AĞIZDAN KULLANILAN BAZI SÜLFONAMİD PREPARATLARININ BROİLERLERDE BİYOEŞDEĞERLİLİĞİ. Levent ALTINTAŞ 2006-ANKARA

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ AĞIZDAN KULLANILAN BAZI SÜLFONAMİD PREPARATLARININ BROİLERLERDE BİYOEŞDEĞERLİLİĞİ Levent ALTINTAŞ FARMAKOLOJİ VE TOKSİKOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Doç. Dr. Ender YARSAN 2006-ANKARA

2 ii Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmakoloji ve Toksikoloji Doktora Programı Çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma, aşağıdaki jüri tarafından Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir. Tez Savunma Tarihi: 03 / 02 / 2006 Prof. Dr. Sezai KAYA Ankara Üniversitesi Jüri Başkanı Prof. Dr. Ayhan FİLAZİ Ankara Üniversitesi Doç. Dr. Hamdi UYSAL Ankara Üniversitesi Doç. Dr. Ender YARSAN Ankara Üniversitesi Doç. Dr. Abdurrahman AKSOY Ankara Üniversitesi

3 iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay Sayfası İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar dizini Şekiller Dizini Çizelgeler Dizini ii iii vi vii viii ix 1. GİRİŞ Biyoeşdeğerlilik Biyoyararlanım/Biyoeşdeğerlilik Ölçütleri Tek Doz Çalışmaları Yinelenen Doz (Kararlı Durum) Çalışmaları Biyoyararlanım/Biyoeşdeğerlilik Çalışmalarında Kullanılan Yöntemler Biyoeşdeğerliliğin Değerlendirilmesi Biyoyararlanım/Biyoeşdeğerlilik Ölçütlerinin Kabul Sınırları Sülfonamidler Genel Yapısı Etki Şekli Etki Spektrumu Farmakokinetik Özellikleri Klinik Kullanımı Trimetoprim 18

4 iv Genel Yapısı Etki Şekli Farmakokinetik Özellikleri Klinik Kullanımı Sülfonamid-Trimetoprim Kombinasyonu Etki Şekli Etki Spektrumu Farmakokinetik Özellikleri Klinik Kullanımı Çalışmanın Amacı GEREÇ ve YÖNTEM Gereç Araç ve Cihazlar Kimyasal Maddeler ve Çözeltiler Kullanılan İlaçlar Laboratuar Malzemeleri Analitik Çözeltiler Deneme Hayvanları Yöntem Hayvan Deneyi Hayvanların Bakım ve Beslenmesi Hayvanların Gruplandırılması İlaçların Verilmesi ve Kan Örneklerinin Toplanması Plazma Analizleri 26

5 v Plazma Sülfametoksazol ve Trimetoprim Yoğunluklarının Belirlenmesi Duyarlılık Limiti ve Geriye Kazancın Belirlenmesi HPLC Parametreleri Farmakokinetik Hesaplamalar İstatistiksel Hesaplamalar BULGULAR Plazma SMZ/TMP Değerlerinin Tespitine Yönelik Bulgular SMZ/TMP nin HPLC de Pik Zamanları Standart Eğrilerin Çizdirilmesi SMZ/TMP Miktarları Metodun Duyarlılık Limitleri Geriye Kazanç Oranları Farmakokinetik Değişkenlere Yönelik Bulgular TARTIŞMA SONUÇ ve ÖNERİLER 42 ÖZET 44 SUMMARY 45 KAYNAKLAR 46 EKLER 51 Ek-1 (Etik Kurul Kararı) 52 ÖZGEÇMİŞ 53

6 vi ÖNSÖZ Sülfonamidler veteriner hekimliğinde sıklıkla kullanılan ve sentetik olarak hazırlanan; sülfanilik asitin amidleri ve türevleri veya sülfa ilaçlar diye de bilinen maddelerdir. Ucuz ve dayanıklı olmaları, kolay bir şekilde uygulanabilmeleri, etki spektrumlarının geniş olması ve özellikle de diğer ilaçlarla birlikte kullanılmaları halinde etki spektrumlarının daha da genişlemesi gibi avantajları bulunmaktadır. Bu avantajlarından dolayı, günümüzde başta kanatlılar olmak üzere, bütün evcil hayvanlardaki bakteri ve parazitlerden ileri gelen solunum ve sindirim sistemi ile idrar yolları hastalıklarında tek başlarına ya da diaminoprimidin türevleri ile birlikte geniş ölçüde kullanılırlar. Veteriner hekimliğinde yaygın olarak kullanılan bu tip müstahzarların kalite kontrol testleri içerisinde biyoeşdeğerlilik denemeleri de önemli bir yere sahiptir. Biyoeşdeğerlilik denemesi aynı etkin maddeyi içeren farklı formülasyonların karşılaştırılması için yapılan biyolojik temelli bir kalite-kontrol testidir. Biyoeşdeğerlilik çalışmalarındaki amaç; farmasötik teknoloji ile benzer farmakolojik etkiyi elde etmek için aynı etkin maddeyi içeren çeşitli ilaç formülasyonlarının değişebilirliliğini; yani, aralarındaki farklılıkları belirlemektir. Burada sözü edilen, farklı fizyolojik yada formülasyonların oranları ve ilacın emiliminin etkisini ölçmektir. Veteriner ilaçlarında da biyoeşdeğerlilik kavramı Avrupa Birliği ve diğer ülkelerde gittikçe artan öneme sahip bir kalite kontrolüdür. Antibakteriyel ilaçların farmakokinetik hareketlerini değiştiren faktörlerin anlaşılması, bu ilaçların etkinliklerinin en üst düzeye çıkarılması için oldukça önemlidir. Sülfametoksazol ülkemizde tavuk hastalıklarının sağaltımında geniş bir kullanım alanı bulmasına rağmen, farklı formülasyonlardaki preparatlarının biyoeşdeğerliliği yönünden herhangi bir araştırma yapılmamıştır. Bu çalışmanın yapılmasında emeği geçen başta danışman hocam Doç.Dr. Ender YARSAN olmak üzere, tez izleme komitemde yer alan Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı Başkanı Prof.Dr. Sezai KAYA ve Doç.Dr. Hamdi UYSAL a; Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyeleri, Araştırma Görevlileri ve çalışan personele; tez çalışmamın uygulama aşamasındaki yardımlarından dolayı Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi nden Araş.Gör.Dr. Dinç EŞSİZ e; Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi nden Yrd.Doç.Dr. Cengiz GÖKBULUT a; Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi nden Yrd.Doç.Dr. Gökhan ERASLAN ve Yrd.Doç.Dr. Murat KANBUR a; Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi nden Doç.Dr. Muammer ELMAS ve Araş.Gör. Kamil ÜNEY e; Abant İzzet Baysal Üniversitesi Mudurnu Meslek Yüksekokulu ndan Yrd.Doç.Dr. Serkan Çakır a içtenlikle teşekkür ederim.

7 vii SİMGELER ve KISALTMALAR α β EAA k a M OKS t 1/2α t 1/2β t 1/2a t doruk Y doruk 0 Y p c.a. ABD AB SMZ TMP İS BY/BE Dİ PBS DAP HPLC FDA WHO EMEA : Plazma ilaç yoğunluğu dağılma dönemi hız sabitesi : Plazma ilaç yoğunluğu atılma dönemi hız sabitesi : Plazma ilaç yoğunluğu-zaman eğrisi altında kalan alan : Emilmeli verilmelerde birinci derece emilme hız sabitesi : Molar : İlacın vücutta ortalama kalış süresi : α-dönemi yarı ömrü : β-dönemi yarı ömrü : Ağızdan verilme durumunda sindirim kanalından emilme yarı ömrü : Plazma ilaç yoğunluğunun doruk değere ulaşma süresi : Plazma doruk ilaç yoğunluğu : t 0 anında plazma ilaç yoğunluğu : Canlı ağırlık Amerika Birleşik Devletleri Avrupa Birliği Sülfametoksazol Trimetoprim İnternal Standart Biyoyararlanım/Biyoeşdeğerlilik Damar içi Fosfat Tampon Diaminoprimidin Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi Food Drug Administration World Health Organization The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products

8 viii Şekiller Dizini Şekil Sülfonamidlerin genel kimyasal yapısı 14 Şekil Trimetoprim kimyasal formülü 18 Şekil Sülfonamid ve trimetopirimlerin etki mekanizması 20 Şekil Standart 2,5 µg/ml (SMZ+TMP ve İS) 270 nm de verdiği pik ve alanı 29 Şekil Standart 2,5 µg/ml (SMZ+TMP ve İS) 225 nm de verdiği pik ve alanı 30 Şekil Standart 2 µg/ml (SMZ+TMP ve İS) 270 nm de verdiği pik ve alanı 30 Şekil Standart 2 µg/ml (SMZ+TMP ve İS) 225 nm de verdiği pik ve alanı 30 Şekil Standart 1 µg/ml (SMZ+TMP ve İS) 270 nm de verdiği pik ve alanı 31 Şekil Standart 1 µg/ml (SMZ+TMP ve İS) 225 nm de verdiği pik ve alanı 31 Şekil Belirli yoğunluklardaki SMZ ün HPLC deki pik alanlarından yararlanılarak hazırlanan standart eğri Şekil Belirli yoğunluklardaki TMP nin HPLC deki pik alanlarından yararlanılarak hazırlanan standart eğri Şekil Damar içi (Grup I), kursak içi (Grup II, III ve IV) verilme durumlarında SMZ yarı-logaritmik plazma yoğunluğu-zaman eğrisi Şekil Damar içi (Grup I), kursak içi (Grup II, III ve IV) verilme durumlarında TMP yarı-logaritmik plazma yoğunluğu-zaman eğrisi

9 ix Çizelgeler Dizini Çizelge Biyoeşdeğerlilik çalışmalarının doğruluğu ve alınan karara etkisi 11 Çizelge Plazma ilaç yoğunluğunu belirlemek için kullanılan gruplar 25 Çizelge Sülfametoksazol ve trimetoprim in standart ve geri kazanımda kullanılmak için hazırlanan yoğunlukları Çizelge Damar içi (Grup I), kursak içi (Grup II, III ve IV) verilen SMZ/TMP farmakokinetik değişkenleri Çizelge A ve B ilacının biyoeşdeğerlilik yönünden önemli farmakokinetik değişkenleri Çizelge B ilacının (test) A ilacına (referans) göre SMZ ve TMP yönünden biyoeşdeğerliliği

10 1 1. GİRİŞ Tüketime sunulan ürünlerin kalite ve güvenliğinin değerlendirilmesi halk sağlığı ve gıda güvenliği yönüyle son derece önemlidir. Rekabetin hızla arttığı günümüz ticari hayatında üretici firmalar pazar paylarını büyütmek ve rekabet edilebilecek kalitede ürün elde etmek için araştırma-geliştirme çalışmalarını artırmışlardır. Uluslar arası ticaretin hızla artması ve ürünlerde kalite ve güvenliğin öne çıkması resmi kurumların bu alandaki kontrol ve denetleme çalışmalarının artmasını da teşvik etmiştir. Sağlık gibi çok önemli bir alanda yoğun şekilde kullanılan ilaçlar için güvenlik ve kalite, diğer ürün gruplarına göre çok daha büyük önem arz eder. İlaçların etkinlik, güvenlik ve kalitesinin kontrol ve denetlenmesi ise öncelikle biyoeşdeğerlilik çalışmaları ile yapılır (Traş ve Yazar, 2002). Ülkemizde veteriner müstahzarlar için tarihli Resmi Gazete de yayımlanan Veteriner İspençiyari ve Tıbbi Müstahzarlar Ruhsat Yönetmeliği bulunmaktadır. Bu Yönetmeliğin amacı, veteriner hekimlikte kullanılmaya mahsus veteriner ispençiyari ve/veya tıbbi müstahzarların ruhsatlandırılma esaslarını, insan ve hayvan sağlığı açısından güvenli ve doğru kullanımını sağlamak için müstahzarların prospektüs ve etiketlerinde bulunması gereken bilgileri ve ruhsat alınacak müstahzarların ruhsatla ilgili işlemlerini belirlemektir (Canbolat, 2002; Resmi Gazete, 2002; Şahin, 2003). Ruhsatlandırma işlemleri, tüm dünyada olduğu gibi ülkemizde de ilaç sektörü için önemli konulardan biridir. İlaç, özelliğinden dolayı diğer ticari ürünlerden farklı olarak, piyasaya arzından önce yetkili otorite tarafından ruhsatının ve satış izninin verilmesi gereklidir (Canbolat, 2002; Anonim, 2003). Beşeri hekimlikte ilaçların ruhsatlandırılması için gereken belgelerin içerisinde biyoyararlanım ve/veya biyoeşdeğerlik çalışmaları bir gereklilik olarak yer almaktadır. Özellikle ilacı ilk keşfeden firmanın ilacı ile patent korumasında olmayan farmasötik eşdeğer olarak üretilen bir ilacın terapötik eşdeğer olduğunun kanıtlanması, bu ilacın klinik açıdan diğerinin yerine kullanılabileceğini gösteren en önemli unsur olarak kabul

11 2 edilmektedir. Dolayısıyla ilaçların ruhsatlandırılmasında kalite, etkinlik ve güvenlik kadar bunların birbiri yerine kullanılabilir olması da hastanın sağlığı ve emniyeti açısından önemlidir (WHO, 1996; FDA, 2000; Şahin, 2003). Sağlık Bakanlığı 1997 yılında yayımladığı bir genelgeyle 2 Mart 1996 öncesinde ruhsat başvurusu yapılmış veya halen piyasada olan beşeri müstahzarların en geç tarihine kadar, 2 Mart 1996 sonrasında başvuruda bulunulmuş beşeri müstahzarlar için ise herhangi bir süre olmaksızın biyoyararlanım/biyoeşdeğerlilik (BY/BE) çalışmalarının sunulmasını zorunlu tutmuştur. Ancak, BY/BE çalışmaları yapılacak ürün sayısının fazla oluşu ve bu etütleri yapmak üzere Sağlık Bakanlığı ndan onay almış klinik araştırma laboratuarlarının bulunmayışı, endüstri için önemli bir sorun olmuş ve belirlenen süre sonunda, tüm etütlerin sunulması tamamlanamamıştır. Bugün için biyoeşdeğerlilik çalışmaları özellikle yurt dışındaki laboratuarlarda gerçekleştirilmekte ve buralardan rapor alınmaktadır (Canbolat, 2002; Anonim, 2003). Ülkemizde, yeni bir ilacın keşfine yönelik yatırımların yetersiz olduğu göz önüne alınırsa, en azından jenerik ilaçlar üzerine belirli bir dikkatin yoğunlaşması gerekir. Bu alanda BY/BE çalışmaları önemli bir yer alır. Orijinal ilaç üreticileri için problem arz etmeyen bu çalışmalar özellikle jenerik üreticiler için büyük önem taşır. Beşeri müstahzarlar için 2000 yılı başından itibaren BY/BE çalışmaları gerektiren ilaçlar için bu belgeler olmadan halka satış izni verilmemektedir. Bu durum, özellikle Ruhsatlandırma Yönetmeliği'nin sekizinci maddesinde açıkça belirtilmektedir. Sağlık Bakanlığı'nın BY/BE çalışmalarına verdiği önem geri ödeme kurumlarını da bu yönde teşvik etmiştir. Sağlık Bakanlığı, ucuz ilaç uygulamasında temel olarak BY/BE belgelerinin göz önüne alınmasını, "ucuz ilaç" değerlendirmenin BY/BE belgeleri olan ilaçlar arasında yapılmasının gerekliliğini öne sürmektedir (Canbolat, 2002). Veteriner ilaçlarının ruhsatlandırılması çevre, hayvan ve toplumun kalitesiz ya da güvenli olmayan ilaçlardan korunması amacıyla yapılır. Avrupa Birliği (AB)'de ruhsatlandırma işlemi 1965'lerde çıkarılan İlaç Direktifine (Medicine Directive; 65/65/EEC) dayanır; daha sonraki dönemde AB üyeleri arasında uyumu ve bir

12 3 örnekliliği sağlamak için iki direktif (81/851/EEC ve 81/852/EEC) daha yayımlanmıştır. 1990'lı yıllarda kontroller özellikle besinlerdeki ilaç kalıntıları ve üretim işlemlerini kontrol eden esasları (Good Manufacturing Practice) değerlendirme yönünde olmuştur (Anonim, 2004b; Anonim 2004c). Bugün AB de veteriner müstahzarlarında ruhsatlandırma işlemleri European Medicinal Evaluation Agency (EMEA) tarafından gerçekleştirilmektedir. Ruhsatlandırma işleminde üç kriter (güvenlik, kalite ve etkinlik) özellikle göz önünde bulundurulur. Ürünün güvenliği kavramı içerisinde 4 farklı hedef bir arada değerlendirilir. Bunlar; hayvan, uygulayıcı, çevre ve gıda değeri olan hayvanlar için tüketici. Hasta hayvan yönüyle ilaç güvenliği en önemli kavramlardan biridir. Bu şekliyle ilaca akut ya da uzun süreli maruziyet sonucunda şekillenebilecek riskler ve aşırı doz ilaç uygulaması sonucu oluşabilecek belirtiler dikkatlice değerlendirilir. Sağlık ve güvenlik bir arada düşünülmesi gereken kavramlardır; özellikle hangi gruptan olursa olsun ilacın uygulayıcıya yönelik risklerini azaltmak için etiket üzerinde gerekli uyarılar yapılmalıdır. Bununla birlikte, ürünün sadece hasta ve uygulayıcıya yönelik riskleri değil, aynı zamanda kendi ya da artıklarının çevreye verebileceği zararı da en aza indirmek için gerekli önlemler alınmalıdır. Bu değerlendirmelerin uygun şekilde yapılabilmesi için çok yönlü denemeler (farmakokinetik çalışmalar, toksisite testleri ve kalıntı analizleri gibi) gerçekleştirilir; bu şekliyle ilaç için uygun doz ve kullanım alanları belirlenir (Anonim, 2004b; Anonim 2004c). Kalite ve etkinlik kriterlerine gelince, farmasötik kalite ürünün güvenliliğinin en önemli parçasıdır; bu şekliyle ürün istenilen standart, saflık ve yapıda pazara sunulabilir. Bu standartlar üretim ve formülasyon işlemlerini kapsar. Stabilite testleri ile de ürünün piyasa şartları altında özelliklerini ne kadar muhafaza edebileceği değerlendirilir. Veteriner müstahzarların ruhsatlandırılmasına ilişkin uygulamalar AB de üç farklı şekilde gerçekleştirilmektedir. Bunlar; ulusal prosedür, merkezi olmayan prosedür ve merkezi prosedürdür (Anonim, 2004b; Anonim 2004c).

13 Biyoeşdeğerlilik Biyoeşdeğerlilik testleri, aynı etkin maddeyi ihtiva eden benzer formülasyonlardaki farklı müstahzarların karşılaştırılmasında kullanılan bilimsel yöntemlerden biridir; bu testlerin amacı iki ürünün sistemik etkilerinin etkinlik ve güvenlik yönünden aynı olup olmadığını tespit etmek ve buna koşut olarak söz konusu ürünlerin uygun plazma yoğunluklarını göstermektir. Ayrıca, bir ilacın aynı kullanım alanındaki diğer müstahzarlar arasında güvenle tercih edilebilmesi de yine bu testlerle ortaya konabilmektedir (EMEA, 2001; Posyniak ve ark., 2001; Traş ve Yazar, 2002; Şahin, 2003). İlaçlarda eşdeğerlilik kavramı ile ilgili aşağıdaki tanımlamalar yapılabilir (Kaya, 2000; Traş ve ark., 2005). Farmakolojik eşdeğerlilik: İki ayrı farmasötik şeklin içine, kimyasal olarak farklı ama vücutta aynı etkin molekülleri ortaya çıkaran ve aynı farmakolojik etkiye yol açan moleküllerin katılması durumudur. Farmasötik eşdeğerlilik: Aynı türden farmasötik şekle aynı maddenin eş miktarının katılması durumunu ifade eder; bu farmasötik şekiller, katı veya dolgu maddeleri farklı olsa da, resmi öngörülerin tüm gereklerine de cevap vermelidir. Kimyasal eşdeğerlilik: Aynı etkin maddeyi yine aynı miktarda içeren ve aynı dozda kullanılan, değişik farmasötik şekillerdeki (tablet, draje gibi) bir ilacın resmi öngörülerde mevcut fiziko-kimyasal özellikleri taşımasını ifade eder. Klinik eşdeğerlilik: Aynı canlıda aynı doz ve doz aralığında verildiğinde aynı sağaltıcı etkiye yol açan ve farmakolojik, kimyasal veya farmasötik olarak eşdeğer ilaçları veya ilaç şekillerini karşılayan bir terimdir. Biyoeşdeğerlilik denemeleri aynı etkin maddeyi içeren farklı formülasyonların karşılaştırılması için yapılan ve biyolojik esasa dayanan kalite-kontrol testleridir. Biyoeşdeğerlilik çalışmalarındaki amaç, farmasötik teknoloji ile, benzer farmakolojik etkiyi elde etmek için aynı etkin maddeyi içeren çeşitli ilaç formülasyonları arasındaki farklılıkları-benzerlikleri belirlemektir (Posyniak ve ark., 2001). Diğer bir

14 5 ifadeyle biyoeşdeğerlilik, aynı etkin maddeyi, aynı farmasötik şekilde ve aynı miktar veya oranda içeren iki veya daha fazla farmasötik ürünün aynı yolla uygulandıklarındaki biyoyararlanımlarının benzerliğidir. Biyoyararlanım kavramı, ağız veya damar içi yol dışında diğer yollarla uygulandığında ilacın dozaj şeklinden sistematik dolaşıma geçme hızı ve oranını ifade eder (Mutlu ve Erkan, 2003). Biyoeşdeğerlilik, tüketici, hekim, halk sağlığı, üretici ve uluslar arası ticaret yönüyle büyük önem taşır. Amerika Birleşik Devletleri (ABD) ve AB de, beşeri ilaçlarda olduğu gibi, veteriner hekimliği ilaçlarında da biyoeşdeğerlilik çalışmaları titizlikle uygulanmaktadır (Traş ve Yazar, 2002). Günümüzde birçok ilaç firması hem beşeri hem de veteriner ilaçları alanında aynı etkin maddeyi içeren fazla sayıda müstahzar çıkarmaktadırlar. Aynı etkin maddeyi aynı miktarda içeren bu ilaçlar arasında karşılaştırma yapıldığında farmasötik eşdeğerlilik kavramı öne çıkmaktadır. Bunu da belirleyen ilacın biyoyararlanımıdır. Örneğin, biyoyararlanımı %60 olan ve 0,24 mg digoksin içeren bir preparatla kalp yetmezliği kontrol altına alınabilirken, aynı dozda fakat biyoyararlanımı %30-40 olan başka bir müstahzarla kalp yetmezliği şiddetlenebilir ve hatta biyoyararlanımı %80 olan bir başka preparatla ise digital zehirlenmesi oluşabilir (Or ve ark., 1994). Biyoyararlanım/biyoeşdeğerlilik çalışmalarında üç temel aşama vardır: Klinik aşaması, Laboratuar aşaması, Deney tasarımı, istatistiksel ve farmakokinetik değerlendirme aşaması. Biyoyararlanım/biyoeşdeğerlilik çalışmalarının klinik bölümü iyi düzenlenmelidir. Bunun amacı araştırıcı, destekleyicinin sorumlulukları, araştırmanın tasarımı, verilerin işlenmesi, istatistiksel analiz ve kalite güvencesi ile ilgili esasları belirlemek, böylece araştırmaların verimli, güvenilir, doğru ve uluslar arası standartlara uygun nitelikte olmasını sağlamaktır (EMEA, 1997; Öner, 2003). Ülkemizde beşeri hekimlikte farmasötik müstahzarların biyoyararlanım ve biyoeşdeğerlilik incelemelerinin uygulanması ile ilgili esasları ve farmasötik bakımdan eşdeğer olan müstahzarların biyoyararlanımlarının farklılık göstermesini ve bu durumun tedavinin yetersizliği veya toksisite artması sonucu sebep olabileceği

15 6 sakıncaları önlemek için alınacak tedbirleri belirten Farmasötik Müstahzarların Biyoyararlanım ve Biyoeşdeğerliliğinin Değerlendirilmesi Hakkında Yönetmelik 27 Mayıs 1994 tarih ve sayılı yazı ile Resmi Gazete de yayımlanmıştır. Yönetmelikte, müstahzarların biyoyararlanım ve biyoeşdeğerlilik bakımından incelenmeleri ile ilgili esaslar, bu incelemelerin gereklilik dereceleri ile ilgili koşullar ve öncelik sırasının belirlenmesine ilişkin kriterler, incelemelerin tasarım, uygulama ve kontrolü, ruhsat başvurularında biyoyararlanımın konumu, incelemeyi yürütecek personel ve incelemenin yapılacağı yerler belirtilmiştir (Resmi Gazete, 1994). Biyoeşdeğerliliğin belirlenmesinde birinci sırada önerilen metot kanda etkin maddenin yoğunluk-zaman eğrisinin belirlenmesi esasına dayanır. Aynı ve uygun deney şartları altında iki ürünün biyoyararlanımlarının kabul edilebilir sınırlar arasında olması durumunda iki ürün biyoeşdeğer kabul edilebilir. Biyoeşdeğerlilik çalışmalarında temel olarak ilacın doruk yoğunluğu (Y doruk ), doruk yoğunluğa ulaşma süresi (t doruk ) ve ilaç yoğunluğu-zaman eğrisi altında kalan alan (EAA) değerlendirmeye alınır (Resmi Gazete, 1994; Colwell ve ark., 1998; EMEA, 2001; Posyniak ve ark., 2001; Traş ve Yazar, 2002; Şahin, 2003; Traş ve ark., 2005). Biyoyararlanım/biyoeşdeğerlilik çalışmalarında önemli bir kriter olan EAA yı hesaplamak için üç yarılanma ömrü boyunca uygun aralıklarla kan örnekleri alınmalıdır. Üç yarılanma ömrü toplam EAA nın %87,5 ini temsil eder; kan örnekleri, plazma ilaç yoğunluğu-zaman eğrisinin inen ve çıkan kısımlarını tam olarak karakterize edebilecek yeterli sıklıkta alınmalıdır. Bu da yaklaşık kan örneği alınmasını gerektirir (Öner, 2003). Biyofarmasötik sınıflandırma sistemine göre ağız yoluyla verilen bir ilacın biyoeşdeğerlilik çalışmalarından muaf olabilmesi için etkin maddenin yüksek çözünürlüğe ve kolay geçebilmeye, ilaç ürününün ise yüksek çözünme hızına sahip olması gerekir. Bir etkin maddenin çözünürlüğünün yüksek olması en yüksek dozunun 37 o C de ph 1-8 aralığındaki üç tampon sisteminin (tercihen ph 1.0, 4.6, 6.8) her birinin 250 ml'sinde çözünmesi demektir. Ancak polimorfizm, partikül büyüklüğü gibi faktörler çözünme hızını etkileyeceği için bu gibi durumlarda özel dikkat gösterilmesi gerekir. Damar içi referans doza oranla emilmesinin %90'dan

16 7 fazla olması durumunda etkin maddenin geçişinin yüksek olduğu kabul edilir. Yüksek geçiciliğin bir göstergesi olarak kabul edilen lineer ve tam emilme durumlarında biyoyararlanımın etkilenme olasılığının az olduğu belirtilmiştir. Ayrıca, test ve referans ürünlerin çözünme hızı profillerinin benzerliğinin 37 o C'de ph 1-8 aralığındaki üç tampon sisteminde (tercihen ph 1.0, 4.6, 6.8) gösterilmesi gerekir. Bu amaçla, benzerlik faktörü tayin edilebildiği gibi, uygun bir model veya modelden bağımsız yöntemler de kullanılabilir. Etkin maddenin %85'inden fazlası ilk 15 (veya 30) dakika içinde çözünürse herhangi bir matematiksel işlem yapmadan profiller benzer kabul edilir (EMEA, 2001; Şahin, 2003) Biyoyararlanım/Biyoeşdeğerlilik Ölçütleri Biyoyararlanımın tayin edilmesi amacıyla kullanılan doğrudan (hız sabiti ve hız profili gibi değerlerin kullanılmasıyla) ve dolaylı (Y doruk, t doruk, ortalama kalış süresi gibi değerlerin kullanılmasıyla) yöntemler mevcuttur. Bu amaçla FDA (Food Drug Administration) sistemik maruz kalma ölçütlerinin (EAA, Y doruk, t doruk ) kullanılmasını önerir. Çalışmanın amacına, ilacın tayin edilmesinde kullanılan analitik yönteme ve ilaç ürününün yapısına bağlı olarak yöntem seçilir. Bir ilacın biyoyararlanımının tayin edilmesinde, plazma verileri, idrar verileri, akut farmakolojik etki ve klinik cevap kullanılabilir. Ancak, biyoyararlanım konusundaki en objektif bilgi, plazma verileri kullanılarak elde edilir (Şahin, 2003; Anonim, 2004a; Traş ve ark., 2005). Plazma verileri kullanılarak biyoyararlanımın belirlenmesinde, klinik çalışmalardan elde edilen farmakokinetik parametreler (plazma ilaç yoğunluğu-zaman eğrisinden yararlanılır) incelenen her formülasyonun emilim hız ve derecesi hakkında bilgi verir. Emilim hızını tayin etmek için bölmesel modeller, grafiksel ve gözlemsel yöntemler kullanılır. Uygulama kolaylığı nedeniyle en sık olarak kullanılan yöntem gözlemsel yöntemdir. Bu yöntem ilacın verilmesinden sonra, Y doruk ve t doruk düzeylerinin tespit edilmesi esasına dayanır. Genellikle tek doz çalışmaları biyoeşdeğerlilik çalışmaları için yeterlidir (Resmi Gazete, 1994; FDA, 2000; EMEA, 2001; FDA, 2002; Öner, 2003; Şahin, 2003).

17 Tek Doz Çalışmaları İlaçlarla ilgili yasal düzenlemeler ve ilgili kaynaklar, tek doz BY/BE çalışmalarında aşağıda belirtilen farmakokinetik ölçütlerin belirlenmesini önerirler (FDA, 2000; EMEA, 2001; Öner, 2003; Şahin, 2003): Sıfırdan t x zamanına kadar EAA (EAA 0-tx ), burada t x ; ölçülen son yoğunluğa (Y x ) karşılık gelen zamandır. Sıfırdan sonsuza kadar EAA (EAA 0- ). En yüksek ilaç yoğunluğu (Y doruk ) ve bu yoğunluğa ulaşabilmesi için geçen süre (t doruk ) Yinelenen Doz (Kararlı Durum) Çalışmaları İlaçlarla ilgili yasal düzenlemeler ve ilgili kaynaklar, yinelenen doz BY/BE çalışmalarında aşağıda belirtilen farmakokinetik ölçütlerin belirlenmesini önerirler (FDA, 2000; EMEA, 2001; Öner, 2003; Şahin, 2003): Kararlı durumda bir dozlama aralığını (ŧ) aşan bir zamana kadar olan EAA (EAA 0- ŧ ), burada ŧ; dozlama aralığıdır. Son doz uygulamasından sonra doğrudan gözlem değerinden elde edilen en yüksek ilaç yoğunluğu (Y doruk ) ve bu yoğunluğa ulaşabilmesi için geçen süre (t doruk ). Kararlı durumda her dozlama aralığı sonundaki ilaç yoğunluğu. Kararlı durumda ortalama ilaç yoğunluğu. Kararlı durumdaki dalgalanma derecesi Biyoyararlanım/Biyoeşdeğerlik Çalışmalarında Kullanılan Yöntemler Amerika Birleşik Devletlerinde FDA, BY/BE çalışmalarında kullanılan yöntemleri öncelik sırasına göre, farmakokinetik çalışmalar, farmakodinamik çalışmalar, klinik çalışmalar ve in vitro çalışmalar şeklinde sıralamıştır.

18 9 Biyoyararlanım ve biyoeşdeğerliğin tayini için, önerilen yöntem farmakokinetik çalışmalardır. Farmakokinetik ölçümler bir ilaç şeklinden ilacın sistemik dolaşıma salınımını tayin eden bir biyotayin olarak da değerlendirilebilir. Ağız yoluyla verilen pek çok hızlı salıveren dozaj şekillerinin biyoeşdeğerlilik çalışmaları için tekrarsız çalışma planları tavsiye edilir. Tekrarlı çalışmalar ise değiştirilmiş salınım yapan dozaj şekilleri ve yüksek değişkenlik gösteren ilaç ürünleri için önerilir. Hemen salıveren ve değiştirilmiş salınım yapan ürünlerin biyoeşdeğerliliklerinin gösterilmesinde genellikle tek doz çalışmaları tavsiye edilir (Resmi Gazete, 1994; FDA, 2000; EMEA, 2001; FDA, 2002; Öner, 2003; Şahin, 2003). Farmakokinetik çalışmaların kullanılamadığı durumlarda geçerliliği olan farmakodinamik yöntemlerin kullanılması önerilir. Biyoyararlanım ve biyoeşdeğerliliği desteklemek amacıyla iyi kontrol edilmiş klinik çalışmaların kullanılabileceği, ancak biyoeşdeğerliliğin gösterilmesi amacıyla karşılaştırmalı klinik çalışmaların genellikle duyarsız olduğu ve mümkün olduğunca kullanılmaması gerektiği belirtilmiştir. Biyofarmasötik sınıflandırma sistemine göre çözünürlüğü, emilimi ve çözünme hızı yüksek olan ağız yoluyla verilen ilaçların biyoeşdeğerliğinin gösterilmesinde bir in vitro yaklaşımın (çözünme hızı) kullanılması uygundur (Şahin, 2003) Biyoeşdeğerliliğin Değerlendirilmesi Bir BY/BE çalışmasının değerlendirilmesinde üç temel kriter esas alınır (FDA, 2001; Öner, 2003); BY/BE çalışmasında kullanılan ölçüt, Bu ölçüt için belirlenen güven aralığı ve Önceden saptanmış biyoeşdeğerlilik sınırları. Bu temel esaslara göre biyoeşdeğerlilik çalışmalarının tasarımında üç yöntem kullanılmaktadır. Bunlar; ortalama biyoeşdeğerliliği, popülasyon biyoeşdeğerliliği ve bireysel biyoeşdeğerliliktir.

19 10 Ortalama biyoeşdeğerlilik, bugüne kadar birçok biyoeşdeğerlilik çalışmasında kullanılmış ve hala yaygın olarak kullanılmaktadır. Çift tek-yönlü test esasına dayanan, %90 güven aralığında, test ve referans ürünün ortalama ölçütlerinin % sınırlarında değerlendirildiği yöntemdir (FDA, 2001; Öner, 2003). Popülasyon biyoeşdeğerliliği ve bireysel biyoeşdeğerlilik de ise ortalamaların yanı sıra ölçüm değişkenleri de karşılaştırılabilir. Popülasyon biyoeşdeğerlilik yaklaşımı, popülasyondaki ölçümün toplam değişkenliğini değerlendirir. Bireysel biyoeşdeğerlilik ise test ve referans ürünler için birey içi değişkenliği olduğu kadar birey-formülasyon etkileşimini de değerlendiren bir yöntemdir (FDA, 2001; Öner, 2003). Biyoeşdeğerlilik çalışmalarında deney düzeni tekrarlı olmayan tasarımlar ve tekrarlı çapraz tasarımlar olmak üzere iki temel bölümde incelenir. Tekrarlı olmayan tasarımlar, standart iki formülasyonlu, iki dönem ve iki sıralı çapraz tasarımlardır. Bunlar genellikle ortalama ve popülasyon yaklaşımının olduğu biyoeşdeğerlilik karşılaştırmaları için seçilen yöntemlerdir. Tekrarlı çapraz tasarımlar ise bireysel biyoeşdeğerlilik çalışmaları için kritik çalışmalardır; bu tasarımla test ve referans ürüne ait biyoyararlanım ölçütlerinin bireyiçi varyans ile birey-formülasyon varyansının kestirimine olanak verir. Gerek çapraz tasarımın, gerekse tekrarlı uygulamaların en büyük yararlarından birisi her bireyin kendisini kontrol olarak kullanmasıdır (Colwell ve ark., 1998; FDA, 2001; Öner, 2003; Anonim, 2004a) Biyoyararlanım/Biyoeşdeğerlilik Ölçütlerinin Kabul Sınırları Genel bir kural olarak iki ilacın biyoeşdeğer olması için EAA ve Y doruk oranlarının %90 güven aralığında ve % sınırlarında olması gerekir. Geniş güvenlik aralığına sahip ilaçlar için daha geniş sınırlar kabul edilebilir; ancak, dar güvenlik aralığına ya da dik doz cevap eğrisine sahip ilaçlar için %20 lik bir fark bile kabul edilmeyebilir. Y doruk değeri örnekleme zamanına bağlı olarak geniş değişkenlik gösterdiğinden, güvenlik aralığı % sınırları arasında kabul edilebilir. t doruk değeri kullanılacağı zaman değişkenliğin mutlak güven aralığı kabul edilebilir olarak

20 11 seçilmelidir; 10 dakikalık t doruk için %20 değişkenlik ile 120 dakikalık t doruk için %20 değişkenlik aynı anlama gelmez. Bu nedenle t doruk için biyoeşdeğerlilik genişliği dikkatli seçilmelidir. İyi bir ilaç ürünü biyoeşdeğerliliğini dolayısıyla biyoyararlanım ölçümlerindeki performansını raf ömrü boyunca korumalıdır (Resmi Gazete, 1994; Colwell ve ark., 1998; FDA, 2000; EMEA, 2001; FDA, 2002; Traş ve Yazar, 2002; Şahin, 2003; Anonim, 2004a; Traş ve ark., 2005). Biyoyararlanım/biyoeşdeğerlilik çalışmalarındaki farmakokinetik ölçütlerden EAA ve Y doruk uygun istatistik metodlar kullanılarak analiz edilmelidir ve verilere analiz için logaritmik dönüşüm uygulanabilir. t doruk için ise dönüştürülmemiş veriler üzerinde uygun bir parametrik olmayan değerlendirme yapılmalıdır. Önceden de belirtildiği gibi farmakokinetik ölçütler için %90 güven aralığında iki formülasyon karşılaştırılmalı, özet istatistiksel bulgular hesaplanmalıdır. Biyoeşdeğerllik çalışma sonuçlarının değerlendirilmesi sonucunda verilen kararın doğru olması üretici, tüketici ve ülke ekonomisi açısından oldukça önemlidir. Bu tür çalışmaların güvenilirliği yani sonuçların doğruluğu da, değerlendirmede alınan kararları (Çizelge 1.1) etkileyen en önemli faktördür (Traş ve ark, 2005). Çizelge Biyoeşdeğerlilik çalışmalarının doğruluğu ve alınan karara etkisi. Gerçek Doğru Karar Yanlış Karar Biyoeşdeğer Karar Herkes Kazanır Tüketici Kaybeder Doğru Karar Yanlış Karar Biyoeşdeğer Değil Tüketici Kaybeder Destekleyen Kaybeder Sonuç olarak, özellikle ağız yoluyla kullanılan ve biyoyararlanım sorunu gösteren etkin madde ve/veya farmasötik dozaj şekillerinde terapötik eşdeğerliliğin gösterilmesinde en önemli test biyoeşdeğerlilik testidir. Ülkemizde yaygın olarak kullanılan farmasötik eşdeğerlilik, ilacın etkinliğini göstermede yetersiz kalan bir kavramdır. Bir ilacın etkinliğinin kanıtlanabilmesi için farmasötik eşdeğerliliğinin yanında terapötik eşdeğer olduğunun da kanıtlanması gereklidir. Terapötik eşdeğerliliği kanıtlanmış ilaçlar değiştirilebilir ilaçlardır; yani, birbirlerinin yerine kullanılabilirler. Yine bu amaçla bir etkin maddenin bir formülasyondan sistemik dolaşıma geçme hız ve derecesini tayin etmek amacıyla yapılan biyoyararlanım

21 12 çalışmalarında ve aynı maddeyi içeren test ve referans ürünlerinin klinik açıdan birbirlerinin yerine kullanılıp kullanılmayacağını göstermek amacıyla gerçekleştirilen biyoeşdeğerlilik çalışmalarında öncelikli olarak farmakokinetik çalışmalar tercih edilmelidir (Resmi Gazete, 1994; WHO, 1996; FDA, 2000; Öner, 2003; Şahin, 2003) Sülfonamidler Veteriner hekimliğinde hastalıkların sağaltımında sıklıkla kullanılmakta olan sülfonamidler, paraaminobenzensülfonamid (sülfanilamid) in sentetik türevleri olup, insan ve hayvanlarda bakteriyel ve protozoal enfeksiyonların tedavisi ve önlenmesi amacıyla kullanılan ilk antibakteriyel ilaçlardandır. Sülfonamidlerin antibakteriyel amaçla kullanılmaya başlanmasından sonra, özellikle hayvanlarda görülen hastalıkların ölüm ve yayılma hızında görülen düşüşler, bu ilaçların geniş bir şekilde kullanılmalarına sebep olmuştur. Yeni antibakteriyel ilaçların kullanıma girmesiyle kullanım alanları daralmasına rağmen, sülfonamidler halen veteriner hekimliğinde çok sık kullanılan ilaçlar arasında yer alırlar. Günümüzde çok sayıda sülfonamid türevi sentezlenmiş olup, bunlardan sadece kadarı uygulama alanı bulmuştur (Nizamlıoğlu, 1992; Pena ve ark., 1995; Kaya, 2000; Şahindokuyucu, 2003). Sülfonamidlerin ucuz ve dayanıklı olmaları, kolay bir şekilde uygulanabilmeleri, etki spektrumlarının geniş olması ve özellikle de diğer ilaçlarla birlikte kullanılmaları halinde etki spektrumlarının daha da genişlemesi gibi avantajları bulunmaktadır. Bu avantajlarından dolayı, günümüzde başta kanatlılar olmak üzere, tüm evcil hayvanlardaki bakterilerden ileri gelen solunum ve sindirim sistemi ile idrar yolları hastalıklarında tek başlarına ya da diaminoprimidin (DAP) türevleri (trimetoprim, ormetoprim gibi) ile birlikte geniş ölçüde kullanılırlar. Bu kombinasyon ile bakterilere karşı sinerjistik tipte bir etkileşme meydana gelir. Bakterilerde pürin sentezi ile ilgili olaylar zinciri üzerinde etkili olan bu iki farklı ilaç grubu, ayrı ayrı kullanıldıklarında bakterilerin gelişmesini engellerken, birlikte kullanıldıklarında bakterilerde öldürücü etkiye sahiptirler (Özkazanç ve Kaya, 1983; Şanlı ve ark.,

22 ; Nizamlıoğlu, 1992; Elmas, 1997; Kaya, 2000; Smith ve Keith, 2000; Şahindokuyucu, 2003). Sülfonamidler uygulama yerlerinden emilme ve vücuttan atılma durumlarına göre 4 grupta incelenirler. Sülfametoksazol bu sınıflandırmada hızla emilen ve atılan sülfonamidler arasında yer alır. Bu madde, beyaz-kirli beyaz arasında değişen renklerde, kokusuz, suda son derece az, alkolde ise az çözünen, kristalize bir tozdur. Hem sistemik hem de idrar yolları hastalıklarının sağaltımında kullanılan değerli bir ilaç olup, genellikle trimetoprimle birlikte hazırlanan müstahzarları şeklinde kullanılır. Sülfametoksazol-trimetoprim kombinasyonları, bakterinin yaşamı için gerekli olan pürin bazlarının sentezlenmesi sırasında 2 farklı kademede engelleme yaparak bakterisid etki oluştururlar. Optimal bakterisid etki için en uygun kombinasyon oranı 5:1 dir (sülfametoksazol-trimetoprim) (Hughes, 1979; Foltzer ve Reese, 1987; Cockerill ve Edson, 1991; Brumfitt ve Hamilton, 1993; Lundstrom ve Sobel, 1995; Elmas, 1997; Allen ve ark., 1998; Smilack, 1999; Kaya, 2000; Smith ve Keith, 2000) Genel Yapısı İlk kez 1908 yılında Gelmo tarafından sentez edilen sülfanilamidin antibakteriyel etkisinin olduğu 1932 yılında Domagk ın boya maddesi olan prontosil in, fareleri Streptococcus haemolyticus un öldürücü dozlarına karşı koruduğunu ortaya koymasıyla anlaşılmıştır (Nizamlıoğlu, 1992). Sülfonamidler, esas itibariyle sülfanilamid (para-aminobenzensülfonamid) maddesinin türevidirler. Tüm sülfonamid türevleri sentetik olarak hazırlanırlar ve benzer yapıya sahiptirler. Sülfonamidlerin genel yapısı, SO 2 NH 2 grubu ile amino grubunun para- pozisyonunda bağlandığı benzol çekirdeğinden oluşur (Şekil 1.1). Yapıdaki azot atomlarından birinin yerine çeşitli gruplar bağlanarak, etki gücü ve süreleri olan çok sayıda sülfonamid bileşikleri türetilebilir. Bakteriler üzerinde etkinlik için molekülde N 4 -paraamino grubunun serbest olarak bulunması esastır (Bevill, 1988; Bywater, 1991; Spoo ve Jim, 1995; Kaya, 2000; Şahindokuyucu, 2003).

23 14 (4) (1) H 2 N SO 2 NH 2 Şekil Sülfonamidlerin genel kimyasal yapısı (Budavari, 1996). Sülfonamidler baz halinde kokusuz, acı lezzetli, suda hemen hiç çözünmeyen ve ışıkla temasta esmerleşen, beyaz renkli kristalize toz bileşiklerdir. Işığa duyarlı olmaları dışında, genellikle dayanıklıdırlar. Amfoterik özellik taşıyan sülfonamidler asit ve bazik maddelerle tuzlar yaparlar. Sodyumlu tuzları ana bileşiklere göre suda daha iyi çözünür ve şiddetli alkali tepkimelidirler. Ortamın ph sı yükseldikçe sudaki çözünürlükleri de artar. Sağaltımda kullanılan sülfonamidlerin çoğu tuz şeklinde ve zayıf asit karakterli bileşiklerdir (Nizamlıoğlu, 1992; Kaya, 2000; Şahindokuyucu, 2003). Sülfametoksazol beyaz-kirli beyaz renkte, kokusuz, suda son derece az (0,3 mg/ml), alkolde az (20 mg/ml) çözünen, pka sı 5,6, kristal bir tozdur. Sülfizomezol, sülfametoksizol diye de bilinir (Kaya, 2000) Etki Şekli Sülfonamidler, bakterilerin üremesini durdurarak veya gelişmesini engelleyerek etkilerini gösterirler. Çok yüksek yoğunluklarda bakterileri öldürücü etki de oluşturabilirler. Özellikle, bakterilerin hızlı gelişme-üreme dönemlerinde daha etkilidirler; zira, bu esnada hem bakteri ve parazite dışarıdan besin girişi fazladır hem de vücudun savunma sistemleri daha etkindir. Bu sebeple, sülfonamidler özellikle akut hastalıkların sağaltımında daha fazla kullanılırlar (Bevill, 1988; Allen ve ark., 1998; Kaya, 2000). Sülfonamidler, bakteri ve protozoonlarda ara metabolizmayı bozarak, mikroorganizmalar için son derece önemli olan folik asit sentezini engellerler. Sülfonamidlere duyarlı bakteri ve protozoonların zarları folik aside geçirgen

24 15 olmadığı için, bu maddeyi dışarıdan alamazlar. Bunlar folik asiti sitoplazmalarında dışardan aldıkları para-aminobenzoik asit (PABA), dihidropterin ve glutamik asiti birleştirerek sentezlerler. Sülfonamidler, bu sentez zincirinde PABA ile dihidropterin arasındaki tepkimeyi gerçekleştiren dihidropteroat sentetaz ın etkinliğini önlerler. Sülfonamidlerin etkisiyle dihidropteroik asitin sentezi azalınca, dihidrofolik asit ve bundan da dihidrofolat redüktaz aracılığında tetrahidrofolat (THF) sentezi azalır. Böylece, pürin bazları, timin ve metiyoninin yapımını sağlayan enzimlerin yardımcı faktörü olarak görev yapan THF türevleri (metil-thf, metilen-thf, formil-thf, folinik-thf, formimino-thf) yapılamaz; sonuçta bakteri ve koksidilerde DNA, RNA ve protein sentezi bozulur; metiyonin ve glisin sentezi de azalır. Sülfonamidler gibi DAP türevleri de bakteri ve protozoonlarda ara metabolizmayı etkilerler. Sülfonamidler ve DAP türevleri bakteri ve protozoonlarda folik asit sentezinde birbirini izleyen iki tepkimeyi gerçekleştiren enzimlerin (sırasıyla dihidropteroat sentetaz ve dihidrofolat redüktaz) etkinliğini engelleyerek sinerjistik etki oluştururlar. Sülfonamidler bakterilerde katalazın etkinliğini engelleyerek, kendileri için zehirli olabilecek düzeylerde hidrojen peroksit birikmesine de yol açarlar (Bywater, 1991; Cockerill ve Edson, 1991; Prescott ve Baggot, 1993; Kayaalp, 1998; Şanlı, 1999; Kaya, 2000; Smith ve Keith, 2000) Etki Spektrumu Sülfonamidler, Gram pozitif ve Gram negatif bakterilere, Chlamydialara ve çoğu protozoon türüne (Eimeria türleri, Toxoplazma türleri) karşı etkili, geniş spektrumlu antibiyotiklerdir. Sülfonamidler, anaerob bakterilere karşı etkili olmadıkları için ciddi anaerob enfeksiyonların sağaltımında kullanılmazlar. Sülfonamidlere duyarlılığı iyi olan bakteri ve protozoa türlerinin başlıcaları; Actinomyces, Bacillus, Brusella, Streptococcus, Chlamydia, Cryptosporidium, Coccidia türleri, E.rhusiopathiae, L. monocytogenes ve Pneumocyctis carinii dir (Prescott ve Baggot, 1993; Allen ve ark., 1998; Kaya, 2000).

25 Farmakokinetik Özellikleri Sülfonamidlerin terapötik etkinliği, büyük ölçüde sudaki çözünürlüklerine bağlıdır. Dokulardaki yoğunlukları, bağırsaklar ve enjeksiyon yerlerinden emilme oranları ve çeşitli vücut dokularında mevcut yoğunlukları ile ilişkilidir (Nizamlıoğlu, 1992). Sülfonamidlerin farmakokinetikleri, sindirim kanalında etkili olanlar (sülfasalazin, sülfaguanidin, fitalilsülfatiyazol gibi) dışında birbirine benzer; fakat, aralarında yine de emilme hızı ve oranı, vücutta dağılımı ve etkinlikleri bakımından farklılıklar vardır. Bu farklılıklar esas olarak bağırsaklardaki materyalin hacmine bağlıdır. Söz konusu içeriğin hacmi arttıkça emilme hızı yavaşlar. Bu yüzden hayvan türleri içerisinde sülfonamidlerin emilme hızı geviş getirenlerde en yavaş ve düzensiz, kedi ve köpeklerde en hızlı, domuz ve atlarda ise bu iki grubun arasındadır. Kanatlılarda ise daha çabuk ve tam bir emilme söz konusudur (Nizamlıoğlu, 1992; Kaya, 2000). Sülfonamidler parenteral, ağız ve yerel yollardan kullanılırlar. Ayrıca, uterus, pleura, periton ve açık yaralardan da emilirler. Fakat sülfonamidlerin tek-sodyumlu tuzları kuvvetli alkali oldukları için enjeksiyon yerlerinde dokusal irritasyon ve nekroza sebep olabilirler. Bu nedenle sülfonamidler tek-sodyumlu tuzları halinde Dİ ve ikisodyumlu tuzları şeklinde de tüm parenteral yollarla verilirler. Kas içi ve periton içi yolla uygulandıklarında, ilk saatte etkili ve 2-4 saatte de plazmada doruk yoğunluğa ulaşırlar. Damar içi yolla verilmeyi takiben, idrarla atılan ilaç miktarı çok yüksektir. Bu durum böbrek tubullerinde kristalleşme tehlikesi doğurur. Genellikle plazma yarı ömrü uzun olan ilaçların Dİ yolla verilmeleri tercih edilir (Nizamlıoğlu, 1992; Kaya, 2000; Şahindokuyucu, 2003). Sülfonamidler Dİ olarak verilmelerinden kısa bir süre sonra kanda en yüksek düzeye ulaşırlar. Sülfonamidlerin kandaki µg/ml yoğunluğu, antikoksidiyal ve antibakteriyel etki için yeterli olmaktadır (Banerjee ve ark., 1974; Nizamlıoğlu, 1992). Üreme sistemi ile ilgili hastalıklarda sülfonamidler çözelti veya tablet (bol) şeklinde uterus içi yolla kullanılabilirler. Bu müstahzarlarda sülfonamidlere yardımcı olarak genellikle üre bulunur. Üre, sülfonamidlerin çözünürlüğünü artırır, proteinlere

26 17 bağlanmasını önler ve sülfonamid antagonistlerini bertaraf ederek etkinliklerini artırır (Kaya, 2000). Sülfonamidler en çok ağız yoluyla uygulanırlar. Sülfonamidler bu yolla verildikleri zaman, sindirim kanalından çözünürlükleriyle orantılı olarak yaklaşık %70-90 oranında emilirler ve 30 dakika sonra idrarda bulunurlar. Genellikle acı lezzetlidirler; suya katılıp verildiklerinde hayvanlar tarafından isteyerek içilmezler. Bu sebeple ilaç müstahzarlarına veya hazırlanacakları suya tatlandırıcılar katılmalıdır. İlaçlar sindirim kanalından basit geçişle emilirler. Bazılarının emilimine ağızda başlanmasına rağmen asıl emilim yeri ince bağırsaklardır. Kana karışan sülfonamidlerin vücutta dağılımları gruplarına göre farklılık gösterir (Nizamlıoğlu, 1992; Kaya, 2000). Sülfonamidler emildikten sonra tüm vücuda yaygın bir şekilde dağılırlar. Süt ve diğer vücut sıvılarına da geçerler. Sülfonamidler başlıca albumin ve az miktarda da serum globulini olmak üzere plazma proteinlerine değişen derecelerde bağlanırlar (Nizamlıoğlu, 1992; Kaya, 2000). Memelilerde sülfonamidlerin esas metabolik yolu, hidroksimetabolitin glukronidasyonunu takip eden hidroksilasyon ve asetilasyon tepkimeleridir. Her iki tepkime yolu birbirlerine bağımsız görünürler. Bu yol prensip olarak sülfonamidin moleküler yapısına ve mevcut olan enzime bağlıdır. Bu yolu etkileyen diğer faktörler ilacın dozu, hayvanın yaşı, cinsiyeti ve sağlıklı olup olmadığıdır. Her sülfonamid bileşiği değişik derecelerde de olsa, asetilasyon tepkimesine uğrar. N 4 deki asetillenme olayı hayvan türüne göre de değişir. Kedi ve köpeklerde tepkimeyi gerçekleştiren N-asetil transferaz ın etkinliği zayıf olduğundan, bu tepkimenin önemi azdır. N 4 -asetilli metabolitlerin etkinliği yoktur ve sudaki çözünürlükleri de zayıftır. Bu sebeple böbrek tubullerinde çökerek hasara yol açabilirler. Sülfonamidler ve metabolitleri genellikle glukuronik asit ve sülfürik asitle birleştirildikten sonra özellikle böbrekler yoluyla vücuttan atılırlar (Nizamlıoğlu, 1992; Kaya, 2000). Sülfametoksazol ağızdan verildikten sonra sindirim kanalından genellikle yavaş emilir ve vücuttan da yavaş atılır. İlaç plazma proteinlerine %60-70 arasında bağlanır; Vd değeri 0.2 L/kg dır. Yüksek oranda asetillenmeye (%30-70) maruz

27 18 kalır. Vücudu asetilli metaboliti, serbest ve glukronid şeklinde idrarla terk eder; idrarla atılması değişkendir ve idrarın ph sına bağımlılık gösterir. Alkali şartlarda idrarla atılan değişmemiş ilaç oranı yükselir (Kaya, 2000) Klinik Kullanımı Sülfonamidler ucuz olmaları ve kolay bulunabilmeleri sebebiyle bakteri, virus ve koksidilerden ileri gelen solunum ve sindirim sistemi ile idrar yolları hastalıklarında geniş şekilde kullanılırlar. Sülfonamidler çeşitli şekillerde (toz, tablet, bağırsak kaplamalı tablet, çözelti gibi) ağızdan, enjeksiyonluk çözelti şeklinde parenteral, toz ve merhem şeklinde haricen uygulanırlar (Nizamlıoğlu, 1992; Kaya, 2000) Trimetoprim Genel Yapısı Trimetoprim (2,4-diamino-5-(3,4,5-trimetoksibenzil) pirimidin) yapısına sahip, beyaz veya sarımsı-beyaz renkte, acı, kokusuz, suda son derece az (4.4 µg/ml) ve kloroformda az (18 mg/ml) çözünen, organik bazik (pka 7.3) bir maddedir (Şekil 1.2). Laktat tuzu halinde suda 50 mg/ml miktarında çözünür (Nizamlıoğlu, 1992; Kaya, 2000; Monarch Pharmaceuticals, 2003). Şekil Trimetoprim kimyasal formülü (Budavari, 1996).

28 Etki Şekli Trimetoprim bakteri veya koksidilerde folik asit sentez zincirinde dihidrofolat redüktaz enziminin etkinliğini engelleyerek etki oluşturur (EMEA, 1997; Kaya, 2000) Farmakokinetik Özellikleri Trimetoprim bütün evcil hayvan türlerine ağız ya da enjeksiyon yoluyla verilebilir. İlacın vücuttaki yarı ömrü türlere göre farklılıklar gösterir. At ve köpeklerde bu süre 4 saatten, tavuk, sığır ve domuzlarda 2 saatten, koyun ve keçilerde ise 1 saatten daha kısadır. İlaç ağızdan verildikten sonra sindirim kanalından iyi emilir ve vücudun tüm sıvı ve doku kesimlerine dağılır. Vücudu büyük ölçüde idrarla terk eder (Nizamlıoğlu, 1992; Kaya, 2000; Monarch Pharmaceuticals, 2003) Klinik Kullanımı Trimetoprim üriner sistem enfeksiyonları, Pneumocystis carinii pneumonia, otitis media, Shigellozis, Salmonellozis ve kronik bronşitis gibi enfeksiyonların tedavisinde kullanılır (Nizamlıoğlu, 1992; Monarch Pharmaceuticals, 2003) Sülfonamid-Trimetoprim Kombinasyonu Etki Şekli Sülfonamidler ve DAP türevleri bakteri ve protozoonlarda folik asit sentezinde birbirini izleyen iki tepkimeyi gerçekleştiren enzimlerin (sırasıyla dihidropteroat sentetaz ve dihidrofolat redüktaz) etkinliğini engelleyerek sinerjistik etki oluştururlar (Şekil 1.3). Ayrıca, ilaçlar tek başlarına genellikle bakterilerin gelişmesini engellerken, ikili karışım halinde ölüme yol açarlar (Bywater, 1991; Prescott ve Baggot, 1993; Kayaalp, 1998; Şanlı, 1999; Kaya, 2000; Smith ve Keith, 2000).

29 20 PABA Dihidropteroat sentetaz Dihidropteroik asit Sülfonamid DAP türevleri glutamik asit Tetrahidrofolik asit Dihidrofolat redüktaz Dihidrofolik asit Dihidrofolat sentetaz Şekil Sülfonamid ve trimetopirimlerin etki mekanizması (Kaya, 2000) Etki Spektrumu Sülfonamid-trimetoprim karışımları genellikle bakterileri öldürerek etkirler. Karışımların çok sayıda Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteriyi kucaklayan geniş bir etki spektrumu vardır. Bu karışımlar bazı protozoa türlerine de etkilidirler (Kaya, 2000) Farmakokinetik Özellikleri Sülfonamid-trimetoprim karışımları ağızdan verildikten sonra, sindirim kanalından iyi emilir ve 1-4 saat içerisinde plazmada doruk değere ulaşırlar. İlaçlar, özellikle derialtı olmak üzere, kas içi uygulama yerlerinden yavaş emilirler. Bu yollarla verildiklerinde yaklaşık 60 dakikada etkili ve 4 saat içerisinde de doruk yoğunluğa ulaşırlar. Yalnız deri altı enjeksiyonları geçici şişlik yaptığından pek tercih edilmez. Kombinasyon hayvanlara da farklı dozlarda verilir. Genellikle kanatlılara 1 L içme suyuna mg sülfonamid ile mg trimetoprim 6 gün süreyle; sığır, koyun, keçi, at, domuz, kedi ve köpeklere ise Kİ yolla günde mg sülfonamid ile 2-8 mg trimetoprim verilmesi uygundur (Nizamlıoğlu, 1992; Kaya, 2000). İki madde grubu da vücutta tüm sıvı ve doku kesimlerine dağılır. Özellikle beyin zarlarının yangılı olması durumunda olmak üzere, kan beyin engelini kolay geçerler

30 21 ve beyin-omurilik sıvısı (BOS) da plazmadakinin %50-70 i seviyede bulunurlar. Vücudu da büyük ölçüde idrarla terk ederler (Kaya, 2000; Smith ve Keith, 2000). Löscher ve ark. (1990) broylerlere değişik dozlarda sülfonamid trimetoprim kombinasyonlarını ağızdan, içme suyu ile Dİ yolla vererek, çeşitli tavuk hastalıklarının tedavisinde etkili olabilecek plazma düzeylerini tespit etmişlerdir. Aynı araştırmacılar, normal dozun birkaç katının verilmesi durumunda hayvanların yan etki göstermeden verilen ilaca dayanabildiklerini de belirtmişlerdir (Nizamlıoğlu, 1992) Klinik Kullanımı Veteriner hekimlikte sülfonamid-trimetoprim karışımları geniş şekilde kullanılırlar. Bunlar hayvanlarda çeşitli bakterilerden ileri gelen solunum ve sindirim sistemi, idrar yolları, üreme kanalı ve yumuşak dokuların özel ve özel olmayan hastalıklarında başarıyla kullanılırlar. Sülfonamid-trimetoprim karışımlarında kullanılacak dozun hesaplanmasında genellikle sülfonamid kısmı esas alınır (Elmas, 1997; Kaya, 2000). Bettinetti ve Giordano (1988) trimetoprim ile sülfonamid bileşiklerinin 1:1 oranındaki kombinasyonları üzerine yaptıkları çalışmada, etkileşimin önemli derecede olmadığını belirlemişlerdir. Yapılan diğer çalışmalar da dikkate alındığında sülfonamid ve trimetoprim kombinasyonlarının 5:1 oranında kullanılması önerilir. Hayvan türüne göre değişmekle beraber, ilaçlar genellikle parenteral olarak günde 1-2 kez 15 mg/kg ve ağızdan da günde 1-2 kez mg/kg miktarlarda verilirler (Nizamlıoğlu, 1992; Elmas, 1997; EMEA, 1997; Kaya, 2000; Smith ve Keith, 2000) Çalışmanın Amacı Veteriner ilaç formülasyonlarının biyoeşdeğerliliklerinin belirlenmesi AB ve diğer ülkelerde gittikçe artan öneme sahip bir kalite kontrolüdür. Antibakteriyel ilaçların farmakokinetik hareketlerini değiştiren faktörlerin anlaşılması, bu ilaçların etkinliklerinin en üst düzeye çıkarılması için oldukça önemlidir. İn vivo

31 22 biyoeşdeğerlilik çalışmaları in vitro çalışmalarla da desteklenebilen değerlendirme testleridir. Biyoeşdeğerlilik sertifikasını almış ürünler uluslar arası standartlarda ürün özelliği taşır. Ülkemizde üretilen veteriner müstahzarların etkinliğini, güvenilirliğini ve kalitesini artırmak, tüketici ve üretici haklarını korumak, bu alanda faaliyet gösteren firmaların kaliteli ürün üretimini teşvik etmek ve ayrıca AB'ye uyum için sürdürülen çalışmalara katkıda bulunmak amacı ile veteriner hekimlikte kullanılan ilaçlarda biyoeşdeğerlilik çalışmalarına gereken önem verilmelidir. Ülkemizde bu konuda henüz somut çalışmalar yapılmamıştır. Bu çalışmada, son yıllarda antibakteriyel amaçla kullanılmaya elverişli birçok yeni antibiyotiğin keşfedilmesine rağmen, halen başta tavuklarda olmak üzere kanatlılarda geniş şekilde kullanılan ilaçlardan birisi olan sülfametoksazol+trimetoprim kombinasyonu ve bu kombinasyonu 5:1 oranında içeren müstahzarların (A ve B ilaçları) çeşitli farmakokinetik değişkenlerin incelenmesi; bu parametreler esas alınarak in vivo şartlarda ilaçların biyoeşdeğerliliklerinin karşılaştırılması planlanmıştır.