Bahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı Bilim Dalı Kodu:

Transkript

1 EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (DOKTORA TEZİ) BAZI ORKİDE TÜRLERİNİN In Vitro KOŞULLARDA ÇOĞALTILMASI, ÇİÇEKLENMESİ Ziraat Yük Müh. Rifat Tarık YARARBAŞ Bahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı Bilim Dalı Kodu: Sunuş Tarihi: Tez Danışmanı: Prof. Dr. Ercan ÖZZAMBAK Bornova İZMİR

2 V ÖZET BAZI ORKİDE TÜRLERİNİN in vitro KOŞULLARDA ÇOĞALTILMASI, ÇİÇEKLENMESİ YARARBAŞ, Rifat Tarık Doktora Tezi, Bahçe Bitkileri Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. M. Ercan ÖZZAMBAK Mart 2008, 90 sayfa Aktif kömür varlığında Cymbidium ve Phalaenopsis te PLB artışı denenmiş, 1 ve 2g/l aktif kömür en iyi sonucu vermiştir. Phalaenopsis te artırılan şeker dozunun PLB çoğalmasına etkisi negatif bulunmuştur. MES ((2-[N-Morpholino]ethane-sulfonik Asit) sitrik asidin Phalaenopsis PLB artışına etkisini araştırdığımızda, t testi sonucuna göre sitrik asit içeren ortam daha verimli bulunmuştur. Eksplant olarak yaprak köke göre önemli bulunmuştur. Destek materyalinin PLB artışına etkisi araştırıldığında; perlit >pamuk >agar >sıvı daldırma=kâğıt sonucu ortaya çıkmıştır. Oncidium sphacelatum, Dendrobium speciosum, Brassia gireoudiana, Cymbidiella pardalina, melez Cymbidium, melez Phalaenopsis in 1, 2, 3, 4, 5mg/l benzyladenine ve 3g/l PVP içeren pamuk destekli sıvı ortamda PLB artış miktarları önemsiz bulunmuştur. Biyoreaktör denemesinde ise sıvı dolşım sıklığının PLBartışına etkisi araştırıldığında Cymbidium, Cymbidiella ve Brassia da 24 dolaşım/gün en iyi uygulama olmuş bunu 12 dolaşım/gün ikinci sırada ve 6 dolaşım/gün üçüncü sırada izlemiştir. Dendrobium speciosum da ise 12 dolaşım/gün en iyi sonucu vermiş, 24dolaşım/gün ikinci sırada ve 6 dolaşım/gün üçüncü sırada yer almıştır. Phalaenopsis ve Brassia da

3 VI thidiazuron dozlarıyla çoğaltma denemesinde, Phalaenopsis için 0,1 ve 0,2 mg/l, Brassia için 0,1 ve 0,3 mg/l thidiazuron en iyi sonucu vermiştir. Protokormlara ultrason uygulamasında ise Phalaenopsis te 0,1mg/l TDZ ve 1dakika ultrason en iyi sonucu vermiştir. Cymbidium da ise, 0,4mg/l TDZ ve 1 dakika ultrason en iyi sonucu vermiştir. Cymbidiella pardalina da İBA ile kurulan köklendirme denemesinde, 1000 ve 100 ppm kısa süre daldırma en iyi sonucu vermiştir. Orchis italica türünün tohum çimlenmesinde ultrason uygulanması, çimlenme süresini 6 kat kısaltmıştır. Ophrys tenthredinifera tohum çimlendirme denemesinde, 18kV luk kısa süreli elektrik şoku sonucunda %5,3 oranında çimlenme elde edilmiştir. Anahtar Kelimeler: PLB, orkide doku kültürü, bioreaktör, tohum çimlenmesi, ultrason uygulaması, elektrik uyartması

4 VII ABSTRACT YARARBAŞ, Rifat Tarık PhD. Thesis, Horticulture Department Thesis Supervisor: Prof. Dr. M. Ercan ÖZZAMBAK March 2008, 90 pages 1 and 2g/l activated charcoal gave the best result in the multiplication of PLB of Cymbidium and Phalaenopsis. A negative correlation was found between increasing sugar concentration and Phalaenopsis PBL multiplication. Citric acid gave the best result compared to MES. In vitro grown leaf explant produced more PLB than the in vitro grown root tip. Result of the comparison of the support material were as follows; perlite > cotton > immersion > filter paper. Differences in multiplication in experiments with Oncidium sphacelatum, Dendrobium speciosum, Brassia gireoudiana, Cymbidiella pardalina, hybride Cymbidium, hybride Phalaenopsis in medium containing 1, 2, 3, 4, 5 mg/l benzyladenine and 3 g/l PVP was found not significant. However, the frequency of external loop in the bioreactor experiment was found significant. 24 loop/day was found the best treatment for Cymbidium, Cymbidiella and Brassia, while 12 loop/day and 6 loop/day were ranked as the second and third, respectively. In the case Dendrobium speciosum 12 loop/day was found as the best treatment, while 24 loop/day and 6 loop/day were ranked as second third, respectively. In multiplication experiments with Phalaenopsis and Brassia, 0,1 and 0,2 mg/l thidiazuron was found to be the best for Phalaenopsis, while 0,1 and 0,3 mg/l thidiazuron were found to be the best for Brassia. Sonication with

5 VIII thidiazuron, 0,1mg/l TDZ in combination with sonication for 1 minute was found best for Phalaenopsis, while 0,4mg/l TDZ in combination with sonication for 1 minute was best for Cymbidium. 1000ppm and 100ppm quick deep had the best rooting effect on Cymbidiella pardalina. Sonication in seeds of Orchis italica reduced seed germination period for six fold. Short term electric shock at 18kV stimulated germination of Ophrys tenthredinifera at %5,3 ratio. Key words: PLB, orchid tissue culture, bioreactor, seed germination, sonication, electric stimulation

6 IX TEŞEKKÜR Bu konuda çalışmamı sağladığı için tez hocam Prof. Dr. Ercan Özzambak a, beni her zaman için destekleyen kardeşlerim Müfid ve Süha Yararbaş a, biyoreaktörün AutoCad programında tam ölçekli çizimi için yengem Çiğdem Midillili Yararbaş a, yine kullandığımız biyoreaktörün sınıflandırılmasındaki yardımları için Ebiltem hocalarından Prof. Dr. Aynur Gürel ve kimya yüksek mühendisi Kerem Bora ya, orkide tohumları ile ilgili bilgiler sağladığı için Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi hocalarından Prof. Dr. Ekrem Sezik e, sağladıkları teknik bilgiler için Chiba Üniversitesi ve Akita Prefectural Üniversitesi Japonya dan Prof. Dr. Masahiro Mii ve Doç. Dr. Kazumitsu Miyoshi ye, Kaliforniya Üniversitesi emeritus profesörlerinden Prof. Dr. Joseph Arditti ye, Hollanda Lowland Biotech ten Willem Evertse ye, Dendrobium la ilgili araştırma notlarını paylaştığı için Charles Baker a, çalışmada kullandığım türlerin bir bölümünün temininde yardımcı oldukları için, bölümümüz doktora öğrencilerinden Zir. Yük. Müh Suna Başer e, Burleigh Park Orchid Nursery Avustralya dan Ian Walters a, Orchid Seed Bank Project Arizona - ABD den Aaron Hicks e, yurt dışından getirtilen bitkiler için izin alınması konularında yardımlarını esirgemediği için Dr. Elif Sabir Şahin e, çalışmam sırasında yardımlarını esirgemedikleri için Dr. Şevket Karaçancı, Ar. Gör. Arzu Karaçancı, Dr. Burçak İşçi, Ar. Gör. Gölgen B. Öztekin e, bilgilerini paylaştığı için Zir. Yük. Müh Başak Düzyaman a, istatistik analizlerimde yardımları için Doç. Dr. Eftal Düzyaman a, yardımları için fen bilimleri enstitüsü öğrenci işlerinden

7 X Ar. Gör. Gül Öner e ve son olarak, saf su üretiminde kullanılan iyon değiştirici reçine kolonlarının derişik hidroklorik ve derişik sodyum hidroksitle rejenerasyonu gibi tehlikeli bir işte yardımlaştığı için laboratuar teknisyeni İbrahimÇetin evebuçalışmaya destek verdiği için Ege Üniversitesi Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonuna teşekkürü borç bilirim.

8 XI İÇİNDEKİLER ÖZET V ABSTACT VII TEŞEKKÜR IX ŞEKİLLER DİZİNİ XIV ÇİZELGELER DİZİNİ XVII KISALTMALAR VE SİMGELER DİZİNİ XIX 1.GİRİŞ 1 2.LİTERATÜR BİLDİRİŞLERİ Orkide İle İlgili Genel Bilgiler Orkidelerin in vitro Yöntemle Çoğaltılması ve Tohum Çimlenmesi ile İlgili Çalışmalar Ultrason Dalgaları ve Elektrik Akımı Uygulamasıİle İlgili Çalışmalar Orkidelerde Çiçeklenme İle İlgili Çalışmalar MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Bitkisel Materyal Besin Ortamının Bileşimi Kullanılan ortamların genel özellikleri Yöntem Kültüre Başlama Farklı destek materyallerinin PLB rejenerasyonuna etkisi denemesi Bitki büyüme düzenleyicileri 22

9 XII Aktif kömür tozu Şeker MES-Sitrik asit Biyoreaktör Denemeleri Ultrason Denemeleri Tohum PLB Rejenerasyonuna etkisi Köklendirme denemeleri Çiçeklendirme Denemeleri Metanol Denemeleri Tropik Orkide Tohumu Çimlendirme Denemeleri Ölçülen Parametreler Ve İstatistik Analiz BULGULAR Phalaenopsis Sıvı Ortamada Kullanılan Destek Materyalin Phalaenopsis PLB Artışı Üzerine Etkisi Şeker Dozu Artışının Phalaenopsis te PLB Artışı Üzerine Etkisi Aktif Kömür Dozunun Phalaenopsis PLB Artışına Etkisi MES ((2-[N-Morpholino]ethane-sulfonik Asit) SitrikasitKarşılaştırması Phalaenopsis te Farklı Eksplantların Rejenerasyon Kapasitesi Cymbidium Aktif kömürün protokorm benzeri yapı (PLB)

10 XIII artışına etkileri Benzyladenin Uygulamaları Biyoreaktör Denemeleri Phalaenopsis biyoreaktör uygulaması Cymbidium biyoreaktör uygulaması Cymbidiella pardalina biyoreaktör uygulaması Dendrobium speciosum biyoreaktör uygulaması Oncidum sphacelatum biyoreaktör Uygulaması Brassia gireoudiana biyoreaktör uygulaması Thidiazuron (TDZ) Denemeleri Thidiazuronun (TDZ) Phalaenopsis PLB rejenerasyonu Üzerine Etkisi Thidiazuron un Brassia gireoudiana Protokormlarının Artışı Üzerine Etkileri Ultrasonun Rejenerasyon Üzerine Etkisi Cymbidium Ultrason Denemeleri Phalaenopsis Ultrason Denemeleri Cymbidiella pardalina da Köklendirme Denemesi Çiçeklendirme Denemeleri Metanol Denemsi Sonuçları Tohum Çimlendirme Denemeleri 56

11 XIV Dezenfeksiyon Denemeleri Tohum Ultrason Denemeleri Orchis italica Ophrys tendridinifera Tropik Orkide Tohum Çimlendirme Denemeleri TARTIŞMA ve SONUÇ 65 KAYNAKLAR DİZİNİ 72 EKLER 84

12 XV Şekil Dizini Sayfa Şekil 1. Dıştan dolaşım sistemli biyoreaktör ve havalandırma filtre diskleri 22 Şekil 2. Biyoreaktör iç motoru 23 Şekil 3. Manyetik karıştırıcı 23 Şekil 4. Kültür kabı destek sehpası 24 Şekil 5. Dıştan dolaşımlı biyoreaktörün ölçeklendirilmiş kesiti 26 Şekil 6. Ultrason tankı (a) ve işlem görmüş tohumlar (b). 27 Şekil 7. Deney düzeneği ve yüksek gerilim uygulamak için kullanılan çakmak ateşleyicisi 28 Şekil 8. Phalaenopsis te köklenme 29 Şekil 9. Destek materyali etkinlik sıralaması 33 Şekil 10. Şeker dozunun rejenerasyon üzerine etkisi 34 Şekil 11. Aktif kömürün rejenerasyon üzerine etkisi 35 Şekil 12. Sitrik asit MES karşılaştırması 36 Şekil 13. Phalaenopsis te yapraktan rejenerasyon 37 Şekil 14. Phalaenopsis te kök ucundan rejenerasyon 37 Şekil 15. Aktif kömürün Cymbidium da rejenerasyon üzerine etkisi 39 Şekil 16. Sıvı dolaşım süresinin Cymbidium PLB rejenerasyonuna etkisi 40 Şekil 17. Cymbidium PLB lerinin biyoreaktördeki durumları 41 Şekil 18. Cymbidiella pardalina nın biyoreaktördeki Durumları 41

13 XVI Şekil Dizini Sayfa Şekil 19. Sıvı dolaşım periyodunun Cymbidiella pardalina PLB rejenerasyonuna etkisi 42 Şekil 20. Dolaşım periyodunun Dendrobium speciosum PLB rejenerasyonuna etkisi 43 Şekil 21. Dolaşım/gün ün Brassia gireoudiana PLB rejenerasyonuna etkisi 45 Şekil 22. Thidiazuron un Phalaenopsis rejenerasyonu üzerine etkisi 46 Şekil 23. Brassia gireoudiana PLB lerine TDZ etkisi 47 Şekil 24. Cymbidium PLB lerinde TDZ ultrason Etkileşimi 49 Şekil 25. Ultrason sonrası rejenerasyon 49 Şekil 26. Phalaenopsis protokorm benzeri yapılarında TDZ ultrason etkileşimi 50 Şekil 27. Phalaenopsis in doku kültüründe çiçeklenmesi 52 Şekil 28. Çeşitli metanol dozlarının Phalaenopsis ve Cymbidium üzerine etkileri 54 Şekil 29. Orchis italica tohumlarında TTC canlılık testi 54 Şekil 30. Dört dakika ultrason uygulaması sonunda testası tamamen uzaklaştırılmış embriyolar 55 Şekil 31. Rizoid oluşumu ve çimlenme başlangıcı 56 Şekil 32. Çimlenmeden 1 ay sonra ultrason uygulanmış (a) ve uygulanmamış (b) tohumların durumları 57 Şekil 33. İki aylık embriyolar ve ilk yapraklarının oluşumu 58

14 XVII Şekil Dizini Sayfa Şekil 34. Bitkilerin 7 aylık durumları 58 Şekil 35. Ophrys tenthredinifera protokormlardan ilk yapraklarınoluşumu 60 Şekil 36. Melez Phalaenopsis tohumlarının invitro da çimlenme durumu 61 Şekil 37. Ekimden 15 gün sonra Cymbidiella pardalina (a) ve Phalaenopsis amabilis 4N (b) tohumlarında (b) çimlenme durumları 61

15 XVIII Çizelge Dizini Sayfa Çizelge 1. Hollanda mezatlarında Phalaenopsis satışının yıllaragöredağılımı 2 Çizelge 2. Avrupa Birliği ihracat rakamları 2 Çizelge 3. Japonya ve ABD nin Phalaenopsis ihracatı 3 Çizelge 4. Almanya nın yılları arasında in vitro süs bitkisi üretimi 3 Çizelge 5. Türkiye nin orkide ithalat ve ihracatı 4 Çizelge 6. Bazı orkide tohumlarının tohum-embriyo boşluk oranları 10 Çizelge 7. New Dogashima ortamı 20 Çizelge 8. MS ortamı 20 Çizelge 9. Phalaenopsis te Destek materyali Duncan sıralaması 34 Çizelge 10. Phalaenopsis aktif kömür Duncan sıralaması 37 Çizelge 11. Cymbidium- aktif kömür Duncan sıralaması 40 Çizelge 12. Cymbidium biyoreaktör Duncan sıralaması 42 Çizelge 13. Cymbidiella pardalina Duncan sıralaması 44 Çizelge 14. Dendrobium speciosum Duncan sıralaması 45 Çizelge 15. Brassia gireoudiana Duncan sıralaması 46 Çizelge 16. Phalaenopsis TDZ rejenerasyon Duncan sıralaması 47 Çizelge 17. Brassia gireoudiana TDZ Duncan sıralaması 49 Çizelge 18. Cymbidium da TDZ, dakika ve interaksiyon Duncan karşılaştırması 50 Çizelge 19. Duncan karşılaştırması Phalaenopsis ultrason ve TDZ uygulaması 52 Çizelge 20. Cymbidiella pardalina da köklenme Duncan Sıralaması 53

16 XIX Çizelge Dizini Sayfa Çizelge 21. Sadece hipoklorit ve hipoklorit + ultrason Uygulamalarınınkarşılaştırılması 60

17 XX KISALTMALAR ve SİMGELER DİZİNİ KV Kilo Volt KHz Kilo Hertz µm mikro molar mg/l miligram/ litre ppm litrede miligram PLB (Protokorm like bodies) protokorm benzeri yapı NAA Naftalen asetik asit IBA İndol butirik asit IAA İndol asetik asit TDZ Thidiazuron

18 1 1. GİRİŞ İlginç şekilleriyle orkideler, keşfedilmeye başlandıkları günden beri insanların dikkatlerini üzerine çekmeyi başarmışlardır. Bunun sonucu olarak, zaman içerisinde, bu doğal türlerden melezleme ve seleksiyon yoluyla doğal türlere göre çok daha güzel ve daha kısa sürede çiçeklenebilen melez hatlar geliştirilmiştir. Orkideler ilk kültüre alındıkları yıllarda, doku kültür teknikleri gibi yoğun üretim yöntemlerinin henüz gelişmemiş olmasından dolayı herkesin alamayacağı kadar pahalı olmasına rağmen doku kültürü yöntemlerinin gelişmesinden sonra, özellikle Phalaenopsis çok daha ekonomik fiyatlarla satılır hale gelmiştir. Orkidelerin üretimi konusunda generatif (tohumla) üretim yöntemleri de kullanılabilmektedir. Phalaenopsis tohum kapsülünde 1,5-2 milyon adet tohum bulunabilmektedir. Orkide tohumları toz tohumlar olarak da adlandırılır. Çoğunlukla çimlenme için gerekli besin maddesini içermezler. Küçük tohumlardır ve büyük hava boşlukları içerirler. Bu sayede rüzgârla ya da suyla oldukça uzun mesafelere taşınabilirler (Ghani and Arditti, 2000). Ancak tohumla üretimde genetik olarak farklı tipte bitkiler oluşmaktadır. Bu istenmeyen bir durumdur ve önüne geçmek için doku kültürü üretim yöntemleri kullanılmaktadır. Tohumla üretim yöntemi virüs iletimini engellediği içindendrobium üretiminde tercih edilmektedir. Dünyaorkideüretimigözönünealındığında ABD, Japonya ve Hollanda en önemli üretici ülkeler konumundadır. Hollanda da

19 2 Phalaenopsis üretimi 1980 lerin sonuna doğru birkaç üreticinin öncülüğünde başlamıştır ve sadece fide üretimini kapsamıştır larda bu sektör, saksı çeşitlerinin gündeme gelmesi ve fidelerin doku kültürü ile üretilmesi nedeniyle dengeli bir şekilde genişlemiştir (Çizelge.1) yılı tahminlerine göre bu ülkenin Phalaenopsis üretim alanı 80 hektar civarındadır. Çizelge 1. Hollanda mezatlarında Phalaenopsis satışının yıllara göre dağılımı ( Knaap et al, 2005) Phalaenopsis Yıl Satış Hacmi (milyon ) Miktar (milyon) Birim Fiyatı ( ) Avrupa Birliğitoplamı hesaba katıldığında ise 2004 rakamlarına göre 71,9 milyon luk kesme orkide ihracatı vardır (Çizelge2). Çizelge 2. Avrupa Birliği kesme çiçek ihracat değerleri (AIPH Statistical Year Book, 2005) Hacim Hacim Değer Ürün (1.000 Adet) (1.000 Kg) (1.000 ) Gül Krizantem Karanfil Orkide Diğer Kesme Çiçekler Amerika Birleşik Devletlerinde ve Japonya da ise Phalaenopsis ihracatı 2004, 2005 ve 2006 yılında aratarak devam etmiştir (Çizelge 3).

20 3 Çizelge 3. Japonya ve ABD nin Phalaenopsis ihracatı (Taiwan External Trade Development Council) Phalaenopsis İhracatı (milyon $) Japonya ABD Toplam Çizelge 4. Almanya nın yılları arasında in vitro süs bitkisi üretimi (Winkelmann et al. 2006). Almanya'da yılları arasında in vitro üretilen süs bitkileri (x1000) TÜR (x1000) Phalaenopsis Miltonia Cypripedium 100 Diğer orkideler (terrestrial) Toplam Orkide Seçilmiş Süs Bitkileri (çok yıllıklar ve su bitkileri dahil) (x1000) Anthurium Cyclamen 200 Dendranthema Dionaea Gentiana Gerbera Helleborus Sinningia Spathiphyllum Streptocarpus Zantedeschia Farklı akvaryum ve sucul bitkiler

21 Çizelge 5. Türkiye nin orkide ithalat ve ihracatı (TÜİK rakamları) Ürün Birim Miktar $ Miktar $ Miktar $ Güller ADET Karanfiller ADET Orkide1er ADET Krizantemler ADET Diğer Çiçekler Kg Buketlik Çiçek Kg ve Tomurcuklar Toplam Türkiye'nin Kesme çiçek İhraacatı (TÜİK rakamları) Güller ADET Karanfiller ADET Orkideler ADET Glayöller ADET Krizantemler ADET Diğer çiçekler Kg Buketlik Çiçek Kg ve Tomurcuklar Toplam

22 5 Almanya da ise yılları arasında orkide üretimi, özellikle de Phalaenopsis üretimi artarak devam etmiştir (Çizelge 4). Ülkemizde de ilgi çeken ve sevilen çiçeklerden biri olan kesme ve saksılı orkideler genellikle ithal edilmekle birlikte, son yıllarda doku kültürü yoluyla üretilmiş fideleri ithal edilerek Antalya ve Yalova civarındaki birkaç serada da yetiştirilmeye başlanmıştır. Bunun sonucunda 2004 yılında 1925 adet orkide ihracatıda gerçekleşmiştir. (Çizelge 5). Saksı ve kesme çiçek dışında, Türkiye de doğal yayılış gösteren, orta kuşak orkideler (terrestrial) grubuna dahil olan türler vardır. Bunların yumrulu türlerden salep droğu eldesinde yararlanılmaktadır. Bu drogdan dondurma ve sıcak salep yapılmaktadır. Orchidaceae familyasına ait 10 cinse bağlı 37 tür ve alt türe ait, yılda kg kurutulmuş salep tozu üretilmektedir (Özhatay et al. 1997). Bu milyon yumru anlamını taşımaktadır. Yumruların toplanmasına ilişkin resmi bir uygulama olmamasına karşın 1989 yılında yumrulu bitkiler düzenlemesi ile ihracaatı yasaklanmıştır. Buna rağmen 1995'de 6.551kg, 1996'da ise 6.880kg salep ihracatı yapılmıştır. Yukarıda çeşitli ülkelerde ki ve ülkemizdeki önemine değinilen orkidelerin ticari çoğaltımında doku kültürü yöntemi kullanılmaktadır. Doku kültürü ile veya tohumdan çoğaltılan orkidelerin en önemli sorunlarından biri çiçeklenmesinin uzun süre almasıdır. Bu durum özellikle çiçek niteliğinin ön plana çıktığı süs bitkileri ıslah

23 6 çalışmalarında seleksyon işlemini geçiktirmekte, ıslah süresini uzatmaktadır. Bu projenin ana amacı çeşitli orkide türlerinin doku kültürü yoluyla çoğaltılması ve tohumlarının in vitroda çimlendirilmesi ve çiçeklendirilmesidir. Bu hedefler doğrultusunda; 1. Orkidenin in vitro da hızlı çoğaltılmasının optimizasyonu, 2. Orkidelerin biyoreaktörde çoğaltılmasının optimizasyonu, 3. Orkidenin in vitro da hızlı şekilde çiçeklenmesi ve ıslah hatlarınıneldesi, 4. Salep ve kültür orkide tohumlarının in vitro da hızlı şekilde çimlenmesi araştırılmıştır.

24 7 2. LİTERATÜR BİLDİRİŞLERİ 2.1 Orkide İle İlgili Genel Bilgiler Orkidelerin pek çoğu, çok yıllık basit yapraklı bitkilerdir, gelişme durumlarına göre dört grupta toplanabilirler; a) Ağaçlar üzerine hava kökleriyle tutunanlar (epifit). b) Taşlara tutunanlar (litofit). c) Kökleriyle toprağa bağlı olan orta kuşak orkideler (terrestrial). d) Çürükçül grup orkideler. e) Parazit gurup (Kreutz, 1998) Geniş çapta Phalaenopsis üretimi Hollanda, Almanya, Çin, Tayvan, ABD ve Japonya da ortaklık çerçevesinde yapılmaktadır. Çeşit geliştirme ABD de, seçilen klonların doku kültürüne alınması Japonya da, yoğun üretim Çin de ve üretilen bitkilerin olgunlaştırılmaları ise Hollanda da gerçekleştirilmektedir (Griesbach, 2002). Yüksek düzey sınıflandırma, gymnostemium ya da sütun olarak adlandırılan erkek ve dişi organyapılarının aynı kaide üzerinde yer almasını temel kabul eder. Bu yapı yalnızca orkidelerde bulunur. Apostasia ve Neuwiedia, Hypoxidaceae familyasında kabul edilmişlerdi

25 8 ancak bir süre sonra olarak ispatladılar. görülmektedir: 1. Tek anterliler. 2. İki anterliler. 3. Üç anterliler. Chase ve arkadaşlarının (2003) bunu moleküler Orchidaceae familyasında üç tip anter yapısı Çizelge 6. Bazı orkide tohumlarının tohum-embriyo boşluk oranları (Arditti and Ghani, 2000) TOHUM EMBRİYO Uzunluk Genişlik Hacim Uzunluk Genişlik Hacim Boşluk % Cymbidium 0.94± ± ± ± ±0. 05 Odontogloss 0.42± ± ± 0.09 ± um 05 ± Oncidium 0.42± ± ± 2.35 Ophrys 0.50± ± ± ± ±0. 03 Orchis 0.49± ± ± ± ± ± ± Orchis 0.46± ±0. 0.2± ± ±2.7 coriophora ,11 77 Orchis 0.39± ± ± ± 0.14±0. mascula ,64 71 Orchis morio 0.56± ± ± ± ± ± ± Orchis purpurea 0.38 ± ± ± ± ± ±0. 34 Orchis 0.52 ± ± ±0. 2.9±1.5 saccata 0.01 ± ,72 58 Orchis simia 0.38 ± 0.15± ± ± ,55 73 Phalaenopsis 0.35 ± 0.08± ± 0.20± 0.08 ±

26 9 Orkide tohumları, toz tohumlar olarak da adlandırılır. Orkide tohumları besin maddesi taşımamaktadır ve embriyo ile testa arasında oldukça büyük boşluk bulunmaktadır (Çizelge6.). Buisetohumunsu ya da hava akımıyla oldukça uzun mesafeler kat etmesine yardım etmektedir. Tohum çimlendiğinde yuvarlak yumurta şekilli bir yapı oluşturu. Aynı şekildeki yapı, yapraktan yada kök ucundan rejenerasyon yapılması durumunda da meydana gelir. Bu sebepten dolayı bu yapılara, protokorm benzeri yapı olarak Türkçeye çevirebileceğimiz ( protokorm like bodies) kelimelerinin baş harflerden yapılan PLB kısaltması ile anılır (Kamemotoet al, 1999). 2.1 Orkidelerin in vitro Yöntemle Çoğaltılması ve Tohum Çimlenmesi ile İlgili Çalışmalar Rotor (1959), düşük sıcaklık seviyelerinin Dendrobium orkidesinde çiçeklenme için gerekli olduğunu göstermiştir. Amphotericin ß, gentamycin, nystatin, quintozene penicillin G, sodyum omadine ve vancomycinin orkide tohum çimlenmesinde çok kötü bir etkisi görülmemişrir. Buna karşılık, in vitro sürgün ucu kültüründe, eksplantın büyümesini engellemiştir (Brown et al. 1982) Shoustari et al.(1994), yıl süre ile +4 C sıcaklıkta saklanan tropik orkide tohumlarında çimlendirme ve kimyasal canlılık testleri yapılmıştır. Taze tohum örneklerine göre depolanmış örneklerde daha az canlılık tespit edilmiştir.

27 10 Aranda Deborah çeşidinden alınan sürgün uçlarından ince hücre tabakası kültürü kuran Laksmanan ve arkadaşları (1995),sürgün uçlarını mm kalınlıkta enlemesine dilimler şeklinde kesilip ortama yerleştirilmiştir. Şahit olarak ise 6-7mm uzunlukta bölünmemiş sürgün ucu kullanılmıştır. Vacin ve Went ortamına %20v/v oranında hindistan cevizi sütü ilave etmişlerdir. 45 günlük kültür süresinin sonunda, ince hücre tabakası kültüründen ortalama 13.6 PLB, bütün sürgün ucu kültüründen ise ortalama 2.7 PLB elde etmişlerdir. Bir yıl içerisinde ince hücre tabakası kültüründen 80,000 bitki elde edilebileceği, bütün sürgün ucundan ise 11,000 bitki elde edilebileceği hesaplanmıştır. Rhynchostylis gigantea dan elde edilen eksplantlardan mm kalınlıkta enlemesine alınan kesitler değişik dozlarda NAA, thidiazuron, benzyladenin, forchlofenuron ve %3 lük şeker içeren MS ortamında kültüre alınmıştır. Optimum kombinasyon 0.3 µm benzyladenin ve 0.3 µm thidiazuron kombinasyonundan alınmıştır. Köklenme 10 µm forchlofenuron ve %1 şeker içeren ortamda gerçekleşmiştir (Bui et al.1999). Aynı yıl içinde, Chen ve arkadaşları, Oncidium Gower Ramsey çeşidinde genç yapraklarından aldıkları parçaları, ½MSortamını 0.3-1mg/l thidiazuron ilavesi ve gelrite ile katılaştırıp kültürealmışlardır. Bir ay içerisinde, kallus oluşmaksızın embriyo kümeleri meydana gelmiştir. Bu embriyoların alt kültüre alınmaları sayılarını çok daha fazla artırmıştır. Bitki gelişimi aynı besin karışımında gerçekleşmiştir.

28 11 Cymbidium sinense tohumlarından elde edilen rizomlardan, mg/l thidiazuron bulunan kültür ortamında sürgün oluşturulmuştur. Ancak, thidiazuron, rizom oluşumunu engellemiştir. ½MS ortamı, 0.5mg/l NAA ve 1g/l aktif kömür ilavesiyle elde edilen kültür ortamında dört ay sonunda 10cm uzunlukta bitkiler elde edilmiştir. Bitkiler, daha sonra spagnum yosununa aktarılmış ve sisleme tesisine yerleştirilmiştir, altı ay burada tutulduktan sonra sera koşullarına geçirilmişlerdir. İkinci yılda, bitkilerin %9.1 i çiçeklenmiştir. Üçüncü yılda %73 ü çiçeklenmiştir (Chang and Chang (2000). Park et al. (2000), Phalaenopsis in yaprak parçalarını biyoreaktörde kültüre almışlardır. Sürekli batık kültür (hava kaldırma kolonu) ve geçici batık kültür protokormlara uygulamışlardır. En uygun yöntem, aktif kömür içeren filtre üzerinde kültüre alınan protokormların geçici batık kültür tekniği ile uygulanmasından oluşmuştur. 2 litre Hyponex içeren ortamda kültüre alınan 1000 protokorm (~20gr) dan 8 haftalık kültür işleminden sonra protokorm elde edilmiştir. Elde edilen protokormlar katılaştırılmış MS, Vacin and Vent, Knudson C, Lindemann ve Hyponex ortamlarında kültüre alınmıştır. Hyponex ortamı, protocormları bitkilere dönüştürmede en başarılı ortam bulunmuştur (%83). Doritaenopsis te çiçek sapı üzerinde bulunan uyur gözler, hava basıncı ile priyodik olarak çalıştırılan biyoreaktörde denenmiştir. Sonuçlar, bu sisitemin, agarla katılaştırılmış kültür ortamına ve sıvı kültüre göre çok üstün olduğunu göstermiştir (Liu et al, 2002).

29 12 Doritis x Phalaenopsis melezinde yapılan çalışmada 1mm kalınlıkta alınan Doritaenopsis (Doritis x Phalaenopsis) yaprak parçalarını zeatin, benzyladenin, thidiazuron içeren ½ MS ortamında yerleştirmişlerdir. Denenen sitokininler içerisinde thidiazuron 9 µm konsantrasyonda optimum çoğalmayı sağlamıştır (Parket al. 2002). Park et al. 2002, dört farklı Phalaenopsis kültür çeşidinin çiçek sapları üzerinde bulunan uyur gözleri MS µm benzyladenin µm NAA + 30g şeker + 7g agar dan oluşan kültür ortamına yerleştirmişlerdir. 12 hafta sonra ortalama PLB oluşmuştur. PLB ler çoğaltılmak için modifiye edilmiş Hyponex (6.5N-4.5P-19K + 20N-20P-20K, 1g/l) + 2g/l pepton + %3 patates özütü + %0.05 aktif kömür + 30g şeker içeren ortam kullanılmıştır. Çeşide bağlı olarak PLB başına PLB rejenere olmuştur. Phalaenopsis Little Steve çeşidinin yaprak parçalarında yapılan başka bir çalışmada ise, 2.4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D; 0.45, 2.26, 4.52 µm), 6-furfurylaminopurine (kinetin; 2.32, 4.65, µm), N6- benzyladenine (BA; 2.22, 4.44, µm), ve 1-phenyl-3-(1,2,3- thiadiazol-5-yl)-urea (TDZ; 2.27, 4.54, µm) dozları denenmiştir. Ortam olarak ½ MS + 10mg/l Myo-inositol + 0.5mg/l niasin + 0.5mg/l pridoksin.hcl + 2mg/l glisin + 1g/l pepton + 170mg/l NaH 2 PO g/l gelrit + 20g/l şeker karışımı kullanmıştır. Thidiazuron ve benzyladenin, yaralanmış yaprak parçalarında embriyo oluşturmuştur. Kinetin etkili olmamıştır. 2.4D ise engelleyici olmuştur (Kuo et al.2005).

30 13 Teixeira ve Tanaka (2006), melez Cymbidium Twilight Moon Day Light kültür çeşidinde PLB üretimini yeni yöntemlerle denemiştir. PLB üretimini, PLB ince hücre tabaka kültürü, embriyonik kallus ve geleneksel PLB olmak üzere üç farklı rotada araştırmışlardır. Elde edilen PLB lerde flow cytometry ve PCR-RAPD yöntemleri uygulanarak genetik stabiliteyi araştırmışlardır. 1. derece PLB den elde edilen 2. Derece PLB ve embriyonik kallusta genetik stabilitenin korunduğunu göstermişlerdir. Saiparasad ve Polisetty (2003), ise, Oncidium Gower Ramsey, Cattleya leopoldii Dendrobium Sonia çeşidinden elde ettikleri PLB leri, 4.44 µm benzyladenin içeren MS ortamı taşıyıcı olarak kullanılarak Caalginat kaplamışlardır. %3 sodyum alginat, 75mM CaCl 2.2H 2 O kullanılarak PLB üzerinde katılaştırılmıştır. Elde edilen kaplanmış PLB ler 4 C sıcaklıkta 75 gün saklanmıştır. Bu sürenin sonunda yapılan çimlendirme denemeleri sonunda %88 in üzerinde çimlenme tespit etmişlerdir. Diuris laxiflora Lindley, Microtis media R. Br., ve Pterostylis sanguinea D.Jones & M. Clements türlerinde paclobutrazole ile yapılan çalışmada, paclobutrazolün mikoriza ve bitki gelişimini olumlu yönde etkilediği bulumuştur (Hollick et al. (2001). Zhou ve Sakaguchi (2001), ise, Doritis x Phalaenopsis melezinde genetik stabiliteyi araştırmışlardır. Akış sitometrisi tekniği ile melez bitkinin kromozom sayılarını incelemişlerdir. Doku kültüründe üretilen bitkilerde farklı ploidi seviyeleri tesbit etmişlerdir. İncelenen hücrelerin

31 14 ploidi seviyesi yüksek olan bir dokudan alındığı sonucuna varmışlardır. Buna karşılık Ishii ve arkadaşları (1998) Phalaenopsis te kallus kültürü yapmışlar ve oluşan bitkilerin çiçeklerinde hiçbir farklılık olmadığını bulmuşlardır. Dendrobium candidum da yapılan ince hücre tabakası kültüründe ½ MS makro + tam doz MS mikro + %2 şeker + 1.2mg NAA + 1,2mg benzyladenin + %0.6 agar içeren ortam karışımını kullanmıştır. Ortama dik olarak yerleştirilen en genç eksplant ortalama 24,5 adet yan sürgün oluşturmuştur (Zhao et al. 2007). Dendrobium çeşidi olan Sonia 17 ve Sonia 28'den in vitroda elde edilen yaprak eksplantlarında çoğaltma denemesi kurulmuştur.yarım doz MS besin ortamına ilave edilen 44.4 µm benzyladenine ile eksplant başına 7 sürgün elde edilmiştir. Köklendirme için ise yarım dozms ortamına eklenen 2 g/l aktif kömür en iyi köklenme sonucunu vermiştir (Martin and Madassery, 2005). Wu et al. (2007), olgunlaşmamış Phalaenopsis tohumlarını in vitro koşullarda çimlendirmişlerdir. Yapılan denemeler sonucunda en etkili besi yerinin 1/3 MS + 2mg/l benzyladenin mg/l NAA + 50g/l muz püresi + 20g/l şeker + 1g/l aktif kömür içeren ortam karışımı olduğunu bulmuşlardır. 2.2 Ultrason Dalgaları ve Elektrik Akımı Uygulaması İle İlgili Çalışmalar Terrestrial orkidelerden Calanthe discolor da çimlenme etkinliğini artırmak için Miyoshi ve Mii (1988) tarafından ultrason uygulaması

32 15 yapılmış ve tohumlarda çimlenme yüzdesi 4-16 dakikalık uygulama sonucu % 10 dan % 60 a çıkarılmıştır. Ultrason süresinin uzaması sonucu tahribat gören tohum sayısının arttığı, çimlenmenin kırılan tohum kabuğundan su ve besin maddesi alımı sonucu gerçekleştiği de aynı araştırıcılar tarafından bildirilmektedir. Calanthe discolor orkide tohumlarına ultrason uygulayarak çimlenme oranını %10 dan %60 a çıkarılmıştır. Bu, ultrasonun orkide tohumu çimlenmesinde ilk kullanılışıdır Miyoshi ve Mii (1988). Ananthakrishnan et al. (2007), ise, ultrasonun rejenerasyon üzerine etkilerini araştırmıştır. Eksplant olarak kullandıkları Cucurbita pepo kotiledonlarına dakika süreyle ultrason uygulamışlardır. Uygulamadan sonra gelişme ortamına alınan eksplantlarda, kontrole göre beş kat daha fazla sürgün gelişimi olmuştur. Başka bir araştırmada Glycine canescens, Prunus avium pseudocerasus, Pyrus communis, Solanum dulcamara ve Solanum viarum protoplastlarında volt arasında gerilim darbe şeklinde uygulanmış, protoplast canlılığında az miktarlarda azalma olduğu bulunmuştur. Elektrik uygulanan protoplastlarda bölünme hızının kontrole göre daha yüksek olduğu saptanandiğer bir sonuçtur (Rech et al. 1987) Cogalniceanu et al. (2000), ise, tütün fidelerinde volt arası karedalga gerilimi 78 ms süreyle uygulamışlardır. Uygulamadan sonra fideler sürgün geliştirme ortamına aktarılmıştır. Eksplantların deneme

33 16 sonundaki büyüklükleri ve rejenerasyon kapasiteleri önemli derecede artmıştır. 2.3 Orkidelerde Çiçeklenme İle İlgili Çalışmalar Başka bir çalışmada ise, melez Phalaenopsis te sıcaklığın çiçeklenme üzerine etkilerini incelenmiştir. HPLC, GC, MS spektrometri yöntemlerini kullanmışlar ve zeatinin yüksek sıcaklık koşullarında formunu ve miktarını belirlemiştir. Yüksek sıcaklık uygulamasının zeatin ribosit ve dihidrozeatine glikoz molekülü bağlanarak aktivitesinin yok olmasına sebep olduğu bulumuştur (Chic et al. 2000). Campos ve Kerbauy (2004), diurnal (25/10 C) koşullarda tutulan Dendrobium bitkilerinde içsel IAA ve zeatin miktarlarının çiçeklenme döneminde artığını bulmuşlardır. Dendrobium Madame Thong-In çeşidinin genç PLB leri, Hindistan cevizi sütü ve benzyladenin içeren sıvı/gelrite iki tabakalı sistemde kültüre alınmıştır. Kontrolde çiçeklenme olmazken Hindistan cevizi sütü eklenmiş ortamlarda çiçeklenme 5 ay sonunda gerçekleşmiştir. Çiçeklerde yapılan melezleme sonucu tohum elde edilmiştir (Sim et al. 2007). Hee et al. (2007), 11.1 µm benzyladenine içeren gelritle katılaştırılmış çift tabakalı ortamda Dendrobium Chao Praya Smile çeşidini altı ay içerisinde %45 oranında çiçeklendirmiştir. Oluşan çiçeklerin %72 si

34 17 morfolojik ve fizyolojik bakımdan fonksiyonel durumdadır. Çiçekler büyüklükleri dışında in vivo çiçeklerle aynı görünümdedir.

35 18 3. MATERYAL ve YÖNTEM Bu çalışma yılları arasında Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü doku kültür laboratuarında gerçekleştirilmiştir. İki ayrı kültür odası kullanılmıştır. Geliştirme amaçlı kullandığımız oda 25 C ± 2 ve çiçeklendirme amaçlı olarak bitkilerin soğuk ihtiyacını karşılamak amacıyla 18 C ± 2 sıcaklıkta tutulmuştur. İklimlendirme. Klima ve BTU lik iki klima ile sağlanmıştır. Işıklandırma ise 3000 Lüks tür ve 8/16 (karanlık/aydınlık) periyodunda çalışan bir zamanlayıcı ile çalıştırılmıştır Materyal Bitkisel Materyal Yapılan çalışmalarda, Orkide Tohum Bankası Projesinden (OSP, Arizona, ABD), Kew Garden İngiltere ve Burleigh Park Orkide Fidanlığı Avustralya dan elde ettiğimiz Phalaenopsis cornu-cevi, Phalaenopsis amabilis (4n), Cymbidiella pardalina, Dendrobium speciosum, Dendrobium nobile var Cooksianum tohumları, hibrit Cymbidium, Brassia gireoudiana, Oncidium sphacellatum protokorm benzeri yapıları (PLB) kullanılmıştır. Çiçekçilerden aldığımız melez Phalaenopsis bitkilerini tozlaştırmak suretiyle elde edilen tohumlar ve çiçek sapında yer alan uyur gözler, yine, İzmir çevresinden topladığımız Orchis italica ve Ophyrs tenthredifera tohumları da çalışmada kullanılmıştır Besin ortamının bileşimi Denemede iki farklı besin ortamı kullanılmıştır.

36 19 a) New Dogashima ortamı (Tokuhara ve Mii, 1993).(Çizelge 7 ) b) MS ortamı (Murashige Skoog, 1962) (Çizelge 8), temel besin Çizelge 7. New Dogashima besin ortamı ( Tokuhara ve Mii, 1993) Bileşenler Makro mg/ Mikro Organik mg/l mg/l Elementler l Elementler Bileşikler NH 4 NO MnSO 4.4 H 2 O 3.0 myo-inositol 100 KNO ZnSO 4.7 H 2 O 0.5 Niasin 1.0 Ca(NO 3 ) 2.4 H 2 O 470 H 3 BO Pyridoksin.HCl 1.0 KCl 150 CuSO 4.5 H 2 O Thiamine.HCl 1.0 MgSO 4.7 H2O 250 Na 2 MoO 4.2 H 2 O Kalsiyum pantotenat 1.0 KH 2 PO CoCl 2.6 H 2 O Adenin Derişik H 2 SO 4 ml L-Cysteine 1.0 D-Biyotin 0.1 Çizelge 8. MS ortamı (Murashige and Skoog, 1962) KH 2 PO mg/l CuSO 4 *5 H 2 O mg/l MgSO4 * 7 H2O 370 mg/l CoCl 2 *6 H 2 O mg/l NH 4 NO mg/l FeSO 4 *7 H 2 O 27.8 mg/l KNO mg/l Disodyum EDTA 37.3 mg/l CaCl 2 *6 H 2 O 440 mg/l Agar 10 g H 3 BO mg/l Şeker 20 g MnSO 4 *4 H 2 O 22.3 mg/l Glisin 2.0 mg/l ZnSO 4 *7 H 2 O 8.6 mg/l Myo-inositol 0.5 mg/l KI 0.83 mg/l Pyridoksin.HCl 0.5 mg/l Na 2 MoO 4 *6 H 2 O 0.25 mg/l Thiamin.HCl 0.1 mg/l Nikotinik asit 0.5 mg/l Ortamları olarak kullanılmış, bu ortama çeşitli denemelerde farklı dozlarda bitki büyüme düzenleyicileri ilave edilmiştir. Besin

37 20 ortamlarının ph sı 1N KOH ve HCl ile sterilizasyon öncesinde 5.5 e ayarlanmıştır. Sterilizasyon işlemi, 121 C sıcaklıkta 20 dakika süreyle gerçekleştirilmiştir Kullanılan ortamların genel özellikleri; 1. ½MS mg/l Myo-inositol + 10 mg/l thiamin. HCl + 1 mg/l pridoksin. HCl + 1 mg/l nikotinik asit + aktif kömür (0,5-1-1,5-2 g/l) mg/l kazein hidrolizat +1g sitrik asit + 20 g/l şeker. 2. ½MS mg/l Myo-inositol + 10 mg/l thiamin. HCl + 1 mg/l pridoksin. HCl + 1 mg/l nikotinik asit + aktif kömür 2 g/l + 1 g/l MES / 10 MS mg/l Myo inositol + 10 mg/l thiamin. HCl + 1 mg/l pridoksin. HCl + 1 mg/l nikotinik asit mg/l aktif kömür + 20 g/l şeker mg/l kazein hidrolizat + 7 g/l agar. 4. ½MS mg/l Myo-inositol + 10 mg/l thiamin. HCl + 1 mg/l pridoksin. HCl + 1 mg/l nikotinik asit + 3 g/l PVP + ( ) mg/l benzyladenine mg/l kazein hidrolizat / 5 MS +100 mg/l Myo-inositol + 10 mg/l thiamin. HCl + 1 mg/l pridoksin. HCl + 1 mg/l nikotinik asit + 170mg/l Na 3 PO 4.12H 2 O + metanol (% dozlarda) (Rodder, 1999) + thidiazuron (0.45mg/l, 1mg/l, 1.45 mg/l) + 40 g/l şeker. 6. ½MS mg/l Myo-inositol + 10 mg/l thiamin. HCl + 1 mg/l pridoksin. HCl + 1 mg/l nikotinik asit mg/l kazein hidrolizat + 20 g/l şeker + (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/l) thidiazuron.

38 YÖNTEM Kültüre Başlama Çalışmada farklı orkide türleriyle çalışılması, bunlara ait tohum, bitki, PLB gibi materyallerin elimizde olması nedeniyle denemenin amaçlarına göre değişik eksplantlarla kültüre başlanmıştır Farklı destek materyallerinin PLB rejenerasyonuna etkisi denemesi 1 numaralı ortam,2 g/l lik aktif kömür dozuyla kurulmuştur. Destek materyali olarak pamuk, perlit, sıvı, agar, filitre kağıdı kullanılmıştır. Her kavonoza 100 ml sıvı ortam konulmuştur. Pamuk hidrofil pamuktur ve ortama konulduğunda üzerinde 3-4 mm kalınlıkta sıvı kalacak miktarda ortama konmuştur. Perlit, süper iri tarım perlitidir ve 400 ml lik hacimdeki kavanozun dip kısmına 1,0-1,5 cm kalınlıkta konulmuştur. Ortam ve perlit ayrı ayrı sterilize edilip soğuduktan sonra bir araya getirilmiştir. Kağıt, kaba filtre kağıdıdır M şeklinde raf oluşturacak tarzda katlanmıştır. Sıvı ortamda çökmesini önlemek için 3 katlı olarak hazırlanmıştır Bitki büyüme düzenleyicileri Bitki büyüme düzenleyicilerinden oksin olarak indolbutirik asit, sitokinin olarak benzyladenin ve sitokinin etkili molekül olarak da thidiazuron kullanılmıştır Aktif kömür tozu Aktif kömür tozu, eksplantların bünyesinde oluşan fenolik bileşiklerin ortamdan uzaklaştırılması için kullanılmaktadır. 0, g/l dozunda Phalaenopsis ve Cymbidium PLB lerinin rejenerasyonu üzerine etkisi araştırılmıştır.

39 Şeker Jüvenil Phalaenopsis PLB lerinde, jüvenilitenin artan şeker dozuyla azalıp azalmadığını anlamak için 20 ve 40 g/l dozlarda kurulmuştur MES Sitrik asit Besin ortamına ph tamponlamak için katılan MES, pahalı olduğu için, alternatif olarak sitrik asit kullanılmıştır. 1 g/l dozda kullanılmışlardır. Rejenere olan PLB miktarları karşılaştırılmıştır. 3.3 Biyoreaktör Denemeleri Biyoreaktör çalışmasında kullanılan kapların kapakları sızdırmaz şekilde contalıdır. Kapaklara ikişer delik açılıp buralara havalanmayı temin etmek için 0.2 µ luk gözeneklere sahip filtre diskleri takılmıştır (Şekil 1). Dıştan dolaşımlı sistemi oluşturmak için, 6cm. çaplı bir petri kabının ortasına ve yan kısmına elmas uçlu freze ile delikler açılmıştır. Petri kabını içerisine 20mm uzunluk x 9mm yüksekliğe sahip + şekilli, teflon kaplı bir manyetik bar yerleştirilmiştir. Petri kabınınyantarafına açılan deliğe, bunzen alevinde L şeklinde büktüğümüz 5ml lik cam pipet, akvaryum silikonu ile yapıştırılmıştır ve petrinin üst kısmındaki delik dışında kalan diğer kısımları da silikonla kapatılmıştır (Şekil 2). Silikon katılaştıktan sonra, oluşturulan sistem içi sıvı dolu bir kaba yerleştirilip altındanmanyetikkarıştırıcı ile karıştırıldığında, merkezkaç etkisiyle sıvı, pipet borusundan akmaktadır. Karıştırıcı motorunun teknik nitelikleri olarak, 12 volt doğru akım geriliminde, 0.26 amper akım çekmektedir. 4x11x40mm boyutlarındaki neodmiyum mıknatıs, güçlü manyetik alanı nedeniyle, motorun verimini etkilememesi için, 3 mm

40 23 kalınlıktaki bir destekle motor milinin tam ortasına yapıştırılmıştır (Şekil 3). Şekil 1. Dıştan dolaşım sistemli biyoreaktör ve havalandırma filtre diskleri.

41 24 Şekil 2. Biyoreaktör iç motoru. Şekil 3. Manyetik karıştırıcı.

42 25 Dıştan dolaşımlı biyoreaktörde, bitkilerin içerisinde duracağı kabın konulması için de 10 cm lik petriden oluşturulan bir sehpa yapılmıştır (Şekil 4 ). Biyoreaktörde kullanılan ortam, ½MS + 100mg/l myo-inositol + 500mg/l kazein hidrolizat + 1mg/l pridoksin.hcl + 10mg/l tiamin.hcl + 1mg/l nikotinik asit + 20g/l şeker + 3g/l PVP + 500mg/l sitrik asit + 3mg/l benzyladenin içermektedir, ph=5,5. Biyoreaktör kapları ve ortamlar otoklavda 121 C sıcaklıkta 20 dakika sterilize edildikten sonra HEPA filtreli kabinde her biyoreaktör kabına 500ml olacak şekilde dağıtılmıştır. Biyoreaktör iç motorlarını çeviren manyetik karıştırıcılar, Şekil 4. Kültür kabı destek sehpası.

43 26 günde 6, 12 ve 24 defa çalışacak şekilde zamanlayıcılara bağlanmıştır. Her bir sıvı dolaşımsüresi15dakikadır. Biyoreaktör sisteminin ölçekli kesiti şekil 5 te verilmiştir. Ölçüler milimetre cinsindendir.

44 Şekil 5. Dıştan dolaşımlı biyoreaktörün ölçeklendirilmiş kesiti (ölçüler milimetre cinsindendir). 27

45 Ultrason Denemeleri Tohum Terrestrial orkide (salep) tohumu çimlendirme için 1/10 MS + 400mg/l kazein hidrolizat + 10mg/l thiamin.hcl + 1mg/l pridoksin.hcl + 1mg/l nikotinik asit mg/l myo-inositol + 200mg/l aktif kömür + 20g/l şeker + 6g/l agar içeren ortam karışımı kullanılmıştır. Ayrıca, salep tohumları zor çimlendikleri için, ultrason uygulaması (Miyoshi ve Mii, 1988) yapılmıştır. Cihazın gücü 30 watt tır, cihaz tankının %60 ı su ile doldurularak deneme yapılmıştır. a b Şekil 6. Ultrason tankı (a) ve işlem görmüş tohumlar (b). Tohumlar deney tüpü içerisinde 10 dakika süreyle, 1-2 damla Tween 20 ilave edilmiş %1 lik sodyum hipoklorür çözeltisinde 10 dakika süreyle dezenfekte edilmiştir. Bundan sonra üç defa steril saf su ile durulanmıştır. Son olarak tohumların içerisinde bulunduğu deney tüpüne steril saf su konup ultrason tankına yerleştirilmiştir (Şekil 6.). 4 dakika

46 29 sürelerde ultrason uygulanmıştır. Her tüp üç ayrı kavonoza ekilmiştir. Ophrys tenthredinifera tohumları iledeaynı deneme tekrarlanmış, ikinci bir deneme olarak, IC555 tümleşik devresiyle oluşturulan 50kHz frekanslı, 9volt gerilimli alternatif akım kare dalga güç kaynağı ve bir piezo elektrik çakmak ateşleyicisi kullanılarak tohumlara elektrik akımı verilmiştir. Çakmak ateşleyicisi (Şekil 7) 18KV gerilim ve 10-6 coulomb elektrik yükünü 10-7 saniye süreyle üretmektedir (Upadhyay, 2001). Elektrolit olarak, 100 ml. saf su içerisinde 120 mg kalsiyum içeren kalsiyum sitrat çözeltisi kullanılmıştır. Şekil 7. Deney düzeneği ve yüksek gerilim uygulamak için kullanılan çakmak ateşleyicisi PLB rejenerasyonuna etkisi Ultrasonun rejenerasyon üzerine olan etkisini araştırmak için kurulan denemelerde, in vitroda geliştirilmiş olan Phalaenopsis ve Cymbidium PLB leri eksplant olarak kullanılmıştır. Ortam 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mg/l thidiazuron dozları ile kurulmuştur. 0-0,5-1-2 dakika zaman serisinde ultrason uygulanmıştır. Deneme üç tekerrürlü kurulmuştur. Ortam içeriği ise; ½ MS mg/l kazein hidrolizat mg/l myo-inositol + 10

47 30 mg/l thiamin.hcl + 1mg/l pridoksin.hcl + 1 mg/l nikotinik asitten + 20g/l şekerden oluşmaktadır. 3.5 Köklendirme denemeleri Elimizde bulunan türlerden Cymbidiella pardalina dışındaki türlerde (Şekil 8) köklenme bir sorun oluşturmamaktadır. Cymbidiella pardalina ile kurduğumuz denmemede indol butirik asit (0,10,100,1000 ppm dozlarda kısa süre daldırma ile) köklenme üzerine etkisi araştırıldı. Şekil 8. Phalaenopsis te köklenme 3.6 Çiçeklendirme Denemeleri Cymbidium ve Phalaenopsis bitkileri 1/5MS + 170mg/l Na 3 PO 4.12H 2 O + 40g/l şeker + 100mg/l myo-inositol + 10mg/l thiamin.hcl + 1mg/l pridoksin.hcl + 1mg/l nikotinik asit bulunan pamuk destekli sıvı ortamda kültüre alınmıştır, ph=5.5. Phalaenopsis bitkileri, enfeksiyon nedeniyle az kaldıkları için yalnızca tek doz (1mg/l)

48 31 thidiazuron içeren ortamda kültüre alınmıştır. Cymbidium ise 0.45mg/l, 1mg/l, 1.45 mg/l ortam serisinde çiçeklenmeye alınmıştır Metanol Denemeleri US numaralı patentte metil alkol ve kompoze gübrenin, orkide türlerinin in vivo da gelişme ve çiçeklenme durumunu iyileştirdiğine ilişkin sonuçlar içermektedir. Bu sonuçları in vitro da elde edilip edilemeyeceğini denemek için % 0.5, 1 ve 2.5 metil alkol dozlarında deneme kurulmuştur. Ortam, azot konsantrasyonu MS ortamının 1/5 i olan, 170 mg/l Na 2 HPO 4 ilave edilmiş, geriye kalan tuz konsantrasyonu açısında ½MS ortamı içeriğine sahip bir ortamdır ve sabit 40 g/l şeker içermektedir. 3.7 Tropik Orkide Tohumu Çimlendirme Denemeleri Elimizde bulunan melez Phalaenopsis bitkilerinin tozlaştırılması ile elde edilen tohumlar. Küf gelişimini önleyici olarak bazı kavonozlara 5mg/l benomil ortama ilave edilmiştir. Orchid Seed Bank Project, Arizona, ABD den temin edilen Phalaenopsis cornu-cevi, Phalaenopsis amabilis (4n), Cymbidiella pardalina, Dendrobium speciosum, Dendrobium nobile var Cooksianum tohum miktarları oldukça az oldukları için yalnızca çimlendirme yapılmıştır. 3.8 Ölçülen Parametreler İstatistik Analiz Ölçülen parametreler, eksplant başına rejenerasyon miktarı (E.B.PLB= (Son PLB Başl. PLB)*Başl. PLB -1 ), eksplant başına köklenme miktarı ve tohum çimlenme yüzdesidir. Denemeler, homojen laboratuar koşullarında gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle analiz yapılırken, tesadüf

49 32 parselleri deneme deseni kullanılmıştır. Karşılaştırma içinse eşleştirilmiş t testi uygulanmıştır. Verilerin analizi için SPSS istatistik analiz programı kullanılmıştır. Gruplar arası önemli farklılıklar Duncan testi ile belirlenmiştir. Varyans analiz tabloları ek listede verilmiştir.

50 33 4. BULGULAR Phalaenopsis Sıvı Ortamda kullanılan Destek Materyalinin Phalaenopsis PLB artışı Üzerine Etkisi Bu çalışmada destek materyalinin Phalaenopsis te protokorm benzeri yapı (PLB) rejenerasyonu üzerine etkisi araştırılmıştır. Yapılan varyans analizi sonucunda (p seviyesinde) destek materyalin PLB artışına etkisi önemli bulunmuştur. Duncan sıralaması sonucunda perlit ilk sırada yer almıştır. Bunu pamuk, agar, kağıt ve desteksiz sıvı ortamı izlemiştir (Çizelge 8 ve Şekil 8). Çizelge 9. Phalaenopsis te Destek materyali Duncan sıralaması. DESTEK PLB artış Duncan testi Perlit 8,92 a Pamuk 7,58 b Agar 6,92 c Sıvı 1,20 d Kağıt 0,85 d Rejenerasyon bakımından perlit en iyi sonucu vermiş olmasına rağmen, protokorm benzeri yapılara (PLB), alt kültür yapılırken zedelemesi nedeniyle terk edilmiş, yerine pamuk destek kullanılmıştır.

51 34 Şekil 9. Destek materyali etkinlik sıralaması Şeker Dozu Artışının Phalaenopsis te PLB Artışı Üzerine Etkisi Bu çalışmada 20g dan 40g a çıkartılan şeker dozunun protokorm benzeri yapı (PLB) rejenerasyonu üzerine olan etkisi araştırılmıştır. Yapılan t testine göre (p 0.001) sonuç önemli bulunmuştur (Şekil 9). 20g şeker içeren besin ortamında 40g şeker içeren besin ortamına göre daha fazla miktarda rejenerasyon meydana gelmiştir.

52 35 PLB Rejenerasyon Miktarı 12, ,0000 8,0000 6,0000 4,0000 2,0000 0, Ölçüm Yapılan Eksplant Adedi 20g 20g Ort. 40g 40g Ort. Şekil 10. Şeker dozunun PLB rejenerasyonu üzerine etkisi Aktif Kömür Dozunun Phalaenopsis PLB Artışına Etkisi Bu çalışmada Phalaenopsis in protokorm benzeri yapılarında kültür ortamına ilave edilen aktif kömürün rejenerasyon üzerine olan etkisi araştırılmıştır. Yapılan varyans analizi sonucu bu etkinin istatistiksel olarak anlamlı olduğu ortaya çıkmıştır. Yapılan Duncan sıralamasında (Çizelge 9) 1g/l ilk sırayı almıştır. Bunu sırasıyla2,3,4ve0.5g/l izlemiştir (Şekil 10).

53 36 Çizelge 10. Phalaenopsis aktif kömür Duncan sıralaması Aktif Kömür (g/l) PLB artış Sıralama 0,5 1,70 c 1 2,56 a 2 2,26 b 3 1,78 c 4 1,74 c 5 1,07 d Aktif Kömürün Phalaenopsis'te rejenerasyon üzerine etkisi Aktif Kömür (g/l) PLB artış Şekil 11. Aktif kömürün rejenerasyon üzerine etkisi MES ((2-[N-Morpholino]ethane-sulfonik Asit) Sitrik asit Karşılaştırması Bu çalışma, pahalı bir ph tamponlayıcı asit olan 2-[N- Morpholino]ethane-sulfonik asit yerine daha ekonomik olan sitrik asidin

54 37 kullanılabilirliğini araştırmak için yapılmıştır. Yapılan t-testi sonuçlarına göre p önem seviyesinde, önemli bulunmuştur. Sitrik asit MES e göre daha fazla protokorm benzeri yapı üretmiştir (Şekil 11). PLB rejenerasyon Miktarı 12,000 10,000 8,000 6,000 4,000 2,000 0, Sitrik A. Sitrik A. Ort. MES MES Ort. Ölçüm Yapılan Eksplant Adedi Şekil 12. Sitrik asit MES karşılaştırması Phalaenopsis te Farklı Eksplantların Rejenerasyon Kapasitesi Çiçek sapı üzerinde bulunan uyur gözlerden eksplant olarak yararlanılmıştır sıvı NDM ortamına 4mg/l benzyladenin ilavesi ile elde edilen ortamda bir yılda ortalama olarak eksplant başına 5 bitki

55 38 geliştirilebilmiştir. Çiçek sapında bulunan uyur gözlerden geliştirilen bu bitkilerden elde edilen kök uçlarından ve en genç yapraklarından rejenerasyon yapılmaya çalışılmıştır (Şekil 12 ve 13). Şekil 13. Phalaenopsis te yapraktan rejenerasyon. Şekil 14. Phalaenopsis te kök ucundan rejenerasyon.

56 39 Phalaenopsis te yaprak ve kök ucu eksplant olarak kullanıldığında elde edilen protokorm miktarlarının karşılaştırılması t=11.18 ve p önem seviyesinde istatistik açıdan önemli bulunmuştur. Eksplant olarak genç yaprak, köke göre daha fazla protokorm benzeri yapı oluşturmuştur. 4.2 Cymbidium Aktif kömürün protokorm benzeri yapı (PLB) artışına etkiler Bu çalışmada Cymbidium un protokorm benzeri yapılarında kültür ortamına ilave edilen aktif kömürün rejenerasyon üzerine olan etkisi araştırılmıştır. Yapılan varyans analizi sonucu etkinin p 0,001 seviyesinde önemli olduğu ortaya çıkmıştır. Yapılan Duncan sıralamasında (Çizelge 11 ve Şekil 14), 1g/l en iyi sonucu vermiştir. Bunu 3, 4, 0.5, 5 g/l aktif kömür dozları izlemiştir. Çizelge 11. Cymbidium- aktif kömür Duncan sıralaması Aktif kömür (g/l) PLB Artışı Sıralama 0,50 0,48 d 1,00 0,65 a 2,00 0,44 e 3,00 0,58 b 4,00 0,53 c 5,00 0,34 f

57 40 Aktif Kömürün Cymbidium' da Rejenerasyon Üzerine Etkisi PLB Artış Oranı 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,5g 1g 2g 3g 4g 5g Aktif Kömür g/l Şekil 15. Aktif kömürün Cymbidium da rejenerasyon üzerine etkisi Benzyladenine Uygulamaları Melez Phalaenopsis, melez Cymbidium, Cymbidiella pardalina, Brassia gireoudiana, Dendrobium speciosum, Oncidium sphacelatum protokorm benzeri yapılarında, 1, 2, 3, 4, 5 mg/l benzyladenin dozlarında kurulan denemelerde istatistik olarak bir fark bulunamamıştır. İstatistik analiz tabloları ekte verilmiştir. 4.3 Biyoreaktör Denemeleri Phalaenopsis biyoreaktör uygulaması Phalaenopsis PLB leri ile günde 6, 12, 24 kez sıvı ortam dolaşımı uygulanan biyoreaktörde üç tekerrürlü olarak kurulan denemede uygulamalar arasında fark bulunmamıştır Cymbidium biyoreaktör uygulaması

58 41 Cymbidium protokormlarının dıştan dolaşımlı biyoreaktörde (Şekil 16) artış miktarları istatistik olarak (p 0.001) önemli bulunmuştur. Yapılan Duncan sıralamasında (Çizelge 12 ve Şekil 15), üç gurup oluşmuştur. 24 dolaşım/gün birinci, 12 dolaşım/gün ikinci, 6 dolaşım/gün ise üçüncü sırada yer almıştır. Kuadratik etki önemli bulunmuştur. Çizelge 12. Cymbidium biyoreaktör Duncan sıralaması Dolaşım/gün PLB rejenerasyon oranı Duncan Sıralaması 6 1,94 c 12 2,44 b 24 3,55 a Cymbidium Biyoreaktör Denemesi Dolaşım/gün PLB Rejenerasyon Oranı Şekil 16. Sıvı Dolaşım periyodunun Cymbidium PLB rejenerasyonuna etkisi.

59 42 Şekil 17. Cymbidium PLB lerinin biyoreaktördeki durumları Cymbidiella pardalina biyoreaktör uygulaması Cymbidiella nın protokormlarının (PLB) biyoreaktördeki (Şekil 17) artış miktarı istatistik açıdan önemli bulunmuştur (p 0.001). Şekil 18. Cymbidiella pardalina nın biyoreaktördeki durumları.

60 43 Çizelge 13. Cymbidiella pardalina Duncan sıralaması Dolaşım/gün PLB rejenerasyon oranı Sıralama 6 1,21 b 12 1,46 a 24 1,40 a Cymbidiella pardalina biyoreaktör denemesi Dolaşım/gün PLB rejenerasyon oranı Şekil 19. Sıvı dolaşım periyodunun Cymbidiella pardalina PLB rejenerasyonuna etkisi. Yapılan Duncan testinde iki gurup oluşmuştur (Çizelge 13 ve Şekil 18).12ve24gelgiteniyisonucuvermiştir. 6 dolaşım/gün ikinci sırada yer almıştır. Kuadratik etki önemli bulunmuştur.

61 Dendrobium speciosum biyoreaktör uygulaması Dendrobium speciosum protokorm benzeri yapılarının (PLB) biyoreaktördeki artış miktarı istatistik (p 0.001) açıdan önemli bulunmuştur (Çizelge 14 ve Şekil 19). Ayrıca kuadratik etki de önemli bulunmuştur. Çizelge 14. Dendrobium speciosum Duncan sıralaması Dolaşım/gün PLB rejenerasyon oranı Duncan sıralaması 6 0,04 c 24 0,15 b 12 0,23 a Dendrobium speciosum Biyoreaktör Denemesi Dolaşım/gün PLB rejenerasyon oranı Şekil 20. Dolaşım periyodunun Dendrobium speciosum PLB rejenerasyonuna etkisi.

62 45 Yapılan Duncan sıralamasında 12 dolaşım/gün en iyi sonucu vermiştir. Bunu 24 dolaşım/gün ikinci ve 6 dolaşım/gün üçüncü sırada izlemiştir Oncidum sphacellatum biyoreaktör uygulaması Oncidum sphacellatum biyoreaktör uygulaması istatistik bakımdan önemsiz bulunmuştur Brassia gireoudiana biyoreaktör uygulaması Brassia gireoudiana protokorm benzeri yapılarının biyoreaktörde artış miktarı istatistik bakımdan önemli bulunmuştur (p 0.001). Yapılan Duncan sıralamasında (Çizelge 15 ve Şekil 20), 12 dolaşım/gün en iyi sonucu vermiştir. Bunu6dolaşım/gün ikinci, 24 dolaşım/gün ise üçüncü sırada izlemiştir. Kuadratik etki önemli bulunmuştur. Çizelge 15. Brassia gireoudiana Duncan sıralaması Dolaşım/gün PLB rejenerasyon oranı Sıralama 6 1,43 b 12 2,13 a 24 0,70 c

63 Brassia gireoudiana Biyoreaktör Denemesi Dolaşım/gün PLB rejenerasyon oranı Şekil 21. Dolaşım/gün ün Brassia gireoudiana PLB rejenerasyonuna etkisi. 4.4 Thidiazuron (TDZ) Denemeleri Thidiazuronun (TDZ) Phalaenopsis PLB rejenerasyonu Üzerine Etkisi Bu denemede sitokinin oksidaz enzimi inhibitörü olan thidiazuronun (Hare ve Staden, 1994) rejenerasyon üzerine etkisi araştırılmıştır. Yapılan varyans analizinde p seviyesinde etki önemli çıkmıştır. Çizelge 16. Phalaenopsis te TDZ rejenerasyonunun Duncan sıralaması TDZ Dozu (mg/l) PLB rejenerasyon oranı Sıralama 0 0,088 cd 0,1 0,870 a 0,2 0,954 a 0,3 0,206 bc 0,4 0,268 b 0,5 0,016 d

64 47 1,2 Phalaenopsis'te Thidiazuronun rejenerasyon etkinliği 1 0,8 0,6 0,4 0, TDZ Dozu (mg/l) PLB rejenerasyon oranı Şekil 22. Thidiazuron un Phalaenopsis rejenerasyonu üzerine etkisi. Yapılan Duncan sıralamasında (Çizelge 16 ve Şekil 21), 0.2 ve 0.1 mg/l en iyi sonucu vermiştir. Bunu sırasıyla 0.4 mg/l, 0.3 mg/l, 0.0 mg/l ve 0.5 mg/l izlemiştir. 0.5 mg/l şahit dozun altında bir sonuç verdiği için zehirli doz olarak nitelenebilir. Kuadratik ve kübik etki önemli bulunmuştur Thidiazuron un Brassia gireoudiana Protokormlarının Artışı Üzerine Etkileri Brassia gireoudiana PLB lerinde TDZ uygulaması istatistik açıdan (p 0.001) önemli bulunmuştur (Çizelge 17). Kuadratik ve kübik etki de önemli bulunmuştur.

65 48 Çizelge 17. Brassia gireoudiana TDZ Duncan sıralaması TDZ mg/l PLB rejenerasyon oranı Sıralama 0 2,05 d 0,1 6,07 a 0,2 4,42 b 0,3 5,91 a 0,4 3,33 c 7 6 Brassia gireoudiana - TDZ etkinliği 5,91 6, ,42 3,33 2,05 0,4 0 0,2 0,3 0, TDZ mg/l PLB rejenerasyon oranı Şekil 23. Brassia gireoudiana PLB lerine TDZ etkisi. Yapılan Duncan sıralamasında 0.1mg/l ve 0.3 mg/l thidiazuron (TDZ) dozu en iyi sonucu vermiştir. 0.2 mg/l 2. sırada, 0.4 mg/l 3. sırada, kontrol ise 4. sırada yer almıştır (Şekil 22). 4.5 Ultrasonun Rejenerasyon Üzerine Etkisi Cymbidium Ultrason Denemeleri Duncan karşılaştırmasında (Çizelge 18 ve Şekil 23), ultrason uygulanmadığında en iyi rejenerasyon sağlayan TDZ dozu 0.1mg/l ve 0.2mg/l bulunmuştur. TDZ uygulanmadığında en iyi rejenerasyon

66 49 sağlayan ultrason süresi 2 dakika bulunmuştur. İnteraksiyon durumundaysa, 0.4mg/l ve 1 dakika ultrason uygulaması en iyi sonucu vermiştir (eksplant başına 16.4 PLB rejenerasyon). Bunu 0.1mg/l TDZ ve 0.5 dakika (10.11 PLB/eksplant), 0.2mg/l TDZ ve 0.5 dakika (8.53 PLB/eksplant), 0.1mg/l TDZ ve 2 dakika (8.43 PLB/eksplant) izlemiştir. Çizelge 18. Cymbidium da TDZ, dakika ve interaksiyon Duncan karşılaştırması TDZ mg/l Dakika 0 0,5 1 2 ort 0 1,2 2,51 2,78 3,11 2,4 e 0,1 5,09 10,11 3,5 8,43 6,78 d 0,2 5,53 8,53 4,52 4,22 5,7 c 0,3 3,48 5,68 2,18 5,35 4,17 b 0,4 3,62 7,43 16,4 5,97 8,36 a ort, 3,78 d 6,85 a 5,88 b 5,42 c 5,48 Cymbidium da uygulanan ultrason süresi, TDZ dozları ve interaksiyonları yapılan varyans analizinde (p 0.001) önemli bulunmuştur.

67 50 PLB artışı Cymbidium TDZ-Ultrason etkileşmesi 0TDZ 0.1TDZ 0.2TDZ 0.3TDZ 0.4TDZ 0dak 0.5 dak 1dak 2dak Şekil 24. Cymbidium PLB lerinde TDZ ultrason etkileşimi Phalaenopsis Ultrason denemeleri Phalaenopsis in vitro eksplantlarda uygulanan ultrason (Şekil 24), TDZ dozları ve interaksiyonları, yapılan varyans analizinde önemli bulunmuştur (p 0.001). Şekil 25. Ultrason sonrası rejenerasyon.

68 51 Çizelge 19. Duncan karşılaştırması Phalaenopsis ultrason ve TDZ uygulaması Dakika 0 0,5 1 2 ort 0 0,29 0,16 1,50 0,14 0,52 d TDZ 0,1 0,90 3,63 16,77 6,82 7,03 a 0,2 0,74 5,06 5,75 9,92 5,37 b mg/l 0,3 5,67 3,46 4,00 3,58 4,18 c 0,4 6,93 0,22 6,48 2,97 4,15 c ort, 2,91 c 2,50 d 6,90 a 4,69 b 4,25 Duncan karşılaştırmasında (Çizelge 19), ultrason uygulanmadığında 6.93 PLB/eksplant oranıyla 0.4mg/lTDZve5.67PLB/eksplantoranıyla 0.3mg/l TDZ en iyi sonucu vermiştir. Sıfır TDZ dozunda ise 1.5 PLB/eksplant oranıyla 1 dakika uygulaması en iyi sonucu vermiştir. PLB miktarı 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Phalaenopsis TDZ - Ultrason Etkileşimi 0 dak 0.5 dak 1 dak 2 dak 0TDZ 0.1 TDZ 0.2 TDZ 0.3 TDZ 0.4 TDZ Şekil 26. Phalaenopsis protokorm benzeri yapılarında TDZ ultrason etkileşimi.

69 52 İnteraksiyon durumunda, PLB/eksplant oranıyla 0.1mg/l TDZ ve 1 dakika ultrason uygulaması en iyi sonucu vermiştir. Bunu 9.92 PLB/eksplant oranıyla 0.2mg/l TDZ ve 2 dakika ultrason uygulaması mg/l TDZ ve 2 dakika ultrason uygulaması 3. sırada izlemiştir (Şekil 25) Cymbidiella pardalina da köklendirme denmesi Cymbidiella pardalina orkide türünde, IBA çözeltisine kısa süre batırılan in vitro bitkilerle kurduğumuz köklendirme istatistik açıdan (p 0.001) önemli bulunmuştur. Çizelge 20. Cymbidiella pardalina da köklenme Duncan sıralaması IBA Kök % Ortalaması Sıralama c b a a Duncan sıralamasında (Çizelge 20), en iyi sonucu 100 ve 1000 mg/l IBA çözeltisi vermiştir. 10 mg/l ikinci sırada yer almıştır. Şahit ise sıfır köklenme ile sonuncu olmuştur.

70 Çiçeklendirme Denemeleri In vitro çiçeklenme, 2006 yılı Haziran ayında oluşan maya enfeksiyonundan sağlam kalan bitkilerle kurulmuştur. 20 kavanozdan oluşan Phalaenopsis çiçeklendirme çalışmasında 4 kavanozda çiçeklenme başlangıcı olmuştur (Şekil 26 ). Şekil 27. Phalaenopsis in doku kültüründe çiçeklenmesi. Ancak, kültür odasındaki sıcaklığın, Ağustos ayında, dört gün süreyle klimanın devre dışı kalması sonucunda 30 C nin üzerine çıkması nedeniyle çiçek sapı oluşumları kurumuştur. Bu durum Blanchard et al, (2007) uygundur. Cymbidium bitkilerinde ise, gece 10 C, gündüz 22 C diurnal koşulu gerçekleştirilemediği için,in vitro çiçeklenme sağlanamamıştır. Bunun

71 54 dışında, bölüm süs bitkileri serasına Haziran ve Ekim aylarında aktarılan Cymbidium fideleri, temmuz-ağustos ayı yüksek sıcaklarından ve aralıkocak ayı düşük sıcaklarından sera iklimlendirmesinin yetersiz ve eksik olmasından dolayı ölmüştür. Bu iki tür için de, elimizde değerlendirebileceğimiz veri bulunmamaktadır Metanol Denemesi Sonuçları Phalaenopsis ve Cymbidium da doku kültüründe, değişken metanol (US patent) dozunun (% dozlarda) sabit thidiazuron konsantrasyonu ile bitkilerin üzerine olan etkisi araştırıldı. Ortam, azot konsantrasyonu MS ortamının 1/5 i olan, 170mg/l Na 2 HPO 4 ilave edilmiştir, geriye kalan tuz konsantrasyonu açısında ½MS ortamı içeriğine sahiptir ve sabit 40g/l şeker içermektedir. %0.5 lik dozda en az olmak üzere bütün metanol dozlarında bitkiler zarar görmüştür. Zarar şekli, yapraklarda kısmen veya tamamen kloroz ve yaprak üzerinde oluşan ondüleli şekiller tarzında bozukluklardır. Cymbidium ve Phalaenopsis bitkileri yapraklarının büyük bir bölümünü kaybetmiştir (Phalaenopsis bitkileri daha fazla olmak üzere). Sağlam kalan Phalaenopsis yapraklarında kalınlaşma gözlenmiştir (Şekil 27).

72 55 Şekil 28. Çeşitli metanol dozlarının Phalaenopsis ve Cymbidium üzerine etkileri. 4.6 Tohum Çimlendirme Denemeleri Dezenfeksiyon Denemeleri Şekil 29. Orchis italica tohumlarında TTC canlılık testi.

73 56 Denemeler Orchis italica tohumlarında gerçekleştirilmiştir. Tetrazolium testi sonucu sayımında, yalnızca hipoklorit + 3kez durulama uygulamasında canlılık % 89 iken, %3 lük Hidrojen peroksit + 3kez durulamada canlılık % 97, % 0.2 lik Benzalkonyum klorür uygulamasında canlılık % 97 bulunmuştur (Şekil 28) Tohum Ultrason Denemeleri Orchis italica Terrestrial orkide tohumları tropik orkide tohumları gibi kolay çimlenmemektedir (Miyoshi and Mii, 1988). Tohum testası sıvı ve dolayısı ile de besin maddesi geçişini engellemektedir. Tohum testasını ultra ses ile çatlatmak ya da tamamen kaldırmak mümkündür. Şekil 30. Dört dakika ultrason uygulaması sonunda testası tamamen uzaklaştırılmış embriyolar.

74 57 Ultrason işleminden sonra tohumların tüpün dip kısmına çöktüğü gözlenmiştir. Dört dakika uygulaması mikroskop altında gözlendiğinde tohum testalarının tamamen uzaklaştığı gözlenmiştir (Şekil 30). Tohumlar ekildikten 15 gün sonra kontrol edilmiştir. Rizoid oluşturma çimlenme başlangıcı olarak kabul edilmiştir (Şekil 31). Şekil 31. Rizoid oluşumu ve çimlenme başlangıcı. Çimlenmeden 1 ay sonra, embriyolardan çıkan rizoidler iyice belirginleşmeye başlamıştır (Şekil 32).

75 58 a b Şekil 32. Çimlenmeden 1 ay sonra ultrason uygulanmış (a) ve uygulanmamış (b) tohumların durumları. Çizelge 21. Sadece hipoklorit ve hipoklorit + ultrason uygulamalarının karşılaştırılması. Hipoklorit + Kontrol Ultrason (4 dakika uygulaması) Ekilen Tohum Sayısı Çimlenen Tohum Çimlenmeyen tohum Çimlenme % si Etiole olan tohum Çimlenme Süresi 90 gün 15 gün Tohumlar, uygulamalardaki çimlenme oranlarına göre sıralanmıştır (Çizelge 21).

76 59 Embriyolar 2 aylık olduklarında ilk yapraklarını oluşturmaya başlamıştır verizoidyoğunluğu oldukça artmıştır (Şekil 33). Bitkiler 7 aylık olduklarında dış ortama aktarılmaya hazır hale gelmiştir (Şekil 34). Şekil 33. İki aylık embriyolar ve ilk yapraklarınınoluşumu. Şekil 34. Bitkilerin 7 aylık durumları.

77 Ophrys tenthredinifera Ophrys tendridinifera da yalnızca ultrason uygulaması ile çimlenme gerçekleşmemiştir. 18kV luk kısa süreli doğru akım uygulaması sonucunda, üç tekerrürün ortalaması %5.3 oranında bir tohum çimlenmesi sağlanmıştır (Çizelge22veŞekil 35). Çizelge 22. Ophrys tenthredinifera daultrasonveelektrikuygulaması Ophrys tendridinifera Yalnızca 4 dakika Ultrason Ultrason + 2dakika 50kHz kare dalga Ultrason + 5 şok Ekilen Tohum Sayısı Çimlenen Tohum Çimlenmeyen tohum Çimlenme % si Etiole olan tohum Çimlenme Süresi gün

78 61 Şekil 35. Ophrys tenthredinifera protokormlardan ilk yapraklarınoluşumu. 4.7 Tropik Orkide Tohumu Çimlendirmeleri Kendi elimizde bulunan melez Phalaenopsis bitkilerinin tozlaştırılması ile elde edilen tohumlar, çok taze olmaları nedeniyle %99 oranında çimlenmişlerdir (Şekil 36 ab). Küf gelişimini önleyici olarak ortama ilave ettiğimiz 5 mg/l benomil, çimlenmeyi çok büyük oranda engellemiştir. Orchid Seed Bank Project, Arizona, ABD den temin edilen Phalaenopsis cornu-cevi, Phalaenopsis amabilis (4n), Cymbidiella pardalina, Dendrobium speciosum, Dendrobium nobile var Cooksianum tohum miktarları oldukça az oldukları için yalnızca çimlendirme yapılmıştır. Phalaenopsis cornu-cevi % 38, Phalaenopsis amabilis (4n) %40 (Şekil 37b), Cymbidiella rhodchila %41.5 (Şekil 37a), Dendrobium speciosum %80, Dendrobium nobile var Cooksianum % 70 çimlenme göstermiştir.

79 62 a b Şekil 36. Melez Phalaenopsis tohumlarının in vitro da çimlenme durumu. a. Benomil uygulanmış, b. Uygulanmamış a b Şekil 37. Ekimden 15 gün sonra Cymbidiella pardalina (a) ve Phalaenopsis amabilis 4N (b) tohumlarında çimlenme durumları.