf, grade 2 vakalarda 6-15 sentroblast/hpf ve grade 3 FL larda >15 sentroblast/hpf bulunmaktadır 5. Grade I ve II FL indolent, grade III FL ise agresif(saldırgan) seyirli kabul edilmektedir. Günümüzde WHO(Dünya Sağlık Örgütü) sınıflandırmasında primer kutanöz FL, FL nın farklı bir varyantı olarak görülmektedir. Sıklıkla baş-boyun bölgesinde veya gövdede yerleşimlidir. Lokal tedavi ile tedavi edilebilir ve klasik FL larla kıyaslandığında daha indolent bir klinik davranış sergilerler. Nodal FL lara zıt şekilde primer kutanöz lenfomalar sıklıkla BCL-2 aşırı ekspresyonu yapmaz ve t(14;18) yeniden düzenlenmesi de yoktur 5. İmmünfenotipik olarak neoplastik hücreler pan-b-hücre antijenleri olan CD19, CD20, CD22, BSAP/PAX-5 ve CD79a eksprese ederler. Tümör hücreleri ayrıca genellikle follikül merkez hücre ilişkili antijenler olan CD10 ve BCL-6 da eksprese ederler 6,7. FL da CD5 ve CD43 negatiftir, sadece nadiren grade 3 FL vakalarında CD43 pozitifliği olabilmektedir 8,9,10. Bcl-2 ekspresyonu vardır. Folliküler büyümede neoplastik folliküler, CD21 pozitif folliküler dendritik hücre(fdc) ağ örgüsüyle ilişkilidir. FDC ağ örğüsü periferde genelde korunmuş iken, merkezde sıklıkla parçalanmıştır 11, Folliküler Lenfoma Biyolojisi Folliküler lenfomanın bazen alevlenme bazen de sönme şeklindeki bilinen özelliklerinde hastanın immün yanıtı anahtar faktör olarak kabul edilmiştir. Bu nedenle aşılar ile olan terapötik yaklaşımlar için aday olabilecekleri düşünülmüştür. Gen ekspresyon profili ile elde edilen yeni moleküler bilgiler, folliküler lenfomada sağkalım ile ilişkisi olan malign B-hücre popülasyonundan çok, zemindeki T-hücre ve makrofaj popülasyonları olduğunu düşündürmektedir 13. Ayrıca diğer gen ekspresyon profil gözlemleri, folliküler lenfomadan diffüz büyük B-hücreli lenfoma (DLBCL) ya dönüşüm olayında yer alan klinik ve morfolojik spektrumun daha iyi anlaşılmasını sağlamıştır 14,15. FL lı hastalarda, yeni bir biyopside büyük hücrelerin yayıldığı bir alan görünümü histolojik transformasyonu tanımlar. Transformasyon ile ilişkili olan klinik faktörler tamamen karakterize değildir. Transforme folliküler lenfomada disregülasyonu 4

15 gösterilen genler ise onkojen c-myc geni ile hücre döngü kontrolü ve artmış metabolizma ile ilişkili olan çeşitli genleri içerir 16. Hastalık biyolojisinin anlaşılması için diğer bir yapı BCL-2 yapısıdır 17. Tümör hücreleri genel olarak anti-apoptotik protein BCL-2 eksprese ederler. Bu normalde BCL-2 ekspresyonunu durduran normal germinal merkez B-hücreleri ile keskin bir karşıtlık oluşturur. Böylece BCL-2 proteininin aşırı ekspresyonu, neoplastik follikülleri reaktif olanlardan ayırmaktadır. BCL-2 geninin anormal ekspresyonu, kromozom 18 üzerindeki BCL-2 geninin kromozom 14 deki IgH geni ile t(14;18) translokasyonuna bağlıdır. Sonuç olarak, BCL-2 gen transkripsiyonu immunoglobulin ağır zincir gen promotörünün kontrolü altına girmekte ve bu da BCL-2 proteininin aşırı ekspresyonu ile sonuçlanmakta ve tümör hücrelerine sağkalım avantajı sunmaktadır. BCL-2 ekspresyon sıklığı sitolojik grade e göre değişme eğilimindedir. Oran olarak grade 1 de yaklaşık %100 iken, grade 2 de %80 den fazla, grade 3 FL daysa %70 arasında değişmektedir 18. Batı dünyasındaki folliküler lenfomaların çoğunda (yaklaşık %85) BCL-2 gen yeniden düzenlenmesi mevcut olup 19, FL ların yaklaşık %15 inde BCL-2 gen yeniden düzenlenmesi bulunmamaktadır. Ancak bu olgularda diğer sitogenetik anormallikler ortaya çıkabilmektedir 20,21. Polimeraz zincir reaksiyonu(pcr), folliküler lenfoma hastalarının çoğunun BCL-2 gen yeniden düzenlenmesi ile birlikte olan hücrelerin varlığının monitörize edilmesini sağlar. Bu yaklaşım rezidüel hastalığın duyarlı olarak ölçülmesini de sağlamaktadır 22, Folliküler Lenfoma Epidemiyolojisi Batı toplumlarında tüm Non-Hodgkin Lenfomaların yaklaşık %40 ını indolent lenfomalar teşkil eder. Folliküler lenfomalar ise bu grup lenfomaların en büyük ve en kolay tanınabilen kategorisidir. Batı istatistiklerinde Non-Hodgkin Lenfomalar içerisinde folliküler lenfoma görülme oranı %22 dir. Nedeni bilinmemekle birlikte folliküler lenfoma insidansı Batı ya göre, Orta Doğu ve Asya da daha düşüktür. Bu grup lenfomalar orta yaş öncesinde nadir olup, median görülme yaşı tır 24. Erişkinlerde en sık düşük dereceli foliküller lenfomalar görülür. Kadınlar ve erkekler eşit sıklıkta etkilenmektedir. 5

16 Etyolojik Faktörler Bazı infeksiyöz ajanlar, otoimmün hastalıklar ve immünosupresyon risk faktörü olarak tanımlansa da, etyolojik faktörlerin büyük kısmı hala bilinmemektedir 25. Birçok FL olgusu özel etyolojik bir faktöre bağlı olmaksızın görülebilir. Buna rağmen epidemiyolojik olarak bazı risk faktörleri belirlenmiştir. Toprakla uğraşanlarda daha sıktır. Kimyagerler, kuru temizleme, boya ve ağaç işçileri ve kozmetikle uğraşanlar risk gruplarıdır. Fenoksiasetik asit, klorfenoller, başta benzen olmak üzere çeşitli solventlere maruz kalma ve kozmetikler içinde özellikle saç boyası riski arttırdığı bilinen kimyasallardır. Fazla protein almak, az sebze tüketmek ve az vitamin almak riski artıran diyetsel özelliklerdir. Kan transfüzyonu, enfeksiyon ajanlarını bulaştırma ve neden olduğu immün baskılama yolu ile lenfoma riskini artıran bir diğer etkendir. Radyasyon majör risk faktörüdür. Ailevi ve edinsel immün yetmezlik durumunda ve ailesinde lenfoma öyküsü olanlarda daha sık görülebilir Folliküler Lenfoma Patogenezi Patogenezinde, multiple genetik lezyonların progressiv ve klonal birikimi sözkonusudur. B-hücreli lenfomaların, B-hücre diferansiyasyon yolağı boyunca tüm basamaklardan oluşabildiği gösterilmiş ve B-hücre olgunlaşmasının donmuş safhası olarak tanımlanmıştır. B-hücreli lenfomalar, nonmalignent karşılıklarının özelliklerini göstermesine rağmen, multiple genetik anormalliklerden oluşanlardan farklıdırlar. Gen ekspresyon profil çalışmaları, orjin hücresinin bazı karekteristiklerini kaybetmeyen B- hücreli lenfomaları tartışmayı sağlamıştır 16,27. Bu çalışmalar hücresel diferansiyasyon, transkripsiyon faktörleri, sinyal yolakları ve lenfoid malignensilerde ve normal lenfoid hücrelerde incelenen önemli diğer düzenleyici moleküller gibi, genomik bir skalada eksprese edilen genleri koordineli olarak tanımlamaya izin verniştir. Bu çalışmalar, aynı zamanda lenfomaların prognostik alt gruplarıyla ilişkili tanınmayan önceki özelliklerini tanımlamıştır 27. Ayrıca gen ekspresyon profil çalışmaları, stromal ve çok yanıtlı hücrelerden ibaret tümör mikroçevresinin dağılımını, ve onun biyolojik davranışını inceleyen ve tümör gelişimine olası etkili diğer faktörlerden ibaret eğitici bir platformu tanıtmıştır. FL da gen ekspresyon profili, T hücreler ve makrofajlar gibi nonmalignent hücreler tarafından oluşturulan immün yanıt özellikleriyle ilişkili olabilen, FL hastalığı olan hastaların sağkalımını yükseltmiştir 13. FL da biyopsi örneklerinde kullanılan bir 6

17 anti-cd68 antikorunun immünohistolojik analizi, daha kötü bir toplam sağkalımı veren lenfoma-ilişkili makrofaj infiltrasyonunun yükseldiğini gösterdi 28. Benzer olarak, CD4 ve FOXP3 (immünohistokimyasal ölçüm ile) eksprese eden tümör-infiltre lenfositlerin, FL lı hastalarda sağkalımın gelişmesiyle karşılıklı ilişki içinde olduğu gösterildi 29,30. Tümör mikroçevresinin, FL nın biyolojik davranışını etkilediğini bu çalışmalar ifade etmiştir. FL nın tanımlanan genetik hatası t(14;18) translokasyonu, sağlıklı bireylerin önemli bir oranının periferal kanında bulunur. Hareketsiz saf B hücrelerinde başlangıçta oluşan görüşe rağmen, Roulland ve ark. 31 yaptıkları bir çalışmada, sağlıklı bireylerde t(14;18) + hücrelerin zaten CSR (class-switch recombinations) olduğunu göstermişlerdir. Sağlıklı bireylerden bu t(14;18) + hücreler, SHM(somatic hypermutation) ve CSR(germinal-merkez geçişini belirler) olan germinal-merkezli B hücrelerden oluşan FL hücrelerine bundan dolayı benzerdir. FL nın %80 inde CSR, verimli olmayan allelde olduğu kadar verimlide de oluşur. Verimli allelde t(14;18) translokasyonu, IgV bölgelerini bozar ve IgM-IgD bölgesi silinir. Bununla birlikte, verimli olmayan allelde bu bölge, IgM ve IgD yüzeyini ifade eden çoğu FL da olduğu gibi korunur. Aynı zamanda bu paradoksik ekspresyon modelinin, t(14;18) + hücreleri taşıyan sağlıklı bireylerde var olduğu bulunmuş ve uzamış B-hücreli sağkalımı onaylayan germinal merkezde BCL-2 nin ektopik ekspresyonu olan hipotezine öncülük etmiştir. Bu nedenle bu B hücreleri üzerinde sağkalım avantajı verir. Ek olarak, sağlıklı bireylerde t(14;18) + B hücrelerin antijen reseptöründen dolayı antijen stimülasyonuna yanıt verilir. Antijen reseptörü sinyali sayesinde neoplastik transformasyona yardım edilmiş olunabilir. Bu bulgu, t(14;18) + B hücrelerin normal bireylerde önceki görünümüne yeni bir ışık tutar 31,32,33. Gen ekspresyon çalışmaları, önceden tanımlanmamış transkripsiyonel düzenleme ile ilgili faktörleri, normal ve neoplastik germinal-merkezli B hücreleirn sağkalımı ve FL patonenez modelleri ve prognozun hastalığa katkısını aydınlatmıştır. Sonuç olarak; normal B-hücrenin gelişimi süresince germinal merkezdeki olaylar olduğu kadar, FL yı kapsayan B-hücreli lenfomaların hastalık modellerinin formülasyonunda önemli faktörler olarak meydana gelen bu olaylar, kontrolü kaldıran mekanizmalardır 4. 7

18 Klinik Bulgular Genelde yavaş büyüyen lenf nodları söz konusudur. Dalak ve kemik iliği tutulumu nispeten sık, ekstranodal tutulum ise seyrektir. Klinik bulgu ve belirtiler lenfomayı oluşturan hücrenin proliferasyon hızı ve ilk lokalizasyonuna bağlıdır 34. Nodal indolent folliküler lenfomalar yüzeyel lenfadenopati (LAP) ile ileri evre hastalık olarak ortaya çıkar. İndolent lenfomalarda lenfadenopati öyküsü uzun sürelidir ve genelde herhangi bir semptoma yol açmaz veya var olan semptomlar orta derecelidir. Evrelemede kemik iliği ve bazen periferik kan tutulum bulguları vardır (Evre IV). Ateş, gece terlemesi ve son 6 ay içinde vücut ağırlığının %10 undan daha fazla kilo kaybı gibi B semptomu belirtileri başlangıçta genellikle yoktur. Agresif lenfomalar genellikle tanı anında semptomatiktir ve hastalık öyküsü kısadır Laboratuvar Bulguları İndolent lenfomalarda kan tutulumu sıktır. Kemik iliği tutulumu, splenomegalisi veya otoimmün yıkım nedeniyle nötropeni, anemi ve trombositopeni görülebilir. Otoimmün komplikasyonlar ve kemik iliği tutulumu low grade lenfomalarda daha sıktır. Gastro İntestinal Sistem tutulumu olan olgularda kanamaya bağlı demir eksikliği anemisi de gelişebilir. Sedimantasyon agresif NHL larda yüksektir. FL lı hastalarda proliferasyon hızı ve tümör kitlesinin indirekt göstergesi olarak serum LDH (Laktik dehidrogenaz) ve beta 2 mikroglobulin düzeyleri yükselebilir. LDH, agresif lenfomalarda artabilir. HIV, HTLV-1, EBV, hepatit B ve C serolojileri gerektiğinde yapılmalıdır. Mediastinal lenfomaları, germ hücreli mediastinal tümörlerden ayırmak için α-fetoprotein veya β human korionik ganadotropin seviyelerine bakılmalıdır. Ayrıca karaciğer ve böbrek tutulumları açısından bu organlara ait fonksiyon testleri yapılmalıdır. Kemik iliği biyopsisi ve aspirasyon materyallerinin immunfenotipleme için flow ctyometric analizi ve FISH metodu ve/veya PCR kullanılarak kromozom analizi yapılmalıdır Tanısal Değerlendirme Folliküler lenfomada t(14;18) translokasyonu vardır. Bu özellik tanı ve ayırıcı tanıda büyük önem taşır 26. Folliküler lenfoma için tipik olan BCL-2 onkogen proteininin varlığının gösterilmesi tanısal özellik taşıyan bulgudur. Folliküler lenfoma 8

19 tanısı histolojiktir. Tanı için yeterli büyüklükte eksizyonel biyopsi yapılmalı ve materyal morfolojik, immünfenotipik, sitogenetik ve moleküler olarak incelenmelidir. Core iğne biyopsisi ve ince iğne biyopsisi FL tanısından ziyade genellikle tedavi sonrası nüks hastalığı kontrol etmek için kullanılmaktadır Evreleme Evreleme değerlendirmesi hem hastanın prognostik özelliklerinin belirlenmesini hem de uygun başlangıç tedavisinin planlanmasını sağlar 5. NHL lar için TNM sınıflamasının pratik olmadığı düşünülmektedir. FL ların evrelenmesinde Ann-Arbor evreleme sistemi kullanılmaktadır. Klinik evrelendirme iyi bir anamnez, fizik muayene, periferik kan ve kemik iliği analizleri, karaciğer ve renal fonksiyon testleri, görüntüleme (torakal ve abdomino-pelvik incelemeler, ultrasond, kemik sintigrafi, PET-CT) ve ilk biyopsi raporu esas alınarak yapılır Görüntüleme 18F-fluorodeoksiglukoz (FDG) pozitron emisyon tomografi (PET), lenfomalarda yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme yöntemidir. FDG-PET görüntüleme yöntemi lenfomalarda hastalığın başlangıç evrelendirmesinde, tedaviye cevabın değerlendirilmesinde ve hastalığın takibinde kullanılır. FDG-PET, lenfoma tanısı olan hastaların ilk evrelendirilmesinde konvansiyonel görüntüleme tekniklerine göre, ek bilgi sağladığından daha üstün bulunmuştur 36. FDG-PET in bilgisayarlı tomografi (BT) ile kombine kullanılması, bu tekniklerin ayrı ayrı kullanılmasına göre daha fazla avantajlar sağlamaktadır. Folliküler lenfomalarda FDG-PET in konvansiyonel evrelemeye göre, daha fazla anormal lenf nodu alanlarını saptadığı gösterilmiştir. Lenfomalarda sıklıkla kullanılan fonksiyonel görüntüleme yöntemlerinden biri olan Ga-67 taraması birçok çalışmada FDG-PET ile karşılaştırılmış ve FDG-PET in üstün olduğu gösterilmiştir. Kemik iliği tutulumunu saptamada FDG-PET in doğruluğu güvenilir bulunmamıştır 37. NHL da bir kür kemoterapi sonrası FDG-PET, tedavinin belirlenmesi bakımından yüksek prognostik değere sahiptir. Bir kür kemoterapi sonrasında ısrarcı FDG tutulumu görülmesi relaps şansının yüksek olduğu anlamına gelirken, negatif FDG-PET sonuçları uzun süreli remisyonun ön habercisidir. Tedavi sonrasında, FDG- PET pozitif olan NHL olgularında relaps oranı %100 iken, FDG-PET negatif olan 9

20 NHL larda da %16,5 olduğu bildirilmiştir. Relapsı önceden haber vermede FDG-PET in tanısal doğruluğu BT den anlamlı olarak daha yüksek bulunmuştur. FDG-PET ile BT nin kombine kullanımı, FDG-PET ve BT nin ayrı ayrı değerlendirilmesinden daha fazla avantajlar sağlamaktadır. Evreleme de PET/BT %93 doğruluk oranına sahip iken PET de bu oran %84 bulunmuştur Prognostik Faktörler Prognoz açısından önemli olan, ancak Ann Arbor evrelendirme sisteminin içermediği parametreler arasında, serum beta-2 mikroglobulin ve (LDH) düzeyleri, tutulan lenf nodlarının, kitlelerin, dalağın boyutları, tutulan bölgelerin sayısı, kemik iliği tutulumunun derecesi, yaş, performans durumu, serum albumin düzeyi gibi hastaya ait faktörler yer almaktadır. Bu faktörlerin bir kısmını dikkate alan International Prognostik indeks (IPI), agresif lenfomalarda olduğu gibi indolent lenfomalarda da geçerlidir. Ancak hastalık biyolojisinde önemli olan tüm faktörleri içermemesi nedeniyle ideal değildir. Ayrıca hastaların büyük çoğunluğunun ileri yaşta ve ileri evrede olması nedeniyle risk ayırımı oranı sınırlıdır 24. IPI nın indolent lenfoma için dezavantajı, en yüksek risk kategorisinde çok az sayıda hastanın olmasıdır 5. Folliküler lenfomalarda tedaviye karar verirken yakın dönemde geliştirilen ve şu ana kadar 5000 in üzerinde hasta da geçerliliği test edilen Folliküler Lenfoma International Prognostik index (FLIPI) nin kullanılması önerilmektedir 24. FLIPI ile yüksek riskli hastalığı olan daha fazla sayıda hasta tanımlanabilmektedir 5. Bu sistemde, IPI den farklı olarak, performans durumu yerine hemoglobin değeri, ekstranodal bölgeler yerine ise nodal bölgelerin sayısı kullanılmaktadır. FLIPI için 5 bağımsız risk faktörü temel alınmıştır (Tablo 1) 1. 10

21 Tablo-1: Folliküler Lenfoma Uluslararası Prognostik İndeksi(FLIPI): 1 Yaş >60 yaş Hb <12g/dl LDH Yüksek(normal değerin üstü) Evre III-IV Nodal bölge sayısı >4 FLIPI sağkalım olasılıklarıyla, üç grup içine (büyüklüğü dengelenmiş) hastaların ayrılmasını mümkün kılmıştır (Tablo 2) 1. Tablo-2: FLIPI ye göre sağkalım oranları: 1 Risk faktörü sayısı FLIPI skoru Hasta oranı 5 yıllık sağkalım 10 yıllık sağkalım 0 veya 1 düşük %36 %91 %71 2 orta %37 %78 %51 3 yüksek %27 %53 %36 Olumsuz özellikleri 0-1 arasında olan hastalar standart tedavi ile %91 oranında 5 yıllık sağkalıma sahipken, 2 faktöre sahip olanların 5 yıllık sağkalımı %78 ve 3 ün üzerinde faktörü olanların 5 yıllık sağkalımı ise yalnızca %53 tür Folliküler Lenfoma Tedavisi Folliküler lenfomalar yavaş seyirli, doz yoğunluğu düşük tedavilerle kontrol edilebilen, bazen de tedavisiz izlenebilen, fakat çoğunlukla nükslerle seyreden bir hastalıktır Evre I-II FL Tedavisi Grade I ve II folliküler lenfomalarda tek ilaç veya doz yoğunluğu düşük kombine tedaviler kullanılabilir. Kombine tedavilerin üstünlüğü remisyon oranlarının yüksekliğidir 26. Evre I-II FL larda radyoterapi küratif olabilmektedir 38. Radyoterapi ve kemoterapi kombinasyonu ile hastalıksız sağkalım oranı 5-10 yılda %70 lere ulaşmıştır. Evre I-II FL da kür potansiyeli bulunması nedeniyle izle ve bekle 11

22 yaklaşımı vardır 39. Bu yaklaşım seçilirse ve hastalıkta yaygınlaşırsa kür şansı ortadan kalkabilecektir. Bu nedenle son veriler evre I-II FL da girişimi önermektedir Evre III-IV FL Tedavisi Evre III ve IV hastalığı olanlar ilerlemiş evre sınıfındadır. Agresif seyreden bir lenfomadır. Diffüz büyük hücreli lenfomalara dönüşüm sıktır. Genellikle doz yoğunluğu yüksek tedaviler gerektirir. Nüks olasılığı oldukça yüksektir. Evre III ve IV hastalıkta yalnızca kemoterapi uygulanmaktadır. Ancak evre III FL da radyasyon tedavisinin etkinliğini araştıran çalışmalar da bulunmaktadır Kemoterapi En uygun sistemik tedavi yaklaşımıdır. Tek ajan ilaç tedavileri olarak; Klorambusil, Siklofosfamid, Fludarabine, Rituximab yer alır. Kombine ilaç tedavileri olarak; CVP (Siklofosfamid, Prednisolon, Vinkristin), CHOP (Siklofosfamid, Doksorubisin, Vinkristin Prednisolon), R-CHOP (Rituximab, Siklofosfamid, Doksorubisin, Vinkristin, Prednisolon), FND (Fludarabine, Mitoksantron, Deksamethazon) günümüzde kullanılmaktadır. Nüks olgularda kombine ilaç tedavileri; CHOP, R-CHOP, ESHAP (Etoposid, Metilprednison, Sitozin arabinozid, Sisplatin), DEHAP (Deksamethazon, Sisplatin, Sitozin arabinozid), R-ICE (Rituximab, Ifosfamid, Mesna, Carboplatin,Etoposid) kullanılır İnterferon Lenfoma tedavisinde immünoterapötik amaçlı kullanılan ilk ajan interferondur. Günümüzde kemoterapiyle eş zamanlı olarak ve kemoterapi sonrası idame tedavisi amaçlı kullanılmaktadır. Hastalıksız sağkalım açısından yararlı olduğu gösterilmiştir Rituximab Geçen 10 yıl, birçok yeni ajanlarla FL lı hastalar için immünolojik temelli tedavi seçeneklerinin artmasına tanıklık etmiştir. Günümüze kadar çok etkili olan rituximab ile, B hücrelerinin yüzey alanında CD20 hedeflenildi. Yapılan faz 3 çalışmalar, kemoimmünoterapinin ileri evre FL lı hastaların toplam sağkalımını ve progresyonsuz sağkalımını geliştirmiştir. İndolent lenfoma tedavisinde tek ajan olarak kullanımıyla 12

23 %50 remisyon sağlamaktadır. Standart kemoterapilerle kombinasyonda, rituximab lı monoklonal antikor tedavisi ile ileri evre FL hastalarının sağkalım oranının yüksek olduğu görülmüştür Lenfoma İdiotip Aşılar FL lı hastaların immün yanıtlarının aşı yaklaşımları ile ölçülebilirliği nedeniyle immün yanıtı arttırmaya yönelik stratejiler günümüzde test edilmektedir 43. Hastanın immünizasyon sonrası bir anti-tümör cevabı olur ve bu cevap tümör progresyonunu / relapsı önler veya geciktirir. Faz I-II çalışmalar, aşılamanın immün yanıtları oluşturabildiğini ispatlamıştır ve bu immün yanıtı oluşturan hastalar, bir immün yanıt oluşturamayan hastalardan daha uzun remisyon süresine sahiptirler Kök Hücre Transplantasyonu Folliküler lenfomada, donörün kardeş olduğu bir transplantta 3 yıllık yaşam olasılığı %64-72 dir 26. Kemoterapiye duyarlı nükslerde sonuç daha iyidir. Bir allogeneik donör immün sistem transplantasyonu, immünoterapinin radikal bir formunu gösterir. Allogeneik transplantasyondaki yakın gelişmeler, bu yöntemlerin akut nonrelaps mortalitesini azaltmış ve önemli komorbiditeli hastalar ve daha yaşlı hastaların redavisine izin vermiştir. Multiple diğer rejimlerde başarısız olan ilerlemiş FL lı hastalarda yüksek tam yanıt oranları ve düşük relaps riski raporlanmıştır 42. Relaps konumundaki transplant deneyimlerinin çoğunluğunu otolog transplant stratejileri oluşturmaktadır 44. Uzun süreli remisyonlar elde edilmekte ve bu strateji çoğu standart tedavi yaklaşımlarından daha etkili görünmektedir. Folliküler lenfomada konvansiyonel allogeneik transplant ile ilgili sınırlı deneyimler oldukça ümit vericidir 45. Bu yaklaşım hastaların %40 kadarında kür elde edilebilecek uzun süreli hastalıksız sağkalım ile sonuçlanabilmektedir. Ancak, allogeneik transplant oldukça yüksek riskli yaklaşım olup, tedavi ilişkili mortalite oranı yaklaşık %30-40 tır. Tedavi ilişkili mortalite oranı sadece %10 olan myeloablatif olmayan allogeneik transplant stratejilerinin geliştirilmesi önemli bir basamaktır

24 Folliküler Lenfomada Yeni Tedaviler CD20 yi hedefleyen çok yeni antikorlar gelişme aşamasındadır. Bunlardan biri olan Ofatumumab, CD20 antijeninin farklı bir epitopuna bağlanan bir insan IgG1 dir ve in vitro CD20 nin daha düşük düzeyleriyle tümör lysing hücrelerinde daha çok etkindir. Veltuzumab, anti-cd22 epratuzumab antikoru içinde kullanılan IgG1 yapısında hümanize edilmiş temel bir antikordur. Tek başına rituximab ile benzer aktiviteye sahip görünmektedir. Çeşitli genetiksel yeni antikorlar geliştirilmiştir. Bunlardan AME -133 ve GA-101 hümanize antikorlardır ve klinik çalışmalarda yolun başındadır. Yeni monoklonal antikorlardan, tümör proliferasyonunu azaltan ve CD80/CD28 yolağını bloke eden anti-cd80 antikoru Galiximab ın yanıt oranı %11 de kalmıştır. Klinik çalışma içinde olan anti-cd40 antikoru SGN-40, tümör hücre yollarına karşı etkilidir. Erken klinik çalışmalar, relaps FL da daha az aktiviteye rağmen relaps NHL da önemli aktiviteyi ileri sürmüştür. Epratuzumab ın rituximab ile olan kombinasyon çalışmalarında, yalnız rituximab ile ümit edilenden daha çok tam remisyon ile daha yüksek bir yanıt oranı görülmüştür. İnotuzumab ozogamicin, bir anti- CD22 antikorudur ve FL da %69 luk bir yanıt oranıyla ümit veren klinik aktivite elde edilmiştir TÜMÖR İMMÜNOLOJİSİ Tümörlere karşı immün yanıt, immün sistemin çoğu zaman olduğu gibi mikroplara değil, yabancı olarak algılanan enfeksiyöz olmayan hücrelere yanıt verdiği durumlardır. Aslında tümörleri yabancı olarak betimleyen antijenler, malign dönüşümün hedefi olan hücrelerin hemen hepsinde salgılanır. Bu nedenle, farklı hücre tiplerine karşı immün yanıtları harekete geçirecek özgül düzenekler gerekmektedir Tümörlere Karşı İmmün Yanıtlar 1950 lerden beri, edinsel immün sistemin fizyolojik işlevinin, değişime uğramış hücrelerin büyümesini engellemek veya bu hücreleri zararlı tümörlere dönüşmeden önce yok etmek olduğuna inanılmaktadır. Bu durum immün gözetim olarak adlandırılmaktadır. Tümörlere karşı immün gözetimin, tümörlerin büyümesini engellemekte önemli olduğunu destekleyen pek çok kanıt vardır. Bununla birlikte, tümörlerin sağlıklı bireylerde geliştiği gerçeği, tümöre karşı bağışıklığın çoğunlukla 14

25 zayıf kaldığını ve hızlı büyüyen tümörlerce kolaylıkla alt edilebildiğini göstermektedir. İmmünologlar, immün sistemin yanıt oluşturduğu tümör antijenlerinin türünün tanımlanması ve tümöre karşı immünitenin en yüksek düzeye çıkarılması ile yakından ilgilenmektedirler Tümör Antijenleri Malign tümörler, immün sistem tarafından yabancı olarak algılanabilecek çeşitli tiplerde moleküller salgılarlar. Eğer, bir bireyin immün sistemi, mevcut bir tümöre yanıt verebiliyorsa, o tümörde, bireyin immün sistemi tarafından yabancı olarak algılanan antijenlerin bulunması gerekmektedir. Kimyasal karsinojenlerle veya radyasyon yoluyla oluşturulan deneysel tümörlerde, tümör antijenleri, normal hücre proteinlerinin mutantları olabilir. Spontan gelişen insan tümörlerinde, farklı hücresel proteinlerin bu tip mutantlarına, deneysel olarak oluşturulan tümörlere oranla daha az rastlanmaktadır. Bazı tümör antijenleri, mutasyona uğramış veya transloke onkogenlerin veya malign dönüşümde rol oynadığı sanılan tümör baskılayıcı genlerin ürünüdür. Bazı insan tümörlerinde immün yanıtlara yol açan antijenlerin, ya aşırı salınan ya da normalde belirli dokulara veya gelişim safhalarına özgü olan fakat tümörler tarafından yanlış düzenlenen normal proteinler olduğu görülmektedir. Bu normal öz antijenlerin, immün yanıtlara yol açmaması beklense de bu antijenlerin anormal salınımları, immün yanıtları harekete geçirmeye yetebilir. Onkojenik virüs kaynaklı tümörlerde, tümör antijenleri genellikle bu virüslerin ürünleridir Kansere Bağlı İmmünolojik Baskılanma Enfeksiyon durumunda son derece etkin olarak çalışan immün sistem, kanserli hücrelere karşı yeterince etkin olamamaktadır. Kanserli hastalarda diğer immün fonksiyonlar da çoğu kez baskılanmıştır. Tümör hücresine bağlı bir neden olarak; çoğu tümör hücresinde antijen hazırlayıcı ve sunucu mekanizmalar kalıtsal olarak hatalıdır. Ek olarak çoğu kanser hücresinde sınıf I doku uygunluk antijeni major histocompatibility (MHC-I) salınımı az ve yetersizdir. Böylece bağışıklık hücrelerinin kanser hücresini tanıması zorlaşmaktadır. Bunun yanında çoğu kanser hücrelerinde bir yardımcı uyarıcı molekül olan B27 salınımı da yetersizdir. Ayrıca tümör hücrelerinin bağışıklık sistemi üzerine etkili pek çok sitokin 15

26 salgıladıkları gösterilmiştir. Bu sitokinler tümör hücresinin bulunduğu ortamda diğer hücrelerle ilişkisini sağlamaktadır. Tümörün kendini besleyecek yani damar oluşumunu uyaran, kendi büyümesini kontrol eden bu sitokinler bağışıklık sistemi üzerine ise çoğu kez negatif etki etmektedir. Böylece tümör hücreleri bağışıklık sisteminin kontrolünden kaçmasını sağlayan mekanizmalar dışında salgıladıkları sitokinler yoluyla da gerçek anlamda bir immünolojik baskılanma oluşturmaktadırlar. Dendritik hücreler bugün bilinen en etkin antijen sunucu hücrelerdir. Dokuda tümörle ilgili antijenlerin T-lenfositlere sunulmasında ve böylece anti-tümöral bağışıklık yanıtının oluşturulmasında sorumluluk taşımaktadırlar. Kanserli dokularda dendritik hücrelerin işlev bozukluğunu gösteren pek çok çalışma yayınlanmıştır. Bu işlev bozukluğu, kanserli hastada saptanan bozulmuş hücresel bağışıklık yanıtının en önemli nedenlerinden birini oluşturmaktadır. Kanserli hastada dendritik hücrelerin hemopoetik kök hücreden olgunlaşması, tümörden salınan VEGF (vasküler endotelyal growth faktör) tarafından engellenmektedir. Sonuçta, hastada kanserli dokuya karşı etkin bağışıklık yanıtı oluşmamaktadır Kanser Tedavisine İmmünolojik Yaklaşımlar Kanser immünoterapisinin ana stratejileri, hastalara antitümör efektörleri (antikorlar ve T hücreleri) sağlamayı, hastaları tümörlerine karşı aktif olarak bağışıklamayı ve hastanın kendi antitümör yanıtlarını uyarmayı amaçlar. İmmün yanıtların son derece özgül olması nedeniyle, tümöre özgül bağışıklığın, hastaya zarar vermeden seçici olarak tümörü yok etmekte kullanılabileceği yıllardır düşünülmektedir. İmmünolojik tedaviye yönelik pek çok yaklaşım, deney hayvanlarında ve insanlar üzerinde uygulanmaktadır. Kanser immünoterapisine yönelik pek çok yeni strateji, hasta immün yanıtlarının tümör hücrelerine karşı güçlendirilmesi esasına dayanmaktadır. Tümörlere karşı immün yanıtları uyarmanın yollarından biri, hastaların kendi tümör hücreleriyle veya bu hücrelerin antijenleriyle aşılanmasıdır. Antitümör bağışıklığın uyarılmasına yönelik bu yeni stratejilerin çoğu, lenfosit aktivasyonu ve düzenlenmesindeki ilerlemelere dayanır ve bu nedenle rasyonel stratejilerdir

27 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Hastalar Çalışmaya Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji ABD da, yılları arasında Folliküler lenfoma tanısı konmuş, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi İç Hastalıkları-Onkoloji B.D. da izlenmekte olan, 19 u erkek, 8 i kadın 27 hasta alındı. Bu hastaların Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi arşiv dosyalarından: yaş, cinsiyet, evre, tanı tarihi, aldığı 1. ve 2. kemoterapi, kemoterapi yanıtları, nüks olup olmaması, progresyonsuz sağkalım zamanı, tanı anında tutulum bölgesi, tanı anında LDH düzeyi, B semptomları, toplam takip süresi ve son durumda hayatta olup olmamaları gibi klinik bilgiler retrospektif olarak incelendi. Hastalar bilgilendirilerek onay alındı İmmünohistokimyasal Testler: Araştırmaya alınan hastaların tanı anındaki tümör dokularından alınan kesitlere, her bir monoklonal antikor testi için aşağıdaki prosedürler uygulandı CD4, CD8, CD57, CD68, FOXP3 Monoklonal Antikor Testleri İçin Öncelikle Yapılan Ortak Çalışma Prosedürü Dokular kasetlendikten sonra %10 luk formaldehitte bekletildi. Aynı gün akşam ototeknikon cihazında fiksasyon işlemi tamamlandı. Ertesi gün sabah parafin blok haline getirildi. Parafine gömülü dokulardan 4-5µ(mikron) kalınlığında kesitler polylysine lam üzerine alındı. Önce 60 derecelik etüv içerisinde bulunan xylol içerisinde dakika bekletildi. Daha sonra oda ısısındaki alkol ve xylol serisinden geçilerek deparafinizasyon işlemi tamamlandı. %0,3 w/v H 2 O 2 in distile suda 5 7 dakika bekletildi CD4 Çalışma Prosedürü Ortak çalışma prosedüründen sonra, saf suda yıkandı. Mikrodalga fırında 600 W(watt) gücünde EDTA buffer solüsyonunda (ph=8) 15 dakika kaynatılarak antigen retriwal işlemi uygulandı. Kapağı açılmadan oda ısısına gelmesi için yaklaşık 45 dakika bekletildi. Saf su ve PBS (Fosfat Buffer Saline) den geçildi. PBS (ph=7,2-7,4). CD4 17

28 Mouse Monoclonal Primary Antibody (Leica Biosystem Newcastle Ltd United Kingdom Cat no:rtu-cd4-1f6) damlatıldı. Yine kapalı ve nemli ortamda 1,5 2 saat inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. Biotin(DAKO North America,Inc Biyotinlated Link Universal,streptavidin HRP ( Rabbit, Mouse, goat )Cat no:k 0690 ) damlatıldı. Oda ısısında 30 dakika inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. Avidin (DAKO North America,Inc Biyotinlated Link Universal,streptavidin HRP ( Rabbit, Mouse, goat )Cat no:k 0690 ) damlatıldı. Oda ısısında 30 dakika inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. AEC(3-amino-9-ethylkarbazole) damlatıldı dakika aralığında mikroskop altında kontrol edilerek boyanma gözlendiğinde preparatlar çeşme suyuna alındı. Saf suda yıkanarak hematoxylene alındı dakika bekletilip tekrar çeşme suyuna alınarak yaklaşık 10 dakika bekletildi ve yıkandı. Dokunun etrafı kurulanıp su bazlı kapama maddesi ile kapatıldı. CD4 monoklonal antikoru, CD4 T helper lenfositleri boyamaktadır CD8 Çalışma Prosedürü Ortak çalışma prosedüründen sonra, saf suda yıkandı. Mikrodalga fırında 600 W(watt) gücünde EDTA buffer solüsyonunda (ph=8) 15 dakika kaynatılarak antigen retriwal işlemi uygulandı. Kapağı açılmadan oda ısısına gelmesi için yaklaşık 45 dakika bekletildi. Saf su ve PBS den geçildi. PBS (ph=7,2-7,4). CD8 Mouse Monoclonal Antibody (Leica Biosystem Newcastle Ltd United Kingdom Cat no:rtu-cd8-295) damlatıldı. Yine kapalı ve nemli ortamda 1,5 2 saat inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. Biotin (DAKO North America,Inc Biyotinlated Link Universal,streptavidin HRP ( Rabbit, Mouse, goat )Cat no:k 0690) damlatıldı. Oda ısısında 30 dakika inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. Avidin (DAKO North America,Inc Biyotinlated Link Universal,streptavidin HRP ( Rabbit, Mouse, goat )Cat no:k 0690) damlatıldı. Oda ısısında 30 dakika inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. AEC damlatıldı dakika aralığında mikroskop altında kontrol edilerek boyanma gözlendiğinde preparatlar çeşme suyuna alındı. Saf suda yıkanarak hematoxylene alındı dakika bekletilip tekrar çeşme suyunda yaklaşık 10 dakika bekletilerek mavileştirildi. Dokunun etrafı kurulanıp su bazlı kapama maddesi ile kapatıldı. CD8 monoklonal antikoru, sitotoksik T hücreleri boyamaktadır. 18

29 CD57 Çalışma Prosedürü Ortak çalışma prosedüründen sonra, Saf su ve PBS den geçildi. PBS (ph=7,2-7,4). CD57 Mouse Monoclonal Primary antibody (Leica Biosystem Newcastle Ltd United Kingdom Cat no:rtu-nk1) damlatıldı. Yine kapalı ve nemli ortamda 1,5 2 saat inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. Biotin(DAKO North America,Inc Biyotinlated Link Universal,streptavidin HRP ( Rabbit, Mouse, goat )Cat no:k 0690) damlatıldı. Oda ısısında 30 dakika inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. Avidin(DAKO North America,Inc Biyotinlated Link Universal,streptavidin HRP ( Rabbit, Mouse, goat )Cat no:k 0690) damlatıldı ve oda ısısında 30 dakika inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. AEC damlatıldı dakika aralığında mikroskop altında kontrol edilerek boyanma gözlendiğinde preparatlar çeşme suyuna alındı. Saf suda yıkanarak hematoxylene alındı dakika bekletilip, tekrar çeşme suyunda yaklaşık 10 dakika bekletilerek mavileştirildi. Dokunun etrafı kurulanıp su bazlı kapama maddesi ile kapatıldı. CD57 monoklonal antikoru, Natural Killer (NK) hücreleri boyamaktadır CD68 Çalışma Prosedürü Ortak çalışma prosedüründen sonra, saf suda yıkandı. Mikrodalga fırında 600 W(watt) gücünde EDTA buffer solüsyonunda (ph 8) 15 dakika kaynatılarak antigen retriwal işlemi uygulandı. Kapağı açılmadan oda ısısına gelmesi için yaklaşık 45 dakika bekletildi. Saf su ve PBS den geçildi. PBS (ph=7,2-7,4). CD68 Mouse Monoclonal Primary Antibody (Leica Biosystem Biosystem Newcastle Ltd United Kingdom Cat no:rtu-cd68) damlatıldı. Yine kapalı ve nemli ortamda 1,5 2 saat inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. Biotin (DAKO North America,Inc Biyotinlated Link Universal,streptavidin HRP ( Rabbit, Mouse, goat )Cat no:k 0690) damlatıldı. Oda ısısında 30 dakika inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. Avidin (DAKO North America,Inc Biyotinlated Link Universal,streptavidin HRP ( Rabbit, Mouse, goat )Cat no:k 0690) damlatıldı. Oda ısısında 30 dakika inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. AEC damlatıldı dakika aralığında mikroskop altında kontrol edilerek boyanma gözlendiğinde preparatlar çeşme suyuna alındı. Saf suda yıkanarak hematoxylene alındı dakika bekletilip, tekrar çeşme suyunda yaklaşık 10 dakika bekletilerek mavileştirildi. Dokunun etrafı kurulanıp su bazlı kapama maddesi ile kapatıldı. CD68 monoklonal antikoru, histiyositleri boyamaktadır. 19

30 FOXP3 Çalışma Prosedürü Ortak çalışma prosedüründen sonra, saf suda yıkandı. Mikrodalga fırında 600 W(watt) gücünde EDTA buffer solüsyonunda (ph=9) 15 dakika kaynatılarak antigen retriwal işlemi uygulandı. Kapağı açılmadan oda ısısına gelmesi için yaklaşık 45 dakika bekletildi. Saf su ve PBS den geçildi. PBS (ph=7,2-7,4). 1/50 oranında dilüe edilmiş olan Primary Antibody (FOXP3 abcam marka Rabbit Polyclonal Cat no:ab 4728) damlatıldı. Yine kapalı ve nemli ortamda 1,5 2 saat inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. Biotin (DAKO North America,Inc Biyotinlated Link Universal, streptavidin HRP (Rabbit, Mouse, goat )Cat no:k 0690) damlatıldı. Oda ısısında 30 dakika inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. Avidin (DAKO North America,Inc Biyotinlated Link Universal, streptavidin HRP (Rabbit, Mouse, goat )Cat no:k 0690) damlatıldı. Oda ısısında 30 dakika inkübe edildi. Saf su ve PBS den geçildi. AEC damlatıldı dakika aralığında mikroskop altında kontrol edilerek boyanma gözlendiğinde preparatlar çeşme suyuna alındı. Saf suda yıkanarak hematoxylene alındı dakika bekletilip, tekrar çeşme suyunda yaklaşık 10 dakika bekletilerek mavileştirildi. Dokunun etrafı kurulanıp su bazlı kapama maddesi ile kapatıldı. FOXP3 antikoru, düzenleyici T hücreleri boyamaktadır İstatistik Analiz İstatistiksel analiz için SPSS (The Statistical Package for the Social Sciences) paket programı kullanıldı. Veriler ortalama değer ± standart sapma olarak değerlendirildi. Survival analizi Kaplan-Meier metodu ile elde edildi ve long-rank testi ile analiz edildi. 20