QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı)

Transkript

1 Mart 2017 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) Sürüm 1 72 Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM cihazı ile kullanım içindir İn vitro tanı amaçlı kullanım için Self-screen B.V., Biothof 15-1, 1098 RX Amsterdam, HOLLANDA R TR Sample to Insight

2 İçindekiler Kullanım Amacı... 4 Özet ve Açıklama... 5 Prosedür Prensibi... 5 Sağlanan Malzemeler... 7 Kit İçeriği... 7 Gerekli Olan Ancak Sağlanmayan Malzemeler... 7 Uyarılar ve Önlemler... 9 Güvenlik Bilgileri... 9 Genel Önlemler... 9 AssayManager profili önlemleri Reaktifi Saklama ve Kullanma Numune Kullanımı ve Saklanması Örnek Hazırlama Protokol: Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM cihazı içinde QIAsure Methylation Test PCR'si Sonuçların Yorumlanması Sorun Giderme Kılavuzu Sınırlamalar QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

3 Performans Özellikleri Tespit Sınırı (LOD) Doğrusallık Hassasiyet Engelleyici Maddeler Klinik Performans Sağlamlık Referanslar Semboller İletişim Bilgileri Sipariş Bilgileri QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017 3

4 Kullanım Amacı QIAsure Methylation Testi FAM19A4 ve hsa-mir124-2 genlerinin hipermetilasyonu başlatıcısının tespiti için metilasyona özgü gerçek zamanlı çoklu PCR testidir. QIAsure Methylation Testi ile test edilebilen örnekler, aşağıdaki yollarla toplanmış numunelerden izole edilmiş bisülfit dönüştürülmüş DNA'yı içerir: digene HC2 DNA Toplama Cihazı ile toplanmış servikal numuneler (hekim tarafından toplanmış) Fırça/süpürge tipi bir toplama cihazı kullanılarak toplanmış ve PreservCyt Solüsyonu içine yerleştirilmiş servikal numuneler (hekim tarafından toplanmış) Bir fırça/süpürge tipi cihaz kullanılarak toplanmış vajinal numuneler (kendi toplamış) Kullanım endikasyonları: 1. Pozitif insan papillomavirüs (HPV) testi olan kadınlarda kolposkopi veya diğer takip prosedürlerine sevk ihtiyacını belirlemek için bir takip testi olarak. 2. Pap testi sonuçlarında belirlenmemiş önemde atipik skuamöz hücreler (ASC-US) bulunan kadınlarda kolposkopi veya diğer takip prosedürlerine sevk ihtiyacını belirlemek için bir takip testi olarak. Bu ürün in vitro tanılama prosedürleri, moleküler biyoloji teknikleri ve Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM sistemi konusunda eğitimli teknisyenler ve laborantlar gibi profesyonel kullanıcılar tarafından kullanılmak üzere tasarlanmıştır. 4 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

5 Özet ve Açıklama DNA metilasyonu, yüksek organizmaların normal gelişimi için önemli bir biyokimyasal işlemdir (1). Sitozin nükleotidinin pirimidin halkasının 5. konumuna bir metil grubu eklenmesini içerir. DNA metilasyonundaki anormal desenler ayrıca karsinojenezde de önemli bir rol oynar. Servikal kanser ve endometriyal kanser dahil pek çok insan kanserinde ve kanser hücre hattında FAM19A4 ve/veya hsa-mir124-2 genlerinin hipermetilasyon başlatıcısı tespit edilmiştir (2 6). Konak hücre metilasyon başlatıcısı analizi özel olarak kanserleri ve kanser benzeri metilasyon profili barındıran ve yüksek kısa dönem kanser ilerlemesi riski olan söz gelimi ilerlemiş servikal intraepitelyal neoplazi (CIN) lezyonlarını tespit eder (3, 7, 8). QIAsure testi, dahili örnek kalite kontrolü olarak ACTB kullanarak servikal veya vajinal numunelerden izole edilmiş bisülfit dönüştürülmüş DNA üzerindeki FAM19A4 ve hsa-mir124-2 genlerinin hipermetilasyon başlatıcısının tespitine olanak tanır. Prosedür Prensibi QIAsure Methylation Testi, FAM19A4 ve hsa-mir124-2 tümör baskılayıcı genlerinin metile başlatıcı bölgelerinin yanı sıra bir referans genin metilasyona özgü olmayan bir parçacığını çoğaltan gerçek zamanlı çoklu PCR testidir. Kit, 2 tüp QIAsure Ana Karışım ve 2 tüp QIAsure Kalibratör içerir. Ana karışım, klinik servikal numunelerden hazırlanmış bisülfit dönüştürülmüş DNA'nın çoğaltılması için amaçlanmıştır. Ana karışım, kliniksel numunelerden hazırlanmış bisülfit dönüştürülmüş DNA'nın çoğaltılması için amaçlanmıştır. Kalibratör, FAM19A4, hsa-mir124-2 ve ACTB amplikonlarının doğrusallaştırılmış plazmid içeren dizileridir. QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017 5

6 İş akışı prosedürü Klinik numune Nükleik asit izolasyonu DNA materyali Çift iplikli DNA belirlenmesi konsantrasyonu Bisülfit işlemi QIAsure testi Rotor-Gene AssayManager ile yorumlama QIAsure testi Rotor-Gene Q MDx cihazı üzerinde çalışır ve Rotor-Gene AssayManager yazılımı veri analizini ve yorumlamayı otomatik olarak gerçekleştirir. CT değeri (döngü eşiği) örnek içinde bulunan hedef molekül sayısıyla ilişkili olan arkaplan sinyali üzerinde bir floresan sinyalin tespiti için gerekli olan PCR döngüsü sayısını temsil eder. QIAsure testi CT değerini FAM19A4 veya hsa-mir124-2 hedeflerinin CT değeri ile referansın (ACTB) CT değeri arasındaki fark olarak hesaplar. Bu CT, FAM19A4 veya hsa-mir124-2 geninin metilasyon başlatıcı düzeyi için görece kantitatif bir değerdir. Normalizasyon için, bir kalibratör örneğinin CT değeri FAM19A4 veya hsa-mir124-2 hedeflerinin CT değerinden çıkartılarak bir CT değeri elde edilir (9). Kalibratör, üç hedefin (yani, FAM19A4, hsa-mir124-2 ve ACTB) bilinen kopya sayısı olan düşük kopya plazmid DNA örneğidir. 6 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

7 Sağlanan Malzemeler Kit İçeriği QIAsure Methylation Test Katalog no. Reaksiyon sayısı QIAsure Master Mix (QIAsure Ana Karışım; 2 tüp) Kahverengi renkli 630 µl QIAsure Calibrator (QIAsure Kalibratör; 2 tüp) Şeffaf renkli 25 µl QIAsure Methylation Test Instructions for Use (İngilizce El Kitabı) 1 Gerekli Olan Ancak Sağlanmayan Malzemeler Kimyasallar ile çalışırken, her zaman uygun laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. Daha fazla bilgi için, ürün sağlayıcısından edinebileceğiniz, uygun güvenlik veri sayfalarına (SDS'ler) başvurun. Kendi kendine toplanan örneklerden örnek hazırlama için sarf malzemeleri ve reaktifler Hologic PreservCyt Solüsyonu Alınan DNA'nın bisülfit dönüşümü için sarf malzemeleri ve reaktifler EZ DNA Methylation Kit (EZ DNA Methylation Kiti; ZYMO Research, kat. no. D5001 veya kat. no. D5002) Rotor-Gene Q MDx cihazı için sarf malzemeleri Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (0,1 ml'lik Şerit Tüpler ve Kapakları; kat. no ) Saflaştırılmış su (ör. moleküler biyoloji sınıfı, distile veya deiyonize) QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017 7

8 Ekipman PCR için özel ayarlanabilir pipetler* (1 10 µl; µl) Tek kullanımlık eldiven > rpm hızlı masaüstü santrifüj* Vorteks karıştırıcı* Qubit (Thermo Fisher Scientific, kat. no. Q33216), NanoDrop 3300 Fluorospectrometer (Florospektrometre; Thermo Fisher Scientific, kat. no. ND-3300) veya eşdeğeri* Gerçek zamanlı PCR için ekipman Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System (Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Sistemi; kat. no ) veya Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM instrument (Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM cihazı; kat. no ) Rotor-Gene AssayManager Core Application yazılım sürümü 1.0.x (burada x, 4'e eşit veya bu değerden daha büyüktür) Rotor-Gene AssayManager Epsilon Plug-in kurulmuş, sürüm 1.0.x (burada x, 1'e eşit veya bu değerden daha büyüktür) QIAsure Test Profili (AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap dosyasından) (burada Y, 1'e eşit veya bu değerden daha büyüktür), hekim tarafından toplanmış servikal numunelerden elde edilmiş bisülfit dönüştürülmüş DNA üzerinde uygulama için QIAsure kendi kendine toplanmış fırça numunesi Test Profili (AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap dosyasından) (burada Y, 0'a eşit veya bu değerden daha büyüktür), kendi kendine toplanmış vajinal fırça numunelerinden elde edilmiş bisülfit dönüştürülmüş DNA üzerinde uygulama için * Cihazların üreticinin önerilerine göre kontrol ve kalibre edilmiş olduğundan emin olun. Ocak 2010 veya daha sonra üretilmiş Rotor-Gene Q 5plex HRM cihazı. Üretim tarihi bilgisi, cihazın arkasındaki seri numarasından edinilebilir. Seri numarası, mm ibaresinin basamak olarak üretim ayını, yy ibaresinin üretim yılının son iki basamağını ve nnn ibaresinin benzersiz cihaz tanımlayıcıyı gösterdiği mmyynnn biçimindedir. 8 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

9 Uyarılar ve Önlemler Sadece in vitro tanı amaçlı kullanım içindir. Güvenlik Bilgileri Kimyasallar ile çalışırken, her zaman uygun laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. Daha fazla bilgi için lütfen ürün sağlayıcısından edinebileceğiniz, uygun güvenlik veri sayfalarına (SDS'ler) başvurun. Bunlar, her bir QIAGEN kiti ve kit bileşenlerine ait SDS'yi bulabileceğiniz, görüntüleyebileceğiniz ve yazdırabileceğiniz adresinde çevrimiçi olarak uygun ve kompakt PDF biçiminde mevcuttur. QIAsure Ana Karışım: Uyarı! Doğurganlığa veya anne karnındaki bebeğe zarar verebileceğinden şüphelenilmektedir. Koruma eldiveni/koruyucu giysi/göz koruması/yüz koruması kullanınız. Maruz kalmış veya ilgili ise: Tıbbi yardım alınız. Kilit altında saklayınız. İçerik/kabı onaylanmış atık atım tesisine atınız. Genel Önlemler PCR testlerinin kullanımı ekipmanların bakımı dahil olmak üzere, moleküler biyolojiye özel ve yürürlükteki yönetmeliklere ve ilgili standartlara uygun iyi laboratuvar uygulamaları gerektirir. QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017 9

10 Her zaman aşağıdakilere dikkat edin: Numunelerle çalışırken tek kullanımlık pudrasız koruyucu eldiven, bir laboratuvar önlüğü ve göz koruması kullanın. Numune ve kitin mikrobiyal ve nükleaz (DNase) kontaminasyonunu engelleyin. Dnase DNA şablonunun bozulmasına neden olabilir. Yanlış pozitif bir yanıt ile sonuçlanabilecek DNA veya PCR ürünü taşıma kontaminasyonundan kaçının. Daima DNase içermeyen aerosol bariyerli tek kullanımlık pipet uçları kullanın. QIAsure testinin reaktifleri optimal olarak seyreltilmiştir. Performans kaybı yaşanabileceği için, reaktifleri daha fazla seyreltmeyin. QIAsure Kitinde tedarik edilmiş tüm reaktifler, yalnızca aynı kit ile tedarik edilen reaktiflerle birlikte kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Aynı partiden olsa bile bir kitten herhangi bir reaktifi başka bir QIAsure kitinden aynı reaktif ile değiştirmeyin çünkü bu performansı etkileyebilir. İlave uyarılar, önlemler ve prosedürler için Rotor-Gene Q MDx cihazı kullanım kılavuzuna başvurun. İnkübasyon sürelerinin ve sıcaklıkların değiştirilmesi hatalı veya uyumsuz verilere neden olabilir. Kitin son kullanma tarihi geçmiş veya yanlış saklanmış bileşenlerini kullanmayın. Bileşenlerin ışığa maruz kalmasını en aza indirgeyin: reaksiyon karışımları maruziyet nedeniyle değişime uğrayabilir. Karışımların PCR reaktifleri içinde bulunan sentetik maddelerle kontamine olmasını önlemek için çok dikkatli olun. Örneği ve test atıklarını, yerel güvenlik prosedürlerinize uygun olarak imha edin. 10 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

11 AssayManager profili önlemleri Farklı örnek tipleri için farklı AssayManager profilleri gereklidir. Aşağıda belirtildiği şekilde test edilecek örnek için doğru profilin kullanıldığından emin olun: Hekim tarafından toplanmış servikal numunelerden elde edilmiş bisülfit dönüştürülmüş DNA'nın testi için QIAsure cervical scrapes Assay Profile (AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap dosyasından) kullanılmalıdır Kendi kendine toplanmış vajinal fırça numunelerinden elde edilmiş bisülfit dönüştürülmüş DNA'nın testi için QIAsure self-collected brush specimens Assay Profile (AP_QIASure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap dosyasından) kullanılmalıdır Reaktifi Saklama ve Kullanma Sevkiyat koşulları QIAsure Methylation Testi kuru buz üzerinde nakledilir. Teslimat esnasında QIAsure Methylation Testinin herhangi bir bileşeninin donmuş olmadığını, dış ambalajın nakliye esnasında açılmış olduğunu veya paket içinde ambalaj notu, el kitapları veya reaktiflerin bulunmadığını fark ederseniz, lütfen QIAGEN Teknik Servis Departmanıyla veya yerel dağıtımcılarla irtibata geçin (arka kapağa bakın veya adresini ziyaret edin). Saklama koşulları QIAsure Methylation Testi teslim alınmasından hemen sonra -30 ila -15 C arasında sabit sıcaklıklı bir dondurucuda saklanmalı ve ışıktan korunmalıdır. QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/

12 Stabilite QIAsure Methylation Testi, belirtilen saklama koşullarında saklandığı zaman belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. Bir kez açıldığında, reaktifler -30 ila -15 C sıcaklıkta orijinal ambalajı içinde saklanabilir. Tekrarlanan çözdürme ve dondurma işlemlerinden kaçınılmalıdır. En fazla 3 kez çözdürüp dondurmanız tavsiye edilir. Açmadan önce tüpü 10 kez ters çevirerek yavaşça karıştırın ve santrifüj edin. Her bir reaktif için son kullanma tarihleri kendi bileşen etiketleri üzerinde belirtilmiştir. Doğru saklama koşulları altında, aynı bileşen partileri kullanıldığı sürece, ürün stabilite süresince performansını korur Numune Kullanımı ve Saklanması Tüm numunelere potansiyel enfeksiyöz madde olarak bakılmalıdır. Servikal numuneler QIAsure kiti servikal numunelerden elde edilmiş bisülfit kaplı genomik DNA örnekleriyle kullanım içindir. Servikal numuneler (kazıntı) için doğrulanmış toplama ortamları PreservCyt toplama ortamı ve digene Specimen Transport Medium'dur (STM, Numune Nakil Ortamı). Laboratuvara ulaştığında klinik örneklerin optimal saklama sıcaklığı 2 ila 8 C'dir. Bu saklama koşullarında, PreservCyt toplama ortamı içindeki örnekler DNA alınmasından önce 3 ay için stabildir. 12 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

13 Not: STM içindeki servikal örnekler test laboratuvarına gece teslim edilmek için 2 ila 30 C'de nakledilebilir ve teslim alınmasından sonra -20 C'de tekrar dondurulabilir. Kendi kendine toplanmış vajinal fırça numuneleri QIAsure Methylation testi kendi kendine toplanmış fırça numunelerinden alınmış bisülfit kaplı genomik DNA örnekleriyle kullanım içindir. Kendi kendine toplanmış vajinal fırça numuneleri kuru olarak veya salin içinde (%0,9 w/v NaCl) toplanıp nakledilebilir ve laboratuvara ulaştıktan sonra PreservCyt toplama ortamı içinde saklanabilir. PreservCyt toplama ortamı içindeki örnekler 2 ila 8 C'de veya oda sıcaklığında 3 ayı geçmemek üzere saklanabilir. Genomik DNA örnekleri Genomik DNA alındıktan sonra DNA örnekleri -30 ila -15 C'de 12 aya kadar saklanabilir ve nakledilebilir. Örnek Hazırlama QIAsure Methylation Testi, ZYMO Research'ün EZ DNA Methylation kiti kullanılarak servikal numunelerden türetilip bisülfit dönüştürülmüş DNA ile kullanım için doğrulanmıştır. DNA ekstraksiyonu Standart DNA numune alma kitleri (ör. kolon temelli ve manyetik boncuk temelli kitler) QIAsure Methylation Testiyle uyumludur. DNA'da kalite ve miktar tayini DNA'nın bisülfit dönüşümünden önce DNA konsantrasyonunu ölçün. DNA konsantrasyonlarını ölçmek için uygun sistemler Qubit Florometre, NanoDrop 3300 Florospektrometre (her ikisi de Thermo Fisher Scientific'den) veya eşdeğerleri. QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/

14 Bisülfit dönüşümü için optimum DNA girişi 100 ng ile 2 µg arasındadır, bisülfit dönüşümü için 200 ng önerilir. DNA konsantrasyonu bisülfit dönüştürme için çok düşükse, DNA numune alımını klinik örneğin daha yüksek bir hacmiyle tekrarlayın veya DNA'yı daha küçük bir elüsyon hacmine ayrıştırın. Örnek alınmış DNA'nın bisülfit dönüştürmesi ZYMO research'ün EZ DNA Methylation kiti QIAsure Methylation Testiyle uyumludur. Not: EZ DNA Methylation kitine göre yeterince yüksek dönüştürme verimliliği elde etmek için (> %98), maksimum örnek DNA girdisi 2 µg'ı geçmemelidir. Reaktiflerin kontaminasyonunu engellemek için bisülfit dönüştürme reaksiyonu QIAsure Ana Karışımın saklandığı ve kullanıldığı yerden farklı, özel bir alanda gerçekleştirilmelidir. QIAsure reaksiyonunda giriş miktarı 2,5 μl bisülfit dönüşümünden geçmiş DNA'dır. Dahili örnek kalite kontrolü negatifse (yani, ACTB CT değerleri > 26,4), numune bisülfit dönüştürülmüş DNA hazırlama yetersiz miktarda ve/veya kalitede materyal ile sonuçlanmış ve geçersiz olarak değerlendirilmiştir. Geçerli aralıktaki bir ACTB CT'ye ulaşmak için bisülfit dönüştürme reaksiyonunu daha yüksek örnek DNA girdisi ile tekrarlayın ve/veya DNA izolasyonunu daha yüksek servikal numune girdisi ile tekrarlayın. Bisülfit dönüştürülmüş DNA 2 ila 8 C arasında 24 saate kadar, -25 ila -15 C arasında 5 güne kadar ve -70 C altında 3 aya kadar saklanabilir. Bisülfit dönüştürülmüş DNA'nın tekrar dondurup çözdürülmesinden daima kaçınılmalıdır. Yeterli kaliteyi korumak için dondurma çözdürme döngülerinin sayısı üçü geçmemelidir. 14 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

15 Protokol: Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM cihazı içinde QIAsure Methylation Test PCR'si* Başlamadan önce önemli noktalar Protokole başlamadan önce Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM cihazı hakkında bilgi edinin. Bkz. cihaz (kat. no veya ) kullanım kılavuzu. Rotor-Gene AssayManager v1.0, PCR sonuçlarının otomatik yorumlanmasına olanak tanır. QIAsure kiti Rotor-Gene Q MDx cihazında Rotor-Gene AssayManager v1.0 kullanarak çalıştırılmalıdır. Rotor-Gene AssayManager v1.0 (kat. no ) ve Epsilon Eklentisi hakkında bilgi edinin ve her ikisinin de kullanım kılavuzlarına bakın. Farklı örnek tipleri için farklı Rotor-Gene AssayManager v1.0 Test Profilleri gereklidir. Aşağıda belirtildiği şekilde test edilecek örnek için doğru profilin kullanıldığından emin olun: Hekim tarafından toplanmış servikal numunelerden elde edilmiş bisülfit dönüştürülmüş DNA'nın testi için QIAsure cervical scrapes Assay Profile (AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap dosyasından) kullanılmalıdır Kendi kendine toplanmış vajinal fırça numunelerinden elde edilmiş bisülfit dönüştürülmüş DNA'nın testi için QIAsure self-collected brush specimens Assay Profile (AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap dosyasından) kullanılmalıdır Not: Deney başına sadece bir örnek test tipi test edilebilir. Ayrı test profilleri her bir örnek tipi için optimize edilmiştir ve müşterilerin her belli örnek tipi için optimal sonuçlar elde etmeleri için doğru Test Profilini seçmeleri önemlidir. * Ocak 2010 veya daha sonra üretilmiş Rotor-Gene Q 5plex HRM cihazı. Üretim tarihi bilgisi, cihazın arkasındaki seri numarasından edinilebilir. Seri numarası, mm ibaresinin basamak olarak üretim ayını, yy ibaresinin üretim yılının son iki basamağını ve nnn ibaresinin benzersiz cihaz tanımlayıcıyı gösterdiği mmyynnn biçimindedir. QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/

16 Başlamadan önce yapılması gerekenler Rotor-Gene AssayManager yazılımı sürümü v1.0.x (burada x, 4'e eşit veya bu değerden daha büyüktür) Rotor-Gene Q MDx'e bağlı bilgisayarda kurulu olmalıdır. Rotor-Gene AssayManager v1.0 Core Application temel yazılım hakkında ayrıntılar için bkz. Rotor-Gene AssayManager v1.0 Core Application User Manual (Rotor-Gene AssayManager v1.0 Temel Uygulama Kullanım Kılavuzu). QIAsure Methylation Testi Epsilon Plug-in adında özel bir eklenti gerektirir (sürüm veya daha yüksek). Bu eklenti QIAGEN internet sayfasından indirilebilir: Bu eklenti, Rotor-Gene AssayManager sürüm 1.0.x (burada x, 4'e eşit veya bu değerden daha büyüktür) kurulu olan bir bilgisayara kurulmalıdır. QIAsure Methylation Testi Rotor-Gene AssayManager v1.0 yazılımıyla çalışmak için teste özel bir profil gerektirir. Bu Test Profili, deneyde döngüleme ve analiz yapmak için gereken tüm parametreleri içerir. 2 QIAsure Test Profili bulunur: 1. QIAsure cervical scrapes Test Profili (AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap dosyasından) hekim tarafından alınan servikal numunelere karşılık gelir 2. QIAsure self-collected brush specimens Test Profili (AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap dosyasından) kendi kendine alınan vajinal fırça numunelerine karşılık gelir. Profiller QIAsure Methylation Testi internet sayfasından indirilebilir: Complete-Assay-Kits/hpv-testing/qiasure-methylation-test-kit-eu/. Test profili Rotor-Gene AssayManager yazılımına aktarılmalıdır. Not: QIAsure kiti sadece Rotor-Gene AssayManager v1.0 içinde belli yapılandırma ayarları programlanmışsa çalıştırılabilir. Sistem çapında süreç güvenliği için aşağıdaki yapılandırma ayarlarının kapalı mod için ayarlanması şarttır: Material number required (Materyal numarası zorunlu) Valid expiry date required (Son kullanma tarihi geçerli olmalı) 16 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

17 Lot number required (Lot numarası zorunlu) Epsilon Plug-in kurulumu ve test profilinin içe aktarımı Epsilon Plug-in ve test profilinin kurulumu ve içe aktarılması Rotor-Gene AssayManager Temel Uygulama Kullanım Kılavuzu ve Epsilon Plug-In Kullanım Kılavuzunda ayrıntılandırılmıştır. Hem Epsilon Plug-in hem de QIAsure test profilinin en güncel sürümünü QIAGEN internet sayfasından indirin. Kurulum işlemine EpsilonPlugin.Installation.msi dosyasına çift tıklayarak başlayın ve kurulum talimatlarını izleyin. Bu işlemin ayrıntılı bir açıklaması için lütfen AssayManager Core Application User Manual (AssayManager Temel Uygulama Kullanım Kılavuzu) içinde Installing Plug-ins (Eklentilerin Kurulumu) bölümüne bakın. Not: Sistem çapında işlem güvenliği için Settings (Ayarlar) sekmesini seçin ve kapalı mod için (kısım çalışma listesi) Material number required (Materyal sayısı gerekli), Valid expiry date required (Geçerli son kullanma tarihi gerekli) ve Lot number required (Parti numarası gerekli) kutularını işaretleyin. Bunlar etkinleştirilmemişse (işaretlenmemişse), etkinleştirmek için tıklayın. Eklentinin başarıyla kurulmasının ardından, Rotor Gene AssayManager yazılımı için yönetici hakları bulunan bir kullanıcının AP_QIAsure_V1_0_Y.iap test profillerini aşağıdaki şekilde içe aktarması gerekir. 1. simgesine tıklayarak Rotor-Gene AssayManager yazılımını açın. Rotor-Gene AssayManager penceresi açılır (bkz. Şekil 1). QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/

18 Şekil 1. Rotor-Gene AssayManager oturum açma ekranı. 2. Kullanıcı adınız ve şifrenizle Rotor-Gene AssayManager'da oturum açın. Closed (Kapalı) modu değiştirmeyin. OK (Tamam) öğesine tıklayın. Rotor-Gene Assay Manager ekranı açılır (bkz. aşağıda) QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

19 1 Set-up (Kurulum) sekmesi. Bu sekme çalışma listelerinin yönetilmesine ve uygulanmasına olanak tanır. 2 Uygulanan çalışma listelerini kontrol etmek yalnızca yeni çalışma listelerini gösterir. 3 Approval (Onay) sekmesi. Bu sekme önceki deneyleri (çalışmaları) bulmanıza olanak tanır. 4 Archive (Arşiv) sekmesi. Onaylanmış eski deneyleri (çalışmaları) bulmanıza olanak tanır. 3. Yapılandırma ortamını seçin. 4. Assay Profiles (Test Profilleri) sekmesini seçin. 5. Import (İçe Aktar) öğesine tıklayın. 5 Service (Bakım) sekmesi. Yazılım tarafından oluşturulan her dosyanın bir denetim geçmişinin raporunu gösterir. 6 Configuration (Yapılandırma) sekmesi. Tüm yazılım parametrelerinin yapılandırılmasına olanak tanır. 7 Rotor-Gene Q MDx sekmeleri. Bağlı değil Bağlı 6. Servikal numuneler için AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap Test Profilini ve/veya iletişim penceresinde içe aktarılacak AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap Test Profilini seçin ve Open (Aç) öğesine tıklayın. 7. Test profili başarıyla içe aktarıldıktan sonra Setup (Kurulum) ortamında kullanılabilir. Not: Bir test profilinin aynı sürümü iki kez içe aktarılamaz. 72 tüplük rotora sahip Rotor-Gene Q MDx cihazlarında örnek işleme 70 adede kadar bisülfit dönüştürülmüş DNA örneği aynı çalışma (deney) içinde bir kalibratör ve bir şablonsuz kontrol yanında test edilebilir. Tablo 1'de bulunan şema QIAsure Methylation Testiyle bir çalışma için yükleme bloğu veya rotor ayarının bir örneğini verir. Sayılar, yükleme bloğu içinde konumları gösterir ve nihai rotor pozisyonunu belirtir. QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/

20 Tablo 1. Rotor-Gene Q MDx cihazında QIAsure kitiyle bir çalışma için plaka ve rotor kurulumu Strip Tüp konumu Örnek adı Strip Tüp konumu Örnek adı Strip Tüp konumu Örnek adı 1 1 Kalibratör 7 25 Örnek Örnek 47 2 NTC 26 Örnek Örnek 48 3 Örnek 1 27 Örnek Örnek 49 4 Örnek 2 28 Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek 51 6 Örnek 4 30 Örnek Örnek 52 7 Örnek 5 31 Örnek Örnek 53 8 Örnek 6 32 Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek 8 34 Örnek Örnek Örnek 9 35 Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek Örnek 70 Tüpler rotora Tablo 1'de gösterildiği şekilde yerleştirilmelidir. Test Profilinde kurulmuş otomatik analiz bu organizasyona dayanır. Farklı bir düzen kullanılırsa, hatalı sonuçlar elde edilecektir. Not: Tüm kullanılmamış konumları boş tüplerle doldurun. 20 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

21 72 tüplük rotora sahip Rotor-Gene Q MDx cihazlarında PCR 1. İşlenecek örnek için aşağıdaki şekilde bir çalışma listesi oluşturun: Rotor-Gene Q MDx cihazını açın. Rotor-Gene AssayManager yazılımını açın ve kapalı modda operatör rolüne sahip bir kullanıcı olarak oturum açın. Çalışma listesi yöneticisinde New work list (Yeni çalışma listesi) öğesine tıklayın ( Setup (Kurulum) ortamında). Kullanılabilir test profilleri listesinden QIAsure test profilini (QIAsure assay profile) seçin. Not: AP_QIAsure_CervicalScrape_V1_0_Y.iap Test Profili servikal numunelere karşılık gelir; AP_QIAsure_SelfCollectedBrush_V1_0_Y.iap Test Profili kendi kendine alınmış vajinal fırça numunelere karşılık gelir. Not: Deney başına sadece bir örnek test tipi test edilebilir. Seçilen test profilini Selected assay profiles (Seçilen test profilleri) listesine aktarmak için Move (Taşı) öğesine tıklayın. Test profili artık Selected assay profiles (Seçilen test profilleri) listesinde görüntülenmelidir. İlgili alana, örnek sayısını girin. Kutunun kapağında basılı aşağıdaki QIAsure kiti bilgileri girin. Materyal numarası: YYYY-AA-GG biçimi kullanılarak geçerli son kullanma tarihi Lot numarası Samples (Örnekler) adımını seçin. Örnek ayrıntılarının bir listesi AssayManager ekranında gösterilecektir. Bu liste, beklenen rotor düzenini temsil eder. Örnek tanımlama numarasını/numaralarını her örnek için bir yorum gibi tüm isteğe bağlı örnek bilgileriyle birlikte bu listeye girin. QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/

22 Properties (Özellikler) adımını seçin ve bir çalışma listesi adı girin (Şekil 2). Şekil 2. Özellikler. is applicable (uygulanabilir) onay kutusunu işaretleyin ve Apply (Uygula) öğesini tıklayın. Çalışma listesini kaydedin. Çalışma listesi yazdırılabilir; bu, PCR hazırlığına ve kurulumuna yardımcı olur. Çalışma listesini yazdırmak için Print work list (Çalışma listesini yazdır) öğesine tıklayın. Örnek bilgileri bu çalışma listesinin bir parçası olacaktır. Not: Çalışma listesi, çalışma cihazda kurulduktan sonra oluşturulabilir veya çalışma listesi cihaza örnekleri eklemeden önce kaydedilebilir. 2. QIAsure çalışmasını kurun. PCR reaksiyonu kontaminasyonu riskini en aza indirgemek için UV ışınımı kapasitesi bulunan bir PCR kabini kullanmanız şiddetle tavsiye edilir. QIAsure Ana Karışımın kullanımı DNA bisülfit dönüştürme reaksiyonunun gerçekleştirildiği alandan ayrı bir alanda gerçekleştirilmelidir. Şablon veya nükleaz kontaminasyonunu engellemek için masa alanını, pipetleri ve tüp raklarını DNA bozucu solüsyon ile kullanmadan önce temizleyin. Not: Yanlış pozitif sonuçlara yol açabilecek herhangi belirsiz şablon veya reaksiyon karışımı kontaminasyonundan kaçınmak için her tüp arasında uçları değiştirin. 22 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

23 QIAsure Ana Karışım ve QIAsure Kalibratörü tamamen çözdürün ve QIAsure Ana Karışımı mümkün olduğunca ışıktan koruyun. Not: Çözdürme adımı 30 dakikadan uzun sürmemelidir, aksi takdirde materyal bozulabilir. Kullanmadan önce 10 kez ters çevirerek yavaşça karıştırın, ardından kısa süre santrifüjleyin. Kullanıma hazır QIAsure Ana Karışımın 17,5 µl'sini uygun strip tüplerine aktarın. Reaksiyon kurulumu oda sıcaklığında yapılabilir. Herhangi bir materyal bozunumundan kaçınmak için QIAsure Ana Karışımı dondurucuya geri koyun. Test kontrollerini ve bisülfit dönüştürülmüş örnekleri aktarmak için tüpleri ayrı bir alana götürün. no template control (NTC) (şablonsuz kontrol (NTC)) konum 2'ye 2,5 µl su ekleyin (bkz. yukarıdaki Tablo 1). Yukarı aşağı pipetleme yaparak yavaşça karıştırın. Konum 1'e 2,5 µl QIAsure Kalibratör ekleyin (bkz. yukarıdaki Tablo 1). Aşağı yukarı pipetleyerek yavaşça karıştırın ve tüpü bir kapak ile kapatın. Karşılık gelen tüpe 2,5 bisülfit dönüştürülmüş DNA ekleyin. Yukarı aşağı pipetleme yaparak yavaşça karıştırın. 4 tüplük bir grup doldurulduğunda tüpleri kapatın. Not: PCR tüpleri örneklerin PCR tüplerine pipetlenmesiyle deneyin başlangıcı arasında makine içinde karanlıkta 2 ila 8 C arasında 30 dakika için saklanabilir. Herhangi bir materyal bozunumundan kaçınmak için QIAsure Kalibratörü dondurucuya geri koyun. Not: Yanlış pozitif sonuçlara yol açabilecek herhangi belirsiz şablon veya reaksiyon karışımı kontaminasyonundan kaçınmak için her tüp arasında uçları değiştirin. 3. Aşağıdaki şekilde Rotor-Gene Q MDx'i hazırlayın ve çalışmayı (deneyi) başlatın: 72 kuyulu rotoru rotor tutucuya yerleştirin. QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/

24 Rotoru Tablo 1'de (sayfa 20) gösterildiği şekilde atanmış pozisyonlara göre pozisyon 1'den başlayarak ve kullanılmayan tüm pozisyonlara boş kapaklı şerit tüpleri yerleştirerek şerit tüpleriyle doldurun. Not: İlk tüpün pozisyon 1'e yerleştirildiğinden ve şerit tüplerinin Tablo 1'de (sayfa 20) gösterildiği şekilde doğru yönelim ve pozisyonda yerleştirildiğinden emin olun. Kilitleme halkasını takın. Rotoru ve kilitleme halkasını Rotor-Gene Q MDx cihazına yükleyin ve cihaz kapağını kapatın. Rotor-Gene AssayManager v1.0 yazılımında çalışma listesi yöneticisinden karşılık gelen çalışma listesini seçip Apply (Uygula) öğesine tıklayın ya da çalışma listesi hala açıksa Apply (Uygula) öğesine tıklayın. Not: Çalışma için çalışma listesi oluşturulmamışsa Rotor-Gene AssayManager v1.0'da oturum açın ve ilerlemeden önce adım 1'i uygulayın. Çalışma (deney) adını girin. Cycler selection (Döngüleyici seçimi) içinden kullanılacak döngüyü seçin. Kilitleme halkasının doğru takıldığını kontrol edin ve ekranda bunu onaylayın. Start experiment (Deneyi başlat) öğesine tıklayın. 4. QIAsure Methylation Testi başlamalıdır. 5. Çalışma bittiğinde Finish run (Çalışmayı bitir) öğesine tıklayın. 6. Çalışmayı çıkarın ve onaylayın. Bir Approver (Onaylayıcı) rolüyle oturum açan kullanıcılar Release and go to approval (Çıkar ve onaya git) öğesine tıklamalıdır. Bir Operator (Operatör) rolüyle oturum açan kullanıcılar Release (Çıkar) öğesine tıklamalıdır. 7. Sonuçları çıkarın. Release and go to approval (Çıkar ve onaya git) tıklandıysa, deney sonuçları görüntülenir. 24 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

25 Bir kullanıcı rolündeki kullanıcı tarafından Release (Çıkar) öğesine tıklanmışsa, Approver (Onaylayıcı) rolünde bir kullanıcının oturum açması ve Approval (Onay) ortamını seçmesi gerekecektir. Filtre seçeneklerini seçip Apply (Uygula) öğesine tıklayarak testin onaylanması için filtreleyebilirsiniz. Sonuçları inceleyin ve her test örneğinin sonuçlarını onaylayın. Results (Sonuçlar) tablosunda onaylanacak örneğe doğru ekranı kaydırın. Onaylanacak her örnek sonucunun ilgili sıranın sonunda üç seçenek düğmesi bulunur. Bir örneğin sonucu için accept (kabul et) ya da reject (reddet) öğesine tıklayın. Not: Rotor-Gene AssayManager tarafından otomatik olarak INVALID (Geçersiz) olarak ayarlanmış bir sonuç reddedilmişse bile artık geçerli bir sonuca dönüştürülemez. İsteğe Bağlı: Sample comment (Örnek yorumu) sütununa bir yorum girin. Release/Report data (Veriyi Çıkar/Raporla) öğesine tıklayın. OK (Tamam) öğesine tıklayın. Rapor Adobe Portable Document formatında (.pdf) oluşturulur ve önceden tanımlanmış klasörde otomatik olarak saklanır. Varsayılan dosya konumu: QIAGEN > Rotor-Gene AssayManager > Export > Reports Not: Bu konum ve klasör, Configuration (Yapılandırma) ortamından değiştirilebilir. Ham veriye karşılık gelen.rex dosyasını dışa aktarmak için Archive (Arşiv) sekmesine gidin. Filtre seçeneklerini kullanarak deneyinizi bulun ve show assays (testleri göster) öğesine tıklayın. Ardından Export.rex file (.rex dosyasını dışa aktar) öğesine tıklayın ve OK (Tamam) öğesine tıklayarak kaydedin. Yazılım.rex dosyasını aşağıdaki önceden belirlenmiş klasöre otomatik olarak kaydeder: QIAGEN > Rotor-Gene AssayManager > Export > Experiments Not: Bu dizin ve klasör specify the.rex file export destination (.rex dosyası dışa aktarma hedefini belirle) sekmesinden değiştirilebilir. Not: Sorun giderme için çalışmanın destek paketi gereklidir. Destek paketi Approval (Onay) veya Archive (Arşiv) ortamlarından oluşturulabilir. QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/

26 adresinde bulunan Rotor-Gene AssayManager Core Application User Manual (Rotor-Gene AssayManager Temel Uygulama Kullanım Kılavuzu), Troubleshooting (Sorun Giderme), Creating a support package (Bir destek paketi oluşturma) bölümüne bakın. Ek olarak, olay tarihine göre ±1 gün şeklinde denetim geçmişi girmek faydalı olabilir. Denetim geçmişi Service (Hizmet) ortamından alınabilir (Rotor-Gene AssayManager Temel Uygulama Kullanım Kılavuzu). 8. Rotor-Gene Q MDx cihazını boşaltın ve şerit tüplerini yerel güvenlik düzenlemelerine uygun şekilde imha edin. Sonuçların Yorumlanması Analiz tamamen otomatiktir. Rotor-Gene AssayManager v1.0 öncelikle amplifikasyon eğrilerini analiz eder; şekillerine ve gürültü miktarlarına bakarak uygun olmayan eğrileri geçersiz sayabilir. Böyle bir durum söz konusu olursa, geçersiz sayılan eğri, bir bayrakla işaretlenir (bkz. Tablo 2). Ardından Rotor-Gene AssayManager v1.0 kontrolleri çalıştıracaktır. Kalibratör NTC Not: Çalışmanın sonunda oluşturulan rapor, çalışma kontrollerinden alınan sonuçları gösterir ve geçersiz verilerin önünde geçersiz kılan bayraklar bulunur. Çalışmadaki tüm kontroller uygun değerdeyse, Rotor-Gene AssayManager bilinmeyen örnekleri analiz eder. Tablo 2, ayrı bir tüpe analiz sırasında Rotor-Gene AssayManager v1.0 tarafından atanabilen geçersiz kılan örnek bayraklarını bu bayrağın ne anlama geldiğinin açıklamasıyla göstermektedir. 26 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

27 Tablo 2. Geçersiz kılan örnek bayrakları ve terimlerin açıklamaları QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/

28 İşaret Davranış Tanım ABOVE_ACCEPTED_RANGE Geçersiz Hedef değeri tanımlanan aralıktan daha yüksek. Bu bir CT, son nokta floresansı veya hesaplanmış değer ör. ortalama CT veya CT olabilir. ASSAY_INVALID Geçersiz Test geçersizdir çünkü harici kontrollerin en az biri geçersizdir. BELOW_ACCEPTED_RANGE Geçersiz Hedef değeri tanımlanan aralıktan daha düşük. Bu bir CT, son nokta floresansı veya hesaplanmış değer ör. ortalama CT veya CT olabilir. CONSECUTIVE_FAULT Geçersiz Bu hedefin hesaplanması için kullanılan bir hedef geçersizdir. CURVE_SHAPE_ANOMALY Geçersiz Ham veri amplifikasyon eğrisi, bu test için tesis edilen davranıştan farklı bir şekil göstermektedir. Yanlış sonuç alınmış veya sonuçların yanlış yorumlanmış olması olasılığı yüksektir. FLAT_BUMP Geçersiz Ham veri amplifikasyon eğrisi, bu test için tesis edilen davranıştan düz bir tümsek şeklinde farklılık göstermektedir. Yanlış sonuç alınmış veya sonuçların yanlış yorumlanmış olması olasılığı yüksektir (ör. yanlış CT değeri belirlenmesi). IN_ACCEPTED_RANGE Geçerli NTC hedef ACTB için 36 üzerindeki sinyal CT değerlerini gösterir. INVALID_CALCULATION Geçersiz Bu hedef için hesaplama başarısız. MULTIPLE_THRESHOLD_CROSSING Geçersiz Amplifikasyon eğrisi eşiği birden çok kez geçiyor. Belirsiz bir CT belirlenemez. NO_BASELINE Geçersiz Başlangıç referans hattı için hiçbir başlangıç değeri bulunamadı. NO_CT_DETECTED Değişken Bu hedef için hiçbir CT algılanamadı. NO_VALUE Geçersiz Hedefin bir değeri yok ancak olması bekleniyor. Bu değer belli bir aralıkta olmak zorunda değildir. Bu bir CT, son nokta floresansı veya hesaplanmış değer ör. ortalama CT veya CT olabilir. NORM_FACTOR_ALTERATION Uyarı Normalizasyon işlemi sırasında sapma. Amplifikasyon eğrisi varsayılan normalizasyon ile görüntülenir; sonuçların doğruluğu manuel olarak kontrol edilmelidir. OTHER_TARGET_INVALID Geçersiz Aynı örnek için başka bir hedef geçersiz. SATURATION Geçersiz Amplifikasyon eğrisinin bükülme noktasından önce ham veri floresanı kuvvetli bir şekilde doygunluğa ulaşıyor. SATURATION_IN_PLATEAU Uyarı Amplifikasyon eğrisinin plato evresinde ham veri floresanı doygunluğa ulaşıyor. 28 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

29 SPIKE Uyarı Amplifikasyon eğrisinin içinde ancak CT'nin belirlendiği alanın dışında ham veri floresansında ani bir artış saptandı. SPIKE_CLOSE_TO_CT Geçersiz Amplifikasyon eğrisinde CT değerinin yakınında ani bir artış saptandı. STEEP_BASELINE Geçersiz Amplifikasyon eğrisinde ham veri floresanı için dik bir şekilde yükselen referans hattı saptandı. STRONG_BASELINE_DIP Geçersiz Amplifikasyon eğrisinde ham veri floresanı için kuvvetli bir şekilde düşen referans hattı saptandı. STRONG_NOISE Geçersiz Amplifikasyon eğrisinin yükselme fazının dışında büyük bir gürültü saptandı. STRONG_NOISE_IN_GROWTH_PHASE Geçersiz Amplifikasyon eğrisinin yükselme (katsal) fazında büyük bir gürültü saptandı. UNCERTAIN Değişken AUDAS'tan gelen sonuçlar temel analizden gelen sonuçlarla çelişiyor. Veri doğruluğunun belirsiz bir otomatik değerlendirmesi mümkün değildir. UNEXPECTED_CT_DETECTED Değişken Çoğalmaması gereken bir hedef için bir CT değeri algılandı. UNEXPECTED_VALUE Geçersiz Hedefin bir değeri var ancak bu değer beklenen bir değer değil. Bu bir CT, son nokta floresansı veya hesaplanmış değer ör. ortalama CT veya CT olabilir. UPSTREAM Değişken Örnek durumu yukarı yönlü bir işlem tarafından (ör. QIAsymphony) Invalid (Geçersiz) veya Unclear (Belirsiz) olarak ayarlanmış. Not: Belirsiz olarak işaretlenmiş örnekler için Rotor- Gene AssayManager davranışı AssayManager yazılımının Configuration (Yapılandırma) ortamında tanımlanır. Yukarı yönlü işlemlerden gelen Invalid (geçersiz) bayrakları daima Rotor- Gene AssayManager'da karşılık gelen bir numune ile sonuçlanır. WAVY_BASE_FLUORESCENCE Geçersiz Amplifikasyon eğrisinde ham veri floresanı için dalgalı referans hattı saptandı. Çalışmadaki tüm kontroller geçerliyse, Rotor-Gene AssayManager v1.0 bilinmeyen örnekleri analiz eder. Sonuçların yorumlanabilmesi için örnekte minimal bir miktarda bisülfit dönüştürülmüş DNA bulunmalıdır. Bu, Rotor-Gene AssayManager tarafından bir örneğin doğrulanabilmesi için 26,4 olan düzenleyici gen ACTB'nin CT değeri ile gösterilir. Ardından FAM19A4 ve hsa-mir124-2 için CT değerleri hesaplanacaktır ve sonuç verilecektir. Bir CT değeri kesme değerinin altındaysa hedef Hypermethylation positive (Hipermetilasyon pozitif) olarak değerlendirilir. QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/

30 Not: Kısmi veya düşük metilasyon düzeyleri, hipermetilasyon düzeylerinin aksine, doğal olarak oluşan ve kanser gelişimiyle doğrudan ilgili olmayan olgulardır. Bir örnek hedeflerin en az biri Hypermethylation positive (Hipermetilasyon pozitif) olarak değerlendirildiğinde Hypermethylation positive (Hipermetilasyon pozitif) olarak görülür. Sorun Giderme Kılavuzu Bu sorun giderme kılavuzu ortaya çıkabilecek sorunların çözümünde yardımcı olabilir. Daha fazla bilgi için ayrıca Teknik Destek Merkezimizdeki Sık Sorulan Sorular sayfasına da bakın: QIAGEN Teknik Servislerindeki uzmanlar her zaman bu el kitabındaki bilgiler ve protokoller ya da örnek ve test teknolojileriyle ilgili tüm sorularınızı yanıtlamaktan mutluluk duyar (iletişim bilgileri için arka kapağa bakın veya adresini ziyaret edin). Rotor-Gene AssayManager ile ilgili sorun giderme bilgileri için lütfen bkz. Rotor-Gene AssayManager Core Application User Manual (Rotor-Gene AssayManager Temel Uygulama Kullanım Kılavuzu). Yorum ve öneriler Genel kullanım Örnek DNA konsantrasyonu bisülfit dönüştürme için çok düşük DNA numunesini kontrol edin DNA numunesi almayı daha konsantre bir klinik örnek ile tekrarlayın Örnek geçersiz olarak değerlendirilmiş: ACTB'nin amplifikasyonu çok düşük veya yok a) Pipetleme hatası ya da unutulmuş reaktifler b) DNA konsantratını kontrol edin Pipetleme şemasını ve reaksiyon kurulumunu kontrol edin. PCR çalışmasını tekrarlayın. Bisülfit dönüştürme için DNA girdisini maksimuma çıkarın. Bisülfit dönüştürme reaksiyonu 100 ng ila 2 µg aralığındaki DNA girdisi için en iyi performansa sahiptir 30 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

31 c) Bisülfat dönüştürülmüş elüatı kontrol edin Yorum ve öneriler Bisülfat dönüştürmeyi tekrarlayın, gerektiğinde daha yüksek bir DNA girdisi kullanılabilir. Örnek geçersiz olarak değerlendirilmiş: FAM19A4 ve/veya hsa-mir124-2 hedefleri geçersiz Yetersiz karıştırma Örneği ve reaksiyon karışımını pipetleyerek karıştırın (tüp başına yaklaşık 10 kez). Örneği tekrarlayın. Pozitif kontrol geçersiz olarak değerlendirilmiş: bir veya daha fazla hedefte amplifikasyon çok düşük veya yok a) Pipetleme hatası ya da unutulmuş reaktifler Pipetleme şemasını ve reaksiyon kurulumunu kontrol edin. PCR çalışmasını tekrarlayın. b) Kısmi bozunma Kit içeriğini -15 ila -30 C arasında saklayın. c) PCR reaktifleri kısmen bozunmuş Tekrar dondurup çözdürmeyi maksimum üç döngüyle sınırlandırın. Kit içeriğini -15 ila -30 C arasında saklayın ve reaksiyon karışımlarını ışıktan koruyun. Tekrarlanan dondurma ve çözdürme işlemlerinden kaçının. d) Şerit tüpünün ters dönmesi Pipetleme şemasını ve reaksiyon kurulumunu kontrol edin. e) Son kullanma tarihi Kullanılan kitin son kullanma tarihini kontrol edin. f) Örneklerin pipetlenmesi ve çalışmanın başlangıcı arasındaki gecikme süresi PCR reaksiyon karışımları örneklerin PCR reaksiyonlarına aktarılması ile makinede çalışmanın başlatılması arasında karanlıkta 2 8 C'de 30 dakika boyunca saklanabilir. Şablonsuz kontrol (NTC) geçersiz a) Pipetleme hatası Pipetleme şemasını ve reaksiyon kurulumunu kontrol edin. PCR çalışmasını tekrarlayın. b) Çapraz kontaminasyon Tüm kritik reaktifleri değiştirin. Taşınma kontaminasyonunu önlemek için her zaman örnekleri, kit bileşenlerini ve sarf malzemelerini yaygın olarak kabul edilen uygulamalar çerçevesinde kullanın. QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/

32 Yorum ve öneriler c) Reaktif kontaminasyonu Tüm kritik reaktifleri değiştirin. Taşınma kontaminasyonunu önlemek için her zaman örnekleri, kit bileşenlerini ve sarf malzemelerini yaygın olarak kabul edilen uygulamalar çerçevesinde kullanın. d) Şerit tüpünün ters dönmesi Pipetleme şemasını ve reaksiyon kurulumunu kontrol edin. e) Örneklerin pipetlenmesi ve çalışmanın başlangıcı arasındaki gecikme süresi PCR reaksiyon karışımları örneklerin PCR reaksiyonlarına aktarılması ile makinede çalışmanın başlatılması arasında karanlıkta 2 8 C'de 30 dakika boyunca saklanabilir. f) Prob degradasyonu Reaksiyon karışımlarını ışıktan koruyun. Floresan eğrisini yanlış pozitiflere karşı kontrol edin. Örnekte sinyal yok veya düşük, ancak kontrol çalışması iyi a) İnhibitör etkileri Bisülfit dönüştürme sırasında santrifüjleme sonrasında filtre üzerinde tampon kalıntısı olmadığını daima kontrol edin. Bisülfit dönüştürmeyi tekrarlayın. b) Pipetleme hatası Pipetleme şemasını ve reaksiyon kurulumunu kontrol edin. PCR çalışmasını tekrarlayın. Problem devam ederse QIAGEN Teknik Servisiyle irtibat kurun. Sınırlamalar QIAsure Methylation Testi reaktifleri sadece in vitro tanılama için kullanılabilir. PCR testlerinin kullanımı ekipmanların bakımı dahil olmak üzere, moleküler biyolojiye özel ve yürürlükteki yönetmeliklere ve ilgili standartlara uygun iyi laboratuvar uygulamaları gerektirir. 32 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

33 Bu kit içinde sağlanan reaktifler ve talimatlar en iyi performans için onaylanmıştır. QIAsure Methylation Testi, Rotor-Gene Q MDx cihazları ve Rotor-Gene AssayManager v1.0'in kullanımında eğitimli laboratuvar çalışanları tarafından kullanılmalıdır. Bu ürün sadece gerçek zamanlı PCR tekniklerinde ve in vitro tanılama prosedürlerinde özel olarak bilgilendirilmiş ve eğitimli çalışanlar tarafından kullanılmalıdır. Elde edilmiş herhangi bir tanı amaçlı sonucun diğer klinik ve laboratuvar bulguları ile birlikte yorumlanması gerekir. En iyi PCR sonuçları için kullanım kılavuzuna (el kitabı) harfiyen uyumluluk gereklidir. Tüm bileşenlerin kutusunda ve etiketlerinin üstünde yazılı olan son kullanma tarihlerine dikkat edilmelidir. Son kullanma tarihleri geçmiş bileşenleri kullanmayın. Düşük DNA kalitesi/miktarına sahip örnekler (yani ACTB CT değerleri kabul edilebilir kriterin sınırında; CT değerleri 25 ila 26,4 arasında) yanlış negatif olarak değerlendirilebilir. Tek başına tekrar test edilmesi önerilir. Tekrar testindeki negatif bir sonuç örneğin hipermetilasyon negatif olduğu, pozitif bir sonuç örneğin hipermetilasyon pozitif olduğu anlamına gelir. QIAsure Methylation Testine tedarik edilmiş tüm reaktifler, yalnızca aynı kit ile tedarik edilen reaktiflerle birlikte kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Bu performansı olumsuz etkileyebilir. QIAsure Methylation Testi HPV pozitif kadınlar için doğrulanmıştır. QIAsure Methylation Testi PreservCyt veya STM toplama ortamında toplanmış ve saklanmış servikal numuneler için ve kendi kendine saline içine toplanmış (%0,9 w/v NaCl) vajinal fırça numuneleri için doğrulanmıştır. QIAsure Methylation Testi formaldehit içeren örnek toplama ortamlarında, ör. BD Surepath veya eşdeğerinde, toplanmış ve saklanmış servikal numuneler ile kullanım için doğrulanmamıştır. Formaldehit DNA'nın çapraz bağlanmasına neden olarak QIAsure Methylation Testinin performansını etkileyebilir. QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/

34 Yalnızca Rotor-Gene Q MDx, QIAsure Methylation Test PCR testi ile kullanım için doğrulanmıştır. Bu ürünün herhangi bir etiket dışı kullanımı ve/veya bileşenlerin değiştirilmesi Selfscreen B.V. sorumluluğunu geçersiz kılar. Self-screen performans çalışmaları kapsamında olmayan laboratuvarlarında kullanılan herhangi bir prosedür için sistem performansının doğrulanması kullanıcıların sorumluluğundadır. Performans Özellikleri Tespit Sınırı (LOD) QIAsure Methylation Testinin analitik hassasiyeti üç amplikon diziliminin tümünü içeren plazmidin seri bir seyreltme serisini kullanarak tespit sınırının %95'i (%95 LOD) olarak belirlenmiştir (yani ACTB, FAM19A4 ve hsa-mir124-2; aralık PCR başına ila 0,25 kopya). Hedefler için %95 LOD en az 35/36 pozitif sonuç veren en düşük plazmid dilüsyonu olarak değerlendirilmiştir (CT< 40). Dört farklı kullanıcı tarafından (kullanıcı başına günde 1 deney) üç farklı Parti ve üç farklı RGQ sistemi kullanılarak toplam 12 deney gerçekleştirilmiştir. Her deney 11 plazmid dilüsyonunun üçlü kopya testini içermektedir. Üç farklı hedefin tümü için %95 LOD PCR başına 7,5 kopyadır. Doğrusallık QIAsure testinin doğrusallığı %95 LOD'u değerlendirmek için gerçekleştirilen 12 deneyden gelen verilerle belirlenmiştir. İki hedef (FAM19A4 ve hsa-mir124-2) ve referans ACTB PCR başına ila 7,5 kopyaya kadar doğrusal amplifikasyona sahiptir. 34 QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/2017

35 Hassasiyet QIAsure Methylation Testinin hassasiyeti test içi değişkenlik olarak belirlenmiştir (bir deneyde aynı konsantrasyona sahip örneklerin çoklu sonuçlarının değişkenliği) ve testin toplam varyansı (farklı kullanıcılar tarafından, farklı cihazlarda, farklı partilerle, farklı laboratuvarlarda oluşturulmuş çoklu test sonuçlarının değişkenliği). Test, hem FAM19A4 hem de hsa-mir124-2 için hipermetilasyon pozitif sonuç vermiş LOD konsantrasyonunun yaklaşık 3 katına karşılık gelen yüksek riskli HPV pozitif servikal numuneden elde edilmiş bisülfit dönüştürülmüş DNA üzerinde gerçekleştirilmiştir. Test 8 çalışmada kopyalı olarak dört farklı kullanıcı tarafından (günde kullanıcı başına bir çalışma) iki farklı laboratuvarda iki farklı Parti ve üç farklı RGQ makinesi kullanarak, örnek başına 16 veri noktasıyla gerçekleştirilmiştir. Değişkenlik katsayısı (CV) CT ve CT değerleri için belirlenmiştir (Tablo 3). Tablo 3. Metilasyon pozitif bir servikal numunedeki CT ve CT değerlerinin %CV'si Örnek türü Testler arası değişkenlik Testin toplam varyansı CT değeri Dahili örnek kalite kontrolü (yani ACTB) %0,3 %1,32 FAM19A4 %1,02 %1,52 hsa-mir124-2 %1,16 %1,64 CT değeri FAM19A4 %3,70 %5,97 hsa-mir124-2 %4,21 %5,75 Belirtilen konsantrasyondaki bir örneğin CT değerlerindeki toplam istatistiksel yayılması dahili örnek kalite kontrolü (ACTB) için %1,32, FAM19A4 için %1,52 ve hsa-mir124-2 için %1,64'dır. Belirtilen konsantrasyondaki bir örneğin CT değerlerindeki toplam istatistiksel yayılması FAM19A4 için %5,97 ve hsa-mir124-2 için %5,75'tir. Engelleyici Maddeler PCR üzerindeki olası etkileri için seçilen engelleyici maddeler bisülfit dönüştürme kitinin desülfonasyon ve yıkama tamponudur. Orijinal örnekte potansiyel olarak bulunan maddeler, örnek DNA'sının silika boncuklarıyla iki kez, yani orijinal örnekten DNA numunesi alma ve QIAsure Methylation Testi Kullanım Talimatları (El Kitabı) 03/