T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANA BİLİM DALI

Transkript

1 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANA BİLİM DALI MENSTRÜEL DÖNGÜDE SIÇAN UTERUS EPİTELİNDE SIKI VE OLUKLU BAĞLANTI PROTEİNLERİNİN DAĞILIMLARININ İMMÜNOHİSTOKİMYASAL OLARAK BELİRLENMESİ DOKTORA TEZİ Dr. Eran Orhan SÖZEN Tez Danışmanı Prof. Dr. Deniz ERDOĞAN ANKARA OCAK 2008

2 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANA BİLİM DALI MENSTRÜEL DÖNGÜDE SIÇAN UTERUS EPİTELİNDE SIKI VE OLUKLU BAĞLANTI PROTEİNLERİNİN DAĞILIMLARININ İMMÜNOHİSTOKİMYASAL OLARAK BELİRLENMESİ DOKTORA TEZİ Dr. Eran Orhan SÖZEN Tez Danışmanı Prof. Dr. Deniz ERDOĞAN Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından 01/ proje numarası ile desteklenmiştir. ANKARA OCAK 2008

3 i

4 İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Resimler Önsöz i ii iii v I. GİRİŞ 1 II. GENEL BİLGİLER 5 II.1. Uterus un Gelişimi 5 II.2. Uterus un Anatomisi 7 II.3. Uterus un Histolojisi 9 II.4. Sıçanlarda Menstrüel Döngü Evreleri ve Özellikleri 14 III. GEREÇ VE YÖNTEM 17 III.1.Gereç 17 III.2. Yöntem 17 IV. BULGULAR 21 V. TARTIŞMA 44 VI. SONUÇ 52 VII. ÖZET 53 VIII. SUMMARY 54 IX. KAYNAKLAR 55 X. ÖZGEÇMİŞ 62 ii

5 RESİMLER Resim 1A-B: Diöstrus evresine ait ZO-1 antikor tutulumu 24 Resim 2A-B: Proöstrus evresinde ZO-1 antikor tutulumu 25 Resim 3A-B: Östrus evresinde ZO-1 antikor immünreaktivitesi 26 Resim 4A-B: Metaöstrus evresinde ZO-1 primer antikor tulumu 27 Resim 5A-B: Diöstrus evresinde klaudin-5 antikoru ile yapılan immünhistokimyasal boyama 28 Resim 6A-B: Proöstrus evresinde klaudin- 5 antikoru ile yapılan immünohistokimyasal boyama 29 Resim 7A-B: Östrus evresinde klaudin-5 antikoru ile yapılan immünohistokimyasal boyama 30 Resim 8A-B: Uterus epitelinin metaöstrus evresinde klaudin -5 antikoru ile yapılan immünhistokimyasal boyama 31 Resim 9A-B: Diöstrus evresinde klaudin-7 primer antikoru ile yapılan immünboyama. 32 Resim 10A-B: Proöstrus evresinde klaudin-7 tutulumu 33 Resim 11A-B: Östrus evresinde klaudin-7 ile yapılan immünohistokimyasal inceleme 34 Resim 12A-B: Metaöstrus evresindeki kaludin 7 ile yapılan immünohistokimyasal boyama 35 Resim 13A-B: Diöstrus evresinde JAM-1 tutulumu 36 Resim 14A-B: Proöstrus evresinde JAM-1 tutulumu 37 Resim 15A-B: Östrus evresinde JAM-1 tutulumu 38 Resim 16A-B: Metaöstrus evresinde JAM-1 primer antikoru ile yapılan immünohistokimyasal inceleme 39 Resim 17A-B: Diöstrus evresinde konneksin-43 tutulumu 40 iii

6 Resim 18A-B: Proöstrus evresinde konneksin -43 tutulumu 41 Resim 19 A-B: Östrus evresinde konneksin -43 primer antikoru ile yapılan immünboyama 42 Resim 20A-B: Metaöstrus evresinde konneksin-43 antikor tutulumu 43 iv

7 ÖNSÖZ Doktora eğitimim boyunca bilgi ve deneyimlerini paylaşarak bana yardımcı olan, tezimin hazırlanmasında büyük desteğini gördüğüm ve öğrencisi olmaktan mutluluk duyduğum Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı başkanımız ve çok değerli danışmanım Sayın Prof. Dr. Deniz Erdoğan a, yetişmemde büyük katkıları olan değerli hocalarım Sayın Prof. Dr. M. Tahir Hatipoğlu, Sayın Prof. Dr. Celal Ilgaz, Sayın Prof. Dr. Candan Özoğul ve Sayın Prof. Dr. Suna Ömeroğlu na, eğitimim süresince bana destek olan Yrd. Doç. Dr. Çiğdem Elmas, Uzm.Dr. Neşe Lortlar Uçankuş a, Tezimin deney aşamasında birlikte çalıştığımız ve yardımlarını aldığım Yrd. Dr. Gülnür Take, Uzm. Dr. Murat Taş ve Arş. Gör. Fatma Helvacıoğlu ve tüm araştırma görevlisi arkadaşlarıma, deney aşamasındaki yardımlarından dolayı Ankara Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi Doğum Anabilim Dalı na, Anabilim Dalımız personeli Şemsi Öztürk, Recep Orhan ve Tekin Koçak a, Doktora eğitimi ve tez çalışmalarımda gerekli süre içerisinde yürütmem gereken işlerde bana sağladıkları destekten dolayı Özel Ankara Tüp Bebek Merkezi sorumlusu Doç. Dr. Kubilay Vicdan ve laboratuar çalışma arkadaşlarıma, Yetişmem ve okumamda büyük emekleri olan annem Yurdagül Sözen ve babam Ergin Sözen e birlikteliğimizden itibaren her zaman yanımda bana destek olan sevgili eşim Füsun Sözen ve canım oğlum Ersun Sözen e teşekkürlerimle Dr. Eran Orhan Sözen Ocak Ankara v

8 I - GİRİŞ Epitel dokusu, vücudun dış yüzünü, organların iç veya dış yüzeylerini yada her iki yüzeylerini de örterek bunları çeşitli etkenlere karşı korur. 27 Epitel dokusu, birbirleriyle sıkıca bağlanmış ve aralıksız olarak dizilen epitel hücrelerinden oluşur. Epitel hücreleri arasındaki aralık çok dar olmasına karşın dokunun sürekliliği ve seçici geçirgenliği, komşu hücreler arasındaki madde iletişimi epitel hücreleri arasındaki yan yüz 27, 30, 60 bağlantı birimleri ile gerçekleşir. Bağlantı birimleri, epitel hücrelerinin yan yüzleri arasında apikalden bazale doğru; sıkı bağlantı ( zonula occludens, tight junction), ara bağlantı (zonula adherens), desmozom ( makula adherens), oluklu bağlantı (gap junction), yan yüz uzantıları (interdigitasyon) olarak beş 27, 36 bileşenden oluşmaktadır. Sıkı bağlantılar komşu epitel hücreleri arasındaki bağlantıda esas rolü üstlenirler. Hücreler arasında bağlantı kurulmasının dışında, hücreler arası aralıktan apikalden bazale yada bazalden apikale su, iyon ve moleküllerin geçişini engellerler. Ayrıca hücre zarında bulunan lipit ve proteinlerin, hücre zarının apikal ve bazolateral alanlarından serbest 39, 40 şekilde difüzyonunu engelleyerek hücre bütünlülüğünü korurlar. Sıkı bağlantılar hücreleri bir bant gibi birleştirirler. Komşu hücrelerin yan zarlarının birbirlerine bitişik dış yaprakları kaynaşmıştır. Bu kaynaşmalar 0,1μm. kalınlıkta bantlar şeklinde olup, 0,1 μm. - 0,5 μm aralıklar halindedir. Kaynaşma noktalarında, iki zarı transmembran birleşme proteinlerinden oluşan ince iplikçikler birbirine bağlanmaktadır. Kaynaşmaların sayısı, epitelin yerine göre değişiklik gösterir. Örneğin sıvı alışverişi ile yakından ilgili olan böbrek proksimal tübüllerinde bağlantı sayısı azdır, mesane epitelinde ise sayı artmaktadır. Son yıllarda, epitel, endotel, ve miyelinize sinir hücrelerinin sıkı bağlantı birimlerinde kırktan fazla protein olduğu bulunmuştur. Bu proteinler; integral sıkı bağlantı proteinleri, sıkı bağlantı plak proteinleri, sitoplazma ve çekirdeğe ait çeşitli 40, 42, 45, 39 proteinler olarak üç esas grupta toplanır. İntegral sıkı bağlantı proteinleri; okludin, klaudin ve junctional adhezyon molekül ( JAM) proteinlerinden oluşur. Okludin ve klaudin, epitelyal geçirgenliğin denetimini ve sıkı bağlantı filamanlarının bütünlüğünü sağlarken, JAM immün tepkimelerde ve yangısal olaylarda, T lenfositlerin, nötrofillerin ve dendritik hücrelerin lenf ve damarlardan dokuya geçişini denetler. 39, 105, 65 Okludin, epitel ve endotel hücrelerarası bariyerin oluşturulmasında en önemli proteindir. Sıkı bağlantıların ince iplikçiklerinin temel yapısını yapar. Yaklaşık olarak 65 kda ağırlığındadır. 34 Okludin lerin bir epiteldeki yoğunluğu, o epiteldeki hücrelerin birbiri ile yapışma derecesine ve geçirgenlik özelliğine bağlıdır. Böbrekte proksimal tübüllerde okludin daha az görülürken, toplayıcı kanallarda, hücresel sınır boyunca daha belirgin olarak dağılım gösterir. 34,39-1 -

9 Klaudin, yirmi dört farklı üyesi olan kda ağırlığında bir proteindir. Klaudin ler, farklı dokularda değişik dağılımlar gösterir. Bunun nedeni endotel ve epitel hücrelerince gösterilen, elektriksel direnç ve hücreler arası iyonik seçicilikte işlev görmeleridir. 39, 35, 105 Nefron bunun en güzel örneğidir. Proksimal tübülde klaudin 2, 10, 11, distal tübülde klaudin 1, 3, 8, toplayıcı kanallarda ise klaudin 1, 3, 4 ve 8 ortaya çıkmaktadır.,86 Embriyonel gelişim sürecinde de bazı çok özel klaudin ler gözlemlenir. 16 Klaudin 11, Y kromozomunda cinsiyet belirleyici bölgenin 54 ani olarak belirginleşmesi sonucunda, Sertoli hücrelerinde görülür. Retina pigment epitelinin gelişimi sırasında Klaudin 5 geçici olarak ortaya çıkar. Embriyonik epitelde klaudin 6 izlenir. 64 JAM 1 ( junctional adhezyon molekülü), epitel ve endotel hücrelerinin sıkı bağlantılarında ve lökositlerin yüzeyinde bulunan kda ağırlığında glikosilat proteindir. İmmünoglobulin ailesine aittir. Yapısında PDZ alanları içeren sıkı bağlantı proteini ZO 1 ile bağlantı kurar. 12,39 Sıkı bağlantı plak proteinleri, çok yönlü protein olan MAGUK ( Hücre zarı ile ilişkili guanilat kinaz eşdeşleri ) protein ailesinin üyesidir. 44 Sıkı bağlantı plak proteinlerinden ilk olarak ZO 1 (zonula occludens -1) periferik membran proteini olarak tanımlanmış ve epitel hücrelerinde, sıkı bağlantı iplikçiklerinde yoğun olarak belirlenmiştir. ZO 1, kda ağırlığında bir proteindir. Yapısındaki PZD alanları ile klaudin, ZO 2, ZO 3 39, 58, 25, 75 ve JAM ile bağlantı kurar. ZO 1, sıkı bağlantılar dışında, epitel hücreleri arasındaki diğer bağlantı birimleriyle de ilişkidedir. Ara bağlantı (zonula adherens) proteini α- catenin ile etkileşimdedir. 57 Ayrıca oluklu bağlantı (gap junction) proteinlerinden konneksin 43 ve konneksin 45 ile de ilişkidedir. 62,104 Sıkı bağlantı plak proteinlerinden ZO 2 ve ZO 3 daha sonra bulunmuştur. ZO 2, 160 kda ağırlığında olup ilk olarak ZO 1 ile birlikte immünolojik çökelme yapan protein olarak tanımlanmıştır. 39, 59 ZO- 2 tümör baskılayıcı proteindir. Özellikle prostat karsinomlarında ve kolon kanserlerinde sık görülür. 17. ZO 2 epitel ve endotel hücreleri dışında fibroblast ve kalp kası hücreleri arasında bulunmaktadır. 59 ZO -3 ise 130 kda ağırlığında bir protein olup, ZO 2 gibi ZO 1 ile birlikte immüno çökeltici olarak tanımlanmıştır. 10 ZO 2 ve ZO-3 ayrıca sıkı bağlantı ve ara bağlantı proteinleri; okludin, klaudin, kingulin, 59, 58, 116 α katenin, aktin ile ilişkidedir. Sıkı bağlantı birimleri dinamik yapılardır. Fizyolojik ve patolojik dış uyarılara karşı belirgin değişiklikler gösterirler. Bir araya gelip sıkıca kenetlenirken sıcaklığa, kalsiyum yoğunluğuna, hücre zarı lipit içeriği değişikliklerine, ortamda bulunan sıvıdaki belli katyonların varlığına duyarlıdır. 1,19-2 -

10 Bağlantı birimlerinden oluklu bağlantı ( gap junction, nekzus), epitel hücrelerinin çoğunda komşu hücre zarının birbirine çok yakın (2-3nm) olduğu konumda bulunması ile özelleşmiştir. Oluklu bağlantı birçok epitel dokusunda hücrelerarası alana materyal geçişi olmaksızın, hücrelerin karşılıklı iletişimine olanak veren yapılardır. Hücrelerarası iletişimi sağlayan bu uzantılar karşılıklı olarak hücre zarından 1,5nm çıkıntı oluştururlar. Her bir çıkıntı hücre zarının çift sıralı lipid tabakası boyunca uzanan 6 adet moleküler ağırlığında polipeptid olan protein alt birimlerinden oluşmaktadır. Oluklu bağlantının alt yapısını oluşturan bu proteinlere konneksin denir ve 6 adet konneksinin bir araya gelerek oluşturdukları hücre çıkıntısı ise konnekson olarak tanımlanır. Komşu hücre zarlarındaki konneksonlar iki hücre arasında 1,5-2nm çapında bir iletişim kanalı oluşturacak şekilde karşılıklı yer alırlar. Hidrofilik özellikte olan bu kanal, hücreler arasında, moleküler ağırlığı 1500 ün altındaki moleküllerin özellikle siklik AMP, Ca +2 ve bazı hormonların geçişini sağlar. 36, 24, 48 Oluklu bağlantının alt yapı birimleri olan konneksinler, sıklıkla omurgalılarda görülen, geniş protein ailesidir. Doku veya hücre tipine özel olarak açığa çıktıkları gibi bazı konneksinler örnek olarak Konneksin 32 ve Konneksin 43 bir çok hücre tipinde görülmektedir. Özellikle Konnekin 43 ( GJA1 olarak ta isimlendirilir) memelilerde en geniş ölçüde açığa çıkan ve en yoğun görülen oluklu bağlantı proteinidir. 83 Hormonlar epitelyal geçirgenliği etkileyen en önemli moleküllerdir. Buna örnek olarak; meme bez epitel hücrelerinde, laktasyon sırasında kortikosteronların ve plasental laktojen ya da prolaktinden birinin sıkı bağlantı birimlerini güçlendirirken buna karşın progesteron hormonunun ise sıkı bağlantı birimlerinin etkisini azalttığı gösterilmiştir. 80 Uterus da işlevi hormonal uyarımlarca düzenlenen bir organdır. Menstruel döngü sırasında serum steroid hormon düzeylerindeki döngüsel değişime karşıt olarak uterus ta belirgin yapısal değişiklikler olaylanır. 88 Dişi kemiricilerde menstruel döngü dört evreden oluşur. Bunlar proöstrus, östrus, metaöstrus ve diöstrus evreleridir. Metaöstrus, diöstrus ve proöstrus evrelerinde, uterus yüzey epitelinde hücre çoğalması olur. Bu çoğalma metaöstrus, diöstrus evrelerinde bez hücre artışı ile birlikte izlenir. Östrus evresinde ise yüzey ve bez epitelinde apopitotik gösterge artar ve yüksek düzeyde hücre ölümü görülür. 81,70,71,72 Menstruel döngüde ovaryum hormonları sıkı bağlantı birimlerinin boyutlarında ve oluklu bağlantı birimlerinin ( gap junction) sayısı ve boyutlarında da değişikliğe neden olur. Örneğin sıçanlarda uterus epitelindeki sıkı bağlantı birimleri, implantasyon günü ile uyumlu gebeliğin beşinci gününde, birinci güne karşın üç kat olarak enine uzamış ve birbirine bağlanmışlardır. Yine örnek olarak insanlarda da uterus epitelindeki oluklu bağlantı birimleri menstrüel döngünün geç proliferasyon 110, 18 evresinde sayı ve boyut olarak artmaktadır

11 Hormonsal değişikliklerin uterus epiteli sıkı bağlantı birimlerine etkisini gözlemleyebilmek gereğiyle bu çalışmada farklı menstrüel döngü evrelerinde sıkı bağlantı birimlerini oluşturan proteinlerden Klaudin 5 ve 7, Zonula okludens 1, JAM-1 dağılımlarının ve oluklu bağlantı (gap junction) proteini Konneksin 43 dağılımının immünohistokimyasal olarak belirlemek amaçlandı

12 II - GENEL BİLGİLER 1. Uterus un Gelişimi Genital sistem mezoderm kökenlidir. Dişi ve erkek embriyoda mezonefrik ve paramezonefrik kanallar olarak iki çift genital kanal bulunur. Paramezonefrik kanal, ürogenital kabarıklığın ön yan yüzeyindeki kölom epitelinin uzunlamasına bir girintisi halinde belirir. Kanal kranial uçtan kölom boşluğu içine huni şeklinde bir yapıyla açılır. Önce mezonefrik kanalın lateralinde uzanır ve onu çaprazladıktan sonra kaudomedial yönde ilerler. Orta hatta diğer paramezonefrik kanala aksi yönden yaklaşır. Başlangıçta bir septumla ayrılmış olan bu iki kanal, daha sonra birleşerek uterus kanalını oluştururlar. Birleşmiş olan kanalların kaudal ucu, ürogenital sinus un arka duvarına doğru ilerleyerek paramezonefrik yada Müller tüberkülü denilen küçük bir şişkinliği yapar. 93 Mezonefrik kanallar Müller tüberkül ünün her iki yanından ürogenital sinus a açılırlar. Dişi embriyolarda, mezonefrik kanallar testesteron yokluğu nedeniyle gerilerken, paramezonefrik kanallar, antimüllerian hormon (müller baskılayıcı) yokluğu nedeniyle dişiliğe farklanırlar. 93 Paramezonefrik kanallar dişide esas genital kanalları oluştururlar. Başlangıçta her bir kanalda üç bölüm gözlemlenir: 1- Kölom boşluğuna açılan kranial vertikal bölüm 2- Mezonefrik kanalları çaprazlayan horizontal bölüm 3- Karşı taraftaki eşiyle birleşen kaudal vertikal bölüm. Ovaryumların inmesiyle paramezonefrik kanalların ilk iki bölümünden tuba uterina lar gelişir. Kaudal bölümler de uterus u oluşturmak üzere kaynaşırlar. Başlangıçta birleşen bu kanallardan oluşan dikey septum daha sonra dejenere olarak ortadan kalkar. Paramezonefrik kanalın ikinci bölümü mediakaudal yönde hareket ettiğinde, ürogenital 77, 93 şişkinlikler giderek daha transvers bir düzleme gelmeye başlar. Kanallar orta hatta birleştikten sonra, geniş bir transvers pelvik katlantı oluşur. Kaynaşmış haldeki paramezonefrik kanalların lateralinden pelvis duvarına kadar uzanan bu katlantıya ligamentum latum uteri denir. Bu ligamentin üst sınırında tuba uterinalar, arka yüzünde de ovaryumlar yer alır. Uterovaginal taslaktan uterus un fundus, korpus, isthmus ve endometriyum epiteli ile bezleri gelişir. Endometriyum stroması ve myometriyum komşu splanknik mezodermden köken alır

13 Uterus un farklı yapılarının gelişmesi 3. trimesterde olaylanır. Temel yapı 1. trimesterin sonunda oluşur. Bezlerin ve kas tabakasının başlangıç oluşumu gebeliğin ortalarında gözlenir. 93, - 6 -

14 2. Uterus un Anatomisi Uterus, (dölyatağı, rahim) pelvis boşluğunda, vücut orta düzleminde, rektum ile mesane (sidik kesesi) arasında, vajina nın (dölyolu) üstünde kalın duvarlı kassal organdır. İçi boş (cavitas uteri) organdır. 52 Uterus un üst yan taraflarından tuba uterina denilen iki boru uzanır. Alt tarafında uterus boşluğu vajina ile birleşir. Yaklaşık olarak 7 9 cm. uzunluğunda, 5 cm. enindedir. Duvar kalınlığı ise 2,5 cm. kadardır. Uterus un üzerinde incebağırsak kıvrımları bulunur. Uterus alt ön tarafta mesane ile komşudur. Gebelik dışında; mesane nin arka üst tarafında, hafif öne eğik durur. Gebelikte büyür ayrıca, şekil ve duruş yönünden değişiklikler gösterir. 94 Anatomik olarak uterus üç bölümdür: 1) Gövde (corpus uteri), 2)Fundus ( fundus uteri), 3) Boyun(cervix uteri). Gövde, uterus un geniş 2/3 üst kısmıdır. Burasının ön yüzü düz, arka yüzü konvekstir. Tuba uterina ların uterus a bağlandıkları yerlerin üstünde kalan kısım ise fundus uteri adını alır. Tüplerin çıktıkları kısımlara da cornu uteri denir. Serviks altta devam eden dar kısımdır. Serviks, korpus tan istmus uteri denilen daralan parça ayırır. 88 Serviks in vajina içine doğru uzamış parçasına porsiyo vaginalis (portio vaginalis cervicis) denir. 28 Servikal kanalın ( canalis cervicis uteri) vagina ya açılan deliğine 52, 28 ostium uteri denir. Uterus, bağlarla (ligamentum, lig.) çevre duvara bağlanır. Bu şekilde duruş ve tutunma sağlanır. Bu bağlar lig. transversium cervicis, lig. pubocervicale, lig. teres uteri ve lig. rectouterinum dur. Bağlar bağ 52, 53 dokusundan yapılmışlardır. Uterus a, arteria iliaca communis ten ayrılan arteria iliaca interna nın dalları olan arteria uterina gelir ve organı besler. Arteria iliaca communis ise aorta abdominalis in iki ana dalından (sağ ve sol) birisidir. Bu arterler organ üzerinde kırımlı uzanırlar ve aralarında bol anastomoz 94, 98 yaparlar. Uterus un venleri kalındır. Arterleri izleyerek uzanırlar. Cervix uteri nin yan taraflarında pleksus venosus uterus denilen ven ağını oluştururlar. Ağdan çıkan venler ise venea uterinae denilen venlerle vena 88, 94 iliaca interna ya açılırlar

15 Uterus un lenf damarları ovarium a ait lenf damarlarıyla birlikte nodi lymphatici aortici ye açılır. Bazıları ise nodi lymphatici iliaca 94, 98 externi ve nodi lymphatici inguinales superficiales e açılmaktadır. Uterus un sinirleri plexus hypogastricus inferior (plexus pelvicus) dan ve büyük miktarda plexus uterovaginalis in ön ve orta bölümlerinden gelir. Parasempatik ve sempatik sinirler bu pleksuslardan 94, 98 gelmektedir

16 3- Uterus un Histolojisi Uterus duvarı dıştan içe perimetriyum, myometriyum ve endometriyum olarak üç katmandan oluşur. Perimetriyum, (tunica seroza) mezotel ve altındaki ince gevşek bağ dokusundan oluşur. Periton un visseral yaprağıdır. Bu dış kat peritonsuz bölgede tunika adventisya olarak tanımlanır. Perimetriyum 28, 88 arka yüzün tümünü ön yüzün ise sadece bir kısmını, örter. Myometriyum, uterus un en kalın katıdır. Birbirinden kolay ayırt edilemeyen üç düz kas katından oluşur ve endometriyum la birlikte döngüsel değişim gösterir. İç kas katı, mukozanın altında uzunlamasına ince düz kas katıdır. Myometriyum un orta kas katmanı büyük arterler, venöz pleksuslar ve lenf damarları içerir. Enlemesine ve uzunlamasına uzanan düz kaslardan yapılıdır. Dış kas katı ise uzunlamasına uzanan düz kaslardan oluşur. 61 Myometriyum, fundus ve korpus un orta bölümlerinde daha kalın, tuba uterina nın (pars intramuralis tuba uterina) açıldığı yerde ise daha incedir. 94 Gebelikte, miyometrium büyüme evresine girer. Hipertrofi ( hücre büyüklüğünün artması) ve hiperplazi ( hücrelerin sayısında artış) gösterir. Bu evrede düz kas hücreleri protein salgılayan ve aktif kollajen 61, sentezleyen hücrelerin ince yapı özelliklerini gösterirler. Gebelik sırasında östrojen hormonunun fazla salınmasıyla kas hücrelerinde büyüme görülürken, menstrüasyon başlaması ve östrojen hormonunun azalmasıyla kas hücrelerinde bir küçülme izlenir. 100 Gebelik sonrasında, bazı düz kas hücrelerinde harabiyet, diğerlerinin boyutlarında azalma ve kollajenin enzimatik yıkımıyla uterus un boyutları gebelik öncesindekine yakın boyutlara iner. 61, Endometriyum (tunica mukoza), uterus un en iç katmanıdır. Epitel ve lamina propria katlarından oluşur. Epitel tek katlı prizmatiktir ve iki tip hücre izlenir. Bunlar silyalı hücreler ve mikrovilluslu salgı yapan hücrelerdir. Yüzey epitel hücreleri miyometriyum a kadar lamina propria içine doğru basit tüp benzeri çöküntüler yaparak uterus bezlerini oluşturur. 28,37 Bez hücreleri yüzey epitel hücrelerine benzemesine karşın silyalı hücreler çok azdır. Genelde tek katlı prizmatik salgı yapan hücrelerden oluşurlar. Bezler bazan dallı tubuler yapı gösterirler. 28 Lamina propria yoğun, düzensiz kollajen lifler içeren bol hücreli gevşek bağ dokusudur (Texus connectivus cellulosus). Lamina propria iğ biçimli bağ dokusu hücreleri, makrofajlar, lökositler ve çok sayıda retiküler lifler içerir. Mensturasyon sırasındaki morfolojik ve fizyolojik değişiklikler, hormonlarca denetlenir

17 Endometriyum iki katmandan oluşur. Miyometriyum a komşu olan, endometriyum un 1/3 derin kısmını oluşturan ve uterus bezlerinin son kısımlarını içeren bölgeye endometriyum bazalis (str. basale endometriale) denir. 28 Bu katman mensturasyon sırasında yapısal değişime uğramaz, fonksiyonel katmanın yenilenmesi için kaynak oluşturur. 88 Endometriyum un 2 /3 yüzeyel bölgesinde ise bezlerin boyun ve gövde bölümleri bulunur. Mensturasyon esas olarak burada olaylanır. Buraya endometriyum fonksiyonalis (str. functionale endometriale) denir. Gebelik ve döngünün sekresyon evresinde iki katmandan oluşur. Bezlerin daralıp kapanmış boyun bölgelerini içeren 2/3 yüzeyel bölümü yoğun yapıdadır ve (str. compactum endometriale) kompakt tabaka ismini alır. Alt bölüm ise genişlemiş, salgıyla dolu bezler nedeniyle süngerimsi yapıdadır ve spongiöz tabaka (str.spongiosum endometriale) olarak bilinir. Fonksiyonal tabaka mensturasyon sırasında dejenere ve prolifere olan katmandır. 28,88 Fonksiyonel tabaka bezlerinde epitel kökenli dört tip hücre bulunur. Bunlar; proliferatif hücreler, salgı oluşturan hücreler, silyalı hücreler, ve bazal hücrelerdir. 1 Proliferatif ve bazal hücrelerin çekirdek kromatinleri yoğundur ve belirsiz bir çekirdekçik içerirler. Sitoplazmaları bazofiliktir. Proliferasyon evresinde hücre sayısı artar ve çekirdeklerin çokluğu nedeniyle bez epitelinde yalancı çok katlı epitel görünümü oluşur. 100 Salgı hücre sitoplazmaları müsinöz olmayan salgı içerir. Salgı önce çekirdek altı sitoplazmada birikir. Bu hücreler vakuollü, vakuolsüz ve tuba uterina hücrelerine benzer hücreler olarak üç farklı yapıdadır. Vakuolsüz hücrelerin çekirdekleri yuvarlaktır. Kromatin kapsamları homojen dağılmıştır. Çekirdekçikleri belirgin, sitoplazmaları eozinofiliktir. Vakuollü hücrelerin çekirdekleri ise proliferatif hücrelerinkine 29, 100 benzer. Silyalı hücreler proliferasyon evresinde daha belirgindir. Genç silyalı hücreler bazal laminaya yakın piramit şekillidir. Sitoplazmaları şeffaf açık renktedir. Salgılama evresinde ince yapı düzeyinde dev mitokondriyonlar ve çekirdeklerinde kanal sistemi tanımlanmıştır. 100 Endometriyum özel bir kan damar sistemi içerir. Miyometriyum un orta bölümlerinde dairesel olarak yerleşmiş arkuat arterlerden iki dal endometriyuma doğru dik açılarla ışınsal ilerler. Bu ışınsal (radiyal) arterler endometriyum bazalisteki kısa düz arterleri oluştururlar. Üst kısımlara doğru ilerleyen bu arterler spiral arterleri yaparlar. Spiral arterler, fonksiyonalis katmanının daha üst kısımlarında incelerek arteriol ve kapillere dönüşürler. 88 Kapiller ağı yüzey epitelinin hemen altındadır. Spiral arterler zengin bir kapiller ağı oluşturarak fonksiyonalis katmanının bezlerini ve bağ dokusunu beslerler. Bu arterler hormonlara duyarlıdır. 100 Düz arterler sadece bazalis katmanını besler ve hormonlara duyarsızdır. Kapiller yatak, laküna denilen ince duvarlı genişlemiş bölgeler içerir. Lakünalar, endometriyum un venöz sisteminde de bulunabilir

18 Endometriyum un tümünde ince duvarlı venlerden ve sinuzoidlerden oluşan bir ağ bulunur. Uterus un venöz sistemi arterlerine eşlik eder. Uterus ta, korpus ve servikste lenf damarları vardır. Endometriyum un lenf damarları fonksiyonal katmanın bezleriyle yakın komşuluktadır. Mukoza ve kas katmanlarında, korpus ve serviks lenf damarları arasında anastomozlar bulunur. Miyometriyum da lenf damarları serozal yüzeye gidildikçe artar. Seroza nın altında özellikle uterus un arka ve daha az oranda ön duvarında lenfatik pleksus oluştururlar. 88,30,100 Endometriyum, yeni doğanda genellikle proliferasyon evresindeki yapıdadır. Doğumdan sonra iki hafta içinde bu yapıda gerileme gözlemlenir. Kanama (menarş) öncesinde endometriyum incedir ve aktif olmayan bezler kapsar. 100 Puberteden önce endometriyum tek katlı alçak boylu kübik epitelle döşelidir. Bu epitel zayıf bir stroma ile desteklenir. Epitel stromaya doğru çöken az sayıda tubüler bez içerir. Kanama ve menopoz arasında, endometriyum tek katlı prizmatik epitel ve altındaki lamina propria'dan oluşur. 101 Endometriyum un her bölgesi hormonlara karşı aynı duyarlılığı göstermez. Tuba uterina ların başladığı bölgeler ve endometriyum fonksiyonalis in servikse yakın olan bölgesi, proliferasyon ve sekresyon erkini az gösterirler. 100 Menopozda endometriyum puberte öncesi yapısına döner. Bezler genişleme gösterip stroma sıkılaşır. 101 Kanama sonrasında ise endometriyum bazalis'in bezleri ve bağ dokusu yapıları östrojenin etkisiyle çoğalıp fonksiyonalis katmanını yeniler. Endometrium bazalis te dökülme görülmez. 101,100 Endometriyum un lamina propria sı düzensiz sıkı bağ dokusudur. Retiküler liflerden ve bağ doku hücrelerinden zengindir. 37 Hücrelerarası madde çoktur. Proliferasyon ve sekresyon evresinde glikozaminoglikanlar fazladır. 100 Endometriyum daki stromal hücrelerin yapısı döngüyle değişiklik gösterir. Proliferasyon evresinin başlangıcında ince, belirsiz sitoplazmaları, iğ biçimli çekirdekleri vardır. Daha ileri evrelerde stroma hücreleri uzar ve sitoplazmaların kapsamları artar. Proliferasyon evresinin sonlarında sekresyon evresinin başında granüllü endoplazmik retikulum tubulusları artar. Sekresyon evresinin sonunda ise damarların çevresinde stroma hücreleri yuvarlak, bol sitoplazmalıdır ve çekirdekleri belirgin hale gelir. Sekresyon evresinin geç dönemlerinde stromada granülositler ve nötrofiller bulunur. Bunlar menstruasyon öncesinde ve menstruasyon sırasında da gözlemlenirler. Stromada bulunan diğer bir tip hücre de stroma köpük hücreleridir. Bunlar lipid içeren bol vakuollü sitoplazmaları olan ve östrojen ile uyarılan hücrelerdir. Stromadaki lenfositler de folliküller oluşturabilirler. Bunlar genellikle bazal katmanda izlenirler. 100 Erginlik çağındaki kadınlarda endometriyum 28 günlük ovarial döngüye koşut olarak periyodik değişmeler gösterir. Buna menstrual ya da uterinal döngü denir. Menstrual döngü yaşlarında başlar, yaşlara değin sürer

19 Endometriyum ortalama 28 günde 3 evresel değişiklik gösterir. Proliferatif evre; folliküler evre olarak da bilinir. Ovaryum folliküllerinin gelişmesiyle eş zamanlı olarak olaylanır. Kanamadan sonra 4 14 günler arasındaki yapısal değişimleri içerir. Proliferatif evrede hücresel çoğalmanın artmasıyla endometriyum yüzey ve bez epiteli yenilenir. 37 Bağ dokusu ve spiral arterler yeniden oluşur. Bu evrede fonksiyonel kat 2 3 milimetreye kadar kalınlaşır. Epitel ve stroma hücreleri mitozla çoğalır. Bezler düzdür, henüz kıvrılmamış ve lümenleri dardır. Ancak glikojen birikimi başlamıştır. Hücreler iri, yoğun kromatinli çekirdek kapsar. 37 Yenilenen spiral arterler fazla kıvrımlı değildirler ve fonksiyonalis katmanının yüzeye doğru 2/3 üne erişirler. Östrojen hormonunun etkisiyle bezler kıvrılır ve lümenleri genişler. 14. günde endometriyum tümüyle yenilenmiştir. 37. Proliferatif evre ovulasyondan bir gün sonraya değin sürer. Bu evrenin sonunda endometriyum 3 mm. kalınlığa ulaşır. Epitel hücrelerinin bazal sitoplazmalarında glikojen birikimi belirgindir. Bu alışılmış histolojik kesitlerde hücrelerin bazal kısımlarında boşluklar şeklinde belirgindir. Sekresyon (luteal) evresi ovulasyondan hemen sonra başlar ve 28. güne değin sürer. Korpus luteumdan salgılanan progesteron hormonunun etkisinde olaylanır. Bu evrede endometriyum kalınlaşmayı sürdürür, bu kalınlaşma epitel hücrelerinin depoladıkları glikojen nedeniyle oluşan hipertrofiden, damarlanmanın artmasından ve ödemden kaynaklanır. 88 İlk saat sekresyon evresinin yapısal olarak durgun dönemidir. Bez hücrelerinin çoğunluğunda vakuoller çekirdek altı sitoplazmadadır. İleri günlerde vakuoller çekirdek üstü bölgeye geçer. 37 Ovulasyon sonrası 5 9. günler orta sekresyon evresidir. Stroma içinde kıvrımlanmış, dallanmış ve genişlemiş lumenleri salgıyla dolu bezlerle özelleşmiştir. Salgı ürünleri bez epitel hücrelerinin bazalinde birikmeye başlar ve apikale doğru birikimi sürdürür ve lümene atılırlar. 37 Salgı apokrin salgılama şeklindedir. Karbonhidratlardan zengindir günde spiral arterler tüm fonksiyonalis katmanını kaplar. Bezlerin salgı erkleri düzensiz hale gelirler. 30 Ovulasyondan sonra günler geç sekresyon evresidir. Spiral arterler belirginleşir. Ovulasyondan sonra döllenme gerçekleşmişse, depolama ve aktif salgılama gibi olaylar sürer. Endometriyum, desidua halini alır. Döllenme olmazsa sekresyon evresinin sonunda korpus luteum un işlevi azalır. Progesteron ve östrojen salgısı da azalır ve nekroz başlar günler mestruasyon evresidir. Bu evrede endometriyum 0,5 3 mm kalınlığındadır. Bezler kısadır. Yüzey epiteli gözlenmez. Hücrelerarası sıvının çekilmesi nedeniyle fonksiyonalis katmanı incelmiştir

20 Kanamanın başlamasından iki gün önce fonksiyonalis katmanındaki spiral arterler aralıklı olarak kasılmaya başlar. Endometriyum kanlanması azalır. 2 gün sonra kalıcı olarak kasılırlar ve fonksiyonalis katmanının oksijen kapsamı azalır. Bu durum, bezlerin işlevlerini yitirmesine, lökositlerin artmasına, iskemi ve nekroza yol açar. 37 Hemen ardından spiral arterler yeniden genişlemelerine karşın yapıları bozulduğundan parçalanırlar. 37 Endometriyum içinde kanama olur. Bu kanama arterlerin açılış sıklığına göre şiddetli ya da yavaştır. Kan bez lümenine birikir. Nekrotik endometriyum fonksiyonalis parçalanır. 37 Kan ve endometrium fonksiyonalis katmanının parçaları atılır. 88 Menstruasyon evresi öncesi ve süresinde bazalis katmanı kendi düz arterlerinden beslenmeyi sürdürür. Buradaki bezlerin bazal hücreleri çoğalır ve yeni oluşan hücreler yüzeye doğru göç ederler. Bu katmanın endotel ve stroma hücreleri de çoğalır. Stromadaki hücrelerden kollajen lifler ve ara madde salgılanır. Bu döneme rejenerasyon ya da yenilenme evresi de denir. Bundan sonra yeni döngünün proliferasyon evresi başlar

21 4. Sıçanlarda Menstrüel Döngü Evreleri ve Özellikleri Sıçanlar puberte başlangıcından yaşlılığa değin döngüsel aktivite gösteren ve mevsime bağlı olmayan poliöstrik yani üreme dönemi boyunca birden fazla kızgınlık evresi görülen hayvanlardır. Puberte ile birlikte gözlenen ilk menstrüel döngü dört gün kadar sürer ve yaşlandıkça bu süre giderek uzayarak hayatın son dönemlerinde altı günü bulur. 81 Sıçanların menstrüel döngüsü 14 günde bir 4 5 gün sürmektedir. Menstrüel döngü proöstrus, östrus, metaöstrus ve diöstrus olarak dört evreden oluşur. Proöstrus evresi 12 saat, östrus evresi saat, metaöstrus evresi 21 saat, diöstrus evresi de 57 saat sürer. 81 Proöstrus evresinde; Lüteinleştirici hormon ve östradiol en üst düzeye ulaşır. Östradiol, evrenin başlangıcında en düşük düzeydeyken, evrenin ortalarına doğru en yüksektir. Östrus evresine geçerken östradiol düzeylerinde hafif bir azalma olur. Follikül uyarıcı hormonda da yavaş bir artış görülür. 81 Östrus evresinde; Lüteinleştirici hormon en düşük düzeydedir. Follikül uyarıcı hormon en yüksek değerine ulaşır. Östradiol düzeyi düşmeyi sürdürür ve bu evrenin ortalarına doğru en alt düzeydedir. Progesteron düzeyinde de artma olur. Östrus un sonuna doğru ovülasyon gerçekleşir 81. Diöstrus evresinde; Lüteinleştirici hormon ve follikül uyaran hormon düzeyleri düşüktür. Bu evrede östradiol düzeyinde de azalma sürer, proöstrus dönemine doğru en düşük düzeye ulaşır. 81 Sıçanlarda, vajinal sitoloji kaba ancak güvenilir bir dolaylı östrojen tayin yöntemidir. Östrojen vajinal duvarda kalınlaşmaya, kan desteğinden yoksun kalan hücrelerde dökülmeğe yol açar. Vajina epiteli, proöstrus evresinde 2 8, östrus ta 7 11, metaöstrus ta 5 9, diöstrus ta 10 hücre katı içermektedir. Vajinal kesitlerde bazalden lümene doğru hücre dizilimi; bazal, parabazal, ara (intermediyer) ve yüzeyel (süperfisiyal) hücreler olarak dizilim göstermektedir. 81,76 Bazal hücreler; küçük, uzamış mikron büyüklükte, yuvarlak ya da hafif oval şekillidir. Çekirdekleri büyüktür. Parabazal hücreler; mikron büyüklükte yuvarlak veya hafifçe yuvarlak hücrelerdir. Çekirdekleri büyük, veziküler olup hücre ortasında yerleşiktir. Bazal ve parabazal hücrelerde çekirdek koyu maviye boyanırken sitoplazma çekirdeğe göre soluk mavi renktedir. 81,76 Ara kat hücreleri; mikron gibi değişken boyutlardadır. Büyük ve küçük ara hücreler olmak üzere ikiye ayrılır. Küçük intermediyer hücreler, mikron boyutlarında, kısmen yuvarlak ya da çoğunlukla oval şekillidir. Çekirdeği geniş ve belirgin olup daha az bazofiliktir ve parabazal hücrelerin çekirdeğinden küçüktür. Sitoplazması açık mavi renkte boyanır. 81,

22 Büyük ara hücreler, mikron boyutlarında, köşeli, kıvrımlı ya da dış sınırları düzenlidir. Çekirdeği de yuvarlak ve veziküler olup yine parabazal hücrenin çekirdeğinden küçüktür. Çekirdek boyutları hücrenin kendi büyüklüğüne göre normal ölçüdedir. Sitoplazmaları daha soluk, açık mavi tonlara boyanmaktadır. Aktif çekirdek ise turuncu mor arası boyanır. 81,76 Yüzeyel hücreler; vajinal sitolojide en büyük hücrelerdir. Boyutları mikrondur. Çok köşeli ve belirgin biçimde düz, bazen de kenarları kıvrılmış olarak düzensiz şekillidir. Çekirdekleri küçük, piknotik ve aşırı solgundur. Hücrelerin sitoplazması mavi ve turuncu boyanabilir. Sitoplazmik boyanın yoğunluğu hücrenin kornifikasyon ya da dejenerasyon derecesine göre değişim gösterir. Belirgin koyu piknotik çekirdekli veya solgun boya alan çekirdek ile normal hafif solgun mavi hücreler kısmi kornifiye hücre sınıflandırılmasına, çekirdeksiz, koyu mavi hücreler ile belirsiz ve yoğun çekirdekli koyu mavi ve yassılmış hücreler tümüyle kornifiye hücre sınıflandırılmasına girmektedir. Kornifiye hücreler, boyayı absorbe etmede başarısız, yaşlı keratinize hücrelerdir. 81,76 Menstrüel döngüde proöstrus başlangıcında, vajinal sitolojide, en baskın hücre tipi ara hücredir, bazal, parabazal ve yüzeyel hücreler az sayıdadır. Bu evrenin sonuna doğru yüzeyel hücrelerde artış olur. Östrus evresinde kornifiye olmuş hücrelerde (yüzeyel hücreler) ve lökositlerde artış olur. Başlangıçta az sayıda görülen parabazal ve bazal hücreler evrenin ortalarına doğru kaybolur. Metaöstrus evresinde yüzeyel hücrelerde azalma görülürken bazal ve parabazal hücrelerde artış gözlemlenir. Ayrıca parçalı çekirdekli lökositler de artış olur. 81,76 Ovaryum steroidlerinin yarattığı etkinin hızla düşmesi nedeni ile epitel hücre topluluğu parabazal ve bazal hücrelere dönüşür. Parabazal ve bazal hücreler diöstrus evresinde de yoğundur. Ara hücrelerde azdır. Alınan smearda mukus yoğunluğu ve lökositler izlenir. Gebelik ya da yalancı gebelik sırasında lökosit artışı tipiktir. 81,76 Sıçanlarda vajinal smear ların incelenmesi amacıyla çeşitli hızlı boyama yöntemleri geliştirilmiştir. Hızlı boyama yöntemlerinde, döngüsel evreye bağlı olarak gelişen hormonal değişimlerin, preparata renk özelliği olarak yeterince yansımaması, hücre sitoplazması ve çekirdeğinin yeterince boya almaması gibi olumsuzluklar belirtilmiştir. Bugün vajinal smear boyamasında Toluidin mavisi ve Papanicolau boyama yöntemleri kullanılmaktadır. 81 Toluidin mavisi boyama yöntemi ile preparat 5 dakika gibi kısa sürede boyanabilmektedir. Ancak, söz konusu boyama yöntemi ile hazırlanmış preparatlarda, hücre çekirdeği, sitoplazma ve zarın yeterince boya almadığı, hücre tiplerinin çok iyi seçilemediği ve ayrıca tanı açısından önemi olan asidofili ve bazofili ayırımı yapılamadığı gözlenmiştir

23 Papanicolaou boyama yönteminde süre, Toluidin mavisi boyama yönteminin aksine dakika sürmektedir. Ancak Papanicolaou boyama yöntemi ile hücre çekirdeğinin boyanması, sitoplazmanın boya alması daha iyi olmaktadır. Mentsrüel döngü evrelerinin ayırt edilmesinde önemli olan bu özelliklerin daha iyi seçilebildiği saptanmıştır. Bu boyama şeklinin ayrı bir olumlu yönü de hücrelerin, östrus evresine yaklaştıkça asidofilik, östrus un bitimiyle birlikte bazofilik renk almasının saptanabilmesidir. 81 Toulidin mavisi boyama yöntemi ile yalnız menstrüel döngü evreleri saptanırken, Papanicalou boyama yöntemi ile, asidofilik indeks ve keratinazasyon oranının belirlenmesine dayanılarak, proöstrus, östrus ve metaöstrus evrelerinin erken ve geç dönemleri de ayrılabilmiştir

24 III. GEREÇ ve YÖNTEM 1. Gereç Bu çalışmada Gazi Üniversitesi Laboratuar Hayvanları Yetiştirme ve Deneysel Araştırma Merkezi nden sağlanan farklı 4 menstrüel evrede bulunan ve her evreden de 4 adet olmak üzere toplam 16 Wistar albino cinsi dişi sıçan kullanıldı. Sıçanların menstrüel evreleri; proöstrus, östrus, metaöstrus ve diöstrus olarak belirlendi. Sıçanların menstrüel evreleri vajinal smear alınıp izlenerek Papanicolaou boyama yöntemiyle ayırt edildi. Çalışma için seçilen dişi sıçanların, ortalama ağırlıkları gramdı ve puberte gelişimlerini tamamlamışlardı. Sıçanların bulunduğu kafeslerde altlık materyali olarak ince saman kullanıldı. Bakım odasında ısı C ve ışık/zaman ayarı 14/10 saat olarak belirlendi. Sıçanlar intraperitoneal ketamin (44mg/kg) ve xylazine (5mg/kg) enjeksiyon ile uyutularak ötenazi gerçekleştirildi. Ötenazi sonrası deneklerin karın bölgeleri açılarak uterusları çıkarıldı. 2. Yöntem Dişi sıçanlar tek tek kafeslere konularak döngüsel izlemeye alındı. İzlenen sıçanlardan 6-12 saat aralıklarla vaginal smear alınıp, Papanicolaou boyama yöntemi kullanılarak sıçanın hangi menstrüal evrede olduğu saptandı. Smear alınırken sıçan kuyruk ve kuyruk kökünden sabitlenip kaldırılarak kafası aşağıya gelecek şekilde tutuldu, vagina % 0,2 lik serum fizyolojik ile yıkandıktan sonra cam baget ile smear alındı. Alınan smear örnekleri lam üzerine yayılarak, Papanicolaou boyama yöntemi için sıvı fiksasyona tabi tutulduktan sonra boyama yapıldı. Papanicolaou Boyama Yöntemi Lam üzerine yayılarak hazırlanan smear örnekleri %95 etil alkol solüsyonu (1/1) içerisinde 20 dakika tespit edildi. Aynı örnek sırayla %80, %70, %50 lik etil alkol içerisine daldırıldı, ardından distile su ile yıkandı

25 Bu işlemden sonra Hemotoxylin boyama solüsyonunda 8 dakika bekletilip distile su dolu iki şaleden geçirildi. Örnek %0,91 lik amonyak (3ml) ve %70 lik alkol (97ml) şeklinde hazırlanan karışım içinde 8 dakika bekletilip sırasıyla %70, %80, %96 lık ethanol içersine daldırılarak yıkandı. Orange G boyama solüsyonu ile 6 dakika boyandıktan sonra % 96 lık etil alkol dolu iki şaleden geçirilerek Polychrom solüsyonunda 6 dakika bekletildi. Daha sonra %86 lık etil alkol dolu iki ayrı şaleden geçirildi. Absolu alkolde yıkandıktan sonra son olarak xylolde bekletilen dokular daha sonra havada kurutularak ışık mikroskobunda incelendi. Vajinal sitolojik veriler Schaberg (1992) nin döngüsel değişimlerine bağlı olarak elde ettiği bulgular doğrultusunda değerlendirildi. Işık Mikroskobik Yöntem Menstrüel evreleri belirlenerek çıkarılan uterus doku örnekleri %10 luk nötral formalin içerisinde 72 saat tespit edildi. Tespit sonrası dokular akar suda 24 saat yıkanarak tespit maddesi dokudan uzaklaştırıldı. Bu işlemden sonra dokular sırayla % 50, % 60, % 70, % 80, % 90 lik etil alkol içerisinde 1 er saat bekletildi. Son aşamada %99.9 absolü alkolde iki kez 1 er saat bekletilerek dokuların sudan kurtarılması ( dehidratasyon) sağlandı. Dokular % 99,9 absolü alkol sedir yağı solüsyonu (1/1) içerisinde 1 saat bekletildikten sonra bir gece sedir yağı içerisine bırakıldılar. Sonrasında üç ayrı şalede bulunan ksilol içerisinde 10 ar dakika bekletilen dokular daha sonra ksilol parafin solüsyonunda (1/1) 1 saat bırakıldılar. Yumuşak parafinde 1 saat, yumuşak- sert parafinde 2 saat, sert parafinde 3 saat bekletildikten sonra dokular parafin bloklama kalıpları içerisine gömülerek sert parafin bloklar elde edildi. Hazırlanan bloklardan alınan 5 mikron kalınlığında kesitler polilizinli lama alınarak immünohistokimyasal yöntem uygulanmak üzere bir gece 37 C lik etüvde bekletildiler

26 İmmünhistokimyasal Yöntem Yöntem olarak peroksidaz anti-peroksidaz indirekt immünohistokimyasal yöntem kullanıldı. 37 C de etüvde bir gece bekletilen kesitler iki ayrı şalede bulunan ksilol içerisinde 15 er dakika bekletilerek dokulardan parafin uzaklaştırıldı. Kesitler sırasıyla % 99.9, %96, %80 lik alkol içerisine 10 ar dakika bırakıldıktan sonra iki ayrı şalede bulunan distile su içerisinde 5 er dakika yıkandılar. İşlem sonrasında kesitlerin çevresi immünohistokimya kalemi PAP-Pen ile sınırlandırıldı. Kesitler immünohistokimyasal boyamayı yapmak için üstü kapaklı inkübasyon kamarasına dizildi. Kesitlerin üzerine tamamen örtecek ve kesitlerin kurumasını engelleyecek biçimde ve miktarda iki kez 5 er dakika distile su damlatıldı. Daha sonra kesitlere üç kez 3 er dakika fosfat tamponlu salin (PBS = phosphate buffered saline) damlatıldı. İnkübasyon kamarasında preparatlar arasındaki gazlı bezler sıcak su ile ıslatılarak nemli ortam sağlandıktan sonra doku içerisindeki peroksidaz aktivitesini bloke etmek için %3 lük hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) 10 dakika uygulandı. Kesitler tekrar üç kez 3 er dakika fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandıktan sonra antikor bağlanma bölgesini sabitlemek gereği ile non-immün protein bloklama solüsyonunda (Blocking Solution, Histostain -Plus Kit, HRP, Broad Spectrum, Zymed Laboratories Inc. USA Kat.no: ) 10 dakika bekletildi. Bu süre sonunda kesitler yıkanmadan her bir kesit üzerine farklı primer antikor solüsyonu kesitleri tamamen örtecek şekilde damlatıldı. İnkübasyon kamarasının ağzı kapatılarak oda ısısında 1 saat, + 4 C de bir gece, bekletildi. Primer Antikorlar: ZO 1(H 300) : Rabbit polyclonal Ig G, Santa Cruz Biotechnology Inc. USA Kat. no: Connexin 43 ( H 150) : Rabbit polyclonal Ig G, Santa Cruz Biotechnology Inc. USA Kat. no: 9059 Claudin 5 (H 52) : Rabbit polyclonal Ig G, Santa Cruz Biotechnology Inc. USA Kat. no:

27 Claudin 7 ( C-15) JAM -1 ( H- 80) : Rabbit polyclonal Ig G, Santa Cruz Biotechnology Inc. USA Kat. no: : Rabbit polyclonal Ig G, Santa Cruz Biotechnology Inc. USA Kat. no: Primer antikor uygulamasından sonra kesitler üç kez 3 er dakika fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı. Daha sonra primer antikora spesifik biotinli sekonder antikor ( Broad Spectrum Second Antibody, Histostain - Plus Kit, HRP, Broad Spectrum, Zymed Laboratories Inc. USA Kat.no: ) 10 dakika uygulandı. Sonrasında üç kez 3 er dakika fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanan kesitlere streptavidin - peroksidaz enzimi (HRP-Streptavidin, Histostain - Plus Kit, HRP, Broad Spectrum, Zymed Laboratories Inc. USA Kat. no: ) 10 dakika uygulandıktan ve kesitler üç kez 3 er dakika fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı. İmmünohistokimyasal tepkimeyi görünür hale getirmek üzere kromojen solüsyonu hazırlandı. Kromojen olarak diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAP) 10 dakika uygulandı. Bu işlemler sonucunda peroksidaz, substratı (hidrojen peroksit) katalize ederek kromojeni kahverengi renk katmanına dönüştürdü. Böylece antijenin lokalizasyonu görüldü. Tüm bu işlemler sonrasında kesitler önce üç kez 3 er dakika fosfat tamponlu salin (PBS) ile daha sonra da 5 dakika akarsu altında yıkandı. Dokunun yapısını seçebilmek amacıyla kesitlere zemin boyamasında Mayer s hematoksileni 2 dakika uygulandı. Boyama sonrası kesit önce 5 dakika akarsu altında yıkandı. Sonrasında amonyaklı su içeren şaleye 4-5 kere daldırılıp çıkarılan kesitler yeniden 5 dakika akarsuda yıkandıktan sonra % 96 alkol içeren şaleye 4-5 kere daldırılarak dehitrate olmaları sağlandı. Son olarak havada kurutulan kesitler ksilol ile etkin bırakıldıktan sonra entellan ile kapatıldı. Işık mikroskobik inceleme ve görüntüleme için Leica DM4000 foto ışık mikroskobu ve Qwin İmage Analyzer (Germany) sistemi kullanıldı

28 IV. BULGULAR Diöstrus evresine ait ZO 1 antikor tutulumunun uterus epitelinin apikal hücre zarında ve yan yüz apikal bölgelerinde ortadan kuvvetliye değiştiği buna karşın sitoplazmanın zayıftan ortaya değişen düzeyde boyandığı gözlemlendi (Resim 1A). Bez hücrelerindeki tutulumunda yüzey epitel hücreleri ile aynı olduğu saptandı (Resim 1B). Proöstrus evresinde ZO-1 antikor tutulumunun uterus yüzey epitelinde apikal hücre zarı, apikal sitoplazma ve yan yüz apikal bölgelerinde kuvvetli olduğu, bazal sitoplazmada ise son derece zayıf olmakla birlikte boyanmanın varlığı saptandı (Resim 2A). Bez epitel hücrelerinde ise tutulum yüzey epiteline benzerlik göstermekle birlikte immünreaksiyonun biraz daha orta dereceli olduğu ayırt ediliyordu (Resim 2B). Östrus evresinde ise ZO 1 antikor tutulumunun yüzey epiteli ve bez epiteli hücrelerine özgün olduğu dikkati çekti. ZO 1 immünreaktivitesi apikal hücre zarında, apikal sitoplazmada ve yan yüzün apikal bölgelerinde belirgindi. Boyanmanın tüm epitel hücrelerinde kuşak şeklinde olduğu ilgiyi çekti. Bazal sitoplazmada tutulum zayıftı (Resim 3A). Bez epitelinde apikal sitoplazmada zayıf, yan yüz apikal bölgelerinde ise kuvvetli ve özgün tutulum dikkati çekti. (Resim 3B). Metaöstrus evresinde, ZO 1 primer antikor tutulumunun epitel hücrelerinde özgün olmadığı, ancak hücrelerin apikal sitoplazmalarında ve yan yüzlerinde orta dereceli tutulumun varlığı dikkat çekiciydi (Resim 4A). Buna karşın bez epitel hücrelerinde immünreaktivitenin apikal hücre zarı ve yan yüzlerin apikal bölgesinde oldukça kuvvetli olduğu gözlemlenirken sitoplazmik tutulumun zayıf olduğu dikkati çekti (Resim 4B). Diöstrus evresinde klaudin 5 antikoru ile yapılan immünohistokimyasal boyamalarda endometriyum yüzey epitelinde sitoplazmik tutulum orta dereceliyken hücrelerin apikal ve yan yüz apikal bölgelerinde oldukça yoğun olduğu ancak hücre yan yüzü boyunca tutulumun varlığı belirgindi (Resim 5A). Bez epitelinde de tutulum yüzey epiteli ile eşdeşdi (Resim 5B). Proöstrus evresinde klaudin 5 antikoru ile yapılan immünohistokimyasal incelemede, tutulumun epitel hücre sitoplazmasında ortadan kuvvetliye değiştiği, hücrenin apikal ve yan yüz hücre zarı boyunca oldukça yoğun olduğu saptandı (Resim 6A). Bez epitelinde de tutulum zar düzeyinde olup reaktivite düzeyi yüzey epiteli ile benzerdi (Resim 6B). Östrus evresinde klaudin 5 antikoru ile yapılan immünohistokimyasal boyamada hem yüzey epiteli hem de bez epitel hücrelerinin yan yüzlerinde immünreaktivitenin son derece kuvvetli olduğu saptandı (Resim 7A-B)

29 Yüzey epitel hücrelerinin apikal sitoplazmasında ortadan kuvvetliye değişen tutulum izlenirken geri kalan sitoplazmik alanlarda oldukça zayıf tutulum izlendi (Resim 7A). Bez epitel hücrelerinde apikal hücre zarında ve hücrenin yan yüzü boyunca yoğun olarak izlenen tutulumun apikal hücre sitoplazmasında sıkı bağlantılara koşut gelen bölgede olduğu görüldü ( Resim 7B). Uterus epitelinin metaöstrus evresinde klaudin 5 antikoru ile yapılan immünohistokimyasal boyamada sitoplazmik tutulumun yoğun olduğu hücre yan yüzleri boyunca ortadan kuvvetliye değişen derecede tutulumun belirgin olduğu gözlemlendi (Resim 8A). Bez epiteli hücrelerinde yer yer kuvvetli hücre zarında da tutulum görülmekle birlikte yüzey epiteli ile eşdeş boyanma özelliği izlendi (Resim 8B). Diöstrus evresinde klaudin 7 tutulumu yüzey epitelinin apikal hücre zarlarında ve bazolateral zayıf olarak izlendi (Resim 9A). Bez epitelinde tutulum yüzey epiteline eşdeşdi (Resim 9B). Proöstrus evresinde yüzey epitelinde klaudin 7 tutulumu, hem zar hem de sitoplazmada zayıf olarak izlenirken bazolateral hücre zarında orta dereceli olarak görüldü (Resim 10A). Bez epitelinde bazolateral hücre zarında ve yer yer apikal hücre zarında orta dereceli tutulum dikkati çekti ( Resim 10B). Östrus evresinde klaudin 7 ile yapılan immünohistokimyasal incelemede yüzey epiteli ve bez epitelinde bazolateral tutulumun özgün olduğu saptandı (Resim 11A-B). Metaöstrus evresindeki uterus epitelinde kaludin 7 ile yapılan immünohistokimyasal boyamada yüzey ve bez epitel hücrelerindeki tutulumun özgün olmadığı dikkat çekiciydi. Hücrelerin yer yer apikal ve bazolateral yüzeylerinde son derece zayıf tutulum varlığı izlendi (Resim 12A-B). Diöstrus evresinde JAM 1 primer antikor ile yapılan immün boyamada yüzey epitelindeki apikal sitoplazmik tutulumun yoğun olduğu izlendi (Resim 13A). Hem bez hem de yüzey epitelinde hücre zarının apikal ve yan yüzleri boyunca JAM-1 in ortadan kuvvetliye değişen tutulum gösterdiği (Resim 13A-B), bez epitelinin sitoplazmasında ise tutulumun ortadan kuvvetliye doğru değiştiği ve apikal hücre zarının yer yer bölgesel yoğun tutulum gösterdiği dikkati çekti (Resim 13B). Proöstrus evresinde JAM-1 tutulumun diöstrus evresinde izlenen tutulum ile aynı olduğu saptandı (Resim 14 A-B). Östrus evresinde JAM 1 tutulumunun hem yüzey hem de bez epitelinde apikal hücre sitoplazmasında ve yan yüz hücre zarları boyunca kuvvetli olduğu buna karşın diğer sitoplazmik alanlardaki tutulumun daha az düzeyde olduğu gözlemlendi. Her iki bölgede de apikal hücre zarında yer yer tutulum saptandı (Resim 15A-B)

30 JAM-1 primer antikoru ile yapılan immünohistokimyasal incelemede metaöstrus evresinde sitoplazmik tutulumun ortadan kuvvetliye değiştiği hem bez hem de yüzey epitel hücrelerinin apikal hücre zarının biraz daha kuvvetli boyandığı, hücrelerin yan yüzü boyunca da tutulumun varlığı ayırt edildi (Resim 16A-B). Diöstrus evresinde konneksin 43 tutulumunun yüzey epiteli ve bez epiteli sitoplazmasında zayıftan ortaya değişkenlik gösterdiği dikkati çekti. Hem bez hem de yüzey epitelinde bazal ve yan yüz bazalinde kuvvetli konneksin 43 immünreaktivitesinin olduğu gözlemlendi (Resim 17A-B). Proöstrus evresinde yüzey epitelinin apikal hücre zarı ve sitoplazmasında ortadan kuvvetliye değişen düzeyde, bazaolateralde ise oldukça kuvvetli konneksin 43 tutulumu belirlendi (Resim 18A). Bez epitelinde de sitoplazmada yer yer ortadan kuvvetliye değişen immünreaktivite izlendi. Apikal hücre zarı ve bazolateral bölgelerde de tutulum kuvvetliydi (Resim 18B). Östrus evresinde konneksin 43 tutulumunun özgün olduğu yüzey epiteli ve bez epiteli hücrelerinin bazal ve apikal hücre zarı ve bazolateral bölgede oldukça kuvvetli reaktivite gösterdiği görüldü (Resim 19A-B). Metaöstrus evresinde konneksin 43 antikor tutulumunun apikal sitoplazmada ve zar da ortadan kuvvetliye değişen düzeyde olduğu görüldü. Ayrıca yüzey epiteli ve bez epitelinde immünreaktivitenin hücrelerin apikal ve yan yüzlerinin bazale yakın bölgelerinde zayıftan ortaya doğru değiştiği belirlendi (Resim 20A-B)

31 Resim 1A-B: Diöstrus evresine ait ZO-1 antikor tutulumu. A) Yüzey epiteli; apikal hücre zarı ( ) ve yan yüz apikal bölgelerinde ( ) ortadan kuvvetliye değişen reaktivite izleniyor. B) Bez epitel hücrelerinde apikal hücre zarında ( ) ve hücre yan yüz apikal bölgelerinde ( ) ortadan kuvvetliye değişen ZO-1 immünreaktivitesi görülüyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

32 Resim 2A-B: Proöstrus evresinde ZO-1 antikor tutulumu. A) Yüzey epitelinde apikal sitoplazma ( ), apikal hücre zarı ( ) ve hücre yan yüz apikal bölgelerinde ( ) kuvvetli, bazal sitoplazmada ( ) zayıf immünreaktivite gözleniyor. B) Bez epitel hücrelerinde ise ZO-1 tutulumunun apikal sitoplazmada ( ), apikal hücre zarında ( ) ve yan yüz apikal bölgesinde ( ) orta dereceli olduğu ayırt ediliyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000 )

33 Resim 3A-B: Östrus evresinde ZO-1 antikor immünreaktivitesi. A) Yüzey epitelinde kuşak şeklinde tutulum görülüyor. Apikal sitoplazmada ( ), apikal hücre zarında ( ) ve yan yüzey apikal bölgelerinde ( ) özgün tutulum izlenirken bazal sitoplazmada ( ) tutulum zayıf olarak gözleniyor. B) Bez epitelinde ZO-1 tutulumu yine apikal hücre zarında ( ), apikal sitoplazmada ( ) ve yan yüz apikal bölgelerinde ( ) zayıf olarak izleniyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

34 Resim 4A-B: Metaöstrus evresinde ZO-1 primer antikor tulumu. A) Yüzey epitel hücrelerinin apikal hücre zarında ( ) ve hücre yan yüzlerinde ( ) orta dereceli tutulum izleniyor. B) Metaöstrus evresinde ZO-1 tutulumunun bez epitel hücrelerinde apikal hücre zarı ( ) ve yan yüz apikal bölgelerinde ( ) kuvvetli, sitoplazmada ( ) ise zayıf olduğu görülüyor (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

35 Resim 5A-B: Diöstrus evresinde klaudin 5 antikoru ile yapılan immünhistokimyasal boyama. A) Yüzey epitelinde orta dereceli sitoplazmik ( ) tutulum izlenirken apikal hücre zarında ( ) ve yan yüz apikal bölgelerinde ( ) yoğun tutulum ayırt ediliyor. B) Bez epitelinde klaudin 5 primer antikorunun hücre sitoplazmasında ( ) orta dereceli, apikal hücre zarında ( ) ve hücre yan yüz apikal ( ) bölgelerinde ise yoğun reaktivite gösterdiği izleniyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

36 Resim 6A-B: Proöstrus evresinde klaudin 5 antikoru ile yapılan immünohistokimyasal boyama. A) Yüzey epitel hücre sitoplazmasında ( ) ortadan kuvvetliye değişen immünreaktivite görülürken, apikal ( ) ve hücre yan yüzleri ( ) boyunca yoğun tutulum ayırt ediliyor. B) Bez epiteli hücre sitoplazmasında ( ) ortadan kuvvetliye değişen immünreaktivite izlenirken, hücrenin apikal ( ) ve yan yüzü ( ) boyunca yoğun tutulum dikkati çekiyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

37 Resim 7A-B: Östrus evresinde klaudin 5 antikoru ile yapılan immünohistokimyasal boyama. A) Yüzey epiteli hücreleri yan yüzlerinde ( ) kuvvetli tutulum izlenirken, apikal hücre sitoplazmasında ( ) tutulumun ortadan kuvvetliye değiştiği izleniyor. Geri kalan sitoplazmik ( ) bölgelerde ise oldukça zayıf tutulum görülüyor. B) Bez epitel hücrelerindeki klaudin 5 tutulumunun apikal sitoplazmada ( ), apikal hücre zarında ( ) ve hücrelerin yan yüzü boyunca ( ) yoğun olduğu dikkati çekiyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

38 Resim 8A-B: Uterus epitelinin metaöstrus evresinde klaudin 5 antikoru ile yapılan immünhistokimyasal boyama. A) Yüzey epitelinde, sitoplazmada ( ) yoğun reaktivite izlenirken, hücre yan yüzleri boyunca ( ) ortadan kuvvetliye değişen tutulumun belirgin olduğu gözleniyor. B) Bez epitel hücrelerinde sitoplazmada ( ) yoğun klaudin 5 immünreaktivitesi izlenirken hücre yan yüzleri boyunca ( ) ortadan kuvvetliye değişen tutulumun belirgin olduğu dikkati çekiyor. Apikal hücre zarında ( ) yer yer kuvvetli immünreaktivite izleniyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

39 Resim 9A-B: Diöstrus evresinde klaudin 7 primer antikoru ile yapılan immünboyama. A) Yüzey epitelinin apikal hücre zarında ( ) ve bazolateral bölgesinde ( ) zayıf tutulum dikkati çekiyor. B) Bez epitel hücrelerinin apikal hücre zarında ( ) ve bazolateral bölgesinde ( ) zayıf klaudin 7 tutulumu ayırt ediliyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

40 Resim 10A-B: Proöstrus evresinde klaudin 7 tutulumu. A) Yüzey epitelinde apikal hücre zarında ( ) ve sitoplazmada ( ) zayıf tutulumu görülürken, hücrenin bazolateral bölgesinde ( ) orta dereceli immünreaktivite izleniyor. B) Bez epitelinde klaudin 7 tutulumun genel olarak bazolateral bölgede ( ), yer yer ise apikal hücre zarında ( ) olduğu dikkati çekiyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

41 Resim 11A-B: Östrus evresinde klaudin 7 ile yapılan immünohistokimyasal inceleme. A) Yüzey epiteli bazolateral bölgelerinde ( ) özgün tutulum izleniyor. B) Bez epitelinin bazolateral bölgelerinde ( ) özgün tutulum izleniyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000 )

42 Resim 12A-B: Metaöstrus evresindeki klaudin 7 ile yapılan immünohistokimyasal boyama. A) Yüzey epitelinde yer yer apikal hücre zarı ( ) ve bazolateral bölgelerde ( ) son derece zayıf tutulum gözleniyor. B) Bez epitelyumi hücrelerinde klaudin 7 ile yapılan immünohistokimyasal boyamada apikal hücre zarı ( ) ve bazolateral ( ) bölgelerde yüzeylerinde son derece zayıf tutulum görülüyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

43 Resim 13A-B: Diöstrus evresinde JAM-1 tutulumu. A) Yüzey epitelinde yoğun sitoplazmik ( ), hücre zarının apikal ( ) ve yan yüzün apikal ( ) bölgelerinde ortadan kuvvetliye değişen JAM -1 reaktivitesi izleniyor. B) Bez epitelinin sitoplazmasında ( ) ve yan yüz apikal ( ) bölgesinde JAM-1 tutulumun ortadan kuvvetliye değiştiği, apikal hücre zarının ( ) ise yer yer yoğun tutulum gösterdiği görülüyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X 1000)

44 Resim 14A-B: Proöstrus evresinde JAM-1 tutulumu. A) Yüzey epitelinde apikal sitoplazmada ( ) kuvvetli, apikal hücre zarı ( ) ve yan yüzleri boyunca ( ) ortadan kuvvetliye değişen reaktivite izleniyor. B) Bez epitelinin sitoplazmasında ( ) ve yan yüzleri ( ) boyunca JAM-1 tutulumun ortadan kuvvetliye değiştiği, yer yer apikal hücre zarında ( ) da yoğun tutulum olduğu gözleniyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

45 Resim 15A-B: Östrus evresinde JAM-1 tutulumu. A) Yüzey epitelinde apikal hücre zarında ( ), apikal sitoplazmada ( ) ve yan yüz ( ) boyunca kuvvetli tutulum görülürken diğer sitoplazmik ( ) alanlarda tutulumun daha zayıf olduğu ayırt ediliyor. B) Aynı evrede JAM-1 tutulumunun bez epitelinde apikal hücre zarında ( ) ve yan yüz hücre zarları ( ) boyunca kuvvetli olduğu görülürken sitoplazmadaki ( ) tutulumun daha zayıf olduğu izleniyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

46 Resim 16A-B: Metaöstrus evresinde JAM-1 primer antikoru ile yapılan immünohistokimyasal inceleme. A) Yüzey epitel hücrelerinde sitoplazmik ( ) tutulum ortadan kuvvetliye değişirken, apikal hücre zarında ( ) kuvvetli tutulum izleniyor. Hücre yan yüzü boyunca ( ) kuvvetli JAM-1 immünreaktivitesi görülüyor. B) Bez epitel hücrelerinde apikal hücre zarı ( ) ve hücre yan yüzlerinde ( ) JAM-1 tutulumu belirgin olarak izleniyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

47 Resim 17A-B: Diöstrus evresinde konneksin 43 tutulumu. A) Yüzey epiteli sitoplazmasında ( ) tutulumun zayıftan ortaya değiştiği izlenirken hücrelerin bazal ( )ve bazolateral ( ) bölgesinde kuvvetli konneksin 43 immünreaktivitesi görülüyor. B) Bez epitel hücrelerinin sitoplazmasında ( ) konneksin 43 tutulumunun zayıftan ortaya değiştiği görülürken hücrelerin bazal ( ) ve bazolateral bölgelerde ( ) kuvvetli konneksin 43 immünreaktivitesi ayırt ediliyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

48 Resim 18A-B: Proöstrus evresinde konneksin 43 tutulumu. A) Yüzey epiteli apikal hücre zarında ( ) ve apikal sitoplazmasında ( ) konneksin 43 tutulumunun ortadan kuvvetliye değiştiği izlenirken, bazolateral ( ) bölgede kuvvetli tutulum görülüyor. B) Aynı evrede bez epitel hücrelerinin sitoplazmasında ( ) ortadan kuvvetliye değişen tutulum, apikal hücre zarında ( ) ve yan yüzlerin apikal ( ) bölgesinde kuvvetli konneksin 43 immünreaktivitesi izleniyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

49 Resim 19 A-B: Östrus evresinde konneksin 43 primer antikoru ile yapılan immünboyama. A) Yüzey epitel hücrelerinin bazal ( ) ve apikal ( ) hücre zarlarında, ayrıca bazolateral bölgede ( ) kuvvetli reaktivite görülüyor. B) Aynı evrede bez epitel hücrelerinin bazal hücre zarında ( ) ve bazolateral ( ) bölgesinde oldukça kuvvetli reaktivite izleniyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)

50 Resim 20A-B: Metaöstrus evresinde konneksin 43 antikor tutulumu. A) Yüzey epitelindeki hücrelerin apikal sitoplazmasında ( ), apikal hücre zarında ( ) tutulumun ortadan kuvvetliye, yan yüzlerinin ( ) bazaline yakın bölgede ise zayıftan ortaya değiştiği ayırt ediliyor. B) Bez epitel hücrelerinin sitoplazmasında ( ) tutulumun ortadan kuvvetliye değişirken, hücrelerin apikal ( ) ve yan yüzlerinin ( ) bazaline yakın bölgede zayıftan ortaya değiştiği izleniyor. (İmmünperoksidaz Hematoksilen X1000)