ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE Proje Türü Proje No Proje Yöneticisi : Lisansüstü Tez Projesi (Yüksek Lisans) : 14L : Doç. Dr. Birce TABAN Proje Başlığı : Ankara Piyasasında Açıkta Satılan Beyaz ve Tulum Peynirlerinde Staphylococcus aureus Varlığının Belirlenmesi ve Belirlenen Suşlarda Bazı Klasik Enterotoksijenik Özelliklerin Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile Araştırılması Yukarıda bilgileri yazılı olan projemin sonuç raporunun e-kütüphanede yayınlanmasını; İSTİYORUM İSTEMİYORUM GEREKÇESİ: Doç. Dr. Birce TABAN İmza

2 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ SONUÇ RAPORU Ankara Piyasasında Açıkta Satılan Beyaz ve Tulum Peynirlerinde Staphylococcus aureus Varlığının Belirlenmesi ve Belirlenen Suşlarda Bazı Klasik Enterotoksijenik Özelliklerin Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile Araştırılması Proje Yürütücüsü: Doç. Dr. Birce TABAN Yardımcı Araştırmacı: Sahar KARIMIHACHEHSOO Proje Numarası: 14L Başlama Tarihi: Bitiş Tarihi: Rapor Tarihi: Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2015 "

3 1. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Ankara Piyasasında Açıkta Satılan Beyaz ve Tulum Peynirlerinde Staphylococcus aureus Varlığının Belirlenmesi ve Belirlenen Suşlarda Bazı Klasik Enterotoksijenik Özelliklerin Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile Araştırılması Son yıllarda gerek üreticilerin gerekse tüketicilerin gıda hijyeni konusunda bilinçli davranmaları ve ilgili yasal yönetmeliklerde yapılan düzenlemeler sayesinde gıda hijyeninde gözlenen gelişmelere karşın, gıda işleme ve hazırlama sırasında uygun hijyenik koşulların sağlanamaması ve/veya korunamaması sonucu başta mastitisli hayvanlardan sağılan sütler olmak üzere, kontamine olmuş sütler ve süt ürünlerinin, özellikle de çiğ sütten üretilen peynirlerin stafilokokal intoksikasyonlar yönünden büyük risk taşıdıkları bilindiğinden, bu proje kapsamında Ankara piyasasında açıkta satılan toplam 63 adet Beyaz ve Tulum peyniri mikrobiyolojik analiz kurallarına uyularak laboratuvara getirilmiş ve bu peynirlerde EN/ISO (01/2004) yöntemine göre yapılan S. aureus izolasyonu sonucu toplam 210 adet tipik S. aureus izolatı elde edilmiştir. Bu izolatların Gram boyama sonucu hepsi Gram pozitif, koagülaz testi sonucu ise 73 adedi koagülaz pozitif (CPS) olarak belirlenmiştir. CPS ların API Staph kiti sonuçlarına göre de; 1, 2, 9, 15, 27, 29 ve 34 no lu örneklerden 1 er adet, 3, 51 ve 56 no lu örneklerden 2 şer adet, 10 no lu örnekden 4 adet, 4 ve 22 no lu örneklerden 5 er adet olmak üzere toplam 27 adet izolat, kısmen identifiye edilmiştir. Bu suşlarda saptanacak koagülaz ve termonükleaz aktiviteleri S. aureus varlığını kanıtlayacağından, bu suşlar bir kez de termonükleaz gen bölgesine (nuc geni) sahip olup-olmadıkları açısından PZR ile incelenmiş ve bu incelemenin sonucunda 27 adet adet izolatın 24 adedinde nuc geninin 279 bç lik bölgesi çoğaltılmıştır. Bir başka deyişle, 63 adet peynir örneğinin 12 adedinde (% 15.9) S. aureus varlığı kesin olarak saptanmıştır. Ancak termonükleaz aktivitesi ile enterotoksin varlığının oluşumu arasında bir ilişkinin olmadığı bilindiğinden, identifikasyonu doğrulanan S. aureus suşlarında gıda intoksikasyonları yönünden büyük önem arz eden bazı stafilokokal klasik enterotoksinleri (SEA ve SED) ifadeleyen genlerin olup-olmadığı projenin devamında yine PZR ile araştırılmış ve yalnızca 10 no lu örnekden izole edilen 5.6 (2) no lu izolatta sea geninin 219 bç lik bölgesi çoğaltılabilmiş ancak hiçbir izolatta sed geninin 317 bç lik bölgesi çoğaltılamamıştır. Dolayısıyla, 63 adet peynir örneğinin yalnızca 1 adedi SEA sentezleyebilecek S. aureus ile kontamine halindeyken, örneklerin hiçbirinde SED sentezleyecek S. aureus bulunmamaktadır. Sonuç olarak Ankara piyasasında açıkta satılan Beyaz ve Tulum peynirlerinde gerek S. aureus gerekse SEA sentezleyebilecek S. aureus saptanması, bunların hem üretimleri sırasında yetersiz sanitasyon koşulların olduğunun göstergesi olması hem de enterotoksin içerme ihtimallerinin fazlalığı nedenleriyle büyük önem arz etmektedir. Bununla beraber kimi peynirlerde düşük S. aureus sayısının saptanmış olması da, enterotoksin açısından oluşabilecek riski azaltmamaktadır.

4 Detection of Presence of Staphylococcus aureus in White Pickled and Tulum Cheeses Sold in Open Markets of Ankara and Investigation of Some Classical Enterotoxigenic Properties of These Strains by Polymerase Chain Reaction (PCR) In this project, a total of 63 white pickled and Tulum cheeses sold in open markets of Ankara brought to the laboratory in compliance with the rules of microbiological analysis and a total 210 typical S. aureus isolates were determined from these cheeses after S. aureus isolation done according to the method of EN/ISO (01/2004) since the great risks for staphylococcal intoxication of contaminated milk and dairy products, primarily milks secreted from mastitic animals and especially raw milk cheeses, as a result of failure to provide and/or maintanence proper hygiene during food processing and preparation, have been known despite the improvement observed at food hygiene through the consciously behave of both manufacturers and consumers on food hygiene and the arrangements made at the relevant legal regulations in recent years. All of these isolates were determined as Gram positive as a result of Gram staining and 73 of them were determined as coagulase positive (CPS) according to the coagulase test results. According to the API Staph kit results of CPS, a total of 27 of isolates including 1 from each sample no: 1, 2, 9, 15, 27, 29 and 34; 2 from each sample no: 3, 51 and 56; 4 from sample no: 10, and 5 from each sample no: 4 and 22 were partially identified. Since coagulase and thermonuclease activities determined in these strains will prove the presence of S. aureus, these strains were also examined for the presence of of thermonuclease gene region (nuc gene) by PCR and as a result, the region of 279 bp was amplified in 24 of these 27 isolates. In other words, S. aureus has been precisely detected in 12 of 63 cheese samples (15.9 %). Consequently, since it is known that there is not a relationship between the formation of the presence of enterotoxin with the thermonuclease activity, the presence of some staphylococcal classic enterotoxins (SEA and SED) genes which have great importance in terms of food intoxication were investigated in the confirmed S. aureus strains by PCR and the region of 219 bp of sea gene was amplified only in isolate number 5.6 (2) from sample no: 10, but 317 bp of sed gene could not be amplified in any of these isolates. Thus, only 1 sample of 63 cheese samples was contaminated with SEA producing S. aureus while SED producing S. aureus were not found in any of them. As a result, detection of both S. aureus and SEA producing S. aureus in white pickled and Tulum cheeses sold in open markets of Ankara, is very important due to being an indicator of poor sanitation conditions during their production as well as redundancy of the possibility of having enterotoxin. However, determination of low numbers of S. aureus in cheeses does not reduce the risks that may arise in terms of enterotoxin. 2. Amaç ve Kapsam Günümüzde gıda kaynaklı hastalıklar açısından insanların karşı karşıya kaldığı en büyük tehlikenin; zehirli bitkiler veya hayvanlar, ağır metaller, pestisidler ya da herbisidler hatta gizli alerjenler gibi mikrobiyel kökenli olmayan faktörlerin değil, gıdalarda bulunan patojenler olduğu bilinmektedir.

5 Patojenler ile kontamine olmuş gıdaların ihraç edilmesinin mümkün olmamasının, ürünün imha edilmek zorunda kalınmasının ya da denetim mekanizması yetersiz olan ülkelerde iç pazarda tüketime sunulmasının, gerek büyük ekonomik kayıplara gerekse insan sağlığı açısından ciddi tehlikelere yol açtığı bilinmektedir. Amerika Birleşik Devletleri (ABD) Hastalık Kontrol ve Korunma Merkezi (CDC) verilerine göre 2008 yılında sadece ABD nde toplam gıda kaynaklı hastalık salgını bildirilmiş, bu salgınlarda hastalık vakası saptanmış, vakaların sı hastanede tedavi görmüş ve 22 si ise ölümle sonuçlanmıştır (CDC 2011). Son yıllarda gerek üreticilerin gerekse tüketicilerin gıda hijyeni konusunda bilinçli davranmaları ve ilgili yasal yönetmeliklerde yapılan düzenlemeler sayesinde gıda hijyeninde gözlenen gelişmelere karşın Staphylococcus aureus halen gıda kaynaklı hastalıkların önde gelen üçüncü nedeni olarak tanımlanmaktadır (Can and Çelik 2012; Akineden et al. 2008; Morandi et al. 2007; Normanno et al. 2007). Staphylococcaceae ailesindeki stafilokoklar içerisinde gıda zehirlenmeleri açısından en önemli tür olan S. aureus, patojen bir bakteri olmasına karşın sağlıklı insanların % unun nazofarinks ve deri florasında yer almakta ve insanların % 60 ı belirli aralıklarla bu patojeni barındırmaktadır (Normanno et al. 2007). Dolayısıyla gıda işleme ve hazırlama sırasında uygun hijyenik koşulların sağlanamaması ve/veya korunamaması sonucu gıdaların S. aureus ile kontamine olmasında en büyük rolü insanlar oynamasına karşın, başta mastitisli hayvanlardan sağılan sütler olmak üzere, kontamine olmuş sütler ve süt ürünlerinin, özellikle de çiğ sütten üretilen peynirlerin stafilokokal intoksikasyonlar yönünden büyük risk taşıdıkları (Rall et al. 2008; Zweifel et al. 2006; Jorgensen et al. 2005; de Buyser 2001) ve hatta bu peynirlerden S. aureus un sıklıkla izole edildiği bildirilmektedir (Jakobsen et al. 2011; Rosengren et al. 2010; Delbes et al. 2006; Kuplulu et al. 2004). Süt ve süt ürünleri esaslı stafilokokal intoksikasyonlar; enterotoksijenik özelliğe sahip stafilokokların süt ve süt ürünlerinde kob/g-ml veya daha yüksek sayıya ulaşması sırasında sentezlenen, ekzotoksin özellikteki stafilokokal enterotoksinlerin (SE) alimenter yol ile alımı sonucu oluşmaktadır (Ertas et al. 2010; Pelisser et al. 2009; Akineden et al. 2008; Bostan et al. 2006). CDC verilerine göre ABD nde her yıl SE lere bağlı gıda zehirlenmelerinden kişi hastaneye yatırılırken, den fazlası da ölmektedir (Pinchuk et al. 2010). Stafilokokal enterotoksinler, kimyasal ve antijenik özellikleri esas alınarak adlandırılmaktadırlar. Bugüne kadar 21 SE tipi tanımlanmış ve bunları ifadeleyen genler belirlenmiş ancak stafilokokal intoksikasyon vakalarının % 95 inin (Rahimi 2013; Ertas et al. 2010; Cremonesi et al. 2005) emetik özellikteki klasik SE ler olarak bilinen SEA, SEB, SEC (SEC 1, SEC 2, SEC 3 ), SED ve SEE kaynaklı olduğu gözlenmiştir (das Dores et al. 2013; Akineden et al. 2008; Cremonesi et al. 2007; Blaiotta et al. 2004; Scherrer et al. 2004). Klasik SE ler arasında SEA ve SED in sıklıkla, SEC nin kısmen intoksikasyonlara neden oldukları saptanmıştır (Ertas et al.

6 2010; Pinchuk et al. 2010; Pelisser et al. 2009; Bostan et al. 2006; Rosec et al. 2002). SEE ve SEB nin ise gıda zehirlenmesi vakalarında hiç saptanmadıkları belirlenmiştir. İnsanlar süt veren hayvanları evcilleştirmeye başladığından beri, süt ve fermente süt ürünleri insan diyetinin önemli bir parçası olmuştur (Jakobsen et al. 2011). Yüksek miktarda S. aureus içeren sütlerin pastörize edilmeden peynire işlenmesi, kullanılan starter kültürün aktivitesinin zayıf olması, sütün pastörizasyon sonrası kontaminasyonu ile ürüne işlenmesi ve uygun olmayan depolama koşulları peynirlerde SE lere bağlı gıda zehirlenmelerinin oluşmasına neden olmaktadır (Küçükçetin ve Milci 2008). Stafilokokal enterotoksinler, pirojenik toksin olarak bilinen geniş biyolojik ve biyokimyasal özellikleri içeren süperantijen olarak adlandırılan grup içerisinde yer almaktadırlar. Stafilokokal intoksikasyonların oluşumunda bireysel duyarlılık, tüketilen gıda miktarı ve toksin tipi önemli olmasına karşın, stafilokokal intoksikasyon kısa inkübasyon süresi ile karakterize edilmekte ve 20 ng ile 1 µg arasındaki seviyelerinde SE içeren gıdanın alınmasından 1-6 saat sonra bulantı, abdominal kramp, diyare ve şiddetli kusma semptomları ile ortaya çıkmaktadır (Rosengren et al. 2010; Scherrer et al. 2004; Balaban and Rasooly 2000). Her ne kadar pastörizasyon işlemi sonucu S. aureus hücreleri inhibe edilebilse de, termostabil özellikte olan SE lerin biyolojik aktivitelerini genellikle korudukları saptanmıştır (Rahimi 2013; Rall et al. 2008; Morandi et al. 2007; Asao et al. 2003; Balaban and Rasooly 2000). Stafilokokal enterotoksinlerin pepsin, tripsin, kimotripsin, kimozin, papain vb. gibi proteolitik enzimlere, düşük ph değerlerine ve fermantasyon koşullarına dirençli olmalarının yanısıra, peynirlerin olgunlaştırılması sırasında da aktivitelerini kaybetmedikleri bilinmektedir (das Dores et al. 2013; Rahimi 2013; Akineden et al. 2008; Cremonesi et al. 2007). Dolayısıyla, çiğ sütten ve/veya hijyenik olmayan ortamlarda üretilen peynirlerin stafilokokal intoksikasyon riskini arttırdıkları, halk sağlığını tehdit ettikleri ve önemli ekonomik kayıplara neden oldukları bildirilmektedir (Ertas et al. 2010; Jorgensen et al. 2005; de Buyser 2001; Santos et al. 1981). Peynirlerde yüksek miktarlarda S. aureus saptanması, hem işletmedeki yetersiz sanitasyon koşullarının göstergesi olması hem de onların enterotoksin içerme ihtimalinin fazlalığı nedenleriyle büyük önem arz etmektedir. Bununla beraber peynirlerde düşük S. aureus sayısının saptanmış olması da, enterotoksin açısından oluşabilecek riski azaltmamaktadır. Çiğ süte kontamine olmuş S. aureus un sentezleyeceği enterotoksinlerin ısıl işlem ve diğer yöntemler ile inaktif hale getirilemeyeceği bilinmektedir. Bu durumda tüketim öncesi yapılacak analizler sonrası S. aureus varlığı saptanmayan ya da düşük miktarlarda saptanan peynirler tüketildiğinde ciddi intoksikasyonlara sebep olabilecektir.

7 Süt ve süt ürünlerindeki SE ler, 20 ng ile 1 µg arası gibi çok düşük seviyelerde olsa bile stafilokokal intoksikasyonlara yol açabilmektedirler. Dolayısıyla, çiğ sütten ve hijyenik olmayan koşullarda üretilen peynirler stafilokokal intoksikasyonlara yol açarak, hem halk sağlığını tehdit edebilmekte hem de önemli ekonomik kayıplara neden olabilmektedir. Türk Gıda Kodeksi Mikrobiyolojik Kriterler Tebliği ne göre eritme peyniri hariç diğer tüm peynirler için, EN/ISO veya 2 yöntemi kullanılarak yapılan analiz sonucunda 5 örnekden yalnızca 2 adedinin en çok kob/g seviyesinde koagülaz pozitif stafilokok içermesine izin verilebileceği ancak 1 örneğin bile 10 3 kob/g dan fazla koagülaz pozitif stafilokok içermesi durumunda ürünün uygunsuz olup, kabul edilemez olacağı belirtilmektedir. Aynı tebliğe göre eritme peynirler ve peynir ürünlerinin 25 gramının stafilokokal enterotoksin içermemesi gerektiği belirtilmektedir. Ocak 2006 tarihinden itibaren yürürlükte olan CEE 2073 sayılı yasa gereğince de, 1 gramında 10 5 kob den fazla S. aureus içeren peynir örnekleri, enterotoksin üretme yetenekleri açısından test edilmelidir. Bu projede, Ankara piyasasında açıkta satılan Beyaz ve Tulum peynirlerinde S. aureus varlığının belirlenmesi ve saptanacak suşlarda gıda intoksikasyonları yönünden büyük önem arz eden bazı klasik enterotoksijenik özelliklerin (SEA ve SED) bir başka deyişle bazı stafilokokal klasik enterotoksinleri ifadeleyen genlerin PZR tekniği kullanılarak araştırılmış ve dolayısıyla bu peynirlerin tüketici sağlığı yönünden güvenilirliği saptanmıştır. 3. Materyal ve Yöntem 3.1. Materyal Proje kapsamında belirtilen makine-teçhizat ve sarf malzemelerin tamamının alımları gerçekleştirilmiştir Peynir örnekleri Çalışmada kullanılan 30 adet Beyaz ve 33 adet Tulum peyniri Ankara piyasasında açıkta satış yapan çeşitli hal ve pazaryerlerinden (Tablo 1.1) belirli zaman aralıklarında tesadüfî olarak alınmış, soğuk zincir kırılmadan mikrobiyoloji laboratuvarına getirilmiş ve 10 gramlık parçalara ayrılarak, her bir 10 gramlık parça vakit kaybetmeden aynı gün analize alınmıştır Bakteri kültürleri Staphylococcus aureus, SEA ifadeleyen gene sahip S. aureus ve SED ifadeleyen gene sahip S. aureus kültürleri, Justus-Liebig Üniversitesi, Veteriner Gıda Bilimleri Enstitüsü, Süt Bilimleri, Almanya dan sağlanmış ve -80 C sıcaklıkta muhafaza edilmiştir. Çalışma boyunca kullanılan bu kültürlerin uygun

8 zaman aralıkları ile triptik soy (TS) broth besiyerine aktarımları yapılmış ve 37 C de 24 saat inkübe edilerek, aktive edilmişlerdir. Tablo 1.1. Çalışmada kullanılan 63 adet peynir örneği Örnek No Örnek Adı Örnek Alım Yeri 1 Elazığ Tulum peyniri Çankaya Nişantaşı Pazarı 2 Malatya Beyaz peynir Sıhhıye Semt Pazarı 3 Aydın Beyaz peynir Çankaya Nişantaşı Pazarı 4 Trabzon Tulum peyniri Çankaya Nişantaşı Pazarı 5 Tulum peyniri Sıhhıye Semt Pazarı 6 Trakya Beyaz peynir Yenimahalle Çamlıca Pazarı 7 Ankara Beyaz peynir Yenimahalle Mesa Pazarı 8 Erzincan Beyaz peynir Esat Pazarı 9 Kırşehir Tulum peyniri Yenimahalle Mesa Pazarı 10 Ankara Tulum peyniri Yenimahalle Mesa Pazarı 11 Ankara Tulum peyniri Yenimahalle Mesa Pazarı 12 Erzincan Tulum peyniri Yenimahalle Çamlıca Pazarı 13 Sivas Tulum peyniri Yenimahalle Çamlıca Pazarı 14 Kars Tulum peyniri Yenimahalle Çamlıca Pazarı 15 Kayseri Tulum peyniri Yenimahalle Çamlıca Pazarı 16 Çubuk Beyaz peynir Dışkapı Pazarı 17 Ankara Beyaz peynir Ulus Hal Pazarı 18 Afyon Beyaz peynir Dışkapı Pazarı 19 Kayseri Tulum peynir Dışkapı Pazarı 20 Kayseri Tulum peyniri Ulus Hal Pazarı 21 Ankara Beyaz peynir Ulus Hal Pazarı 22 Ankara Beyaz peynir Ulus Hal Pazarı 23 Erzincan Beyaz peynir Dışkapı Pazarı 24 Köy Tulum peyniri Ulus Hal Pazarı 25 Beyaz peynir Dışkapı Pazarı 26 Erzincan Tulum peyniri Ulus Hal Pazarı 27 Erzincan Tulum peyniri Dışkapı Pazarı 28 Malatya Beyaz peynir Sincan Törekent Pazarı 29 Tulum peyniri Mamak Semt Pazarı 30 Erzincan Tulum peyniri Sincan Törekent Pazarı 31 Tulum peyniri Mamak Semt Pazarı 32 Tulum peyniri Mamak Semt Pazarı 33 Beyaz peynir Sincan Törekent Pazarı 34 Hatay Tulum peyniri Mamak Semt Pazarı 35 Tulum peyniri Sincan Törekent Pazarı 36 Tulum peyniri Sincan Törekent Pazarı 37 Hatay Tulum peyniri Mamak Semt Pazarı 38 Beyaz peynir Mamak Semt Pazarı 39 Gümüşhane Tulum peyniri Mamak Semt Pazarı 40 Tulum peyniri Sincan Törekent Pazarı 41 Beyaz peynir Batıkent Kapalı Pazarı 42 Beyaz peynir Mamak Akşemsettin Pazarı 43 Beyaz peynir Eryaman Etap Pazarı

9 44 Beyaz peynir Eryaman Etap Pazarı 45 Beyaz peynir Mamak Fatih Pazarı 46 Beyaz peynir Eryaman Etap Pazarı 47 Beyaz peynir Mamak Fahri Korutürk Pazarı 48 Erzincan Tulum peyniri Batıkent Kapalı Pazarı 49 Erzincan Tulum peyniri Aydınlıkevler Pazarı 50 Erzincan Tulum peyniri Eryaman Devlet Mah. Pazarı 51 Beyaz peynir Yenimahalle Çamlıca Pazarı 52 Beyaz peynir Yenimahalle Çamlıca Pazarı 53 Beyaz peynir Yenimahalle Mesa Pazarı 54 Beyaz peynir Yenimahalle Mesa Pazarı 55 Beyaz peynir Keçiören Kardeşler Pazarı 56 Tulum peyniri Yenimahalle Mesa Pazarı 57 Tulum peyniri Yenimahalle Mesa Pazarı 58 Tulum peyniri Keçiören Kardeşler Pazarı 59 Tulum peyniri Keçiören Kardeşler Pazarı 60 Tulum peyniri Keçiören Kardeşler Pazarı 61 Beyaz peynir Çukurambar Nişantaşı Pazarı 62 Beyaz peynir 100.Yıl Pazarı 63 Beyaz peynir Dışkapı Örnek Mah. Pazarı Besiyerleri ve enzimler Çalışmada kullanılan Tryptic Soy (TS) broth, Tryptic Soy (TS) agar, Baird Parker agar ve Brain Heart broth, Merck (Almanya) markalı besiyerleridir. Koagülaz testi sırasında kullanılan liyofilize tavşan plazması da, Merck (Almanya) markalı bir enzim çözeltisidir. Bu besiyerlerinin ve enzim çözeltisinin bileşimleri ve hazırlanış şekilleri, EK 1 bölümünde verilmektedir Tampon ve çözeltiler Çalışmada kullanılan ¼ lük Ringer çözeltisi, 10 mm tris-hcl çözeltisi (ph: 8.0), 10 mg/ml lizozim çözeltisi, 0.5 M Na 2 EDTA (disodyum etilendiamin tetraasetik asit) çözeltisi (ph: 8.0) ve tris-borik asit- EDTA (TBE) tamponu (10X) nun bileşimleri ve hazırlanış şekilleri, EK 2 bölümünde verilmektedir Boya çözeltileri Araştırmada kullanılan 1 mg/ml etidyum bromür çözeltisi ve 6X yükleme boya çözeltisinin bileşimleri ve hazırlanış şekilleri, EK 3 bölümünde verilmektedir DNA izolasyonu ve saflaştırılması işlemi deney düzeneği Çalışmada proje kapsamında alınan Nüve (Türkiye) markalı mikrosantrifüj kullanılmıştır. Bu düzenek; maksimum devir/dakika hızda çalışabilen ve 24 adet standard mikrosantrifüj tüpünü tutabilen, mikrolitre açılı bir rotor ve bu rotorun kapağını içermektedir.

10 DNA izolasyonu ve saflaştırılması kiti Çalışmada kullanılan Roche (Almanya) markalı high pure PCR template preparation (HPPTP) kitinin içeriği ve içeriğindeki tampon ve çözeltilerin hazırlanış şekilleri, EK 4 bölümünde verilmektedir Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemi deney düzeneği Araştırmada THE-MWG (Almanya) markalı Primus 96 termocycler (Şekil 1.1) kullanılmıştır Oligonükleotidler Çalışma esnasında termonükleaz gen bölgesi (nuc geninin) 279 bç lik bölümünü amplifiye eden (Brakstad et al., 1992), sea geninin 219 bç lik bölümünü amplifiye eden (Tsen and Chen, 1992) ve sed geninin 317 bç lik bölümünü amplifiye eden Integrated DNA Technologies (Almanya) markalı primer çiftleri kullanılmıştır. Bu primer çiftlerinin hazırlanış şekilleri EK 5 bölümünde verilmektedir Agaroz jel elektroforez işlemi deney düzeneği Çalışmada Serva (Almanya) markalı BlueMarine 100 ve BlueMarine 200 yatay elektroforez tankları ve bu tanklara uygun ebatlardaki jel tablaları ve tarakları ile birlikte BioRad (İngiltere) markalı PowerPac Basic güç kaynağı kullanılmıştır Jel görüntüleme işlemi deney düzeneği Araştırmada Syngene (İngiltere) markalı InGenius jel görüntüleme ve analiz sistemi (Şekil 1.2) kullanılmıştır. Bu düzenek; karanlık oda, yüksek performanslı digital fotoğraf makinası, UV emisyon filtresi ve filtre kabini ve 302 nm lik dalgaboyunda çalışan UV translüminatörü içermektedir ve çalışma esnasında jel analizi software i GeneTools içeren bilgisayara bağlı olarak kullanılmıştır. Şekil 1.1. PZR yöntemi deney düzeneği Şekil 1.2. Jel görüntüleme ve analiz sistemi deney (Anonymous, 2003) düzeneği (Anonymous, 2004a)

11 3.2. Yöntem Peynir örneklerinden S. aureus izolasyonu Ankara piyasasında açıkta satış yapan çeşitli hal ve pazaryerlerinden (Tablo 1.1) belirli zaman aralıklarında tesadüfi olarak 30 adet Beyaz ve 33 adet Tulum peyniri örneği alınarak soğuk zincir kırılmadan mikrobiyoloji laboratuvarına getirilmiştir. Herbir peynir örneğinden 10 g alınarak, 90 ml ¼ lük Ringer çözeltisi içeren steril filtreli Stomacher torbalarına aktarılmış ve Interscience Bag (Fransa) markalı bag mixer 400P cihazında homojenize edilmiştir. Hazırlanan bu homojenizatların uygun dilüsyonları yapılarak, EN/ISO (01/2004) yöntemine göre S. aureus izolasyonu gerçekleştirilmiştir (Şekil 2.1). Bu amaçla; her bir örneğin uygun dilüsyonlarından Baird-Parker agar besiyerine yayma yöntemi kulllanılarak paralel inokülasyon yapılmış ve petri kapları, C sıcaklıkta saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda, izole edilen etrafı saydam zonlu mm çaplı siyah parlak renkli konveks yapıda tipik S. aureus kolonilerinin identifikasyonu amacı ile, Gram boyama, koagülaz ve API Staph kiti testleri gerçekleştirilmiştir. Gram boyama amacıyla, Brain infusion broth broth kullanılarak 37 C sıcaklıkta saat inkübasyon sonunda elde edilen kültürlerden preparat hazırlanmış, kurutulmuş ve tespit edilmiştir. Bu preparat ilk olarak, kristal violet boya çözeltisi ile 2-3 dakika boyanmış, preparat üzerindeki boya yıkanmış ve ardından preparat üzerine lugol çözeltisi konarak 1-2 dakika bekletilmiştir. Preparat üzerindeki lugol çözeltisinin de yıkanmasının ardından preparata, absolut alkolde dekolorizasyon işlemi uygulanmış ve yine yıkama gerçekleştirilmiştir. Son olarak preparat, safranin çözeltisi ile 5-10 saniye boyanmış, preparat üzerindeki boya yıkanmış ve kurumaya bırakılmıştır. Kuruma işleminin ardından, preparat üzerine birkaç damla immersiyon yağı damlatılarak 100X objektifinde mikroskopla incelenmiştir. Bu işlem sonucunda mor görülen bakteri hücreleri, Gram pozitif olarak değerlendirilmiştir. Koagülaz testi amacıyla, liyofilize tavşan plazması 3 ml steril destile su ile sulandırılıp steril küçük tüplere 0.3 ml olacak şekilde dağıltılmış ve üzerlerine Brain Infusion broth kullanılarak 37 C sıcaklıkta saat inkübasyon sonunda elde edilen kültürlerden 0.1 ml şer eklenerek, 37 C sıcaklıkta inkübe edilmişlerdir. Her saat başı tüplerde pıhtılaşma olup olmadığı tüpleri yavaşça eğerek kontrol edilmiş ve tüplerde belirgin pıhtı oluşumu (% 75 pıhtı) koagülaz pozitif stafilokok (CPS) olarak değerlendirilmiştir. Koagülaz pozitif stafilokoklar Biomérieux (Fransa) markalı API identifiye edilmiştir. Staph kiti kullanılarak kısmen

12 Örnek/homojenizat/dilüsyon Baird-Parker agar (35-37 C, 24 saat ± 2 saat) Tipik (etrafı saydam zonlu mm çaplı siyah parlak renkli konveks) kolonilerin sayımı 1 Tipik/atipik koloni seçimi Tryptic soy broth (35-37 C, saat) ve/veya Tyrptic soy agar (35-37 C, saat) İDENTİFİKASYON AMAÇLI Gram boyama [Koagülaz testi 2 (Brain infusion broth) (35-37 C, 4-6 veya 24 saat)] Koagülaz pozitif stafilokokların (CPS) belirlenmesi 3 API Staph kiti ile identifikasyon 4 1 Stafilokokal intoksikasyona neden olan toksin düzeyine, S. aureus sayısı kob/g-ml den fazla olduğunda ulaşılmaktadır. Bu nedenle, S. aureus sayısı 5 X 10 5 kob/g-ml olan gıdalar kesinlikle riskli olarak kabul edilmektedir. Bu sebeple peynir örneklerindeki toplam stafilokok sayımı gerçekleştirilmiştir. Aynı zamanda, S. aureus suşları için koagülaz ve enterotoksin oluşumu arasında yüksek bir korelasyon olduğundan, sayım sonuçları yüksek çıkan peynir örnekleri stafilokokal enterotoksin (SE) aranması açısından (AOAC ) VIDAS SET 2 ile incelemeye alınmıştır. Bununla beraber gıdadaki düşük S. aureus sayısı da, gıdanın kesinlikle güvenli olduğunu göstermemektedir (Tükel ve Doğan 2000). 2 Koagülaz enzimi ekstraselüler olarak serbest formda veya hücre yüzeyine bağlı olarak iki ayrı şekilde bulunmaktadır. Protrombine bağlanarak onu aktive etmekte ve bu şekilde fibrinojenin fibrine polimerize olmasını sağlamaktadır. Fibrinle kaplanan bakteri hücre duvarı da, fagositoza daha dirençli hale gelmektedir. 3 Koagülaz aktivitesi S. aureus için pozitiftir ve patojenliğini belirlemede önemli bir indikatördür. Koagülaz enzimi ile kandaki fibrinojen, fibrine dönüşerek koagülasyona sebep olmakta ve tavşankanı plazması ile belirlenebilmektedir. S. aureus suşları için koagülaz ve enterotoksin oluşumu arasında yüksek bir korelasyon olup, toksin varlığının gösterilemediği durumlarda koagülaz pozitif S. aureus sayısı önemli olmaktadır (Ünlütürk ve Turantaş 2003). Şekil 2.1. EN/ISO (01/2004) yöntemi

13 Gıdada saptanacak koagülaz ve termonükleaz, S. aureus varlığını kanıtlamaktadır. Bu amaçla, API Staph test kiti kullanılarak kısmen identifiye edilmiş izolatlar, doğrulama amaçlı olarak termonükleaz gen bölgesine (nuc geni) sahip olup-olmadıkları açısından PZR ile incelenmiş ve bu incelemenin sonucunda S. aureus kesin olarak doğrulanmıştır. Ancak, termonükleaz ile enterotoksin varlığının oluşumu arasında bir ilişkinin olmadığı da bildirilmektedir (Tükel ve Doğan 2000). Bu amaçla da, identifikasyonu doğrulanan S. aureus suşlarında bazı stafilokokal klasik enterotoksinleri ifadeleyen genlerin olup-olmadığı yine PZR ile araştırılmıştır (Şekil 2.2). DOĞRULAMA AMAÇLI DNA izolasyonu ve saflaştırılması 1 nuc gen bölgesi ile gerçekleştirilen PZR çalışması 2 sea ve sed gen bölgeleri ile gerçekleştirilen PZR çalışması 3 1 Çalışmada kullanılan DNA izolasyonu ve saflaştırılması işleminin uygulama basamakları Şekil 2.3 de gösterilmektedir. 2 Çalışmada S. aureus a özgü geni belirlemek amacıyla kullanılan primerlerin oligonükleotid dizileri Ek 5 de gösterilmektedir. Bu primer dizileri kullanılarak gerçekleştirilen PZR analizinde, Tablo 2.1 de belirtilen PZR amplifikasyon bileşenleri derişim ve miktarları ve Tablo 2.2. ve 2.3 de belirtilen PZR döngülerindeki parametre değerleri kullanılmıştır. 3 Çalışmada SE leri kodlayan genleri belirlemek amacıyla kullanılan primerlerin oligonükleotid dizileri Ek 5 de gösterilmiştir. Bu primer dizileri kullanılarak gerçekleştirilecek PZR analizinde Tablo 2.1 de belirtilen PZR amplifikasyon bileşenleri derişim ve miktarları ve Tablo 2.2. ve 2.3 de belirtilen PZR döngülerindeki parametre değerleri kullanılmıştır. Şekil 2.2. Çalışmanın ilerleyen aşamaları DNA izolasyonu ve saflaştırılması işlemi CPS lardan DNA izolasyonu ve saflaştırılması işlemi, high pure PCR template preparation kit kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Şekil 2.3). Bu amaçla, 1.5 ml lik steril mikrosantrifüj tüpüne, 200 L bakteri süspansiyonu ve 5 L lizozim çözeltisi eklenmiş ve 37 C sıcaklıkta 15 dakika inkübasyona bırakılmıştır. Bu inkübasyonun ardından aynı tüpe, 200 µl bağlama tamponu ve 40 µl proteinaz K çözeltisi eklenerek, hemen karıştırılmış ve 70 C sıcaklıkta 10 dakika süre ile ikinci bir inkübasyona bırakılmıştır. Daha sonra aynı tüpe, 100 L izopropanol eklenerek karıştırılmış ve bu karışım, filtre başlık içeren toplama tüpünün üstteki filtre kısmına aktarılarak, g de 1 dakika santrifüj işlemine tabi tutulmuştur. Santrifüj işlemi sonrası üst sıvıyı (süpernatant) içeren toplama tüpü atılarak filtre, başka bir steril toplama tüpüne yerleştirilmiştir. Yeni toplama tüpüne yerleştirilen bu filtre kısmına, 500

14 µl inhibitör uzaklaştırma tamponu eklenerek, g de 1 dakika santrifüj işlemi yapılmıştır. Santrifüj işlemi sonrası üst sıvıyı içeren toplama tüpü atılarak filtre, başka bir steril toplama tüpüne yerleştirilmiştir. Yeni toplama tüpüne yerleştirilen bu filtre kısmına, 500 µl yıkama tamponu eklenerek g de 1 dakika santrifüj işlemi yapılmıştır. Santrifüj işlemi sonrası üst sıvıyı içeren toplama tüpü atılarak filtre, başka bir steril toplama tüpüne yerleştirilmiş ve bir önceki işlem tekrar edilmiştir. Santrifüj işlemi sonrası üst sıvı uzaklaştırılmış ve filtre, aynı toplama tüpüne yerleştirilerek, g de 10 saniye santrifüj işlemi yapılmıştır. Artakalan üst sıvıyı içeren toplama tüpü atılmış ve filtre, 1.5 ml lik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilmiştir. 1.5 ml lik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilen filtre üzerine, 200 µl 70 C sıcaklıkta bekletilen ayırma tamponu eklenerek, g de 1 dakika süre ile son bir santrifüj işlemi yapılmıştır. Son olarak, filtre başlık atılmış ve tüpte kalan üst sıvı, hedef DNA yı içerdiğinden, ileri aşamalarda kullanılmak üzere -20 C sıcaklıkta saklanmıştır PZR amplifikasyon bileşenleri Çalışmada dntp lerin (datp, dgtp, dctp ve dttp) herbirinin 10 mm lık eşit derişimlerini içeren ve hazır halde ticari olarak satılan Roche markalı (Almanya) PZR nükleotid karışım çözeltisi kullanılmıştır. PZR amplifikasyon karışımı hazırlanırken hedef DNA ve primerler arasında oluşabilecek özgün olmayan bağlanmaların Taq DNA polimeraz enzimi ile uzatılmasını önlemek amacı ile, 75ºC nin altındaki sıcaklıklarda inaktif halde bulunan ancak 95ºC de 3 dakikalık bir beklemenin ardından aktif hale geçebilen ve hazır halde ticari olarak satılan Roche markalı (Almanya) modifiye Taq (FastStart Taq) polimeraz enzim çözeltisi kullanılmıştır. Çalışmanın bu aşamasında, nuc geninin 279 bç lik bölümünü (Brakstad et al., 1992), sea geninin 219 bç lik bölümünü (Tsen and Chen, 1992) ve sed geninin 317 bç lik bölümünü (Johnson et al., 1991) amplifiye etmek amacı ile yapılan her bir PZR analizi hazırlığında Tablo 2.1 de verilen bileşenler kullanılarak toplam 30 L lik PZR amplifikasyon karışımı hazırlanmış ve kullanılmıştır (Akineden et al., 2008). Bu amaçla; ince çeperli 0.2 ml lik PZR tüpü içerisinde, 2.5 L hedef DNA, 19.9 L ultra saf su ve 100 M olarak hazırlanan primer çiftinden 1 er L ile birlikte, hepsi Roche markalı (Almanya) olmak üzere hazır halde ticari olarak satılan 10 mm lık PZR nükleotid karışımından 0.6 L, 10X PZR tamponundan 3 L, 25 mm lik MgCl 2 çözeltisinden 1.8 L, 5 U/L lik FastStart Taq DNA polimeraz enzim çözeltisinden 0.2 L olacak şekilde toplam 30 L lik PZR amplifikasyon karışımı hazırlanmış ve kullanılmıştır.

15 1.5 ml lik steril mikrosantrifüj tüpüne aktarım (200 L bakteri süspansiyonu + 5 L lizozim çözeltisi) İnkübasyon (37 C, 15 dakika) µl bağlama tamponu (ph: 4.4) + 40 µl proteinaz K çözeltisi İnkübasyon (70 C, 10 dakika) L izopropanol 2.0 ml lik steril toplama tüpünün filtre kısmına aktarım Santrifüj işlemi (8 000 g, 1 dakika) Filtrenin, başka bir toplama tüpüne yerleştirimi µl inhibitör uzaklaştırma tamponu (ph: 6.6) Santrifüj işlemi (8 000 g, 1 dakika) Filtrenin, başka bir toplama tüpüne yerleştirimi µl yıkama tamponu (ph: 7.5) Santrifüj işlemi (8 000 g, 1 dakika) Filtrenin, başka bir toplama tüpüne yerleştirimi µl yıkama tamponu (ph: 7.5) Santrifüj işlemi (8 000 g, 1 dakika) Filtrenin, aynı toplama tüpüne yerleştirimi Santrifüj işlemi ( g, 10 saniye) Filtrenin, 1.5 ml lik steril mikrosantrifüj tüpüne yerleştirimi µl 70 C ayırma tamponu (ph: 8.5) Santrifüj işlemi (8 000 g, 1 dakika) Süpernatanthedef DNA Şekil 2.3 CPS hücrelerinden DNA izolasyonu ve saflaştırılması uygulama basamakları (Anonymous, 2004)

16 Tablo 2.1. Çalışmada kullanılan PZR amplifikasyon bileşenleri derişim ve miktarları Primer nuc-1 nuc-2 SEA-1 SEA-2 SED-1 SED-2 Hedef gen bölgesi Primer (100 M) nuc 1 1 sea 1 1 sed 1 1 PZR amplifikasyon bileşenleri derişim ve miktarları (L) PZR nükleotid karışımı (10 mm) 10X PZR tamponu MgCl 2 çözeltisi (25 mm) FastStart Taq DNA polimeraz (5 U/L) Ultra saf su Hedef DNA PZR döngüsü parametre değerleri Çalışmanın bu aşamasında, nuc geninin 279 bç lik bölümü Tablo 2.2 de belirtilen değerler, sea geninin 219 bç lik ve sed geninin 317 bç lik bölümleri Tablo 2.3 de belirtilen değerler kullanılarak amplifiye edimiştir. Tablo 2.2. nuc geninin 279 bç lik bölümünün amplifikasyonu için kullanılan PZR döngüsündeki parametre değerleri Sıcaklık ( C) Süre (saniye) Döngü sayısı (adet) Başlangıç denatürasyonu Denatürasyon Bağlanma Uzama Son uzama Tablo 2.3. sea geninin 219 bç lik ve sed geninin 317 bç lik bölümlerinin amplifikasyonu için kullanılan PZR döngüsündeki parametre değerleri Sıcaklık ( C) Süre (saniye) Döngü sayısı (adet) Başlangıç denatürasyonu Denatürasyon Bağlanma Uzama Son uzama PZR işlemleri sonrası elde edilecek tüm amplikonların gösterilmesi amacıyla amplikonlar, ilk olarak, agaroz jel elektroforez işlemi uygulanarak etidyum bromür çözeltisi ile boyanmış agaroz jelde yürütülecektir. Bu işlemi takiben elektroforez ortamından alınan jeller, 302 nm dalgaboyunda UV ışık

17 altında moleküler ağırlık belirteci ile karşılaştırılarak görüntülemeye alınacak ve ilgili gen bölgeleri için yukarıda belirtilen amplikon uzunluklarına karşılık gelen DNA fragman bantları aranarak, amplikonlar değerlendirilecektir Agaroz jel elektroforez işlemi Çalışmanın bu aşamasında, çoğaltılan hedef DNA ların gösterilmesi amacı ile ilk olarak, agaroz jel elektroforez işlemi uygulanmıştır. Bu işlem esnasında, %1.5 lik agaroz jeli (w/v) kullanılmıştır. Bu jelin içeriği ve hazırlanış şekli, EK 6 bölümünde verilmektedir. Agaroz jel elektroforez işleminde ilk olarak; tabla üzerinde oluşturulan agaroz jel, uygun ebatlardaki yatay elektroforez tankına yerleştirilmiş ve ardından tank içerisine, jelin üzerini kapatacak miktarda, TBE tamponundan (1X) ilave edilmiştir. Diğer tarafdan, amplikonlardan (PZR yöntemi ile çoğaltılan hedef DNA lar) 10 ar L alınarak, 2 şer L 6X yükleme boya çözeltisi ile karıştırılmışlardır. Boyanarak hazır hale getirilmiş bu amplikonlar, daha sonra, jeldeki kuyucuklara yüklenmiş ve ilk kuyucuğa yüklenen Fermentas markalı (Litvanya) 100 bç lik GeneRuler TM DNA ladder plus (ready-to-use) moleküler ağırlık belirteci eşliğinde, yaklaşık saat 90 volt sabit akımda yürütülmüşlerdir. 6X yükleme boya çözeltisinin jel sistemini terk etmesinden sonra, elektrik akımı kesilmiştir Jel görüntüleme işlemi Çalışmanın bu aşamasında, çoğaltılan hedef DNA nın ve SEA ve SED lerin gösterilmesi amacı ile son olarak, elektroforez ortamından alınan jel, 302 nm dalgaboyunda UV ışık altında moleküler ağırlık belirteci ile karşılaştırılarak görüntülemeye alınmış ve nuc geninin 279 bç lik, sea geninin 219 bç lik ve sed geninin 317 bç lik uzunluklarına karşılık gelen DNA fragman bantları aranarak, amplikonlar değerlendirilmiştir. 4. Analiz ve Bulgular Ankara piyasasında açıkta satış yapan çeşitli hal ve pazaryerlerinden belirli zaman aralıklarında tesadüfî olarak alınan 30 adet Beyaz ve 33 adet Tulum peyniri örneğinden, EN/ISO (01/2004) yöntemine göre yapılan S. aureus izolasyonu sonucu toplam 210 adet tipik S. aureus izolatı elde edilmiştir. Bu izolatların Gram boyama sonucu hepsi Gram pozitif, koagülaz testi sonucu ise 73 adedi koagülaz pozitif (CPS) olarak belirlenmiştir (Şekil 2.4). CPS ların API Staph kiti sonuçlarına göre de; 1, 2, 9, 15, 27, 29 ve 34 no lu örneklerden 1 er adet, 3, 51 ve 56 no lu örneklerden 2 şer adet, 10 no lu örnekden 4 adet, 4 ve 22 no lu örneklerden 5 er adet toplam 27 adet izolat, kısmen identifiye edilmiş ve numarandırılmıştır (Şekil 2.5). Bu izolatların elde edildiği peynirlerdeki toplam stafilokok sayıları ve bu izolatlar ile ilgili bilgiler, Tablo 2.4 de belirtilmiştir. Dolayısıyla, çalışmanın ilerleyen aşamalarında bu 27 adet izolatta doğrulama amaçlı nuc geninin ve ayrıyeten SEA ve SED ifadeleyen genlerin olupolmadığı araştırılmıştır.

18 (İzolat No: 4.2) (İzolat No: 5.5 (2)) (İzolat No: 7.6 (3)) (İzolat No: 4.4) (İzolat No: 12.6 (3)) (İzolat No: 2.1 (4)) Şekil 2.4. Koagülaz testi görüntülerinin bir kısmı

19 (İzolat No: 1.7) (İzolat No: 2.3) (İzolat No: 3.3) (İzolat No: 3.5) (İzolat No: 4.2) (İzolat No: 4.3) (İzolat No: 4.4) (İzolat No: 4.5) Şekil 2.5. API Staph testleri görüntülerinin bir kısmı

20 Tablo 2.4. Çalışmanın ilerleyen aşamalarında kullanılacak izolatlar Örnek No Örnek Adı Pazar Yeri Örnekdeki toplam stafilokok sayısı İzolat No API Staph (%) 1 Erzurum Tulum peyniri Çankaya Nişantaşı Pazarı 9.4 X Malatya Beyaz peynir Sıhhıye Semt Pazarı 7.4 X Aydın Beyaz peynir Çankaya Nişantaşı Pazarı 5.7 X Trabzon Tulum peyniri Çankaya Nişantaşı Pazarı 2.7 X Kırşehir Tulum peyniri Yenimahalle Mesa Pazarı 3.7 X (2) Ankara Tulum peyniri Yenimahalle Mesa Pazarı 3.7 X (2) 5.5 (2) 5.6 (2) 5.8 (2) Kayseri Tulum peyniri Yenimahalle Çamlıca Pazarı 3.4 X (2) (3) 7.2 (3) 7.3 (3) 7.4 (3) 7.6 (3) 22 Ankara Beyaz peynir Ulus Hal Pazarı 3.4 X 10 5* 27 Erzincan Tulum peyniri Dışkapı Pazarı 3.0 X (3) Tulum peyniri Mamak Semt Pazarı 9.5 X (4) Hatay Tulum peyniri Mamak Semt Pazarı 3.0 X (4) Beyaz peynir Yenimahalle Çamlıca Pazarı 5.0 X 10 6* 1.5 (6) (6) Tulum peyniri Yenimahalle Mesa Pazarı 1.3 X 10 5* 6.11 (6) (6) 98.1 * Stafilokokal intoksikasyona neden olan toksin düzeyine, S. aureus sayısı kob/g-ml den fazla olduğunda ulaşılmaktadır. Bu nedenle, S. aureus sayısı 5 X 10 5 kob/g-ml olan gıdalar kesinlikle riskli olarak kabul edilmektedir. Bu sebeple peynir örneklerindeki toplam stafilokok sayımı gerçekleştirilmiştir. S. aureus suşları için koagülaz ve enterotoksin oluşumu arasında yüksek bir korelasyon olduğundan, 22, 51 ve 56 no lu peynir örnekleri stafilokokal enterotoksin (SE) aranması açısından (AOAC ) VIDAS SET 2 ile incelenmiş ve bu peynir örneklerinde herhangi bir SE varlığına rastlanılmamıştır. 2.5 L hedef DNA ve 19.9 L ultra saf su ile birlikte, 10 mm lık PZR nükleotid karışımından 0.6 L, 10X PZR tamponundan 3 L, 25 mm lik MgCl 2 çözeltisinden 1.8 L, 5 U/L lik FastStart Taq DNA polimeraz enzim çözeltisinden 0.2 L olacak şekilde toplam 30 L lik PZR amplifikasyon karışımı kullanılarak, 95 C de 180 saniyelik başlangıç denatürasyonu, 94 C de 60 saniyelik denatürasyon, 55 C de 30 saniyelik bağlanma ve 72 C de 30 saniyelik uzama basamaklarının 37 kere tekrarlanmasını ve son olarak da 72 C de 210 saniyelik son uzamayı içeren PZR işlemi gerçekleştirildiğinde, 27 adet adet izolatın 24 adedinde 279 bç lik bölgesi çoğaltılmış ve dolayısı ile %1.5 lik agaroz jelde 279 bç lik

21 bu özgün bant, yalnızca 2 no lu örnekden izole edilen 2.3 no lu izolatta, 3 no lu örnekden izole edilen 3.3 no lu izolatta ve 56 no lu örnekten izole edilen 6.3 (6) no lu izolatta gözlenilmemiştir. Bu çalışma esnasında, hatalı-pozitif ya da beklenilmeyen ürün (primer-dimer) bandına rastlanılmamıştır (Şekil 2.6). Şekil 2.6. S. aureus izolatlarının termonükleaz gen bölgesine (nuc geni) sahip olup-olmadıkları açısından incelendiği PZR sonucunun % 1.5 lik agaroz jeldeki görüntüsü ÜST JEL ALT JEL bç lik moleküler ağırlık belirteci 100 bç lik moleküler ağırlık belirteci 2 Pozitif kontrol (PK) Pozitif kontrol (PK) 3 İzolat No: 1.7 İzolat No: 10.1 (2) 4 İzolat No: 2.3 İzolat No: 7.1 (3) 5 İzolat No: 3.3 İzolat No: 7.2 (3) 6 İzolat No: 3.5 İzolat No: 7.3 (3) 7 İzolat No: 4.2 İzolat No: 7.4 (3) 8 İzolat No: 4.3 İzolat No: 7.6 (3) 9 İzolat No: 4.4 İzolat No: 12.6 (3) 10 İzolat No: 4.5 İzolat No: 2.1 (4) 11 İzolat No: 4.6 İzolat No: 7.2 (4) 12 İzolat No: 4.1 (2) İzolat No: 1.3 (6) 13 İzolat No: 5.4 (2) İzolat No: 1.5 (6) 14 İzolat No: 5.5 (2) İzolat No: 6.3 (6) 15 İzolat No: 5.6 (2) İzolat No: 6.11 (6) 16 İzolat No: 5.8 (2) İzolat No: Negatif kontrol (NK)

22 2.5 L hedef DNA ve 19.9 L ultra saf su ile birlikte, 10 mm lık PZR nükleotid karışımından 0.6 L, 10X PZR tamponundan 3 L, 25 mm lik MgCl 2 çözeltisinden 1.8 L, 5 U/L lik FastStart Taq DNA polimeraz enzim çözeltisinden 0.2 L olacak şekilde toplam 30 L lik PZR amplifikasyon karışımı kullanılarak, 95 C de 180 saniyelik başlangıç denatürasyonu, 94 C de 120 saniyelik denatürasyon, 55 C de 120 saniyelik bağlanma ve 72 C de 60 saniyelik uzama basamaklarının 30 kere tekrarlanmasını ve son olarak da 72 C de 210 saniyelik son uzamayı içeren PZR işlemi gerçekleştirildiğinde, 27 adet adet izolatın 1 adedinde 219 bç lik bölgesi çoğaltılmış ve dolayısı ile %1.5 lik agaroz jelde 219 bç lik bu özgün bant, 10 no lu örnekden izole edilen 5.6 (2) no lu izolatta gözlenilmiştir. Bu çalışma esnasında, hatalı-pozitif ya da beklenilmeyen ürün (primer-dimer) bandına rastlanılmamıştır (Şekil 2.7). 2.5 L hedef DNA ve 19.9 L ultra saf su ile birlikte, 10 mm lık PZR nükleotid karışımından 0.6 L, 10X PZR tamponundan 3 L, 25 mm lik MgCl 2 çözeltisinden 1.8 L, 5 U/L lik FastStart Taq DNA polimeraz enzim çözeltisinden 0.2 L olacak şekilde toplam 30 L lik PZR amplifikasyon karışımı kullanılarak, 95 C de 180 saniyelik başlangıç denatürasyonu, 94 C de 120 saniyelik denatürasyon, 55 C de 120 saniyelik bağlanma ve 72 C de 60 saniyelik uzama basamaklarının 30 kere tekrarlanmasını ve son olarak da 72 C de 210 saniyelik son uzamayı içeren PZR işlemi gerçekleştirildiğinde, 27 adet adet izolatın hiçbirinde 317 bç lik bölgesi çoğaltılamamış ve dolayısı ile %1.5 lik agaroz jelde 317 bç lik bu özgün bant, hiçbir izolatta gözlenilmemiştir. Bu çalışma esnasında, hatalı-pozitif ya da beklenilmeyen ürün (primer-dimer) bandına rastlanılmamıştır (Şekil 2.8).

23 Şekil 2.7. S. aureus izolatlarının sea gen bölgesine sahip olup-olmadıkları açısından incelendiği PZR sonucunun % 1.5 lik agaroz jeldeki görüntüsü ÜST JEL ALT JEL bç lik moleküler ağırlık belirteci 100 bç lik moleküler ağırlık belirteci 2 Pozitif kontrol (PK) Pozitif kontrol (PK) 3 İzolat No: 1.7 İzolat No: 5.6 (2) 4 İzolat No: 2.3 İzolat No: 7.1 (3) 5 İzolat No: 3.3 İzolat No: 7.2 (3) 6 İzolat No: 3.5 İzolat No: 7.3 (3) 7 İzolat No: 4.2 İzolat No: 7.4 (3) 8 İzolat No: 4.3 İzolat No: 7.6 (3) 9 İzolat No: 4.4 İzolat No: 12.6 (3) 10 İzolat No: 4.5 İzolat No: 2.1 (4) 11 İzolat No: 4.6 İzolat No: 7.2 (4) 12 İzolat No: 4.1 (2) İzolat No: 1.3 (6) 13 İzolat No: 5.4 (2) İzolat No: 1.5 (6) 14 İzolat No: 5.5 (2) İzolat No: 6.3 (6) 15 İzolat No: 5.8 (2) İzolat No: 6.11 (6) 16 İzolat No: 10.1 (2) İzolat No: Negatif kontrol (NK)

24 Şekil 2.8. S. aureus izolatlarının sed gen bölgesine sahip olup-olmadıkları açısından incelendiği PZR sonucunun % 1.5 lik agaroz jeldeki görüntüsü ÜST JEL ALT JEL bç lik moleküler ağırlık belirteci 100 bç lik moleküler ağırlık belirteci 2 Pozitif kontrol (PK) Pozitif kontrol (PK) 3 İzolat No: 1.7 İzolat No: 5.6 (2) 4 İzolat No: 2.3 İzolat No: 7.1 (3) 5 İzolat No: 3.3 İzolat No: 7.2 (3) 6 İzolat No: 3.5 İzolat No: 7.3 (3) 7 İzolat No: 4.2 İzolat No: 7.4 (3) 8 İzolat No: 4.3 İzolat No: 7.6 (3) 9 İzolat No: 4.4 İzolat No: 12.6 (3) 10 İzolat No: 4.5 İzolat No: 2.1 (4) 11 İzolat No: 4.6 İzolat No: 7.2 (4) 12 İzolat No: 4.1 (2) İzolat No: 1.3 (6) 13 İzolat No: 5.4 (2) İzolat No: 1.5 (6) 14 İzolat No: 5.5 (2) İzolat No: 6.3 (6) 15 İzolat No: 5.8 (2) İzolat No: 6.11 (6) 16 İzolat No: 10.1 (2) İzolat No: Negatif kontrol (NK)

25 5. Sonuç ve Öneriler Enterotoksin üretebilme özelliğine sahip olan S. aureus, stafilokokal gıda zehirlenmelerinin en önemli kaynaklarından birini oluşturmaktadır. Süt ve süt ürünleri de çoğu kez stafilokokal gıda zehirlenmesine neden olan enterotoksijenik S. aureus ile kontamine olmaktadır. Örneğin 2000 yılının Temmuz ayı başlarında Japonya nın 8 farklı bölgesinde stafilokokal gıda intoksikasyonuna bağlı büyük bir salgın yaşanmış ve kadar vakanın kontamine süt ürünlerinin tüketilmesi sonucunda ortaya çıktığı belirlenmiştir (Asao et al. 2003). Yine 1999 yılının Şubat ve Mayıs aylarında Brezilya da iki adet gıda kaynaklı salgının meydana geldiği ve ilk salgında kontamine peyniri tüketen 50 kişinin 2 saat içerisinde stafilokokal intoksikasyona ilişkin semptomlar gösterdiği; ikincisinde ise kontamine çiğ süt tüketen 328 kişide diyare ve kusma semptomlarına rastlanıldığı bildirilmiştir. Bu kontamine peynirde, SEA, SEB ve SEC saptanırken, çiğ sütte SEC ve SED belirlenmiştir (do Carmo et al. 2002). Çiğ sütün kontaminasyonu, yetersiz ısıl işlem uygulamaları, kullanılan starter kültürlerin aktivitelerinin yetersizliği, üretim sürecinde yetersiz sanitasyon ve uygun olmayan depolama koşulları sonucunda stafilokokların hızla gelişerek enterotoksin oluşturmaları, peynirlerde görülen S. aureus kaynaklı gıda zehirlenmelerinin başlıca nedenleri arasında yer almaktadır (Küçükçetin ve Milci 2008). Dolayısıyla bu proje ile Ankara piyasasında açıkta satılan Beyaz ve Tulum peynirlerinde S. aureus varlığının belirlenmesi ve saptanacak suşlarda gıda intoksikasyonları yönünden büyük önem arz eden bazı klasik enterotoksijenik özelliklerin (SEA ve SED) bir başka deyişle bazı stafilokokal klasik enterotoksinleri ifadeleyen genlerin PZR tekniği kullanılarak araştırılması, gerek bu peynirlerin tüketici sağlığı yönünden güvenilirliğini saptamak gerekse ilgili bilim alanında veri oluşturması açılarından önem arz etmektedir. das Dores et al. (2013); optimal sensitivity plate (OSP) ve ELFA-VIDAS yöntemlerini karşılaştırmalı olarak araştırmaları sırasında, geleneksel olarak üretilen Minas peynir örneklerinin % 75 inde OSP yöntemi kullanarak SEA saptamışlar ancak ELFA-VIDAS yöntemi kullandıklarında örneklerin hiçbirinde enterotoksin varlığı belirlememişlerdir. Aynı araştırıcılar bu peynirlerden izole ettikleri 44 adet S. aureus suşunun % 12,5 inin SEA ve SEC üretebildiğini ve PZR ile yaptıkları çalışmada ise sadece 1 adet izolatta seb gen varlığının olduğunu gözlemlemişlerdir. Rosengren et al. (2010); 44 adet peynirden 156 adet koagülaz pozitif stafilokok izolatı elde ettiklerini ve bunların 152 adedinin (% 97) S. aureus olduğunu belirlemişlerdir. Bu S. aureus suşlarının 45 adedinin (% 30) SE leri ifadeleyen herhangi bir geni bulundurmamalarına karşın, 67 adedinin (% 44) sadece sec geni bulundurduğunu, 40 adedinin (% 26) ise SE leri ifadeleyen birden fazla geni (sea, seg, sei veya sea ve seh) taşıdığını saptamışlardır. Akineden et al. (2008); 181 adet keçi peyniri ile yaptıkları çalışmada, örneklerin 14 adedinde S. aureus varlığı belirlemiş ve S. aureus varlığı belirlenen örneklerden izole edilen 64 adet S. aureus suşunun 19 adedinin enterotoksijenik (SEA ve SEC üretebildiği) olduğunu saptamış ve bunların pastörize keçi sütünden

26 üretilen 5 farklı peynirden izole edildiklerini belirtmişlerdir. Normanno et al. (2007); 993 adedi et ve 641 adedi süt ürünü olan toplam 1634 adet örnek ile yaptıkları çalışmada, 100 adet et ve 109 adet süt ürününden 125 adet enterotoksijenik S. aureus izole etmişler ve kontaminasyon düzeyinin süt örneklerinde daha fazla olduğunu bildirmişlerdir. Morandi et al. (2007); inek, keçi, koyun, manda sütleri ve bunların ürünlerinden izole ettikleri S. aureus larda, bazı SE leri ifadeleyen genlerin dağılımını ve stafilokokal klasik enterotoksinlerin üretim varlığını araştırmışlardır. Bu amaçla; 112 adet S. aureus suşu, stafilokokal klasik enterotoksin (SEA-SED) üretimi açısından ilk olarak immuno-enzimatik ve ardından ters pasif lateks aglütinasyon yöntemleri kullanılarak incelenmiştir. SE leri ifadeleyen genleri belirlemek amacıyla ise, multipleks PZR yöntemi kullanmışlardır. İnceledikleri toplam 112 adet S. aureus suşunun % 67 sinin bazı SE leri ifadeleyen genlere sahip olduğunu ancak yalnızca % 52 sinin tespit edilebilir miktarda klasik enterotoksinleri ürettiğini saptamışlardır. Ikeda et al. (2006); peynir örnekleri ile yaptıkları çalışmada, peynir örneklerinin hiçbirinde klasik SE saptamamalarına karşın, izole ettikleri 38 adet suşun 13 adedinin seg ve sei genlerini taşıdığını ancak 20 adedinin SE leri ifadeleyen genleri bulundurmadığını saptamışlardır. Cremonesi et al (2008); çiğ sığır ve keçi sütlerinden üretilen 33 adet peynir örneğinin tamamında S. aureus varlığı belirlemişler ve bunların 14 adedinin bazı SE leri ifadeleyen genlere sahip olduğunu saptamışlardır. Cremonesi et al. (2005); süt ve süt ürünlerinde enterotoksijenik S. aureus varlığını belirlemek amacıyla multipleks PZR yöntemi geliştirmişlerdir. Bu amaçla; 93 adet izolatta, multipleks PZR yöntemi kullanarak, 23S rrna, coa ve nuc genleri ile birlikte sea, sec, sed, seg, seh, sei, sej ve sel enterotoksin genlerinin varlığını araştırmışlardır. Bu yöntemle elde edilen sonuçları, immunoassay yöntemleri kullanılarak elde ettikleri sonuçlar ile karşılaştırdıklarında, multipleks PZR yönteminin yüksek seçicilik ve duyarlıkta olduğunu saptamışlardır. Blaiotta et al (2004); et ve süt ürünlerinden izole ettikleri S. aureus suşlarında stafilokokal enterotoksin genlerin varlığını PZR ile belirlemişlerdir. Scherrer et al. (2004); çiğ keçi ve koyun sütlerinden izole ettiği 293 adet S. aureus suşunun 123 adedinin SEC yi, 31 adedinin SEG yi, 28 adedinin SEA yı, 26 adedinin SEJ yi, 24 adedinin SEI yı, 4 adedinin SEB yi ve 4 adedinin SED yi ifadeleyen genleri bulundurduklarını saptamışlardır. Holečková et al. (2002), koyun peynirinden izole ettikleri 19 adet S. aureus suşundan 9 adedinin (% 47.4) enterotoksin (özellikle SEB) ürettiğini saptamışlardır. Ülkemizde tüketilen bazı peynirlerde stafilokokal enterotoksin bulunma oranları ve enterotoksin tiplerine yönelik çalışmalara bakılacak olursa; Can and Celik (2012); Ankara da farklı marketlerde ambalajsız olarak satılan 200 adet peynirin 12 adedinde (% 6) ortalama olarak 4.31 log kob/g düzeyinde S. aureus saptamışlar ve ELIZA yöntemi kullanarak bu izolatların 3 ünün enterotoksin oluşturabilme yeteneğinde olduklarını belirlemişlerdir. Bunlardan 2 adedinin yalnızca SEC, 1 adedinin ise SEC+SED oluşturabildikleri belirlenmiştir. Ertas et al. (2010); 100 adet koyun peynirinin 60 adedinden S. aureus izole etmişler ve izolatların 5 adedinin sea, 2 adedinin seb ve 1 adedinin ise sed genlerini

27 bulundurduklarını belirlemişlerdir. Ayrıca, ELIZA yöntemi kullanarak peynirlerin 7 adedinde (% 2.3) SE saptamışlardır. Kuplulu et al. (2004), Ankara da farklı marketlerde satışa sunulan 214 adet peynirin 56 adedinden (% 26.2) koagülaz pozitif stafilokok, 35 adedinden de (% 16.4) enterotoksijenik stafilokok izole etmişlerdir. 41 adet enterotoksijenik stafilokok izolatının enterotoksin üretme yeteneklerini ve toksin tiplerini ELIZA yöntemi kullanarak belirlemişler ve buna göre 25 izolatın SEA, 4 izolatın SEB, 6 izolatın SEC, 5 izolatın SEA+SEC ve 1 izolatın SEA+SED ürettiğini saptamışlardır. Buna ilaveten özellikle Tulum ve Beyaz peynirlerinin halk sağlığı açısından yüksek risk taşıdıklarını gözlemlemişlerdir. Sancak et al. (2002), 50 adet Van otlu peynirinde enterotoksijenik S. aureus suşlarının varlığı ile enterotoksin durumunu araştırmak üzere yaptıkları bir çalışmada, örneklerin % 14 ünde 8.4 X X 10 4 kob/g seviyesinde S. aureus belirlemişler ve izole edilen bu suşların % 42.8 inin enterotoksijenik özellikte olduğunu belirlemişlerdir (Küçükçetin ve Milci 2008). Dolayısıyla bu projede de Ankara piyasasında açıkta satılan Beyaz ve Tulum peynirlerinde S. aureus varlığının belirlenmesi ve saptanacak suşlarda bazı klasik enterotoksijenik özelliklerin (SEA ve SED) bir başka deyişle bazı stafilokokal klasik enterotoksinleri ifadeleyen genlerin ELIZA yöntemi yerine daha güvenilir olan PZR tekniği kullanılarak araştırılması gerçekleştirilmiş ve daha güncel ve kesin bir sonuca varılmıştır. Bu durum, Ankara piyasasında açıkta satılan Beyaz ve Tulum peynirlerinin hijyenik olmayan koşullar altında üretilip, çeşitli hal ve pazaryerlerinde (Tablo 1.1) satıldıkları ve satılan bu peynirlerin gerek S. aureus gerekse enterotoksijenik (SEA üretebilen) S. aureus ile kontamine olabildiklerini göstermektedir. Ayrıca bu peynirlerde düşük seviyede S. aureus bulunması veya hiç bulunmaması, onların stafilokokal gıda zehirlenmelerine neden olmayacağı anlamına gelmemektedir çünkü S. aureus süte uygulanan pastörizasyon işlemi ile inhibe olsa da, SE ler inaktive edilememektedir. Halk sağlığı açısından besin değerinin yüksek olmasından dolayı önemli bir yere sahip Beyaz ve Tulum peynirlerinin uygun olmayan koşullarda üretilmeleri ve bu yerlerde satılmaları durumunda risk oluşturdukları aşikardır. Mikrobiyolojik kalitesi yüksek sütlerin, yeterli pastörizasyon işleminden sonra hijyenik koşullar altında peynire işlenmeleri ve olgunlaştırma süresini tamamlandıktan sonra, kontaminasyonları önlemek adına önlemlerin alındığı ve denetimleri yapılan satış yerlerinde satılmaları gerekmektedir. 6. Ekler Ek 1. Çalışmada kullanılan besiyerleri Triptik Soy (TS) Broth-MERCK Cat. No Mikroorganizmaların geliştirilmesinde kullanılmıştır.

28 Tablo Ek 1.1. Triptik soy (TS) broth bileşimi BİLEŞEN DERİŞİM (g/l) Kazein peptonu 17.0 Soya peptonu 3.0 D (+) glukoz 2.5 NaCl 5.0 K 2 PO ph: (sterilizasyon sonrası) Hazır karışımdan 30 gram tartılarak, 1000 ml destile su içerisinde çözündürülür. Test tüplerine gerekli miktarlarda dağıtılarak, otoklavda 121C sıcaklıkta 15 dakika süre ile sterilize edilir. Besiyerini içeren tüpler, 4C sıcaklıkta muhafaza edilmelidir ve kullanım öncesi oda sıcaklığına getirilmelidir (Anonymous, 2000). Triptik Soy (TS) Agar-MERCK Cat. No Mikroorganizmaların geliştirilmesinde kullanılmıştır. Tablo Ek 1.2. Triptik soy (TS) agar bileşimi BİLEŞEN DERİŞİM (g/l) Kazein peptonu 17.0 Soya peptonu 3.0 D (+) glukoz 2.5 NaCl 5.0 K 2 PO Agar 15.0 ph: (sterilizasyon sonrası) TSB besiyerinin hazır karışımına 15 gram agar (Merck Cat. No ) eklenerek ya da hazır karışımdan 45 gram tartılarak, 1000 ml destile su içerisinde çözündürülür. Erlen veya balon gibi cam kaplara ya da test tüplerine gerekli miktarlarda dağıtılarak, otoklavda 121C sıcaklıkta 15 dakika süre ile sterilize edilir. Sterilizasyon sonrası, erlen veya balon gibi cam kaplardaki besiyeri steril petri kaplarına dökülerek katılaşmaya bırakılır ya da besiyerini içeren tüpler yatık halde katılaşmaya bırakılır. Besiyerini içeren petri kapları, ters olarak, 4C sıcaklıkta muhafaza edilmelidir ve kullanım öncesi yüzeyleri kurutulmalıdır. Besiyerini içeren tüpler de, 4C sıcaklıkta muhafaza edilmelidir ve kullanım öncesi oda sıcaklığına getirilmelidir (Anonymous, 2000). Baird Parker Agar-MERCK Cat. No EN/ISO (01/2004) yönteminde selektif katı besiyeri olarak kullanılmıştır.

29 Tablo Ek 1.3. Baird Parker agar bileşimi BİLEŞEN DERİŞİM (g/l) Kazein peptonu 10.0 Et ekstraktı 5.0 Maya ekstraktı 1.0 Sodyum pürivat 10.0 Glisin 12.0 Lityum klorür 5.0 Agar 15.0 ph: (sterilizasyon sonrası) Hazır karışımdan 58 gram tartılarak, 950 ml destile su içerisinde çözündürülür. Erlen veya balon gibi cam kaplara gerekli miktarlarda dağıtılarak, otoklavda 121C sıcaklıkta 15 dakika süre ile sterilize edilir. Sterilizasyon sonrası, bazal besiyeri 45 C sıcaklığa soğutulur ve manyetik karıştırıcıda yavaşça karıştırılırken üzerine önceden oda sıcaklığına getirilmiş 50 ml yumurta sarısı-tellurit emülsiyonu (Merck Cat. No ) ilave edilip, steril petri kaplarına dökülerek katılaşmaya bırakılır. Besiyerini içeren petri kapları, ters olarak, 4C sıcaklıkta muhafaza edilmelidir ve kullanım öncesi yüzeyleri kurutulmalıdır (Anonymous, 2000). Opak sarı renkli bu besiyerinde S. aureus kolonileri lipoliz ve proteoliz aktiviteleri sonucunda koloni etrafında tipik zon ve halka oluşturmaları, tellürit in tellürium a indirgenmesi sonucunda siyah koloni oluşturmaları gibi tipik karakteristik özellikler ile belirlenmektedirler. 37 C sıcaklıkta 24 saat inkübasyon sonunda S. aureus, mm çapında siyah, parlak konveks koloniler oluşturmaktadır. Koloni çapı, 48 saat inkübasyondan sonra, mm olmaktadır. Brain Heart Broth-MERCK Cat. No Mikroorganizmaların geliştirilmesinde kullanılmıştır. Tablo Ek 1.4. Brain Heart broth bileşimi BİLEŞEN DERİŞİM (g/l) Nutrient substrate (beyin ekstraktı, kalp ekstraktı ve peptonlar) 27.5 D (+) glukoz 2.0 NaCl 5.0 Na 2 HPO ph: (sterilizasyon sonrası)