DOMATES BAKTERĐYEL KANSER HASTALIĞI

Transkript

1 DOMATES BAKTERĐYEL KANSER HASTALIĞI (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) NA KARŞI DAYANIKLI DOMATES BĐTKĐLERĐNDE GENETĐK KALITIMIN BELĐRLENMESĐ Demet ÇELĐK Yüksek Lisans Tezi Bitki Koruma Anabilim Dalı Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ 2011 Her hakkı saklıdır

2 T.C. GAZĐOSMANPAŞA ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ BĐTKĐ KORUMA ANABĐLĐM DALI YÜKSEK LĐSANS TEZĐ DOMATES BAKTERĐYEL KANSER HASTALIĞI (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) NA KARŞI DAYANIKLI DOMATES BĐTKĐLERĐNDE GENETĐK KALITIMIN BELĐRLENMESĐ DEMET ÇELĐK TOKAT 2011 Her hakkı saklıdır

3

4

5 ÖZET Yüksek Lisans Tezi DOMATESTE BAKTERĐYEL KANSER HASTALIĞI (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) NA KARŞI DAYANIKLI DOMATES BĐTKĐLERĐNDE GENETĐK KALITIMIN BELĐRLENMESĐ Demet ÇELĐK Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı Danışman: Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ Domates, toplam ekiliş alanı, üretimi ve ticareti açıdan Türkiye de yaş sebze grubunun en önemli ürünlerinden birisini oluşturmaktadır. Domateslerde yetiştiricilik sırasında fungal ve viral hastalık etmenlerinin yanı sıra pek çok bakteriyel etmende önemli ürün kayıplarına neden olmaktadır. Bu bakteriyel hastalıklardan biri olan Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al., in (Cmm) neden olduğu bakteriyel kanser hastalığıdır. Bu hastalığın mücadelesinde dayanıklı çeşit kullanımı en etkin, ekonomik, çevre dostu ve insan sağlığını koruyan bir yöntem olarak görülmektedir. Bu hastalığa dayanıklı kültür domates çeşitleri bulunmamakta olup, bakteriyel kanser hastalığına karşı dayanıklılık kaynağı domatesin yabani akrabalarıdır. Çalışmada kültür domatesinin NCEBR3 homozigot hattı, bu domatesin kimyasal mutasyonu ile oluşturalan M3 mutant domatesleri ve yabani domates LA 1579 hattının Cmm nin en virulent ırkı olan Cmm2 ye karşı patojenisite testlerinde reaksiyonları belirlenmiştir. Testler sonucunda dayanıklı M3 ( ) hattı ile orta derecede dayanıklı LA 1579 ( ) hattı melezlenerek F 1 populasyonu oluşturulmuştur. Yapılan moleküler çalışmalarda ebeveynler arasında polimorfizmi ortaya koyabilmek için 11 adet Simple Sequence Repeats (SSR) markörü kullanılmış olup 8 adet SSR markörü NCEBR3, M3 ve LA 1579 arasında polimorfik bulunmuştur. Test edilen markörlerin ebeveynler üzerinde polimorfizm oranı %73 olarak ortaya konmuştur. 2011, 76 sayfa Anahtar Kelimeler: Domates, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Bakteriyel kanser hastalığı, SSR markörleri i

6 ABSTRACT Master of Science Thesis IDENTIFICATION OF GENETIC INHERITANCE OF RESISTANT TOMATOES AGAINST BACTERIAL CANKER (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) DISEASE By Demet ÇELĐK Gaziosmanpaşa University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Plant Protection Supervisor: Asst. Prof. Dr. Özer ÇALIŞ Tomato is one of the most important product in terms of area, production and trade of fresh vegetable in Turkey. During the tomato production, several fungal and viral pathogens cause diseases, additionally, bacterial diseases result significant crop losses. One of the bacterial diseases is bacterial wilt and canker disease caused by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al., (Cmm). The resistant tomato plants are able to use for controlling the bacterial canker disease because the method is the most effective, economical, environmental, and human frendly. There is no disease-resistant tomato cultivars; however, resistant plants are present in wild tomato accessions. In this study, we used original tomato cultivar NCEBR3, mutant M3 and wild LA 1579 tomato lines to identify resistance reactions to the most virulent isolate (Cmm2) of bacterial canker disease in pathogenicity tests. The pathogenicity test results revaled that resistant M3 ( ) plants and intermediate resistant LA1579 ( ) plants where the two lines were crossed to produce F 1 populations. Moleculer studies conducted to determine polimorphism between the parents, 11 Simple Sequence Repeats (SSR) markers were analysed in PCR reactions. The analyses shown that 6 SSR markers were polymorphic between NCEBR3, M3 and LA 1579 plants. Among tested markers, 73% of them gave polymorphism to use in future studies. 2011, 76 pages Key Words: Tomato, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Bacterial Canker Disease, SSR markers ii

7 ÖNSÖZ Çalışma konumun belirlenmesinde, hazırlanmasında ve yazımında benden hiçbir zaman güler yüzünü, desteğini, ilgisini eksik etmeyen, yapıcı ve yönlendirici fikirleriyle bana her zaman doğru yolu gösteren sayın danışman hocam Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ a sonsuz teşekkürler. Yüksek lisans tez savunmamın jüri üyeleri olan ve değerli fikirleriyle katkıda bulunan sayın hocalarım Doç. Dr. Yusuf YANAR ve Yrd. Doç. Dr. Çetin ÇEKĐÇ e teşekkür ederim. Çalışmalarım sırasında emeği geçen mutlu ve sıkıntılı anlarımın yoldaşları olan değerli arkadaşlarım Arş. Gör. Đbrahim SAYGILI, Zir. Yük. Müh. Zeliha Selcen BAYAZIT a ve Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bitki Koruma Bölümü Öğretim Elemanları, Doktora, Yüksek Lisans ve Lisans öğrencilerine en içten teşekkürlerimi sunarım. Hayatımın her aşamasında olduğu gibi yüksek lisans çalışmalarım esnasında da benden maddi ve manevi desteğini esirgemeyen, zorluklarla savaştıkça hep daha güçlü olacağımı öğreten sevgili annemcim, babamcım ve biricik kardeşim iyi ki varsınız. Sizler benim bu dünyadaki en büyük hazinemsiniz. Girdiğim her yolda beni başarıya odakladınız, her halime katlandınız, destek oldunuz, sabrettiniz size yürekten sonsuz teşekkürler Demet ÇELĐK 06/2011 iii

8 ĐÇĐNDEKĐLER Sayfa ÖZET.. i ABSTRACT... ii ÖNSÖZ... iii ĐÇĐNDEKĐLER.. iv ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ... v TABLOLAR DĐZĐNĐ vii 1. GĐRĐŞ LĐTERATÜR ÖZETLERĐ 8 3. MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Çalışmada Kullanılan Fitopatojen Bakteriler Çalışmada Kullanılan Test Bitkileri Kullanılan Çözeltilerin ve Besi yerlerinin Hazırlanışı Yöntem Bitkilerin Yetiştirilmesi Bakteriyel Hastalık Etmeni Cmm2 nin GYCA Besi Ortamında Geliştirilmesi Patojenisite Testi Melez Bitkilerin Oluşturulması Bitkilerden DNA Đzolasyonu PCR Analizleri Agarose Jel Elektroforezi Moleküler Markörler BULGULAR Patojeniste Test Sonuçları Moleküler Analiz Sonuçları SONUÇLAR ve TARTIŞMA KAYNAKLAR ÖZGEÇMĐŞ iv

9 ŞEKĐLLER LĐSTESĐ Sayfa Şekil 2.1. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu sistemik enfeksiyon sonucu oluşan solgunluk görünümü 9 Şekil 2.2. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu yaprak yanıklığı.. 10 Şekil 2.3. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu iletim demetlerinde ki renklenme belirtileri.. 10 Şekil 2.4. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu lokalize enfeksiyon sonucu oluşan lokal yaprak yanıklıkları. 11 Şekil 3.1. NCEBR3, M3 ve LA1579 hattına ait domates fidelerinin 7 no lu saksılara aktarıldıktan sonra Biyoteknoloji serasında gelişmeleri 36 Şekil 3.2. Bakteriyel etmen Cmm2 nin GYCA besi ortamındaki gelişimi. 37 Şekil 3.3. Steril şartlarda besi ortamında geliştirilen Cmm2 bakteri izolatlarının steril kürdan yardımıyla domates fidelerinin gövdelerine batırılarak inokulasyonun gerçekleştirilmesi Şekil 3.4. Đnokule grubu bitkilerdeki bakteriyel etmenin gelişimi Şekil 3.5. Polen ana hücrelerinin dişicik borusuna zarar vermeyecek şekilde pens yardımıyla uzaklaştırılması Şekil 3.6. Yalnız bırakılan dişicik borusuna hassas ebeveynin polenlerinin değdirilmesi. Şekil 3.7. Melez meyvelerin gelişimi Şekil 3.8. PCR amplifikasyonu sonunda elde edilen PCR ürünlerinin loading dye boyası eklendikten sonra (A) %1.5 luk agarose jele yüklenmesi (B) ve yükleme sonrası jeldeki görünümü (C). Şekil 3.9. PCR ürünlerinin 100 V luk akıma bağlı %1.5 luk agarose jelde saat süreli koşturulması Şekil Koşma işleminden sonra agarose jel içerisindeki DNA bantlarının Bio Capt programı kullanılarak görüntülenmesi v

10 ŞEKĐLLER LĐSTESĐ Sayfa Şekil 4.1. NCEBR3 bitkisinin patojenisite testinden 28 gün sonraki durumu ve kontrol bitkisiyle karşılaştırılması... Şekil 4.2. M3 bitkisinin patojenisite testinden 28 gün sonraki durumu ve kontrol bitkisiyle karşılaştırılması.. Şekil 4.3. LA 1579 bitkisinin patojenisite testinden 14 ve 28 gün sonraki durumu Şekil 4.4. Çalışmada kullanılan SSR38, SSR70 ve SSR349 markörleri kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonun görünümü. SSR70 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 119 bp lik band verirken LA1579 ile 103 bp lik bant oluşturmuştur. SSR349 ve SSR38 markörleri test edilen DNA lar arasında bir ploymorfizm oluşmamıştır. Çalışmada Ladder olarak 50 bp lik moleküler size markör ve Negatif kontrol olarakta distile steril su kullanılmıştır. (1: M3, 2: LA 1579, 3: NCEBR3).. Şekil 4.5. Çalışmada kullanılan SSR47, TOM184, SSR13, TOM210 ve SSR70 markörleri kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonun görünümü. SSR47 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 189 bp lik band verirken LA1579 ile 193 bp lik bant oluşturmuştur. TOM210 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 216 bp lik band verirken LA1579 ile 204 bp lik bant oluşturmuştur. SSR70 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 119 bp lik band verirken LA1579 ile 103 bp lik bant oluşturmuştur. TOM184 primeri NCEBR3 ve M3 DNA larıyla amplifikasyon oluşturmamıştır. SSR13 markörü test edilen DNA lar arasında bir polymorfizm vermemiştir. Çalışmada 100 bp lık Ladder kullanılmıştır (1: LA 1579, 2: M3, 3: NCEBR3) Şekil 4.6. Çalışmada kullanılan SSR333, SSR45, SSR638 ve SSR306 markörleri kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonun görünümü. SSR333 primeri NCEBR3 ve M3 ile 201 bp lik bant ve LA1579 ile 223 bp lik bant oluşturmuştur. SSR306 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 255 bp lik bant verirken LA1579 ile 273 bp lik bant oluşturmuştur. SSR45 primeri NCEBR3 ve M3 mutantı ile 140 bp lik band verirken LA1579 ile 149 bp lik bant oluşturmuştur. SSR 638 markörü M3 mutantı ile 157 bp lik bant veriken LA1579 ile 161 bp lik bant oluşturmuştur. Çalışmada 50bp lık Ladder ve negatif kontrol olarak distile steril su kullanılmıştır. (1: NCEBR3, 2: M3, 3: LA 1579) vi

11 TABLOLAR LĐSTESĐ Sayfa Tablo 1.1. Dünya Sebze Üretiminde Önemli Ülkeler ve Dünya Üretimindeki Payları 2 Tablo 1.2. Dünya domates üretimi yapan ülkeler ve üretim miktarları 4 Tablo 3.1. Bakteriyel kanser ve solgunluk (Clavibacter michiganensis subsp. micgiganensis) hastalığına karsı Amerikan Ulusal Germplasm Sisteminde ( taranarak laboratuarımıza getirilen tohumlar.. Tablo 3.2. NCEBR3, M3 ve LA 1579 bitkileri arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada kullanılan SSR markörleri. Tablo 4.1. Çalışmada kullanılan NCEBR3, M3 ve LA 1579 domates hatlarının Cmm2 ile yapılan patojenisite test sonuçları vii

12 1 1. GĐRĐŞ Asya ile Avrupa kıtalarının birleştiği yerde ve Akdeniz ile Karadeniz arasında yer alan Türkiye asırlar boyunca birçok uygarlıklara ev sahipliği yapmış; çok önemli bir tarım, ticaret ve ulaşım merkezi olmuştur. Türkiye coğrafi yapısından gelen bu avantajlar sayesinde topraklarında güzel bir iklim çeşitliliği bulunan bir ülkedir ve bu çeşitlilik bitkisel üretimine de yansımaktadır. Anadolu da hemen hemen tüm ılıman iklim bahçe ürünleri ile subtropik ürünlerin önemli kısmı ekonomik bir şekilde üretilmektedir. Ürün çeşitliliği ve ekonomik avantajları sayesinde, yağlı tohumlar ve bazı tropik meyveler hariç tutulduğunda, Türkiye temel bitkisel ürünlerde kendisine yeten bir ülke konumunda olup; birçok üründe de üretim fazlasına sahiptir (Abak, 2006). Bahçe bitkileri yetiştiriciliğinde dünyada önemli bir konuma sahip olan Türkiye; birçok bitki türü açısından gen merkezi konumunda olması nedeniyle büyük bir tür ve çeşit zenginliğine sahiptir (Şeniz ve ark., 2005). Bitkisel çeşitlilik içerisinde sebzeler özellikle dengeli beslenmede insanlar için alınması gerekli olan besin öğeleri olarak oldukça büyük önem taşırlar (Balkaya, 1999). Dünya nüfusunun yaklaşık % i az gelişmiş ülkelerde ve bölgelerde yaşamakta ve bu insanlar genellikle gıda olarak bitkilerle yaşamlarını sürdürmektedirler. Bugün dünyada hem kültüre alınmış hem de doğadan toplanarak değerlendirilen sebzeler içerdikleri protein, karbonhidrat, yağ, lif, vitamin, antioksidan ve mineral maddeler bakımından insan beslenmesinde önemli bir etkiye sahiptirler. Sebze olarak değerlendirilen bitkilerin toprak üstü ve toprak altı kısımları değişik şekillerde çiğ veya pişmiş olarak kullanılmaktadır (Eşiyok, 2005). Dünya içersinde küçük dünya olarak tanımlanan Türkiye, iklim özellikleri ve tabiat örtüsü bakımından bu tanımlamayı gerçekten hak eden bir konumdadır. Çünkü ülkemizde mevcut bulunan hemen hemen bütün iklim özelliklerinin bir arada görülmesi mümkündür. Dolayısıyla her mevsimde birçok sebzenin yetiştirilme kullanılma imkanı ülkemiz koşullarında mevcuttur (Şeniz, 1993). Ülkemizde 1 milyon ha alan üzerinde yaklaşık 25.7 milyon ton kadar sebze üretilmektedir ve bunun 9.8 milyon tonunu domates oluşturmaktadır (Tablo 1.1) (Anonim, 2011a). Ülkemizde toplam domates

13 2 üretiminin yarısına yakınını sofralık domates, diğer yarısını da sanayi tipi domates oluşturmaktadır (Alan ve ark., 1992). Tablo Dünya Sebze Üretiminde Önemli Ülkeler ve Dünya Üretimindeki Payları (FAO, 2008). Ekiliş Alanı Ekilişte pay Üretimde pay Ülkeler Üretim (ton) (ha) (%) (%) Çin , ,7 Hindistan , ,5 ABD , ,3 Türkiye , ,8 Rusya Fed , ,8 Mısır , ,8 Đran , ,8 Đtalya , ,5 Đspanya , ,4 Diğerleri , ,4 Toplam Anavatanı Güney Amerika nın orta ve güney kısımları olduğu bilinen domates (Lycopersicum esculentum L.) dünyada tarımı en fazla yapılan sebzelerden biridir. Kültür domatesi Amerika dan Avrupa ya, oradan da Afrika ya geçmiştir. Bugün kültürü yapılmış olan domateslerin L. hirsitum, L. peruvianum ve L. pimpinellifolium dan faydalanılarak geliştirildiği, ana materyalin ise L. peruvianum olduğu bilinmektedir (Vural ve ark., 2000). Domatesin Orta Amerika ve Güney Meksika da çok sayıda tür ve çeşidi bulunmaktadır. Amerika kıtasında, ekvatorun 30 o kuzey enlem ve 30 o güney enlem sınırları arasında kalan bölgeler domatesin anavatanı kapsamı içerisinde kalmakta ve Güney Amerika nın batı kıyılarının domatesin anavatanının merkezi olduğu bildirilmektedir (Günay, 2005). Peru da Maya uygarlığı zamanında adı xtomatl veya tomatl olarak geçen domates, orijini olan Peru, Bolivya ve Ekvator dan 16. yüzyılda Đspanyollar tarafından Avrupa ya getirilerek yetiştirilmeye başlanmıştır (Küçüker, 1994). Avrupa da uzun süre zehirlidir diye çekinilen domates daha sonra kültür bitkisi olarak kabul görmüştür (Ekinci, 1972).

14 3 Anadolu ya 150 yıl önce getirilmiş olup günümüzde yaygın olarak yetiştirilmekte ve sevilerek tüketilmektedir (Yazgan ve Fidan, 1996). Oldukça kuvvetli kök sistemine sahip olan domates, dallanmış kazık kökler ve buradan çıkmış sekonder kökler şeklinde gelişir. Yapraklar bileşik şekilde ve tüylerle kaplıdır. Kendine döllenen bir bitki olup, toprak isteği yönünden çok seçici değildir. Besin maddelerince zengin her toprakta başarı ile yetiştirilir (Vural ve ark., 2000). Domates, bugün beslenme programlarında önemli yeri olan bir sebzedir. Domatesin 100 gr ında 0.55 mg vitamin B6, 1700 IU vitamin A ve 0,10 mg vitamin B1 ile 21 mg C vitamini bulunmaktadır. Bu değerler bir yetişkinin günde 4-5 domates yemesi halinde günlük vitamin gereksinimini karşılayabileceği gerçeğini ortaya koymaktadır (Sevgican, 1999). Kalori değerinin düşük olması taze domatesi iyi bir rejim besini haline getirmiştir. Domatesin beyin hücrelerinin yaşlanmasını yavaşlattığı, bağışıklık sistemini güçlendirdiği, kireçlenmeyi önlediği, saçları ve cildi güzelleştirdiği, kalp hastalıkları ve kansere karşı koruyucu etkisinin olduğu yapılan çalışmalarla ortaya konmuştur (Sevgican, 1999). Domates, dünyada en çok üretilen, tüketilen ve ticarete konu olan tarım ürünlerinin basında gelmesi, insan beslenmesinde vazgeçilmez ürünlerden olması ve gıda sanayinde dondurulmuş, konserve, salça, ketçap, tursu gibi çok çeşitli kullanım alanlarına sahip olması nedeniyle önemli sebzelerin basında gelmektedir. Domates dünyada birçok ülkede yetiştirilmekle birlikte, Türkiye uygun iklim koşulları nedeniyle üretiminde önemli ülkelerden biridir (Anonim 2011b). Domates, Doğu Anadolu nun iklimsel olarak uygun olmayan kısımları hariç, Türkiye nin hemen hemen her yerinde, sera ve açık tarla koşullarında yetiştirilmektedir. Meyve şekli (yuvarlak, basık, konik, armut şeklinde vs.) ve bitki görünüşü (cüce veya uzun) bakımından farklılık gösteren çeşitli varyetelerinin kültürü yapılmaktadır (Davis, 1978). Ülkemizde hem sofralık hem de sanayiye yönelik domates üretimi yapılmaktadır. Ülkemizin her bölgesinde üretilmekle birlikte, sofralık domates Adana, Mersin, Antakya, Antalya, Đzmir, Çanakkale, Konya ve Tokat ta yoğun olarak üretilirken,

15 4 turfanda üretim genellikle örtü altında Akdeniz kıyısında Mersin ve Antalya illerinde yapılmaktadır. Sanayi için domates üretimi Marmara ve Ege bölgelerinde Balıkesir, Bursa, Manisa ve Çanakkale illerinde yapılmaktadır (Bayrak ve Kaya, 2009). Ülkemizin yaş meyve sebze ihracatında ilk sırada yer alan domates, yurt dışına hem taze sofralık, hem de işlenmiş halde ihraç edilmektedir. Akdeniz Đhracatçılar Birliği nin 2009 raporuna göre 2007 yılında taze domates ihracatı yapan ülkeler arasında Türkiye ton ile Meksika, Đspanya, Hollanda ve Ürdün den sonra 5. sırada yer almıştır. Ülkemiz domates salçası ve kurutulmuş domates ihracatında lider ülkeler arasındadır (Bayrak ve Kaya, 2009). Türkiye kendi başına her türlü tarımsal üretimi gerçekleştiren, kendisi için yeterli tarımsal ürünleri üreten ve ürettiği tarımsal ürünlerden yurt dışına ihracat edebilen Dünyanın sayılı tarım ülkelerinden biridir (DPT, 2009). Ülkemiz Dünya domates üretiminde ton üretim ile en çok domates üretimi yapan ülkeler olan Çin ve A.B.D den sonra içerisinde 3. sırada yer almaktadır (Tablo 1.2) (FAO, 2008). Đçerisinde bulunduğumuz Tokat bölgesi ise yıllara göre değişmekle birlikte bin tonluk domates üretimi ile Türkiye'nin domates üretiminin %6 sını karşılamaktadır (Anonymous, 2009). Tablo Dünya domates üretimi yapan ülkeler ve üretim miktarları (FAO, 2008). Ülke Üretim (ton) Çin USA Türkiye Hindistan Đtalya Đran Mısır Brezilya Đspanya Meksika

16 5 Tokat ili Türkiye de domates tarımı yapılan illerden en önemlilerden birini oluşturmaktadır yılında Türkiye domates üretiminde yaklaşık %7 lik, Dünya domates üretiminde yaklaşık %0.5 lik sahip olan ilimizde ha alanda yaklaşık 510 bin ton üretim gerçekleştirilmiştir (Anonim, 2007). Özellikle 1994 yılından itibaren başlatılan çalışmalarda dış Pazar isteklerine uygun çeşitlerin üreticilere kazandırılmış olması günümüzde Tokat ilinde gerçekleştirilen üretimi elde edilen verim miktarını sonucunda Dünya ve Türkiye ortalamasının üzerine çıkarmıştır. Ilık ve sıcak iklim meyvesi olan domates, sıcaklık değerleri açısından minimum 16 ºC, maksimum 35 ºC de normal gelişimini sürdürebilir. Tokat ın sahip olduğu sıcaklık ve yağış değerleri domates tarımına oldukça müsaittir. Tokat ın uygun doğal koşulları hemen her ilçede bu sebzenin üretimine olanak sağlamış olsa da pazarla sorununun çözüldüğü, sulanabilen ovalık alanlarda yoğun bir üretim gerçekleştirilmektedir (Yürüdür ve Akkurt, 2008) yılında ha olan domates üretim alanlarının yaklaşık %97 si ve üretiminin yaklaşık %99 u Merkez, Erbaa, Niksar, Pazar, Turhal ilçeleri tarafından karşılanmıştır. Türkiye de domates üretiminin % 1,5-2,0 si yurt dışına ihraç edilmekte, geri kalan bölüm ise yurt içinde kullanılmaktadır. Yurtiçi kullanımında taze tüketim oranı % civarında bulunmaktadır. Üretimin yaklaşık 1/4 lük bölümü ise işleme sanayinde salça, konserve, doğranmış domates gibi çeşitli ürünlere işlenmektedir (Anonim, 2011c). Gerek örtü altı gerekse tarla koşullarında domates üretiminde ekonomik kayıplara neden olan faktörlerin başında bitki hastalıkları gelmektedir. Domateste fungal ve viral hastalık etmenlerinin yanı sıra pek çok bakteriyel etmende önemli ürün kayıplarına neden olmaktadır (Karaca ve Saygılı, 1982). Domateste hastalık oluşturan bakteriler Pseudomonas, Xanthomonas, Clavibacter, Erwinia, Agrobacterium ve Ralstonia cinsleri içerisinde yer almaktadır (Üstün, 2008). Bu bakteriyel hastalıklardan biride Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. in (Cmm) neden olduğu bakteriyel solgunluk hastalığıdır. Bakteriyel solgunluk hastalığı tohum kaynaklı olması nedeniyle savaşımı güç hastalıklardandır (Erkan, 1988). Etmen domates dışında fasulye, bezelye, mısırda da ürün kayıplarına neden olmaktadır. Patojen 1910 yılında A.B.D de ilk rapor edilişinden bu yana tüm Dünya ya yayılmış, tarla ve seradaki

17 6 domateslerde ciddi kayıplara neden olmuştur (Hayward ve Waterson, 1964). Çalışmanın yürütüldüğü Tokat bölgesinde bakteriyel hastalık etmeni Cmm domates üretimi yapılan alanlarda bulunmuş ve domates üretimi yapılan alanların %8 nin bu etmen ile bulaşık olduğu ortaya konmuştur. Bakteriyel Kanser Hastalığı domatesin tohum kaynaklı en önemli hastalıklarındandır. Cmm tarafından oluşturulan, hastalık tablosunda ilk göze çarpan, iletim dokularının bakterilerce işgal edilmesi sonucu oluşan, ilk görünür belirti diyebileceğimiz solgunluktur. Solgunluk gelişmiş bitkilerde yavaş ve dereceli olarak ilerler. Sistemik olarak enfekte olmuş bitkilerde ilk belirti yaşlı yapraklarda görülür. Bu yapraklar solar ve aşağı doğru sarkıp asılı kalır. Bu hastalıkta, bitkinin bir tarafı solduğu halde diğer tarafı sağlıklı görülebilir. Bazı durumlarda aynı yaprak sapına bağlı olan yaprakçıkların bir kısmı solgun gözükürken diğer yaprakçıkların turgorunu koruduğu ve sağlıklı görüldüğü durumlara da rastlanabilir. Etmen meyve de ise ortası kahverengi ve çevresi beyaz bir hale ile çevrili kuş gözü lekeleri olarak bilinen simptomlar gösterir (Özaktan ve Bora, 1991). Bakteriyel etmen köpek üzümü gibi Solanaceae familyası üyelerinde de yaşayabilir. Nem, etmenin bitkiyi hastalandırabilmesi için önemli bir etkendir (Fatmi ve Schaad, 1988). Etmenin farklı yerlerde yaşamını sürdürebilme özelliğinden dolayı mücadelesinde zorluklar yaşanmaktadır. Sertifikalı tohum ve fide kullanımı bakteriyel solgunluk hastalığının mücadelesi için önemlidir. Ancak bu etmenle epifitik olarak bulaşık olan tohumların sertifika alabilme olasılığı bulunmaktadır. Bu şekildeki tohumlar ve yine bu tohumlardan elde edilen fidelerin kullanımı ile hastalık yayılabilmektedir (Chang ve ark., 1992). Ancak uygulanabilirliği kabul edilmiş olan tohum uygulamaları da Cmm e karşı her zaman etkili olmayabilir (Thyr ve ark., 1973). Aynı zamanda kültürel önlemlerin tek balına yetersiz oluşu çiftçileri yoğun olarak kimyasalların kullanımına yöneltmektedir. Bitki hastalıkları ile mücadelede yoğun biçimde kullanılan kimyasalların insan sağlığı ve doğa üzerine olan olumsuz etkilerinin üzerine tüketicilerdeki bilinçlenme ve çevre kirliliğine karşı duyarlılığın artması üreticileri daha az kimyasal kullanmaya

18 7 yönlendirmiştir. Özellikle bakteriyel patojenlerin kimyasallara karşı dayanıklılık oluşturmaları, bunlara karşın bakteriyel solgunluk hastalığına karşı yeterli ve etkili bir mücadele yönteminin olmayışı dayanıklı çeşit kullanımını da kapsayan alternatif yöntemlerin çalışılmasını öncelikli konular haline getirmiştir. Bu projenin amaçları; bakteriyel kanser hastalığına karşı ümitvar olarak bulunan NCEBR3 domates mutantlarının M3 populasyonundaki patojenisite testlerini gerçekleştirmek, orijinal NCEBR3 domates bitkileri, M3 domates mutant bitkileri ile yabani domates bitkisi Solanum pimpinellifolium (LA 1579) bitkileri arasındaki polimorfizmi SSR markörleri ile belirlemek, M3 mutant bitkileri ile yabani S. pimpinellifolium (LA 1579) bitkilerini melezleyerek F 1 popülasyonunu oluşturmaktır. Bu çalışma ile NCEBR3 orijinal ve bunların M3 mutantları ile yakın akrabaları olan S. pimpinellifolium (LA 1579) bitkileri arasındaki genetik kalıtım ortaya konmaya çalışılacaktır.

19 8 2. LĐTERATÜR ÖZETLERĐ 2.1. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al., Hakkında Genel Bilgiler Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis; Prokaryota alemi, Firmicutes bölümü, Thallobacteria sınıfı, Microbacteriaceae familyası, Clavibacter cinsi içerinde yer almakta (Agrios, 2005) ve dünya çapında domates üretimini kısıtlayan en önemli bakteriyel etmenlerden biri olarak bilinmektedir (Saygılı ve ark., 2006). Etmen bakteri, Erwin F. Smith tarafından ilk olarak Bacterium michiganense daha sonra Aplanobacter michiganense olarak isimlendirilmiştir. Đlerleyen zamanlarda Pseudomonas michiganensis, Phytomonas michiganensis ve Mycobacterium michiganensis olarakta isimlendirilmiş, ancak terminolojik isimlendirmenin kabul edilmesiyle yaklaşık 50 yıl Corynebacterium michiganense olarak adlandırılmıştır lerde patojenin hücre duvarı yapısı ile ilgili yeni bilgilere dayanılarak Clavibacter sınıfı içerisinde yeniden sınıflandırma yapılmış ve Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. olarak isimlendirilmiştir (Gleason ve ark., 1993). Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, domates (Solanum lycopersicum Mill.), biber (Capsicum annum L.), patlıcan (Solanum melongena) ve Lycopericium hirsutum, Lycopericium pimpinellifolium gibi bazı Solanaceae familyasına ait türlerde hastalık oluştursa da, domates ekonomik anlamda önemli olduğu tek kültür bitkisidir (Çetinkaya-Yıldız ve Aysan, 2008). Hastalık belirtileri, etmenin bitkiye giriş yoluna göre farklılık göstermektedir. Enfeksiyon tohumdan gelişirse veya yaralar yoluyla patojen direkt iletim demetlerine giriş yapmışsa sistemik enfeksiyondan söz edilir. Sistemik enfeksiyonlar bitkilerde solgunlukla başlar (Şekil 2.1). Tek taraflı solgunluk, renk değişimi ve yanıklık (Şekil 2.2) tipik hastalık belirtileridir. Sistemik enfeksiyonlar fide döneminde meydana gelmişse genç fideler hızla solar, çöker ve ölür. Đlerleyen dönemde ise hasta bitkilerin gövdeleri boyuna kesildiğinde iletim demetlerinde başta sarımsı renklenme daha sonra

20 9 kızılımsı kahverengiye dönen renk değişimi (Şekil 2.3) gözlenir. Solmuş bitkilerin iletim demeti tıkandığından ileri dönemde yapraklara besin ve su taşınması gerçekleşmez bunun sonucunda da yanıklıklar hatta kavrulmuş gibi görünümler ortaya çıkar (Çetinkaya-Yıldız ve Aysan, 2008). Eğer patojen hidatodlar gibi doğal açıklıklar veya tüylerin kırılmasıyla açılan yaralardan bitkiye girdiğinde ise, lokalize olmuş enfeksiyondan söz edilir. Yaprakçıkların kenar nekrozları genellikle lokalize olmuş enfeksiyonların ilk simptomlarıdır (Şekil 2.4). Lokalize olmuş bir enfeksiyon zamanla, iletim demetlerine ilerleyerek uygun koşullar altında sistemik bir enfeksiyonu başlatabilir. Hastalıktan dolayı meydana gelen kayıplar esas olarak bitkilerin solması ve çökmesi ile oluşmakta, domates meyveleri üzerinde KUŞ GÖZÜ lekesi olarak bilinen 3-6 mm çaplı, ortası kahverengi ve çevresi beyaz bir hale ile çevrili yüzeysel simptomlar şeklinde kendini gösteren lekeler de meyvenin pazar değerini düşürmektedir (Çetinkaya-Yıldız ve Aysan, 2008). Şekil Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu sistemik enfeksiyon sonucu oluşan solgunluk görünümü.

21 10 Şekil Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu yaprak yanıklığı Şekil 2.3. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu iletim demetlerinde ki renklenme belirtileri

22 11 Etmen gövde, meyve ve iletim demetlerinde renk değişikliği, gövdede çatlama şeklindeki KANSER lere, bitkinin öz kısmında boşluklar oluşumuna ve sonunda bitkinin ölümüne neden olmaktadır (Özaktan ve Bora, 1991). Yapraktaki belirti genelde yaprakların kenar kısımlarında gözlenir. Hastalığın bu dönemine Yanıklık Dönemi adı verilir. Şekil 2.4. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in neden olduğu lokalize enfeksiyon sonucu oluşan lokal yaprak yanıklıkları Domateste ekonomik zarar meydana getiren bu bakteriyel etmenin inokulum kaynakları, bulaşık toprak, yabancı otlar, hastalıklı bitkiler, hastalıklı bitki artıkları ve özellikle bulaşık tohumlardır (Çetinkaya Yıldız ve Aysan, 2008). Bu hastalıkla mücadelede; hastalıksız tohum kullanımı, fiziksel ve kimyasal tohum uygulamaları (Fatmi ve ark., 1991), koruyucu bakır uygulamaları (Özaktan, 1991), toprak solarizasyonu (Tokgönül, 1998), biyolojik mücadele (Tokgönül ve Çınar, 1999), bitki aktivatörleri (Çetinkaya Yıldız ve Aysan, 2005) ve çinko gübrelemesi (Çakmak ve Aysan, 2009) önerilmektedir. Ancak istenilen düzeyde hastalık önlenememektedir. Mücadelede en etkin ve çevreci yöntem olanak varsa dayanıklı çeşit kullanılmalıdır.

23 C. m. subsp. michiganensis (Smith) Davis et al., in Epidemiyolojisi Đle Đlgili Yapılan Çalışmalar Bakteriyel etmen Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ilk kez 1909 yılında Amerika Birleşik Devletlerinin Michigan eyaletinde domates üretim alanlarında saptandığından beri dünyanın domates yetiştirilen bütün bölgelerinde rapor edilmiştir (Gleason ve ark.,1993). Cmm domates bitkisinde hem kalite hemde kantite de azalmaya neden olmaktadır. Sherf ve Macnab (1986) bakteriyel solgunluk hastalığını domatesin en korkulan ve yıkıcı hastalıklarından biri olarak tanımlamakta ve 1960 yılında Kuzey Carolina, Kenya ve Ontario da %60-80 nin üzerinde ürün kayıpları ile sonuçlanan epidemiler oluşturduğunu bildirmektedirler. Chang (1992a) fidelerin tarlaya şaşırtılması esnasında enfektelenen domates bitkilerinde %31-83 oranında enfeksiyon oluştuğunda, ortalama meyve ağırlığında 13 g, toplam ürün miktarında ise %46 oranında azalma olduğunu bildirmiştir. Etmen Amerika Birleşik Devletlerinin Midwest (1930 lu ve 1980 li yıllar), Ontario (1960 lı ve 1980 li yıllar) ve Kuzey Carolina (1960 lı yıllar) eyaletlerinde çeşitli yıllarda meydana getirdiği epidemilerde üretici bazında %80 nin üzerinde, bölgesel olarak ise %5-10 oranında ürün kaybına neden olmuştur (Gleason et al., 1993). Ricker ve Riedel (1993) yaptıkları çalışmada, fideler tarlaya şaşırtılmadan önce etmen tarafından enfektelendiğinde çevre şartlarına bağlı olarak ürün miktarının %63-93 oranında azaldığını bildirmişlerdir. Ülkemizde ise bakteriyel solgunluk hastalığının varlığı Tokgönül (1998) ün bildirdiğine göre ilk olarak Đç Anadolu bölgesinde (Bremer ve Özkan, 1950) saptandıktan sonra, Güney Doğu Anadolu (Bremer ve ark.,1952), Marmara (Karahan, 1965) ve Ege bölgesinde (Karaca ve Saygılı, 1977) tespit edilmiştir. Daha sonra yapılan çalışmalarda etmen Doğu Akdeniz (Çınar, 1980), Çukurova bölgesi (Öktem, 1985) Batı Akdeniz (Basim ve ark., 2004) ve Doğu Anadolu (Sahin ve ark., 2002) bölgelerinde domates üretim alanlarında belirlenmiştir.

24 13 Hastalığın Ankara ilinde %0.5 ile %23 arasında bir yaygınlık gösterdiği tespit edilmiştir, ancak bazı ilçelerde %100 bulaşık tarlalara da rastlanmıştır. Yapılan çalışmalarda patojenin kurumuş domates gövdesinde 5 ay, kurumuş yaprakta (saplı) ise 4 ay süre ile yaşadığı tespit edilmiştir ( (Öktem, 1985). Orta Anadolu Bölgesi nde 14 ilde (Afyon, Ankara, Bolu, Burdur, Çankırı, Eskişehir, Isparta, Kayseri, Kırşehir, Konya, Nevşehir, Niğde, Yozgat ve Zonguldak) domates ekim alanlarında 354 örnekleme noktasında domates bakteriyel hastalıkları surveyi yapılmıştır. Surveyler sonucunda Afyon dışındaki 13 ildeki 97 tarlada Domates Bakteriyel Kanser Hastalığına rastlanmıştır. Hastalık sırayla Isparta (% 5,25),Yozgat (% 4,67), Ankara (% 3,71), Çankırı (%1,8) ve Niğde (%1,4) illerinde oldukça yüksek oranda görülmüş, diğer illerde ise % 0,07 0,71 arasında değişen oranlarda saptanmıştır (Öktem ve Benlioğlu, 1993). Kahveci ve Gürcan (2003) yaptıkları çalışmada Antalya (Alanya, Elmalı, Kaş, Korkuteli, Kumluca, Manavgat, Merkez ve Serik ilçeleri) ilinde incelenen sera ve tarla domateslerinde solgunluk gösteren bitkilerden izole edilen 72 adet bakteri izolatını yaptıkları testler sonucunda Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis olarak tanılamışlardır. Şahin ve ark., (2002) yapmış oldukları bir çalışmada Doğu Anadolu Bölgesinde Oltu, Đspir ve Yusufeli ilçelerinde Target çeşidi ticari domates üretimi yapılan 6 farklı üretim alanında hastalık yaygınlığının %100 olduğunu bildirmişlerdir. Yapılan biyokimyasal testler ve yağ asit metil ester analizleri sonucunda elde ettikleri izolatları Clavibacter michiganensis susp. michiganensis olarak tanılamıştır. Basım ve ark., (2004) Isparta ya bağlı Keçiborlu, Çandır ve Şeyhler ilçeleri ile Antalya ya bağlı Serik, Aksu, Kumluca, Demre ve Kınık ilçelerinde örtü altı domates yetiştiriciliği yapılan alanların %26 ve %65 arasında değişen oranlarda Cmm ile bulaşık olduklarını saptamışlardır.

25 14 Yıldız (2007) ın Çukurova bölgesinde yaptığı arazi sürveyleri sonucu hasta domates bitkilerinden yapılan izolasyonlarda domates bitkilerinin yoğun bir biçimde Cmm etmeni ile bulaşık olduğunu tespit etmiştir. Çalışmada Adana, Mersin, Antalya, Bursa, Artvin ve Đzmir illerinde domates üretim alanlarında sürveyler yapılmıştır. Sürvey yapılan üretim alanlarında simptomolojik olarak yapılan gözlemler sonucunda bakteriyel kanser hastalığının görüldüğü yıllarda %15-25 arasında değişen oranlarda yaygınlık gösterdiği belirlenmiştir. Özellikle bir önceki üretim sezonunda hastalık saptanmış ve yaygınlık oranının %70-80 lere ulaştığı tespit edilmiştir C. m. subsp. michiganensis (Smith) Davis et. al., in Bulaşma Yolları Bakteriyel solgunluk etmeni Cmm toprakta, bitki artıklarında, yabancı otlarda, sera konstrüksiyon malzemeleri, çeşitli tarımsal aletler (fide saksısı, oluk, budama makası vb), üzerinde ve tohumlarda yaşamını sürdürebilmektedir (Blancard, 1988). Tokgönül (1998) ün bildirdiğine göre Grogan ve Kendrik in 1953 de, Thyr ın ise 1969 da yaptığı çalışmalarda Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ile bulaşık domates tohumlarının hastalığın en önemli inokulum kaynağı olduğu ve etmenin tohumda taşınma oranının %0.25 ile %100 arasında değiştiği bildirilmiştir. Ayrıca Tokgönül (1998) ün bildirdiğine göre, Öktem (1985) Türkiye de domates üretiminin periyodik artışına paralel olarak tohumluk probleminin ortaya çıktığını ve çok sayıda çeşidin ülkeye girişi ile domates bakteriyel hastalıklarında artış görüldüğünü bildirmiştir. Chang (1992) fidelerin tarlaya şaşırtılması esnasında enfektelenen domates bitkilerinde %31-83 oranında enfeksiyon oluştuğunda, ortalama meyve ağırlığında 13 g, toplam ürün miktarında ise %46 oranında azalma olduğunu bildirmiştir. Ricker ve Riedel (1993) yaptıkları çalışmada, fideler tarlaya şaşırtılmadan önce etmen tarafından enfektelendiğinde çevre şartlarına bağlı olarak ürün miktarının %63-93 oranında azalma görüldüğünü saptamışlardır. Nedumaran ve Vidhyasekaran (1982) Hindistan ın farklı bölgelerinden elde ettikleri domates tohumları ile yaptıkları çalışmada Cmm ile doğal bulaşıklılığın ciddi bir tehlike oluşturduğunu saptamışlar ve bununla ilgili geniş çalışmaların acil olarak başlaması

26 15 gerektiğini bildirmişlerdir. Ayrıca enfekteli domates tohumlarından etmenin elde edilmesi ve tanılanması için çeşitli yöntemleri araştırmışlardır. Etmenin tohumdan fideye taşınmasının epidemi oluşumundaki öneminin belirlenmesi için yapılan bir çalışmada ise tohumdan fideye %0.01 oranında taşınan Cmm in tarlada önemli bir epideminin başlangıcı olabileceği belirlenmiştir (Chang ve ark., 1991). Özaktan (1991) ın bildirdiğine göre Byran (1930) etmenin iletim sistemi yardımı ile tohumları sistemik olarak enfekte ettiğini ve embiryoda bulunduğunu belirlemiştir. Ayrıca çalışmada doğal enfekteli tohumlarda bakterinin tohuma geçiş oranının %1-5, yapay enfekteli tohumlarda ise %21-40 oranında olduğu belirlenmiştir. Patino-Mendez (1964) yaptığı çalışmada Cmm in tohumları tohum kabuğu veya tohum zarından geçerek enfekte ettiğini, tohum zarının en içte bulunan hücrelerine doğru hareket ettiğini, ancak embriyoya giremediğini saptamıştır. Walker (1969) ise etmenin enfekteli meyve etinin ekstraksiyon işlemi sırasında tohumları yüzeysel olarak bulaştırabildiğini ve tohum kabuğundan kotiledon yapraklara daha sonra ise iletim sistemine yayıldığını belirtmiştir. Cmm in sebep olduğu Domates Bakteriyel Solgunluğunun primer inokulum kaynağının tohum olduğu bilinmektedir (Tsiantos, 1987). Bu etmenin embriyoda bulunduğu ve vasküler sistem yardımıyla tohumları sistemik olarak infekte ettiği (Bryan, 1930) ve etmenin tohumları tohum kabuğu ya da tohum zarından geçerek infekte ettiği, tohum zarının en içteki hücrelerine doğru hareket ettiği fakat embriyoya girmediği saptanmıştır (Pantino-Mendez, 1964). Etmenin infekteli meyve etinin ekstraksiyon işlemi sırasında tohumları yüzeysel olarak bulaştırabildiği ve tohum kabuğundan kotiledonu, daha sonra da vasküler sistemi işgal ettiği bilinmektedir (Özaktan ve Bora, 1991). Birçok araştırıcı ise Cmm in bir diğer inokulum kaynağının toprak olduğunu ve bu etmenin toprakta belirli koşullarda canlılığını sürdürebildiğini belirtmişlerdir (Grogan and Kendrick, 1953).

27 16 Cmm in topraktaki yaşam süresinin belirlenmesi için yapılan bir çalışmada inokulasyondan 8 ay sonra hava ile kurutulmuş topraktan etmen geri izole edilemezken, 2 o C deki nemli toprakta ay süre ile canlı ve virülent kalabildiği saptanmıştır (Strider, 1967). Ayrıca Ciccarone ve Carili (1948) de yaptıkları çalışmada Đtalya da etmenin toprakta dört yıl süreyle yaşayabildiğini belirlemişlerdir. Grogan and Kendrick (1953), etmenin tarladaki kalıntısının önemli olmadığını belirtmiştir, Dick (1981) ise kışı toprakta geçiren bakterinin meyve üzerinde lekelenmelere sebep olduğunu saptamalarına rağmen; Ciccarone ve Carili (1948) Đtalya da bu etmenin toprakta 4 yıl süreyle canlı kalabildiğini belirtmiştir. Bulaşık kalıntılarda da bu etmen bir yıldan uzun süre canlılığını sürdürebilmektedir (Farley and Miller, 1973). Basu (1966) nun yaptığı bir çalışmada ise; 20 º C de domates yaprakları inkube edilmiş ve etmenin 36 hafta süreyle canlı kalabildiği saptanmıştır. Gleason ve ark. (1991) toprak yüzeyinde kalan bulaşık bitki artıklarında etmenin en az 24 ay boyunca canlı kalabildiğini fakat toprağa gömülen bulaşık bitki artıklarında sadece 7 ay boyunca canlılığını sürdürdüğünü belirlemişlerdir. Ayrıca araştırıcılar kışı bulaşık bitki artıklarında geçiren epifitik Cmm populasyonunun primer inokulum kaynağı olarak rol oynayabileceğini bildirmektedirler. Chang ve ark., (1992) patojenin toprak yüzeyinde kalan bulaşık bitki artıklarında, toprağa gömülen bulaşık bitki artıklarına göre daha uzun süreyle canlılığını koruyabildiğini belirlemişlerdir. Gitaitis ve ark., (1989) domates bakteriyel solgunluk hastalığının esas inokulum kaynaklarının topraktaki artıklar, yabancı otlar, bulaşmış odunsu parçalar, enfekteli bitkiler ve enfekteli tohumlar olduğunu bildirmişlerdir. Etmenin latent peryodunun uzun olması, hasta ve sağlıklı fide ayrımının yapılmasını güçleştirmektedir. Bu yüzden araştırıcılar hızlı tanıda yarı seçici besi yeri kullanımını önermekte ayrıca akşamsafası (Mirabilis jalapa) bitkisinde etmen tarafından oluşturulan aşırı duyarlılık reaksiyonunun hızlı tanıda güvenilir bir kriter olabileceğini bildirmektedirler. Trevors ve Finnen (1990) ise organik maddeler içeren kumlu, killi yapıdaki steril olmayan toprağa 12 patojenik Cmm izolatı inokule etmişlerdir. 30 gün boyunca yaptıkları izolasyonlarda başlangıçta etmeni %90 seviyelerinde geri izole ederken 30.

28 17 günde bu oran %10 un altına düşmüştür. Araştırıcılar patojenin bazı izolatlarının toprakta canlılığını devam ettirebildiğini bir kısmının ise zayıf canlılık gösterdiğini saptamışlardır. Patojenin düşük yoğunlukta elde edilmesinin, etmenin izolasyonundaki zorluklardan kaynaklanabileceğini bildirmişlerdir. Cmm in seconder bulaşma kaynağının ise; budama, koltuk alma gibi kültürel işlemlerin yanı sıra yağmur, su ve pestisit damlacıklarının olduğu belirtilmektedir (Sasaki, 1987). Fatmi ve Schaad (2002) farklı coğrafik bölgeler de Cmm in bulaşık bitki artıklarında canlılığının belirlenmesi üzerine araştırmalar yapmışlardır. Çalışmalarını Amerika Birleşik Devletlerinin California ve Ohio eyaletlerinde Fas ın ise Melk Zhar ve Ait Melloul bölgelerinde sürdürmüşlerdir. Araştırıcılar patojenin toprak yüzeyine bırakılan domates gövdelerinde Ohio ve California da 314 gün boyunca, Melk Zhar ve Ait Melloul da sırası ile 194 ve 132 gün boyunca canlılığını devam ettirdiğini saptamışlardır. Toprağa gömülen gövdelerde ise etmenin Ohio da 314 gün, California da 240 gün, Ait Melloul ve Melk Zhar da 60 gün boyunca yaşamını sürdürdüğünü belirlemişlerdir. Araştırıcılar elde ettikleri bu bilgiler ışında Cmm in bitki artıklarındaki yaşam süresinin hem coğrafik bölgeye göre, hem de bitki artıklarının toprak yüzeyinde veya toprak içerisinde gömülü olmasına bağlı olarak değiştiğini bildirmişlerdir C. m. subsp. michiganensis (Smith) Davis et. al., Đle Mücadele Primer enfeksiyonların önlenmesinde tohum bulaşıklığının giderilmesi öncelikli bir konudur. Tohumla taşınan bakteriyel etmenlerin mücadelesinde tohum uygulamaları olarak; 1. Genel olarak üretim materyaline (tohum, fide, fidan vb) uygulanan antagonistlerin (Bacillus subtilis (Quantum 4000TM), Penicillium oxalicum, Chaetomium spp., Pseudomonas cepacia, Streptomyces griseoviridis (Mycostop), Gliocladium virens, Agrobacterium radiobacter ve Trichoderma spp.) yer aldığı, biyolojik mücadele yöntemi,

29 18 2. Tohum partilerinde patojenlerin enfeksiyonları nedeni ile rengi, şekli ve görünümü değişmiş, zarar görmüş tohumların mekanik olarak ayrılması esasına dayanan, mekanik mücadele yöntemi, 3. Tohumlara zarar vermeden, sıcaklıkla (sıcak su uygulaması, sıcak hava uygulaması, havalı buhar uygulaması ve radyasyon uygulaması) patojenlerin ortadan kaldırılması prensibi ile çalışan fiziksel mücadele yöntemi, 4. Streptomisin sülfat, Streptomisin, Kasugamisin, Na hipoklorit (NaOCl), Bronopol, Captafol, Mancozeb, TCMTB, Thiram, Hidroklorik asit (HCI), Sodyum hidroksit (NaOH) ve Sodyum fosfat (Na3PO4) gibi kimyasalların kullanıldığı kimyasal mücadele yöntemi uygulanmaktadır (Karsavuran ve ark., 2005). Tohum uygulamaları, tohum ve toprak kökenli mikroorganizmaların zararını önlemek veya azaltmak için düşünülmüş yöntemlerdir (Karsavuran ve ark., 2005). Sodyum hipoklorit, hidroklorik asit, bakır asetat, sıcak su uygulamaları Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis e karşı etkili bulunan fiziksel ve kimyasal tohum uygulamalarıdır (Özaktan, 1991). Hastalık ile mücadelede yoğun biçimde kullanılan kimyasalların insan ve çevre sağlığı üzerine olan olumsuz etkilerinin ortaya çıkması, düşük dozlarda ve çevreye dost kimyasal kullanımının hızla artmasına neden olmuştur. Bunun yanında bakteriyel solgunluk hastalığına karşı yeterli ve etkili bir mücadele yönteminin olmayışı insanları yeni mücadele yöntemlerinin arayışına sürüklemiştir. Bu patojeni elimine etmek için kullanılan birçok mücadele yöntemi vardır. Bu mücadele yöntemlerine ilişkin literatür özetleri aşağıda verilmiştir. Đnfekteli tohumda bulunan bakteriyi yok etmek için önerilen mücadele yöntemleri içinde kuru sıcaklık ve sıcak su uygulamaları ile ilgili literatür bilgilerini özetlemek gerekirse; Fatmi ve Schaad (1988), 0.6 M HCl de 5 saat, % 0.5 asitli bakır asetatta 20 dakika, 52 º C sıcak suda 20 dakika veya 56 º C sıcak suda 30 dakika tohum uygulaması kullanarak patojenin tohumdan eradikasyonunu sağlamışlardır. Uygulanan blotter testlerinde, 56 0 C de sıcak su uygulaması hariç, bütün tohum uygulamaları çimlenmeyi

30 19 olumsuz etkilemiş, ancak tohumlar steril toprağa ekildiğinde ise sadece HCl ve 52 º C de ki sıcak su uygulaması çimlenmeyi önemli ölçüde düşürmüştür. Ark (1944), infekteli bitkilerden elde edilen domates tohumlarını 24 saat süreyle ºC de kuru sıcaklığa bırakmak suretiyle tohumda bulunan bakterinin kontrol edilebileceğini ve bu sıcaklık derecelerinin tohum çimlenmesi için de toksik olamayacağını kanıtlamıştır. Özaktan ve Bora nın, (1991), yaptığı bir çalışmada Cmm ile bulaşık tohumlara, ekimden önce sıcak su uygulaması yapılmıştır ve buna göre en etkili sıcaklık uygulamasının; º C olduğu saptanmıştır. En etkili kuru sıcaklık uygulaması ise bulaşık tohumların 75 C de 16 saat bekletilmesinden elde edilmiştir. Yapılan başka bir araştırmada ise 53 C sıcak su uygulamasının (Orth, 1937), 56 C de 30 dakika süreyle sıcak su uygulamasının, Goode and Sasser (1980) ise; C de 25 dakika süreyle sıcak su uygulamasının infekteli domates tohumunda bulunan Cmm yi başarılı şekil elimine ettiğini saptamışlardır. Domates tohumlarının % 0-6 lık HCl ile dakika süreyle ekstrasyonundan sonra 66 C de 3 saat kurutulmasının sistemik infekteli domates tohumlarındaki Cmm nin elimine edilebileceği saptanmıştır (Thyr et al., 1973). Blood (1937), yeni ekstrakte edilmiş tohumların % 0,8 lik asetik asit içinde 24 saat süre bekletilmesi sonucunda Cmm nin elimine edildiğini belirtmiştir. Shoemarker and Echandi (1976) ise, tohumların % 1,05 lik sodium hypocholorit içinde 40 dakika, % 5 lik HCl de ise, 5 saat süreyle tutulması sonucunda hastalığın önemli ölçüde engellendiğini saptanmıştır. Dhanvantari (1989), tohumlar 0,6 M HCl, % 0,6 sodium hypocholorit içinde 15 dakika süreyle bekletilmesi sonucunda etmenin önemli ölçüde engellendiğini saptamıştır. Hastalıklı domates tohumları % 0,5 lik ethyl mercury phosphate solüsyonu içinde 5 dakika süreyle tutulması sonucunda, in vivo testlerde % arasında hastalıktan arı tohum elde edildiği ve fitotoksisite görülmediği saptanmıştır. Özaktan ve Bora nın (1991), Metoksietil civaklorür ün değişik dozlarıyla yaptığı tohum ilaçlamasında, domates tohumlarında Cmm e etkisinin en yüksek olduğu dozun, ppm olduğu saptanırken, Streptomycin uygulamasında ise bu dozun, ppm olduğu in vitro

31 20 testlerde saptanmıştır. Karahan (1969) ve Çınar (1980) ın yaptığı çalışmada % 15 Hg içeriğine sahip olan phenyl mercury acetate preparatının Cmm ye karşı etkinli olduğunu saptamışlardır. Tohumların % 0,1 lik civa klorid süspansiyonuna daldırmanın etmeni elimine etmekte başarılı olduğu belirtilmiştir (Mathai, 1984). Bogatsevska et al. (1989) ise; infekteli tohumların 52 º C sıcaklıkta 25 dakika % 0,25 lik phenyl mercury acetate süspansiyonuna daldırılması sonucunda tohum kaynaklı olan bu hastalığın önemli ölçüde azaltıldığını ve sıcaklık olmaksızın yapılan tohum uygulamasının daha az etkili olduğunu bildirmiştir. Yapılan başka bir çalışmada ise streptomycin in, etkili bir tohum ilacı olduğu in vivo ve in vitro testlerle saptanmıştır (Waksman, 1949). Köhler (1950) ise; hastalıkla bulaşık tohumların % 0,01 lik streptomycin süspansiyonunda 20 dakika süreyle bekletilmesinin, kontrolde % 60 oranında hastalık gözlenmesine karşın, uygulama görmüş tohumlardan gelişen bitkilerde bakteriyel kansere rastlanmadığını saptamıştır. Yapılan diğer bir çalışmada ise Cmm ile yapay infekteli domates tohumlarının 24 saat süreyle antibiyotik süspansiyonuna bırakılması sonucunda kontroldeki hastalık şiddetinin % 84,6 olduğu saptanırken, Penicilin dışında Streptomycin, Bacitracin ve Polymycin B gibi antibiyotiklerin bakteriyel solgunluğu etkili biçimde kontrol ettiği saptanmıştır. Streptomycin in 4 saat içinde tohum gömleğini geçtiği ve Cmm için etkili bir tohum ilacı olduğu belirtilmiştir. Tohumda bulunan patojenin elimine edilmesinde kullanılan bir diğer mücadele yöntemi ise; meyve etli tohumların fermentasyona tabi tutulmasıdır. Bu alanda yapılan çalışmalarda (Blood, 1937), meyve etli tohumların saat süreyle yapılan fermentasyonunda tohumdaki inokulumun kontrol edilebildiği; bunun nedeninin ise fermente olan meyve eti içinde laktik ve asetik asitlerin varlığı ve infekteli tohumların bu asitlerle ıslatılması sonucunda bu etmenin gelişiminin engellemesi sonucuna varılmıştır. Krüger ise (1959) ; fermente olmuş meyve etinin Cmm ye karşı engelleme aktivitesinin yüksek olduğunu ve fermentasyon sırasında üretilen antibiyotiklerin tohum gömleğinden embriyoya geçme yeteneğini kanıtlamıştır. Mathai (1984) ise; 30 C de 2-3 gün süreyle yapılan fermentasyonun bakteriyi engelleme konusunda başarılı olduğunu saptamıştır. Özaktan ve Bora (1991) ise, katkı yapılmaksızın sadece meyve etli tohumlar, toprak katkısı ve çürük meyve kullanılarak yaptıkları fermentasyon işlemi sonucunda oluşan mikroorganizmaların fermente olmuş meyve suyu örneklerinden izole

32 21 edilmiş ve bu bakterileri antagonistik yetenekleri açısından değerlendirmiştir. Sonuç olarak; her üç uygulamada da hastalığın önlenmesine karşın toprak katkılı fermentasyonun patojeni daha iyi elimine ettiği saptanmıştır. Bu hastalığı elimine etmekte kullanılan bir diğer yöntem de tohum uygulamalarının, kimyasal mücadele ile desteklenmesidir. Krüger (1960), domates fidelerinin Cmm ile infeksiyonundan önce köklerin albamycin, albamycin + terramycin ile uygulama görmesinin hastalık şiddetinde önemli bir azalmaya neden olduğunu saptamıştır. Strider (1969), fungisid uygulaması ve nemli hava koşullarında hastalığın yayılım hızının arttığını ve bakteriyel etmenin kullanılan fungisidlerde canlı kalabildiğini belirtmiştir. Bunun dışında standart fungisid programına (Maneb + Zineb) tribazik bakır sülfat ın veya streptomycin katılmasının meyve ve yaprak simptomlarını azalttığı sonucuna varılmıştır. Congleton and Huisingh (1970), gövde inokulasyonundan önce 14 saat süreyle kökleri 10 µg/ml Vancomycin veya Ristocetin içine daldırılarak uygulama gören ve bulaşık toprağa dikilen bitkilerdeki hastalık şiddetinde % oranında azalma olduğu belirtilmiştir. Farley and Miller (1973) ise, etmenin budama ile yayıldığını belirterek, budama öncesi ve sonrasında 4,5 g/l tetracycline püskürtmekle sera koşullarında hastalığın kontrol edildiğini, aynı şekilde tarlada da etkili sonuç verdiğini belirtmişlerdir. Pilavcı ve Ulukuş (1987), fide köklerine yaptıkları 3 saatlik antibiyotik uygulaması sonucunda; 5,0 g/l dozundaki troleandomycin in etkililiğinin % 29,36 olduğunu, 1,0 g/l dozundaki streptomycin uygulamasının ise % oranında etkinlik sağladığını saptamışlardır. Etmenin tohumda taşınma oranı % 0, olmasına karşın (Agarwal and Sinclair, 1997) bazı alanlarda bulaşık topraklardan kaynaklanan infeksiyonlar da önem taşımaktadır. Strider (1967), organizmanın toprakta 18 ay süreyle canlı kalabileceğini ve toprağa yapılacak olan methyl bromide uygulamasıyla bakterinin elimine edilebileceğini