BRASSİCA NİGRA BİTKİSİNİN İN VİTRO ŞARTLARDA DOKU KÜLTÜRÜ İLE ÇOĞALTILMASI

Transkript

1 YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BRASSİCA NİGRA BİTKİSİNİN İN VİTRO ŞARTLARDA DOKU KÜLTÜRÜ İLE ÇOĞALTILMASI Biyolog Yasemin YILDIZHAN FBE Biyomühendislik Anabilim Dalından Hazırlanan YÜKSEK LİSANS TEZİ Tez Danışmanı : Prof. Dr. Huriye KUZU (YTÜ) İkinci Tez Danışmanı : Prof. Dr. Abdülrezzak MEMON (TÜBİTAK-MAM) İSTANBUL, 2007

2 ii İÇİNDEKİLER ii Sayfa SİMGE LİSTESİ... v KISALTMA LİSTESİ...vi ŞEKİL LİSTESİ...vii ÇİZELGE LİSTESİ...ix ÖNSÖZ... x ÖZET.xi ABSTRACT...xii 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Bitki Doku Kültürü Bitki Hücre, Doku ve Organ Kültürü Teknikleri Doku Kültürü nün Klasik Çoğaltma Metotlarıyla Karşılaştırılması Bitki Doku Kültürlerinin Tarihi Gelişimi Türkiye de Doku Kültürü Çalışmaları Bitki Doku Kültürü Aşamaları Uygun Laboratuvar Düzeninin Kurulması Kullanılacak Bitki Parçalarının Seçimi Besi Ortamının Seçimi Bitki Büyüme Düzenleyicileri Sterilizasyon Çalışma Alanının Sterilizasyonu Besin Ortamlarının, Alet ve Ekipmanların Sterilizasyonu Besin ortamlarının, alet ve ekipmanlarının sterilizasyonu Otoklav ve sıcak hava sterilizasyonu Filtre sterilizasyonu Mikrodalga sterilizasyonu Bitki materyallerinin yüzey sterilizasyonu Kallus Kültürü İn-vitro Köklendirme Köklenen Bitkilerin Dış Ortama Alıştırılması (Aklimatizasyon) Bitkinin Sistematikteki Yeri Bitkinin Yayılımı Biyolojisi Vejatatif Özellikleri Yaprak Özelliği Generatif Özellikleri Çiçek Özelliği Meyve Özelliği Ekonomik Özelliği Brassica Biyoteknolojisi... 27

3 iii Brassica Transformasyon Çalışmaları Organogenesis Genotip Eksplantların Yaşı Etilen İnhibitörü Diğer Besi Ortamı Bileşenleri Somatik Embriyonogenesis Brassica da Moleküler İşaretleyiciler (Marker) ve Islah Türkiye de Brassicaceae Familyası na Ait Çalışmalar DENEYSEL ÇALIŞMALAR Deneysel Çalışmalarda Kullanılan Cihazlar ve Kimyasal Maddeler Deneysel Çalışmalarda Kullanılan Cihazlar Kullanılan Kimyasal Maddeler Deneyde Kullanılan Çözeltiler Vitamin karışımı ana solüsyonu B 1 vitamini ana solüsyonu BAP (6-Benzylaminopurin) ana solüsyonu NAA (α Naftalenasetik asit) ana solüsyonu IBA (3-Indolbutirik asit) ana solüsyonu Myoinositol ana solüsyonu Zeatin ana solüsyonu GA 3 ana solüsyonu Bitki Materyali Besi Ortamının İçeriği Besi Ortamlarının Hazırlanması ve Sterilizasyonu Bitki Büyüme Düzenleyicilerinin Stok Çözeltilerinin Hazırlanması Bitki Materyalinin Çimlenme Ortamı Olgun B. nigra Tohumlarının Sterilizasyonu ve Çimlenme Yüzdesi Yüzey Sterilizasyonu Yapılmamış Olgun B. nigra Tohumlarının Çimlenme Kapasitesi Üzerine Ön Çalışma Brassica Tohumlarının Sterilizasyonu ve Çimlenme Yüzdesi Üzerine NaOCl nin, ph ın ve Optimum Bekletilme Süresinin Etkisinin Belirlenmesi İçin Deneysel Çalışma Tip Tohum Bitki Parçasının Alınması (Eksplant Kültür) Tamamen Rejenerasyonu Gerçekleşen Bitkinin Toprak Kültürüne Aktarımı (Aklimatizasyon): Sterilizasyon Teknikleri Tohumların Sterilizasyonu Isı İle Sterilizasyon Filtrasyon İle Sterilizasyon Kullanılan Aseptik Yöntemler Cam Malzemelerin Sterilizasyonu Pens ve Bistürilerin Hazırlanması ve Sterilizasyon Çalışma Şartları Kültür Şartları Verilerin Toplanması DENEYSEL SONUÇLAR VE TARTIŞMALAR iii

4 iv 4.1 Yüzey Sterilizasyonu Yapılmamış Olgun B. nigra Tohumlarının Çimlenme Kapasitesi Brassica Tohumlarının Sterilizasyonu ve Çimlenme Yüzdesi Üzerine NaOCl nin, ph ın ve Optimum Bekletilme Süresinin Etkisi Deneme Kontrol Serisi Deneme Serisi Deneme Serisi Deneme Serisi Deneme Serisi Değerlendirme Hipokotil Eksplantı Kallus Oluşumu Sürgün Oluşumu Apeks Eksplantı Gövde Eksplantı İndirekt Köklendirme Toprağa uyum (Aklimatizasyon) KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ iv

5 v SİMGE LİSTESİ AgNO 3 Gümüş Nitrat Cd Kadmiyum Cu Bakır Co Kobalt μl Mikrolitre µg Mikrogram mg Miligram ml Mililitre gr Gram cm Santimetre ºC Santigrat derece mm Milimolar µm Mikromolar l Litre Ni Nikel Se Selenyum Zn Çinko Mn Manganez Fe Demir Ppm Milyonda bir parça (Parts per million) v

6 vi KISALTMA LİSTESİ BAP 6-benzylamino-purin BBD Bitki büyütme düzenleyicileri DNA Deoksiribonükleik asit GA Giberalik asit HCl Hidrojen klorür IAA İndol-3-asetik asit IBA İndol bütrik asit NAA 1-Naftalinasetik asit MS Murashige and Skoog Besi ortamı MGBG Methylglyoxal-bis- (guanylhydrazone) UV Ultra Viyole vi

7 vii ŞEKİL LİSTESİ Şekil 2.1. Bitki büyütme kabininde kültüre alınmış örnekler Şekil 2.2. BA ve NAA nın sürgün oluşumuna etkisi Şekil 2.3. MS besi ortamında kallus oluşumu Şekil 2.4. Kallus hücrelerinin mikroskopta görünümü Şekil 2.5. Kallus hücrelerinin mikroskopta görünümü Şekil 2.6. IAA ve kinetin hormonlarının indirekt köklenmeye etkisi Şekil 2.7. Brassica nigra bitkisinin genel görünüşü (Fotoğraf de çekilmiştir.) Şekil 2.8. Brassica nigra nın yumurtalığının mikroskopta görünümü Şekil 2.9. Brassica nigra nın çiçeklenmesi (Fotoğraf tarihinde çekilmiştir) Şekil Brassica nigra bitkisine ait stamen ve petallerin görünüşü Şekil Çiçeklenme, meyve ve tohum oluşumu Şekil Brassica nigra ya ait tohumlar (4) Şekil Brassica juncea nın genel görünümü Şekil 4.1. Hipokotil eksplantının 8 farklı besi ortamında oluşan kallus oranlarının değişimi. 53 Şekil 4.2. MS1 ortamında hipokotil eksplantından kallus oluşumu Şekil 4.3. MS2 ortamında hipokotil eksplantından kallus oluşumu Şekil 4.4. MS4 ortamında hipokotil eksplantından kallus oluşumu (7. gün) Şekil 4.5. MS12 ortamında 7 günün sonunda ölen kalluslar Şekil.4.6. MS1 ortamında apeksten direkt sürgün oluşumu Şekil.4.7. MS2 ortamında apeksten direkt sürgün oluşumu Şekil 4.8. Apeks eksplantından 5 farklı besi ortamında oluşan kallus oranlarının değişimi Şekil 4.9. Apeks eksplantının 5 farklı besi ortamındaki direkt sürgün oluşturma oranlarının değişimi Şekil MS1 besiortamında apeksten indirekt sürgün oluşumu başlangıcı (7. gün) Şekil MS1 besiortamında, apeksten indirekt sürgün oluşumu, kallus oluşumundan sonra 15. gün Şekil MS1 besi ortamında, apeksten indirekt sürgün oluşumu, kallus oluşumundan sonra 19. gün Şekil MS1 besi ortamında apeksten indirekt sürgün oluşumu, kallus oluşumundan sonra 25. gün Şekil MS3 besi ortamında apeks indirekt sürgün oluşumu Şekil MS4 besi ortamında apeksten indirekt sürgün oluşumu Şekil Apeks eksplantının 3 farklı besi ortamındaki indirekt sürgün oluşturma oranlarının değişimi Şekil MS3 ortamında gövde eksplantından kallus oluşumu (14 günlük) Şekil Gövde eksplantının 5 farklı besi ortamındaki kallus oluşturma oranlarının değişimi64 Şekil Gövde eksplantının 5 farklı besi ortamındaki direkt sürgün oluşturma oranlarının değişimi Şekil MS1 ortamında gövdeden direkt sürgün oluşumu Şekil Köklenme ortamlarında oluşan indirekt köklerin oranlarının değişimi Şekil MS0 besi ortamında indirekt kök oluşumu (20 günlük) Şekil MS0 besi ortamında indirekt kök oluşumu (20 günlük) Şekil MS7 besi ortamında indirekt kök oluşumu (3 günlük) Şekil Apex indirekt köklenme, MS7 (IBA), 8 günlük Şekil Gövde sürgünü, indirekt köklenme, MS6 (NAA), 7 günlük (30/03/2007) Şekil Apeks sürgünü, indirekt köklenme, MS9 (12 µg l-1 AgNO 3 ), 19 günlük (10/08/2005) Şekil B. nigra nın aklimatizasyon çalışmaları (1. aşama) Şekil Torfa uyum sağlamış B. nigra bitkisi Şekil B. nigra nın toprak + torfa (2:1) uyumu vii

8 viii Şekil Toprağa uyum sağlamış B. nigra, 05/04/2006, çiçeklenme başlangıcı Şekil Çiçeklenme başlangıcı 06/04/ Şekil Tohum başlangıcı 25/04/ Şekil B. nigra dan elde edilen tohumlar viii

9 ix ÇİZELGE LİSTESİ Çizelge 1.1. Çeşitli metal hiperakümülatör türler ve biyoakümülasyon kapasiteleri... 2 Çizelge 2.1. Bitki doku kültüründe önemli çalışmalar (Babaoğlu vd., 2001) Çizelge 2.2. Bitki doku kültüründe kullanılan besi ortamlarının içeriği Çizelge 2.3. Uygulama alanları ve etki şekillerine göre bitki büyüme düzenleyici, engelleyici ve hormon grupları Çizelge 2.4. Bitki doku kültüründe en çok kullanılan bitki büyüme düzenleyicileri (Babaoğlu ve ark., 2001) Çizelge 2.5. Ekonomik özelliğe sahip bazı Brassica türleri Çizelge 2.6. Brassica da kullanılan bazı markırlar ve işlevleri Çizelge 3.1. Deneyde kullanılan sarf maddeler Çizelge 3.2. MS besi ortamında kullanılan makro ve mikro elementler Çizelge 3.3. MS besi ortamında kullanılan diğer elementler Çizelge 3.4. Kallus ve sürgün oluşumu için kullanılan MS besi ortamları Çizelge 3.5. Köklendirme ortamları Çizelge 4.1. Tohumların çimlenme oranları (%) Çizelge 4.2. Hipokotil eksplantının 8 farklı besi ortamında, kallus oluşturma oranlarının karşılaştırılması Çizelge 4.3. Apeks eksplantının 5 farklı besi ortamında kallus oluşturma oranlarının karşılaştırılması Çizelge 4.4. Apeks eksplantının 5 farklı besi ortamında direkt ve indirekt sürgün oluşturma oranlarının karşılaştırılması Çizelge 4.5. Gövde eksplantının 5 farklı besi ortamında kallus oluşturma oranlarının karşılaştırılması Çizelge 4.6. Gövde eksplantından, 5 farklı besi ortamında oluşan direkt sürgün oranlarının karşılaştırılması Çizelge 4.7. Sürgünlerin 5 farklı köklendirme ortamında, indirekt köklenme oranlarının karşılaştırılması ix

10 x ÖNSÖZ Yüksek Lisans eğitimimde ve tezimin oluşmasında gösterdiği anlayış ve bilimsel katkılarından dolayı değerli danışmanım Prof.Dr. Huriye KUZU ya; TÜBİTAK-Bitki Moleküler Genetiği Laboratuvarı nda, deneysel çalışmalarımda beni yönlendiren ve bilgisini esirgemeyen ikinci danışmanım Prof.Dr. Abdülrezzak MEMON a; beni her zaman destekleyen, tecrübelerinden yararlandığım ve adını her zaman saygıyla anacağım Bölüm Başkanım Sayın Prof.Dr. M. Mustafa AKDESTE ye; Bana bir ağabey desteği veren ve çalışmalarım sırasında tüm tecrübelerini bana aktaran sevgili arkadaşım, büyüğüm Ufuk DEMİREL e; Tezimin yazım aşamasında büyük yardımlarını gördüğüm sevgili dostlarım Melike ERSÖZ, Özlem ERTEKİN ve Turgay GÜVEN e; TÜBİTAK, GMBE, Bitki Moleküler Genetiği Laboratuvarı nda ki tüm çalışma arkadaşlarıma; beni her konuda destekleyen aileme ve dostlarıma; Hayatı boyunca beni destekleyen, güvenen, seven ve her zaman arkamda görünmez bir güç olarak duran çok sevdiğim, eksikliğini her zaman hissedeceğim, yakın zamanda kaybettiğim Dedem Hasan YILDIZHAN a; Bana ve bu teze emeği geçmiş olan herkese; SONSUZ TEŞEKKÜRLER. x

11 xi ÖZET Son yıllarda toksik etkiye sahip ağır metallerle kirlenmiş suları ve toprakları temizlemek için çevre dostu ve ucuz maliyetleri nedeniyle metal akümülatörü olan bitkilerin kullanımı hızla artmaktadır. Hiper akümülatör bitki olarak adlandırılan bu bitkilerin kökleriyle ppm veya ppm e kadar ağır metalleri akümüle ettikleri ispatlanmıştır. Özellikle Brassicaceae familyasına ait türlerle (Brassica juncea, Thlaspi caerulescens J.&C.) yapılan çalışmalarda bu bitkilerin hiper akümülatör bitki özelliğinde oldukları belirlenmiştir. Bu tez çalışması ile, büyük miktarlarda Cu, Zn ve Cd u akümüle ettiği gösterilen Brassica nigra nın olgunlaşmış dokularından verimli in vitro rejenerasyon sistemi geliştirildi. Brassica nigra, geniş alanda Güneydoğu Anadolu da özellikle bu bölgenin maden yataklarında yetişmekte olan bir türdür. Bu çalışma ile Brassica nigra nın fitoremediasyon amaçlı çok miktarda üretimi için düşük maliyetli ve verimli bir rejenerasyon metodu tanımladık. Çalışmanın başlangıç aşamasında B. nigra tohumları steril edildi ve hormonsuz Murashige and Skoog (MS) besi ortamında 30 günlük çimlenmeye bırakıldı. Rejenerasyon ve kallus oluşumu frekanslarını değerlendirmek amacıyla, 30 günlük eksplantlar, farklı konsantrasyonlarda 6-Benzil Amino Pürin (BAP) ve 1-Naftalin Asetik Asit (NAA) içeren MS besi ortamlarına aktarıldı. Yüksek kallus oluşumu hipokotil, apeks ve gövde eksplantlarında saptandı. Direkt ve indirekt sürgün rejenerasyonlarının her ikisi de apeks eksplantlarında belirlendi. Direkt sürgün rejenerasyonu NAA ve BAP ın tüm kombinasyonlarında gözlemlendi. Apeksten indirek sürgün oluşumu, NAA ve BAP hormonlarının uygun oranlarda bulunduğu 0.2 mg ml -1 NAA mg ml -1 BAP, 0.5 mg ml -1 NAA+ 2.0 mg ml -1 BAP ve 1.0 mg ml -1 NAA+ 0.2 mg ml -1 BAP) besi ortamlarıyla sağlandı. İndirekt ve direkt oluşan sürgünler, kök oluşumu için 5 farklı MS besi ortamına aktarıldı ve kökler 7-20 gün içerisinde gelişti. Kök oluşumu sonrası tam rejenerasyonu gerçekleşen bitkiler toprağa transfer edildi. Geliştirilmiş olan bu çalışma Brassica nigra için verimli ve düşük maliyette rejenerasyon metodunu gösteren ilk çalışmadır. Anahtar Kelimeler: metal akümülatör, Brassica nigra, kallus, in vitro rejenerasyon xi

12 xii ABSTRACT The use of metal accumulator plants in the rehabilitation of toxic heavy metal contaminated soil and waterlands has been growing increasingly in recent years. It has been proved that these "hyper accumulator plants" can accumulate heavy metals up to to ppm. Especially the studies conducted with the species belonging to Brassicaceae family (Brassica juncea, Thlaspi caerulescens J.&C.) revealed that, these plants have a significant hyper accumulation capacity. An efficient in vitro plant regeneration system was developed from mature tissues of Brassica nigra, which was shown previously to accumulate large amounts of Cu, Zn and Cd. These plant species are widely grown in Southeastern Anatolia and are especially present in mining areas of this region. Here we describe an efficient and low cost regeneration method for mass production of these plants for phytoremediation purpose. Brassica nigra seeds were sterilised and germinated on Murashige and Skoog's (MS) medium without hormones for 30 days. Thirty-day-old explants were cultured on MS medium supplemented with different concentrations of 6-benzylamino-purine (BAP) and 1-naphthaleneacetic acid (NAA) to evaluate the frequency of regeneration and callus formation. High frequency callus formations were induced on hypocotyl, apex and shoot explants. Both direct and indirect shoot regeneration was obtained from apex explants. Direct shoot regeneration was observed in all combinations of NAA and BAP. Indirect shoot regeneration from apex was induced with appropriate ratios of both NAA and BAP (0.2 mg ml -1 NAA mg ml -1 BAP, 0.5 mg ml -1 NAA+ 2.0 mg ml -1 BAP and 1.0 mg ml -1 NAA+ 0.2 mg ml -1 BAP) in the medium. Indirect and direct regenerated shoots were transferred to five different MS media for root formation and roots were formed within 20 to 25 days. After root formation, plants were transferred to pot culture. As far as we are aware this is a first kind of study showing an efficient and low cast regeneration method for Brassica nigra. Key words: metal accumulator, Brassica nigra, callus, in vitro regeneration xii

13 1 1. GİRİŞ Son yıllarda Biyoremediasyon, çevre kirliliğinin ortadan kaldırılması çalışmalarında çok önem kazanmıştır. Gerek karasal ya da sucul habitatların kirlenmesini önlemek amacıyla kullanılmakta olan arıtım teknolojileri ve gerekse kirlenmiş habitatların temizlenmesini sağlayan biyolojik iyileştirme teknolojileri olarak tanımlanan biyoremediasyon, temelde fiziksel, kimyasal ve ağırlıklı olarak biyolojik süreçlerin kullanımıyla geliştirilmiş teknolojilerdir (Utsunamyia, 1980; Chaney, 1983; Baker vd., 1991). Günümüzde bitkiler, çevre kirliliğini ortadan kaldırmak için yüksek maliyetli teknolojilerin yerine ekonomik, birçok toprak türünde uygulanabilir, tahrip edici özelliği olmayan ve doğal bir yöntem olarak biyoremediasyon çalışmalarında kullanılmaya başlanmış ve bu yöntemler Fitoremediasyon Teknolojisi olarak adlandırılmıştır (Memon vd., 1999; Kärenlampi, 2000). Tarım, madencilik, madenlerin tasfiyesi, hızlı sanayileşme, enerji ve yakıt üretimi, gibi faaliyetler sonucu ağır metaller çevre kirliliğinde önemli bir yer tutmaya başlamıştır (Nedelkoska, 2000). Toksik etkiye sahip ağır metallerle kirlenmiş suları ve toprakları temizlemek için çevre dostu ve ucuz maliyetleri nedeniyle metal akümülatörü olan bitkilerin kullanımı hızla gelişmektedir (Cunningham vd., 1995; Memon vd., 1999; Chen vd., 2000). Metal tolere edebilir hale gelen populasyonlar, bitki populasyonlarının birçok seleksiyon baskısı altındaki değişimlerini araştırma fırsatı verir ve fitoremediasyon işleminde endüstriyel olarak da kullanılabilecek bitkilerin seçimini sağlar (Mengoni vd., 2000). Endüstriyel olarak kirletilmiş topraklar tamamen bitki örtüsü bakımından fakir değildir ve buralarda yaşamaya, çoğalmaya genetik olarak uyum sağlamış bitkiler görmek mümkündür. Genel olarak bu bitkiler kirlenmemiş çevrelerde yaşayan ancak kirletilmiş çevrelerde de yaşamaya uyum sağlamış ekotipler şeklinde evrimleşmiştir (Mengoni vd., 2000). Büyük miktarlarda Ni, Cu ve Cd akümüle edebilen farklı metal akümülatörü bitkiler tanımlanmıştır (Memon vd., 1979, 1980; Chaney vd., 1997). Örneğin, Brassicaceae familyasına ait Thlaspi caerulescens J.&C. bitkisinin sırasıyla 1000 ppm ve 30,000 ppm Cd ve Zn akümüle ettiği gösterilmiştir (Pence vd., 2000). Bu nedenle bitki hiper akümülatör bitki olarak isimlendirilmiştir. Ayrıca, Alyssum bertoloni nın kökleriyle 10,000 ppm Ni ( Krämer vd., 1996, 1997; Brooks, 1998) ve Brassica juncea nın kökleriyle 13,000 ppm Cu akümüle ettiği ispatlanmıştır (Dushenkov vd., 1995).

14 2 Çizelge 1.1. Çeşitli metal hiperakümülatör türler ve biyoakümülasyon kapasiteleri Bitki Türü Metal Yaprak Bileşeni Referans Ppm Thlaspi caerulescens Zn:Cd :1 800 Reeves ve Brooks, (1983); Baker ve Walker, (1990) Ipomea alpina Cu Baker ve Walker, (1990) Sebertia acuminata Ni 25% (kuru sap) Jaffre vd., (1976) Haumaniastrum robertii Co Brooks, (1977) Astragalus racemosus Se Beath vd., (1937) Devamlı Toprak Kullanımını ve Gıda Güvenliğini İyileştirmede Fitoteknolojiler (Phytotechnologies to Promote Sustainable Land Use Management and Improve Food Chain Safety) isimli TÜBİTAK- COST (859) projesinin ilk aşamasında, Güneydoğu Anadolu Bölgesi Florası nda endemik ağır metal akümülatör bitkisi keşfetmek için çalışmalar yapıldı. İlk olarak yaklaşık 30 bitki türü bölgeden toplanıldı ve Atomik Absorpsiyon Spektrometresi kullanılarak her bir bitkinin yaprak, gövde ve köklerinde ağır metal (Fe, Mn, Cu, Cd) analizi yapıldı (Memon vd., 1980). Yapılan analizler değerlendirildiğinde Brassica nigra nın Cu ve Cd akümülatörü olabileceği sonucu çıkartıldı. Yürütülen proje kapsamında, bu konudaki deneysel çalışmalar hala devam etmektedir. Bu tez çalışmasında, projenin diğer bir aşaması olan Brassica nigra nın rejenerasyon çalışmaları başlatıldı. Brassica cinsi, yüksek oranda ağır metal akümüle etmeleri nedeniyle çevre açısından son derece önemlidir. Çevre kirliliğinin azaltılmasında, eksozlardan çıkan veya çevrede bulunan ağır metallerin temizlenmesinde ve özellikle Biyoremediasyon çalışmalarında bu bitkilerden yararlanmak amaçlanmaktadır. Yağlı tohumları bakımından bitkisel yağ olarak kullanılan ve protein zengini olması nedeniyle büyük bir ekonomik öneme sahip olan ürün türlerinden, Brassica cinsi dünya genelinde geniş bir yayılım göstermektedir (Zhou, 2001). Brassica nigra (kara hardal) Brassicaceae familyasına ait, Anadolu platosunda geniş bir yayılım gösteren çift çenekli bir türdür (6). Brassica ile ilgili araştırmalarda ağırlıklı olarak protoplast ve in vitro dokulardan yüksek verimlilikte bitki rejenerasyonu çalışılmıştır (Klimaszewska ve Keller, 1987; Pua vd., 1989; Shukla ve Sawhney, 1991). Transformasyon deneylerinin çoğunluğu Brassica juncea ve Brassica napus ile yapılmıştır (Mathews vd., 1990; Dias vd., 1996) ve bitki rejenerasyonları çeşitli eksplantlardan başarı ile elde edilmiştir (Hui vd., 1978; George ve Rao, 1980; Murata ve Orton, 1987; Eapen ve George, 1997).

15 3 Bu çalışmanın temel amacı, Brassica nigra bitkisinin yüksek miktarda üretimini, Anadolu ve Trakya bölgelerindeki metalle kirlenmiş alanların temizlenmesinde kullanmak üzere gerçekleştirmektir. Bu amaçla metal akümülatörü Brassica nigra bitkisinin basit ve mali açıdan uygun rejenerasyonu, doku kültürü teknikleri kullanarak gerçekleştirildi. Günümüzde büyük bir çevre kirliliğine yol açan ağır metallerin, bu bitkileri kullanarak etkisini azaltmak ve ağır metallerin akümüle edilmesi sırasında çalışan genleri tespit ederek başka bitkilere aktarımını sağlamak için bu çalışma öncü bir çalışma niteliğindedir.

16 4 2. GENEL BİLGİLER 2.1 Bitki Doku Kültürü Dünya nüfusunun beslenmesinde en çok kullanılan yaklaşık 30 bitki grubu içinde en önemlileri tahıllar, baklagiller, endüstri bitkileri, sebzeler ve meyve ağaçlarıdır. Ancak buğday, çeltik, mısır ve patatesin üretim miktarlarının toplamı diğer ürünlerin toplamından daha fazladır. Bununla beraber dünya florasında yaklaşık 250 bin bitki türünün bulunduğu fakat bunlardan sadece 3000 adedinin besin değerine sahip olduğu bildirilmektedir (Babaoğlu, 1998). Bitkilerin insan ve hayvan beslenmesinde kullanımı amacıyla iyileştirilmesi çalışmalarında iki önemli dönem göze çarpmaktadır. Bunlardan ilki Yeşil Devrim olarak adlandırılan, klasik bitki ıslahı, ticari gübreler ve diğer agronomik tekniklerin gelişiminin etkili olduğu dönemdir. Yeşil devrimde üretim, tohum-bitki-tohum döngüsünde gerçekleştirilir. İkinci dönem ise Gen Devrimi olarak adlandırılmaktadır (Kung, 1993). DNA nın yapısının anlaşılması, bakteri genetiği, bitki doku kültürünün gelişimi ve bu tekniklerin birçok bitkiye uygulanabilir olması gen devrimi döneminin başlamasını hazırlamıştır. Yeşil devrim ile karşılaştırıldığında gen devriminde hedefe ulaşma bakımından bir tümevarım söz konusudur. Yani, baz nükleotid gen kromozom, ribozom amino asit protein kloroplast mitokondri, hücre doku organ bitki ve tohum zincirinin her parçası amaca ulaşmada ayrı ayrı veya birlikte değerlendirilerek üzerinde değişiklikler yapılabilmektedir. Bunlar arasında hücreye kadar olan konular genellikle bitki genetik mühendisliğinin, hücre-tohum arasındaki konular ise bitki doku kültürünün ilgi alanlarıdır. Görüldüğü gibi bitki doku kültürü, bitki genetik mühendisliği ile birlikte bitki biyoteknolojisini oluşturan ana unsurlardan biridir (Babaoğlu vd., 2002). Bitki doku kültürü; aseptik (steril) şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre (meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku (çeşitli bitki kısımları = eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi bitki kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesidir (Babaoğlu vd., 2001). Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik çeşitlilik oluşturmak doku kültürünün temel araçları arasında sayılabilir. Bu nedenle bitki doku kültürleri genetiksel iyileştirme çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca kaybolmakta olan türlerin korunmasında ve çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde, çeşitli doku kültürü yöntemleri rutin olarak uygulanmaktadır.

17 5 2.2 Bitki Hücre, Doku ve Organ Kültürü Teknikleri Bitki doku kültürü işlemlerinde ve genetik iyileştirmelerde kullanılan temel sistem bitki rejenerasyonudur. Bitki rejenerasyonu, kültürü yapılan hücrelerin özellikleri itibariyle üç kısımda incelenebilir: Organize olmuş meristematik hücreleri içeren somatik dokulardan rejenerasyon Meristematik olmayan somatik hücrelerden rejenerasyon Mayoz bölünme geçirmiş gametik hücrelerden rejenerasyon Birinci tip rejenerasyonda uç ve yan meristemlerden bitkiler çoğaltılır. Buna meristem kültürü yoluyla klonal çoğaltım denilir. Elde edilen hücreler tamamen donör (verici) bitkiye benzerler. İkinci tip rejenerasyon; doğrudan bir bitki eksplantının kesilmiş yüzeylerindeki belirli somatik hücrelerin bir kısmının genellikle bitki büyüme düzenleyicilerinin etkisi sonucu bölünerek ve organize olarak, organları ve daha sonra da bitkiyi veya bir somatik hücrenin sürekli bölünerek embriyo ve daha sonra da tam bir bitkiyi oluşturması şeklinde olabilir. Ayrıca her iki durum, belirli bir kallus, proto-kallus veya hücre süspansiyonu oluşumu devresinden sonra da ortaya çıkabilir. Ortaya çıkan bitkilerde bazı kalıtsal veya geçici varyasyonlar oluşabilir. Son olarak normal kromozom sayısının yarısını içeren hücrelerden de direk veya dolaylı yollarla bitki rejenerasyonu olabilir. Bu durumda donör bitkinin kromozom sayısının yarısına sahip, genellikle steril olan haploid bitkiler elde edilebilir. Bitkilerin laboratuvarda veya kontrollü şartlarda fazlaca miktarda çoğaltılması, (mikro çoğaltım, klonal çoğaltım) klasik usullerle bitki üretimine önemli bir alternatiftir. Mikro çoğaltma çevre ve besin kontrolü yapılabilen steril (mikroorganizma, toz vb. ihtiva etmeyen) yetiştirme şartlarında bir bitkinin tomurcuk, boğum, yaprak ve kök parçaları gibi çeşitli yerlerinden alınan küçük parçalarının (eksplant) kültürü sonucu yeni bitkilerin üretilmesidir. Üretilen bitkiler her bakımdan birbirinin aynısıdırlar. Yani yapılan bu iş bitki klonlaması veya genetik kopyalamadır. Yeoman a (1993) göre bitki hücre ve doku kültürlerinin pratik uygulamaları ve yapılma amaçları aşağıdaki gibi özetlenebilir: Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik çeşitlilik oluşturmak doku kültürünün temel amaçları arasında sayılabilir. Bu nedenle bitki doku kültürleri genetiksel iyileştirme çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Kaybolmakta olan türlerin korunmasında ve çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde, çeşitli doku kültürü yöntemleri rutin olarak uygulanmaktadır. Genellikle bitkilerin

18 6 yaprak, gövde veya köklerinden alınan parçalarındaki vücut hücrelerinin özel besin ortamlarında kültüre alınması yoluyla uygulanır. En çok karşılaşılan uygulama hücrelerde, o hücrelerin alındığı bitkiye benzer bitki veya bitkiler üretmektir. Buna rejenerasyon denilir. Ayrıca tek başına hücreler veya organlar (örnek: kökler) çoğaltılabilir ve çeşitli amaçlar için kullanılabilir. Bu işlem bitkilerin amaca uygun olarak genetik yönden değiştirilmesine de imkan sağlamaktadır. Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik varyabilite oluşturmak Kaybolmakta olan türlerin korunması Çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde rutin olarak uygulanmaktadır. 2.3 Doku Kültürü nün Klasik Çoğaltma Metotlarıyla Karşılaştırılması Günümüzde, bitki ıslahının tarım üretimin artırmasındaki payı ve önemi tartışılmaz bir durumdadır. Geleneksel ıslah yöntemleri bitkisel üretimin artırılmasında oldukça başarılı olmasına rağmen doğası gereği yavaş ve zaman alıcıdır. Ayrıca, bu yöntemlerde doğadaki dar sınırlar içerisinde bulunan çeşitlilikten faydalanmak esastır. Bugün hepsinde olmasa da özellikle insanlar için yaşamsal öneme sahip tahıllarda sorunların çözümü için genetik çeşitliliğin sınırlarına yaklaşılmış veya söz konusu bu genetik çeşitlilik tüketilmek üzeredir. Bunun için önemli kültür bitkilerin ıslahında kullanılacak daha geniş bir genetik çeşitliliği tahmin etmek zorunludur. Bu ise taksonomik genetik olarak farklı türler arasındaki eşeysel uyuşmazlık engellerinin aşılması, mutasyonlar, DNA formundaki genetik materyalin transferi, habloid hücreler ve bitkilerin ede edilmesi protoplast kaynaşması veya somatik melezlemeler ile mümkündür. İşte bitki doku kültürleri belirtilen bu hususlarda büyük bir potansiyele sahiptir. Bugün doku kültürlerden elde edilen sonuçlar laboratuvar dışına çıkarak pratikte ve ticarette kullanım alanı bulmuş olup, gelişen tekniklerle her geçen gün daha da önem kazanmaktadır. Bitki doku kültürlerinin bitki ıslahında uygulama alanları aşağıdakiler gibi sıralanabilir: Türler arası melezlemelerden sonra embriyo kültürü Haploid bitki üretiminde anter (polen) ve yumurtalık (ovül) kültürü Somaklonal varyasyon İn vitro seleksiyon İn vitro döllenme İn vitro germplazm muhafazası

19 7 Somatik hücre melezlemesi (protoplast füzyonu) Gen transferi Bunların dışında bitki doku kültürünün ticari ve ıslah dışı uygulama alanlarıda mevcuttur. Bunlar aşağıdaki gibi sıralanabilir: Hastalıksız bitki elde edilmesinde meristem kültürü Mikroçoğaltım Sentetik tohum üretimi (somatik embriyolar) Sekonder metabolit üretimi (kallus-hücre süspansiyonları) Kimeralar Ayrıca bitki doku kültürlerinin temel araştırmalardaki uygulama alanları da oldukça geniştir. Doku kültürü, protoplast izolasyonu ve füzyonu, hücre, doku ve bitki beslenmesi, sitogenetik çalışmalar, morfogenesis çalışmaları ve biyolojik azot fiksasyonu gibi temel araştırmalarda da kullanılabilmektedir. Bu tür araştırmalar genellikle sistem geliştirmede kullanılır. 2.4 Bitki Doku Kültürlerinin Tarihi Gelişimi İlk topraksız üretim şekli olan hidrofonikler tüm bir bitkinin labaratuvarda tam olarak formüle edilmiş besin ortamlarında yetiştirilebilmesi düşüncesini ve daha sonra da bitki organlarının benzer şekilde kültüre alınabilmesi fikrini doğurmuştur (Chrispeels ve Sadava, 1994). Bu yolda en önemli adımlardan birisi besin ortamlarının geliştirilmesi ve tamamen aseptik şartlarda doku kültüründe kullanılmasıdır. Ayrıca zaman içinde organ ve doku gibi daha büyük parçalardan tek hücre kültüre doğru çalışmaların yöneldiği görülmektedir. Tarihte doku kültürü ile ilgili çalışmalar ilk hücre teorisinin ispatından sonra 1900 lü yıllarda başlamıştır yılında Haberlandt ilk izole hücrelerin kültürünü yaparak doku kültürü çalışmalarını başlatmıştır. Bunun sonucunda, 1983 yılında bitkilere ilk gen transferi gerçekleştirilmiştir (Çizelge 2.1). Bu transferin gerçekleştirilmesinde doku kültürünün kullanılması gerekli olmuştur ( Dixon, 1985; Ramawat, 2003). Doku kültürünün tarihsel gelişimindeki önemli çalışmalar aşağıda maddeler halinde kısaca verildi.

20 8 Çizelge 2.1. Bitki doku kültüründe önemli çalışmalar (Babaoğlu vd., 2001). Tarih Çalışmalar Araştırıcılar 1902 İlk izole hücrelerin kültürü Haberlandt 1904 Olgun embriyoların kültürü Hanning 1917 Biyoteknoloji teriminin ilk defa kullanımı Karl Ereky 1920 Oksin hormonunun keşfi ve tanımlanması Went vd Kök ve sürgün uçlarının tek başına laboratuvarda Kotte ve Robbins çoğaltımı 1924 İlk embriyo kurtarma tekniği (mısır) Dieterich 1934 İlk sürekli olarak tek başına çoğalan kök kültürleri White (domates) 1934 İlk kallus (değişmeden bölünüp çoğalan hücre topluluğu) Gautheret kültürleri 1942 İlk kallus kültürlerinden sekonder metabolit eldesi Gautheret 1946 İlk sürgün uçlarından (apikal meristem) bitki eldesi Ball 1953 DNA'nın yapısının belirlenmesi Watson ve Crick 1954 İlk hücre süspansiyonlarından bitki eldesi Muir vd İlk sitokinin hormonunun tanımlanması ve öneminin Skoog ve Miller ortaya konulması 1958 İlk somatik embriyogenesis (havuç) Steward vd Enzimler kullanılarak ilk canlı protoplast izolasyonu Cocking 1962 MS doku kültürü besin ortamının geliştirilmesi Murashige ve Skoog 1965 Tek hücreden bitki elde etme (rejenerasyon) Vasil ve Hilderbrandt 1967 İlk haploid bitkinin üretimi (anter polen kültürü) Bourgin ve Nitsch 1968 B5 ortamının geliştirilmesi Gamborg vd HEPA filtrelerin kullanılmaya başlanması 1978 Cinsler arası ilk somatik melezleme Melchers vd Transgenik ilk bitkinin elde edilmesi ve tarla testleri Murai vd. (tütün) 1990 Sentetik tohum geliştirme ve hızlı dondurma yoluyla germplazm muhafazası çalışmalarının başlaması İlk rekombinant (genetik olarak değiştirilmiş) insan gıdası (Flavr Savr, domates) 2.5 Türkiye de Doku Kültürü Çalışmaları Türkiye de doku kültürü çalışmaları Üniversiteler ve Ziraai Araştırma Enstitü Laboratuvarları nda mikroüretim çalışmaları ile başlamıştır. Ayrıca Ege ve Ankara Üniversiteleri ile Bornova Ziraai Araştırma Enstitüsü öncü kuruluşlardır. Günümüzde çok sayıda Üniversite, Araştırma Enstitüsü, TÜBİTAK ve özel sektör laboratuvarlarında bitki doku kültürü çalışmaları gerçekleştirilmektedir. Ayrıca TÜBİTAK, Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Türkiye Teknoloji Geliştirme Vakfı, Türkiye Tohum Endüstrisi Derneği, üniversite ve diğer araştırma kuruluşlarından katılımcılar Türkiye de bitki biyoteknolojisinin durumunu,

21 9 önceliklerini ve stratejilerini belirlemek ve bu konuda yasal düzenlemeleri yapmak için çaba harcamaktadırlar. Bu konuda en önemli adımlardan biri üniversitelerden gelmiştir. Bir çok üniversitenin çeşitli anabilim dallarında bitki biyoteknolojisi ile ilgili dersler uygulamalı olarak okutulmaya başlanmıştır (Babaoğlu vd., 2002). 2.6 Bitki Doku Kültürü Aşamaları Bitki doku kültürü çalışmaları için sırasıyla aşağıda belirtilen aşamalar gerçekleştirilir (Dixon, 1985; Babaoğlu vd., 2002; Ramawat, 2003): Uygun bir laboratuvar düzeninin kurulması Kullanılacak bitki parçalarının ve besin ortamlarının seçimi, hazırlanması ve sterilizasyonu Kallus veya hücre süspansiyonlarının oluşturulması Kallus veya hücre süspansiyonlarından veya doğrudan somatik veya gametik hücrelerden bitki rejenerasyonunun uyarılması Oluşan sürgünlerin çoğaltılması ve boylarının uzatılması, somatik embriyoların oluşturulması Uzayan sürgünlerin köklendirilmesi Köklenen bitkilerin dış ortama alıştırılması (aklimatizasyon) Uygun Laboratuvar Düzeninin Kurulması Doku kültür çalışmalarında en önemli aşama doku kültürü için uygun laboratuvar düzeninin kurulmasıdır. Kültür çalışmalarında sterilite çok büyük önem taşımaktadır (Gamborg ve Phillips, 1995). Çünkü bitki doku kültüründe kullanılan, çeşitli besin ortamlarını içeren gıda ortamları bakteri ve mantarların gelişmesini desteklemektedir. Böylece mikroorganizmalar hızla gelişerek, daha yavaş büyüyen bitki dokularını tahrip etmekte ve ölümlere neden olmaktadır. Kültüre alınan bitki dokusuna göre daha yavaş gelişen mikroorganizmalar da salgıladıkları toksik maddelerle bitki hücrelerinin gelişmesine olumsuz etki yapmaktadır (Gönülşen, 1987). Genellikle ihtiyaca göre değişmekle beraber bir doku kültürü laboratuvarında başlıca 3 ana bölme olmalıdır (Gönülşen, 1987): Ön Hazırlık Odası Gıda ortamlarının hazırlandığı, bitkinin temizlenip sterilize edilir duruma getirildiği, kullanılan kap ve malzemelerin yıkanıp temizlendiği bölmedir.

22 10 Kültür Hazırlama Odası Kültürün yapılacağı kısım, temiz ve hava akımının olmadığı bir yer olmalıdır. Bu amaçla, steril odalar ve steril kabinler kullanılabilir. İnkübasyon Odası (Kültür Geliştirme Odası) Çoğu bitki kültürleri, sabit sıcaklık ve ışık içeren ortamlarda daha iyi gelişebilmektedir. Sıcaklığı sabit, zaman saati ile ışık ayarı yapılabilen odalar kullanılabilir. Şekil 2.1. Bitki büyütme kabininde kültüre alınmış örnekler Kullanılacak Bitki Parçalarının Seçimi Eksplant (parça) seçimi dikkat edilecek en öncelikli konular arasındadır. Doku kaynağı olarak kullanılacak organ dikkatli seçilmelidir. Toprak üstü parçalar toprak altı parçalardan daha az kontaminasyona uğramıştır (Babaoğlu vd., 2002; Ramawat, 2003). Yine bir bitkide iç dokular dış dokulardan daha az kirlilik unsuru taşırlar. Alınan eksplant ne kadar küçük olursa kontaminasyon riski o kadar fazladır. Eksplant yaşı, rejenerasyon kapasitesi ile ters orantılıdır. Yani genç dokular daha başarılı sonuç verir. Eksplantın bitkiden alındığı dönem de çok önemlidir. Çiçeklenme dönemi ve sonrası bitkilerden alınan eksplantlar doku kültürü için hiç uygun değildir. İn vitro fidelerden elde edilen eksplantlar en uygun kaynak materyalidir. Aynı zamanda eksplantın alındığı bitkiye ait diğer özelliklerde kültüre başlamadan önce dikkat edilecek konular arasındadır ( Werbrouck ve Debergh, 1994).

23 Besi Ortamının Seçimi Hücre, doku ve organlar ancak uygun gıda maddelerini içeren bir ortamda gelişebilirler. Bitki doku kültüründe kullanılan, çeşitli araştırıcılar tarafından hazırlanmış ve onların adları ile anılan birçok gıda ortamları vardır: Murashige ve Skoog (1962), White (1963), Gautheret (1942), Nitsch (1951), Hildebrant vd., (1946), Heler (1953), Reinert ve White (1956), Gamborg vd., (1968), Schenk ve Hildebrandt (1972) bunlardan bazılarıdır (Gönülşen, 1987). Bu gıda ortamlarının içeriği Çizelge 2.2 de ayrıntılı olarak verilmiştir. Kullanılacak gıda ortamlarını, kültüre alınan bitki materyali ve amaca bağlı olarak modifiye etmek mümkündür. Bir doku için en uygun ortam ancak denemeler sonucu saptanabilir. Bir gıda ortamını oluşturan maddeleri aşağıdaki gibi temel olarak sıralamak mümkündür (Dixon, 1985; Babaoğlu vd., 2002): Su Makro elementler (azot, fosfor, sodyum, magnezyum, kükürt, vb.) Mikro elementler (demir, manganez, çinko, bakır, vb.) Vitaminler (thiamin, nikotinik asit, vb.) Şekerler (sakkaroz, glikoz, vb.) Jel yapıcı maddeler (agar, fitajel, jelatin, vb.) Amino asitler (glisin, arginin, vb.) Kimyasal olarak tanımlanamayanlar (hindistan cevizi sütü, vb.) Bitki büyüme düzenleyicileri

24 12 Çizelge 2.2. Bitki doku kültüründe kullanılan besi ortamlarının içeriği Bitki Büyüme Düzenleyicileri Bitki büyüme düzenleyicileri (BBD) doku kültürü ortamlarının en önemli unsurudur. Bitkilerin büyüme ve gelişmesini artıranlar veya durduranları vardır. Tür ve çeşitlere göre değişmekle birlikte uygun olmayan konsantrasyonda ortama ilave edildiklerinde genellikle hiçbir etki ortaya çıkmaz. Bitki hormonları, bir dokuda üretilip, büyüme ve gelişmenin olacağı

25 13 diğer dokulara taşınan ve çok düşük konsantrasyonlarda etkili olan endojen organik bileşiklerdir. İndol asetik asit, zeatin, zeatin ribozid, GA, absisik asit ve etilen bitkilerce üretilen hormonlardandır. Sentetik yollarla üretilenler de dahil olmak üzere genel olarak hepsine bitki büyüme düzenleyicileri adı verilmektedir. En çok kullanılanlar; oksinler, sitokininler, gibberellinler, absisik asit ve etilendir. Etki tiplerine göre bitki büyüme düzenleyicileri Çizelge 2.3 de gruplar halinde verilmiştir (Babaoğlu vd., 2002). Oksinler; hücrelerin büyümesi ve bölünmesinde, köklendirme, yan sürgünlerin gelişiminin engellenmesinde etkilidirler. Oksinler, doku kültürlerinde tek başına kullanıldıklarında kallus uyarımını, hücre süspansiyonlarının elde edilmesini ve somatik embriyo oluşumunun uyarımını, sitokininlerle birlikte kullanıldıklarında yine kallus oluşumunu, sürgün rejenerasyonunu (organogenesis) ve somatik embriyo oluşumunun uyarılmasını sağlayabilirler. Ayrıca elde edilen sürgünlerin köklendirilmesinde vazgeçilmez bir kullanıma sahiptirler. Doğal olarak oluşan temel hormon formu IAA (indol-3-asetik asit) tir. Fakat IAA, sıcaklık ve ışıkta kararsız bir yapı gösterdiği için bitki doku kültürü ortamlarında çok sık kullanılmaz. Bazı besi ortamlarında, IAA dan dolayı oluşabilecek sorunları azaltan ve IAA ya göre daha dengeli bir yapı gösteren İndol-asetil-L-alanin ve İndol-asetil-L-glisin gibi IAA nın amino asit konjugatları kullanılır (Gamborg, 2002). Ayrıca, doku kültürü çalışmalarında IAA nın daha kararlı kimyasal analogları sıklıkla kullanılır. En çok kullanılan diğer oksinler arasında, sentetik 2,4-diklorofenoksi asetik asit (2,4-D) yer alır. Ayrıca sentetik oksinler olarak naftelen asetik asit (NAA), indol bütrik asit (IBA), 2,4,5-T ve Pikloram sayılabilir. Sentetik oksinler ticari uygulamalarda meyve dökümünün engellenmesi ve çeliklerin köklendirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır ( Dixon, 1985; Ramawat, 2003). En çok kullanılan sitokininler adenin (aminopürin) türevleridir. Bunlar içinde de benzil amino pürin (BAP) en çok kullanılanıdır. Sitokininler, çoğunlukla kök ucu meristemi ve genç yapraklarda üretilir. Hücre bölünmesi, yeniden farklılaşma, bitki sürgün üretimi ve sürgün çoğaltımında etkili olup (Smith, 1992) antioksidan etki göstererek yaşlanmayı da geciktirirler. Fakat sürgünlerde köklenmeyi ve embriyogenesisi engellerler. Evans vd., (1981), kinetin ve BAP ın konsantrasyon olarak µm ( mg/l) arasında kullanıldığı zaman türlerin % 75 inin sürgün oluşturduğunu belirtmişlerdir. Özellikle son yıllarda çok sık kullanılan ve güçlü bir sitokinin aktivitesi gösteren TDZ ve CPPU nun doku kültürlerinde kullanımı ile ilgili birçok çalışma mevcuttur (Malik ve Saxena, 1992; Hosokawa vd., 1996; Faure vd., 1998). Fakat sentetik olarak elde edilen sitokinin benzeri bu iki maddenin kullanımı ile elde edilen sürgünlerin köklendirilmesi oldukça zor olmaktadır. Doğal sitokinin

26 14 formları, zeatin ve zeatin riboziddir. Fakat bunlar daha pahalıdırlar (Babaoğlu vd., 2002). Gibberellinler; meristemlerden bitki rejenerasyonunun uyarılmasında, sürgünlerin boylarının uzatılmasında, embriyo ve ovül kültürlerinde kullanılmaktadır. Kallus gelişimini, organogenesisi ve adventif kök oluşumunu engellerler. Ayrıca bitkilerde gövdenin uzamasını ve çiçeklenmeyi artırırlar. Fazla dozda kullanılırsa çok fazla boy uzamasına neden olurlar. Şekil 2.2. BA ve NAA nın sürgün oluşumuna etkisi Çizelge 2.3. Uygulama alanları ve etki şekillerine göre bitki büyüme düzenleyici, engelleyici ve hormon grupları. Oksinler: 4-CPA (p-cpa), 2,4-D, 2,4-DB, 2,4-DEP, 2,4,5-T, IAA, IBA, naftalenasetamid, α-naftalenasetik asit (NAA), 1-naftol, naftoksiasetik asit (NAO), potasyum naftenat, sodium naftenat, dikloroprop, fenoprop, sodium naftenat Sitokininler: 2iP, benzil amino pürin (BAP), kinetin, zeatin, CPPU Gibberellinler: Gibberellin, gibberellik asit Anti-oksinler: Klofibrik asit, TIBA Büyüme uyarıcılar: Brasinolid, himeksazol Büyüme engelleyiciler: Absisik asit, ansimidol, butralin, karbaril, klorofonyum, klorprofam, flumetralin, fluoridamid, fosamin, glifosin, izopirimol, jasmonik asit, maleik hidrazit, mepiquat Büyüme gerileticiler: Kloromequat, daminozid, flurprimidol, paclobutrazol, tetsiklasis, unikonazol Morfaktins: Klorfluren, klorflurenol, dikloroflurenol, flurenol Defolyantlar: Kalsiyum siyanamit, dimethipin, endotal, etefon, metokzuron, pentaklorofenol, thidiazuron (TDZ), tribufos Etilen salgılayıcılar: ACC, AVG, etefon Diğer sınıflandırılamayan bitki büyüme düzenleyicileri: Benzofluor, buminafos, karvon, siyobutit, siklokeksimid, etiklozat, fenridazon, forklorofenuron, karetazan, metasülfokarb, sintofen, tripentenol

27 Adı 15 Çizelge 2.4. Bitki doku kültüründe en çok kullanılan bitki büyüme düzenleyicileri (Babaoğlu vd., 2001) Oksinler 2,4,5- Triklorofenoksi asetik asit 2,4- Diklorofenoksi asetik asit İndol-3-asetik asit İndol-3-butirik asit İndol-3- propiyonik asit Naftalen asetik asit Naftiloksi asetik asit p-klorofenoksi asetik asit Kısa Adı Mol. Ağırlığı Erime durumu Toz halde saklama sıcaklığı ( 0 C) Stok solüsyon saklama sıcaklığı ( 0 C) Etkili Kons. aralığı (mg/l) 2,4,5-T EtOH OS * O 2,4-D EtOH OS O IAA EtOH O/F IBA EtOH O/F IPA NaOH O/F NAA NaOH OS O NOA NaOH OS O 4-CPA EtOH OS O Fenil asetik asit PAA EtOH OS O/F 4-amino-3,5,6- trikloro pikolinik asit Picloram DMSO OS O Sitokininler Adenin sülfat Su OS BAP NaOH OS CPPU DMSO Benzil amino pürin N-(2-Choloro- 4-pyridyl)-N - Fenil üre İzopentil adenin 2IP NaOH Kinetin K NaOH Fenil-3- Thidiazu DMSO, OS (1,2,3- ran KOH 0.05 thiadiazol-5-yl) (TDZ) üre Adenin sülfat HCl OS O 250 Zeatin ZEA NaOH F Otoklav (O)- Filtre (F) ile Sterilizasyon O O F O/F O/F O/F

28 Zeatin ribozid ZR NaOH Gibberellik GA Su asit 5.0 Absisik asit ABA 264 Su * OS Ortam Şartları F F F Sterilizasyon İn vitro (laboratuvarda ve steril şartlarda) doku kültüründe en önemli nokta sterilizasyon işlemleridir. Bakteriler en yaygın kontaminasyon kaynağıdır. En sık rastlananlar, Agrobacterium, Bacillus, Lactobasilluc, Pseudomanas bakterileridir. Sterilizasyon, sterilize edilecek yer ve materyale göre 3 kısımda değerlendirilebilir ( Dixon, 1985; Ramawat, 2003): Çalışma alanının sterilizasyonu Kullanılacak alet, ekipman, kapların ve besin ortamlarının sterilizasyonu (ısı ile bozulabilenler, ısı ile bozulmayanlar) Bitki materyalinin sterilizasyonu Çalışma Alanının Sterilizasyonu Steril çalışma alanında kullanılacak yüzeyler özellikle steril kabin içi, en az dakika önce % 10 luk ticari sodyum hipoklorit solüsyonu (% 5 NaOCl içeren) veya % 70 lik alkolle silinir. Eğer kabin içinde bir UV lambası varsa açılır. Fakat bu sırada kabin içinde hiçbir iş yapılmaz ve canlı bitki materyali bulundurulmaz. Kültüre alma sırasında kullanılacak aletler (bisturi, pens vb.) kullanımdan önce etil alkol içine batırıldıktan sonra alev lambasına tutularak alevle yüzey sterilizasyonuna tabi tutulur. Kültür kapları örneğin cam kavanozlar açıldıktan sonra boğazları ve ağız kısımları aleve tutulmalıdır. Bu işlem kapların ağız kısımlarından kaynaklanabilecek kontaminasyonu engelleyecektir ( Babaoğlu vd., 2002) Besin Ortamlarının, Alet ve Ekipmanların Sterilizasyonu Besin ortamları, alet ve ekipmanlar 3 şekilde sterilize edilebilirler; Otoklav ve buhar (sıcak hava) sterilizasyonu, Filtre sterilizasyonu ve Mikrodalga sterilizasyonu Besin ortamlarının, alet ve ekipmanlarının sterilizasyonu Besin ortamları, alet ve ekipmanlar 3 şekilde steril edilebilirler: 1) Otoklav ve buhar sterilizasyonu 2) Filtre sterilizasyonu 3) Mikrodalga sterilizasyonu

29 Otoklav ve sıcak hava sterilizasyonu Charles Chamberlain ın 1879 yılında buharlı otoklavı kullanıma sokmasıyla birlikte sterilizasyon, birçok alanda karşımıza çıkmıştır (Dağlı, 2003; Sultan, 2006). Besin ortamlarının sterilizasyonu için standart bir işlem olarak otoklavda 15 dakika boyunca 105 kpa basınçta 121 ºC de tutulması gerekmektedir (Hatipoğlu, 1993). Bazı maddeleri içeren kapların sterilizasyonunda sıcaklık kademeli olarak artırılmaktadır. Bu durumda 116 ºC de 30 dakika başarılı sonuçlar verir. 300 ml den daha fazla besin ortamı içeren şişelerin kapakları gevşek tutulmalıdır. Otoklav sonrası kapaklar hemen sıkıştırılmalıdır. Bütün ortamlar otoklav edildikten sonra 1-2 saat dışarıda bekletilmeli ve soğuduktan sonra kullanılıncaya kadar kapalı dolaplarda saklanmalıdır. Sterilize edilecek bütün ekipmanlar otoklav veya sıcak hava fırınlarında srerilize edilebilirler. Aletler ve boş kaplar ise otoklava dayanıklı poşetler içine konulduktan ve ağızları kapatılıp, otoklav bandı ile yapıştırıldıktan sonra sterilize edilebilirler. Özel otoklav bantları sterilizasyon sonrası renk değiştirir. Bu, içerisinde bulunan kapların veya ortamın sterilize edilip edilmediğinin en iyi göstergesidir ve muhtemelen oluşabilecek karışıklıkları önler. Hemen bozulabilen maddeleri içermeyen ortamlar en geç 3-4 ay içerisinde, diğerleri ise duruma göre en kısa zamanda kullanılmalıdır. Sterilitenin hala korunduğundan emin olmanın en pratik yolu, ortam kullanılacağı zaman kapak gevşetilirken basınçlı hava çıkışının hissedilmesiyle olur. Eğer kapaklar gevşek ise kullanılmadan önce ağızları mutlaka aleve tutulmalıdır. Erlenler, pipetler ve diğer kuru mataryaller ağızları alüminyum folyo ile kapatılarak veya uygun metal konteynerler içine konularak bir sıcak hava fırınında 1-4 saat süreyle 200 ºC de tutularak sterilize edilebilirler. Normal plastik malzemeler kesinlikle otoklavda veya fırında steril edilmezler Filtre sterilizasyonu Filtre sterilizasyonu sıvı ortamlar ve ısı ile bozulabilen maddelerin stok solüsyonları için uygulanır. Genel olarak 0,22 μm poroziteli selüloz nitrat filtrelerden mikoplazma ve Pseudomona diminuta (0,1 μm) hariç hiçbir bakteri veya fungal sporların geçemeyeceği kabul edilmektedir. Fakat bu organizmalara diğerlerine göre çok daha az rastlanmaktadır. Filtre senkronizasyonu için çeşitli sistemler kurulabilir. İki litre kapasiteli çelikten yapılmış silindirler, 250 ml lik plastik Sartorius filtreler ve tek kullanımlık selüloz nitrattan yapılmış membran filtreler kullanılabilir. İlk iki sistem basınçlı hava kullanılarak daha önceden sterilize edilmiş ve uygun membran takılmış filtre ile steril transfer kabini içinde besin

30 18 ortamını süzme esasına dayalıdır. Son sistemde filtre, enjektör ucuna takılır ve ortam steril plastik veya cam şişeler içine süzülür. Bazı durumlarda sıvı önce 0,45 μm, daha sonra 0,22 μm filtreden geçirilerek sterilize edilmelidir. Filtre ile sterilize edilen besin ortamlarını herhangibir kontaminasyon riskinden korumak için bu ortamlar en az 4-5 gün dolapta tutulduktan sonra kullanılmalıdır. Filtre ile sterilize edilen ortamları kullanarak katı ortamlar yapılmak isteniyorsa, sıvı ortamlar çift yoğunlukta hazırlanırlar, yine çift yoğunlukta hazırlanmış ve otoklav edilmiş agar ile kabin içinde karıştırılarak normal yoğunluğa getirilebilirler (Dixon, 1985; Ramawat, 2003) Mikrodalga sterilizasyonu Doku kültüründe kullanılacak malzemelerin ve besin ortamlarının sterilizasyonunda yoğun olarak kullanılan otoklav ve filtre sterilizasyonuna alternatif bir diğer yöntem de mikrodalga sterilizasyonudur (Tisserat vd., 1992). Çünkü özellikle filtre sterilizasyonu pahalı ve az miktarda ortam için uygun olmakta, otoklav ile sterilizasyon ise uzun zaman almakta ve sterilize edilecek malzemelere zarar verebilmektedir. Tisserat vd., (1992), 700 W gücünde bir ev mikrodalga fırınını kullanarak %3 sakkaroz içeren 100 ml besin ortamının 5 dakikada, 250 ml ortamın 10 dakikada ve 1 litre ortamın da 15 dakikada başarıyla steril edilebileceğini bildirmişlerdir Bitki materyallerinin yüzey sterilizasyonu Doku kültüründe en uygun eksplant kaynağını, daha önceden steril edilmiş tohumlardan elde edilen aseptik fideler oluşturur. Çünkü bu şekilde elde edilen fidelerin sterilizasyona ihtiyacı olmamaktadır ve böylece yüzey sterilizasyonu işleminin zararlı etkilerinden sakınılmaktadır. Eğer böyle bir şans yok ise, dış şartlardan alınan eksplantlar öncelikle musluk suyu altında en az yarım saat tutulur. Tohum ve yumru gibi daha kaba parçalar 1-20 saniye alkol içinde tutulduktan sonra gerçek yüzey sterilizasyonu ortamına konulur. Yüzey sterilizasyonu doku kültürü işlemleri arasında en önemli aşamalardan biridir. Yüzey sterilizasyonu için en fazla kullanılan maddeler etil alkol, sodyum veya kalsiyum hipoklorit, civa klorür, gümüş nitrat ve hidrojen peroksittir. Ayrıca sterilizasyon amacıyla biyositler de kullanılabilir (Babaoğlu vd., 2001). Bitki parçalarının sterilizasyonu ile ilgili bazı önemli noktalar: Bütün durulama ve kurutma işlemleri steril kabin içinde yapılmalıdır. Ticari solüsyon en az %5 sodyum hipoklorit içermeli ve yüksek saflıkta olmalıdır. Pratik olarak en fazla %20-30 (h/h) oranında ticari solüsyon içeren karışımlar

31 19 kullanılmaktadır. Bütün sterilizasyon solüsyonlarında, özellikle yaprak ve gövde gibi kısımların sterilizasyonunda kullanılacak solüsyonlarda 100 ml solüsyon için yayıcı yapıştırıcı olarak 2 damla Tween-20 kullanılması tavsiye edilir. Çok küçük tohumların sterilizasyonu, sterilizasyon solüsyonu içine konulan bir filtre veya beyaz tülbent içinde yapılabilir Kallus Kültürü Kallus, organize olmamış bitki parankinma hücrelerinin kitlesel yapısıdır. Kallus kültürü ise, yine bitkiden alınan bitki parçalarının uygun besin ortamlarında kallus oluşturmasıdır, yani izole edilmiş hücre yığınlarının steril kültürüdür (Gönülşen, 1987). Bazı dokuları kültüre almak güç olmasına rağmen kök ve gövde iletim dokularının yakınındaki dokular kallus kültür tekniğinde iyi sonuçlar vermektedir. Ayrıca kallus kültüründe, genellikle gövde ve köklerdeki kambiyal dokular kullanılmakla birlikte; meyve, polen, endosperm, olgun ya da olgun olmayan embriyo da başlangıç materyali olarak kullanılmaktadır. Kallus kültürüne bitkilerin bölünebilme özelliğini taşıyan hücrelerden başlanabilir (Ramawat, 2003). Parankimatik dokularının hormon sentezleyememeleri nedeniyle kallus kültüründe besin ortamına belirli hormonların katılması gereklidir. Özellikle oksinlerden IAA, NAA (naftalenasetikasit) ve 2-4 D (triklorofenoksiasetikasit); stokininlerden ise BA ve Kinetin kallus oluşumu için besin ortamına katılmaktadır. Kullanılan eksplanta bağlı olarak kallus oluşumu; kambiyum, korteks, soymuk veya odun parankimasından başlar ve 3-8 hafta içinde, 25 o C sıcaklık ve düşük ışık yoğunluğunda (bazen karanlıkta), küçük parçalara bölünerek alt kültüre alınabilecek büyüklüğe ulaşır (Şekil 2.3). Kallus kültürünün kullanım amaçları; 1) Genetik varyasyon yaratmak suretiyle bunlar arasında amaca uygun olanların seçilmesi. 2) Virüslerler bulaşık olmayan kallus hücrelerini izole ederek virüssüz bitkiler elde edilmesi. 3) Kallus dokularından yararlanılarak aşı uyuşmazlığının belirlenmesi. Kallus kültürün uzun süreli olarak uygulanması, kromozom sayısının katlanması (poliploidi), azalması ve kromozom kırılmalarına yol açmaktadır. Bu genetik varyasyon, ıslah amaçlı çalışmalarda değerlendirilebilmesine karşın, kallus kültürün bitkilerin çoğaltılmasında kullanımını engellemektedir.

32 20 Şekil 2.3. MS besi ortamında kallus oluşumu Şekil 2.4. Kallus hücrelerinin mikroskopta görünümü

33 21 Şekil 2.5. Kallus hücrelerinin mikroskopta görünümü

34 İn-vitro Köklendirme İn-vitro köklendirme genellikle substrat olarak agarlı besi ortam kullanılarak yapılmaktadır (Tilkat, 2003). Sürgün gelişimi ortamlarında sitokininin varlığı köklenmeyi engellemektedir. Tam bir bitki oluşturmak için sürgünler, sürgün oluşturma ortamından farklı bir hormonal komposizyona sahip olan yeni bir ortama aktarılmaktadır. Sürgünler belirli bir uzunluğa eriştikten sonra köklenmeleri amacıyla köklenme ortamına alınır. Türlerin çoğunda köklenmenin desteklenmesi için NAA ya da IBA (0.1-1 mg/l) ya gereksinim duyulur. Bazı bitkilerde ise, sürgünlere standart köklenme tozları ya da toz IBA uygulandıktan sonra toprağa bu bitkiler dikilerek köklendirilebilmektedir (Babaoğlu vd., 2002). Şekil 2.6. IAA ve kinetin hormonlarının indirekt köklenmeye etkisi Köklenen Bitkilerin Dış Ortama Alıştırılması (Aklimatizasyon) Doku kültürlerinden elde edilen bitkicikler, normal şartlara transfer edildiğinde kök ve sürgün sistemlerinin her ikisinin adaptasyonu söz konusu olmaktadır. Transfer için optimum devre, köklerin gelişmeye başladığı ve yaprakların kendilerinin fotosentez yapabildikleri devredir (Gönülşen, 1987). Ex- vitro ortama aktarıldıktan sonra bitkilerin zarar görmesinden veya fazla oranda bitki kayıplarından dolayı mikroçoğaltım gibi bir çok doku kültürü tekniği geniş oranda kısıtlı olmaktadır (Hayashi ve Kozai, 1988; Kozai, 1991; Ziv, 1992; Zobayed vd., 1999; ve Soon vd., 2000). Bunların başlıca sebepleri; yapraklarda mum tabakası oluşumu, zayıf kütikula gelişimi, düşük stoma fonksiyonu, zayıf ikincil kök oluşumu ve bunların sonucunda da aşırı su kaybı ve düşük fotosentez kapasitesidir (Zobayed vd., 1999)..

35 Bitkinin Sistematikteki Yeri Çalışmada materyal olarak kullanılan Brassica nigra nın sistematikteki yeri aşağıda belirtildiği gibidir (2) (5): Alem : Plantae Bitkiler Altalem : Tracheobionta Vasküler bitkiler Üstbölüm : Spermatophyta Tohumlu Bitkiler Bölüm : Magnoliophyta Angiospermliler, çiçekli bitkiler Sınıf : Magnoliopsida Çiftçenekliler Altsınıf : Dilleniidae - Takım : Brassicales (Capparales) - Familya : Cruciferae (Brassicaceae) Hardalgiller Cins : Brassica (L.) Hardal Tür : Brassica nigra Kara Hardal 2.8 Bitkinin Yayılımı Birçok ülkede ekonomik önemi olan ve ticareti yapılan Brassica nigra nın, dünya üzerindeki yayılımı Avrupa, Kuzey Afrika, Güney Batı Asya dır. Yurdumuzda ise, genellikle Marmara Bölgesi, Akdeniz Bölgesi, Doğu Anadolu Bölgesi ve Ege Bölgesi nde yayılım gösterir (Davis, 1965). 2.9 Biyolojisi Vejatatif Özellikleri Genel olarak siyah hardal olarak bilinen Brassica nigra, boyu 0.6 m den 1.5 m ye kadar uzayabilen, bazı bölgelerde ise 2 m yi bulan tek yıllık otsu bitkidir (Yatskievych, 2000). Sarı çiçeklidir. Hayat formunu, şiddetli bir kuraklık veya soğuğun egemen olduğu devrede tohum olarak geçirir (terofit). Kazık kök yapısına sahip olan bitkinin gövde tipi ise dik gövdedir, nadiren tüysüzdür. Şekil 2.7. Brassica nigra bitkisinin genel görünüşü (Fotoğraf de çekilmiştir.)

36 Yaprak Özelliği Yaprak dizilişi alternat tipte olup, yaprak şekli olarak genellikle üsttekiler ovat, alttakiler ise lirattır. Yaprakları saplıdır. Üst yapraklar basit tip yaprak tipi alt yapraklar ise bileşik tip yaprak özelliği gösterir. Bitkinin yaprak kenarları alt ve üst yapraklarda farklıdır, genellikle üsttekiler dentat alttakiler ise lopludur. Yaprak ucu akut özellikte olup yaprak kaidesi üst yapraklarda aurikulat alt yapraklarda ise atenuat tiptir. Yaprakların bitkiye bağlanması petiolattır Generatif Özellikleri Çiçek Özelliği Brassica nigra bitkisinde, erkek ve dişi organlar aynı çiçek üzerinde görüldüğü için çiçek eşem durumu hermafrodit özellik gösterir. Petaller 4 tane olup sarı renkte ve tüysüzdür. Erkek üreme organı olan stamenler 6 adet olup diktir. 4 uzun ve 2 kısa stamenin meydana getirdiği erkek üreme organı, bu özelliği ile tetradinamus özellik gösterir. Flamentler yeşilimsi-sarı, 4 mm uzunluğunda ve tüysüzdür. Anterler sarı renkte ve 1.5 mm uzunluğunda olup, anter tipi ve bağlantısı versatildir. Yumurtalık yeşil renkte, yaklaşık 3 mm uzunluğunda ve tüysüzdür (Şekil 2.8). Ovaryum durumu üst durumludur. Şekil 2.8. Brassica nigra nın yumurtalığının mikroskopta görünümü

37 25 Çiçek sapı 1.3 mm uzunluğunda ve meyveyle birleşiktir. Sepaller 4 tane olup yeşilimsi-sarıdır ve 4 mm uzunluğundadır (3). Çiçeklenme zamanı nisan ve kasım aylarıdır. Diğer çiçek özellikleri aşağıda sıralandığı gibidir: Periant tipi : Diklamideik (kaliks ve koralla birlikte) Çiçek simetrisi Kaliks tipi Korolla şekli Karpel durumu Stilus tipi Stigma tipi Plasentasyon Meyva tipi Tozlaşma : Bilateral : Korisepal : Koripetal : Sinkarp : Teret : Kapitat : Paryetal : Silikuva (Meyva gagalı) : Arı ve böcekler tarafından sağlanır. Şekil 2.9. Brassica nigra nın çiçeklenmesi (Fotoğraf tarihinde çekilmiştir).

38 26 Şekil Brassica nigra bitkisine ait stamen ve petallerin görünüşü Şekil Çiçeklenme, meyve ve tohum oluşumu Meyve Özelliği Tohum gömleği dar ve diktir. Meyve tipi silikuva olup gagalıdır. Tohumlar 1-2 mm uzunluğunda olup kırmızımsı siyah renktedir. Meyveleri 1-3 cm uzunlukta 2-3 mm genişlikte, sap üzerine yatık, tüysüz, hemen hemen dört köşeli, kısa sivri uçludur. Yassı ve köşeli olan meyvelerinde tohumların bulunduğu yerler şişkindir. Kullanılan kısımları tohumları ve tohumlarından elde edilen yağıdır. Bitkinin yaprakları dökülmeye başladığında meyve salkımları toplanır. Bunlar 15 gün kadar gölgede kurutulduktan sonra tohumları alınır.

39 27 Şekil Brassica nigra ya ait tohumlar (4) Ekonomik Özelliği Özellikle tohumları yağlı tohum olarak adlandırılır ve birçok yerde (Orta Avrupa, Anadolu ve İran da) kültürü yapılan önemli bir ekonomik bitkidir. Hardal tohumlarında müsilaj, yağ, sinapin, sinigrin isimli glikozit ve mirozinaz fermenti vardır. Çok eskiden beri tıpta kullanılmaktadır. Hafif antiseptiktir Brassica Biyoteknolojisi Brassica cinsi, Brassicaceae (syn. Cruciferae) familyası içinde ekonomik olarak, çok önemli özelliğe sahip bir cinstir. Bu cinse ait birçok tür ve ekotip sebze, besin, tohum yağı olarak ve sos- baharat şeklinde kullanılması özellikleriyle değerli bir üründür. Ayrıca birçok türü lifli yapısı nedeniyle diyet amaçlı kullanılmaktadır (Cardoza, 2004). Brassica sebzesi vitamin, mineral ve lif kaynağıdır. Bu cinsin yapısında kansere karşı koruyucu olduğu ispatlanan fitokimyasallar bulunmaktadır (Steinmetz ve Potter, 1996). Brassica da yağ tohumları büyük bir ekonomik öneme sahiptir. Yağ tohumlarının bulunduğu türler arasında Brassica juncea, Brassica carinata, Brassica rapa (syn. Brassica campestris) ve Brassica napus gibi türler bulunmaktadır ve genellikle bu özelliklerinden dolayı kolza adını alırlar. Brassica tohumları düşük alifatik bileşiklere sahip oldukları zaman kanola olarak adlandırılır. Kanola genellikle Brassica napus türü için kullanılır ve bu tür dünya genelinde çok yaygın bir yağ tohumu ürünüdür (Cardoza, 2004). Ayrıca son zamanlarda Brassica rapa ve Brassica juncea ya ait variyeteler de kanola niteliğinde kullanılmaya başlanmıştır. Özellikle Brassica nigra yağlara

40 28 ilave edilen bir baharattır. Sebze olarak tüketilen dünya genelinde ki Brassica türleri arasında ise Brassica oleracea, Brassica rapa ve Brassica napus yer almaktarır. Bu grup brokoli, şalgam ve lahana gibi sebzeleri içerir. Çizelge 2.5. Ekonomik özelliğe sahip bazı Brassica türleri Brassica juncea Kahverengi Hardal Sebze, sos Brassica nigra Siyah Hardal Yağ, sos, baharat Brassica rapa Yem şalgamı Yem, yağ, baharat Brassica napus Kanola, Kolza Sebze, baharat, yağ Brassica oleracea Lahana Sebze, yağ Brassica carinata Yağ şalgamı Yağ, baharat Brassica ürünleri olan yağ tohumları ve sebzelerde birçok çalışmalar yapılırken, çeşitli türlerin Brassica biyotipleri hızlı bir değişim devri geçirdi. Özellikle kısa zamanda yetiştirilerek tohum elde edilen kısa yaşam döngülü bitkilerle ilgili yapılan çalışmalarda, Brassica cinsine ait birçok yabani türde çok iyi sonuçlar elde edildi. Kısa yaşam döngülü bitkiler, genetik seleksiyonla oluşturulan ve gün gibi yaşama sürelerine sahip olan türlerdir. Ayrıca diğer türlere göre daha küçük boyutta olurlar (Williams ve Hill, 1986). Hızlı yaşam döngüsüne sahip Brassicalar, 3-4 kat daha uzun genom büyüklüğüne sahip Arabidopsis thaliana ya göre daha kısa genoma sahip olması nedeniyle model bir laboratuvar bitkileridir (Arumuganathan ve Earle, 1991). Doğal ıslah yöntemleriyle elde edilen hızlı yaşam döngüsüne sahip bu bitkilerin Brassica genusundaki en önemli temsilcisi Brassica rapa dır. Yabani Brassica rapa dünya genelinde en önemli 2 yabani türden biridir (diğer yabani tür pirinçtir) (Holm vd., 1997; Halfhill vd., 2003; Stewart vd., 2003; Basu vd., 2004). Bu model bitkilere aynı familyadan diğer bir örnekte Brassica oleracea dır. Brassicaeae ya ait biyoteknolojik çalışmaları doku kültürü, transformasyon ve moleküler çalışmalar olarak 3 ana bölümde toplayabiliriz. Bu ana bölümleri incelediğimizde, yapılan çalışmaları şu şekilde sıralayabiliriz; organogenesis, somatik embriyonagenesis, mikrospor kültürü, somaklonal variyasyonlar, somatik hücre füzyonu, in-vitro şartlarda bitki yetiştirilmesi için genetik verimliliği arttırmak üzere yapılan moleküler işaretleyiciler ve transformasyon çalışmaları.

41 29 Şekil Brassica juncea nın genel görünümü Brassica Transformasyon Çalışmaları Brassica cinsinde transformasyon ile ilgili ilk çalışmaları Poulsen (1996), Earle vd., (1996), Earle ve Knauf (1999) yaptı. Çoğunlukla çalışmalar ekonomik öneme sahip türlerde B. juncea (Barfield ve Pua, 1991), B. napus (Moloney vd., 1989), B. rapa (Radke vd., 1992), B. oleracea (De Block vd., 1989), B. nigra (Gupta vd., 1993), ve B. carinata (Narasimhulu vd., 1992) yapıldı. Brassica transformasyonunu ve transformasyon verimliliğini etkileyen faktörlerin etkilerini bulmak için Poulsen (1996) tarafından çeşitli metodlar kullanıldı. Agrobacterium tumefaciens aracılığı ile transformasyon metodu, gerek verimli sonuçların alınması gerekse bu cinse ait birçok türde pratik olarak uygulanabilmesi nedeniyle en çok tercih edilen metoddur. Ancak hala genetik kayıpları ortadan kaldırmak için daha verimli transformasyon metodlarının geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Son zamanlarda brokoli (Henzi vd., 2000) ve kanola (Cardoza ve Stewart, 2003) gibi çok önemli Brassica ürünlerinde verimli transformasyon metodlarının geliştirildiği rapor edildi. Brassica türlerinde birçok konuda transformasyon çalışmaları yapılmaktadır, bunların içerisinde en önemlisi herbisit direnci (HR) çalışmalarıdır ve HR kanola ile ilgili dünya genelinde 40 dan fazla transgenik ürün geliştirildi (Vinitha ve Neal, 2004). Örneğin, Kanada da, 2003 yılında, 3.15 milyon hektar alanda transgenik kanola yetiştirildi. İmidazol, glufosinat ve glifosat gibi herbisitlere dirençli kanola, ABD ve Kanada da ticari olarak uygundur. Herbisit direncine diğer örnekler, glufosinat direncini içeren brokoli (Waterer vd., 2000) ve Brassica rapa (Qing vd., 2000) ile

42 30 Brassica napus da ki sülfonilüre direnci (Blackshaw vd., 1994) ve bromoksinil (Zhong vd., 1997) direncidir. Yağ kalitesini arttırmak Brassica transformasyonu için diğer bir hedeftir. Brassica yağı tüm dünyada kullanılan bir üründür ve tohumlarındaki yağ asidi profilini geliştirmek için transformasyon teknolojisini kullanmak son derece uygundur (Cardoza, 2004) Organogenesis Organogenesis bitki rejenerasyonunda doku kültürü teknikleri ve bitki transformasyonu için son derece gerekli hatta zorunlu bir tekniktir (Cardoza, 2004). Brassica türleri doku kültür tekniklerinin geliştirilmesinde son derece önemli bir yere sahiptir. Birçok Brassica türü için rejenerasyon teknikleri geliştirildi. Organogenesis, diğer rejenerasyon teknikleri ile karşılaştırıldığında Brassica ürünlerinde daha geniş çapta kullanılan bir rejenerasyon yoludur. Brassica cinsi bitkilerde organogenesis yoluyla rejenerasyon, kotiledon, (Sharma vd., 1990; Hachey vd., 1991; Ono vd., 1994), hipokotil (Yang vd., 1991), pedünkül (çiçek sapı) segmentleri (Eapen ve George, 1997), yapraklar (Radke vd., 1988), epidermal ve subepidermal hücrelerinin ince hücre katmanları (Klimaszewska ve Keller, 1985), kökler (Xu vd., 1982) ve protoplast (Glimelius, 1984; Spangenberg vd., 1986; Kik ve Zaal, 1993; Hu vd., 1999) gibi çeşitli dokularda günümüze kadar başarılı bir şekilde uygulandı. Ancak, hipokotil segmentleri doku kültüründe daha çok tercih edilen eksplanttır ve Brassica türlerinde rejenerasyon yeteneği nedeniyle çok fazla kullanılmaktadır (Cardosa, 2004). Organogenesisi etkileyen faktörler aşağıda sırasıyla açıklandığı gibidir Genotip Brassica cinsinde rejenerasyon, yüksek oranda genotipe bağlıdır ve bu cinse ait birçok türde rejenerasyon çalışmaları mevcuttur. Örneğin, Brassica napus da kültüre alınan 100 örnekte %0 ile %91 arasında çok büyük oranda çeşitlilik gözlendi (Ono vd., 1994). Brassica junce nın Hindistan kültürlerinde, Avustralya kültürlerine göre daha iyi oranda rejenerasyon gözlendi (Pental vd., 1990). Çin lahanasının (B. rapa. ssp. pekinensis) 123 genotipinde yapılan çalışmalarda, %95 ile %0 arasında değişen geniş değer aralıklarında rejenerasyon frekansı gözlendi (Zhang vd., 1998). Bu nedenle Brassica doku kültürü ve rejenerasyonunda genotip spesifikliği sınırlayıcı bir faktördür.

43 Eksplantların Yaşı Birçok Brassica türünde rejenerasyon, alınan eksplantın yaşına bağlıdır. Yapılan çalışmalarda genç eksplantların yaşlı eksplantlardan daha iyi sonuçlar verdiği gösterildi. Birçok araştırmacı, 3-4 günlük çimlenmiş bitkilerin optimal rejenerasyon oranı gösterdiğini ispatladı. Örneğin, 3 günlük B. rapa ssp. oleifera 4 günlük kültüre alınanlardan daha fazla oranda rejenerasyon göstermektedir (Burnett vd., 1994). Brassica napus da, 4 günlük çimlenen bitkilerden alınan eksplantlar, optimal %90 oranında rejenerasyon ürünü sağlamaktadır (Ono vd., 1994). Kısa yaşam döngüsüne sahip Brassica rapa dan çimlendikten sonra 3 günlük alınan eksplantlarda en iyi rejenerasyon oranı sağlandı (Teo vd., 1997). Yukarıda verilen örnekler incelendiğinde, bitkilerin rejenerasyon kapasiteleri çimlendikten sonra 4 günün üzerinde azalmaktadır sonucuna varılabilir. Brassica juncea (Sharma vd., 1990) ve Brassica rapa da (Hachey vd., 1991) bitki, çimlenme gerçekleştikten sonra 3-5 günlükken optimal sürgün rejenerasyonu vermektedir. Başka bir denemede 2 haftalık lahanalardan alınan eksplantlarda çok iyi rejenerasyon sonuçları elde edildi (Jin vd., 2000) Etilen İnhibitörü Bir etilen inhibitörü olan gümüş nitrat Brassica rejenerasyonu için gerekli ve son derece önemli bir adjuvanttır (Pental vd., 1990; Sethi vd., 1990; Williams vd., 1990; Palmer, 1992; Pua ve Chi, 1993). Bu nedenle gümüş nitrat, Brassica doku kültüründe rutin olarak kullanılmaktadır. Brassica türlerinde positif etkisi ispatlanmış diğer etilen inhibitörleri gümüş tiosülfat (Eapen ve George, 1996; 1997) ve aminoetoksvinglisin dir (Chi vd., 1990; Burnett vd., 1994) Diğer Besi Ortamı Bileşenleri Brassica da besi ortamına ilave edilen katkı maddeleri rejenerasyon etkisini arttırabilir. Methylglyoxal-bis- (guanylhydrazone) (MGBG), bir spermidin biyosentezinden elde edilen inhibitör olup Brassica da ve diğer genuslarda rejenerasyon frekansını %7 den %63 e yükselttiği ispatlandı (Sethi vd., 1990) ayrıca, diğer araştırmacılar tarafından Brassica napus da MGBG nin sürgün oluşumu üzerine positif bir etkiye sahip olduğu (O Neill vd., 1996) bulundu. Tersine, bir poliamin olan biyokiminin, (bitkisel veya hayvansal proteinden elde edilen azotlu bileşik), gümüş nitrat ve aminoethoxyvinylglycine ile birlikte kullanıldığında Çin turpunda sürgün oluşumunu arttırdığı ispatlandı (Pua vd., 1996). Ancak, biyokim tek başına kullanıldığında etkili olmamaktadır sadece etilen inhibitörleriyle birlikte çalışmaktadır. Brassinolideler, bileşiklerin oldukça yeni bir sınıfı olup, karnabar bitkisinde hipokotil segmentlerinden sürgün oluşumunu beklenmedik bir şekilde uyardıkları ispatlandı (Sasaki, 2002).

44 Somatik Embriyonogenesis Doku kültürü ile bitkilerin rejenerasyonunu arttırmak için birçok yol izlenmektedir bu nedenle genuslarda çeşitli araştırmalar yapılmıştır. Brassica larda organogenesis yolu ile rejenerasyonu sağlamakta sorun yaşandığı durumlarda somatik embriyonogenesis devreye girer. Somatik embriyonogenesis, ayrıca bazı türlerdeki köklerde mikroüretimde (mikropropogasyon) yaşanan zorlukları ortadan kaldırmak amacıyla tercih edilen bir rejenerasyon yöntemidir. Mikrosporlar ve anterler birçok Brassica türünde, somatik embriyonogenesis yönteminde tercih edilen eksplantlardır (Lichter, 1989; Sato vd., 1989; Aslam vd., 1990; Baillie vd., 1992). Ayrıca rejenerasyon için diğer eksplantlarında kullanıldığı birçok çalışma mevcuttur. Brassica napus daki, hipokotilden elde edilen somatik embriyolar (Kohlenbach vd., 1982), protoplasttan elde edilen koloniler (Kranz, 1988) ve olgunlaşmamış kotiledonların (Turgut vd., 1998) kullanıldığı somatik embriyonogenesis çalışmaları örnek olarak verilebilir. Çin lahanasında, somatik embriyonogenesis kotiledon eksplantından elde edilmiştir (Choi vd., 1996). Deane vd., (1997) ve Leroy vd., (2000) tarafından karnabaharda hipokotil eksplantları kullanılarak somatik embriyolar oluşturulmuştur. Hızlı yaşam döngüsüne sahip Brassica napus da, hipokotil eksplantı ve düşük ph da (3.5-5) MS basal besi ortamı (Murashige ve Skoog, 1962) kullanılarak somatik embriyonogenesisin yapıldığı rapor edilmiştir (Koh ve Loh, 2000). Organogenesis için genotip Brassica türlerinin embriyogenik frekansının arttırılmasında çok önemli bir faktördür. Somatik embriyonogenesisde ise genotipin etkili olduğu B. rapa (Baillie vd., 1992), B. carinata (Barro ve Martin, 1999) ve B. napus la (Chuong vd., 1988) yapılan çalışmalarda gösterilmiştir (Cardosa, 2004) Brassica da Moleküler İşaretleyiciler (Markır) ve Islah Günümüzde neredeyse bütün modern bitki ıslah çalışmalarında moleküler işaretleyiciler (markır) kullanılmaktadır. Brassica türlerinde genetik varyasyonu tanımlamak, genotipleri belirlemek ve mikropropogasyon ile üretilen veya klonlanarak üretimi sağlanan bitkilerde birçok amaçla farklı moleküler markırlar kullanılmaktadır. Brassica ürünlerinde ise genetik uygunluğu geliştirmek için moleküler markırlar kullanılmaktadır. Brassica da kullanılan bazı moleküler markırlar ve işlevleri çizelge 2.6. da gösterildiği gibidir.

45 33 Çizelge 2.6. Brassica da kullanılan bazı markırlar ve işlevleri 2.11 Türkiye de Brassicaceae Familyası na Ait Çalışmalar Tuzluluk tarım yapılan alanlarda verimliliği olumsuz yönde etkileyen önemli etmenlerden birisidir. Ülkemizde toplam olarak mil. ha lık bir alanda tuzluluk problemi görülmektedir (Munsuz vd., 2001). Tuzluluk problemi kurak ve yarı kurak bölgelerde, yağışın yetersiz olduğu bölgelerde doğal olarak bulunmaktadır. Sulamaya açılan alanlarda ise aşırı sulama ile taban suyundaki tuzların üst katmanlara çıkışı ile oluşmaktadır. Bitkilerin tuz yoğunluklarına karşı tepkileri farklıdır. Bazı bitkilerin tuza toleransı daha fazla olabilir. Ayrıca bitkilerin tuza karşı gösterdikleri tepki gelişme durumlarına göre farklılık gösterdiği gibi, bitki familyalarının ve hatta tür içindeki çeşitlerin de tuzluluğa farklı reaksiyon gösterdiği bilinmektedir. Tuzlu koşullarda çimlenme ve fide gelişimi dönemi, bitkinin toplam yaşam döngüsü içerisinde en kritik dönemdir (Katerji vd., 1994; Wang ve Shannon, 1999; Almansouri vd., 2001). Topraktaki tuzlar, suyun osmotik basıncını yükselterek tohumlar tarafından alınmasını engellemekte veya Na + ve Cl - iyonlarının toksik etkisinden dolayı çimlenmeyi olumsuz etkilemektedir (Öz ve Karasu, 2002; Essa, 2002; Sadeghian ve Yavari, 2004). Türkiye'nin yıllık ham yağ ithalatı ile yağlı tohum ithalatı her geçen yıl artmaktadır yılı verilerine göre ton bitkisel ham ve rafine yağ ve ton yağlı tohum ithalatı yapılmıştır (Anonim, 2004). Yağlı tohum, ham ve rafine yağ ile yağlı tohum küspesi olarak yaklaşık 1 milyar dolarlık döviz karşılığında ithalat yapılmıştır yılında yağlı tohum işleyen fabrikaların birçoğunun kapanması sebebiyle ham yağ ithalatında önemli bir artış

46 34 olmuştur. Özellikle yağ bitkileri üretiminin yetersiz olmasından dolayı bitkisel yağ üretimimiz yetersiz kalmakta ve her yıl giderek artan yağ ihtiyacımız ithalatla karşılanmaktadır (Kolsarıcı vd., 2005). Bilindiği gibi kolza, lahana (B. oleracea L.) ile yağ şalgamının (B. campestris L.) doğada kendiliğinden melezlenmesi sonucunda oluşmuş amfidiploid bir türdür (Andersson ve Olsson, 1961; Donwey ve Röbbelen, 1989). Tohumlarında % oranındaki yağı ile daha çok sıvı halde ve katı olarak da margarin sanayisinde değerlendirilen kolza, ülkemizin değişik bölgelerinde ekim nöbetine girebilecek en önemli alternatif bir yağ bitkisidir. Yağındaki erusik asidin tamamen elemine edilmesinden sonra Kanola ticari ismiyle dünyada yağ bitkileri arasında soyadan sonra üretim bakımından 2. sırayı alan kolza bitkisi, yağındaki oleik asidin yüksek olması, omega-3 ve omega-6 yağ asitleri grubuyla en sağlıklı yağlar içerisinde yer almaktadır. Kolza ile aynı takım ve familyadan olan ve birçok tarımsal özellik bakımından da büyük benzerlik gösteren yağ şalgamı, kurağa ve soğuğa karşı kolzaya göre daha dayanıklı olup, 2-3 hafta daha erkencidir. Tohumlarındaki ham yağ oranı ıslah çalışmalarıyla %45 lere çıkartılarak kolzaya ulaştırılmıştır (Kolsarıcı vd., 1995). Kaya vd., (2005), tarafından Bazı Brassica Türlerinin Çimlenme ve Çıkışı Üzerine NaCl Konsantrasyonlarının Etkileri konulu ülkemizde bir çalışma yapılarak, kolza ve kolzanın genitörlerinden olan lahana ve yağ şalgamının çimlenmesi ve çıkışı üzerine NaCl konsantrasyonlarının etkilerini belirleyerek, bu türler ve çeşitler arasında tuza dayanıklılık bakımından farklılıkların ortaya konulması sağlanmıştır. Kolza çeşitlerinden Bristol, yağ şalgamı çeşitlerinden Agat ve lahana çeşitlerinden Mohrenkopf un tuza daha toleranslı olduğu belirlenmiştir. Bu çalışma ile, incelenen türler ve çeşitler tuz stresine farklı tepkiler göstermesine rağmen, çimlenme yüzdesi tuz seviyelerinden etkilenmeyen ve tüm tuz seviyelerinde daha hızlı çimlenme ve çıkış gösteren yağ şalgamının kolza ve lahanaya göre tuza daha toleranslı olduğu bulunmuştur (Kaya vd., 2005). Türkiye de genellikle dünyada çok fazla üretimi yapılan ve ekonomik değere sahip kolza bitkisi üzerine çalışmalar yapılmaktadır. Ülkemizde tarımı ve yararlanılması bakımından yakın bir geçmişi olan kolza, dünyanın en eski yağ bitkilerinin başında gelir (Algan ve Emiroğlu, 1985). Dünya bitkisel yağ üretiminde kullanılan yağ bitkilerinin en önemlileri soya, pamuk, yerfıstığı, ayçiçeği, kolza, susam, mısır ve yağ palmiyesidir. Ülkemizde tüketilen yağların %46.7 si ayçiçeğinden, %32.8 i pamuk tohumundan, %20 si zeytin ve diğer bitkilerden elde edilmektedir (Arıoğlu, 1999) yılı verilerine göre ülkemizde kolzanın ekim alanı 650 ha, üretimi ton, verimi kg/da olarak belirlenmiştir

47 35 (Anonymous, 2003). Kolza, kışlık ve yazlık olarak yetiştirilebilmesi, vejetasyon süresinin diğer yağ bitkilerine oranla daha kısa olması, birim alandan yüksek verim sağlanması, tohumlarında yağ oranının yüksek oluşu yanında sağlığa zararlı oranda erusik asit ve glukosinolat içermeyen çeşitlerin ıslah edilmesi ve ekiminden hasada kadar bütün yetiştirme tekniğinin mekanizasyona uygun olması gibi özelikleri nedeniyle oldukça avantajlı bir bitkidir. Hasat zamanının diğer yağ bitkilerinden 1-2 ay kadar erken olması nedeniyle, yağ fabrikalarına hammadde sağlayarak çalışma kapasitesini yükseltmekte ve uygun bölgelerde ikinci ürün tarımına olanak sağlamaktadır (Başalma ve Uranbey, 1998). Ayrıca ilkbaharda ilk çiçek açan bitkilerden biri olduğu için arıcılıkta da büyük önem taşımaktadır (Atakişi, 1977). Kolza tohumu ortalama % yağ, % 25 protein ve % 20 polisakkaritler ihtiva etmekte olup, olgunlaşması için soya ve ayçiçeğine göre daha az ısıya ihtiyacı duymaktadır (Özgüven, 1992). Kolza tarımının diğer bir avantajı ise bu bitkinin buğday ve baklagillere göre daha erken hasat olgunluğuna gelmesi ve ikinci ürün tarımında toprak işleme için yeterli zaman kalmasıdır (Karasalan, 1999). Ülkemiz birçok yağ bitkisinin üretimine uygun ekolojilere sahip olmasına rağmen, bitkisel yağ açığımız her geçen gün artmaya devam etmektedir. Yağ açığımızın giderilmesi amacıyla, farklı ekolojilerde yetiştirilebilecek yağ bitkilerinin saptanması ve uygun üretim tekniklerinin belirlenmesine yönelik araştırmalar ile üretimi teşvik edici programların başlatılması, uzun vadede ülke ekonomisine önemli katkılar sağlayacaktır. Tarımsal üretim açısından oldukça zengin potansiyele sahip olan Van ilinde, fazla alternatif bitkinin bulunmadığı, ilde sadece arpa, buğday, şeker pancarı, patates, yonca ve korunga üretiminin yapıldığı gözlenmektedir. Halbuki bitkisel yağ açığımızın kapatılmasında önemli rol oynayabilecek kolza bitkisinin de ekim nöbeti sistemine dahil edilmesi gerekir. Ülkemizde kolza ile ilgili birçok çalışma yapılmıştır. Değişik bölgelerde yürütülen çalışmalarda, kolza çeşitlerinde incelenen özeliklerden elde edilen değerler farklı olmuştur. Yapılan çeşitli adaptasyon çalışmalarında; Çiçek, (1990), bitki boyunu cm, dal sayısını adet, harnup sayısını adet arasında, Özgüven vd., (1992), Harran ovası koşullarında dal sayısını adet/bitki, harnup sayısını adet/bitki, 1000 tane ağırlığını g, tohum verimini kg/da arasında, Kırıcı ve Özgüven, (1995) çalışmasında kapsül sayısını adet/bitki, tohum verimini kg/da arasında, Özer ve Oral (1997), Erzurum koşullarında 16 kolza çeşidi ile yaptıkları araştırmada; bitki boyunu cm, dal sayısını adet/bitki, harnup sayısını adet/bitki, harnupta tane sayısını adet/harnup, 1000 tane ağırlığını g, protein oranını % , yağ oranını

48 36 % ve tohum verimini kg/da değerleri arasında, Başalma, (2004), Ankara koşullarında 25 kışlık kolza çeşidini kullanarak yürüttüğü çalışmasında; bitki boyunu cm, yan dal sayısını adet, kapsüldeki tohum sayısını adet, tohum verimini kg/da ve yağ oranını %40.2-%47.7 değerleri arasında bulduklarını bildirmişlerdir. Bunun yanında yapılan diğer çalışmalarda (Başalma ve Uranbey, 1998; Karaaslan ve Özgüven, 1998; Sağlam vd., 1999; Özgüven ve Kırıcı, 1999; Öztürk ve Akınerdem, 1999; Koç, 2000; Öz, 2002) da verim ve bitkisel karakterlerin çeşit, yıl, ekolojik koşullar ve yetiştirme tekniğine göre değiştiği bildirilmektedir (Tunçtürk vd., 2005). Ayrıca ülkemizde, Brassica türleriyle ilgili rejenerasyon çalışmaları da yapılmaktadır (Çolak vd., 1999). Bunlara ek olarak daha çok Brassica juncea (Uysal vd., 2007), Brassica napus (Çiçek, 1990) ve Alyssum L. (Babaoğlu, 2004) türleriyle çalışmalar yapılmasına rağmen Brassica nigra ile ilgili herhangi bir çalışma yapılmamıştır.

49 37 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 3.1 Deneysel Çalışmalarda Kullanılan Cihazlar ve Kimyasal Maddeler Deneysel Çalışmalarda Kullanılan Cihazlar Isıtıcılı Magnetik Karıştırıcı (IKA laboratecknik) Etüv ph Metre (İnolab WTW Level 1) Hassas Terazi (Cyho JL-180) Kaba Terazi (Sartorius BL 15005) Bidistile Su Cihazı (USFelga Purelab Plus) Laminar-Hava Akışlı Kabin (Herause- HSP123 / ) Sıvı Azot Tankı Otoklav Bitki Büyütme Kabini Mikropipet (20µM,200µM,1000µM) (Gilson/ M10031B) Bitki Büyütme Odası Buzdolabı (+4ºC) (Arçelik, 4022T/102070) Vakum Filtrasyon Sistemi (Millipore) İnkübatör (GFL / 3032)

50 Kullanılan Kimyasal Maddeler Çizelge 3.1. Deneyde kullanılan sarf maddeler MADDE ADI ÜRETİCİ FİRMA KATALOG NO Murashige ve Skoog Bazal Tuz Karışımı Sigma M 5524 Indol-3-Butirik Asit (IBA; 4-[3-Indol]butirik asit) [C 12 H 13 NO 2 ] Sigma I-5386 α-naftalen Asetik Asit (NAA) Sigma N-1145 Sükroz [C 12 H 22 O 11 ] Merck K benzylamino-purin (BAP) Sigma B Gümüş Nitrat (AgNO 3 ) Sigma S-1179 Fitajel Sigma P-8169 Tween 20 Sigma P-7949 GA 3 (C 19 H 22 O 6 ), Giberalin (Giberalik asit) Fluka Glisin (C 2 H 5 NO 2 ) Merck 4201 Miyoinositol Sigma I 5125 Tiyamin HCl (Vitamin B 1 ) [C 12 H 17 CIN 4 OS.HCl] Sigma T 4625 Nikotinik asit (Niaci; Pyridine-3-carboxylic acid) [C 6 H 5 NO 2 ] Sigma N-4126 Sodyum Hidroksit (NaOH) Sigma S-8045 Hidroklorik asit (HCl) Carlo Herba Torf Toprağı Bahçe Toprağı Sodyum Hipoklorit Özgün Bahçecilik Özgün Bahçecilik Ticari Çamaşır Suyu Zeatin Sigma Z-0164 Etanol Aldrich 24,511-9

51 Deneyde Kullanılan Çözeltiler Vitamin karışımı ana solüsyonu Glisin 0,2 mg Miyoinositol Tiamin HCl Nikotinik asit Distile su 19 mg 1 mg 5 mg 100 cc ye tamamlanır B 1 vitamini ana solüsyonu Tiamin HCl 50 mg Distile su 50 cc ye tamamlanır BAP (6-Benzylaminopurin) ana solüsyonu BAP 50 mg 1N HCl Distile su 2-3 cc. 50 cc ye tamamlanır NAA (α Naftalenasetik asit) ana solüsyonu NAA 50 mg % 95 lik Etil Alkol 3-5 cc. Distile su 50 cc ye tamamlanır IBA (3-Indolbutirik asit) ana solüsyonu IBA 50 mg % 95 lik Etil Alkol 3-5 cc. Distile su 50 cc ye tamamlanır Myoinositol ana solüsyonu Myoinositol 10 g Distile su 100 cc ye tamamlanır.

52 Zeatin ana solüsyonu Zeatin 1N NaOH Distile su 500 mg 3-5 cc. 50 cc ye tamamlanır GA 3 ana solüsyonu GA 3 EtOH Distile su 50 mg 3-5 cc. 50 cc ye tamamlanır. 3.3 Bitki Materyali Bu tez çalışmasında deney materyali olarak Doğu Anadolu Bölgesi nde doğal olarak yetişen Brassicaceae familyasına ait Brassica nigra (kara hardal) tohumları kullanıldı. Tohumlar 4ºC de buzdolabında muhafaza edildi. Rejeneresyon için kullanılacak sürgünler, in-vitro koşullarda steril olarak çimlendirilmiş tohumlardan sağlandı. 3.4 Besi Ortamının İçeriği Bütün çalışmalarda besi ortamı olarak Murashige ve Skoog tarafından önerilen temel besi ortamı olan, MS besi ortamının modifiye edilmiş hali, katı besi ortamı olarak kullanıldı. Tüm çalışmalarda besi ortamı %0.26 fitajel ile desteklendi. Köklendirme ve indirekt sürgün oluşumunda kullanılan bitki düzenleyicilerin konsantrasyonları ilgili alt bölümde verilecektir. 3.5 Besi Ortamlarının Hazırlanması ve Sterilizasyonu Denemelerde besi ortamı olarak Murashige ve Skoog tarafından önerilen temel besi ortamının modifiye edilmiş şekli kullanıldı. Çalışmalar sırasında MS tuzu hazır halde (Sigma Chemical Co.) ortama ilave edildi. MS (Murashige ve Skoog) besi ortamının içeriği Çizelge 3.2.ve 3.3. de ayrıntılarıyla verildi.

53 41 Çizelge 3.2. MS besi ortamında kullanılan makro ve mikro elementler MAKROELEMENTLER Adı Miktarı (mg/l) KNO NH 4 NO MgSO 4, 7H 2 O 370 CaCl 2, 2H 2 O 440 KH 2 PO MİKROELEMENTLER Adı Miktarı (mg/l) MnSO4, 4H2O 22,3 H3BO3 6,2 ZnSO4, 7H2O 8,6 NaMoO4, 2H2O 0,25 CuSO4, 5H2O 0,025 KI 0,83 CoCl2, 6H2O 0,025 Çizelge 3.3. MS besi ortamında kullanılan diğer elementler GRUP 2 Adı Miktarı (mg/l) Na2-EDTA.2H2O 37,3 FeSO4, 7H2O 27,08 ORGANİK BİLEŞİKLER (VİTAMİNLER VE AMİNOASİTLER) Adı Miktarı (mg/l) Myo-inositol 100 Nikotinik asit 0,5 Glisin 2,0 Pyridoxine.HCl 0,5 Thiamine.HCl 0,1 DİĞER KATKI MADDELERİ Adı Miktarı (mg/l) Sakkaroz 30 Phtogel 3,0 Kullanılan tüm maddeler g l -1, mg l -1 ve/veya (w/v) yüzde ile ifade edildi. MS besi ortamı hazırlamak için 2 litrelik erlenmayer içerisine 250 ml distile saf su konuldu ve içerisine mıknatıs konularak manyetik karıştırıcı üzerine erlenmayer yerleştirildi. Her madde eklendikten sonra çökelmeyi önlemek amacıyla hazırlanan solüsyon çalkalandı. Daha sonra sırasıyla besi ortamına 4,3 g l -1 MS tuzu (Sigma Chemical Co.) (Murashige ve Skoog, 1962; Bicakci ve Memon, 2005) ve 20 g l -1 sakkaroz eklendi. Karışım distile su ile 1000 ml ye

54 42 tamamlandı. Besi ortamının ph ı 0,5 M NaOH ve 0,5 M HCl ile, 5.6±1 e ayarlandı. Katılaşmayı sağlamak amacıyla ortama 2,6 g l -1 fitajel eklendi ve besi ortamı 1.2 kgf /cm 2 basınç altında 20 dakika süre ile otoklav edildi. Besi ortamı yaklaşık 45 º C sıcaklığa geldikten sonra 1ml l -1 MS vitamini ve bitki düzenleyicileri (oksin ve sitokininler) düz akımlı kabin içerisinde ortama ilave edildi. Besi ortamı daha fazla bekletilmeden 25 ml l -1 olarak TPP petrilere (9 cm çapında) döküldü. 3.6 Bitki Büyüme Düzenleyicilerinin Stok Çözeltilerinin Hazırlanması Bitki Büyüme Düzenleyicilerinin (BBD) stok çözeltilerinin hazırlanması için, büyüme maddelerinin ihtiyaç duyulan miktarları bir parça folyo içinde tartıldı. Stok çözeltiler genelde mg/ml konsantrasyonlarında hazırlandı. Tartımdan sonra 10 ya da 50 ml falkon tüplere küçük manyetik karıştırıcılarla birlikte aktarıldı. Bazı maddeler ( örneğin NAA) az miktarda (2-3 ml) 1M KOH, ya da 1 M HCl (BAP) içinde çözdürüldü. Bazı maddeler ise ( örneğin IBA) alkolde eritildi. Eritilen BBD steril saf suyla 15 ya da 50 ml ye tamamlandı. BBD, sıcakta yapıları bozulacağı için 0,22 µm çapında filtre ile steril edildikten sonra besi ortamına ilave edildi. BBD stok çözeltileri +4ºC de buzdolabında saklandı. 3.7 Bitki Materyalinin Çimlenme Ortamı Brassica nigra tohumları steril edildikten sonra modifiye edilmiş MS (Murashige ve Skoog, 1962) besi ortamında çimlendirildi. Tohumların sterilizasyonu ilgili bölümde açıklanmıştır. Kullanılan çimlenme ortamı 2.15 g/l, (½) MS tuzu (Sigma Chemical Co.) (Murashige ve Skoog, 1962; Bicakci ve Memon, 2005), %2 (w/v), 20 g l -1 sükroz (sakkaroz), 1ml l -1 MS vitamin solüsyonu ve 2.6 g l -1 fitajel kullanılarak hazırlandı. Besi ortamının ph ı, NaOH (0,5 M) ve HCl (0,5 M) ile olarak ayarlandı ve besi ortamı 20 dakika, 121 o C, 1.2 kgf /cm 2 basınç altında otoklav edildi. Steril edilen ortama, yaklaşık 45 º C sıcaklığa geldikten sonra 1ml l -1 MS vitamini ilave edildi ve besi ortamı bekletilmeden Magenta GA 7 kaplarına, her bir kaba 75 ml olacak şekilde aktarılarak soğumaya bırakıldı. Her bir magentaya 10 tohum ekildi ve magentaların ağzı parafilm ile çevrildi. Bütün magentaların dış yüzeyi ışığı önlemek için alimünyum folyo ile sarılarak bitki büyüme kabininde 10 saat ışıklı/karanlık periyotta, μmolm -2 s -1 ışık yoğunluğunda tohumlar çimlenmeye bırakıldı.

55 Olgun B. nigra Tohumlarının Sterilizasyonu ve Çimlenme Yüzdesi B. nigra olgun tohumlarından itibaren rejenerasyon araştırmaları esnasında, sterilizasyon tekniğinin geliştirilmesi ve çimlenme yüzdesini arttırmak için aşağıdaki deneme serisi kuruldu. Olgun Brassica nigra tohumlarından steril doku kültürü materyali elde etmek için, bir sterilant olan sodyum hipokloritin (NaOCl) ve %75 lik etil alkolün sterilizasyon üzerindeki etkisi araştırıldı. Aşağıdaki deneylerin hepsinde ependorf içindeki tohumların yüzey sterilizasyonu elle çalkalanarak yapıldı. 3.9 Yüzey Sterilizasyonu Yapılmamış Olgun B. nigra Tohumlarının Çimlenme Kapasitesi Üzerine Ön Çalışma Bu deneyde olgun B. nigra tohumlarının çimlenmesi için bir sterilizasyon işlemine gerek olup olmadığını tespit etmek için, 24±1 ºC sıcaklıkta, 14/10 saat-ışıklı/karanlık periyotta, μmolm -2 s -1 ışık yoğunluğu şartlarında bulunan bitki kabinlerinde steril nemlendirilmiş kurutma kağıtları üzerine Brassica tohumları çimlenmeye bırakıldı. Ortamın nem dengesi, her 3 günde, steril kabin içerisinde ortamı ıslatacak kadar su ilave edilerek sağlandı. Denemenin ilk 7 gününde tohumların % 50 den fazlası bakteri ve mantarla enfekte oldu. 15 günün sonunda ise enfeksiyon oranı %90 ı buldu. Bu sonuçlar gösteriyor ki, Brassica tohumlarının in-vitro koşullarda çimlendirilmesi için bir sterilizasyon işlemine gerek vardır Brassica Tohumlarının Sterilizasyonu ve Çimlenme Yüzdesi Üzerine NaOCl nin, ph ın ve Optimum Bekletilme Süresinin Etkisinin Belirlenmesi İçin Deneysel Çalışma İlk deneyde, herhangi bir yüzey sterilizasyon işlemine tabi tutulmadan kültüre alınan Brassica tohumlarında yüksek oranda kontaminasyon rapor edilmişti. Bu deney serilerinde, tohumların enfekte olmadan çimlenmesi ve dekontaminasyonuna etkisini tespit etmek için farklı konsantrasyonlardaki NaOCl ve %75 lik etil alkolün tohumlar üzerinde etkisi, çimlenme ortamının ph ının ve tohumların NaOCl ve alkol içerisinde optimum bekletilme süresinin çimlenme yüzdesine etkisi bir kontrol grubu ile birlikte test edildi. Bunun için 5 deneme serisi oluşturuldu, toplanma zamanları birbirinden farklı iki tip tohum kullanıldı. Oluşturulan deneme serileri aşağıda belirtildiği gibidir:

56 Tip Tohum 1. Deneme Serisi (Kontrol Serisi) ph : 6,0-6,5 Sterilant : - Bekletilme süresi : - 2. Deneme Serisi ph : 5,6±1 Etken madde : % 75 lik etil alkol % 20 lik Sodyum hipoklorit Bekletilme süresi : Alkol 1 dk. Sodyum hipoklorit 20 dk. 3. Deneme Serisi ph : 6,0-6,5 Sterilant : % 75 lik etil alkol % 20 lik Sodyum hipoklorit Bekletilme süresi : Alkol 1 dk. Sodyum hipoklorit 20 dk. 4. Deneme Serisi ph : 5,6±1 Sterilant Bekletilme süresi : % 5 lik Sodyum hipoklorit :15 dakika 5. Deneme Serisi ph : 6,0-6,5 Sterilant Bekletilme süresi : % 5 lik Sodyum hipoklorit : 15 dakika

57 45 Her bir deneme serisi 2. tip tohum içinde oluşturuldu. Deneme serilerinde, 4 magentanın her birine 10 ar adet Brassica tohumu, steril şartlarda MS besi ortamına kültüre alındı. Tohumların çimlenmesi için kullanılan MS besi ortamı önceki bölümlerde de belirtildiği gibi, 20 g l -1 sakkaroz ve 2,6 g l -1 fitajelle desteklendi. Bütün magentaların etrafı ışığı engellemek için alüminyum folyo ile sarıldı ve soğuğun çimlenmeye etkisini belirlemek için 2 magenta, +4ºC de 2 gün boyunca bekletildi. Diğer 2 magentadaki tohumlar ise daha önce belirtilen iklim şartlarında bitki büyüme kabininde çimlenmeye bırakıldı. 2 günün sonunda magentalar soğuk odadan alınarak kültür odasına alındı ve çimlenmeye bırakıldı Bitki Parçasının Alınması (Eksplant Kültür) Çimlenme ortamına ekilen B. nigra tohumları, çimlenme gerçekleştikten sonra yaklaşık 30 gün boyunca bitki büyütme kabininde, 10 saat ışıklı/karanlık periyotta, μmolm -2 s -1 ışık yoğunluğunda büyümeye bırakıldı. 30 günlük bitki materyalinden gövde, apeks ve hipokotil olmak üzere 3 farklı eksplant alındı. Bu parçalar, 20 g l -1 sükroz ve 1 ml l -1 MS vitamin solüsyonu ile birlikte farklı bitki büyüme düzenleyicilerini içeren ayrıca kallus oluşumunu, sürgün rejenerasyonunu ve kök oluşumunu destekleyen çeşitli bileşiklerin bulunduğu MS besi ortamına kültüre alındı (Murashige ve Skoog, 1962; Bicakci ve Memon, 2005). Kallus ve sürgün oluşumu için kullanılan besi ortamları Çizelge 3.4. de listelenmiştir. Besi ortamının ph ı 0,5 M NaOH ve 0,5 M HCl ile, ye ayarlandı. 2 % sükroz ve 0.26 % fitajel (katılaşmayı sağlayan madde) içeren bazal besi ortamı 121 o C, 1.2 kgf /cm 2 basınçta, 20 dakika süre ile otaklav edildi. Bitki büyüme düzenleyicileri ve vitaminler 0,22 µm mikro filtre ile steril edildi ve besi ortamının sıcaklığı yaklaşık 45 ºC ye gelince ortama ilave edildi.10 gövde ve 5 apeks ve 5 hipokotil eksplantı, 3 deneme paralelinde her biri 25 ml besi ortamı içeren petrilere kültüre alındı (her bir paralel için 3 petri ). Gövde ve hipokotil eksplantları 1-2 cm uzunluğunda parçalara ayrıldı ve yaralı bölgeler besi ortamına değecek şekilde ortama alındı. Bütün çalışmalar düz akımlı steril kabin içerisinde yapıldı. Petrilerin etrafı, dışarıdan gelebilecek her hangi bir kontaminasyonu önlemek amacıyla parafilm ile sarıldı ve petriler 24±1 ºC sıcaklıkta, 14/10 saat-ışıklı/karanlık periyotta μmolm -2 s -1 ışık yoğunluğu şartlarında bulunan bitki kabinlerine transfer edildi. Kabinin nemi % olarak ayarlandı.

58 46 Çizelge 3.4. Kallus ve sürgün oluşumu için kullanılan MS besi ortamları SÜRGÜN ORTAMLARI İÇERİĞİ MS 1 MS+ 0.2 mg l -1 NAA+ 1.0 mg l -1 BAP MS 2 MS+ 0.5 mg l -1 NAA+ 0.5 mg l -1 BAP MS 3 MS+ 0.5 mg l -1 NAA+ 2.0 mg l -1 BAP MS 4 MS+ 1.0 mg l -1 NAA+ 0.2 mg l -1 BAP MS 5 MS+ 2.0 mg l -1 NAA+ 0.5 mg l -1 BAP MS10 MS+ 2 mg l -1 BAP MS11 MS+ 4 mg l -1 BAP MS12 MS+ 6 mg I -1 zeatin+ 0.1 mg l -1 NAA mg l -1 AgNO 3 MS13 MS+ 1 mg l -1 BAP+ 0.5 mg l -1 GA 3 MS14 MS+ 3 mg l -1 BAP mg l -1 NAA+2.5 mg l -1 AgNO 3 MS15 MS+ 2 mg l -1 BAP mg l -1 NAA Alınan eksplantlardan sürgün oluşumu gerçekleştikten sonra, günlük sürgünler, indirekt köklenme için farklı konsantrasyonlarda oksin hormonları ve AgNO 3 içeren 5 farklı MS besi ortamına (Murashige ve Skoog, 1962; Bicakci ve Memon, 2005) aynı büyütme kabini şartlarında alt kültüre alındı. Aktarma, sürgünlerin strese girmesini önlemek için mümkün olduğu kadar hızlı bir şekilde yapıldı. Deneme serileri 3 paralelli olarak (her bir paralelde 3 magenta ve/ veya kavanoz) gerçekleştirildi. Köklendirme ortamı için kullanılan besi ortamları Çizelge 3.5. de belirtildiği gibidir. Köklenme gerçekleştikten gün sonra, bitkiler toprak kültürüne transfer edildi. Çizelge 3.5. Köklendirme ortamları KÖKLENDİRME ORTAMLARI İÇERİĞİ MS 6 MS mg l -1 NAA MS 7 MS mg l -1 IBA MS 8 MS+1.0 mg l -1 NAA mg l -1 IBA MS 9 MS + 12 µg l -1 AgNO 3 MS 0 MS Tamamen Rejenerasyonu Gerçekleşen Bitkinin Toprak Kültürüne Aktarımı (Aklimatizasyon): Tamamen rejenerasyonu gerçekleşen bitkiler, köklere zarar vermeyecek şekilde forsep ile besi ortamından çıkartıldı ve köklere yapışan fitajel paçaları su ile yıkanarak temizlendi. Böylece herhangi bir zarara uğramadan in vitro şartlardan alınan bitkiler, ilk önce makro ve mikro elementlerce çok zengin çiçek toprağına (torf) aktarıldı. Aktarımdan sonra bitkiler su ile

59 47 sulandı ve üzerleri sera şartlarına adaptasyonu kolaylaştırmak ve % 90±5 bağıl nemi korumak için naylon poşetlerle kapatıldı. Daha sonra bitkilerin sera şartlarına adaptasyonundan önce, bağıl nem, her gün poşete 5 delik açılarak derece derece yaklaşık % 60±5 e düşürüldü ve 5 günün sonunda poşet tamamen çıkartıldı. Bu bitkilere düzenli olarak 3 günde bir su verildi. Her fide ayrı ayrı saksılar içinde, bitki büyüme odasında, gece gündüz sıcaklığı 24±1 ºC sıcaklıkta, 14/10 saat-ışıklı/karanlık periyotta μmolm -2 s -1 ışık yoğunluğu şartlarında gelişmeye devam ettiler. Torfta, 20 günlük aklimatizasyondan sonra bitkiler, bu sürenin sonunda 2:1 oranında toprak-torf karışımına aktarıldı ve bitkiler çiçeklenme ve tohum oluşumu için büyümeye bırakıldı Sterilizasyon Teknikleri Tüm bitkiler gibi B. nigra tohumlarının mantar kökenli ve bakteri kökenli enfeksiyonunu engellemek ve enfeksiyondan kaçınmak için önceki bölümlerde de anlatıldığı gibi, tohumların yanı sıra denemelerde kullanılan besi ortamı, kullanılan aletler ve kültür kaplarının da tamamen steril (mikropsuz) şartlar altında kullanılması çok önemlidir. Bu nedenle sterilize edilecek B. nigra tohumları için, en iyi yüzey sterilizasyon tekniğinin geliştirilmesi gereklidir. Ayrıca bu metod tüm bu mikroorganizmaları uzaklaştıracak, bitki sistemine zarar vermeyecek yukarıdaki yöntemlere uygun bir metod olmalıdır. Tüm in-vitro çalışmalar sırasında izlenen sterilizasyon yöntemleri aşağıda tanımlanmıştır Tohumların Sterilizasyonu Brassica nigra tohumlarının yüzey sterilizasyonu %5 (v/v) sodyum hipoklorit içerisine bir damla Tween 20 eklenerek hazırlanan solusyon ile yapıldı. Tohumlar, solusyon içerisinde 15 dakika çalkalandı ve son aşamada 8-10 defa steril su ile yıkandı. Sterilizasyonu yapılan tohumlar 1 saat steril su içerisinde bekletildikten sonra çimlenme ortamına ekildi. Tüm işlemler düz akımlı steril kabin içerisinde yapıldı ve sodyum hipoklorit olarak ticari çamaşır suyu kullanıldı Isı İle Sterilizasyon Deneyler sırasında kullanılan distile su içeren kaplar (erlenmayerler), besi ortamı içeren erlenmayerler (ısıda bozulabilecek elemanlar eksik), pensler, bistüriler ve plastik doku kültür kapları iki katlı alüminyum folyo içerisine sarıldı ve otoklavda 121 o C, 1.2 kgf /cm 2 ısı basıncı altında 20 dakika sterilize edildi.

60 Filtrasyon İle Sterilizasyon IBA, BAP, NAA, AgNO 3 ve sükroz gibi yapısı sıcakta bozulan bileşiklerin sterilizasyonu için mikro filtrasyon kullanılır. Çalışma sırasında kullanılan bu bileşikler, Steril TPP marka (0, 22 µm) mikro filtre kullanılarak steril edildi Kullanılan Aseptik Yöntemler Tüm işlemler, standart sterilizasyon yöntemleri izlenerek steril bir düz akımlı kabin içinde gerçekleştirildi. Kullanımdan önce cerrahi TOP Glove eldivenleri giyildi ve çalışmalar sırasında düzenli olarak, ayrıca istemeden steril olmayan maddelere dokunulduktan sonra, eller % 70 lik alkol ile steril edildi. Uzun süreli çalışmalarda yüz maskesi kullanıldı. Çalışma öncesi, düz akımlı kabinin içi teknik alkol ile silinerek, 5 dakika süreyle UV lamba yakıldı. Pensler ve bistüri tutucuları kullanılmadan önce her defasında daima % 96 lık alkole ve daha sonra ateşe tabi tutularak soğutulduktan sonra kullanıldı. Bütün çalışmalar sırasında yapılan sterilizasyonun devam etmesi için dikkat edildi ve kullanılmadan önce tüm yüzeyler % 70 alkol ile silindi Cam Malzemelerin Sterilizasyonu Çalışmalar sırasında kullanılan tüm cam malzemeler (tüp, erlen, mezür, pipet, beher, kavanoz) su kullanılarak fırça yardımı ile iyice temizlendi. Daha sonra saf sudan geçirilerek 75 º C etüvde 1,5 saat bekletilerek kurutuldu. Kurutulan cam malzemeler 121 o C, 1.2 kgf /cm 2 basınç altında 25 dakika otoklav edilerek steril edildi. Kullanılan magenta GA-7 kültür kapları ise, alüminyum folyo ile sarılarak yine 121 o C, 1.2 kgf /cm 2 basınç altında 25 dakika otoklav edilerek steril edildi Pens ve Bistürilerin Hazırlanması ve Sterilizasyon Çalışmalar sırasında eksplantlar bitkiden forsep ve bistüriler yardımıyla alındı. Her çalışmadan önce kabin içerisinde pens ve bistüriler % 96 lık alkole ve daha sonra ateşe tutularak steril edildi ve soğutulduktan sonra kullanıldı Çalışma Şartları Tüm rejenerasyon çalışmalarında, eksplantlar için 25 ml katı besi ortamı içeren TPP petriler ve 75 ml katı besi ortamı içeren Magenta GA 7 kültür kapları kullanıldı. Köklendirme çalışmaları için sürgünler, 200 ml katı besi ortamı içeren kavanozlara ve ya magenta GA 7 kültür kaplarına aktarıldı. Tüm çalışmalar steril düz akımlı kabinde yine steril aletler kullanılarak yapıldı. Çalışılan ortam ve kabinin içi her çalışmadan önce % 70 lik alkolle silinerek 5 dakika UV lamba ile steril edildi ve malzemeler kabin içi sterilizasyonun bozulmaması için yine % 70 lik alkolle silinerek kabin içine alındı.

61 Kültür Şartları Kültürler genellikle, 24±1 ºC sıcaklıkta, 14/10 saat-ışıklı/karanlık periyotta μmolm -2 s -1 ışık yoğunluğu altında inkübasyona alındı. Işık kaynağı olarak lüx lük ışık şiddetine sahip civalı Flüoresan lambalar (400 w, MBFR/U, Thorn) kullanıldı. Tüm rejenerasyon çalışmalarında eksplantlar için 25 ml katı besi ortamı içeren TPP petriler (9 cm çapında) kullanıldı. Köklendirme çalışmaları için sürgünler ya 75 ml besi ortamı içeren Magenta GA 7 kültür kaplarına ya da 200 ml besi ortamı içeren cam kavanozlara aktarıldı Verilerin Toplanması Enfekte olan ve olmayan tohumların ya da diğer yüzey sterilizasyon materyallerinin kültür başlatılması sırasında miktarları kaydedildi. Rejenerasyon sırasında sürgün proliferasyonunu hesaplamak için sürgün sayıları ve adventif kök sayıları genellikle kültürden 30 gün sonra kaydedildi. Köklenme durumları ve kök sayıları her sürgün için not edildi.

62 50 4. DENEYSEL SONUÇLAR VE TARTIŞMALAR 4.1 Yüzey Sterilizasyonu Yapılmamış Olgun B. nigra Tohumlarının Çimlenme Kapasitesi B. nigra olgun tohumlarından itibaren rejenerasyon araştırmaları sırasında, sterilizasyon tekniğinin geliştirilmesi ve çimlenme yüzdesini arttırmak için farklı deneme serileri kuruldu. Bu denemenin amacı, olgun Brassica nigra tohumlarından steril doku kültürü materyali elde etmek için, bir sterilant olan sodyum hipokloritin (NaOCl) ve %75 lik etil alkolün sterilizasyon üzerindeki etkisini araştırmak ve olgun B. nigra tohumlarının çimlenmesi için bir sterilizasyon işlemine gerek olup olmadığını tespit etmektir. Deney, daha önce bölüm 3.8 de belirtilen kültür şartları uygulanarak gerçekleştirildi ve deney sonucunda aşağıda belirtilen morfolojik gözlemler elde edildi. Denemenin ilk 7 gününde tohumların % 50 den fazlası bakteri ve mantarla enfekte oldu. 15 günün sonunda ise enfeksiyon oranı %90 ı buldu. Bu sonuçlar gösteriyor ki, Brassica tohumlarının in-vitro koşullarda çimlendirilmesi için bir sterilizasyon işlemine gerek vardır. 4.2 Brassica Tohumlarının Sterilizasyonu ve Çimlenme Yüzdesi Üzerine NaOCl nin, ph ın ve Optimum Bekletilme Süresinin Etkisi Sterilizasyon ile ilgili yapılan ilk denemede, herhangi bir yüzey sterilizasyon işlemine tabi tutulmadan kültüre alınan Brassica tohumlarında yüksek oranda kontaminasyon rapor edilmişti. Bu denemede ise, tohumların enfekte olmadan çimlenmesi ve dekontaminasyonuna etkisini tespit etmek için farklı konsantrasyonlardaki NaOCl ve %75 lik etil alkolün tohumlar üzerindeki etkisi, çimlenme ortamının ph ının ve tohumların NaOCl ve alkol içerisinde optimum bekletilme süresinin çimlenme yüzdesine etkisi bir kontrol grubu ile birlikte test edildi. Deney sonucunda elde edilen morfolojik gözlemler aşağıda belirtilmiştir. Deney serilerindeki tohumların çimlenme yüzdesi, her magentada çimlenen tohum sayısının toplam tohum sayısına oranı 100 ile çarpılarak bulundu. Deneme serileri 25 gün gözetim altında tutuldu Deneme Kontrol Serisi Kontrol grubundaki bütün tohumlarda, 3 gün içerisinde bakteri ve mantar enfeksiyonu gözlemlendi. Ortamda enfeksiyon oluşmasına rağmen, iki tohum tipinde de sırasıyla % 10 ve %5 oranında çimlenme gerçekleşti.

63 Deneme Serisi Tohumlarda ve besi ortamında hiçbir kontaminasyon gözlenmemesine rağmen çimlenme de gerçekleşmedi. Tohumlar yaklaşık olarak 1 ay gözlem altında tutuldu Deneme Serisi Tohumlarda ve besi ortamında kontaminasyon oluşmadı. 2. tip tohumlarda çimlenme gözlenmezken 1. tip tohumlarda %10 oranında çimlenme gerçekleşti. Tohumların çimlenmesi, diğer deneme serileri ile karşılaştırıldığında daha uzun sürede ve yavaş oldu. Radikula çıkışı kültürden yaklaşık gün sonra başladı Deneme Serisi Tohumlarda ve çimlenme ortamında hiçbir kontaminasyon meydana gelmedi. 1. tip tohumlarda %50 oranında, 2. tip tohumlarda % 30 oranında çimlenme gözlendi (Çizelge 4.1). Tohumlarda radikula gelişmesi kültürden yaklaşık 7 gün sonra başladı. Kök oluşumu ve gelişimi genellikle sürgünlerden daha fazla olarak gözlemlendi. Hipokotil gelişimi 10 günlük kültür süresi sonrası oldukça belirginleşti. Sekonder yaprak oluşumu hipokotil gelişiminden sonra yaklaşık 15. günde başladı Deneme Serisi Tohumlarda ve besi ortamında kontaminasyon oluşmadı. Çimlenme oranı, 1. tip tohumlarda %95 oranında, 2. tip tohumlarda %75 oranında gerçekleşti. Radikula çıkışı, kültürden yaklaşık 5 gün sonra başladı. Kök oluşumu ve gelişimi genellikle sürgünlerden daha fazla olarak gerçekleşti. Hipokotil gelişimi 7 günlük kültür süresi sonrası gözlemlendi. Sekonder yaprak oluşumu hipokotil gelişiminden sonra yaklaşık 10. günde başladı. 5. deneme serisinde elde edilen sonuçlar diğer deneme serileri ile karşılaştırıldığında Brassica tohumlarının çimlenmesinin, bu ortamda daha fazla oranda ve daha hızlı çimlendiğini söyleyebiliriz. 4.3 Değerlendirme Deneme serilerinden elde edilen veriler incelendiğinde Brassica tohumlarının çimlenmesi için en uygun ortamın 5. deneme ortamı olduğuna karar verildi. Çizelge 4.1 de verilen değerlere göre, çimlenen tohumların oranlarında önemli farkların olduğu görülmektedir. Tohumların % 75 alkol ile muamele edildiği denemelerde çimlenme hiç olmamıştır ve ya çok az bir oranda gerçekleşmiştir, ayrıca bu ortamlarda NaOCl konsantrasyonunun %20 olması tohum çimlenmesi oranını negatif yönde etkilemiş olabilir. Bu sürenin 15 dakikadan daha yüksek olması ve alkolle muamele tohumların bozulmasına ya da çimlenmemesine neden olmaktadır. Elde edilen sonuçlara göre, tohumların dekontaminasyonu için, NaOCl de bekletilme

64 52 süresinin etkili olduğu görülmektedir. Ayrıca ortamın ph ı değiştiğinde de çimlenme oranlarında değişiklikler gözlenmiştir. Bu sonuçlar bize Brassica tohumlarının çimlenme yüzdesine besi ortamının ph ının da etkili olduğunu gösterir. Elde edilen sonuçlar ve daha önce rapor edilen bilgiler ışığında, Brassica tohumlarının dekontaminasyonu % 5 lik NaOCl ile 15 dakika süreyle muamele edilerek başarılabilir. Çizelge 4.1 de verildiği gibi besi ortamının ph ının olarak ayarlanması tohumların çimlenme verimliliğini arttırmaktadır. Ayrıca yine elde edilen veriler ışığında, 1. tip tohumun çimlenme yüzdesinin daha fazla olduğu belirlendi ve Brassica nigra nın rejenerasyon çalışmaları sırasında bu tohumların kullanılmasına karar verildi. Deney Serileri Çizelge 4.1. Tohumların çimlenme oranları (%) Enfekte Olan Tohumlar (%) 1. Tip Tohumlar 2. Tip Tohumlar Çimlenen Enfekte Olan Tohumlar (%) Tohumlar (%) Çimlenen Tohumlar (%) 1 (Kontrol) Hipokotil Eksplantı Kallus Oluşumu Hipokotil eksplantından elde edilen veriler incelendiğinde, kullanılan kallus oluşturma ve sürgün büyütme ortamlarından, sadece sitokin [MS 10 (2 mg l -1 BAP) ve MS 11 ( 4 mg l -1 BAP] kullanılan ortamlarda ve ya sitokin hormonlarının etkisi ile karşılaştırmak amacıyla yüksek konsantrasyonda oksin [MS 12 (6 mg I -1 zeatin+ 0.1 mg l -1 NAA mg l -1 AgNO 3 ] hormonlarının kullanıldığı besi ortamlarında bütün hipokotillerin kallus oluşturduğu gözlendi. Sitokin oranının (BAP), oksin (NAA) oranına daha fazla veya eşit olduğu kültür ortamlarına (MS1, MS2, MS3) alınan hipokotil eksplantlarında kallus oluşumu, yaklaşık 5-7 gün gibi kısa sürede gerçekleşti. 3 tekrarlı deney serilerinden elde edilen veriler incelendiğinde, hipokotilden MS1 ortamında %98.75 oranında, MS2 ortamında %94.53 oranında, MS3 ortamında ise %93.22 oranında kallus oluşumu hesaplandı (Çizelge 4.2).

65 53 Çizelge 4.2. Hipokotil eksplantından 8 farklı besi ortamında, kallus oluşturma oranlarının karşılaştırılması ± Kallus Oluşumu (%) MS1 98,75 ± 1,70 MS2 94,53 ± 1,17 MS3 93,22 ± 2,76 MS4 91,22 ± 2,60 MS5 92,33 ± 1,73 MS10 96,75 ± 1,24 MS11 97,25 ± 1,24 MS12 94,25 ± 1,44 Kallus Oluşturma Oranı % 100,00 98,00 96,00 94,00 92,00 90,00 88,00 86,00 MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS10 MS11 MS12 Besi Ortamları Kallus Oranı Şekil 4.1. Hipokotil eksplantından 8 farklı besi ortamında oluşan kallus oranlarının değişimi Kalluslar genelde sarımsı-yeşil renkte ve oldukça büyüktü (Şekil 4.2). Kallus oluşumundan yaklaşık 10 gün sonra kalluslarda köklenme görüldü. Kallus oluşumu, eksplantın besi ortamına değdiği yaralı bölgeden başlayarak tüm doku yüzeyine yayıldı.

66 54 Şekil 4.2. MS1 ortamında hipokotil eksplantından kallus oluşumu Şekil 4.3. MS2 ortamında hipokotil eksplantından kallus oluşumu Oksin (NAA) oranının sitokin oranından (BAP) daha fazla olduğu kültür ortamlarına (MS4, ve MS5) alınan hipokotil örneklerinde kallus oluşumu yine yaklaşık 5-7 gün içerisinde, kısa sürede gerçekleşmesine rağmen diğer ortamlara göre daha kısa sürede kalluslarda köklenme gözlendi. Ayrıca oluşan kalluslar, sitokininin miktarının fazla olduğu ortamlara göre daha

67 55 küçüktü. Sonuçlar değerlendirildiğinde MS4 ortamında %91.22 oranında, MS5 ortamında ise % oranında kallus oluşumu gerçekleşti (Çizelge 4.2). Şekil 4.4. MS4 ortamında hipokotil eksplantından kallus oluşumu (7. gün) Elde edilen veriler değerlendirildiğinde hipokotilden kallus oluşumu için en iyi ortamların MS1, MS2 ve MS3 olduğunu söyleyebiliriz Sürgün Oluşumu Denemeler sırasında kullanılan kallus oluşturma ve sürgün büyütme ortamlarından, sadece sitokin [MS 10 (2 mg l -1 BAP) ve MS 11 ( 4 mg l -1 BAP)] kullanılan ortamlarda ve ya sitokin hormonlarının etkisi ile karşılaştırmak amacıyla yüksek konsantrasyonda oksin [MS 12 (6 mg I -1 zeatin+ 0.1 mg l -1 NAA mg l -1 AgNO 3 )] hormonlarının kullanıldığı besi ortamlarında bütün hipokotiller, kallus oluşturmasına rağmen aynı eksplantlarda sürgün oluşumu gerçekleşmedi. Oluşan bütün kallusların 7-9 gün içinde öldüğü gözlendi (Şekil 4.5). Ayrıca hipokotilden sürgün oluşumunu gerçekleştirmek için kullanılan diğer besi ortamlarında da sürgün oluşumu elde edilemedi [MS 13( 1 mg l -1 BAP+ 0.5 mg l -1 GA 3 ), MS 14 (3 mg l -1 BAP mg l -1 NAA+2.5 mg l -1 AgNO 3 ), MS 15(2 mg l -1 BAP mg l -1 NAA)]. Bu besi ortamlarındaki kalluslar yaklaşık 2 ay boyunca gözlem altında tutuldu fakat her hangi bir sürgün oluşumu gerçekleşmedi. Bu denemelerden elde ettiğimiz sonuçlar ışığında yüksek konsantrasyonda ve ya tek başına sitokin hormonları kullanıldığında bu hormonların kallus hücreleri üzerine toksik etki ettiğini söyleyebiliriz.

68 56 Şekil 4.5. MS12 ortamında 7 günün sonunda ölen kalluslar Hipokotil kültürler yüksek oranda kallus oluşumu göstermesine rağmen (Çizelge 4.2) sürgün oluşturma ortamlarının hiç birinde kallustan indirekt sürgün oluşumu gerçekleşmedi.

69 Apeks Eksplantı NAA ve/ve ya BAP hormonlarının farklı konsantrasyonlarının kullanıldığı besi ortamlarında apeks parçalarının direkt rejenerasyon gösterdiği gözlemlendi (Şekil 4.6). Sürgün ve kallus oluşumunu gerçekleştirmek için kullanılan 5 farklı besi ortamında da direkt sürgün çıkışı gerçekleşti. Şekil.4.6. MS1 ortamında apeksten direkt sürgün oluşumu Şekil.4.7. MS2 ortamında apeksten direkt sürgün oluşumu

70 58 Apeks eksplantında kallus oluşumu yaralı bölgelerde, direkt rejenerasyon gerçekleştikten sonra ve % ve 73,75 oranları arasında gerçekleşti (Çizelge 4.3). Direkt sürgün oluşumundan 8-10 gün sonra, kallus oluşumu gerçekleştiğinde, indirekt sürgün oluşumu yüksek verimlilikte MS7 besi ortamında, % oranda ve düşük verimlilikte, MS9 ve MS10 besi ortamlarında sırasıyla % ve oranlarında gözlendi (Çizelge 4.4). Apeksten alınan eksplantlarda direkt sürgün oluşumu 5-7 gün içerisinde gerçekleşti. Direkt rejenerasyon sonucu oluşan sürgünler, gün büyütüldükten sonra indirekt kök oluşumu için 5 farklı besi ortamında alt kültüre alındı. Çizelge 4.3. Apeks eksplantının 5 farklı besi ortamında kallus oluşturma oranlarının karşılaştırılması ± Kallus Oluşumu (%) MS1 73,75 ± 2,97 MS2 92,21 ± 1,38 MS3 83,87 ± 4,20 MS4 95,00 ± 2,66 MS5 86,67 ± 4,81 Kallus Oluşturma Oranı 100,00 80,00 % 60,00 40,00 20,00 Kallus Oranı 0,00 MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 Besi ortamları Şekil 4.8. Apeks eksplantından 5 farklı besi ortamında oluşan kallus oranlarının değişimi Apeksten oluşan direkt sürgünler 2-3 cm boyuna ulaşınca, steril şartlarda köklendirme ortamına aktarıldı ve apeks parçaları tekrar aynı ortama kültüre alındı. Yaklaşık 6 günün sonunda apekslerde kallus oluşumu başladı, kallus tüm dokuyu kapladıktan sonra indirekt

71 59 sürgün oluşumu başladı. Kallus üzerinde yeşilimsi bir doku dışarıya doğru oluşmaya başladı (Şekil 4.11) ve apeks eksplantları %100 ve arasında direkt sürgün oluşumu gösterirken ayrıca % ve oranında indirekt sürgün oluşumu gösterdi ( Çizelge 4.4). Aşağıdaki resimlerde, apeksten indirekt sürgün oluşumu, MS1 ortamında farklı zamanlardaki oluşum durumuna göre gösterilmiştir. Çizelge 4.4 incelendiğinde, apeks eksplantından indirekt sürgün oluşumu MS1, MS3 ve MS4 besi ortamlarında gerçekleşirken MS2 ve MS5 ortamlarında gözlenmedi. Elde edilen veriler incelendiğinde apeksten indirekt sürgün oluşumu için en uygun ortamın MS1 ortamı olduğunu söyleyebiliriz. Ayrıca, direkt sürgün oluşumu MS2, MS3 ve MS5 besi ortamlarında düşük oranda gerçekleşirken MS1 ve MS4 ortamlarında yüksek verimlilikte gözlendi. Bu veriler doğrultusunda apeksten direkt sürgün oluşumu için en uygun besi ortamlarının MS1 ve MS4 olduğunu söyleyebiliriz. Çizelge 4.4. Apeks eksplantının 5 farklı besi ortamında direkt ve indirekt sürgün oluşturma oranlarının karşılaştırılması ± Direkt Sürgün Oluşumu İndirekt Sürgün Oluşumu MS1 100,00 ± 0,00 67,50 ± 1,58 MS2 97,77 ± 1, MS3 90,53 ± 2,87 40,00 ± 4,47 MS4 100,00 ± 0,00 20,00 ± 3,16 MS5 74,07 ± 5, Direkt Sürgün Oluşturma Oranı 120,00 100,00 80,00 % 60,00 40,00 20,00 Sürgün Oranı 0,00 MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 Besi ortamı Şekil 4.9. Apeks eksplantının 5 farklı besi ortamındaki direkt sürgün oluşturma oranlarının değişimi

72 60 Şekil MS1 besiortamında apeksten indirekt sürgün oluşumu başlangıcı (7. gün) MS1 besi ortamında kallus oluşumu gerçekleştikten 7 gün sonra dokunun yüzeyinden dışarıya doğru yeşilimsi bir yapı oluşmaya başladı. Şekil MS1 besiortamında, apeksten indirekt sürgün oluşumu, kallus oluşumundan sonra 15. gün 15. günün sonunda bu yapı daha belirgin bir duruma gelerek yaprağa dönüşmeye başladı.

73 61 Şekil MS1 besi ortamında, apeksten indirekt sürgün oluşumu, kallus oluşumundan sonra 19. gün 19. günün sonunda yapraklar gelişerek sürgün haline dönüştü. Şekil MS1 besi ortamında apeksten indirekt sürgün oluşumu, kallus oluşumundan sonra 25. gün

74 günün sonunda sürgün gelişerek, uzamaya başladı ve kallustan tamamen farklı bir bitkiciğe dönüştü. Şekil MS3 besi ortamında apeks indirekt sürgün oluşumu Şekil MS4 besi ortamında apeksten indirekt sürgün oluşumu

75 63 İndirekt Sürgün Oluşturma Oranı % 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 MS1 MS3 MS4 Besi Ortamı Sürgün Oluşumu Şekil Apeks eksplantının 3 farklı besi ortamındaki indirekt sürgün oluşturma oranlarının değişimi 4.6 Gövde Eksplantı NAA ve/ve ya BAP hormonlarının farklı konsantrasyonlarının kullanıldığı besi ortamlarında gövde parçalarının direkt rejenerasyon gösterdiği gözlemlendi (Şekil 4.19). Gövde eksplantlarının 5 farklı kültür ortamında, nodlardan %76.73 ve % arasında direkt sürgün oluşumu gerçekleşti (Çizelge 4.6). Direkt sürgün oluşumu ile kallus oluşumu başlangıcı aynı zamanda görüldü. Gövdeden elde edilen kalluslar apeks eksplantında olduğu gibi, gövde eksplantının besi ortamına temas ettiği yaralı bölgelerden oluşmaya başladı ve tüm dokuyu kapladı. Kallus oluşturma oranı, %95.18 ve %88.30 arasında hesaplandı (Çizelge 4.5). Elde edilen veriler incelendiğinde, gövdeden kallus oluşumu en yüksek verimlilikte MS3 ve MS5 besi ortamında gerçekleşti. Ayrıca MS1, MS2 ve MS4 besi ortamlarında da yüksek verimlilikte kallus oluşmasına rağmen değerlerin MS3 ve MS5 besi ortamlarından daha düşük verimlilikte olduğu görüldü. Elde edilen sonuçlar ışığında, gövdeden kallus oluşumu için en uygun ortamların MS3 ve MS5 besi ortamları olduğunu söyleyebiliriz. Çizelge 4.5. Gövde eksplantının 5 farklı besi ortamında kallus oluşturma oranlarının karşılaştırılması ± Kallus Oluşumu (%) MS1 88,30 ± 2,88 MS2 90,43 ± 2,88 MS3 95,00 ± 2,24 MS4 88,49 ± 3,42 MS5 95,18 ± 2,24

76 64 Gövde eksplantından indirekt sürgün oluşumu 5 farklı sürgün oluşturma ortamında da gerçekleşmedi. Örnekler 1,5 ay gözlem altında tutuldu. Bazı deneme serilerinde kalluslar çok büyüdüğü için bölünerek, aynı besi ortamlarına alt kültüre alındı fakat indirekt sürgün oluşumu gözlenmedi. Bu sonuçlar değerlendirildiğinde Brassica nigra bitkisinde, indirekt sürgün oluşumu için gövde eksplantının uygun olmadığını söyleyebiliriz. Şekil MS3 ortamında gövde eksplantından kallus oluşumu (14 günlük) Gövde Eksplantı Kallus Oranı 96,00 94,00 % 92,00 90,00 88,00 86,00 Kallus Oranı 84,00 MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 Besi Ortamı Şekil Gövde eksplantının 5 farklı besi ortamındaki kallus oluşturma oranlarının değişimi

77 65 Gövdeden alınan eksplantlarda direkt sürgün oluşumu 7-10 gün içerisinde gerçekleşti. Direkt rejenerasyon sonucu oluşan sürgünler, gün büyütüldükten sonra indirekt kök oluşumu için 5 farklı besi ortamına alt kültüre alındı. Sürgünler steril şartlarda köklendirme ortamlarına aktarıldıktan sonra kalluslar aynı besi ortamına geri konuldu ve 1 ay gözetim altında tutuldu. Çizelge 4.6. Gövde eksplantından, 5 farklı besi ortamında oluşan direkt sürgün oranlarının karşılaştırılması ± Direkt Sürgün Oluşumu (%) MS1 76,73 ± 1,68 MS2 54,20 ± 4,68 MS3 48,89 ± 2,90 MS4 53,31 ± 2,97 MS5 47,50 ± 5,64 Gövde Eksplantı Direkt Sürgün Oranı % 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 Sürgün Oranı Besi Ortamı Şekil Gövde eksplantının 5 farklı besi ortamındaki direkt sürgün oluşturma oranlarının değişimi

78 66 Şekil MS1 ortamında gövdeden direkt sürgün oluşumu 4.7 İndirekt Köklendirme 5 farklı köklendirme besi ortamına alt kültüre alınan sürgünlerde, indirekt kök oluşumu 5-20 gün arasında gerçekleşti. Sürgünler MS6, MS7, MS8, MS9 ve MS0 ortamlarında sırasıyla % 68.54, 92.27, 83,23, ve oranlarında indirekt köklenme gösterdi (Çizelge 4.7). Doğrudan köklendirme ortamlarına alınan sürgünlerin rejenerasyon süreleri incelendiğinde, MS0 ortamında 5 gün ile en kısa sürede kök oluşumunun gerçekleştiği görüldü (Şekil 4.21). Diğer besi ortamlarında ise gün arasında kök oluşumu gözlendi. Elde edilen veriler incelendiğinde indirekt köklenmenin en yüksek verimlilikte MS7 ve MS0 köklendirme ortamlarında gerçekleştiği görüldü. MS6, MS8 ve MS9 besi ortamlarında ise daha düşük oranda indirekt köklenme görüldü. Bu veriler ışığında Brassica nigra bitkisinin, in vitro şartlarda indirekt köklenmesi için en uygun ortamların MS7 ve MS0 olduğunu söyleyebiliriz. Çizelge 4.7. Sürgünlerin 5 farklı köklendirme ortamında, indirekt köklenme oranlarının karşılaştırılması ± İndirekt Köklenme Oluşumu (%) MS6 (1.0 mg l -1 NAA) 68,54 ± 1,87 MS7 (1.0 mg l -1 IBA) 92,27 ± 2,73 MS8 (1.0 mg l -1 NAA mg l -1 IBA ) 83,23 ± 2,70 MS9 (12 µg l -1 AgNO 3 ) 58,33 ± 3,23 MS0 85,71 ± 2,27

79 67 İndirekt Köklenme Oranı % 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 Köklenme Oranı 0,00 MS6 MS7 MS8 MS9 MS0 Besi Ortamı Şekil Köklenme ortamlarında oluşan indirekt köklerin oranlarının değişimi Şekil MS0 besi ortamında indirekt kök oluşumu (20 günlük)

80 68 Şekil MS0 besi ortamında indirekt kök oluşumu (20 günlük) MS7, MS9 ve MS0 besi ortamlarında indirekt kök rejenerasyonunun sürgün ucundan oluştuğu (Şekil 4.22) fakat MS6 ve MS8 besi ortamlarında ise 5-15 günlük sürenin sonunda sürgün ucunda meydana gelen kallustan oluştuğu gözlendi (Şekil 4.26). Şekil MS7 besi ortamında indirekt kök oluşumu (3 günlük)

81 69 Şekil Apex indirekt köklenme, MS7 (IBA), 8 günlük Şekil Gövde sürgünü, indirekt köklenme, MS6 (NAA), 7 günlük (30/03/2007)

82 70 Şekil Apeks sürgünü, indirekt köklenme, MS9 (12 µg l -1 AgNO 3 ), 19 günlük (10/08/2005)

83 Toprağa uyum (Aklimatizasyon) Kök oluşumu gerçekleştikten 15 gün sonra tam bir bitki haline gelen sürgünler toprağa aktarıldı. Sürgünlerin dış ortamdan etkilenmemesi ve toprağa kolay uyum sağlaması için toprağa aktarma 2 aşamada gerçekleştirildi. İlgili bölümde açıklanan bu yöntemler sonunda tüm bitkiler toprağa uyum sağladı ve bitkilerden tohum elde edildi. Brassica nigra nın toprağa uyum sağlaması için gerçekleştirilen aşamalar aşağıda fotoğraflarla gösterilmiştir; Şekil B. nigra nın aklimatizasyon çalışmaları (1. aşama)

84 72 Şekil Torfa uyum sağlamış B. nigra bitkisi Şekil B. nigra nın toprak + torfa (2:1) uyumu

85 73 Şekil Toprağa uyum sağlamış B. nigra, 05/04/2006, çiçeklenme başlangıcı Şekil Çiçeklenme başlangıcı 06/04/2006

86 74 Şekil Çiçeklenme 21/04/2006 Şekil Tohum başlangıcı 25/04/2006