Seçkin SOYA. Biyomühendislik Anabilim Dal Bilim Dal Kodu: Sunu Tarihi: Bornova- ZM R

Transkript

1 EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ (YÜKSEK L SANS TEZ ) DOMATES ÇE TLER NDE (Lycopersicum esculentum Mill.) KÖK UR NEMATODU VE Verticillium SOLGUNLU UNA KAR I DAYANIKLI HATLARIN DNA MARKÖRLER KULLANILARAK TARANMASI Seçkin SOYA Biyomühendislik Anabilim Dal Bilim Dal Kodu: Sunu Tarihi: Tez Dan man : Doç. Dr. M. Bahattin TANYOLAÇ Bornova- ZM R

2 II

3 III ÖZET DOMATES ÇE TLER NDE (Lycopersicum esculentum Mill.) KÖK-UR NEMATODLARINA VE Verticillium SOLGUNLU UNA DAYANIKLILI I KONTROL EDEN DNA MARKÖRLER LE DOMATES HATLARININ TESP T ED LMES Seçkin SOYA Yüksek Lisans Tezi, Biyomühendislik Anabilim Dal Tez Yöneticisi: Doç. Dr. M. Bahattin Tanyolaç Temmuz 2008, 62 sayfa Bu çal mada, 288 domates (Lycopersicon esculentum) bitkisinin kök-ur nematodlar na ve Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n DNA markörleriyle tespit edilmesi amaçlanm t r. Öncelikle, her iki hastal k etmeni için özel olarak geli tirilmi CAPS primerleriyle bitkilerden izole edilen DNA lar n primer ba lanma bölgelerinin olup olmad saptanm, kök-ur nematodlar için yap lan analizlerde 288 örne in 247 sinde, Verticillium solgunlu u için yap lan analizlerde 288 örne in 235 inde primer ba lanma bölgesine rastlanm t r. Daha sonra, kök-ur nematoduna dayan kl l n tespiti için TaqI, Verticillium solgunlu una dayan kl l n tespiti için HincII restriksiyon enzimi ile DNA lar kesilmi, ve örneklerin hastal klara dayan kl l klar n n heterozigot olarak m yoksa homozigot olarak m yönetildikleri saptanm t r. Kök-ur nematodlar na duyarl bitki say s 200, heterozigot dayan kl bitki say s 45, homozigot dayan kl

4 IV bitki say s 2 olarak bulunmu tur. Verticillium solgunlu una duyarl bitki say s 125, heterozigot dayan kl bitki say s ise 110 olarak tespit edilmi tir. Anahtar sözcükler: Domates, kök-ur nematodlar, Verticillium solgunlu u, hastal klara dayan kl l k, DNA markörleri.

5 V ABSTRACT SCREENING THE RESISTANCE TO ROOT-KNOT NEMATODES AND Verticillium WILT BY DNA MARKERS IN TOMATO (Lycoepersicum esculentum Mill.)) Seçkin SOYA MSc in Bioengineering Department Supervisor: Assoc. Prof. Dr. M. Bahattin TANYOLAÇ July 2008, 62 pages In this study, it is purposed to determine the resistance of 288 tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) plants to root-knot nematodes and Verticillium wilt by DNA markers. Firstly, it is established that whether the tomato samples have primer binding site or not by the CAPS primers which are specifically designed for both of the diseases. In the analysis of primer binding site to root-knot nematodes and Verticillium wilt diseases, it is found that in the 288 tomato samples, 247 and 235 tomato samples have specific primer binding site, respectively. Then, for determination of resistance to root-knot nematodes and Verticillium wilt, TaqI and HincII, respectively, restriction enzymes are used to understand whether

6 VI the samples are homozygous or heterozygous resistant, or susceptible to these diseases. It is found that 200 samples are susceptible, 45 samples are heterozygous resistant and 2 samples are homozygous resistant to root-knot nematodes, and 125 samples are susceptible, 110 samples are heterozygous to Verticillium wilt. Key words: Tomato, root-knot nematode, Verticillium wilt, disease resistance, DNA markers

7 VII TE EKKÜR Çal malar mda destek ve yard mlar n hiçbir zaman esirgemeyen, en yo un zamanlar nda bile ilgisini eksik etmeyen, bilgi ve deneyimlerini benimle payla an de erli hocam Say n Doç. Dr. Bahattin TANYOLAÇ a, laboratuarda en ufak bir sorunum oldu unda yard mlar n esirgemeyen ve her zaman destekçim olan Ar.Gör. Filiz ALTAN a, yüksek lisans ö retimim boyunca laboratuarda beraber çal t m ve desteklerini her zaman hissetti im sevgili arkada lar m Hilal Betül KAYA ve Cengiz AKKALE ye, tezimin son zamanlar nda bana her türlü destek veren P nar AKYÜREK e, de erli Biyomühendislik ve EB LTEM ailesine, beni bu zamana kadar yeti tiren ve sonsuz sevgilerini hep hissetti im, bilgi ve deneyimlerini payla an sevgili Babam, Annem ve Ablama te ekkür ederim.

8 VIII

9 IX Ç NDEK LER Sayfa No ÖZET...III ABSTRACT...V TE EKKÜR...VII EK LLER D Z N...XI Ç ZELGELER D Z N...XV 1. G R L TERATÜR B LD R LER MATERYAL VE METOT Materyal Metot DNA zolasyonu DNA Safl k Analizi Agaroz Jel Elektroforezi Jellerin Boyanmas ve Görüntülenmesi DNA Miktar ve Seyreltme Oranlar n n Belirlenmesi CAPS Markör Analizi CAPS Primerleriyle Ço alt lm DNA lar n Agaroz Jel Elektroforezi ile Görüntülenmesi Restriksiyon Enzim Kesim Analizi Restriksiyon Enzim Kesimi Sonras DNA lar n Agaroz Jel Elektroforezi ile Görüntülenmesi...26

10 X 4. BULGULAR DNA safl k analizi, uygun DNA seyreltme oran n n bulunmas, ve uygun Taq polimeraz enziminin belirlenmesi CAPS Markör Analizi Restriksiyon Enzim Kesim Analizi TARTI MA VE SONUÇ...46 EK1 Çal mada Kullan lan Çözeltiler...50 KAYNAKLAR D Z N...55 ÖZGEÇM...61

11 XI EK LLER D Z N ekil Sayfa No ekil 4.1: RNaz ve ProteinazK eklenmi baz örneklerin DNA izolasyonu jel görüntüsü...27 ekil 4.2: Çe itli oranlarda seyreltilmi baz örnek DNA lar n n seyreltme denemesi jel görüntüsü...28 ekil 4.3: Çe itli Taq polimeraz enzimlerinin örnekler üzerine etkisinin incelenmesi...28 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...29 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...29 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...29 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...30 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...30 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...30 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...31 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...31 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...31 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...32

12 XII ekil Jelde net görülmeyen örnekler için tekrar yap lan kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...32 ekil Jelde net görülmeyen örnekler için tekrar yap lan kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...32 ekil Jelde net görülmeyen örnekler için tekrar yap lan kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...33 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...33 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...33 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...34 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...34 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...34 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...35 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...35 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...35 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...36 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi...36 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi...37 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi...38 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi...38

13 XIII ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi...38 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi...39 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi...39 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi...39 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi...40 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi...40 ekil Jelde net görülmeyen örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi...40 ekil Jelde net görülmeyen örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi...41 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi...41 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi...41 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi...42 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi...42 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi...42 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi...43 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi...43

14 XIV ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi...43 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi...44 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi...44

15 XV Ç ZELGELER D Z N Çizelge Sayfa No Çizelge 1. May Tohumculuk A.. den elde edilen domates örnek listesi...17

16 1 1. G R Kültür domatesi (Lycopersicon esculentum Mill.), dünyada geni bir alanda üretilmekte ve tar m endüstrisinin temelini olu turmaktad r. Dünya çap nda, patatesten sonra en çok tüketilen ikinci sebzedir ve üphesiz en popüler bahçe bitkisidir (Foolad, 2007). Domates yeti tiricili i, Türkiye nin farkl iklim ve toprak yap s na sahip bütün tar msal bölgelerine yay lm durumdad r. Ülkemizde ekili, üretim ve ekonomik yönden domates, sebze yeti tiricili i aç s ndan ilk s ralarda yer almaktad r y l nda ton olan Türkiye deki domates üretimi, 2005 y l nda tona ula m t r (Turhan ve Korkmaz, 2006). Çin, Amerika, Hindistan, Türkiye, M s r ve talya dünyan n önde gelen domates yeti tiricileridir. Domates, taze olarak yenilebildi i gibi di er yiyecekler içine kat larak çok çe itli i lenmi ürün olarak (ezme, do ranm ürünler, kabu u ç kar lm bütün domates gibi) ve suyu, sos ve çorba gibi çe itli formlar yla büyük bir önem sahibi olmu tur. Bununla birlikte, içinde A, B 1, B 2, C, K vitaminleri, niasin, protein, ya, karbonhidrat, potasyum, kalsiyum ve demir bulunur. Ayr ca taze ve i lenmi domates, bir antioksidan olan ve domatese parlak k rm z rengini veren bir pigment olan likopenin en zengin kayna d r ve likopen hücreleri kanserle ili kili olan oksidantlardan korumaktad r (Foolad, 2007). Kalp, karaci er ve eker hastalar için çok faydal d r (Aybak ve Kayg s z, 2007). Her geçen y l gittikçe artan nüfusun besin ihtiyac n n kar lanmas nda; besin maddelerinin, üretiminin artt r lmas ve birim

17 2 alanda yeti tirilen ürün miktar n n daha fazla olmas, birim alandan daha fazla ürün elde etmek için, bitkilerin sa l kl yeti tirilmesi ve hastal klardan korunmas gerekmektedir. Bunun için hastal k etmenlerinin tespit edilmesi ve bu etmenlere dayan kl ürün elde etmek amaçlanmaktad r. Patojenlere dayan kl hatlar n elde edilmesiyle, dayan ks z hatlar n elemine edilmesi ve daha az miktarda pestisit kullan lmas amaçlanmaktad r. Pestisitle üstesinden gelinemeyen zararl lar n DNA markör teknikleriyle dayan kl hatlar n seçilmesi ve pestisit kullan m n n önüne geçmek amaçlanmaktad r. Klasik slah yöntemlerine göre DNA marker yöntemleriyle hem zamandan hem de üretim yap lacak alandan tasarruf sa lamak ve dolay s yla minimum alanda kaliteli olarak maksimum verim elde etmek amaçlanmaktad r. Verticillium solgunlu u; yayg n olarak bilinen toprak kökenli fungal hastal k etmenleridir. Verticillium solgunlu unun belirtileri, hastal k etmeni bitkilerin iletim demetlerinde görülmektedir. Özellikle kurak ko ullarda yapraklar pörsüyerek solar, alt yapraklar n uç k s mlar sarar r ve bitki boylar nda farkl l klar görülür. Yaprak ayas nda kahverengi ve kül grisi lekeler bulunur, yaprak saplar uzun süre ye illi ini muhafaza eder ve sa l kl gibi görülen bitkilerin gövdesi kesildi inde kahverengi lekeler ve aç k renkte kabuklar dikkati çeker. Bitki ölümü nadir olarak görülür, fakat alt yapraklar n tamam kurudu undan dolay, verimi büyük ölçüde dü ürmektedir (Web 1).

18 3 Verticillium bitkinin olu turdu u defans yan t ndan kaçmak için ve bitkide kolonize olarak büyüyebilmek için bitki hücre duvar n parçalayan enzimleri, özellikle pektinolitik enzimleri (poligalakturonaz, pektat ve pektin liyazlar, pektinesteraz), salg lamak zorundad r. Bununla birlikte, bu enzimlerden baz lar semptom geli imini te vik etmektedir. In vitro ve (veya) bitkilerde Verticillium taraf ndan üretilen di er pek çok tipteki bile enler çe itli konukçularda semptomlar (yaprak zay fl ve (veya) sar l k-nekroz) te vik etmektedir. Bunlar çe itli ekilde toksinler veya hücre ölümünün elisitörleri olarak adland r lm t r (Robb, 2007). Verticillium enfeksiyonunun bitki hücresindeki reseptörler taraf ndan anla lmas, dayan kl bitkilerde hipersensitif hücre ölümü yoluyla enfekte olmu bölgenin izole edilmesi ile sonuçlan r. Enfeksiyon ayn zamanda bitki hücrelerinde salisilik asit (SA), jasmonik asit (JA) ve etilen gibi bitki hormonlar n n sentezlenmesine yol açar. Bu hormonlar, bitki savunma sistemini uyararak aralar nda fitoaleksinler, antimikrobiyal peptitler, peroksidazlar ve di er birçok patojen ili kili(pr) proteinin de bulundu u patojen ile ilgili birçok genin ifade edilmesine yol açar. Bunun yan nda, bitkinin hücre duvar n n yap s olas sald r lara kar sa lamla t r l r. Enfekte olmu hücrede ortaya ç kan sinyaller enfekte olmam (sistemik) dokuya da iletilerek patojenesis ile ilgili protein genlerinin ve dolay s yla da dayan kl l n olu mas na neden olur (Kazan ve Güler, 2001). Kök-ur nematodlar (Meloidogyne cinsi) küçük yuvarlak kurtçuklar olup, yeti tiricilere y ll k milyarlarca dolar kay p ya atan

19 4 obligat parazitlerdir (Williamson, 1999). Konukçusu oldu u bitkinin kök sisteminde urlara neden olarak, bitkinin iletim dokular n bozar ve topraktan su ve besin al veri i k s tlan r. Bitkide geli me yava lar ve durur, bodurla ma görülür. Yapraklarda sararma, çiçek ve meyve dökülmeleri olur. Enfeksiyon a r ise bitki tamamen kuruyabilir (Web 2). Bitki parazitik nematodlar enfeksiyon için önemli olan küçük ç k nt lar (stylet) ve özofajiyal (esophageal=yemek borusu) salg bezleri gibi iki özelle mi yap ya sahiptir. Amphidlerden (kemosensör organlar) salg lanan salg lar, nematodun kemosensör organ hücre duvar yüzeyinde birikerek bitki-nematod etkile imde önemli rol oynamaktad r. Bu salg lar nematodlar n hücrelere do ru çekilimi ve hücrenin delinmesi için gerekli olan salg lard r. Nematodlar genellikle kök uçlar na do ru yönelirler. Burada, nematoddan gelen sinyallere cevap olarak, nematodun ba bölgesine biti ik olan bitki prokambiyal hücreleri dev hücrelere geli ir. Bu geni, çok çekirdekli, metabolik olarak aktif hücreler endoparazit için sürekli bir besin kayna olarak i görürler. Dev hücrelerdeki çoklu çekirdek sitokinezden ayr lmam mitoz sonucu olmaktad r. Ayn zamanda olu an i lik ve nematod çevresindeki kortikal hücrelerin bölünmesi urlar n ve Meloidogyne spp. enfeksiyonun karakteristiki biçimi bozulmu kök yap s ekillenmesine sebep olur.

20 5 Bitkiler nematoda kar genel olarak gen ekspresyon seviyelerini de i tirerek yan t verir. Kök-ur nematodlar yla enfekte olmu domates köklerinde, bilenen birkaç bitki savunma genleriyle homoloji gösteren (peroksidaz, kitinaz, lipoksijenaz, ve proteinaz inhibitörlerini içeren) genler nematod enfeksiyonundan sonra bölgesel olarak te vik edilir. Bitki hücre duvar nda bulunan glukoproteinleri kodlayan bir gen ailesi olan ekstensin in mrna seviyeleri, enfeksiyondan sonra domates kök uçlar ndaki urlarda önemli derecede artmaktad r. Bitki hücreleri mekanik yaralanma veya fungal enfeksiyona iç duvar yüzeyinde h zl kalloz birikimi yoluyla da yan t verirler. Bitkiler ayr ca dayan kl l k genleri arac l yla (domateste Mi geni) lokalize hücre ölümünü te vik ederek nematod ile enfekte olan hücrelerin uzakla t r lmas n sa larlar (Williamson, 1996). Bu çal mada amaç, ekonomik olarak büyük önemi bulunan domatesin verimine büyük ölçüde etki eden iki hastal k olan Verticillium solgunlu u ve kök-ur nematodu enfeksiyonuna kar dayan kl domates hatlar n n DNA markör teknikleriyle taranmas (dayan kl dominant hatlar n heterozigot veya homozigot olup olmad klar na bak larak) ve böylece dayan kl hatlar n h zl ve sa l kl bir seleksiyonu gerçekle tirmektir.

21 6 2. L TERATÜR B LD R LER 1980 lerden beri DNA markörleri aralar nda domatesinde bulundu u pek çok ürün yeti tiricili inde en önemli araçlardan biri olarak geni çapta kullan lmaktad r. Bu zamana kadar, Grube ve ark. (2000) taraf ndan rapor edildi i üzere, bitki patojenlerinin bütün temel s n flar na dayan kl l k sa layan 40 dan fazla (bir çok tek gen ve çoklu özellik lokuslar n (QTL) içeren) gen domates genomunda haritalanm ve/veya Solanaceous türlerinden klonlanm t r. Daha sonra, di er dayan kl l k genleri (Bai ve ark., 2003; Chunwongse ve ark., 2002; Parrella ve ark., 2002), klonlanm Resistance (R dayan kl l k ) genleri (Leister ve ark., 1996) aras nda ortak aminoasit dizi benzerlikleri ta yan bölgelerden elde edilen DNA markörleri de domates genomunda haritalanm t r. 29 Resistance Gen Analogunun (RGA) 12 domates kromozomundan 9 unda bulundu u RGA tabanl bir domates moleküler linkage haritas olu turulmu tur (Foolad ve ark., 2002; Zhang ve ark., 2002). Birkaç RGA lokusu clusterda (grupta) bulunmu ve yerleri bilinen domates R geni veya çoklu dayan kl l k lokusuyla çak m t r. Bu harita buna ilave olarak hastal a dayan kl l k için genlerin ve çoklu özellik lokuslar n n tan nmas ve haritalanmas için bir temel olu turaca ve markör destekli seleksiyon için yararl olaca rapor edilmi tir. Hastal a dayan kl l k lokuslar na ba l markörler, markör destekli seleksiyon (MAS) programlar için kullan labilmekte, bu ayr ca birkaç dayan kl l k geninin ayn genotip içinde biriktirilmesine (dayan kl l k genlerinin piramitlenmesi ) izin vermektedir. Ek olarak,

22 7 dayan kl l k genlerine ba lanan markörler ayr ca genlerin klonlanmas ve sekanslanmas için yararl olabilmektedir. Domateste, birkaç dayan kl l k geni imdiye kadar sekanslanm t r (Cf-2, Cf-4, Cf-5, Cf-9, Pto, Mi, I2, ve Sw-5). Klonlanm R genleri u anda bitki yeti tiriciler için bitki yeti tirme stratejilerinin markör destekli yeti tirme yoluyla verimlili inin geli tirilmesi için yeni araçlar sa lamaktad r (Barone, 2002). Kaloshian ve ark.(1995), yaprak sine ine kar dayan kl l k lokusunun domateste kök-ur nematoduna dayan kl l k geni Mi ile ili kili oldu unu rapor etmi lerdir. Tarla denemelerinde 47 tane farkl domates hatt kullan lm t r. Bu hatlardan 17 tanesinin heterozigot dominant, 4 tanesinin homozigot dominant, geri kalan 26 örne in resesif oldu u rapor edilmi tir. Dayan kl hatlar n yapraklar nda 15 den fazla sinek görülmezken, dayan kl olmayan hatlar n yapraklar nda ortalama 168,6 ya kadar sinek görülmü tür. Homozigot dominantlarda heterozigot dominantlara göre daha az sinek varl gözlenmi tir. Sera denemelerinde 2 farkl grupta toplam 5 tane yak n izogenik hat kullan lm ve bunlar n kendi aralar nda nematoda dayan kl l klar n n farkl oldu u dolay s yla sineklere dayan kl l klar n n da paralel oldu u gözlemlenmi tir. Dayan kl hat olan VFNT nin kök-ur nematodlar na dayan kl l n n ya a ba l olarak artt belirlenmi tir. Mi geninin yaprak sineklerine ba lant l oldu unu göstermek amac yla Mi dayan kl l için ayr lm 67 F 2 generasyonu Mi genine ba lanan REX-1 markörüyle analiz yap lm t r. Bunlardan 39 unun heterozigot (e/p), 14 ünün homozigot (e/e, ve p/p) oldu u tespit edilmi tir. Yaprak sine ine dayan kl hatt n Mi geni içinde sinek dayan kl l k geninin (Meu1) 650 kb oldu u tespit edilmi tir.

23 8 Kawchuk ve ark.(1998), domateste Verticillium solgunlu una kar dayan kl l k geni ile ili kili olan RAPD markörlerini saptam lard r. Bu markörlerden yola ç k larak kodominant ve spesifik allel SCAR polimorfik markörleri geli tirilmi tir. Kodominant SCAR tespiti için korunmu RAPD sekanslar na spesifik olan primer B (5 - CCATGAACAGATGTGACTTGTGTG-3 ) ve primer E (5 -CGATAACAACCAACTCTCTGTCTC-3 ) kullan lm t r. Allel spesifik SCAR lar n tespiti için primer B ile birlikte Ve alleliyle ili kili sekansa spesifik primer C veya ve alleliyle ili kili sekansa spesifik primer D kullan lm t r. Kar l kl çaprazlar Verticillium solgunlu una duyarl Ailsa Craig ve dayan kl Craigella domates yak n-izogenik hatlar kullan lm t r. Sonuç olarak ortaya ç kan heterezigot F 1 bitkileri kendilenerek Ve alleli için ayr mlanm 600 bireyli bir F 2 popülasyonu olu turulmu tur. F 2 popülasyonunda 3:1 aç l m oran, 450 dirençli 150 duyarl birey, gözlemlenmi tir. Toplamda, 149 rasgele seçilmi F 2 bireyi Ve lokusuyla ili kili kodominant ve allel-spesifik SCAR lar kullan larak incelenmi tir. DNA polimorfizmiyle çok yak n ba lant gösteren SCAR lar kullan larak incelenen Ve geni ta yan 119 duyarl, 19 heterozigot dayan kl, ve 11 homozigot dayan kl F 2 dölleri aras nda bir rekombinasyon gözlemlenmemi tir. Allel spesifik primerlerle ço alt lan genomik DNA n n jel elektorforez sonuçlar nda homozigot dayan kl bitkilerde Ve allelinden üretilmi ürünün 800bç uzunlu unda oldu u gözükürken, heterozigot dayan kl ve duyarl bitkilerde ve allelinden üretilmi ürünün 750bç uzunlu unda oldu u gözlemlenmi tir. Yüksek çözünürlüklü linkage haritalar nda bu markörlerin yerleri tespit edilmi ve Ve lokusunun 0.67 ± 0.49 cm aras nda oldu u saptanm t r.

24 9 Aslam ve ark.(2000), pamukta yaprak k v rc kl l k virüsü (CLCuV) hastal na dayan kl l kla ili kili DNA markörlerini belirlemek için yapt klar çal mada, genetik analizler CLCuV dayan kl l n n tek bir dominant genle kontrol edildi ini ileri sürmü lerdir. Bu çal mada, Gossypium barbadense ve Gossypium hirsutum un bir çapraz ndan elde edilen interspesifik bir F 2 popülasyonu CLCuV ye duyarl ve dayan kl bitkiler içinde fenotipik olarak s n fland r lm t r. Bu F 2 bitkilerinin bir altkümesi CLCuV dayan kl l k genine ba lanan DNA markörlerini belirlemek için RFLP ile selektif genotipleme yoluyla de erlendirilmi tir. 67 F 2 den türevlenmi F 3 ailesi 137 RFLP lokusunda ayr m için de erlendirilmi tir. Üç DNA markör lokusunun, birbirlerine ba l, CLCuV dayan kl l ile önemli derecede ili kide oldu u ayr ca gösterilmi tir. Ba lant l markörlerin sekanslanmas yeti tirilmi popülasyonlardaki CLCuV-dayan kl bitkilerin PCR-tabanl belirlenmesindeki kullan m için lokus-spesifik DNA primerlerine izin verece i rapor edilmi tir. Najimi ve ark.(2002), Asya sine ine (Mayetiola destructor (Say)) dayan kl l k genleri H5 ve H22 ile ili kili markörlerin AFLP analizi ile ilgili çal m lard r. Asya sine i, dünya çap nda bu daya en çok zarar veren zararl lardan biridir. Asya sine ine dayan kl l ktan sorumlu genler bu zarar verici böce e kar ürünün en etkin olarak korunmas n ve ekonomik kay plar n önüne geçilmesini sa lamaktad r. Bugüne kadar, 27 dayan kl l k geni (H1- H27) bu dayda rapor edilmi ve bunlar aras nda, 11 tanesi Fas ta çok etkin oldu u bulunmu tur. Yap lan çal mada, ekmeklik bu daydaki Asya sine ine dayan kl l k genlerine

25 10 ba lanan markörlerin belirlenmesi için yak n-izogenik hatlarla (NILs) ve bulk segregant analizi (BSA) ile birlikte AFLP (ço alt lm fragman uzunlu u polimorfizmi) analizinden faydalan lm t r. Yak n izogenik hatlar n iki parças DNA kayna olarak kullan lm, birinin H5 dayan kl l k geni aç s ndan di erinin ise H22 dayan kl l k geni aç s ndan farkl l k gösterdi i bulunmu tur. 42 primer kombinasyonu kullan larak, 4200 selektif DNA fragman bu day genomu boyunca analiz edilmi, her kombinasyon ve NILs çifti ba na 100 bant ortalamas elde edilmi tir. 28 polimorfik bant tespit edilmi ve bunlardan 13 ü H5 lokusuyla, 15 i ise H22 lokusuyla ili kili oldu u bulunmu tur. Bezawada ve ark.(2003), pamukta kök-ur nematodlar na dayan kl l kla ili kili DNA markörlerinin belirlenmesi ve kök-ur nematoduna dayan kl l k genlerinin kal t m eklinin tayin edilmesi ile ilgili yapt çal mada, k smen dayan kl hat, Clevewilt 6-1, ve duyarl kültür, Stoneville 213, çaprazlanm t r. Sonuç olarak ç kan F 1 ve F 2 popülasyonlar ve ebeveynler 16 polimorfik markör sa layan 120 SSR primer çifti kullan larak genotiplenmi tir. Dayan kl l n en iyi ölçümünü sa layan hastal k belirtileri, 3:1 mendel aç l m oran na (duyarl :dayan kl ) popülasyonun uyumunu tayin etmek için kullan lm t r. Fenotipik ve markör verileri Clevewilt 6-1 in yaralanmaya dayan kl l k için resesif genin kayna olabilece ini göstermektedir. DNA markörü BNL 1421 ayr mlanm F 2 popülasyonunda lezyon indeksindeki %8 lik de i ikli i aç klamaktad r. Mapmaker analizi BNL 1421 ve BNL 1669 un 15.4 cm l k bir uzakl kla ba land n göstermektedir. Bu her iki markör da l mdan sapma göstermi tir. BNL

26 in dayan kl l k üzerindeki ufak etkisinin kök-ur nematoduna dayan kl l k özelli iyle markörün zay f ba lanmas ndan veya yanl ba lanmadan dolay olmu olabilece i rapor edilmi tir. Suzuki ve ark. (2003), Capsicum türlerinde virüslere dayan kl kaynaklar n taranmas ve tarla denemeleri ile ilgili yapt klar çal mada, kültür ve do al türleri içeren 37 Capsicum örne i h yar mozaik virüsü (CMV) ye dayan kl l k için taranm, ve ayr ca domates aspermy virüsü (TAV), domates mozaik virüsü (ToMV), biber yumu ak leke virüsü (PMMoV), ve domates benekli solgunluk virüsüne (TSWV) yan tlar gözlemlenmi tir. C. Baccatum PI, C. frutescens LS, ve C. frutescens cv. Tabasco türleri CMV-Y e kar hipersensitif bir reaksiyon göstermi, ve bunlar sistematik olarak enfekte edilmemi lerdir. Sadece C. annuum cv. Sapporo-oonaga ve cv. Nanbu-oonaga n n inoküle edilmi yapraklar CMV-Y ile enfekte edilmi, ve viral enfeksiyon sistematik olarak yay lmam t r. Bu be tür CMV-Y ye dayan kl olarak dü ünülmü tür. Bu türler TAV izolat hariç di er CMV izolatlar na da dayan kl oldu u rapor edilmi tir. C. Baccatum PI C. frutescens LS, cv. Sapporo-oonaga, ve cv. Nanbu-oonaga PMMoV ye duyarl bulunmu, C. Baccatum PI C. frutescens LS sistematik nekroz göstermi tir. Bütün CMV dirençli örnekler TSWV ye duyarl olarak bulunmu tur. CMV, PMMoV, ve/veya TSWV-dayan kl örnekleri içeren sekiz Capsicum örne inin tarla testlerinde C. baccatum PI bitkilerinin ço u CMV ve PMMoV ile enfekte tarlalarda enfeksiyon göstermemi tir. Mekanik inokülasyonda gözüktü ü gibi, C. frutescens LS, cv. Tabasco, cv. Sapporo-oonaga, and cv. Nanbuoonaga y tarlada CMV ile enfekte etmenin zor oldu u bulunmu tur.

27 12 Simko ve ark. (2003), patateste Verticillium solgunlu una dayan kl l kla ilgili DNA markörlerini belirlemeye çal m lard r. Domateste, Verticillium dahliae e dayan kl l k kromozom 9 da haritalanm yak n olarak ba l iki gen (Ve1, Ve2) ile yürütülmektedir. Domates Ve1 ve Ve2 genlerindeki lösince zengin tekrar domainleri amplifiye eden primerleri kullanm lard r. Bu primerlerin ve genomik DNA n n kal p olarak kullan m yla Verticillium dayan kl l k gen homologlar dirençli cv. Reddale de tespit edilmi tir. Sonuç olarak ortaya ç kan aminoasit sekans Ve1 ve Ve2 domates dayan kl l k genleriyle yüksek benzerlikte oldu u bulunmu tur. StVe1, Ve1 geninin patatesteki homolo u olup, domates Ve1 geni ile ayn genomik pozisyonda haritalanm t r. StVe1 e ba lanan mikrosatellit markörleri çe itli patates türlerinde ço unlu u tetraploid olan 48 genotipin taranmas nda kullan lm t r. Test edilen markörlerden biri Verticillium dayan kl l yla yüksek ba lant göstermi tir (p < 0.001). Korelasyon genel olarak STM1051 markörü (~190bp size band) olmayan dayan kl genotiplerin tamamen yoklu una dayal oldu u bulunmu tur. STM1051 markörünün Verticillium a duyarl genotiplerin tespit edilmesinde potansiyel bir kullan m oldu u, domates ve patates Verticillium dayan kl l k genleri aras nda direkt bir evrimsel ili ki olabilece i ileri sürülmektedir. Skupinová ve ark.(2004), CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) metodu ve standart enfeksiyon testleri kök-ur nematodlar na (Meloidogyne incognita) kar dayan kl domateslerin (Lycopersicon esculentum L.) elde edilmesinde kullanm lard r. CAPS

28 13 metodu 10 tane Çek Cumhuriyeti ve 4 tane yabanc ülkelerden al nm domates çe itlerinde Mi geninin genomik yap s n n tayin edilmesinde kullan lm t r. Primer olarak REX-F1 5 - TCGGAGCCTTGGTCTGAATT-3 ve REX-R2 5 - GCCAGAGATGATTCGTGAGA-3 kullan lm t r. Duyarl hatlarda 750 bç lik monomorfik bant gözlenirken, heterozigot dayan kl hatlarda üç bant (750 bç, 570 bç ve 160 bç), homozigot dayan kl hatlarda ise iki bant (570 bç ve 160 bç) gözlenmi tir. Enfeksiyon testi sonuçlar ile DNA n n moleküler genetik analizi sonuçlar n n kar la t r lmas dayan kl ve duyarl genotiplerin belirlenmesinde %100 benzerlik göstermi tir. Devran ve Elekçio lu (2004) nun çal malar nda, domates bitkisi M. incognita ile enfekte edilip dayan kl ve duyarl hatlar belirlemi lerdir. Nematoda dayan kl l k testleri sonucuna göre, Kök-ur indeksi de erinin duyarl bitkilerde 2 den büyük, dayan kl bitkilerde ise 2 ve 2 den küçük oldu u saptanm t r. Ayr ca Mi genine özgü primerler C1/2 (5 -cagtgaagtggaagtgatga-3 ) ve C2S4 (5 -ctaagaggaatctcatcacagg- 3 ) kullan larak dayan kl ve duyarl bitkiler PCR ile belirlenmi tir. 1.6 kb DNA band dayan kl bitkilerde bulunurken duyarl bitkilerde bulunmam t r. Burada elde edilen veriler nda, geleneksel olarak kullan lan dayan kl l k testleri ile moleküler çal malar n birbirlerini destekledi i ve bu primerlerin slah program nda uygulanabilece i sonucuna var lm t r. Blaszczyk ve ark.(2005), seçilmi kahverengi pas hastal na dayan kl l k genleri için aday DNA markörlerinin tespit edilmesi için

29 14 yapt klar çal mada, dayan kl l k geni Lr1, Lr9, Lr10, Lr13, Lr19, Lr21, Lr24, Lr26, Lr28, Lr35, ve Lr37 ta yan Thatcher yak n-izogenik hatlardaki toplam 286 lokus PstI AFLP metoduyla DNA polimorfizmi için taranm t r. 33 selektif primerle yap lan ara t rmada 16 aday markör bulunmu tur. Seçilmi dayan kl l k genlerinin varl ya da yoklu una göre karakterize edilmi kültür bitkileri üzerine yap lan bundan ba ka do rulama çal malar Lr24, Lr26 ve Lr37 için markörlerin özgüllüklerini do rulam t r. AFLP tabanl P markörü STS markörüne ba ar l ekilde dönü türülmü tür. Yeni markör Lr37-spesifik markörüne (CslVrga13)1,7 cm uzakl kta ba lanm t r. Ananga ve ark.(2006), Leptosphaeria maculans sebebiyle olu an Brassica türlerinin ciddi bir hastal olan kara yan kl a dayan kl l kla ili kili RAPD markörlerini ara t rm lard r. L. maculans a dayan kl l n genetik analizi Brassica germplazmlar ndan al nan 15 diploid ve tetraploid genomdan ve 9 örnek ise tetraploidlerden yap lm t r. Bütün genotipler kotiledon safhas nda kara yan k hastal için taranm ve 24 genotipin %46 s dayan kl, geri kalan %54 de duyarl olarak bulunmu tur. Di er taraftan, eri kin bitki taramas bütün genel genotiplerin dayan kl oldu unu ortaya koymu tur. Kara yan k hastal na dayan kl l kla ili kili DNA markörü belirlenmesi çal malar nda, bütün genotipler 13 RAPD ve 8 SSR markörüyle 169 ço alt lm ürün üretilmesi ile taranm t r. Alt RAPD markörünün (OPB01, OPE03, OPE16, OPF10, OPE12, ve OPI01) polimorfik oldu u, SSR markörlerinin ise monomorfik oldu u bulunmu tur. Ki-kare analizi RAPD primerleriyle ço alt lm 5 fragman n (OPE , OPE16-

30 , OPE , OPE , ve OPI01-280) önemli derecede kara yan kl kla ili kili oldu u bulunmu tur. Akinbo ve ark.(2007), dünyadaki cassava yeti tirme bölgelerinde cassava n n temel bir hastal olan Cassava antraknoz hastal na(cad) dayan kl l kla ili kili markörleri belirlemek için, F 1 dölleri dayan kl genotip TME117 ve duyarl genotip TMS92/0326 aras nda bir çaprazlama ile deney popülasyonu olu turmu lard r. Ki-kare testi monogenik dominant bir kal t m fikri veren dayan kl dan duyarl ya beklenen oran 1:1 için iyi bir benze me vermi tir. 200 dekamer primeri CAD a dayan kl ve duyarl ebeveynler kullan larak görüntülenmi tir. Bulk segregant analizi TMS 92/0326 ve TME 117 den türevlenen F 2 bireylerinde antraknoza dayan kl l kla ba lant l RAPD lerin ara t r lmas için h zl bir ekilde kullan lm t r. Gene ba lanan fragman OPAF2 ve OPF06 primerleriyle her iki taraftan s ras yla 13.1 ve 22.2 cm olarak belirlenmi tir. Acciarri ve ark.(2007), Güney talya bölgesinde tipik olarak büyüyen meyvesinin pembe rengiyle, y geninden dolay, renksiz meyve derisi ile karakterize olan Rosa(= pembe) domatesleri ile ilgili ara t rmalar nda, bu Rosa domatesleri aras nda Rosa di Sorrento lokal rklar n n Verticillium solgunlu una ( rk 1) dayan kl l k gösterdi ini belirlemi lerdir. Domateste, V.dahliae ve V.albo-atrum un rk na dayan kl l k, ayn patojene dayan kl l ba ms z olarak yöneten s k ca ili kili iki genle, Ve1 ve Ve2, ili kili oldu unu rapor edilmi tir. Ve1 ve Ve2 için s ras yla seçici allel-spesifik PCR amplifikasyonu (V2LeO3F ve

31 16 V2LeO3R CAPS primerleriyle) ve bunu izleyen enzimatik restriksiyon (HincII restriksiyon enzimi) ile bir PCR amplifikasyonu temelli iki yeni markör geli imi bildirilmi tir. Bu primerlerle ço alt lan fragman n duyarl hatlarda 1029 bç uzunlu unda oldu u ve enzimatik reaksiyonla dayan kl hatlardaki fragman n kesilmesi sonucunda ise 428 bç ve 601 bç lik iki fragmana olu tu u rapor edilmi tir. Bu iki markör Ve lokuslar ndaki her iki allelik formun belirlenmesine izin vermekte ve markör destekli seleksiyon kullan m için potansiyelleri ilgi çekmektedir. Ayr ca, Rosa di Sorrento dayan kl hatlar Ve-dayan kl hatlarda bulunanlarla ayn dayan kl l k allellerine sahip oldu u belirtilmi tir. Mijatovi ve ark.(2008), domates çe itleri ve hibritlerinin Verticillium dahliae ve Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici e dayan kl l klar n test etmi lerdir. Be ticari domates hibriti (Luna F 1, MarkoF 1, Nada F 1, Zlatni jubilej F 1, Balkan F 1 ) ve dört hat (S-31, D-150, P-2/02, P-3/02) Verticillium dahliae ve Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici e dayan kl l k için de erlendirilmi tir. V. Dahliae e dayan kl l k için test edilen bitkiler iki-dört yaprakl safhada köklerinden inokule edilmi tir. ki yaprakl safhadaki domates bitkilerinin dayan kl l k testlerinde F. oxysporum f. sp. lycopersici, race 1 ve 2 nin iki izolat kullan lm t r. P-2/02, S-31 hatlar ve hibrit Marko F 1 V. Dahliae ye yüksek dayan kl l k göstermi tir. Luna F 1 ve Nada F 1 hibritleri P-3/02 ve D-150 hatlar gibi k smen dayan kl, Zlatni jubilej F 1 ve Balkan F 1 hibritleri duyarl bulunmu tur. Test edilen bütün domates genotipleri az ya da çok her iki F. oxysporum f. sp. Lycopersici izolat na duyarl oldu u rapor edilmi tir.

32 17 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Çal mada May Tohumculuk A.. den elde edilen ve a a da belirtilen 288 domates örne i kullan lm t r. Çizelge 1. May Tohumculuk A.. den elde edilen domates örnek listesi Örnek no Hat ismi ve hat içi no Örnek no Hat ismi ve hat içi no Örnek no S.RED-1 41 AVTY S.RED-2 42 AVTY S.RED-3 43 AVTY S.RED-4 44 AVTY S.RED-5 45 AVTY S.RED-6 46 AVTY S.RED-7 47 AVTY2-7 Hat ismi ve hat içi no S.RED-8 48 AVTY2-8(*) S.RED-9 49 AVTY2-9(*) S.RED AVTY2-10(*) 11 Y AVTY AVTY Y AVTY AVTY Y AVTY AVTY Y AVTY AVTY Y AVTY AVTY Y AVTY AVTY3-6(*) 17 Y AVTY AVTY3-7(*) 18 Y AVTY1-8(*) 58 AVTY3-8(*) 19 Y AVTY1-9(*) 20 Y AVTY1-10(*)

33 18 Örnek no Hat ismi ve hat içi no Örnek no Hat ismi ve hat içi no Örnek no 59 GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT97-9 Hat ismi ve hat içi no 68 GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL GPT GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL GPT MTL MTL638-8

34 19 Örnek no Hat ismi ve hat içi no Örnek no Hat ismi ve hat içi no Örnek no Hat ismi ve hat içi no 173 MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL MTL Y-06-MTL MTL MTL Y-06-MTL MTL MTL Y-06-MTL MTL MTL Y-06-MTL MTL MTL Y-06-MTL MTL MTL Y-06-MTL MTL MTL Y-06-MTL MTL MTL 496-1

35 Metot DNA zolasyonu Doyle(1991) taraf ndan yap lan DNA izolasyon metodu küçük modifikasyonlarla gerçekle tirilmi tir. zolasyon s ras yla a a daki ekilde yap lm t r; µl mikroprep buffer ependorf içindeki yapraklara (yakla k 0,2 g) ilave edilip matkapla parçalanm t r µl daha mikroprep buffer ilave edilmi tir. 3- Yava ça kar t r l p 65 0 C de 1 saat inkübasyona b rak lm ve her 10dk da bir çalkalanm t r µl kloroform/izoamilalkol (24:1) ilave edilmi ve ard ndan yava ça kar t r lm t r. 5- Örnekler 5000rpm de 10dk santrifüj edilmi tir. 6- Santrifüjden sonra üst faz temiz bir ependorfa al n p üzerine ependorftaki s v n n yakla k 2 kat kadar 4 0 C de bekletilmi %100 lük etanol ilave edilmi tir. 7- Ependorflar yava ça kar t r larak bulutlanma olmas sa lanm t r. 8- Örnekler 5000 rpm de 3dk santrifüj yap lm t r. 9- Dibe yap an DNA dü meyecek ekilde ependorftaki s v dökülmü tür.

36 Pelet üstüne 0,2 M Na-Ac/%70lik etanol den 500 µl eklenerek y kama yap lm t r rpm de 3 dk santrifüjlenerek dibe yap an pelet dü meyecek ekilde ependorftaki s v dikkatlice dökülmü tür. 12- Pelet üzerine 500 µl %70 lik etanol ilave edilerek son y kama i lemi gerçekle tirilmi tir rpm de 3 dk santrifüjlenerek pelet üstündeki s v bo alt lm ve ependorfta hiç alkol kalmamas için örnekler bir gece kurumaya b rak lm t r 14- Alkol uçtuktan sonra 50 µl ultrapure su ilave edilerek 65 0 C de 1 saat süresince DNA n n çözülmesi beklenmi tir. 15- Çözülen DNA ya 5 µl proteinaz K ve 15 µl RNaz ilave edilerek 37 0 C de 1 saat bekletilmi tir. 16- zole edilen DNA -20 C de daha sonra kullan lmak üzere saklanm t r. 0 Kullan lan çözeltilerin içerikleri Ek1 de verilmi tir DNA Safl k Analizi Ultra saf su içinde çözülmü halde bulunan DNA lardan, 2 µl al narak 96 l k PCR tüpleri içine konulmu ve üzerlerine 8 µl ultra saf su ve 2 µl brom fenol mavisi ilave edilmi tir. Elde edilen DNA, ultra saf su ve boya kar m daha önceden haz rlanm ve 1X TAE (Tris-Asetat-

37 22 EDTA) içerisinde yakla k 15 dk bekletilmi %1 lik agaroz jel içinde olu turulmu kuyucuklara yüklenmi tir Agaroz Jel Elektroforezi DNA safl k analizi için gerekli olan %1 lik agaroz jel haz rlayacak kadar gerekli agaroz 1X TAE çözeltisi ile kar t r larak C de kaynat larak homojen hale getirilmi tir C ye kadar so umas beklendikten sonra elektroforez kasalar na dökülerek örnek miktar na uygun taraklar yerle tirilmi ve yükleme i leminin yap laca kuyucuklar n aç lmas sa lanm t r. Jel donduktan sonra kasa elektroforez tank n n içine konulmu tur. Tanklara jelin üzerini 2-3 cm geçecek kadar 1X TAE çözeltisi ilave edilmi tir. Haz rlanan örnekler jelde aç lan kuyucuklara mikro pipet yard m yla yüklenmi tir. Örneklerin yüklendi i kuyucuklar n en ba ndaki kuyucu a 2 µl moleküler a rl k markörü (DNA ladder, Fermentas GeneRuler 1 kb Cat.No: SM0313) yüklenmi tir. Yükleme i lemi tamamland ktan sonra elektroforez kasalar güç kayna na ba lanm ve 60 voltta 120 dk boyunca yürütülmü lerdir Jellerin Boyanmas ve Görüntülenmesi Örneklerin 2 saatlik yürüme i lemi tamamland ktan sonra jeller saf su içine al narak 5 µl/100ml konsantrasyonda etidyum bromid boya ile 30 dk boyunca boyanma i lemine tabi tutulmu tur. Boyanan jellerin ultraviyole jel görüntüleyici ile foto raflar görüntülenerek bilgisayar ortam na aktar lm t r.

38 23 Agaroz jel elektroforezi ve boyamada kullan lan çözeltilerin içerikleri Ek1 de verilmi tir DNA Miktar ve Seyreltme Oranlar n n Belirlenmesi Örnek DNA lar n n seyreltme oranlar n n belirlenebilmesi için 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/800, 1/2000, 1/4000, 1/20000, 1/40000 oranlar n nda seyreltmeler yap lm t r. Seyreltilen örnek DNA lar RAPD primerleri kullan larak PCR da amplifiye edilmi tir. Daha sonra amplifiye edilen örnekler agaroz jele yüklenmi ve elektroforezi yap larak ç kan bantlar n yo unlu una göre uygun seyreltme oranlar örnekler için belirlenmi tir. Bu çal mada 288 örnek için kullan lan seyreltme oran 1/800 dür CAPS Markör Analizi Verticillium solgunlu una dayan kl domates çe itlerinin dayan kl l kla ili kili genleri içerip içermediklerinin belirlenmesi için Acciarri ve ark.(2007) a göre, CAPS primerleri V2Le03F (CAAACATAGCTGGAAGAATC) ve V2Le03R (TAGGAGGAAAAGAATTGG) kullan lm t r. Verticillium solgunlu u ile ilgili denemelerde, PCR tabanl DNA amplifikasyon ko ullar, 150 sn 94 0 C ilk denaturasyon basama, 45 sn

39 C, 45 sn 47 0 C, 120 sn 72 0 C (35 kez), 180 sn 72 0 C, ve 4 0 C olarak ayarlanm t r. Kök-ur nematodlar na dayan kl domates çe itlerinin dayan kl l kla ili kili genleri içerip içermediklerinin belirlenmesi için Skupinová ve ark.(2004) a göre, CAPS primerleri REX-F1 (5 - TCGGAGCCTTGGTCTGAATT-3 ) ve REX-R2 (5 - GCCAGAGATGATTCGTGAGA-3 ) kullan lm t r. Kök-ur nematodlar ile ilgili denemelerde, PCR tabanl DNA amplifikasyon ko ullar, 180 sn 94 0 C ilk denaturasyon basama, 60 sn 94 0 C, 120 sn 55 0 C, 120 sn 72 0 C (30 kez), 480 sn 72 0 C, 4 0 C olarak ayarlanm t r. Denemeler için bir örnek ba na haz rlanan PCR kokteylinin içerikleri Ek1 de verilmi tir CAPS Primerleriyle Ço alt lm DNA lar n Agaroz Jel Elektroforezi ile Görüntülenmesi CAPS primerleriyle ço alt lm domates DNA lar n n ilgili Verticillium solgunlu una veya kök-ur nematodlar na dayan kl l k genlerini içerip içermediklerini tespit etmek için, PCR dan ç kan örnekler örnek say s na göre haz rlanm %2 lik agaroz jel elektroforezinde 100 volt ak mda 2,5 saat süreyle yürütülmü tür. Daha sonra elektroforezden ç kan jeller boyama tank na al n p etidyum bromid

40 25 boyas yla 5 µl/100 ml konsantrasyona denk gelecek ekilde etidyum bromid eklenmi saf suda 30 dk boyunca boyama i lemine tabi tutulmu tur. Boyama i leminden sonra fazla boyan n ortamdan uzakla t r lmas amac yla jeller 5 dk boyunca sadece saf su ile y kama i lemi gerçekle tirilmi tir. Boyanan örnekler ultraviyole k alt nda görüntülenerek foto raflar çekilmi ve daha sonra bilgisayar ortam na aktar lm t r. Agaroz jel elektroforezi ve boyamada kullan lan çözeltilerin içerikleri Ek1 de verilmi tir Restriksiyon Enzim Kesim Analizi CAPS primerleriyle hastal klara dayan kl l k gen bölgeleri ço alt lm domates DNA örnekleri, daha sonra Verticillium denemeleri için N. Acciarri ve ark.(2007) n n yapt çal ma baz al narak HincII restriksiyon endonükleaz enzimi ile, kök-ur nematodlar denemeleri için S. Skupinová ve ark.(2004) n n yapt çal ma baz al narak TaqI restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesim i lemine tabi tutulmu lard r. Restriksiyon enzimi kesimi için 1 örnek için kullan lan PCR kokteyl içerikleri Ek1 de verilmi tir.

41 Restriksiyon Enzim Kesimi Sonras DNA lar n Agaroz Jel Elektroforezi ile Görüntülenmesi Kök-ur nematodlar na ve Verticillium solgunlu una dayan kl l k genlerini içeren domates DNA lar n n ilgili restriksiyon ile kesimi sonras nda de belirtildi i ekilde agaroz jel elektroforezinde yürütülerek kesim i leminin olup olmad dolay s yla örneklerin heterozigot mu yoksa homozigot mu olduklar belirlenmi tir.

42 27 4. BULGULAR 4.1 DNA safl k analizi, uygun DNA seyreltme oran n n bulunmas, ve uygun Taq polimeraz enziminin belirlenmesi DNA izolasyonundan sonra 288 DNA örne i safl k analizi için agaroz jel elektroforezinde yürütülmü ve DNA kalitesi tespit edilmi tir. Jelde görüntülenen DNA band n n parlakl na ve netli ine bakarak uygun seyreltme oran Verticillium analizleri için 1/800 seyreltme oran, kök-ur nematodu analizleri için 1/800 ve 1/100 olarak belirlenmi tir. Taq polimeraz enzim denemesinde kendi enzimimiz SB, Fermentas, SB+Fermentas kar m ve Metis enzimi kök-ur nematodu analizinde baz örnekler üzerinde denenmi tir. En iyi sonucu kendi enzimimiz olan SB enzimi vermi tir. ekil 4.1: RNaz ve ProteinazK eklenmi baz örneklerin DNA izolasyonu jel görüntüsü

43 28 ekil 4.2: Çe itli oranlarda seyreltilmi baz örnek DNA lar n n seyreltme denemesi jel görüntüsü ekil 4.3: Çe itli Taq polimeraz enzimlerinin örnekler üzerine etkisinin incelenmesi 4.2. CAPS Markör Analizi Kök-ur nematodlar na dayan kl l k için CAPS primerleri REX-F1 ve REX-R2 ile, Verticillium solgunlu una dayan kl l k için CAPS primerleri V2Le03F ve V2Le03R ile ço alt lan 288 domates örne i, agaroz jel elektroforezinde ayr mland ktan sonra her birinin kök-ur nematodlar na ve Verticillium solgunlu una dayan kl l kla ilgili primer ba lanma bölgelerine sahip olup olmad klar belirlenmi tir.

44 29 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi

45 30 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi

46 31 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi

47 32 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil Jelde net görülmeyen örnekler için tekrar yap lan kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil Jelde net görülmeyen örnekler için tekrar yap lan kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi

48 33 ekil Jelde net görülmeyen örnekler için tekrar yap lan kök-ur nematodlar na dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi

49 34 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi

50 35 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi

51 36 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l k için primer ba lanma bölgelerinin belirlenmesi Kök-ur nematodlar na dayan kl l kla ilgili primer ba lanma bölgelerine sahip olan DNA örnekleri 750kb uzunlu unda tek bant vermekte iken, Verticillium solgunlu una dayan kl l kla ilgili primer ba lanma bölgelerine sahip olan DNA örnekleri 1029kb uzunlu unda tek bir bant vermektedir. Kök-ur nematodlar na dayan kl l kla ili kili gen bölgesini ço altabilmek için primer ba lanma bölgesini 288 örnekten 247 si

52 37 içermektedir. Bu rakam toplam örnek miktar n n % 85,8 ini olu turmaktad r. Verticillium solgunlu una dayan kl l kla ili kili gen bölgesini ço altabilmek için primer ba lanma bölgesini 288 örnekten 235 i içermektedir. Bu rakam toplam örnek miktar n n %81.6 s n olu turmaktad r Restriksiyon Enzim Kesim Analizi Kök-ur nematodlar na ve Verticillium solgunlu una dayan kl l kla ilgili primer ba lanma bölgelerini içeren örneklerin belirlenmesinden sonra, kök-ur nematodlar na dayan kl l k analizi için CAPS primerleriyle ço alt lm DNA fragmanlar n n TaqI restriksiyon endonükleaz enzimi ile, Verticillium solgunlu una dayan kl l k analizi için CAPS primerleriyle ço alt lm DNA fragmanlar n n HincII restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesim i lemi gerçekle tirilmi tir. ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi. Örnek olarak, A ile gösterilen 8 numaral örnek duyarl, B ile gösterilen 12 numaral örnek heterozigot dayan kl özellik göstermektedir.

53 38 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi

54 39 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi

55 40 ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi ekil aras örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi ekil Jelde net görülmeyen örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi

56 41 ekil Jelde net görülmeyen örneklerin kök-ur nematodlar na dayan kl l klar n n belirlenmesi. Örnek olarak, A ile gösterilen 223 numaral örnek duyarl, B ile gösterilen 232 numaral örnek heterozigot dayan kl, C ile gösterilen 382 numaral örnek homozigot dayan kl özellik göstermektedir. ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi. Örnek olarak, A ile gösterilen 26 numaral örnek heterozigot dayan kl, B ile gösterilen 31 numaral örnek duyarl d r. ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi

57 42 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi

58 43 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi

59 44 ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi ekil aras örneklerin Verticillium solgunlu una dayan kl l klar n n belirlenmesi lgili restriksiyon enzimi ile kesim i leminden sonra 288 DNA örne i, incelenen hastal klara kar gen bölgesi içerip içermedikleri, e er içeriyorlarsa bu dayan kl l kla ili kili gen bölgesinin homozigot mu yoksa heterozigot mu özellik gösterdi i jel görüntülerinden analiz edilmi tir. Kök-ur nematodlar na dayan kl l k analizleri sonucunda, bu hastal a duyarl bireylerde 750kb uzunlu unda kesilmemi tek bant