KOLESTEROL TAYİNİ İÇİN YENİ BİR BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI. Nevim BAŞAK YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 KOLESTEROL TAYİNİ İÇİN YENİ BİR BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI Nevim BAŞAK YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ OCAK 2014 ANKARA

2 Nevim BAŞAK tarafından hazırlanan KOLESTEROL TAYİNİ İÇİN YENİ BİR BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI adlı bu tezin Yüksek Lisans tezi olarak uygun olduğunu onaylarım. Prof. Dr. Ahmet YAŞAR Tez Danışmanı, Kimya Anabilim Dalı. Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Kimya Anabilim Dalında Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Mustafa KAVUTÇU Biyokimya (Tıp) Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi. Prof. Dr. Ahmet YAŞAR Kimya Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi. Doç.Dr. Fatma ARSLAN Kimya Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi. Tez Savunma Tarihi: 28 / 01 / 2014 Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini onamıştır. Prof. Dr. Şeref SAĞIROĞLU Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü.

3 ii TEZ BİLDİRİMİ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Nevim BAŞAK

4 iv KOLESTEROL TAYİNİ İÇİN YENİ BİR BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI (Yüksek Lisans Tezi) Nevim BAŞAK GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Ocak 2014 ÖZET Bu çalışmada, kolesterol tayini için yeni bir amperometrik biyosensör geliştirildi. Bu amaçla, platin levha üzerinde pirolün polivinilsülfonatlı ortamda elektropolimerleşmesi ile polipirol-polivinilsülfonat filmi hazırlandı. Kolesterol esteraz ve kolesterol oksidaz enzimleri, polipirolpolivinilsülfonat film içine tutuklama yöntemiyle immobilize edildi. Kolesterol tayini, hazırlanan biyosensörün yüzeyinde gerçekleşen enzimatik tepkime sonucu oluşan hidrojen peroksitin 0,40 V da yükseltgenmesine dayanarak yapıldı. Biyosensörün kolesterol tayini için çalışma aralığı tayin edildi. Kolesterol biyosensörünün cevabına ph nın ve sıcaklığın etkisi araştırıldı. Biyosensörün tekrar kullanılabilirliği ve raf ömrü tayin edildi. Hazırlanan biyosensör ile biyolojik sıvıda (kan) kolesterol tayini yapıldı. Biyolojik ortamlarda olabilecek girişimlerin biyosensör cevabı üzerine etkileri incelendi. Bilim Kodu : Anahtar Kelimeler : Kolesterol, Kolesterol oksidaz, Kolesterol esteraz, biyosensör, polipirol, polivinilsülfonat Sayfa Adedi : 103 Tez Yöneticisi : Prof.Dr. Ahmet YAŞAR

5 v PREPARATION OF A NEW BIOSENSOR FOR THE DETERMINATION OF CHOLESTEROL (M. Sc. Thesis) Nevim BAŞAK GAZİ UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES January 2014 ABSTRACT In this study, new amperometric biosensor for determination of cholesterol was developed. For this reason; polypyrrolepolyvinylsulphonate films have been prepared on the platinum electrode by the electropolymerization of pyrrole in the presence of polyvinylsulphonate. Cholesterol esterase and cholesterol oxidase enzymes have been immobilized in polypyrrole-polyvinylsulphonate via the entrapment method. Cholesterol detection is based on the oxidation of hydrogen peroxide at 0,4 V produced by the enzymatic reaction on the biosensor surface. The linear working range of cholesterol biosensor was determined. The effects of ph and temperature on the response of the biosensor were investigated. Reproducubility and storage stability were determined for the biosensor. The performance of biosensor has been tested with human blood samples. The effects of the interference occuring in biological environments on the response of the biosensor were investigated. Science Code : Key Words : Cholesterol, Cholesterol oxidase, Cholesterol esterase, biosensor, polypyrrole, polyvinylsulphonate Page Number : 103 Supervisor : Prof. Dr. Ahmet YAŞAR

6 vi TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim süresince bilgisi ve deneyimleriyle bana yardım eden ve yönlendiren, zamanını ve desteğini esirgemeyen değerli hocam, tez danışmanım Sayın Prof. Dr. Ahmet YAŞAR a ; Çalışmalarım boyunca bilgisi ve tecrübesi ile desteğini esirgemeyen çok değerli hocalarım Sayın Yrd. Doç. Dr. Servet ÇETE ye, Sayın Doç. Dr. Fatma ARSLAN a ve Sayın Doç. Dr. Halit ARSLAN a ; Özel yaşamım ve deneysel çalışmalarımda sabırla bana yardım eden ve desteğini esirgemeyen sevgili manevi ablam Özlem ÇOLAK a, Arş. Gör. Dr. Demet UZUN a, Arş. Gör. Soner DÖNMEZ e, Elif AYNACI ya, Gökçen KARPUZ a ve tüm çalışma arkadaşlarıma; Hayatımın her döneminde hiçbir fedakarlıktan kaçınmadan beni bugünlere getiren, maddi ve manevi destekleriyle her zaman yanımda olan sevgili babam Şakir BAŞAK a, annem Elmas BAŞAK a, ablam Mine BAŞAK ve kardeşim Merve BAŞAK a; Sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

7 vii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... iv ABSTRACT... v TEŞEKKÜR... vi İÇİNDEKİLER... vii ÇİZELGELERİN LİSTESİ... xii ŞEKİLLERİN LİSTESİ... xiii 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Enzimler Kolesterol esteraz (ChEt) enziminin özellikleri Kolesterol oksidaz (ChOx) enziminin özellikleri Tepkime mekaniznası Kolesterol oksidaz ve kolesterol esterazın uygulama alanları Analitik uygulamaları Biyosensörler Biyosensörlerin yapısı ve fonksiyonları Biyobileşenler Algılayıcılar (Transduserler) Biyosensörlerin uygulama alanları Biyosensör hazırlanmasında dikkat edilmesi gerekenler İletken Polimerler... 21

8 viii Sayfa Pirol Elektrokimyasal polimerleşme mekanizması İletken polimerlerle enzim immobilizasyonu Biyobileşen İmmobilizasyonu Enzim immobilizasyon yöntemleri Enzim Sensörleri Genel çalışma prensibi Enzim sensörlerinin sınıflandırılması Amperometrik enzim elektrotlar Performans Faktörleri Seçicilik Kullanım ömrü Kalibrasyon gereksinimleri Tekrarlanabilirlik Kararlılık Yüksek duyarlılık Yeterli düzeyde tayin sınır Geniş ölçüm aralığı Hızlı cevap zamanı Basit ve ucuzluk Kaynak Araştırması DENEYSEL KISIM Cihazlar ve Malzemeler... 56

9 ix Sayfa Elektrokimyasal analiz cihazı Hücre ve elektrotlar ph metre Su banyosu Mikro pipet Argon gazı Saf su SEM cihazı AFM cihazı Yüzey temas açısı cihazı Profilometre cihazı (Film Kalınlığının Ölçülmesi) Kullanılan Reaktifler ve Özellikleri Kullanılan çözeltiler Platin Yüzeye Polipirol-Polivinilsülfonat (PPy-PVS) Kaplanması Pt/PPy-PVS elektrodun SEM analizi Pt/PPy-PVS elektrodun AFM analizi Pt/PPy-PVS elektrodun yüzey temas açısı analizi Pt/PPy-PVS elektrodun profilometre (Film Kalınlığı Ölçülmesi) Platin/Polipirol-Polivinilsülfonat (Pt/PPy-PVS) Elektrodunun Hidrojen Peroksite Duyarlılığının Belirlenmesi Pt/PPy-PVS Film Elektrot ile Serbest Enzimin Çalışması Biyosensörün Hazırlanması... 64

10 x Sayfa Çapraz bağlama yöntemi ile immobilizasyon Tutuklama yöntemi ile immobilizasyon Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün SEM analizi Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün AFM analizi Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün yüzey temas açısı analizi Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün profilometre (Film Kalınlığı Ölçülmesi) Biyosensörün Kolesterol Duyarlılığının Belirlenmesi Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx Biyosensörünün En İyi Koşullarının Belirlenmesi ph nın etkisi Sıcaklığın etkisi Substrat derişiminin etkisi Biyosensörün tekrar kullanılabilirliğinin belirlenmesi Biyosensörün raf ömrünün belirlenmesi Biyosensör Üzerine Girişim Yapan Maddeler Biyolojik Sıvıda (Kanda) Kolesterol Tayini SONUÇLAR VE TARTIŞMA Pt/PPy-PVS Film Elektrodunun Hidrojen Peroksite Duyarlılığının Belirlenmesi Pt/PPy-PVS Film Elektrodunun Serbest Enzimin Bulunduğu Çözeltide Kolesterol Palmitata Duyarlılığının Belirlenmesi Çapraz Bağlama ve Tutuklama Yöntemi ile İmmobilizasyon SEM Analizi AFM Analizi Yüzey Temas Açısı Analizi... 81

11 xi Sayfa 4.7. Profilometre spektrumu (Film Kalınlığının Ölçülmesi) Biyosensörün En İyi Çalışma Koşullarının Belirlenmesi ph etkisi Sıcaklık etkisi Substrat derişiminin etkisi Biyosensörün tekrar kullanılabilirliğinin belirlenmesi Biyosensörün raf ömrünün belirlenmesi Biyosensör Üzerine Girişim Yapan Maddeler Biyolojik Sıvıda (Kanda) Kolesterol Tayini Sonuç KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ

12 xii ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Biyosensör algılayıcıları Çizelge 2.2. Biyosensörler için uygulama alanları Çizelge 2.3. İletken polimerler ve iletkenlikleri Çizelge 2.4. İletken polimerlerin kullanıldığı biyosensörler Çizelge 2.5. Enzim immobilizasyon yöntemleri Çizelge 2.6. Enzimin bağlanmasını sağlayan fonksiyonel gruplar Çizelge 2.7. Enzim sensörlerinin sınıflandırılması Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan kimyasal maddelerin adları, saflık dereceleri ve temin edildikleri firmalar Çizelge 4.1. Biyosensör üzerine (1,0x10-5 M kolesterol palmitat derişiminde ) girişim yapan maddeler ve girişim etkileri Çizelge 4.2. Kan numunelerinde hesaplanan kolesterol derişimleri... 93

13 xiii Şekil ŞEKİLLERİN LİSTESİ Sayfa Şekil 1.1. Kolesterol ün molekül yapısı... 1 Şekil 1.2. İnsan vücudunda kolesterolün işlevi... 1 Şekil 2.1. Bir substrat molekülünü bağlayan enzimin şematik olarak gösterilmesi... 7 Şekil 2.2. Kolesterol esteraz enziminin üç boyutlu yapısı... 8 Şekil 2.3. Kolesterol oksidaz enziminin üç boyutlu yapısı Şekil 2.4. Kolesterol oksidaz enziminin tepkime mekanizması Şekil 2.5. Bir biyosensörün şematik yapısı Şekil 2.6. Biyosensörlerin yapısı ve çalışma prensibi Şekil 2.7. Pirolün aktif noktaları Şekil 2.8. Pirolün elektrokimyasal polimerleşme mekanizması Şekil 2.9. Kovalent bağlama Şekil Adsorpsiyon Şekil İyonik bağlama Şekil Çapraz bağlama Şekil Polimer matrikste tutuklama Şekil Mikrokapsülleme Şekil Biyosensör teknolojisinde kullanılan biyoaktif materyal sıralamasında enzimlerin yeri Şekil Enzim sensörlerinin genel şematik gösterimi Şekil Amperometrik esaslı bir biyosensörün şematik gösterimi Şekil 3.1. Kaplama ve ölçümde kullanılan hücre sistemi Şekil 3.2. Pt/PPy-PVS film elektrodunun voltamogramı... 62

14 xiv Şekil Sayfa Şekil 4.1. Elektrot yüzeyinde gerçekleşen elektron aktarımı Şekil 4.2. Pt/PPy-PVS elektrodun H 2 O 2 ye duyarlılığı Şekil 4.3. Pt/PPy-PVS film elektrodun serbest enzimli ortamda kolesterol palmitata duyarlılığı Şekil 4.4. a) Çapraz Bağlama b) Tutuklama ile immobilizasyon Şekil 4.5. Tekrarlanabilirlik (Tutuklama yöntemi ile) Şekil 4.6. Tekrarlanabilirlik (Çapraz bağlama yöntemi ile) Şekil 4.7. Pt/PPy-PVS filminin SEM fotoğrafı Şekil 4.8. Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörünün SEM fotoğrafı Şekil 4.9. Pt/PPy-PVS filminin AFM fotoğrafı Şekil Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörünün AFM fotoğrafı Şekil Pt/PPy-PVS filminin yüzey temas açısı fotoğrafı Şekil Pt/PPy-PVS-ChEt -ChOx biyosensörünün yüzey temas açısı fotoğrafı Şekil Pt/PPy-PVS filminin profilometre spektrumu Şekil Pt/PPy-PVS-ChEt -ChOx biyosensörünün profilometre spektrumu Şekil Biyosensörün aktivitesine ph nın etkisi Şekil Biyosensörün aktivitesine sıcaklığın etkisi Şekil Biyosensörün amperometrik cevabına kolesterol palmitat derişiminin etkisi (Michaels-Menten grafiği) Şekil Biyosensörün aktivitesi üzerine kolesterol palmitata duyarlılığını gösteren Lineweaver-Burk grafiği Şekil Kolesterol biyosensörü için kalibrasyon grafikleri Şekil Biyosensörün tekrar kullanılabilirliğinin incelenmesi Şekil Biyosensörün raf ömrünün incelenmesi... 91

15 1 1. GİRİŞ Kolesterol (C 27 H 46 O, M A :386,65 g/mol), 3-hidroksi-5-dehidro kolestan olup, hayvansal organizmalarda en çok bulunan bir steroldür [1]. Şekil 1.1. Kolesterol ün molekül yapısı Kolesterol biyolojik zarların yapısında bulunan ve yaşam için temel olan yapısal bir bileşen olup mum kıvamında yağımsı bir maddedir. Beyin, sinirler, kalp, barsaklar, kaslar, karaciğer başta olmak üzere tüm vücutta yaygın olarak bulunur. Vücut kan plazmasında kolesterol, bazı hormonların (steroit bileşikler), D vitamini ve yağları sindiren safra asitlerin çıkış maddesi olarak kullanılır [2-3]. Şekil 1.2. İnsan vücudunda kolesterolün işlevi

16 2 Bu işlemler için kanda çok az miktarda kolesterol bulunması yeterlidir. Kanda fazla miktarda kolesterol bulunması kolesterolün kan damarlarında birikmesine, damarların daralmasına, sertleşmesine yol açar. Kolesterol hangi organın damarlarında birikirse o organa ait hastalıklar ortaya çıkar [3]. Kolesterol normal koşullarda kanda çözünmez. Kanda çözünmesi için karaciğerde bir proteinle birleşmesi gerekir. Bu kolesterol ve protein birleşimine lipoprotein adı verilir. Çok çeşitli lipoprotein türleri vardır bunların en önemlileri aşağıda verilmiştir ve 5 e ayrılırlar: Şilomikronlar Çok düşük yoğunluklu lipoproteinler Ara yoğunluktaki lipoproteinler Düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL): Kan kolesterolünün yaklaşık %70 ini taşımaktadırlar. Kan damarları duvarlarına girebilmek için yeterince küçüktürler ve damarlara zarar verirler. Kötü tür kolesterol olarak adlandırılırlar. Yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL): Vücudun kullanmadığı kolesterolü karaciğerden safraya boşaltmak üzere taşır. Kolesterolün bir cins ters naklini yaptığı için iyi tür kolesterol olarak adlandırılırlar. Kanda toplam kolesterol ve LDL kolesterolün yüksek olması yüksek risk oluşturmaktadır. Ayrıca HDL kolesterolün düşük olması da bir risktir. Normal şartlarda sağlıklı bireyin kan plazmasında 200 mg/dl değerinin altında kolesterol bulunur. İnsan vücudunda bulunan kolesterolün üçte ikisi yağ asitleri ile esterleşmiş halde üçte biri ise sterol olarak mevcuttur [3-4]. Bunun üzerindeki değerler yüksek kolesterol seviyesi olarak bilinir [3]. Kandaki veya serumdaki kolesterol seviyesi, koroner kalp hastalığı, damar sertliği ve başka klinik hastalıkların teşhisinde ve tromboz risklerinin, miyokart enfarktüsünün değerlendirilmesinde temel bir parametredir [5]. Bu nedenle kanda kolesterol seviyesinin tayini önemlidir.

17 3 Kolesterol tayini için enzimatik ve enzimatik olmayan metotlar geliştirilmiştir. Enzimatik olmayan metodlar, fazla zaman alan, uzman işgücü ve pahalı kimyasal maddeler gerektiren ve serumdaki kolesterol analizlerinin hızlı ve otomatik yapılmasına uygun olmayan metodlardır. Kolesterol tayini için enzimatik metotlar ise karmaşık prosedürler gerektirir ve her bir analizdeki enzimlerin pahalı olmasından dolayı yüksek maliyetlidir. Kolesterolün serumdaki ve kandaki tayini için tasarlanan biyosensörler ile duyarlılık, seçicilik, hız, kararlılık geliştirilmiş ve maliyet düşürülmüştür. Biyosensörler için enzimatik elektrotların uygulaması enzimin uygun matrislerde immobilizasyonu ile başarılmıştır. Kolesterol oksidaz immobilizasyonu değişik matrislerde yapılmıştır: iletken polimerler, sol-gel, kendiliğinden toplanan tabakalar (SAM), karbon pasta, selüloz asetat, nanopartiküller, grafit-teflon bileşimi gibi [5]. Bu çalışmada kolesterole duyarlı yeni bir amperometrik biyosensör hazırlandı. Bunun için, Platin/Polipirol-polivinilsülfonat (Pt/PPy-PVS) elektrotları pirolün elektropolimerleşmesiyle hazırlandı [6]. Daha sonra kolesterol esteraz (ChEt) ve kolesterol oksidaz (ChOx) enzimlerinin tutuklama yöntemi ile immobilizasyonu sağlanarak Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörü elde edildi. Enzimlerin katalizlediği reaksiyonlar şöyledir: Kolesterol esteri + H2O Kolesterol esteraz Kolesterol + Yağ asidi Kolesterol oksidaz Kolesterol + O 2 Kolest-4-en-3-on + H 2 O 2 Kolesterol tayini, enzimatik reaksiyon sonucu oluşan H 2 O 2 in +0,40 V da yükseltgenmesi esasına dayanarak yapıldı. Biyosensörün en iyi çalışma koşulları belirlendi ve performansını etkileyen faktörler incelendi. Film elektrot ve biyosensörün yüzeyinin morfolojik yapısı SEM, AFM, yüzey temas açısı, profilometre gibi yöntemlerle karakterize edildi. Biyolojik sıvılarda olabilecek

18 4 ve amperometrik cevap akımını etkileyeceği düşünülen muhtemel girişimler incelendi. Hazırlanan biyosensör ile biyolojik sıvıda (kan) kolesterol tayini yapıldı. Bu çalışma Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörünün hazırlanma koşulları; immobilizasyon tekniği ve tayin yöntemi açısından diğer çalışmalardan farklıdır.

19 5 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Enzimler Enzimler canlı organizmalarda kimyasal reaksiyonları katalize eden ve hiçbir yan ürün oluşmasına fırsat vermeden % 100 lük bir ürün verimi sağlayan biyolojik katalizörlerdir. Katalitik RNA moleküllerinin (ribozimler) küçük bir grubu dışında bütün enzimler protein yapısındadır. Proteinlerin en büyük ve en çok özelleşmiş grubunu teşkil ederler [7-55]. Canlıları oluşturan moleküller, yani biyomoleküller kinetik yönden oldukça kararlı olup kendiliğinden kolayca reaksiyon vermezler. Bir hücredeki tüm kimyasal olaylar enzimler aracılığıyla gerçekleştirilir. Biyomoleküllerin kararlılığı şu önemli sonucu sağlamaktadır; hücre içinde enzimi olmayan reaksiyon gerçekleşmesi hemen hemen mümkün değildir, kendiliğinden reaksiyon meydana gelmez. Bunun anlamı, enzimlerin protein yapısında oldukları ve DNA tarafından şifrelendikleri için, bir hücrede gerçekleşen bütün olaylar DNA seviyesinde düzenlenip kontrol edilmektedir demektir. Buradan, enzimleri sadece katalizör özelliği ile nitelemenin eksik bir tanımlama olacağı anlaşılmaktadır. Biyokimya tarihinde araştırmaların büyük çoğunluğunu enzimler üzerindeki çalışmalar oluşturmuştur. Kataliz olayı ile ilgili önemli ilk çalışmalar yılları arasında midedeki enzimatik sindirim üzerinde yapılmıştır. Belirli bir enzim üzerindeki ilk çalışmayı 1835 yılında İsveçli kimyager S.S. Berzelius gerçekleştirmiş ve diastazın nişastayı hücre içinde sülfürik asitten daha yüksek verimle hidrolizlediğini göstermiştir yılında L. Pasteur fermentasyon olayının enzimler tarafından yürütüldüğünü deneylerle ispat etmiş olmasından dolayı enzimler için ferment terimi kullanılmaya başlanmıştır. Fakat Pasteur enzimlerin yalnız canlı hücre yapısı içerisinde görev yapabildiklerini zannetmiştir [8].

20 6 Enzimoloji alanında şüphesiz en önemli gelişme 1926 yılında, Summer ın üreaz enzimini Jack Beané bitkisinden elde edip kristallendirdikten sonra protein yapısında bir bileşik olduğunu ortaya koymasıdır. Önceleri şüphe ile karşılanan bu sonuç, yılları arasında Northrop un pepsin, tripsin ve kimotripsin enzimlerini kristallendirmesi ve protein yapısında olduklarını kesin olarak ortaya koymasıyla doğrulanmıştır. Bugün yaklaşık olarak 2000 kadar enzim tanımlanmış, birçoğu saf halde elde edilip kinetikleri incelenmiş ve 200 den fazlası da kristallendirilmiştir. Ancak yapılan genetik çalışmalar henüz tespit edilmemiş birçok enzim varlığının olduğunu göstermektedir [8]. Enzimlerde proteini oluşturan aminoasitlerin sayısı, diziliş sırası ve moleküllerin yapısı belirli bir düzen içindedir. Bu düzen enzimin substrata seçiciliğini sağlar. Enzimin protein yapısının yanında ona aktiflik kazandıran gruplar vardır. Bazı enzimler yalnızca proteinden oluşurken bazıları protein yanında protein olmayan bir kısım içerirler. Enzimin protein kısmına Apoenzim, protein olmayan kısmına Kofaktör ya da Koenzim denir. Sıklıkla karşılaşılan kofaktörler arasında metal iyonları (Zn 2+, Fe 2+ gibi) ve organik yapıda olan (NAD +, FAD gibi) koenzimler yer alır. Apoenzim ve kofaktörün oluşturduğu aktif yapıya da holoenzim denir [9]. Holoenzimin büyük bir kısmını apoenzim oluşturur. Apoenzim tek başına katalitik aktivite göstermez. Enzimin gerçek aktivitesi sadece koenzim ve apoenzim bir arada olduğunda gözlenir [10]. Enzim molekülünün belirli bir bölgesinde belirli amino asitlerin oluşturduğu bir kısım bulunur. Protein zincirinin bu bölgesi enzimin katalitik etkisinden sorumlu olup Aktif bölge olarak tanımlanır. Substrat ve eğer varsa koenzim, bu merkeze hidrojen bağları, hidrofobik etkileşimler, iyonik bağlar veya kovalent bağlar ile bağlanır [11]. Aktif bölge substratı bağlayarak bir enzim substrat (ES) kompleksi meydana getirir. ES kompleksi, enzim-ürün (EÜ) kompleksine dönüşür ve enzim üründen ayrılır (Şekil 2.1).

21 7 Şekil 2.1. Bir substrat molekülünü bağlayan enzimin şematik olarak gösterilmesi Enzim aktivitesine etki eden faktörler enzim miktarı, substrat konsantrasyonu, ph, sıcaklık, iyonik şiddet, sahipse kofaktör derişimi, aktivatör ve inhibitör derişimleri olarak sıralanabilir. Enzimler yeterli koşulların sağlanması durumunda etkilerini gösterebiliyor olmaları enzimlerden doğal ortamların dışındaki pek çok alanda da yararlanabilme imkanını ortaya çıkarmaktadır. Bu nedenle enzimlere ilişkin tüm nitelik ve özellikleri bir bütün olarak inceleyen enzimoloji bilim dalı, başta biyokimya ve moleküler biyoloji olmak üzere fizikokimya, bakteriyoloji, mikrobiyoloji, genetik, botanik, tarım, farmakoloji, toksikoloji, patoloji, fizyoloji, tıp, mühendislik ve biyoteknoloji gibi bilim dalları ile çeşitli endüstriyel alanlar için büyük önem taşımaktadır Kolesterol Esteraz Enziminin Özellikleri Kolesterol esteraz enziminin protein yapısında 579 tane amino asit kalıntısı vardır. Aktif merkezdeki aminoasitler Ser194, His435, Asp320 dir [12].

22 8 Şekil 2.2. Kolesterol esteraz enziminin üç boyutlu yapısı Vücutta fazla miktardaki kolesterol, hücre içinde kolesterol esterleri olarak depolanır. Kolesterol esteraz enzimi kolesterolün yağ asidi esterlerini ve diğer sterolleri hidrolize edebilen ve sentezleyebilen tersinir enzimdir [12]. Esas olarak pankreas ve pankreas sıvısında bulunur ve aynı zamanda diğer dokularda da meydana gelir. Kolesterol esteri + H 2 O Kolesterol esteraz Kolesterol + Yag asidi R O O H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 H 3 C H H H HO H 3 C H 3 C H 3 C H H H CH 3 CH 3 R O C OH İlk olarak 1900 yıllarında enzimatik olarak katalize sentezi ve bazı dokuların varlığında kolesterol esterlerin hidrolizi gözlenmiş ve tanımlanmıştır ve 1950 yıllarında Yamamoto ve Treadwell tarafından kolesterol esteraz üzerinde kapsamlı çalışmalar yapılmıştır [13] yılında Korzenovsky tarafından serum ve diğer çeşitli dokularda kolesterol esteraz enzimi incelenmiştir yılında Hernandez ve Chaikoff pankreas kolesterol esteraz özellikleri ve enzimatik aktivite tahmini için bir turbidimetrik yöntem

23 9 geliştirmiştir [14]. İlerleyen yıllarda kalp-damar hastalığı ve yüksek serum kolesterol arasındaki bilinen ilişki ile ilgili bir çalışma yapılmıştır. Kolesterol esteraz kullanılarak toplam serum kolesterol belirlenmesinde klinik uygulamalar yer bulmuştur [15]. Domuz pankresasından elde edilen kolesterol esterazın özellikleri [16]: Sistematik adı: EC kolesterol: steril - ester açilhidrolaz Görünümü: Donmuş toz hali beyazdır. Molekül kütlesi: Yaklaşık 167 kda ( jel filtrasyonu ile ) İzoelektrik noktası: 5,95 ± 0,05 İnhibitörleri: İyonik deterjanlar, Hg ++, Ag + En iyi ph: 7,4 En iyi sıcaklık: 25 C ph kararlılık aralığı: 6,5 8, Kolesterol Oksidaz Enziminin Özellikleri Kolesterol oksidaz çeşitli mikroorganizmalardan saflaştırılan iki işlevli bir enzimdir. Bu enzim merkezde iki tepkimeyi katalizler. İlk tepkimede kolesterolün, yükseltgenmesini, ikinci tepkimede ise oluşan yükseltgenme ürününün kolesterol-4- en-3-on a dönüşümünü sağlar ve bu sırada aşağıda da verildiği gibi H 2 O 2 açığa çıkar [1-2, 18].

24 ten beri kolorimetrik tayin ile serum içindeki serbest kolesterolün hesaplanmasında bu enzim kullanılmaktadır [1-2, 18]. Serum içindeki toplam kolesterolün hesaplanması klinik teşhisler için gereklidir. Kolesterolün yüksek değeri bazı damarların çeperlerinde birikerek damarların tıkanmasına, tiroit bezinin az çalışmasından kaynaklanan tiroit bozukluğuna, böbrek tubuluslarının dejenerasyonun yol açtığı bir hastalığa, şeker hastalığına ve sarılığa sebep olur. Düşük değeri ise boynun önünde bulunan tiroit bezinin fazla çalışmasından ileri gelen bir bozukluğa ve kansızlığa sebep olur [22-23]. Kolesterol oksidaz steroitlerin izomerizasyonunu ve oksidasyonunu sağlayan koenzim FAD taşıyan bir enzimdir [18, 20]. Enzimin protein yapısında 492 tane amino asit kalıntısı vardır. Aktif merkezdeki amino asitler His447, Glu361 dir. En önemli amino asit kalıntısı Glu361 dir. Glu361 mekanizmadaki izomerizasyon basamağında bir proton alıcısı gibi görev yapar. Şekil 2.3 de Glu361 küçük sarı toplar olarak gösterilmiştir. Proteine bağlı FAD, enzimin mavi renkte gösterilen α-sarmal ile çevrelenmiştir [22]. Şekil 2.3. Kolesterol oksidaz enziminin üç boyutlu yapısı Kolesterol oksidaz farklı ortamlarda bulunan mikroorganizmalardan elde edilmiştir. Bunların sınıflandırılması yıllar boyunca geliştirilmiştir. İlk defa

25 11 Turfitt, Nocardia erythropolis mikroorganizmasından enzimi saflaştırmış ve kolesterolün yükseltgenmesi üzerine etkilerini incelemiştir. Stadtman ve arkadaşları ekstrakte edilen serbest enzimin inkübasyonundan 4-kolest-3-on u elde etmişlerdir. Bu gelişmelerden sonra birçok mikroorganizmada bu enzim bulunmuştur. Kolesterol oksidazın elde edildiği mikroorganizmalar aşağıda verilmiştir [24-25]. Corynebactericum Arthrobacter Nocardia erythropolis ve Rhodococcus eryhcopolis Nocardia rhdochrous ve Rhodococcus rhdochrous Mycbacterium Pseudomonas Brevibacterium cholesterolicum Streptoverticillium cholesterolicum Streptomyces violascens Rhodococcus Streptomyces bakterisinden elde edilen kolesterol oksidazın özellikleri [22]: Sistematik adı: E.C kolesterol: oksijen oksidoredüktaz Görünümü: Donmuş toz hali sarıdır. Molekül kütlesi: Yaklaşık 59 kda ( jel filtrasyonu ile ) İzoelektrik noktası: 5,1 ± 0,1 ve 5,4 ± 0,1 İnhibitörleri: İyonik deterjanlar, Hg ++, Ag ++ En iyi ph: 6,5 7,5 En iyi sıcaklık: 37 C ph kararlılığı: 4,0 9,0 Termal kararlılığı: 70 C nin altında Kararlılığı: 37 C de en az bir ay

26 Tepkime mekanizması Kolesterol oksidaz enziminin katalizlediği tepkime mekanizması Şekil 2.4 de gösterildiği gibidir. Katalizleme iki safhada gerçekleşir. İlk tepkime kolesterolün kolest-5-en-3-on a yükseltgenmesi, ikinci tepkime ise kolest-5- en-3-on un kolest-4-en-3-on a dönüşüm tepkimesidir [25]. Şekil 2.4. Kolesterol oksidaz enziminin tepkime mekanizması Kolesterol oksidaz ve kolesterol esterazın uygulama alanları Gıda analizlerinde kolesterol tayini amacı ile kullanılır. Kolesterol oksidaz Kolesterol + O 2 Kolestenon + H 2 O 2 Katalaz H 2 O 2 + Metanol Formaldehit + 2 H 2 O

27 13 Formaldehit + NH asetilaseton Lutidin Boyar maddesi+ 3 H 2 O Katkı maddesi olarak yumurta sarısı içeren gıdalarda kolesterol tayini amacı ile kullanılır [11]. Klinik analizlerde kolesterolün belirlenmesi amacıyla kullanılır. Kolesterol esteraz, kolesterol oksidaz ve peroksidaza bağlı enzimatik kolorimetrik yöntem kolay duyarlı ve özeldir. Bu yüzden de rutin analizler için uygundur. Bu da aşağıdaki kimyasal reaksiyonlara dayandırılmaktadır. Kolesterol esteraz Kolesterol esteri + H 2 O Kolesterol + Yağ asidi Kolesterol oksidaz Kolesterol + O 2 Kolest -4-en-3-on + H 2 O 2 Peroksidaz H 2 O aminofenazon + Fenol Kinonimin boyası Bu örnekteki ilk tepkimede kolesterol esterleri kolesterol esteraz tarafından kolesterol ve yağ asitlerine hidrolizlenir. İkinci tepkimede kolesterol, kolesterol oksidaz tarafından kolest-4-en-3-on ve H 2 O 2 ye yükseltgenir. H 2 O 2, peroksidaz katalizörlüğünde 4-aminofenazon ve fenol varlığında renkli 4-(pbenzokinon-monoimino) fenazon oluşumunu sağlar. İndikatör ve stokiyometrik olarak eşleşmiş tepkimeler yardımıyla kolesterol derişimine ulaşılır [26]. Etkin enzim güçlü bir böcek öldürücüdür [27].

28 Analitik uygulamaları Analitik inceleme olarak kolesterol esteraz ve kolesterol oksidazın kullanımı için birçok yeni uygulamalar vardır. a) Farklı örnek türlerinde kolesterolün saptanması için kullanılır. Bu örnekler Serumda toplam ve esterleşmiş kolesterol tayini Yüksek ve düşük yoğunluklu (HDL-LDL) lipoprotein ölçülmesi b) Hücrelerdeki kolesterol tayini ve enzimlerin yol açtığı hücre zarlarının parçalanmasının tespit edilmesi c) İnsan safrası ve safra taşlarındaki toplam kolesterol tayini d) Kemilüminesans ve floresans yöntemleriyle kolesterol tayini e) Biyosensör yapımı ve enzimin polimer matrikse immobilizasyonu Genelde kolesterol tayini yöntemlerin çoğu H 2 O 2 ölçümüne dayanır. Bu sebeple bu yöntem dolaylı bir yöntemdir. Bunun sebepleri çeşitlidir. Birinci olarak H 2 O 2 in renk oluşturan bileşenlerle eşleşmesi sonucunda yüksek seviyede renk verici maddeler oluşur. Bu da daha hassas kolesterol ölçülmesini sağlar. İkinci olarak, H 2 O 2 nin redoks tepkimesi açık bir şekilde saptanır. Bu da kolay voltametrik ve amperometrik ölçme yapılmasını sağlar [24].

29 Biyosensör Canlılar teknologların hayal bile edemeyecegi duyarlılık performansı gösterirler. Örnegin, bazı köpeklerin koku almaları insanlardan kat daha duyarlıdır. Yılan balıkları, tonlarca su içerisine ilave edilen birkaç damla yabancı maddeyi hemen algılarlar. Kelebekler partnerlerinin yaydığı birkaç molekülü bile hissederler. Algler ise zehirli maddelere karşı çok duyarlıdırlar. İşte canlılara bu uyarıları algılamayı mümkün kılan biyolojik maddelerin analiz sistemleri ile birleştirilmesi sonucunda biyosensörler ortaya çıkmıştır [28]. Biyosensör, biyolojik olaylardaki biyokimyasal değişimleri algılayarak, biyolojik olayın teşhisine imkan tanıyan bir ölçme sistemi olarak tanımlanabilir. Biyosensörler, birbiri içine geçmiş biri biyokimyasal diğeri elektrokimyasal özellikteki iki çeviriciden oluşmaktadır (Şekil 2.5). Biyokimyasal kısmın görevi analizlenecek madde ile etkileşerek onu tanımaktır. Bu tanıma olayının sonucunda bir biyokimyasal ürün de oluşabilmektedir. Biyosensörün ikinci kısmı olan elektrokimyasal kısım ise bu tanıma olayını ölçülebilir bir sayısal değere dönüştürmekle görevlidir [28-29]. Şekil 2.5. Bir biyosensörün şematik yapısı Biyosensörlerin tarihi 1950 li yılların ortalarında Clark ın Cincinnati Hastanesinde (Ohio, ABD) ameliyat sırasında kanın O 2 miktarını bir elektrotla

30 16 izlemesi ile başlamıştır yılında Clark ve Lyons glukoz oksidaz enzimini O 2 elektrodu ile kombine ederek kanın glukoz düzeyini ölçmeye başlamışlar. Böylece yeni bir analitik sistem oluşturmuşlar. Bu sistem bir yandan biyolojik sistemin (enzim) yüksek spesifikliğini diğer taraftan ise fiziksel sistemin (elektrot) tayin duyarlılığını belirlemiştir ve geniş spektrumlu uygulama olanağı elde etmiştir. Clark ve Lyons un geliştirdiği ilk biyosensörde elektron alıcısı olarak oksijen kullanılırken, ikinci jenerasyon biyosensörlerde O 2 yerine elektronları enzimin redoks merkezinden elektron yüzeyine taşıyabilen bir redoks medyatörü kullanılmaya başlanmıştır. Üçüncü jenerasyon biyosensörlerde enzimin redoks merkezi ile elektrot yüzeyi arasında doğrudan elektriksel iletişim sağlanmıştır ve redoks medyatörlerine gereksinim kalmamıştır [30]. Glukoz + O 2 GOD Glukonik asit + H GOD: Glukoz oksidaz GOD-FADH 2 + M ox GOD-FAD + M red + 2H 2 M red = M ox = redoks medyatörü Biyosensörler, diğer adıyla biyospesifik elektrotlar, biyoajanları immobilize halde kullanan, çeşitli gaz, iyon ve biyolojik maddelerin teşhisi, kantitatif tayini ve orijinal sistemlerde izlenmesi amacıyla geliştirilmiş problardır. Biyosensörler klinik tıpta teşhis ve tayin amacıyla, fermantasyon analizi ve kontrolünde biyoloji, kimya, gıda endüstrisi, ziraat ve veterinerlikteki çeşitli analizlerde, endüstriyel gaz ve sıvıların analizinde, çevre kirlenmesinin izlenmesinde, patlayıcılar ve diğer askeri alanda kullanılmaktadır. En basit tanımıyla biyolojik katalizör taşıyan sensörler olarak tanımlanır. Biyosensörler canlılardaki çeşitli maddelerin algılanmasını mümkün kılan biyolojik maddelerin birleştirilmesiyle ortaya çıkmıştır. Bu sistemler bir yandan biyolojik

31 17 sistemin yüksek seçimliliğini diğer yandan sensörlerin tayin duyarlılığını birleştirmiş ve çok geniş uygulama alanı bulmuştur. Biyosensörlerin yüksek spesifiklik yanında; renkli ve bulanık çözeltilerde geniş bir konsantrasyon aralığında doğrudan ölçmeye olanak sağlamak gibi üstünlükleri vardır. Fakat reseptör olarak adlandırılan biyobileşenlerin ph, sıcaklık, iyon şiddeti gibi ortam koşullarından etkilenmesi biyosensörün raf ömrünü azalttığından bir dezavantajdır [29] Biyosensörlerin yapısı ve fonksiyonları Biyosensör sistemi üç temel bileşenden meydana gelmektedir (Şekil 2.6). Bunlar, seçici tanıma mekanizmasına sahip biyomolekül, biyoajan ve bu biyoajanın incelenen madde ile etkileşimi sonucu oluşan fizikokimyasal sinyalleri elektronik sinyallere dönüştürebilen çevirici ve elektronik bölümlerdir. Bu bileşenlerden en önemlisi, tayin edilecek maddeye karşı son derece seçimli fakat tersinir bir şekilde etkileşime giren, duyarlı biyolojik ajandır. Bir başka deyişle biyosensörler, genellikle analizlenecek madde ile seçimli bir şekilde etkileşime giren biyoaktif bir bileşenin, bu etkileşim sonucu ortaya çıkan sinyali ileten bir iletici sistemle birleştirilmesi ve bunların bir ölçüm sistemi ile kombinasyonuyla oluşturulurlar [28-29]. Şekilde bir biyosensörün çalışma prensibi gösterilmiştir (Şekil 2.6).

32 18 Şekil 2.6. Biyosensörlerin yapısı ve çalışma prensibi Biyobileşenler Enzimler, mikroorganizmalar, organeller, doku kesitleri, antikorlar, nükleik asitler ve biyolojik zarlar içine yerleştirilmiş kimyasal reseptörler sensörlerde biyobileşen olarak kullanılırlar. Biyosensörlerin yapısında görev alan biyobileşenler çoğu zaman biyoreseptör olarak adlandırılırlar. Biyoreseptörler analizlenecek maddeyi dönüşüme uğratırlar ve bu dönüşüme eşlik eden değişimler dönüştürücü tarafından algılanır. Yüksek spesifikliklerinden dolayı enzimler en yaygın kullanılan biyoreseptörlerdir [29] Algılayıcılar (Transduserler) Transduserler, reseptörlerin biyolojik reaksiyonunu ölçülebilir fiziksel bir sinyale dönüştürürler. Biyokimyasal reaksiyona göre algılayıcılar seçilir. Elektrotlar amperometrik veya potansiyometrik ölçümlerde kullanılır ve burada hedef analittir. (O 2 elektrodunda çözünmüş O 2, ph elektrodunda H + iyonu gibi ) [29].

33 19 Algılayıcılar dört grupta toplanabilir; 1) Elektrokimyasal algılayıcılar - Amperometrik esaslı - Potansiyometrik esaslı - Kondüktometrik esaslı 2) Optik algılayıcılar - Absorbans ölçümünü temel alanlar - Floresans veya fosforesans ölçümünü temel alanlar - Kırılma indisini temel alanlar 3) Kütle değişimini temel alan algılayıcılar 4) Isı değişimini temel alan algılayıcılar - Termistörler Ölçülen madde türü, yayınlanan makale sayısı ve ticari olarak üretilen tür ve sayılar dikkate alındığında, elektrokimyasal ölçüm bazlı sistemlerin diğer sistemlere göre çok daha fazla ilgi gördüğü söylenebilir. Elektrokimyasal algılayıcılardan en yaygın olarak kullanılanlar potansiyometrik ve amperometrik esaslı olanlardır [31]. Çizelge 2.1. Biyosensör algılayıcıları ALGILAYICILAR İyon seçimli elektrot Gaz duyarlı elektrot Alan etkili transistörler Polarografik Optoelektronik cihazlar Termistörler Kondüktometri Piezoelektrik ÖLÇÜM ESASI Potansiyometrik Potansiyometrik Potansiyometrik Amperometrik Optik Kalorimetrik İletkenlik Kütle değişimi

34 Biyosensörlerin uygulama alanları Biyosensörlerin, klinik teşhis, tıbbi uygulamalar, süreç denetleme, biyoreaktörler, kalite kontrol, tarım ve veterinerlik, bakteriyel ve viral teşhis, ilaç üretimi, endüstriyel atık su denetimi, madencilik, askeri savunma sanayi gibi alanlarda yaygın olarak kullanımı söz konusudur [29]. Biyosensörler; gıda maddeleri, metabolitler, vitaminler, antibiyotikler, ilaçlar gibi organik maddeler ile bazı anorganik bileşikler yanında enzimler, virüsler ve mikroorganizmaların tayininde kullanılmaktadır [29]. Çizelge 2.2. Biyosensörler için uygulama alanları Klinik teşhis, biyomedikal sektör Gıda üretim ve analizi İlaç analizi Bakteri ve virüs teşhisi Çevre koruma ve kirlilik kontrolü Askeri uygulamalar Proses kontrolü Biyoreaktör kontrolü Tarım ve veterinerlik Endüstriyel atık su kontrolü Maden işletmelerinde zehirli gaz analizleri Hiç şüphesiz biyomedikal sektör biyosensörler için en iyi pazardır. Bu alanda uygulama olanağı olan ilk biyosensörler enzim biyosensörleridir. Ticari olarak üretilen ilk biyosensör ise şeker hastalığı teşhisi için kan ve idrarda glukoz tayininde kullanılan glukoz oksidaz elektrodudur [29]. Son yıllarda tıbbi analizörlere enzim elektrodları takılarak yoğun bakım ünitelerinde kullanılmaya başlanmıştır. Biyoteknoloji ve gıda endüstrisinde başta glukoz olmak üzere birçok monosakkarit, aminoasitler, organik asitler (laktik asit), üre ve alkol tayinlerinde enzim biyosensörleri kullanılmaktadır. Ayrıca, gıdalardaki yabancı maddeler (pestisitler, toksinler ve hormonlar vb.) yanında aroma ve tazelik gibi kompleks parametreler için de biyosensörler kullanılabilir. Toprak, hava ve su kirliliğinin kontrolünde mikrobiyal

35 21 biyosensörler ve enzim biyosensörleri kullanılmaktadır. İlaçların kötü amaçla kullanımı ve uyuşturucu ile mücadelede biyosensörler kullanılabilecektir. Böylece uyuşturucu madde arayan köpeklerin yerini biyosensörler alabilir ve gümrüklerde, karakollarda zaman kazanılabilir [29] Biyosensör hazırlanmasında dikkat edilmesi gerekenler Biyosensör tasarımlarında önce biyosensörün hangi analiti tanıyacağı tespit edilmelidir. Daha sonra aşağıda yer alan maddeler dikkate alınarak biyosensörler dizaynı yapılmalıdır. Bunlar sırasıyla; i. Analite uygun biyoreseptörün seçimi, ii. Biyoreseptörü dönüştürücüye sabitlemede kullanılacak uygun ve verimli immobilizasyon yönteminin belirlenmesi, iii. Biyoreseptörün analiti tanımasıyla oluşan kimyasal veya fiziksel sinyali anlaşılabilir sinyal formuna dönüştürecek olan transduserin seçimi ve dizaynı olarak sıralanabilir [32] İletken Polimerler Polimerik malzemeleri metallerden ayıran en önemli özellik yalıtkan olmalarıdır. Bu özellik polimerik malzemelerin kullanımında birçok üstünlükler sağlamaktadır. Fakat son yıllarda, elektrik akımını iletebilen yeni bir organik polimer sınıfı geliştirilmiştir. Asetilen, pirol, tiyofen gibi çeşitli benzen türevlerinden sentezlenen ve organik metaller olarak da bilinen bu polimerler korozyon önleyici kaplama olarak, pillerde ve kararlılıklarına bağlı olarak mikroelektronikte önemli bir potansiyele sahiptirler. Bu polimerler arasında polipirol ve türevleri elektriksel özelliği, çevresel kararlılığı, kimyasal ve elektrokimyasal sentezinin kolaylığından dolayı en yoğun şekilde incelenen grubu oluşturur [33, 77].

36 22 İletken polimerler konusundaki ilk çalışmalar 1950 lerde başlamıştır. İletkenlikleri oda sıcaklığında 5-10 S/cm olan yarı iletken polimerler yılları arasında üretilmiştir. Günümüzdeki anlayışa uygun iletken polimerler 1970 lerin sonunda ortaya çıkmaya başlamıştır. Shirakawa yöntemiyle elde edilen poliasetilenin bir yükseltgen ile dop edilmesi sonucunda iletkenliğinin 10 8 kat arttığı görülmüştür [34]. İlk olarak elektrokimyasal polimerizasyon yöntemi 1900 yılında Szarvasy tarafından yapılmıştır. İletkenlik konusunda en önemli adım 1979 da Diaz ın pirolü elektrokimyasal yöntemle yükseltgeyerek polipirolü elde etmesiyle atılmıştır. Polipirol anot üzerinde üretilebilmiş ve güçlü bir film olarak yüzeyden çıkarıldığında iletkenliği 100 S/cm ye ulaşabilmiştir. Benzer şekilde, elektroyükseltgenme yöntemiyle iletken politiyofen, anot üzerinde üretilebilmiştir. Karbosol ve indol gibi aromatik bileşiklerden de elektrokimyasal yöntemlerle polimerler üretilmiştir. Anilinin elektroyükseltgenmesiyle anot yüzeyinde toz halde iletken polianilin elde edilmiştir. Bazı iletken polimerler kimyasal yöntemlerle de üretilebilmektedir. Örneğin pirol, Br 2 veya AsF 5 ile yükseltgendiğinde iletken polipirol elde edilmiştir [34]. Polipirol ve türevleri genellikle pirolün kimyasal ve elektrokimyasal oksidasyonuyla hazırlanırlar. Pirolün kimyasal sentezi yanı sıra elektrokimyasal sentezi de uzun yıllardan beri bilinen bir yöntemdir. Sulu ya da susuz ortamda elektrokimyasal çalışma olasılığı kimyasal olarak sentezlenen polipirolden daha yüksek iletkenlik gösteren filmler sentezlenebilmesi ve elde edilen polimer filmin yarı iletkenlerin korozyonunu azaltma avantajı elektrokimyasal senteze ilgiyi artırmıştır. Fakat elde edilen polipirol sert ve kırılgandır ve bu zayıf mekanik özellikler onun uygulama alanlarında kullanım potansiyelini de düşürmektedir. Polimerlerin iletkenliği Çizelge 2.3 te verilmiştir. Poliasetilen yüksek iletkenliğe sahip olmasına rağmen hava ve nem içerebilmesi nedeniyle ticari bir iletken polimer değildir.

37 23 Polipirol ve politiyofen, poliasetilene göre hava ortamında oldukça kararlı olmaktadır [33]. İletken polimerlerin en önemli problemlerinden biri herhangi bir çözücüde çözünememe problemidir. Son yıllarda bu çözünmeme problemi de bilinerek yapısal modifikasyon olmadan polipirolün çözünebilme problemini çözmek için sulu demirklorür çözeltisi, suda çözünebilen polimerizasyon sistemleri araştırılmıştır. Fakat bu sistemlerde, metilselüloz, polivinilalkol, polivinil pirolidon veya poliakrilamit gibi nötral polimerler kullanılarak polipirolün kolloidal çözeltileri üretilmiştir [33]. İletken polimerlerin çözünme zorluğu onların antielektrostatik filmler, elektronik pencereler, kimyasal sensörler, şarj edilebilen piller gibi uygulamalar için gerekli elektronik ve optik özelliklerini veren moleküler karakteristikleri olan π-elektronik yapılarının delokalize π-elektronik yapı onların yüksek elektronik polimerizasyonuna dolayısıyla zincir içinde yüksek π-π etkileşmesine yol açmaktadır. Bu da polimerin çözünme yerine agregasyonuna neden olmaktadır [33].

38 24 Çizelge 2.3. İletken polimerler ve iletkenlikleri Polipirolün çözünmeme probleminin temeli bilindiğinden ilk akla gelen çözüm, polimerin elektronik polarizebilitesini azaltmaktır. Bu yapısal modifikasyonla yapılırsa polimer çözünebilir ama aynı zamanda tüm yararlı optik ve elektronik özelliklerini kaybedebilmektedir. Bu nedenle son zamanlarda üzerinde çalışılan çözüm, polimerin başka bir polimer ile kompleksini oluşturmaktır [33,39].

39 25 Lineer polimerlerin intermoleküler kompleksleri zıt yüklerin etkileşmesi hidrojen ve hidrofobik bağların oluşumu ya da metal iyonlar yoluyla etkileşerek çözünen veya çözünmeyen çoklu kompleks oluşturmak üzere sentez edilebilmektedirler [33] Pirol Pirol ün kaynama noktası 130 o C, yoğunluğu 0,948 g/ml ve kokulu renksiz bir sıvıdır. Mineral asitleriyle hızlıca polimerleşmektedir. Pirol aromatik bileşiktir ve deneysel rezonans enerjisi kcal/mol dür [33]. Şekil 2.7. Pirolün aktif noktaları Pirol 2 veya 5 pozisyonunda gruplar atak yapabilir. Pirolün heterosiklik azot grubu zayıf bazik özelliktedir. Pirol suda az çözünmektedir fakat organik çözücülerde çok miktarda çözünmektedir. Pirol alkali iyonlarla çözünmez polimerizasyonla birlikte asit içinde yavaş çözünme göstermektedir [33,39] Elektrokimyasal polimerleşme mekanizması Elektronik iletken polipirol filmlerinin oluşumu anodik olarak asetonitrilin yükseltgenmesi ile ilk olarak Diaz tarafından yapılmıştır. Çözücü, elektrolit, fonksiyonel gruplar, elektrot potansiyeli ve diğer özelliklerin değiştirilmesiyle literatürde oldukça fazla miktarda çalışma bulunmaktadır ama polimerizasyon mekanizmasını anlamak uzun sürmüştür [33,39].

40 26 Polipirolün elektrokimyasal polimerleşme mekanizması Şekil 2.8 de verilmektedir. Reaksiyon sulu veya susuz çözeltilerde ve oksijensiz ortamlarda anodik indirgenme ile başlamaktadır ve devam eder. Polipirol kimyasal olarak da üretilebilir. Şekil 2.8 de görüldüğü gibi radikal katyonlar dimerleşip tekrar yükseltgenmekte veya başka monomere katılıp sonra yükseltgenmektedir. Oluşan dikatyon iki proton kaybederek nötürleştikten sonra yükseltgenme ile başlayan basamağa tekrar dönmekte ve bu mekanizma polimerleşme duruncaya kadar tekrarlanmaktadır. Elde edilen polimerin yapısı, mol kütlesi, iletkenliği ve fiziksel dayanıklılığı deney koşullarına göre farklılık gösterir. Çözücü olarak genellikle dielektrik sabiti yüksek olan ancak nükleofilik karakter göstermeyen organik çözücüler tercih edilir. Anot olarak platin levha, camsı karbon veya indiyum kalay oksit (ITO) camı kullanılır. Elektrolitlerin yüksek potansiyellerde bozunmaması istenir ve - - tetra alkillerin BF 4 veya CIO 4 tuzları tercih edilir. Bu anyonlar polimerler için en uygun dopantlardır. Anot potansiyelinin de aşırı yükseltgenmeye sebep olmayacak şekilde düşük tutulması gerekir. Aşırı yükseltgenen polimerin ana zincirindeki konjuge çift bağlar kırılırsa konjugasyon kesintiye uğrar ve iletkenlik düşer. Örneğin polipirol sulu çözeltide Ag/AgCl referans elektroduna göre +0,8 volttan daha yüksek potansiyellerde aşırı oksitlenerek iletkenliğini kaybedebilir [34,39].

41 27 Şekil 2.8. Pirolün elektrokimyasal polimerleşme mekanizması Elektrokimyasal sentez, basitliği ve yeniden üretilebilmesinden dolayı, elektrik iletken polimerlerin sentezi için hızla genel bir yöntem olarak kabul görmeye başlamıştır. Elektrokimyasal sentezin oda sıcaklığında gerçekleşebilmesi de onun önemli bir avantajıdır. Hem potansiyel hem de akım zamanla değiştirilerek film kalınlığı da kontrol edilebilmektedir. İletken polimerlerin elektrokimyasal polimerizasyonu genellikle şu yöntemler ile yapılmaktadır: (1) Akıma karşı (galvanostatik), (2) Potansiyele karşı (potansiyostatik) ya da (3) potansiyel taraması. Standart elektrokimyasal teknikte (hücre içerisinde çalışma elektrodu, referans elektrot ve karşıt elektrotdan oluşan üçlü elektrot sistemi) genellikle en iyi filmler elde edilmektedir. Elektrokimyasal sentez

42 28 homojen bir monomerle yapılabildiği gibi, kopolimerizasyonla da yapılabilmektedir. Poliazulen, politiyofen, polianilin, polipirol gibi bazı filmler bu yolla senetezenebilmiştir [35] İletken polimerlerle enzim immobilizasyonu Elektrokimyasal polimerizasyon teknikleri kullanarak işlevselleştirilmiş ve değiştirilmiş elektrot yüzeyleri elde edilmesi yöntemi, elektrot yüzeylerinde biyolojik tanımlama öğelerinin immobilizasyonu için uygulanabilmektedir [29]. İletken polimerler elektrotların elektroanalitik uygulamalarında, enzim immobilizasyonuna sıklıkla rastlanılmaktadır. Çizelge 2.4 de görüldüğü gibi enzim kullanılan biyosensörlerin geniş bir uygulama alanı bulunmaktadır [34]. Çizelge 2.4. İletken polimerlerin kullanıldığı biyosensörler D-Alanin Atrazin Kolesterol Kolin Dopamin Galaktoz Glutamat Substrat Enzim Polimer Tayin yöntemi D-Aminoasit oksidaz Polipirol Amperometri Tirozinaz Polipirol Amperometri Kolesterol oksidaz PPD Amperometri Kolesterol oksidaz ve Polipirol Amperometri Kolesterol esteraz Kolin oksidaz Polipirol Amperometri Tirosinaz Polipirol Amperometri Galaktoz oksidaz Polianilin Amperometri Glutamat Polipirol Amperometri Dehidrojenaz Polipirol Fruktoz dehidrojenaz Polianilin Kondüktometri Pepsin Polipirol Amperometri Peroksidaz Polianilin Amperometri Lipaz Polipirol Amperometri NADH dehidrojenaz Polipirol Amperometri Ürikaz Polianilin Kondüktometri Lipaz Polianilin Kondüktometri Fruktoz Hemoglobin Hidrojen peroksit Lipitler NADH Ürik asit Trigliseritler

43 Biyobileşen İmmobilizasyonu Biyosensörler farklı özellikteki iki elemanın (dönüştürücü ve biyobileşen) kombinasyonu ile oluşmaktadırlar. Uygun biyoreseptör ve dönüştürücü seçildikten sonra bunların birbirine bağlanması aşılması gereken en önemli sorundur. Bu bağlama işlemi biyoreseptör immobilizasyonu olarak tanımlanmaktadır. Bağlama işleminde çok değişik yöntemler kullanılabilmektedir. Hangi yöntemin kullanılacağı seçilen dönüştürücü ve biyoreseptöre göre belirlenmektedir. İmmobilizasyon, biyoreseptörün kararlılığı ve tekrar kullanımı açısından büyük avantaj sağlamaktadır [36] Enzim immobilizasyon yöntemleri Enzimin, elektrot yüzeyine yüksek aktivite ile ince tabaka içerisine fiziksel olarak yerleştirilmesi kovalent ve kovalent olmayan yöntemlerle gerçekleştirilir. Basitçe immobilizasyon, serbest haldeki enzimi elektrot yüzeyinde yarı geçirgen bir membran kullanarak tutmak suretiyle gerçekleştirilir. Elde edilen elektrot, çoğunlukla kötü kararlılık gösterir ve fazla miktarda enzime gereksinim duyar. İmmobilize enzimlerin serbest enzimlere üstünlükleri şöyle sıralanabilir; -Reaksiyon sonunda ortamdan kolayca uzaklaştırılabilir (süzme, santrifüjleme gibi ) ve ürünlerin enzim tarafından kirletilmesi gibi bir problem yaratmaz. - Çevre koşullarına (ph, sıcaklık vb.) karşı daha dayanıklıdır. - Birçok kez ve uzun süre kullanılabilir. - Sürekli işlemlere uygulanabilir. - Serbest enzime kıyasla daha kararlıdır. - Ürün oluşumu kontrol altında tutulabilir. - Birbirini izleyen çok adımlı reaksiyonlar için uygundur. - Bazı durumlarda, serbest enzimden daha yüksek bir aktivite gösterebilir. - Enzimin kendi kendini parçalaması olasılığı azalır. - Mekanistik çalışmalar için uygundur.

44 30 Çizelge 2.5 de enzim immobilizasyon yöntemleri şematik olarak gösterilmiştir. Çizelge 2.5. Enzim immobilizasyon yöntemleri Fiziksel veya kimyasal olarak immobilize edilen enzimler, daha iyi bir stabilite gösterir ve diğer maddelerle etkileşimi daha azdır. Tercih edilen immobilizasyon yöntemleri aşağıdaki gibidir; Taşıyıcıya Bağlama Yöntemleri Taşıyıcıya bağlamada bir protein olan enzim molekülünün yapısından yararlanılır. Molekül yüzeyindeki fonksiyonel gruplar, iyonik gruplar ve hidrofobik bölgeler bu bağlamada rol alırlar. Enzim immobilizasyonunda kullanılacak taşıyıcılar reaktif değil ise yardımcı bir reaktif ile aktivite edilmeleri gerekir. İmmobilizasyon işlemi, çok yumuşak koşullarda (oda sıcaklığı, nötral ph vb.) gerçekleştirilmelidir. Taşıyıcı suda çözünmemeli ama büyük ölçüde hidrofobik karakterli de olmamalı, suda ıslanabilmeli ve ayrıca mekanik kararlı olmalıdır. Bu tür taşıyıcıların seçiminde, enzim-taşıyıcı bağının aktivite için zorunlu gruplar üzerinden

45 31 olmaması yanında, taşıyıcının enzim tarafından parçalanmaması, mikroorganizma üremesine olanak vermemesi, ph ve çözücülere karşı dayanıklı olması gibi özellikler taşımasına dikkat edilir. Kovalent bağlama Enzimlerin reaktif taşıyıcılara kovalent bağlanması genelde sulu ortamda gerçekleştirilir. Reaktif taşıyıcıda ve enzimde bulunup enzimin bağlanmasını sağlayan fonksiyonel gruplar Çizelge 2.6 daki gibidir. Çizelge 2.6. Enzimin bağlanmasını sağlayan fonksiyonel gruplar Enzimin taşıyıcıya kovalent bağlanmasında dikkat edilecek önemli nokta, bağlanmanın enzim aktivitesi için zorunlu gruplar üzerinden olmaması ve bağlanma sırasındaki sterik engellemeler nedeni ile bu grupların rahatsız edilmemesidir. Taşıyıcıya kovalent bağlanma enzimin zincirindeki aminoasitlerin taşıdığı fonksiyonel gruplar üzerinden gerçekleşir. Şekil 2.9. Kovalent bağlama

46 32 Adsorpsiyon Enzim immobilizasyonunda kullanılan en eski ve en basit yöntemdir. Proteinler ve özellikle enzimlerin katı yüzeylerde adsorpsiyonu detaylı şekilde araştırılmıştır. Adsorpsiyonun asıl amacı enzim immobilizasyonu olmayıp, enzim saflaştırmaktı ancak suda çözünmeyen taşıyıcılarda adsorpsiyon yönteminin enzim immobilizasyonunda oldukça sık kullanıldığını görmekteyiz. Yöntem, yüzey aktif suda çözünmeyen bir adsorbanın enzim çözeltisi ile karıştırılması ve enzimin aşırısının iyice yıkanarak uzaklaştırılması temeline dayanır. Taşıyıcıya bağlanmada etkin olan Van der Walls kuvvetleridir. Adsorbanlar çok değişik türde olmakla birlikte iyi bir adsorpsiyon sağlayabilmek için genellikle adsorbanın bir ön işlemden geçirilmesi gerekir. Enzim immobilizasyonunda en sık kullanılan adsorbanlar; aktif karbon, gözenekli cam, diatome toprağı, CaCO 3, kül, silikajel, bentonit, hidroksiapatit, nişasta, gluten ve kalsiyum fosfattır. Bir enzimin suda çözünmeyen taşıyıcıda adsorpsiyonu ph, çözücü, iyon şiddeti, enzim-adsorban oranı ve sıcaklık gibi faktörlere bağımlıdır. Bu faktörlerin araştırılması, adsorpsiyon ve aktivitenin önemli ölçüde geri kazanılması için en iyi koşulların saptanması çok önemlidir. Adsorpsiyon mekanizması genellikle çok karışık olup, birçok olasılıktan hangisinin gerçekleşeceğinin önceden saptanması güçtür. Prensip olarak, bir proteinin aktif yüzeylerde adsorpsiyonu tersinir bir işlem olmalıdır. Ancak bazı durumlarda (örneğin; kolenitte adsorplanmış üreaz) tersinir olmayan adsorpsiyon söz konusu olabilmektedir. Eğer aktivite sabit kalıyor ve immobilize enzim sürekli işlemlerde kullanılabiliyorsa bu tür adsorpsiyon enzim immobilizasyonu için idealdir. Desorpsiyon, reaksiyon ürünlerinin kirlenmesine ve aktivitede sürekli bir değişmeye neden olur. Tersinir adsorpsiyonlar enzim immobilizasyonu için pek uygun değildir.

47 33 Bazı adsorbanlar bir enzimin farklı biçimlerini, aktif ya da inaktif biçimlerinden birini adsorbe ederken diğerini desorbe etmektedir. Eğer enzimin aktif şekli desorbe edilirse bazı durumlarda immobilize enzimin bağıl aktivitesi yüzde 100 den büyük değerler alır, tersi durumda bağıl aktivite sıfır olur yani immobilizasyon ürünü hiç aktivite göstermemektedir. Yöntemin yararları; enzimin immobilizasyon işleminin basit oluşu, değişik biçim ve yükteki taşıyıcıları seçme olanağı vermesi ve bir yandan immobilizasyonu gerçekleştirirken diğer yandan enzim saflaştırılmasına olanak sağlamasıdır. Yöntemin sakıncaları; her ne kadar immobilizasyon işlemi kolay olsada optimal koşulların saptanması çok güçtür. Eğer enzim ile taşıyıcı arasında kuvvetli bir bağlanma yok ise bu durumda desorpsiyon sonucu enzim serbest halde reaksiyon ortamına geçer ve ürünlerin kirlenmesine neden olur. Şekil Adsorpsiyon İyonik bağlama Bu yöntem, iyon değiştirme yeteneğine sahip suda çözünmeyen taşıyıcılara enzimin iyonik bağlanması temeline dayanır. Bazı durumlarda iyonik bağlama yanında fiziksel adsorpsiyon da etkili olmaktadır. İyonik bağlama çok yumuşak koşullarda gerçekleştiğinden, enzimin konformasyonunda ve aktif merkezinde değişikliğe neden olmaz. Ancak;

48 34 enzim ile taşıyıcı arasındaki bağ kovalent bağ kadar güçlü olmadığından enzim kaçısı söz konusudur. Şekil 2.11.İyonik bağlama Şelat bağlama Bazı transizyon metallerinin şelat yapma özellikleri sayesinde enzimlerin organik ve inorganik taşıyıcılara bağlanması mümkündür. Yöntem ilk kez 1971 yılında uygulanmaya başlamış daha sonra da kullanılmaya devam edilmiştir. Biyospesifik bağlama Enzimler ile antikorlar ve lektinler arasındaki biyospesifik etkileşimden yararlanılarak enzim immobilize edilebilir. Lektinler, kendine özgü karbonhidrat atıklarını içeren enzimlere kuvvetlice bağlanırlar. Örneğin bu yöntem ile immobilize edilen invertaz, sakkarozun kesiksiz inversiyonunda kullanılmıştır. Spesifik monoklonal antikorları suda çözünmeyen materyale bağlayarak hazırlanan taşıyıcılar enzim immobilizasyonunda başarılı biçimde kullanılmaktadır.

49 35 Çapraz Bağlama Yöntemleri Küçük moleküllü, bi veya multi fonksiyonel reaktifler enzim molekülleri arasında kovalent bağlar yaparak sonuçta suda çözünmeyen komplekslerin oluşmasını sağlarlar. Çapraz bağlanma derecesi ve immobilizasyon, protein ve reaktif derişimine, ph ya da immobilize edilecek enzime çok bağımlıdır. Moleküller arası bağlanmalar yanında, molekül içi bağlanmalar da söz konusudur. Bu yöntem ile enzim immobilizasyonu 4 farklı şekilde gerçeklesir: - Enzimin yalnız bifonksiyonel reaktif ile reaksiyonu - Enzimin ikinci bir protein varlığında bifonksiyonel reaktif ile reaksiyonu - Enzimin suda çözünen bir taşıyıcıda adsorpsiyonundan sonra bifonksiyonel reaktif ile reaksiyonu - Enzimin bifonksiyonel reaktif tarafından aktive edilmiş polimer taşıyıcı ile reaksiyonu En çok kullanılan çapraz bağlama reaktifleri; gluteraldehit, kloroformat ve karbonildiimidazol, heterosiklik halojenürler, bioksiranlar, divinilsülfonlar, pbenzokinon, transizyon metal iyonları ve epiklorhidrinlerdir. Çapraz bağlama reaksiyonu çok yumuşak koşullarda gerçekleşmediğinden bazı durumlarda önemli ölçüde aktivite kaybı söz konusudur. Enzimler bu şekilde birbirlerine bağlandıklarında jelatinimsi bir yapı oluştururlar, bu nedenle mekanik bakımdan çok kararsızlardır. Çok sayıda enzimin diğer enzimler için matriks olarak davranmasından dolayı bu yöntem iyi bir immobilizasyon yöntemi değildir.

50 36 Şekil 2.12.Çapraz bağlama Kopolimerizasyon yöntemleri Enzimler bir kopolimerizasyon reaksiyonunda monomerlerden biri gibi davranır ve polimer matrikse bağlanmış olur. Yöntem, polimer matrikse tutuklamaya benzemekle birlikte enzim kaçısının önlenmesi gibi üstünlüğü vardır. Tutuklama Yöntemleri Tutuklama yöntemi prensip olarak enzim molekülünü belirli bir ortamda durmaya zorlamaktır. Enzim bulunduğu çevreden dışarıya çıkamaz. Bu işlem, polimer matriks içindeki kafeslerde gerçekleştirilebileceği gibi yarı geçirgen membranlar içinde mikrokapsülleme ile de gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi kovalent bağlama ve çapraz bağlama ile immobilizasyondan ayıran en önemli özellik; enzim molekülünün fiziksel veya kimyasal olarak herhangi bir taşıyıcıya bağlanmış olmamasıdır. Polimer matrikste tutuklama Polimerizasyon ve çapraz bağlamanın oluştuğu ortamda enzimin de bulunduğu takdirde enzim, çapraz bağlama sonucu oluşan odacıklarda (kafes) tutuklanmaktadır. Bu amaçla en çok kullanılan polimer; N,N - metilenbisakrilamid ile çapraz bağlanmış poliakrilamiddir.

51 37 Yöntem, yüksek derece çapraz bağlı bir polimerin enzim çözeltisi içinde oluşturulması temeline dayanır. Polimerleşme sonucu enzim molekülleri çapraz bağ ağları arasında tutuklanmakta ve böylece ana çözeltiye geçmeleri engellenmektedir. Uygun çaplı substrat molekülleri polimer kafes içinde tutuklanmış enzim moleküllerine ulaşır ve reaksiyon ürünleri de dışarı çıkar. Bu yöntemde kullanılacak substratın küçük moleküllü olması gerekir. Bu tip immobilizasyon, ilk kez 1963 yılında tripsin, kimotripsin ve diğer enzimlerin immobilizasyonunda kullanılmıştır. Molekül kütlesi den fazla olan enzimlerin bu yöntem ile immobilizasyonları oldukça kolaydır. Bu tür immobilizasyon işleminde en çok kullanılan taşıyıcılar; hidrofilik temele dayalı poliakrilamid jeli ve jel oluşturan polisakkaritlerdir. Ayrıca silikon lastiği ve silikajel de kullanılmaktadır. Tutuklama yanında özellikle yüklü polimerlerde fiziksel adsorpsiyonun da etkin olduğu saptanmıştır. Polimer zincirleri arasındaki çapraz bağlama değişik bifonksiyonel veya multifonksiyonel reaktiflerle sağlanmaktadır. Örneğin, bu yöntemle enzim immobilizasyonunda en çok kullanılan taşıyıcı olan poliakrilamidin çapraşık bağlanması N,N -metilenbisakrilamid ile gerçekleştirilir. Çapraz bağlı taşıyıcıların hazırlanmasında, monomer ve çapraz bağlayıcı reaktiflerin mol oranları çok önemlidir. Bu durum bir yandan enzim moleküllerinin tutuklanacağı hücrelerin çapına etki ederken, diğer yandan taşıyıcının fiziksel özelliklerinde önemli değişmelere de neden olacaktır. Bu yöntem ile immobilize edilen enzimin asıl özelliklerinde bir değişme beklenmez. Fakat taşıyıcının tipi ve enzimatik reaksiyonlar bölgesel mikro çevre etkilerinin oluşmasına neden olurlar. Örneğin, taşıyıcının yüklü olması önemli bir etkendir. Taşıyıcının yüklü olması immobilize enzimin özelliklerinde serbest enzime kıyasla çok önemli değişmelere neden olmaktadır.

52 38 Bu yöntemin yararları; çok kolay uygulanması, gerçek bir fiziksel yöntem olması ve çok az miktarlarda enzim kullanılarak gerçekleştirilmesidir. Nötral, suda çözünmeyen taşıyıcılarla da immobilizasyon gerçekleştirilmekte ve kimyasal bir bağlanma olmadığından yüklü taşıyıcıya gerek duyulmamaktadır. Yöntemin sakıncaları ise; immobilizasyon işlemi sırasında inaktivasyonun deney koşullarına çok sıkı bağımlı oluşu ve immobilize enzimin ancak küçük moleküllü substratlara karşı iyi bir aktivite göstermesidir. Şekil Polimer matrikste tutuklama Mikrokapsülleme Bu yöntem enzim moleküllerinin yarı geçirgen bir membran içinde tutuklanmasından ibarettir. Mikrokapsüllerin büyüklüğü μm arasında değişir. Enzimler daha çok kimyasal mikrokapsülleme ile immobilize edilir. Bu yöntem ile enzim immobilizasyonu; sürekli ve sürekli olmayan yarı geçirgen membran mikrokapsüllerde tutuklama olmak üzere iki grupta incelenebilir. Sürekli mikrokapsüllerde çerçeve membran katı, süreksiz mikrokapsüllerde lipozomlar ise bir sıvı tabakadır. İmmobilizasyonda kullanılan çerçeve maddesinin (membran) yarı geçirgen olması zorunludur. Ayrıca bu yarı geçirgen membranın gözenek çapları; substrat moleküllerinin kapsül içine girişine ve ürün moleküllerinin dışarı çıkışına olanak verecek büyüklükte olmalıdır. Substrat molekülleri ne kadar küçük ise bu yöntem ile immobilize edilmiş enzimin verimliliği o ölçüde yüksek olacaktır [40].

53 39 Şekil Mikrokapsülleme 2.7. Enzim Sensörleri Enzim biyosensörleri hedef analit derişimi ile orantılı sinyal üreten analitik cihazlara verilen genel addır. Enzim biyosensörleri söz konusu sinyali üretirken enzim ve dönüştürücüleri birlikte kullanmaktadır. Bu sinyal reaksiyonu katalizleyen enzim tarafından proton derişimindeki değişim, oksijen veya amonyak gazı gibi gazların açığa çıkması ya da geri alınımı, ışık emisyonu, absorpsiyon veya yansıtıcısı emisyonu ve benzer olaylar ile oluşmaktadır. Dönüştürücü, bu sinyali akım, potansiyel, sıcaklık değişimi, elektrokimyasal ışık absorpsiyonu, termal veya optik ölçülebilir cevaplara dönüştürmektedir [38]. Biyosensör teknolojisindeki ilk örnekler özellikle amperometrik ve potansiyometrik temelli enzim elektrotları şeklinde ortaya çıkmışlardır. Bu durumun en önemli nedeni o tarihteki bilgi ve teknolojik birikimin söz konusu çalışmalar için yeterli düzeye ulaşmış olmasıdır. Biyosensör teknolojisinde kullanılan biyoaktif materyal sıralamasında enzimlerin yeri Şekil 2.15 de verilmiştir [38].

54 40 Şekil Biyosensör teknolojisinde kullanılan biyoaktif materyal sıralamasında enzimlerin yeri Biyosensör geliştirmek amacı ile oksidoredüktaz, hidrolaz ve liyaz grubuna ait çeşitli enzimler dönüştürücülerle birleştirilerek sağlık hizmetlerinde, ilaçlarda, gıda endüstrisinde, çevresel izlemelerde ve koruma gibi uygulama alanlarında kullanılmaktadır [38] Genel çalışma ilkesi Enzim sensörleri, biyobileşen olarak enzimin kullanıldığı iletici ve ölçme sisteminden oluşmaktadır. Diğer biyosensörlerde olduğu gibi enzim sensörlerinde de biyoaktif tabakanın iç ve dış yüzeylerinde zarlar, sinyali yükselticiler, mikro işlemciler, kaydedici veya bilgisayar sistemleri amaca yönelik olarak kullanılabilmektedir. Bir enzim sensörünün genel gösterimi Şekil 2.16 da verilmiştir [38].

55 41 Şekil Enzim sensörlerinin genel şematik gösterimi Bir enzim elektrodunda enzimi içeren biyoaktif tabaka, enzimin katalizlediği reaksiyona uygun bir iletim ve ölçüm sisteminin uzantısı olan bir iletici ile birleştirilmektedir. İletim sistemi biyoaktif tabakada gerçekleşen enzimatik reaksiyon sonucu oluşan ürünün miktarındaki artışı tespit edebilecek şekilde seçilmelidir. Biyoaktif tabakadaki ve biyoaktif tabaka iletici ara yüzeyindeki derişimlerin hızlı bir şekilde dengeye ulaşabilmesi için difüzyon engelini en aza indirmek amacıyla biyoaktif tabaka kalınlığının mümkün olduğunca ince olması gerekmektedir. Bunun yanı sıra biyoaktif tabakada sabit bir substrat derişimi sağlayabilmek için ölçme çözeltisinin yeterli bir sürede karıştırılması gerekmektedir. İletici sistemin ölçme sistemine gönderdiği sinyal biyoaktif tabaka ile iletici ara yüzeyindeki derişimlerdeki değişikliğe bağlıdır. Ancak söz konusu derişimler denge halinde ölçme çözeltisindeki derişimlerle orantılı olduğundan dolayı çoğunlukla kalibrasyon grafiği çizilerek sonuca varılmaktadır [38] Enzim sensörlerinin sınıflandırılması Enzimatik sensörlerin sınıflandırılması en yaygın olarak, enzimatik reaksiyon sonucu oluşan sinyalin belirlenme ilkesine göre yapılmaktadır (Çizelge 2.7) [38].

56 42 Çizelge 2.7. Enzim sensörlerinin sınıflandırılması 1. Elektrokimyasal Esaslı Enzim Sensörleri a. Amperometrik esaslı enzim sensörleri Birinci nesil amperometrik enzim elektrotları İkinci nesil amperometrik enzim elektrotları Üçüncü nesil amperometrik enzim elektrotları b. Potansiyometrik esaslı enzim sensörleri Proton duyar potansiyometrik enzim elektrotları Amonyum duyar potansiyometrik enzim elektrotları Karbondioksit duyar potansiyometrik enzim elektrotları Diğer iyon duyar potamsiyometrik enzim elektrotları c. Yarı iletkenleri esas alan enzim sensörler, Enzim alan etki transistörleri (ENFET) 2. Optik esaslı enzim sensörleri; Absorpsiyon esaslı optik enzim sensörleri Flouresans esaslı optik enzim sensörleri Biyoluminesans esaslı optik enzim sensörleri 3. Kalorimetrik esaslı enzim sensörleri 4. Piezoeleketrik esaslı enzim sensörleri Amperometrik enzim elektrotlar Amperometri sabit bir potansiyeldeki akım şiddetinin ölçümünü esas alır. Sinyal, elektrot yüzeyine kütle aktarım hızına bağlıdır. Elektroaktif bir ürünün salınıvermesi veya reaktifin biyokatalitik reaksiyona bağlı olarak tüketimi platin gibi inert bir çalışma elektrodunda doğrudan izlenebilir. İkinci elektrot referans elektrot olarak iş görür. Şekil 2.17 de amperometrik esaslı bir enzim sensörünün şeması verilmiştir.

57 43 Şekil Amperometrik esaslı bir enzim sensörünün şematik gösterimi İletici sistem olarak bir amperometrik sensörün kullanılması durumunda potansiyometrik sensörden en büyük fark, ürünlerden sinyal oluşturan türün elektrot yüzeyinde tüketilmesidir. Oksijen tüketimine ilişkin reaksiyonlar aşağıda verilmiştir: Katodik reaksiyon; O 2 + 2H 2 O + 2e - H 2 O 2 + 2OH - H 2 O 2 + 2e - 2OH - Anodik reaksiyon; Ag (k ) + Cl - AgCI (k) + e - Toplam reaksiyon; 4Ag ( k ) + O 2 + 2H 2 O + 4Cl - 4AgCl (k) + 4OH - Sinyal oluşturan türün sensör yüzeyinde tüketilmesi sebebiyle, iletici ile biyoaktif tabaka ara yüzeyindeki ürün derişiminin sıfır olduğu varsayılır. Bu

58 44 nedenlerden dolayı, amperometrik enzim sensörlerinde denge durumundaki reaksiyon hızı, enzim içeren biyoaktif tabakanın bir yarı geçirgen membranla çevrelenmiş olduğu koşulda, substratın söz konusu membrandan difüzyon hızına eşittir [29]. Bir elektrot tepkimesinin hızı; i) çözeltiden elektrot yüzeyine doğru akan kütle transfer (difüzyon) hızına ii) tepkimeye girecek olan maddenin bir kimyasal tepkime ile oluştuğu durumlarda çözelti tepkimesinin hızına iii) adsorplanan türler olması durumunda, yüzeye tutunma ve yüzeyden koparak çözeltiye geçme hızına iv) elektrot yüzeyindeki madde ile elektrot arasındaki yük aktarımı yani elektron aktarım hızına bağlıdır. Bu ise tepkimeye giren madde türüne, derişimine, elektrot malzemesinin türüne ve uygulanan gerilime bağlıdır Performans Faktörleri Hazırlanan biyosensörün hedeflenen amaçlar çerçevesinde kullanılabilir olup olmadığına ancak performans faktörlerinin ayrıntılı bir şekilde belirlenmesinden sonra karar verilebilir Seçicilik Biyosensörün kompleks bir matriks içerisinde tek başına analitik bir ölçüm cihazı olarak kullanılabilmesini sağlamaktadır. Seçiciliğin yeterli olmadığı durumlarda çalışma prosedürüne bu eksiği giderecek ek işlemler eklenmesi gerekmektedir. Seçiciliğin zayıf olmasından kaynaklanan sorunlar biyosensörün kullanımını zorlaştırmaktadır.

59 Kullanım ömrü Biyolojik çevirici olarak enzim kullanıldığı durumlarda enzim aktivitesindeki azalma kullanım ömrünü kısıtlayan en önemli faktördür. Enzimin yaşam süresi, biyosensörün raf ömrü yanı sıra kalibrasyon sıklığı, kararlılık, tekrarlanabilirlik gibi parametreleri de etkilemektedir Kalibrasyon gereksinmesi İdeal bir biyosensörün hiç kalibrasyona gerek duymaması veya en az kalibrasyona gerek duyması istenmektedir. Ancak teorikte planlanan bu özellik pratikte günümüzde gerçekleştirilememiştir. Biyosensörlerin raf ömürleri boyunca sıkça veya belirli aralıklarla kalibre edilerek duyarlılıklarından bir şey kaybedip kaybetmedikleri incelenmektedir Tekrarlanabilirlik İdeal bir biyosensör elektrodunun aynı derişimde veya aynı özelliklere sahip birden fazla örneğe daldırılmasıyla yapılan deneylerde aynı sonuçların okunması gerekmektedir. Tekrarlanabilirlik değeri ne kadar iyi olursa o biyosensör uygulaması da o kadar iyi olur Kararlılık Elektrot kararlılığının yüksek olduğu durumlar ideal biyosensörler için gereklidir. Kararlılık, kullanılan enzimin fiziksel dayanıklılığından etkilendiği gibi; ph, ısı, nem, ortam O 2 derişimi, enzimi immobilize etmek için kullanılan polimerin kimyasal ve fiziksel karakteri gibi parametrelerden de etkilenebilmektedir.

60 Yüksek duyarlılık Hazırlanan elektroda immobilize edilmiş olan enzim; yalnızca belirli maddelere (substratlara) karşı duyarlı olmalıdır. Duyarlılık, akım-derişim eğrisinin eğimi ile orantılıdır. Eğim değeri büyüdükçe duyarlılıkta da artış gözlenmektedir. Kullanılan enzimin substratları dışında biyosensörlerin girişim yapan maddelerden etkilenmemesi istenmektedir Yeterli düzeyde tayin sınırı Tasarlanan biyosensörün ideal tanımına uyması için tayin sınırının belirli bir derişim değerinin altında olması gerekmektedir. Belirtilen bu tayin sınırı elektrot yüzeyinin büyüklüğü, enzimin tayin edilecek maddeye karşı olan ilgisi, immobilize edilen enzim miktarı, enzim immobilizasyonunda kullanılan polimer tabakasının kalınlığı gibi faktörlerden etkilenmektedir Geniş ölçüm aralığı Ölçüm aralığı denen bölge, biyosensörden elde edilen akım-derişim eğrilerinin doğrusal olduğu derişim aralığıdır. Tüm biyosensör uygulamalarında çalışma ortamında belirli bir derişim değerine ulaşıldıktan sonra akım-derişim eğrilerinde doğrusallıktan sapma gözlenmeye başlamaktadır. Bu durum enzimatik eğrilerin en önemli ve karakteristik bir özelliğidir. Doğrusallıktan sapmanın nedeni yanıt olarak okunan akım değerlerindeki değişimin azalmasından kaynaklanmaktadır. Bunun nedeni ise ortamda artan analizlenecek madde miktarının fazlası ile reaksiyona girecek enzim olmamasıdır Hızlı cevap zamanı Amperometrik uygulamalarda analizlenecek bir madde örneğini çalışma ortamına eklemeden önce elektrot yüzeyinde oluşan akımın sabit kalması

61 47 istenmektedir. Akım sabit kaldıktan sonra analizlenecek madde ortama eklenir ve akımdaki değişim kaydedilir. İkinci bir eklemeden önce akım değerinin yine sabit kalması beklenmektedir. İşte ilk eklemeden sonra akımın tekrar sabit kalmasına kadar geçen zamana cevap zamanı denir. Cevap zamanının kısa ya da hızlı olması ideal biyosensörlerin özelliklerindendir Basitlik ve ucuzluk Kullanımı, tasarımı basit ve ucuz biyosensörler hazırlamak biyosensör yapımında her zaman hedeflenmiş bir düşüncedir. Biyosensör yapılarının basitleştirilmesine en iyi örnek ikinci kuşak biyosensörlerin yapılarında bulunan medyatörlerin daha gelişmiş modeller olan üçüncü kuşak biyosensörlerde ortadan kaldırılmasıdır [41] Kaynak Araştırması Muhammet ve arkadaşları, kolesterol tayini için yeni bir biyosensör geliştirmişlerdir. Bu amaçla sülfürik asit ortamında pirolün ve anilinin elektropolimerleşmesiyle platin/polianilin-polipirol elektrot hazırlamışlar ve kolesterol oksidazı hazırladıkları elektrot üzerine immobilize etmişlerdir. Kolesterol tayinini, enzim elektrodun yüzeyindeki enzimatik tepkime sonucu oluşan hidrojen peroksidin +0,70 V da yükseltgenmesine dayanarak yapmışlardır. Kolesterol biyosensörünün cevabına ph nın ve sıcaklığın etkisini incelemişlerdir. Biyosensörün kolesterol için doğrusal çalışma aralığını 1,8 x ,0 x 10-5 M olarak tespit etmişlerdir. İmmobilize enzimin optimum ph değeri 7,0 ve optimum sıcaklık değeri 60 o C bulunmuştur. İmmobilize enzimin K M değeri 3,3 mm ve V maks değeri 5,26 mm/dakika olarak hesaplanmıştır. Biyosensörün 30 ölçüm sonunda aktivitesini %82 oranında koruduğu gözlemlenmiştir ve 23 gün sonunda başlangıç amperometrik cevabının yaklaşık %40 sini kaybettiği görülmüştür. Hazırlanan biyosensörle biyolojik sıvıda (kan) kolesterol tayini yapmışlardır [42].

62 48 Fadime ve arkadaşları yapılan bu çalışmada, kolesterol tayini için yeni bir amperometrik biyosensör geliştirmişlerdir. Bu amaçla pirol elektropolimerleşirken polivinilsülfonat da elektrot yüzeyine taşınmıştır ve aynı zamanda enzim de yüzeye taşınarak hapsetme yöntemiyle immobilize edilmiştir ve platin/polipirol polivinilsülfonat-enzim elektrot hazırlanmıştır. Kolesterol tayini, hazırlanan enzim elektrodun yüzeyinde gerçekleşen enzimatik tepkime sonucu oluşan hidrojen peroksitin +0,40V da yükseltgenmesine dayanarak yapmışlardır. Biyosensörün kolesterol için doğrusal çalışma aralığı 4,0x10-5 2,0x10-4 M olarak tayin etmişlerdir. İmmobilize enzimin optimum ph değeri 7,25 ve optimum sıcaklık değeri 35 o C bulunmuştur. İmmobilize enzimin K M değeri 1,16 mm ve V maks değeri 1,78 mm/dakika olarak hesaplanmıştır. Biyosensörün 20 ölçüm sonunda aktivitesini %35 oranında koruduğu gözlemlenmiştir ve 78 gün sonunda başlangıç amperometrik cevabının yaklaşık %73 sini kaybettiği görülmüştür. Biyolojik ortamlarda olabilecek girişimlerin biyosensör cevabı üzerine etkileri araştırmışlardır. Hazırlanan biyosensörle biyolojik sıvıda (kan) kolesterol tayini yapmışlardır [43]. Singh ve arkadaşları amperometrik kolesterol biyosensörünün yapımında, elektrokimyasal tutuklama tekniğini kullanarak, kolesterol oksidaz ve kolesterol esteraz enzimlerini birlikte iletken polipirol film üzerine immobilize etmişlerdir. Elektrokimyasal polimerizasyonu 0,8 V da iki elektrotlu hücre kullanarak gerçekleştirmişlerdir. Amperometrik biyosensörün doğrusal çalışma aralığını, optimum ph değerini, çalışma potansiyelini, sıcaklık ve raf ömrünü kolesterol için deneysel olarak tayin etmişlerdir. Doğrusal çalışma aralığını 1-8 mm, raf ömrünü +4 C de 4 hafta, optimum ph yı 6,5-7,0, sıcaklığı 45 C ve çalışma potansiyelini 0,50 V olarak bulmuşlardır. Elektrodun hassasiyetini 0,15 μa/mm ve gözlenen K M değerini 9,8 mm olarak hesaplamışlardır. Polimer filmin iletkenliğini 3,0x10-3 S/cm olarak tayin etmişlerdir [1].

63 49 Katrlik ve arkadaşları yaptıkları çalışmada kolesterolün doğrudan tayini için girişim etkisi olmayan biyosensör tasarlamışlardır. Biyosensör sistemi düzlemsel altın elektroda modifiye edilmiş immobilize enzim peroksidaz, çözünmeyen medyatör, asetat selülöz tabakaları ve tampon çözelti içinde kolesterol oksidaz enziminden meydana gelir. Selüloz asetat tabakaları ve düşük potansiyel uygulamalı referans elektrot, askorbat, üre, laktat, glukoz, nitrit ve nitratın biyosensör cevabındaki girişimlerini engelleyerek, numuneye ön işlem uygulamaya gerek kalmadan direk kolesterol tayinine imkan sağlamıştır. Kolesterolü doğrusal çalışma aralığındaki derişimlerde (1,1-40 μmol/l) tampon çözelti içinde analiz etmişlerdir. Biyosensörün iletme sistemini (kolesterol oksidaz çözeltisi olmadan) μmol/l derişim aralığında tampon çözelti içinde hızlı hidrojen peroksit tayini için kullanmışlardır. Biyosensörün iletme sistemi iyi bir saklama süresi göstermiştir, 50 gün sonra biyosensörün başlangıç aktivitesinin %77 sini korumuştur [2]. Özer ve arkadaşları, serbest kolesterolün enzim elektrotla gerçekleştirilen amperometrik ölçümlerini, polivinilferrosenyum perklorat içinde kolesterol oksidaz immobilizasyonuyla gerçekleştirmişlerdir. Film platin elektrot üzerine kaplanmıştır. Amperometrik ölçümler 0,7 V da gerçekleştirilmiştir. Enzim elektrodun cevap akımına, polimer film kalınlığının, çalışma sıcaklığının, çözünmüş oksijen gazının, enzim konsantrasyonunun ve çözelti ph sının etkilerini incelemişlerdir. Enzim elektrot sisteminin gözlenen K M değerini ve aktivasyon enerjisini hesaplamışlardır. Biyosensörün doğrusal çalışma aralığını, hassasiyetini ve kararlılığını tayin etmişlerdir [44]. Solanki ve arkadaşları yaptıkları çalışmada kolesterol oksidazı polianilinpolipirol kopolimeri üzerine kovalent olarak immobilize etmişlerdir. Elektrokimyasal kaplama cam indiyum kalay oksit (ITO) tabakaları üzerinde yapılmış, çapraz bağlayıcı olarak glutaraldehit kullanılmıştır. Filmlerin özellikleri sırasıyla, UV-görünür bölge spektroskopisi, kızılötesi spektroskopisi, taramalı elektron mikroskobu, fotometrik ve amperometrik

64 50 teknikler kullanılarak bulunmuştur. Poli(An-ko-Py)/ChOx biyoelektrodu kullanarak kolesterolün doğrusal çalışma aralığını 1-10mM olarak bulmuşlardır. Poli(An-ko-Py)/ChOx biyoelektrot içinde kolesterol oksidaz aktivitesinin en yüksek olduğu ph değerini 7,0; sıcaklığı 25 C olarak bulmuşlardır. Poli(An-co-Py)/ChOx elektrodun hassasiyetini 93,35 μa/mm ve kararlılığını +4 C de 10 hafta olarak tayin etmişlerdir [5]. Singh ve arkadaşları kolesterol oksidaz ve kolesterol esterazı polianilin film üzerine kovalent olarak immobilize etmişlerdir. Enzim filminin özelliklerini, UV- görünür bölge spektroskopisi, kızılötesi spektroskopisi, taramalı elektron mikroskobu kullanarak bulmuşlardır. Filmlerin elektrokimyasal davranışları sırasıyla dönüşümlü voltametri (CV) ve amperometrik teknikler kullanılarak çalışılmıştır. Elektrodun cevap süresini 40 s, kolesterol oleat derişimi için doğrusal çalışma aralığını mg/dl, optimum sıcaklığını 46 C, optimum ph aralığını 6,5-7,5, hassasiyetini 7,5x10-4 μa/mm ve raf ömrünü 6 hafta olarak tayin etmişlerdir [45]. Çırpan ve arkadaşları kolesterol oksidazı elektropolimerizasyon yoluyla iletken kopolimerlere, tiyofen3-asetik asit kolesteril ester ile polipirole, immobilize etmişlerdir. Destek elektrot olarak p-toluen sülfonik asit kullanılmışlardırr. Enzim elektrodun kinetik parametrelerini (V maks, K M ) ve tekrarlanabilirliğini incelenmişlerdir. Filmlerin yüzey morfolojisini taramalı elektron mikroskobuyla incelemişlerdir [46]. Basu ve arkadaşları, gıda örneklerinde toplam kolesterol tayini için oksijen elektrot yüzeyine kolesterol esteraz (ChEt) ve kolesterol oksidaz (ChOx) enzimleri ko-immobilizasyon ile immobilize edilerek bir kolesterol biyosensör geliştirmişlerdir. Elektrot altın katot ve Ag/AgCI anottan oluşmaktadır. Enzimler, glutaraldehit ve sığır serum albumin (BSA) ile çapraz bağlama yöntemi ile immobilize edilmiştir. Sensörün optimum ph sı 6,0 ve optimum sıcaklığı 25 C olarak tayin edilmiştir. Tasarlanan sensör kolesterol palmitat için tayin sınırı 1-75 mg/dl ve doğrusal çalışma aralığı 2-50 mg/dl olarak

65 51 bulunmuştur. Kalibrasyon eğrisi farklı kolesterol palmitat konsantrasyonlarına (mg/dl) karşı Vi (ppm/dakika ) çizilerek belirlenmiştir. Yumurta, et gibi farklı gıda örneklerinde total kolesterol belirlemek için sensörün uygulaması çalışılmıştır. İmmobilize enzim elektrodun raf ömrü 9 haftada incelenmiştir [47]. Singh ve arkadaşları, kolesterol tayini için sol-jel filmleri üzerine kolesterol esteraz ve kolesterol oksidaz enzimlerinin immobilize edilmesiyle kolesterol biyosensörü tasarlamışlardır. Kolesterol oksidaz (ChOx) ve kolesterol esteraz (ChEt), tetraetilortosilikat (TEOS) sol-jel filmleri üzerine kovalent bağlama ile immobilize edilmiştir. Bu şekilde hazırlanan tetraetilortosilikat solgel/chet/chox enzim filmler, sırasıyla taramalı elektron mikroskobik (SEM), UV-görünür spektroskopik, kızılötesi (FTIR) spektroskopik ve amperometrik teknikleri kullanılarak karakterize edilmiştir. Tetraetilortosilikat solgel/chet/chox üzerinde yapılan fotometrik ölçüm sonuçları ile optimum sıcaklık 55 0 C, cevap süresi 180 s, raf ömrü 1 ay, tayin sınırı 12 mg dl -1, duyarlılık 5,4 x 10-5 Abs. mg -1 dl -1 olarak bulunmuştur [48]. Le Huy ve çalışma grubu amperometrik kolesterol biyoalgısı için polianilin film üzerine poli(stiren-ko-akrilik asid) manyetik mikroküreler ve kolesterol oksidaz enzimini kovalent olarak immobilize etmişlerdir. Çalışmada ilk olarak manyetik Fe 3 O 4 nanopartiküller sentezlemişler ve poli(stiren-ko-akrilik asid) (PSA) tarafından yüzeye karboksilatlanmıştır. Daha sonra taramalı elektron mikroskobu (SEM) analiz teknikleri ile karakterize edilmiştir. Çapraz bağlayıcı olarak glutaraldehit kullanılarak, Fe 3 O 4 /PSA mikro-küreler üzerine kolesterol oksidaz (ChOx) enziminin immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Platin/polianilin (PANİ) modifiye elektrot üzerine Fe 3 O 4 /PSA-ChOx başarılı bir şekilde sentez edilmiştir. PANI/Fe 3 O 4 /PSA-ChOx algılama özellikleri dönüşümlü voltametrik ve kronoamperometrik teknikleri kullanılarak çalışılmıştır. Optimize edilmiş deneysel koşullar altında biyosensör; geniş doğrusal çalışma aralığı 0,2-1,8 mm (R 2 =0,9901), düşük tayin sınırı (0,02 mm), kısa cevap süresi (5-10 s) ve yüksek hassasiyet (8796 µa.mm -1.cm -2 )

66 52 gibi mükemmel özellikleri göstermiştir. Biyosensör; glikoz, askorbik asit, ürik asit ve asetaminofen gibi seçilen organik bileşikler ile girişim testinde yüksek seçicilik göstermiştir [49]. Chauhan ve arkadaşları, serum kolesterol tayin etmek için kalem grafit çubuk üzerine kolesterol oksidaz enzimini immobilize ederek amperometrik bir biyosensör tasarlamışlardır. Optimum çalışma koşulları, ph 6,8, optimum sıcaklık 25 C olarak bulmuşlardır. 1,29x ,33x10-3 M aralığında değişen cevap akımı, kolesterol konsantrasyonu ile orantılı olarak ölçülmüştür. Cevap süresi 30 s ve tayin sınırı 0,09x10-3 M olarak bulunmuştur. Metabolitler tarafından hiçbir girişim etkisi gözlenmemiştir. Biyosensörün raf ömrü 25 gün boyunca 200 kez tekrar edilmiştir ve kullanılmadığı zaman içinde +4 C'de muhafaza edilmiştir [50]. Basniwal ve arkadaşları bir kolesterol biyoelektrot tasarlamak amacıyla indiyum kalay oksit kaplı cam plaka üzerine polianilin-p-toluen sülfonik asitgümüş (PANI-pTSA-Ag) nanokompozit film hazırlanması için kronoamperometri tekniğini kullanmışlardır. Biyoelektrot yüksek hassasiyet 36,3 µamg -1 dl -1, hızlı cevap süresi 10 s, tayin aralığı mg/dl olarak bulunmuştur. Biyoelektrot soğutulmuş koşullar altında 50 gün aynı aktiviteyi koruduğu tespit edilmiştir. Kan serum örneklerinde total kolesterol tayini için bu biyoelektrot kullanılmıştır [51]. Khan ve arkadaşları indiyum kalay oksit (İTO) üzerine TritonX-100 [4 -(1,1,3,3-tetrametilbütil) fenil polietilen glikol],non-iyonik bir yüzey aktif madde varlığında elektrokimyasal polimerizasyonla hazırlanmış polianilin (PANI) filmin üzerine glutaraldehit aracılığıyla kolesterol oksidaz (ChOx) enziminin kovalent bağlama yöntemi ile immobilize edilerek kolesterol biyosensörü tasarlamışlardır. Hazırlanan ChOx/PANITX-100/ITO biyoelektrot kızılötesi spektroskopisi (FTIR), dönüşümlü voltametri (CV) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) teknikleri kullanılarak karakterize edilmiştir. Amperometrik ve fotometrik teknikler kullanılarak ChOx/PANI-TX-100/ITO

67 53 biyoelektrot üzerine ölçümlerin sonucu tayin sınırı 5 mg dl -1, doğrusal çalışma aralığı mg dl -1 ve hassasiyeti 131 μa/(mg/dl cm 2 ) olarak bulunmuştur. Biyosensörüm optimum sıcaklığı 65 0 C, raf ömrü 20 hafta (+4 0 C) olarak bulunmuştur [52]. Pundir ve arkadaşları serum kolesterol tayini için kolesterol esteraz, kolesterol oksidaz ve peroksidaz enzim karışımlarını polivinil klorür (PVC) üzerine ko-immobilizasyonu gerçekleştirilerek enzim şeridi tasarlanmıştır. Hazırlanan enzim şeridin kinetik parametreleri; optimum ph 7,2 ve optimum sıcaklığı 45 o C, raf ömrü 4 ay, tekrarlanabilirliği 200 ölçüm olarak bulunmuştur [53]. Türkaslan ve arkadaşları amperometrik kolesterol biyosensör matrisi için uygun iletken polimeri belirlemişlerdir. İki iletken polimerler, poli (pirol) (PPy) ve poli (3,4-etilendioksitiyofen) (PEDOT) kolesterol biyosensörü matrisleri olarak kullanılmıştır. Her iki polimer yüzeyine kolesterol oksidaz (ChOx) enzimi immobilize edilmiştir. Enzim elektrotların amperometrik cevapları medyatör yokluğunda +0,70 V da H 2 O 2 nin oksidasyon akımı izleyerek ölçülmüştür. Her iki matris için kinetik parametreler; Km, Imax, raf ömrü, tekrarlanabilirlik, ph ve sıcaklık etkisi belirlenmiştir. Km değerleri sırasıyla PPy ve PEDOT enzim elektrotlar için 7,9 ve 1,3 mm olarak bulunmuştur. Sonuç olarak PEDOT enzim elektrodun subsrata karşı daha yüksek ilgi gösterdiği rapor edilmiştir [54]. Khan ve arkadaşları Triton X-100 (TX-100) ince film ile elektrokimyasalpolimerleştirilmiş polianilin (PANI) üzerine kolesterol oksidaz (ChOx) enzimi başarılı bir şekilde kovalent bağlama yöntemi ile immobilize edilerek kolesterol biyosensör tasarlanmıştır. PANI-TX-100 ince filmine kolesterol oksidaz (ChOx) immobilizasyonu sonucu yüzey morfolojisindeki değişim atomik kuvvet mikroskobu (AFM) analizi kullanılarak incelenmiştir. UVgörünür absorpsiyon spektrumları ve kızıl ötesi (FTIR) ile PANI-TX-100

68 54 matriksine kolesterol oksidaz (ChOx) enziminin immobilizasyon işlemininin gerçekleşmiş olduğu teyit edilmiştir [55]. Solanki ve arkadaşları kolesterol tayini için indiyum kalay oksit (ITO) cam plakalar üzerine poli (pirol-ko-n-metil pirol) katkılı p-toluen sülfonat üzerine kolesterol oksidaz (ChOx) elektrokimyasal olarak hapsedilerek kolesterol biyoelektrot tasarlanmıştır. Tasarlanan ChOx-kopolimer-PTS/ITO biyoelektrot dönüşümlü voltametri (CV), kızılötesi (FTIR) spektroskopisi, UV-görünür spektroskopisi, taramalı elektron mikroskobu (SEM) teknikleri kullanılarak karakterize edilmiştir. Kolesterol biyoelektrodun cevap süresi 19 s, doğrusal çalışma aralığı mg /dl, en iyi ph aralığı 6,5 ve 7,5 arasında, raf ömrü 4 C' de 6 hafta olarak bulunmuştur. Biyoelektrot askorbik asit, ürik asit ve glukoz gibi girişim yapan türlerin varlığında, neredeyse girişim etkisi gözlenmemiştir [56]. Kumar ve arkadaşları bir indiyum kalay oksit (ITO) elektrot üzerine (3 glisidoksipropil ) trimetoksisilan ( GPTMS ) nın biyo uyumlu tabaka üzerine kolesterol oksidaz ve kolesterol esteraz ( ChOx ve ChEt ) enzimlerinin kovalent bağlama yöntemiyle immobilize edilmesiyle elektrokimyasal kolesterol biyosensör tasarlanmıştır. ChOx / GPTMS / ITO bioelektrodu kızılötesi spektroskopi (FTIR), temas açısı ölçümleri (CA), atomik kuvvet mikroskobu (AFM), elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) ve dönüşümlü voltametri (CV) teknikleri kullanılarak karakterize edilmiştir. ChOx- ChEt/GPTMS/ITO biyo-algılayıcı elektrot için elektrokimyasal çalışmaların sonuçları, tayin aralığı 1,5-6,1 mm, hassasiyeti 0,351 µa (mg/dl) -1, raf ömrü 10 hafta ve tekrarlanabilirliği 10 ölçüm olarak bulunmuştur. Michaelis-Menten sabiti (K M ) değeri 0,43 mm gözlemlenmiştir. Ayrıca, Bu biyosensör serum örneklerinde, toplam kolesterol konsantrasyonunu tahmin etmek için de kullanılabileceği sonucuna varılmıştır [57]. Singh ve arkadaşları kolesterol tayini için p-toluen sülfonik asit (PTS) kullanılarak indiyum kalay oksit (ITO) elektrot üzerine polipirol (PPy) ve

69 55 karboksi fonksiyonalize çok katmanlı karbon nanotüp (MWCNT) elektropolimerizasyonu ile yeni bir biosensör tasarlanmıştır. Esterleşmiş kolesterol tahmini için N-hidroksi süksinimid ve N-etil-N-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid kullanarak PPY-MWCNT/ITO nanokompozit elektrot üzerine kolesterol oksidaz (ChOx) ve kolesterol esteraz (ChEt) enzimleri immobilize edilmiştir. ChEt-ChOx/PPY-MWCNT/PTS/ITO biyoelektrodu kızılötesi spektroskopi (FTIR) ve taramalı elektron mikroskobu teknikleri kullanılarak karakterize edilmiştir. ChEt-ChOx/PPY-MWCNT/PTS/ITO nanobiyoelektrot cevap süresi 9 s, doğrusal çalışma aralığı , M /l, K M değeri 0,02 mm, ve en iyi sıcaklık 45 C olarak tayin edilmiştir. Bu elektrot literatürdeki diğer total kolesterol elektrotlar ile karşılaştırıldığında gelişmiş biyoalgı özellikleri sergilediği ve kan serum örneklerinde kolesterol tayin etmek için kullanılabilir olduğu sonucuna varılmıştır [58]..

70 56 3. DENEYSEL KISIM 3.1. Cihazlar ve Malzemeler Elektrokimyasal analiz cihazı Amperometrik ölçme işlemlerinde BAS Epsilon-EC-Ver NT elektrokimyasal analiz cihazı kullanıldı Hücre ve elektrotlar Amperometrik ölçme işlemlerinde Şekil 3.1 de verilen üç elektrotlu ölçme sistemi kullanıldı. Referans elektrot olarak BAS RE-5B no lu Ag/AgCl, karşıt elektrot olarak MW-1032 no lu platin tel ve çalışma elektrodu olarak 0,5 cm² yüzey alanlı ve polipirol-polivinilsülfonat ile kaplanmış platin levha elektrotlar kullanıldı. Şekil 3.1. Kaplama ve ölçümde kullanılan hücre sistemi

71 ph metre Tampon çözeltilerinin ph larının ölçülmesinde ORION Model 720A phiyonmetre cihazı kullanıldı Su banyosu Isıtma, soğutma ve sabit sıcaklık çalışmaları için Grant W14 marka termostatlı dolaşımlı su banyosu kullanıldı Mikro pipet 5 µl 100 µl ve 100 µl µL çözelti ilaveleri için Brand marka ± 0,05 µl hassasiyeti olan mikro pipetler kullanıldı Argon gazı Çözeltide çözünmüş halde bulunan oksijeni uzaklaştırmak amacıyla Kargaz firmasından temin edilen yüksek saflıktaki ( % 99,999 ) argon gazı kullanıldı Saf su Çözeltinin hazırlanmasında kullanılan saf su; GFL marka saf su cihazından sağlandı SEM cihazı Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji bölümünde JEOL JSM-6060 LV markalı cihazda elektrotların yüzey fotoğrafları elde edildi.

72 AFM cihazı Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Fizik bölümünde Omicron AFM/STM kombine sistem markalı cihazda elektrotların yüzey fotoğrafları elde edildi Yüzey temas açısı analiz cihazı Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya bölümünde flaş kamera aksesuarlı Kruss DSA100 markalı cihazda elektrotların yüzey fotoğrafları elde edildi Profilometre cihazı (Film kalınlığının ölçülmesi) Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Fizik bölümünde Veeco dektak 150 markalı cihazda elektrotların yüzey kalınlığı belirlendi Kullanılan Reaktifler ve Özellikleri Çalışmada kullanılan kimyasal maddelerin adları, saflık dereceleri ve temin edildikleri firmalar Çizelge 3.1 de verilmiştir.

73 59 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan kimyasal maddelerin adları, saflık dereceleri ve temin edildikleri firmalar Kimyasal Madde Saflık Derecesi Temin Edildiği Firma Pirol % 98 δ=0,987 Aldrich Polivinilsülfonat %25 Aldrich Sodyum Perklorat % 98 Sigma-Aldrich Hidrojen Peroksit % 30 δ=1,13 kg/l Sigma-Aldrich Glutaraldehit (C 5 H 8 O 2 ) %25 d=0,78 Aldrich Borik asit (H 3 BO 3 ) % 99,5 Merck Ürik Asit % 99 Sigma Parasetamol (Asetaminofen) % 99,4 - L-(+)-Askorbik asit % 99 Carlo Erba Glukoz - Merck Sodyum Hidroksit (NaOH) % 99 Carlo Erba Hidroklorik asit (HCl) % 36,5 BDH Lityum Karbonat % 45 Merck Monosodyum hidrojen fosfat (NaH 2 PO 4 ) %99 Merck Disodyum hidrojen fosfat %99 Merck (Na 2 HPO 4 ) Kolesterol - Merck Kolesterol palmitat - Sigma Nonaetilen glikol - Sigma monododesil ether Triton-X Merck Propan 2-ol - Merck Kullanılan çözeltiler Hidrojen peroksit: % 35 lik δ=1,13 kg/l olan hidrojen peroksitten belli bir miktar alınarak derişimi 0,1 M olacak şekilde 25 ml stok çözelti hazırlandı. 25 er ml 1,0x10-3 M ve 1,0x10-5 M hidrojen peroksit çözeltileri de su ile seyreltilerek hazırlandı.

74 60 Fosfat tamponu: Monosodyum hidrojen fosfat ve disodyum hidrojen fosfattan sırasıyla 1,9096 ve 23,6030 gram tartılarak saf suda çözüldü, hazırlanan çözeltinin ph sı 1,0 M NaOH ve 1,0 M HCl ile 8,0 e ayarlandı ve çözeltideki analitik derişimi 0,1 M olacak şekilde seyreltildi. Farklı ph ve derişimlerdeki tampon çözeltileri hazırlamak için aynı yol izlendi. Tampon çözelti buzdolabında +4 C de muhafaza edildi. Kolesterol oksidaz enzim çözeltisi: Toplam aktivitesi 100 ünite olan kolesterol oksidaz enzimi alındı ve saf suda çözüldükten sonra hacim ölçülü balonda 5 ml ye tamamlandı (20 ünite/ml). Deney sırasında kullanılacak olan enzim çözeltisi buzdolabında bekletildi. Uzun süre kullanılmadığı durumlarda çözelti derin dondurucuda saklandı. Kolesterol esteraz enzim çözeltisi: Toplam aktivitesi 30,8U/mg olan kolesterol esteraz enzimi alındı ve saf suda çözüldükten sonra istenilen oranda hacim ölçülü balonda tamamlandı (30 ünite/ml). Deney sırasında kullanılacak olan enzim çözeltisi buzdolabında bekletildi. Uzun süre kullanılmadığı durumlarda çözelti derin dondurucuda saklandı. Kolesterol palmitat çözeltisi: Katı kolesterol palmitat belli bir miktar tartılarak nonaetilen glikol monododesil ether ilave edilerek renksiz ve berrak çözelti elde edilemeye kadar ısıtarak karıştırma işlemi gerçekleştirildi. Daha sonra derişimi 0,1 M ph sı 8,0 olan fosfat tamponu ile 1,0x10-3 M 10 ml kolesterol palmitat çözeltisi hazırlandı. Farklı ph ve derişimdeki kolesterol palmitat çözeltilerini hazırlamak için aynı yol izlendi. Hazırlanan kolesterol palmitat çözeltisi tazeliğini gün korudu. Bu süre içinde kolesterol palmitat çözeltisi buzdolabında muhafaza edildi. Askorbik asit çözeltisi: Katı askorbik asitten 0,0440 gram tartılarak derişimi 0,1 M ph sı 8,0 olan fosfat tamponunda 0,01 M 25 ml stok askorbik asit çözeltisi hazırlandı. Farklı derişimlerdeki askorbik asit çözeltileri belli hacimlerde alınarak fosfat tamponu ile seyreltilerek hazırlandı.

75 61 Ürik asit çözeltisi: Katı ürik asitten 0,0420 gram tartılarak 0,1 M Li 2 CO 3 çözeltisinde çözüldükten sonra 0,1M ph sı 8,0 olan fosfat tamponu eklenerek 1,0x10-2 M 25 ml stok ürik asit çözeltisi hazırlandı. Parasetamol çözeltisi (asetaminofen): Katı parasetamolden 0,0378 gram tartılarak, üzerine 0,1M ph sı 8 olan fosfat tamponu eklenip 1,0x10-2 M 25 ml stok parasetamol çözeltisi hazırlandı. Farklı derisimlerdeki parasetamol çözeltileri stok çözeltiden belli hacimlerde alınarak fosfat tamponuyla seyreltilerek hazırlandı. Glukoz çözeltisi: Katı glukozdan 0,0990 gram tartılarak üzerine 0,1M ph sı 8 olan fosfat tamponunda çözülerek 5,0x10-2 M 10 ml stok glukoz çözeltisi hazırlandı. Sodyum perklorat: Katı sodyum perklorattan belli bir miktar tartılıp saf suda çözülerek 1 M 100 ml stok NaClO 4 çözeltisi hazırlandı. Sodyum hidroksit çözeltisi: Katı sodyum hidroksitten belli bir miktar alınıp saf suda çözülerek 0,1 M 10 ml çözeltisi hazırlandı Platin Yüzeye Polivinilsülfonat ve Polipirol Kaplanması Elektrot yüzeyinin temizlenmesi: Kaplama işleminden önce platin levhanın yüzeyi mekanik, kimyasal ve elektrokimyasal olarak temizlendi. İlk başta platin yüzeyi sıfır numara zımpara ile parlatıldı, daha sonra aleve tutuldu. 5 dakika süre ile aseton, etil alkol, derişik HCl ve derişik nitrik asit içinde bekletildi. Tekrar saf suyla yıkandı, kurutuldu ve yüzeydeki su uzaklaştırıldı. Her kaplama işleminden önce yüzey bu şekilde temizlendi [71]. Temizlenmiş Pt levha elektrodunun yüzeyi polipirol-polivinilsülfonat film ile kaplandı. Polipirol, elektrot yüzeyine pirolün elektropolimerleşmesiyle biriktirildi. Elektropolimerleşmede üçlü elektrot sistemi kullanıldı. Çalışma

76 62 elektrodu olarak platin levha (0,5 cm²), karşıt elektrot olarak platin tel ve referans elektrot olarak ise Ag/AgCl elektrot kullanıldı. Polipirolpolivinilsülfonat film elde etmek amacıyla pirolün hücre içi derişimi 0,1 M olacak şekilde 71 µl pirol, 2,5 ml polivinilsülfonat (%25), 7,429 ml saf su eklenmesiyle toplam 10 ml lik bir çözelti hazırlandı. Bu çözeltiye temizlenmiş platin elektrot daldırıldı ve 10 dakika argon gazı geçirilerek çözeltideki oksijen gazı uzaklaştırıldı. Elektropolimerizasyon işlemi dönüşümlü voltametri tekniğiyle -1,0V +2,0V potansiyelleri arasında, 50 mv/s tarama hızında ve 4 dönüşümde [78] yapıldı. Kaplama işleminden sonra elektrot yüzeyi saf suyla yıkanarak kullanılmak üzere fosfat tamponu içinde bekletildi. Böylece platin/polipirol-polivinilsülfonat (Pt/PPy-PVS) elektrot hazırlandı [72]. Şekil 3.2. Pt/PPy-PVS film elektrodunun voltamogramı Pt/PPy-PVS film elektrodun SEM analizi Bölüm 3.3 de hazırlanan film elektrodun SEM analizi yapılması için değişik yüzey fotoğrafları çekildi ve çekilen yüzey fotoğrafları arasından en uygun olan görüntü seçildi (Şekil 4.7).

77 Pt/PPy-PVS film elektrodun AFM analizi Bölüm 3.3 de hazırlanan film elektrodun AFM analizi yapılması için değişik yüzey fotoğrafları çekildi ve çekilen yüzey fotoğrafları arasından en uygun olan görüntü seçildi (Şekil 4.9) Pt/PPy-PVS film elektrodun yüzey temas açısı analizi Bölüm 3.3 de hazırlanan film elektrodun yüzey temas açısı analizi yapılmak için değişik yüzey fotoğrafları çekildi ve çekilen yüzey fotoğrafları arasından en uygun olan görüntü seçildi (Şekil 4.11) Pt/PPy-PVS film elektrodun kalınlığının ölçülmesi (Profilometre) Bölüm 3.3 de hazırlanan film elektrodun kalınlığı profilometre cihazı ile ölçüldü (Şekil 4.13) Platin/Polipirol-Polivinilsülfonat Elektrodunun Hidrojen Peroksite Duyarlılığının Belirlenmesi Bölüm 3.3 de belirtildiği gibi hazırlanan Pt/Polipirol-polivinilsülfonat elektrot, Ag/AgCI referans elektrodu ve platin tel; 9 ml 0,1M fosfat tamponu ve 1 ml 1 M NaCIO 4 çözeltisinin içine daldırıldı. Çalışma elektrodu 0,40 V sabit potansiyelde dengeye getirildi [78] ve denge akımı kaydedildi. Denge akımına ulaşan elektrot ile hücre içi derişimi 0,1 µm ile 5,0x10-2 M arasında değişen hidrojen peroksit çözeltilerinden ilaveler yapıldı. Her ilave sonunda hücre içerisi 300 s karıştırılıp, karıştırmanın bitiminden itibaren 200 s sonrasındaki akım okundu [79]. Okunan akım değerleri ile denge akımı arasındaki farklar alınarak her bir derişim için i değerleri hesaplandı. Elde edilen Δi değerleri hidrojen peroksit derişimine karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.2).

78 Pt/PPy-PVS Film Elektrot ile Serbest Enzim Çalışması Bölüm 3.3 de belirtildiği gibi hazırlanan çalışma elektrodu 9 ml tampon çözeltisi 1 ml destek elektrolit (NaClO 4 ) bulunan çözeltiye daldırılarak 0,40 V sabit potansiyelde dengeye getirildi. Ardından 50 µl kolesterol esteraz ve 50 µl kolesterol oksidaz enzimlerinden ilave edilerek enzimli ortamda dengeye gelmesi beklendi ve denge akımı kaydedildi. Daha sonra hücre içi derişimi 0,1 µm 1 mm arası artan derişimlerde kolesterol palmitat ilaveleri yapıldı. Her ilave sonrasında reaksiyonun tamamlanabilmesi için 300 saniye karıştırıldı ve karıştırmanın bitiminden itibaren 200 saniye sonrasındaki akım okundu. Okunan akım değerleri ile denge akımı arasındaki farklar alınarak her bir derişim için i değerleri hesaplandı. Elde edilen Δi değerleri kolesterol palmitat derişimine karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.3) Biyosensörün Hazırlanması Çapraz bağlama yöntemi ile immobilizasyon Bölüm 3.3 de belirtildiği gibi hazırlanan Pt/PPy-PVS elektrodunun yüzeyi saf su ile yıkandıktan sonra, 30 µl glutaraldehit (GA), 1 mg BSA, 50 µl ph 7,0 fosfat tamponu ve 50 µl kolesterol esteraz (ChEt) ve 50 µl kolesterol oksidaz (ChOx) enzimlerini içeren çözeltiden elektrodun her iki yüzeyine de eşit miktarda ilave edilerek kuruyana kadar bekletildi. Kuruyan Pt/PPy-PVS- ChEt-ChOx biyosensörü saf su ile yıkanıp tampon çözeltide bir süre bekletildi. Tampon çözelti ve destek elektrolit ihtiva eden hücre sisteminde dengeye getirildi. Dengeye gelen sisteme artan kolesterol palmitat konsantrasyonların da ilaveler yapıldı ve okunan akım değerleri ile denge akımı arasındaki farklar alınarak her bir derişim için Δi değerleri hesaplandı. Elde edilen Δi değerleri kolesterol palmitat derişimine karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.4). Çapraz bağlama yöntemiyle hazırlanan biyosensörün tekrarlanabilirliği incelenerek grafiğe geçirildi (Şekil 4.6).

79 Tutuklama yöntemi ile immobilizasyon İmmobilizasyon işlmeminden önce platin levhanın yüzeyi mekanik, kimyasal ve elektrokimyasal olarak temizlendi. İlk başta platin yüzeyi sıfır numara zımpara ile parlatıldı, daha sonra aleve tutuldu. 5 dakika süre ile aseton, etil alkol, derişik HCl ve derişik nitrik asit içinde bekletildi. Tekrar saf suyla yıkandı, kurutuldu ve yüzeydeki su uzaklaştırıldı. Platin levha için temizleme işlemi bu şekilde tamamlandı. Daha sonra hücre içerisine 6,429 ml su, 71 µl pirol, 2,5 ml polivinilsülfonat, 0,5 ml kolesterol esteraz (ChEt) ve 0,5 ml kolesterol oksidaz (ChOx) ilave edilerek 10 ml lik bir hücre hazırlandı. Hücreden 10 dakika argon gazı geçirilerek oksijen gazı uzaklaştırıldı. Daha sonra dönüşümlü voltametri tekniği kullanılarak -1,0V +2,0V arasında 50 mv/s tarama hızında 4 dönüşümde pirolün polivinilsülfonatlı ortamda platin elektrot yüzeyinde elektropolimerleşmesi sırasında kolesterol esteraz/ kolesterol oksidaz enziminlerinin yüzeye taşınması sağlandı. Elde edilen Platin/polipirol-polivinilsülfonat-kolesterol esteraz-kolesterol oksidaz (Pt/PPy- PVS-ChEt-ChOx) biyosensörün yüzeyi bol saf su ile yıkandı. Tutuklama yöntemi ile hazırlanan biyosensörün kolesterol palmitata duyarlılığı incelenerek grafiğe geçirildi (Şekil 4.4). Biyosensör kullanılmadığı zamanlarda buzdolabında +4 o C de fosfat tamponunda bekletildi Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün SEM analizi Bölüm deki gibi hazırlanan biyosensorün SEM analizi yapılmak için değişik yüzey fotoğrafları çekildi ve çekilen yüzey fotoğrafları arasından en uygun olan görüntü seçildi. Pt/PPy-PVS film elektrot ile Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün SEM fotoğrafları karşılaştırıldı (Şekil 4.8) Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün AFM analizi Bölüm deki gibi hazırlanan biyosensorün AFM analizi yapılmak için değişik yüzey fotoğrafları çekildi ve çekilen yüzey fotoğrafları arasından en

80 66 uygun olan görüntü seçildi. Pt/PPy-PVS film elektrot ile Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün AFM fotoğrafları karşılaştırıldı (Şekil 4.10) Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün yüzey temas açısı analizi Bölüm deki gibi hazırlanan biyosensörun yüzey temas açısı analizi yapılmak için değişik yüzey fotoğrafları çekildi ve çekilen yüzey fotoğrafları arasından en uygun olan görüntü seçildi. Pt/PPy-PVS film elektrot ile Pt/PPy- PVS-ChEt-ChOx biyosensörün yüzey temas açısı fotoğrafları karşılaştırıldı (Şekil 4.12) Pt/PPy-PVS-ChEt- ChOx biyosensörünün film yüzey kalınlığının ölçülmesi (Profilometre) Bölüm deki gibi hazırlanan biyosensörün yüzey kalınlığı profilometre cihazı ile ölçüldü. Pt/PPy-PVS film elektrot ile Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörünün spektrumları karşılatırıldı ve film kalınlıkları hesaplandı (Şekil 4.14) Biyosensörün Kolesterol Duyarlılığının Belirlenmesi Bölüm deki gibi hazırlanan biyosensörün kolesterol palmitata duyarlılığının belirlenmesi için üçlü elektrot sistemi kullanıldı. Üçlü elektrot sisteminde çalışma elektrodu olarak hazırlanan biyosensör, referans elektrot olarak Ag/AgCl elektrot, karşıt elektrot olarak ise platin tel kullanıldı. Elektrokimyasal hücreye ph sı 8 olan fosfat tamponundan 9 ml ve 1 M lık sodyum perklorat çözeltisinden 1 ml konuldu. 0,40 V sabit potansiyelde biyosensör dengeye getirildi ve denge akımı kaydedildi. Daha sonra artan derişimlerde kolesterol palmitat ilaveleri yapıldı. Her ilavede çözelti 300 saniye karıştırıldı ve 200 saniye sonrasındaki akımlar okundu. Okunan akım değerleri ile denge akımı arasındaki farklar alınarak her bir derişim için i

81 67 değerleri hesaplandı. Elde edilen i değerleri Bölüm de elde edilen i değerleriyle birlikte grafiğe geçirilerek karşılaştırıldı (Şekil 4.4 ) Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx Biyosensörünün En İyi Çalışma Koşullarını Belirlenmesi Biyosensörün en iyi çalışma koşullarının belirlenmesi için ph nın etkisi, sıcaklığın etkisi, substrat derişiminin etkisi, biyosensörün tekrar kullanılabilirliği ve raf ömrünün belirlenmesi çalışıldı ph nın etkisi Bölüm de anlatıldığı gibi hazırlanan ve kararlı hale getirilen biyosensörün amperometrik cevap akımı üzerine ph nın etkisini incelemek için ph sı 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 ve 9,0 olan 0,1 M fosfat tamponları hazırlandı. Hücre içerisine ph değeri 6,0 olan fosfat tampon çözeltisinden 9 ml ve sodyum perklorat çözeltisinden 1 ml konuldu. Elektrot bu çözeltide 0,40 V da dengeye getirildi ve denge akımı kaydedildi. Sonra ph değeri 6,0 olan fosfat tampon çözeltisiyle hazırlanan kolesterol palmitat çözeltisinden hücredeki kolesterol palmitat derişimi 5,0x10-5 M olacak şekilde hücreye ilave edildi. Kolesterol palmitat ilavesinden sonra hücre ortamı 300 s karıştırıldı, 200 s sonundaki akım kaydedildi ve denge akımıyla farkı alınarak ph 6,0 için i değeri hesaplandı. Aynı işlemler ph değeri 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 ve 9,0 olan fosfat tamponları için de tekrarlandı. Okunan akım değerleri ile denge akımı arasındaki farklar alınarak her bir ph ortamı için i değerleri hesaplandı. Elde edilen Δi değerleri ph ya karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.15) Sıcaklığın etkisi Bölüm de anlatıldığı gibi hazırlanan ve dengeye getirilen biyosensörün amperometrik cevap akımı üzerine sıcaklığın etkisini incelemek amacı ile 20 o C, 25 o C, 30 o C, 35 o C, 40 o C, 45 o C, 50 o C, 55 o C, 60 o C, 65 o C ve 70 o C

82 68 sıcaklığındaki ortamlarda biyosensörün amperometrik cevap akımları ölçüldü. Hücre içine ph sı 8,0 olan 0,1 M 9 ml tampon çözeltisi ve 1 ml 1 M sodyum perklorat çözeltisi konuldu ve biyosensör hücreye daldırıldı. Su banyosu kullanılarak hücre içindeki çözeltinin sıcaklığı 20 o C olacak şekilde ayarlandı. 0,40 V sabit potansiyelde dengeye getirildi ve denge akımı kaydedildi. Sonra hücre içi derişimi 5,0x10-5 M olacak şekilde kolesterol palmitat ilavesi yapıldı. İlave sonrasında 300 s karıştırılıp 200 s sonundaki akım okundu. Aynı işlemler diğer sıcaklık değerlerinde de yapılarak okunan akım değerleri kaydedildi. Okunan akım değerleri ile denge akımı arasındaki farklar alınarak her bir sıcaklık için i değerleri hesaplandı. Elde edilen i değerleri sıcaklığa karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.16) Substrat derişiminin etkisi Bölüm deki gibi hazırlanan biyosensör; içerisinde, ph sı 8,0 olan 0,1 M 9 ml 0,1 M fosfat tamponu ve 1 ml 1,0 M sodyum perklorat bulunan çözeltiye daldırıldı. 0,40 V sabit potansiyelde dengeye getirilerek denge akımı kaydedildi. Daha sonra 0,1µM 1 mm hücre içi derişim aralığında kolesterol palmitat ilaveleri yapıldı. Her ilavede çözelti 300 saniye karıştırılıp, 200 saniye sonundaki akım okundu ve denge akımı ile arasındaki farklar alınarak her bir kolesterol palmitat derişimi için Δi değerleri belirlendi. Kolesterol palmitat derişimlerine karşı Δi grafiği çizildi (Michaelis-Menten eğrisi) (Şekil 4.17). Çizilen bu grafikten yararlanılarak biyosensörün çalışma aralığı belirlendi. Ayrıca elde edilen verilerden Lineweaver-burk grafiği çizildi ve bu grafikten yararlanarak kolesterol esteraz/kolesterol oksidaz enzimine özgü K M(gözlenen) ve V maks(gözlenen) değerleri belirlendi (Şekil 4.18) Biyosensörün tekrar kullanılabilirliğinin belirlenmesi Bölüm de anlatıldığı gibi hazırlanan biyosensörün en iyi çalışma koşulları altında tekrar kullanılabilirliğini ölçmek amacıyla hücre içi 5,0x10-5 M derişiminde kolesterol palmitat çözeltisi ile arka arkaya ölçümler yapıldı. Her

83 69 ölçüm için denge akımı ile okunan akım arasındaki farktan Δi değeri belirlendi. Ölçüm sayısına karşı Δi değerleri grafiğe geçirildi (Şekil 4.20) Biyosensörün raf ömrünün belirlenmesi Bölüm de anlatıldığı gibi hazırlanan biyosensörün raf ömrünü belirlemek için 60 gün boyunca değişik zaman aralıklarında toplamda 16 ölçüm olacak şekilde 5,0x10-5 M sabit kolesterol palmitat derişiminde biyosensörün amperometrik cevap akımı ölçüldü. Ölçüm işlemi tamamlanan biyosensör, bir sonraki ölçüm işlemine kadar tampon çözelti içerisinde +4 o C de buzdolabında bekletildi. Her ölçüm sırasında denge akımı ile okunan akım değeri arasındaki farklar alınarak i değerleri hesaplandı. Elde edilen i değerleri saklama süresine karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.21) Biyosensör Üzerine Girişim Yapan Maddeler Bölüm ye göre hazırlanan ve dengeye getirilen biyosensörün en iyi çalışma koşullarında 1,0x10-5 M kolesterol palmitat derişiminde elde edilen amperometrik cevap akımı üzerine biyolojik sıvılarda var olan ve girişim etkisi yapabilecek maddelerden askorbik asit, parasetamol (asetaminofen), ürik asit ve glukozun girişim etkileri incelendi. Bu çalışmada girişim yapan türlerin derişimleri kanda bulunan derişimleri ile aynı olacak şekilde alındı. Askorbik asidin girişim etkisinin incelenmesi Bölüm ye göre hazırlanan Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörü, içerisinde 9 ml ph sı 8,0 olan 0,1 M fosfat tamponu ve 1 ml 1,0 M NaClO 4 bulunan toplam 10 ml lik hücrede 0,40 V elektrot potansiyelinde dengeye getirilerek denge akımı kaydedildi. Hücre içi derişimi 1,0x10-5 M olacak şekilde kolesterol palmitat ilavesi yapıldı. Çözelti 300 s karıştırılıp 200 s sonundaki akım okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak kolesterol palmitat neden olduğu cevap akımı kaydedildi. Aynı çözelti üzerine hücre içi

84 70 derişimi 1,0x10-4 M olacak şekilde askorbik asit eklendi. 300 s karıştırılıp 200 s sonundaki akım okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak kolesterol palmitat ve askorbik asitin neden olduğu toplam cevap akımı kaydedildi. Bu toplam akımdan 1,0x10-5 M kolesterol palmitattan kaynaklanan cevap akımı çıkarılarak 1,0x10-4 M askorbik asidin cevap akımı bulundu. Bulunan bu akım toplam cevap akımına oranlanarak 1,0x10-4 M askorbik asidin yüzde girişimi hesaplandı (Çizelge 4.1). Parasetamol (Asetaminofen) ün girişim etkisinin incelenmesi Bölüm ye göre hazırlanan Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörü, içerisinde 9 ml 0,1 M fosfat tamponu ve 1 ml 1,0 M NaClO 4 bulunan toplam 10 ml lik hücrede 0,40 V elektrot potansiyelinde dengeye getirilerek denge akımı kaydedildi. Hücre içi derişimi 1,0x10-5 M olacak şekilde kolesterol palmitat ilavesi yapıldı. Çözelti 300 s karıştırılıp 200 s sonundaki akım okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak kolesterol palmitatın neden olduğu cevap akımı kaydedildi. Aynı çözelti üzerine hücre içi derişimi 1,0x10-4 M olacak şekilde parasetamol eklendi. 300 s karıştırılıp 200 s sonundaki akım okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak kolesterol palmitat ve parasetamolün neden olduğu toplam cevap akımı kaydedildi. Bu toplam akımdan 1,0x10-5 M kolesterol palmitatın neden olduğu cevap akımı çıkarılarak 1,0x10-4 M parasetamolün sebep olduğu cevap akımı bulundu. Bulunan bu akım toplam cevap akımına oranlanarak 1,0x10-4 M parasetamolün yüzde girişimi hesaplandı (Çizelge 4.1). Glukozun girişim etkisinin incelenmesi Bölüm ye göre hazırlanan Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörü, içerisinde 9 ml 0,1 M fosfat tamponu ve 1 ml 1,0 M NaClO 4 bulunan toplam 10 ml lik hücrede 0,40 V elektrot potansiyelinde dengeye getirilerek denge akımı kaydedildi. Hücre içi derişimi 1,0x10-5 M olacak şekilde kolesterol palmitat ilavesi yapıldı. Çözelti 300 s karıştırılıp 200 s sonundaki akım

85 71 okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak kolesterol palmitatın neden olduğu cevap akımı kaydedildi. Aynı çözelti üzerine hücre içi derişimi 5,0x10-3 M olacak şekilde glukoz eklendi. 300 s karıştırılıp 200 s sonundaki akım okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak kolesterol palmitat ve glukozun neden olduğu toplam cevap akımı kaydedildi. Bu toplam akımdan 1,0x10-5 M kolesterol palmitatın sebep olduğu cevap akımı çıkarılarak 5,0x10-3 M glukozun sebep olduğu cevap akımı bulundu. Bulunan bu akım toplam cevap akımına oranlanarak 5,0x10-3 M glukozun yüzde girişimi hesaplandı (Çizelge 4.1). Ürik asidin girişim etkisinin incelenmesi Bölüm ye göre hazırlanan Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörü, içerisinde 9 ml 0,1 M fosfat tamponu ve 1 ml 1 M NaCIO 4 bulunan, toplam 10 ml lik hücrede, 0,40 V elektrot potansiyelinde dengeye getirilerek denge akımı kaydedildi. Daha sonra hücreye derişimi 1,0x10-5 M olacak şekilde kolesterol palmitat ilavesi yapıldı. Çözelti 300 saniye karıştırılıp, 200 saniye sonundaki akım okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak; 1,0x10-4 M kolesterol palmitatın sebep olduğu cevap akımı kaydedildi. Aynı çözelti üzerine hücre içi derişimi 3,0x10-4 M olacak şekilde ürik asit ilavesi yapıldı. Çözelti 300 saniye karıştırılıp, 200 saniye sonundaki akım okundu ve denge akımı ile arasındaki fark alınarak; kolesterol palmitatın ve ürik asidin sebep olduğu toplam cevap akımı kaydedildi. Bu akımdan 1,0x10-5 M kolesterol palmitatın sebep olduğu cevap akımı çıkarılarak 3,0x10-4 M ürik asidin sebep olduğu cevap akımı bulundu. Bulunan bu akım toplam cevap akımına oranlanarak 3,0x10-4 M ürik asidin yüzde girişimi hesaplandı (Çizelge 4.1).

86 Biyolojik Sıvıda (Kanda) Kolesterol Tayini Biyolojik sıvıdaki kolesterol tayini için 5 kişiden kan örneği alındı. Örnek alma işlemleri sağlıklı bireylerden yapıldı. Bu örnekler steril kaplara alındı ve analiz yapılıncaya kadar buzdolabında muhafaza edildi. Kan serumunda kolesterol tayini için seyreltme işlemleri yapıldı. Seyreltme işlemi sayesinde kan serumundaki kolesterol derişimi biyosensörün doğrusal çalışma aralığına getirilmesi ve girişim yapan maddelerin biyosensörün tayin sınırının altındaki bir derişime indirilmesi sağlandı. Bölüm deki gibi hazırlanan ve dengeye getirilen biyosensör, kandaki total kolesterol miktarınının belirlenmesi amacıyla elektrokimyasal hücreye ph sı 8,0 olan 9 ml 0,1 M fosfat tamponu çözeltisi ve 1 ml 1,0 M sodyum perklorat çözeltisi konuldu. 0,40 V elektrot potansiyelinde dengeye getirilerek denge akımı kaydedildi. Serumlardan belli hacimler alındı ve 100 defa seyreltme işlemi olacak şekilde biyosensörün bulunduğu hücreye eklendi. Sonra 0,40 V sabit potansiyel uygulanıp hücreden geçen akım kaydedildi. Daha sonra derişimi bilinen kolesterol palmitat çözeltilerinden ilave edilerek okunan akım değerleri kaydedildi. Her bir denge akımı ile okunan akım arasındaki farktan i değeri belirlendi. Aynı işlemler alınan beş kan numunesi için de gerçekleştirildi. Standart ekleme yöntemiyle kolesterol palmitat derişimleri belirlendi (Çizelge 4.2).

87 73 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA Bu çalışmada platin yüzey üzerine iletken bir polimer olan polipirol ve polivinilsülfonat kaplandı. Hazırlanan bu film üzerine pirol ve polivinilsülfonat elektropolimerleşme yöntemiyle elektrot yüzeyinde biriktirilirken kolesterol esteraz ve kolesterol oksidaz enzimleri polimer içerisine tutuklama yöntemi ile immobilize edildi. Hazırlanan biyosensörün analitik ve biyokimyasal özellikleri incelendi. Film elektrot ve biyosensör yüzeyinin morfolojik yapısı SEM, AFM, yüzey temas açısı ölçümü ve profilometre spektrumu (film kalınlığı ölçümü ) gibi yöntemlerle karakterize edildi. Biyosensör üzerine ph, sıcaklık, substrat derişimi, girişim etkisi incelendi. Ayrıca biyosensörün tekrarlanabilirliği ve raf ömrü belirlendi. Enzimatik reaksiyonların bir kısmında reaksiyon ürünü olarak H 2 O 2 açığa çıkar. Hazırlanan biyosensörlerin çoğu, uygulanan sabit potansiyelde çalışma elektrodunun yüzeyinde enzimatik reaksiyon sonunda oluşan H 2 O 2 in yükseltgenmesi esasına dayanmaktadır [59-61]. H 2 O 2 aşağıdaki reaksiyona göre oluşmaktadır: Kolesterol esterleri + H 2 O Kolesterol Esteraz Kolesterol + Yağ asidi Kolesterol + O 2 Kolesterol Oksidaz Kolest-4-en-3-on + H 2 O 2 Oluşan bu hidrojen peroksit platin elektrot yüzeyinde sabit bir potansiyelde aşağıdaki reaksiyona göre yükseltgenmektedir [59]: H 2 O 2 O 2 + 2H + + 2e - Yükseltgenmenin meydana geleceği bir potansiyelde çalışıldığında devreden geçen anodik akım oluşan hidrojen peroksitin derişimi, dolayısıyla kolesterol derişimi ile orantılıdır. Bu çalışmanın prensibi de yukarıdaki prensiple aynı olmakla beraber daha önce bu film ile kolesterol esteraz/kolesterol oksidaz

88 74 enzimlerinin birlikte ilgili bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu yüzden yapılan bu çalışma orjinal bir çalışmadır. Bu çalışmada Platin/Polipirol-polivinilsülfonat-kolesterol esteraz- kolesterol oksidaz (Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx) biyosensörü ile enzimatik reaksiyon sonucunda oluşan hidrojen peroksidin dolayısıyla kolesterol ölçülmesinde çözeltide ve elektrot yüzeyinde gerçekleşen olaylar şematik olarak aşağıdaki şekilde gösterilmektedir: Şekil 4.1. Elektrot yüzeyinde gerçekleşen elektron aktarımı Bu çalışmada ise polipirol-polivinilsülfonat film elektrotla kolesterol esteraz / kolesterol oksidaz enzimlerinin immobilize şekline ait analitik ve biyokimyasal özellikler incelenmiş olup bunlarla ilgili sonuçlar ve yorumları aşağıda verilmiştir Pt/PPy-PVS Film Elektrodunun Hidrojen Peroksite Duyarlılığının Belirlenmesi Kolesterolün, kolesterol oksidaz aracılığıyla kolest-4-en-3-on dönüşümü sırasında reaksiyon ürünü olarak hidrojen peroksit açığa çıkar. Bu yüzden hazırlanan biyosensörün temeli de reaksiyon sonucunda açığa çıkan hidrojen peroksitin elektrot yüzeyinde yükseltgenmesi esasına dayanır. Bu nedenle

89 i (µa) 75 Bölüm 3.3 de belirtildiği gibi hazırlanan Pt/PPy-PVS elektrodun H 2 O 2 ye duyarlılığı incelendi. Artan H 2 O 2 derişimine karşı elde edilen i değerleri grafiğe geçirildi. Elde edilen veriler sonucu elektrodun hidrojen peroksite karşı duyarlı olduğu görüldü. Grafik incelendiğinde elde edilen eğrinin doğrusallığının (R 2 =0,999) çok yüksek olduğu görüldü (Şekil 4.2) R² = 0, ,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 H 2 O 2 Derişimi, mm Şekil 4.2. Pt/PPy-PVS elektrodun H 2 O 2 ye duyarlılığı 4.2. Pt/PPy-PVS Film Elektrodun Serbest Enzimli Ortamda Kolesterol Palmitata Duyarlılığının İncelenmesi Bölüm 3.5 de bahsedildiği şekilde hazırlanan hücrede serbest enzimin substratı olan kolesterol palmitat ile reaksiyonu sonucu açığa çıkan H 2 O 2 nin elektrot yüzeyine difüzlenerek yükseltgenmesi sonucu oluşan anodik akımın kolesterol palmitat derişiminin artmasıyla arttığı görüldü. Elde edilen i değerleri grafiğe geçirildi (Şekil 4.3).

90 i (µa) 76 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 R² = 0,991 0,00 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 Kolesterol palmitat derişimi, mm Şekil 4.3. Pt/PPy-PVS film elektrodun serbest enzimli ortamda kolesterol palmitata duyarlılığı Grafikte de görüldüğü gibi kolesterol palmitat derişiminin artışına paralel olarak akımlarda da bir artış gözlenmiştir. Bu sonuç, kolesterol palmitatın enzimatik reaksiyon sonucu oluşturduğu ürün olan H 2 O 2 nin elektrokimyasal olarak tespit edilebileceğinin bir göstergesidir Çapraz Bağlama ve Tutuklama Yöntemi ile İmmobilizasyon Bu çalışmada kolesterol esteraz/kolesterol oksidaz enzimleri için uygun immobilizasyon tekniğinin seçilmesi hedeflendi. Bu amaçla Bölüm de anlatıldığı gibi çapraz bağlama ve Bölüm de anlatıldığı gibi tutuklama yöntemleri kullanılarak biyosensör hazırlandı ve artan kolesterol palmitat ilaveleri sonucu amperometrik cevap akımları kaydedildi. Her iki immobilizasyon tekniği için de elde edilen i değerleri kaydedilerek tek bir grafikte toplandı (Şekil 4.4). Ayrıca her iki tekniğin tekrarlanabilirliği kıyaslandı.

91 i ( µa ) i ( µa ) 77 0,60 0,50 a b 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 Kolesterol Palmitat Derişimi, mm Şekil 4.4. a) Çapraz Bağlama b) Tutuklama ile immobilizasyon Grafikte görüldüğü üzere tutuklama yöntemi ile immobilizasyon yapıldığında çapraz bağlama yöntemine göre daha yüksek akımlar elde edildi. Bunun nedeni; çapraz bağlama esnasında glutaraldehitin enzimin aktif merkezine bağlanarak enzimi inhibe edebilmesidir [76]. Ayrıca her iki biyosensörün tekrar kullanılabilirlikleri de karşılaştırıldı (Şekil ). 0,08 0,06 0,04 0,02 0, Ölçüm Sayısı Şekil 4.5. Tekrarlanabilirlik (Tutuklama yöntemi ile)

92 i ( µa ) 78 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0, Ölçüm Sayısı Şekil 4.6. Tekrarlanabilirlik (Çapraz bağlama yöntemi ile) Tutuklama yöntemi ile hazırlanan biyosensörün 20 ölçme sonunda başlangıç aktivitesinin yaklaşık % 82,3 sini koruduğu görülürken bağıl standart sapma değeri %5,96 iken çapraz bağlama yöntemi ile hazırlanan biyosensörün ise 20 ölçme sonunda başlangıç aktivitesinin yaklaşık % 80,5 ini koruduğu ve bağıl standart sapma değeri %7,26 olarak bulunmuştur. Bağıl standart sapma değerleri kıyaslandığında tutuklama yöntemin çapraz bağlama yöntemine göre daha düşük çıktığı görülmektedir. Yapılan değerlendirmeler sonucu düşük bağıl satandart sapma değeri ve yüksek akım değerlerinden dolayı tutuklama yönteminin çapraz bağlama yöntemine göre avantajlıdır. Bu nedenle tutuklama yöntemi uygun immobilizasyon tekniği olarak seçildi SEM (Taramalı Elektron Mikroskopu) Analizi Bölüm 3.3 de anlatıldığı gibi hazırlanan film elektrot ve Bölüm de anlatıldığı gibi hazırlanan biyosensörün taramalı elektron mikroskobu ile çekilen yüzey fotoğrafları sırasıyla Şekil 4.7 ve Şekil 4.8 de gösterilmiştir.

93 79 Şekil 4.7. Pt/PPy-PVS filminin SEM fotoğrafı Şekil 4.8. Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörünün SEM fotoğrafı

94 80 Elektrotların enzimli ve enzimsiz SEM fotoğraflarına bakıldığında ikisinin birbirinden farklı olduğu görülmektedir. PPy filmin doğal görüntüsü taneciklidir. Büyültme miktarı artırılarak SEM alındığında bu yapının karnıbahar yapısına benzediği görülmektedir [74]. Ayrıca dopant miktarı arttıkça PPy nin tanecik boyutu artar. Tanecikli yapı artan dopant derişimi sebebiyle daha sıkışık ve daha düşük gözeneklere sahiptir. Kolesterol esteraz ve kolesterol oksidaz enzimleri immobilize edildikten sonra karnabahar yapısınının bozulduğu gözlenmektedir. Enzimlerin immobilizasyonu ile yeni bir morfolojik yapı oluşmuştur. Bu morfolojik yapı bize enzimlerin başarılı bir şekilde Pt/PPy-PVS filme immobilize edildiğini göstermektedir AFM (Atomik Kuvvet Mikroskopu) Analizi Bölüm 3.3 de anlatıldığı gibi hazırlanan film elektrot ve Bölüm de anlatıldığı gibi hazırlanan biyosensörün atomik kuvvet mikroskobu ile çekilen yüzey fotoğrafları sırasıyla Şekil 4.9 ve Şekil 4.10 da görülmektedir. Şekil 4.9. Pt/PPy-PVS filminin AFM fotoğrafı

95 81 Şekil Pt/PPy-PVS-ChEt-ChOx biyosensörünün AFM fotoğrafı Enzimli ve enzimsiz yapılar için alınan sonuçlar iki boyutlu ve üç boyutlu olarak düzenlenmiş olup görüntülerdeki farklılık birbirinden açık bir şekilde ayırt edilebilmektedir. Yapıya kolesterol esteraz/kolesterol oksidaz enzimlerinin immobilizasyonu işlemiyle yapıda oluşmuş olan rastgele dağılmış tanecikli yapılar enzimli yapıya atfedilmektedir. Enzimsiz (PPy-PVS) yapısının yüzey morfolojisi, yapıya kolesterol esteraz ve kolesterol oksidaz enzimlerinin eklenmesiyle yüzeyde yeni bir morfolojik yapılanma oluşmuştur. Buna bağlı olarak kolesterol esteraz/kolesterol oksidaz enzimlerinin immobilizasyon işlemi yüzeyi daha pürüzsüz yapmıştır. Bu sonuç, yüzey pürüzlülük değeri olan Root Mean Square (RMS) (karekök ortalama) değerleri ile desteklenmektedir. Enzimli görüntü için RMS değeri 717 nm ve enzimsiz yapının RMS değeri 884 nm dir Yüzey Temas Açısı Analizi Bölüm 3.3 de anlatıldığı şekilde hazırlanan film elektrot ile Bölüm de anlatıldığı şekilde hazırlanan biyosensörün yüzey temas açısı fotoğrafları sırasıyla Şekil 4.11 ve Şekil 4.12 de görülmektedir.

96 82 Şekil Pt/PPy-PVS filminin yüzey temas açısı fotoğrafı Şekil Pt/PPy-PVS-ChEt -ChOx biyosensörünün yüzey temas açısı fotoğrafı Yüzeylerin hidrofobik-hidrofilik özelliklerinin belirlenmesi birçok biyokimyasal uygulamada büyük önem taşımaktadır. Yüzeylerin hidrofilik-hidrofobik karakterlerinin belirlenmesi için yüzeylerin su değme açısı ölçümleri alınmaktadır. Her iki şekilde incelendiğinde enzim immobilize edilen filmin diğer filmden daha yayvan olduğu gözlenmiştir. Bu da bize enzim immobilize edilen filmin hidrofilik, enzim olmayan filmin ise hidrofobik olduğunu göstermektedir. Zaten enzimler protein yapısında olduğundan hidrofilik olması beklediğimiz bir sonuçtur ve buda bize enzimin polimer yüzeye başarılı bir şekilde immobilize edildiğini göstermektedir. Ayrıca temas açıları ölçüldüğünde PPy-PVS film elektrodunun temas açısı 51, PPy-PVS-ChOx- ChEt biyosensörünün temas açısı ise 22 bulunmuştur. Yüzeyin su değme açısının 22 olması yüzeyin hidrofilik gruplarca zengin hale geldiğini ve hidrofilik karakter kazandığını göstermektedir. Bulunan sonuçlar literatür sonuçları ile de desteklenmektedir [63,75].

97 Profilometre (Film kalınlığı ölçülmesi) Bölüm 3.3 de anlatıldığı şekilde hazırlanan film elektrot ile Bölüm de anlatıldığı şekilde hazırlanan biyosensörün film kalınlıkları ölçüldü ve profilometre spektrumları sırasıyla Şekil 4.13 ve Şekil 4.14 de görülmektedir. Şekil Pt/PPy-PVS film elektrodun Profilometre spektrumu Şekil Pt/PPy-PVS-ChEt -ChOx biyosensörünün Profilometre spektrumu